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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Transglutaminasesubstrat,
das Metalloproteasen inaktiviert und antibiotische Eigenschaften
besitzt, sowie Verfahren zur Herstellung des Proteins. Weiterhin
werden Proteinsequenzen und Antikörper gegen das erfindungsgemäße
Transglutaminasesubstrat zur Verfügung gestellt.
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Transglutaminasen
(Protein-Glutamin: Amin-γ-Glutamyltransferasen, EC 2.3.2.13)
sind ubiquitär vorkommende Enzyme, die die kovalente Vernetzung
von Proteinen über die Seitenketten der Aminosäuren
Glutamin und Lysin katalysieren (siehe
1). Weiterhin
können in Gegenwart einer Transglutaminase primäre Amine
und Omega-Hydroxyfettsäuren mit Glutamindonorproteinen
verknüpft werden, wodurch die Alkylierung eines Proteins
an der betreffenden Glutaminseitenkette durch Umamidierung oder
Veresterung eintritt. Ist das Amin über einen Abstandshalter
von typischerweise 2–5 Methylengruppen mit einer weiteren
funktionellen Struktureinheit verbunden, zum Beispiel einem Fluoreszenzfarbstoff,
erhält das Transglutaminasesubstrat neuartige Eigenschaften,
in dem speziellen Fall eine Eigenfluoreszenz. Biologische Funktionen
von Transglutaminasen sind im Wesentlichen nur bei Säugern,
Pflanzen und Parasiten bekannt (
Mehta und Eckert (Hrsg.), 2005,
in: Prog. Exp. Tumor Res. (Bertino, Hrsg.) Vol. 38, Karger, Basel).
Beispielsweise stabilisiert der Blutgerinnungsfaktor XIII in Gegenwart
von Calciumionen und nach Aktivierung durch Thrombin den gebildeten
Blutpfropfen durch Vernetzung der Fibrinfäden. Welche Rolle
bakterielle Transglutaminase im Lebenszyklus von Streptomyceten
spielt, ist bis heute nicht geklärt. Jedoch besitzen bakterielle
Enzyme wegen ihrer höheren Stabilität, einer calciumunabhängigen
Aktivität und einfacher Herstellungsverfahren eine große
wirtschaftliche Bedeutung, vor allem im Lebensmittelbereich (Motoki
et al., 1992,
US 5.156.956 (20.
Oktober 2002)). Die enzymatische Vernetzungsreaktion erlaubt in
einfachen Anwendungen die Verbesserung von Produkteigenschaften
wie beispielsweise Textur, Gelstärke oder Viskosität
(
Nielsen, 1995, Food Biotechnol., S. 119–156). Bakterielle
Transglutaminase lässt sich aber auch bei der Herstellung
von Emulgatoren und Diagnostikkits, bei Immobilisierungsverfahren
sowie der Herstellung unterschiedlichster Biomaterialien verwenden.
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Actinomyceten
sind dafür bekannt, dass sie die meisten natürlichen
Antibiotika, darunter eine Vielzahl von Proteaseinhibitoren, produzieren.
Proteaseinhibitoren, die von Streptomyceten eine peptidische Struktur aufweisen
und sehr spezifisch Proteasen hemmen. Proteasen werden nach ihrem
Katalysemechanismus bzw. nach dem Aufbau des Katalysezentrums in
vier Hauptklassen eingeteilt, das sind Serinproteasen, Cysteinproteasen,
Aspartylproteasen und Metalloproteasen. Jeder Proteasetyp vereinigt
verschiedene Enzymklane und Enzymfamilien unter seinem Dach. Zu
den Serinproteasen gehören beispielsweise Trypsin-, Chymotrypsin- und
Elastase-ähnliche Proteasen sowie Aminopeptidasen, zu den
Cysteinproteasen Papain-ähnliche Proteasen und Dipeptidylpeptidasen,
zu den Aspartylproteasen Pepsin-ähnliche Proteasen und
zu den Metalloproteasen Thermolysinähnliche Proteasen,
Collagenasen oder Carboxypeptidasen. Entsprechend inhibiert Leupeptin
Trypsin-ähnliche Proteasen (Kim et al., 1998, Biochem.
