CN111138513B

CN111138513B - 谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选

Info

Publication number: CN111138513B
Application number: CN202010008938.3A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 王洪彬; 宋平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: CN111138513A

Abstract

本发明涉及谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选，通过体外RNA展示筛选技术获得了芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转氨酶的八肽交联肽，该交联肽在短肽(八肽)水平上为研究谷氨酰胺转氨酶交联时位点和序列选择倾向性提供了依据，有望提高谷氨酰胺转氨酶的应用水平。

Description

谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选

技术领域

本发明属于酶工程领域和食品工程领域，具体涉及芽孢杆菌来源谷氨酰胺转氨酶的交联肽的筛选。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TG)广泛存在于动物、植物以及微生物体内。谷氨酰胺转氨酶可以催化蛋白质分子内和分子间的谷氨酸残基和赖氨酸残基之间形成共价交联，从而改变原始蛋白质的结构和功能性质，被广泛应用于食品加工领域、纺织领域、材料工程与生物医药领域，其中在食品加工领域应用最多。目前的谷氨酰胺转氨酶主要以微生物来源为主，但由于对谷氨酰胺转氨酶在短肽(八肽)水平上的交联过程、位点和序列选择性尚不清楚，且缺乏相关研究，严重制约了该酶的理论改造研究以及应用水平的提高。

本发明工作试图通过mRNA体外展示技术探寻谷氨酰胺转氨酶的交联规律。mRNA体外展示技术，在筛选效能上具有高库容量高灵敏度等优势。其核心技术特征在于，肽库的RNA序列与其翻译的对应氨基酸序列通过连接子(linker)形成了mRNA-linker-多肽融合分子，并用于亲和肽筛选，所获亲和肽序列可以通过共价连接的cDNA的PCR扩增和高通量测序实现超高灵敏度的鉴定。在筛选过程中，mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-蛋白质融合体，能在大容量的多肽文库(10¹³～10¹⁵)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白。然而，利用mRNA体外展示技术探寻谷氨酰胺转氨酶交联规律的研究却鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于，通过mRNA体外展示筛选技术，为芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转氨酶筛选多肽类交联肽。

本发明实现目的的技术方案如下：

通过mRNA体外展示方法初筛谷氨酰胺转氨酶的候选交联肽，并通过交联实验的测定验证谷氨酰胺转氨酶交联肽的交联效果，步骤如下：

(1)特殊设计与合成的DNA库，经过体外转录、linker光交联、体外翻译和纯化、反转录等步骤获得基因型表型融合分子库，即mRNA-linker-多肽融合分子库；

(2)通过链霉亲和素磁珠固定生物素修饰的六赖氨酸；

(3)随后将mRNA-linker-多肽融合分子库与磁珠固定六赖氨酸，并加入谷氨酰胺转氨酶进行孵育筛选，筛选获得的亲合肽通过PCR扩增其DNA后进入下一轮筛选。

(4)经多轮筛选最终捕获得到高亲和力的融合分子，并通过PCR扩增和DNA测序实现候选交联肽的序列鉴定。

(5)测定芽孢杆菌来源谷氨酰胺转氨酶对交联肽的交联转化率，确认交联肽的交联效果。

mRNA体外展示筛选获得的芽孢杆菌来源谷氨酰胺转氨酶的交联肽，在序列上呈现如下特征，其中，从N端起N1位置氨基酸为酪氨酸或者组氨酸；N2位置为半胱氨酸或者色氨酸；N1-N7位置所含氨基酸的种类包括组氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸和谷氨酸，多肽序列的羧基端位点C1位置为酪氨酸、亮氨酸或者组氨酸。八肽序列中氨基酸位置的命名为：从N段开始各个氨基酸位置依次为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、C1。其中，谷氨酰胺转氨酶对以下十种八肽具有较佳的交联活性，包括HWHQYCPY、YCSWQYYH、YCAYSQPH、YCPIDQAY、HCKQCDPY、YWTQGEEY、YCGGQTVY、YWSVGQMY、HWGANYQH和YCPELPQY。氨基酸缩写对应关系为：组氨酸，H；丝氨酸，S；天冬氨酸，D；半胱氨酸，C；谷氨酰胺，Q；亮氨酸，L；赖氨酸，K；丙氨酸，A；脯氨酸，P；甘氨酸，G；谷氨酸，E；异亮氨酸，I；缬氨酸，V；苏氨酸，T；甲硫氨酸，M；色氨酸，W；酪氨酸，Y。氨基酸序列书写顺序为从N端到C端。

本发明的有益效果是：

通过mRNA体外展示多轮筛选成功获得了多种谷氨酰胺转氨酶的新型八肽交联肽。其中谷氨酰胺转氨酶对HWHQYCPY等交联肽有极高的交联效果，揭示了短肽(八肽)水平上谷氨酰胺转氨酶交联过程中序列的选择性，本发明对谷氨酰胺转氨酶酶制剂的广泛应用和发展具有重大意义。

附图说明

图1RNA体外展示技术所筛选八肽序列中不同位点氨基酸种类的分布图

图2谷氨酰胺转氨酶对不同肽段的交联转化率

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：mRNA体外展示多轮筛选获得谷氨酰胺转氨酶的交联肽

1.mRNA展示DNA文库的构建

化学合成编码随机八肽的DNA文库，并在5’端添加T7聚合酶启动子、翻译增强子和翻译起始密码子等序列，在3’端添加亲和纯化标签。DNA库具体序列为：

(TTCTAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGACTACAAAGACGACGACGATAAGAAGACTYACTGSNNSNNSNNSNNSNNSYACTGGTCAGCGAGCTGCCATCATCATCATCATCATCACCGGCTAT)；

引物序列F:(5’TTCTAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA3’)R:(5’ATAGCCGGTGATGATGAT GATGATGATGGC 3’),DNA库及引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将DNA库PCR扩增，其扩增程序为：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃10s，共30个循环；72℃10min。

2.转录

PCR产物经Cycle-Pure Kit DNA纯化试剂盒(OMEGA)纯化，采用DEPC水进行洗脱。纯化后的DNA(10ng/μL)1μL，75mM T7 ATP Solution 2μL，75mM T7 UTP Solution 2μL，75mM T7 CTP Solution 2μL，75mM T7 GTP Solution 2μL，T7 10×Reaction Buffer 2μL，T7Enzyme Mix 2μL，混匀，37℃水浴4h。水浴反应后加入1μL DNA酶，37℃水浴反应15min，接着65℃水浴5min后立即置于冰上2min，消除RNA二级结构。经柱式RNA