J. 331, S. 539–545), Chymostatin Chymotrypsin-ähnliche
Proteasen (Umezawa et al., 1970, J. Antibiot. (Tokyo) 23,
S. 425–427), Elastatinal Elastase-ähnliche
Proteasen (Umezawa et al., 1973, J. Antibiot. (Tokyo) 26,
S. 787–789), Bestatin (Umezawa et al.,
1976, J. Antibiot. (Tokyo) 29, S. 97–99), Lapstatin
(Repic Lampret et al., 1999, Arch. Microbiol. 171, S. 397–404),
Leucinal (Sträter et al., 1995, Biochemisty 34,
S. 14792–14800), Phebestin (Nagai et al.,
1997, J. Antibiot. 50, S. 82–84), Probestin (Yoshida
et al., 1990, J. Antibiot. 43, S. 149–153) Aminopeptidasen,
Antipain Trypsin- und Papain-ähnliche Proteasen (Hanlon
und Liener, 1986, Camp. Biochem. Physiol. B, 84, S. 53–57; Kadowaki
et al., 2003, Biol. Chem. 384, S. 911–920), Pepstatin
Pepsin-ähnliche Proteasen (Kunimoto et al., 1972,
J. Anibiot. (Tokyo) 25, S. 251–255), Piperastatin
A (Murakami et al., 1996, J. Enzyme Inhib. 10, S. 93–103)
und Piperastatin B (Murakami et al., 1996, J. Enzyme Inhib.
11, S. 51–66), Histargin (Umezawa et al.,
1984, J. Antibiot. (Tokyo) 37, S. 1088–1090) sowie
(S)-Alpha-Benzyläpfelsäure (Tanaka et
al., 1984, J. Antibiot. (Tokyo) 37, S. 682–684)
Carboxypeptidasen. Kleine antibiotische Proteaseinhibitoren sind
keine Substrate von Transglutaminasen und können daher
nicht enzymatisch vernetzt, modifiziert oder kovalent in Proteingerüste
eingebaut werden.
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Weiterhin
ist bekannt, dass mit Streptomyceten zwei Arten von proteinogenen
Proteaseinhibitoren hergestellt werden können: der Thermolysin-Inhibitor
SMPI (Tate et al., 1998, J. Mol. Biol. 282, S. 435–446)
und verschiedene Subtilisin-Inhibitoren (z. B. Taguchi et
al., 1998, J. Biochem. (Tokyo) 124, S. 804–810),
die eine eigene große Inhibitorfamilie, die Streptomyces-Subtilisin-Inhibitoren-(SSI)-Familie,
bilden und auch neutrale Metalloproteasen wie zum Beispiel SGMPII
(Kumazaki et al., 1993, J. Biochem. (Tokyo) 114, S. 570–575)
oder TAMEP (Zotzel et. al., 2003, Eur. J. Biochem. 270,
S. 3214–3222) hemmen können. SMPI und
Proteine der SSI-Familie besitzen ein Molekulargewicht von ungefähr
14000 Dalton, wobei SSI-Moleküle als Dimere mit einer Molmasse
von 28000 Da beschrieben werden. Zwei intramolekulare Cystinbrücken
sorgen dafür, dass SSI-Proteine ohne Verlust der Aktivität
hohen Temperaturen (> 80°C)
ausgesetzt werden können (Kojima et l., 1993, J.
Mol. Biol. 230, S. 395–399). Sie hemmen das Wachstum
von Schimmelpilzen (Vernekar et al., 1999, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 262, S. 702–707) und Viren (Angelova
et al., 2006, Biochim. Biophys. Acta 1760, S. 1210–1216).
Nach dem derzeitigen Stand der Kenntnis können die bekannten
proteinogenen Inhibitoren von Actinomyceten nicht durch Transglutaminase
vernetzt werden.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Proteaseinhibitoren
mit antibiotischen Eigenschaften herzustellen, die mit Transglutaminasen
enzymatisch vernetzt oder funktionalisiert werden können. Zur
Lösung der Aufgabe wurden erfindungsgemäß Stämme
von Actinomyceten mehrere Tage kultiviert. Zellüberstände
von Flüssigkulturen oder wässrige Extrakte von
Agarkulturen wurden unter Verwendung verschiedener Proteasen auf
Inhibitoraktivität untersucht. Überraschenderweise
wurde dabei ein neuartiges antibiotisches Transglutaminasesubstrat
mit Inaktivierungsaktivität gegen die neutralen Metalloproteasen
Dispase von Bacillus polymyxa und Thermolysin von Bacillus themoproteolyticus
rokko entdeckt. Das erfindungsgemäße Transglutaminasesubstrat
wird nachfolgend als „dispase autolysis inducing Protein"
(DAIP) bezeichnet.
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Von
den Erfindern ist beobachtet worden, dass DAIP bereits 24 Stunden
nach dem Animpfen in Flüssigkulturen nachweisbar ist und
seine höchste Aktivität nach 40–48 Stunden
erreicht.
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Von
den Erfindern ist weiterhin beobachtet worden, dass Streptomyces
mobaraensis, ein Stamm, der früher zur Gattung Streptoverticillium
gehörte, die höchste DAIP-Menge in Flüssigmedien
erzeugt (siehe 2).
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
von DAIP zur Verfügung. Die Produktion ist dabei aus zellfreien Überständen
von Flüssigkulturen oder filtrierten Extrakten von Agarkulturen möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird DAIP mit Flüssigkulturen
von Streptomyces mobaraensis in 40–48 Stunden hergestellt.
Die Reinigung bis zur Homogenität erfolgt danach aus den
zellfreien Überständen durch Ethanolfällung
und Kationenaustauschchromatographie an Fractogel EMD SO3 – (siehe 3).
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Das
gereinigte Produkt wird erfindungsgemäß unbehandelt
oder nach einer Entsalzung als Lyophilisat, Ammoniumsulfatpräzipitat
oder in gepufferter Lösung nach Zusatz von 30–50
Prozent Glycerin, 10–30% Maltodextrin, 5–30% Polyethylenglycol
oder 2–20 mM Glutathion bei –80°C bis
+4°C gelagert.
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Mit
gereinigtem DAIP wurden erfindungsgemäß polyklonale
Kaninchen-Antikörper hergestellt, die spezifisch mit DAIP
auch in Anwesenheit anderer Proteine der Kulturbrühe von
Streptomyces mobaraensis reagieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Information zur Struktur
von DAIP zur Verfügung. Mit SDS-Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie
wurde für DAIP ein apparentes Molekulargewicht von 37.000
Dalton bestimmt. DAIP ist damit erheblich größer
als die beiden bekannten proteinogenen Streptomyces-Proteaseinhibitoren
SMPI und SSI. Der isoelektrische Punkt von DAIP liegt zwischen 7.1
und 7.2. Die nachstehende Sequenzinformation, die bisher in keiner
Proteindatenbank verzeichnet ist, wurde durch Edman-Abbau und MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie
(siehe 4) erhalten:
-
A) Edman-Analyse
-
A
D S T S G X R A P S X T K V T G D G A V T F
wobei X eine beliebige
Aminosäure ist;
-
B) MALDI-TOF-TOF-Analyse
-
- Peptid D: S N L F A A S V S A L R
- Peptid E: D G D A C D R
- Peptid F: G D V
- Peptid G: N A H D G L S A G L G
- Peptid H: F K S P N A A E V L P
- Peptid I: K A D V K S V T K A D T S D Y L
- Peptid K: G S S
- Peptid L: L S V E
-
Markierungsversuche
von gereinigtem DAIP mit dem spezifischen Markierungsreagenz Monobiotinylcadaverin
(MBC) und Transglutaminase offenbarten überraschenderweise,
dass DAIP reaktive Glutaminreste besitzt, die die erfindungsgemäße
Vernetzung und Modifizierung von DAIP mit Transglutaminasen ermöglichen.
-
Weiterhin
wurde von den Erfindern beobachtet, dass die Reaktivität
der Glutaminreste des DAIP durch Strukturmodulatoren der allgemeinen
Struktur R1-CO-X-R3 (mit
X, R1 und R2 wie
in der Deutsche Patentanmeldung „Strukturmodulator von
Proteinen" vom 17. September 2007 beschrieben) ohne Verlust der
Inaktivierungsaktivität gesteigert werden kann (siehe 5).
Die Konzentration der Detergenzien liegt bei 0–0,2% (m/v),
vorzugsweise bei 0–0,07% (m/v).
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Markierungsversuche
von gereinigtem DAIP mit dem spezifischen Markierungsreagenz N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)hexandiamin
(ZQG-HDA-Biotin) und Transglutaminase offenbarten überraschenderweise,
dass DAIP reaktive Lysinreste besitzt, die die erfindungsgemäße
Vernetzung von DAIP mit Transglutaminasen ermöglichen.
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Weiterhin
wurde von den Erfindern beobachtet, dass die Reaktivität
der Lysinreste des DAIP durch Strukturmodulatoren der allgemeinen
Struktur R1-CO-X-R3 (mit
X, R1 und R2 wie
in der Deutsche Patentanmeldung „Strukturmodulator von
Proteinen" vom 17. September 2007 beschrieben) ohne Verlust der
Inaktivierungsaktivität gesteigert werden kann (siehe 6).
Die Konzentration der Detergenzien liegt bei 0–0,2% (m/v),
vorzugsweise bei 0–0,07% (m/v).
-
Die
Vernetzung von DAIP wurde erfindungsgemäß mit
Transglutaminase durchgeführt (siehe 7). Dabei
wurde von den Erfindern die Entstehung oligomerer und polymerer
Aggregate des DAIP beobachtet. Der Versuch zeigt weiterhin, dass
sich DAIP für den enzymatischen Einbau in neuartige Biomaterialien
eignet, um diesen antibiotische Eigenschaften zu geben.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Information zur biologischen
Funktion von DAIP zur Verfügung. DAIP inaktiviert erfindungsgemäß Metalloproteasen,
vorzugsweise Mitglieder der M4-Metalloproteasenfamilie, insbesondere
aber Dispase und Thermolysin. Größenausschlusschromatographie
von DAIP-Dispase-Gemischen zeigt, dass das Absorptionssignal von
Dispase abnimmt, während DAIP unversehrt bleibt. Dabei
entstehen gleichzeitig neue Fragmente (siehe 8). Die
vollständige Inaktivierung wird bereits bei molaren DAIP-Dispase-Verhältnissen
kleiner 0.1 beobachtet.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Information zur antibiotischen
Eigenschaft von DAIP zur Verfügung. Von den Erfindern wurde
beobachtet, dass die Entstehung von Schimmel auf Wurstscheiben durch DAIP
gehemmt wird (siehe 9).
-
Erfindungsgemäß wurde
weiterhin beobachtet, dass DAIP das Wachstum von multizellulären
Actinomyceten hemmt (siehe 10).
-
Die
folgenden Abbildungen und Beispiele erläutern die Erfindung.
-
Beschreibung der Abbildungen
-
1:
Reaktionsschema von Transglutaminasen. Die Gamma-Carboxamidgruppe
von proteingebundenem Glutamin wird unter Freisetzung von Ammoniak
auf ein primäres Amin übertragen. Wenn der Glutamylakzeptor
die Epsilon-Aminofunktion eines proteingebundenen Lysinrests ist,
wird eine inter- oder intramolekulare Isopeptidbindung ausgebildet,
abhängig davon, ob ein zweites oder dasselbe Protein beteiligt
sind.
-
2:
Kultivierungsverlauf von Streptomyces mobaraensis: Bestimmung der
Restaktivität von Dispase nach einer Inkubation von 30
Minuten mit Kulturüberstand bei 37°C
-
3:
Reinigung von DAIP aus zellfreier, ethanolgefällter Kulturbrühe
von Streptomyces mobaraensis
- A) Typisches Elutionsprofil
einer Kationenaustausch-Chromatographie. Spur M: Mischung von Proteinen mit
den Molmassen 67, 45, 29 und 21 kDa.
- B) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel von vereinigten
Spitzenfraktionen
- C) Western-Blot mit DAIP-Antiserum
-
4:
MALDI-TOF-Massenspektrum von Peptiden, die durch Trypsinverdau von
DAIP erhaltenen und für die Sequenzanalyse verwendet wurden.
-
5:
Markierung von gereinigtem DAIP mit Monobiotinylcadaverin (MBC)
und Transglutaminase zur Identifizierung reaktiver Glutaminreste.
Spuren 1–3, Transglutaminase; Spur M, Mischung von Proteinen mit
den Molmassen 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 kDa; Spuren 5–7,
Mischung aus DAIP und Transglutaminase; Spuren 8–10, DAIP.
Zusatz von N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin: 0%, Spuren 1,
5, 8; 0,05%, Spuren 2, 6, 9; 0,1%, Spuren 3, 7, 10.
- A) Auf Nitrocellulose transferiert Proteine einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
angefärbt mit einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat
- B) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel
-
6:
Markierung von gereinigtem DAIP mit N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)hexandiamin
(ZQG-HDA) und Transglutaminase zur Identifizierung reaktiver Lysinreste.
Spuren 1–3, Transglutaminase; Spur M, Mischung von Proteinen
mit den Molmassen 67, 45, 29, 21, 14,3, 6,5 kDa; Spuren 5–7,
DAIP und Transglutaminase; Spuren 8–10, DAIP. Zusatz von
N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin: 0%, Spuren 1, 5, 8; 0,05%,
Spuren 2, 6, 9; 0,1%, Spuren 3, 7, 10.
-
- A) Auf Nitrocellulose transferiert Proteine
einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angefärbt mit
einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat
- B) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel
-
7:
Vernetzung von DAIP mit Transglutaminase in Gegenwart von 0,05%
N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin; Spuren 1–6, Inkubation
der Reaktionsmischung für 0, 1, 2, 3, 4 und 18 Stunden
bei 37°C.
- A) Silbergefärbtes
SDS-Polyacrylamidgel
- B) Western-Blot mit anti-DAIP-Antiserum.
-
8:
Autolyse von Dispase induziert durch DAIP. Dispase-DAIP-Mischungen
wurden unmittelbar nach der Vereinigung durch Größenausschlusschromatographie
getrennt.
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9:
Konservierungsversuch von Wurstscheiben mit DAIP. Probe 1 wurde
mit sterilisiertem Wasser bestrichen, Probe 2 mit DAIP-haltigem,
sterilisiertem Wasser. Nach 24 Stunden waren Schimmelpilzkolonien nur
auf Probe 1 gewachsen. Nach 72 Stunden (gezeigt) war Probe 1 mit
einem Schimmelpilzrasen bedeckt, während Probe 2 nur einzelne
Kolonien aufwies.
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10:
Hemmung des Wachstums von Streptomyces coelicolor A3 (2) durch DAIP.
Ein mit DAIP getränktes Filterpapier wurde vor dem Animpfen
auf dem Nähragar platziert. Die Kultivierung erfolgte bei
28°C für 100 Stunden.
-
Die
folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden
Erfindung.
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Beispiel I
-
Kultivierung von Streptomyceten
-
a) Plattenkulturen zum Inokulieren von
Flüssigmedien und zur Stammkonservierung
-
Die
Anzucht der Mikroorganismen zur Inokulation von Flüssigmedien
sowie das Anlegen von Dauerkulturen erfolgte auf GYM-Agarplatten
(Shirling und Gottlieb, 1966, Int. J. Syst. Bacteriol. 16,
S. 313–340). Ausgehend von Reinkulturen der DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) wurden
Streptomycetenstämme in sterilem Wasser aufgenommen. Die
Suspension wurde mit einer Pipette auf die GYM-Platten überführt
und mit einem Drigalski-Spatel verteilt.
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Vor
der Inokulation von Flüssigkulturen wurden Vorkulturen
auf einer neuen Agarplatte angelegt. Hierzu wurden Bakterienkolonien
mit einer Impföse auf der Platte ausgestrichen und bei
28°C mindestens 5 Tage inkubiert, bis neben dem Substratmycel
auch sporulierende Lufthyphen zu sehen waren.
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Zur
Stammkonservierung wurden die Streptomycetenstämme nach
etwa 30 Tagen auf eine neue GYM-Agarplatte überimpft. Die
Petrischalen wurden anschließend mit einem Kunststofffilm
verschlossen und bei 28°C inkubiert.
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b) Flüssigkulturen zur präparativen
Herstellung von DAIP
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Zur
präparativen Produktion von DAIP wurden 1 L Erlenmeyer-Kulturkolben
mit 110 ml Flüssigmedium befüllt. Nach dem Autoklavieren
der Kulturmedien wurde über einen Sterilfilter 1 ml Spurenelementlösung
zugeführt und mit einer Vorkultur, die auf GYM-Agarplatten
angezüchtet wurde, beimpft.
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Die
Kultivierung erfolgte bei 28°C bis zum Erreichen des gewünschten
DAIP-Produkts. Der Sauerstoffeintrag, der für das Wachstum
der aeroben Bakterien benötigt wird, erfolgte durch intensive
Bewegung der Flüssigkultur auf einem Querschüttler
mit einer Frequenz von 110 pro Minute. Nach einem bis vier Tagen
wurde das DAIP-enthaltende Kulturmedium von den Mikroorganismen
durch Zentrifugation und Filtration getrennt, direkt weiter verarbeitet
oder bei –20°C gelagert.
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c) Kultivierung von Streptomyces mobaraensis
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Die
Anzucht und Stammkonservierung von Streptomyces mobaraensis erfolgte
auf Agarplatten, ausgehend von einer Reinkultur der DSMZ. Die Submerskultivierung
zur DAIP-Produktion erfolgte, wie unter Beispiel 1b) beschrieben,
in einem Komplexmedium das zusätzlich mit Spurenelementen
angereichert war (Voelskow, 19, Jahrbuch Biotechnologie,
Carl Hanser Verlag, München, S. 341–361).
Nach einer Kultivierungsdauer von einem bis vier Tagen wurde die
Zellmasse durch Zentrifugation und Filtration vom Flüssigmedium, in
das die Bakterien das Produkt sekretieren, getrennt. Die volumenbezogene
Dispase-Inaktivierungsaktivität für DAIP lag bei
0.5 IE/ml bzw. 0.1 IE/mg (Definition der Inaktivierungseinheit IE
wie unter Beispiel 2a) beschrieben). Die produzierte DAIP-Menge
lag durchschnittlich bei 30–50 Milligramm pro Liter Kulturbrühe.
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Beispiel II
-
Bestimmung der Inaktivierungsaktivität
von DAIP
-
a) Vorinkubation mit einer Protease
-
Der
eingesetzte Inaktivierungsaktivitätstest für DAIP
beruht auf einer Vorinkubation des inaktivierenden Proteins mit
einer Protease für die Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur
und Bestimmung der proteolytischen Restaktivität mit einem
der unter Beispiel 2b) bis d) beschriebenen Aktivitätstests.
-
b) Modifizierter Ansontest
-
- (Yang und Wang, 1999, Bot. Bull. Acad. Sin. 40,
S. 259–265)
-
200 μl
Alkali-lösliches Casein (10 mg/ml) in 0,1 M Tris/HCl pH
7,5 mit 2 mM CaCl2 und 200 μl einer geeigneten
Protease-DAIP-Mischung mit der Proteasemenge von Tab. 2 wurden bei
37°C für 10 min inkubiert. Nach Zugabe von 600 μl
Trichloressigsäure wurde zentrifugiert, und die Absorption
des Überstands wurde bei 280 nm gegen eine Blindprobe ohne
Protease in 1-cm-Küvetten gemessen. Die Konzentration absorbierender Aminosäuren
und Peptide, die durch die Restaktivität der Protease in
den Überstand gelangen, wird summarisch als „freies
Tyrosin" erfasst. Der Extinktionskoeffizient für Tyrosin
beträgt unter den gewählten Bedingungen 0.9881
mM–1 cm–1.
Eine modifizierte Anson-Einheit (AE) entspricht dabei der Freisetzung
von einem Mikromol Tyrosin pro Minute. Die Reduktion von einer Anson-Einheit
durch DAIP wird als eine Inaktivierungseinheit (IE) bezeichnet.
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c) Furylacryloylglycyl-L-phenylalanylamid-Test
-
- (Feder und Garrett, 1971, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 43, S. 943–948.)
-
In
einer Mikrotiterplatte wurden 190 μl einer Protease-DAIP-Mischung,
die 30 μg Dispase enthielt, in 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 50
mM 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure (MES), 2 mM CaCl2 und 0,01% Triton X-100 mit 10 μl
10 mM Furylacryloylglycyl-L-phenylalanylamid (FAGFA) bei 37°C
bis zu 20 min inkubiert. Die Abnahme der Absorption wurde dabei
bei einer Wellenlänge von 340 nm kontinuierlich verfolgt.
Zur Ermittlung der proteolytischen Restaktivität wurde
FAGFA in unterschiedlichen Konzentrationen vollständig
hydrolysiert. Der ermittelte Extinktionskoeffizient beträgt –527
ml/mmol. Eine proteolytische Aktivitätseinheit entspricht
der Hydrolyse von 1 nmol FAGFA.
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d) DABCYL-Ser-Phe-EDANS-Test
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- (Weimer et al., 2006, Anal. Biochem. 352, S. 110–119)
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15 μg
Dabcyl-Ser-Phe-EDANS in 200 μl 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 mit
2 mM CaCl2 wurden mit 300 μl einer DAIP-Protease-Mischung,
die 10 μg Dispase enthielt, bei 37°C für
10 min inkubiert. Nach Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 500 μl
20 mM EDTA wurde die Emission bei 490 nm und einer Excitationswellenlänge von
336 nm in 1-cm-Küvetten gemessen.
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Beispiel III
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Reinigung von DAIP aus der Kulturbrühe
von Streptomyces mobaraensis
-
a) Herstellung eines zellfreien Überstands
-
Streptomyces
mobaraensis wurde, wie unter Beispiel Ic) beschrieben, in einem
Flüssigmedium 40–48 Stunden kultiviert. Die gebildete
Zellmasse wurde durch Zentrifugation (10000 g, 4°C, 10
min) und Filtration abgetrennt, und der Überstand wurde
weiter verarbeitet.
-
b) Anreicherung von DAIP durch Ethanolfällung
-
Zellfreier Überstand
wurde auf 4°C gekühlt, mit dem gleichen Volumen
an –18°C kaltem Ethanol gemischt und 30 Minuten
inkubiert. Nach Abtrennung der gefällten Proteine durch
Zentrifugation (10000 g, 4°C, 10 min) wurde die Ethanolmenge
im Überstand auf 80 Vol% erhöht. Bei diesem Verfahrensschritt
präzipitiert DAIP, wobei die Fällung nach 30 Minuten abgeschlossen
ist. Das Produkt wurde abzentrifugiert, in 50 mM Acetatpuffer pH
4 aufgenommen, unter Kühlung gelagert oder sofort weiter
verarbeitet.
-
c) Säulenchromatographische Methode
-
Die
vollständige Reinigung von DAIP erfolgte durch Niederdruck-Flüssigchromatographie
an einem starken Kationenaustauschermaterial. Vor Beginn wurde das
Ethanolpräzipitat durch Filtration durch einen 0,45-μ-Filter
von feinsten Partikeln befreit. Die für die Chromatographie
verwendeten Puffer wurden mit Milli-Q-Wasser angesetzt, vor Gebrauch
sterilfiltriert und im Ultraschallbad entgast. Tabelle 1: Elutionsbedingungen für
DAIP
| Funktion | Puffer
A | Puffer
B | Volumen
(ml) |
| Auftrag
der Proteinlösung | | | 20–30 |
| Elution
der nichtbindenden Proteine | 100 | | |
| Linearer
Gradient | 100-0 | 0-100 | 300 |
-
Die
Chromatographie erfolgte bei Raumtemperatur. Alle Protein enthaltenden
Fraktionen wurden durch Inaktivierungsaktivitätstests,
SDS-PAGE, Western-Blots und Proteinbestimmungen charakterisiert. Fraktionen,
die DAIP enthielten, wurden gegebenenfalls vereinigt, unbehandelt
eingefroren oder vor der Lagerung bei –20°C mit
Entsalzungssäulen oder durch Dialyse entsalzt, lyophilisiert,
mit Ammoniumsulfat gefällt oder durch Zugabe von Glycerin,
Maltodextrin, Polyethylenglycol oder Glutathion konditioniert.
| Geräte | Pharmacia | |
| Stationäre
Phase | Fractogel
EMD SO3 – (S) | |
| | Durchmesser
1,6 cm | |
| | Betthöhe
10.3 cm | |
| | Bettvolumen
20 ml | |
| Mobile
Phasen | 50
mM Acetat pH 4,0 | (Puffer
A) |
| | 1
M Natriumchlorid in 50 mM Acetat pH 4,0 | (Puffer
B) |
| Flussrate | 1
ml/min | |
| Injiziertes
Volumen | 20–30
ml Ethanolpräzipitat in Puffer A | |
| Detektion | Kontinuierliche
Messung der Absorption bei λ = 280 nm | |
-
Beispiel IV
-
Charakterisierung von DAIP
-
a) Bestimmung der Molekülgröße
-
Das
SDS-Polyacrylamidgel belegt die vollständige Reinigung
des Dispase inaktivierenden Proteins DAIP von Streptomyces mobaraensis
(siehe 3B). Die anhand der Markerproteine
bestimmte apparente Molmasse beträgt 37.000 Dalton.
-
Die
Molmasse von DAIP wurde weiterhin durch Größenausschlusschromatographie
unter Verwendung einer 60 cm Superdex-75-Säule bestimmt.
Der verwendete 50 mM Tris-HCl-Puffer enthielt 150 mM Natriumchlorid
und 2 mM Calciumchlorid und war auf pH 7,0 eingestellt. Die Flussrate
betrug 1 ml/min. Zur Kalibrierung wurden Alkoholdehydrogenase von
Saccharomyces cerevisiae mit einem Molekulargewicht von 150 kDa,
bovines Serumalbumin mit 66 kDa, Ovalbumin mit 45 kDa, bovine Carboanhydrase
mit 29 kDa und bovines Cytochrom C mit 12,4 kDa verwendet. Die gefundene
apparente Molmasse von DAIP beträgt 37.000 Dalton.
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b) Bestimmung des Isoelektrischen Punkts
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Der
isoelektrischen Punkt von DAIP wurde mit einem vorgefertigten Acrylamidgel
von Serva (Servalyt Prenet) nach Angaben des Herstellers bestimmt.
Zur Kalibrierung wurden Pferd-Cytochrom C (10,7), bovine Ribonuklease
(9,5), Lectin aus Lens culinaris (8,3, 8,0, 7,8), Pferd-Myoglobin
(7.4, 6,9), bovine Carboanhydrase (6,0), bovines Lactoglobulin (5,3,
5,2), Trypsininhibitor aus Sojabohne (4,5), Glucoseoxidase (4,2)
und Amyloglucosidase (3,5), beide von Aspergillus niger, verwendet.
Der gefundene isoelektrische Punkt von DAIP liegt zwischen 7,1 und
7,2.
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c) Bestimmung von Proteinsequenzen
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Gereinigtes
DAIP wurde durch Gelelektrophorese getrennt (Poduslo, 1981,
Anal. Biochem. 114, S. 131–139), auf Polyvinylidendifluorid-(PVDF)-Membanen
transferiert (Khyse-Andersen, 1984, J. Biochem. Biophys.
Methods 10, S. 203–209) und mit Coomassie-Blau
gefärbt (Matsudaira, 1987, J. Biol. Chem. 262,
S. 10035–10038). Die Proteinbande wurde ausgeschnitten
und durch Edman-Abbau analysiert.
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Auf
eine PVDF-Membran geblottetes und gefärbtes DAIP wurde
ausgeschnitten, mit Trypsin in 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH
8.2 über Nacht (ca. 18 Stunden) bei 37°C inkubiert
und durch MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
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Beispiel V
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Herstellung von Antiserum gegen DAIP
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Das
nach dem Verfahren von Beispiel IIIc) gereinigte DAIP wurde zur
Immunisierung eines Kaninchens verwendet. Die DAIP-spezifischen
Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie
nach Angaben des Säulenherstellers (Biorad) gereinigt
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Beispiel VI
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Biotinylierung von DAIP mit Transglutaminase
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a) Markierung mit Monobiotinylcadaverin
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Die
Markierung von DAIP zur Bestimmung reaktiver Glutaminseitenketten
erfolgte in 0,1 M N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)
(HEPES) pH 7,5. 30 μl gepufferte Lösung enthielten
7,5 μl DAIP (0,3–0,4 mg/ml), 2 mM Monobiotinylcadaverin
(MBC), 0–0,2% N-Lauroylsarcosin oder N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin
und 2,5 μl Transglutaminase (0.2–0,3 mg/ml). Die
Inkubation erfolgte bei 37°C für 2 Stunden. Die
Reaktionsmischung wurde durch SDS-Polyarylamidgelelektrophorese
getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einem
Avidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat angefärbt. Dazu
wurden zunächst nach dem Proteintransfer unspezifische
Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran mit fettfreier Milch blockiert.
Nach mehrfachem Waschen mit 10 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/0,05% Tween
pH 8,0, Inkubation mit dem Avidinkonjugat (50 ng/ml) für
1,5 Stunden bei Raumtemperatur, erneutem Waschen und Einstellen
der Membran auf pH 9,5 mit 0,1 M Tris-HCl/0,1 M NaCl/5 mM MgCl2 erfolgte die Färbung mit 5-Brom-4-chlorindolylphosphat
und 2,2'-Di-p-nitrophenyl-5,5'-diphenyl-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid
(Nitrotetrazoliumblau).
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b) Markierung mit N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)hexandiamin
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Das
enzymatische Markierungsverfahren von DAIP zur Bestimmung von reaktiven
Lysinresten erfolgte wie unter Beispiel VIa) beschrieben. Nur enthielt
die Reaktionsmischung anstelle von MBC 0,13 mM N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)hexandiamin
(ZQG-HDA).
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Beispiel VII
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Vernetzung von DAIP mit Transglutaminase
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Die
Vernetzung von DAIP durch Transglutaminase erfolgte wie unter Beispiel
VIa) beschrieben in HEPES-Puffer pH 7,5 mit 0,05% N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin
und ohne Markierungsreagenz. Die Reaktionsmischung wurde bis zu
24 Stunden inkubiert, durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt,
silbergefärbt oder nach Transfer auf eine Nitrocellulosemembran
unter Verwendung von DAIP-Antiserum immunchemisch gefärbt.
-
Beispiel VIII
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Bestimmung der Spezifität von
DAIP
-
Die
Inaktivierungsaktivität von DAIP gegenüber verschiedenen
Proteasen wurde mit der unter Beispiel IIa) beschriebenen Analysenmethode
bestimmt. Dabei wurde für Papain und Bromelain das Verfahren
dahin gehend verändert, dass ein 0,1 M Citratpuffer pH
6,5 verwendet wurde. Dabei zeigte sich die besonders hohe Aktivität
von DAIP gegenüber Dispase. Weiterhin wird Thermolysin
bei höheren DAIP-Konzentrationen inaktiviert, während
andere Metalloproteasen wie TAMEP und Collagenase von Clostridium
histolyticum sowie Serin- und Cysteinproteasen unverändert
bleiben.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
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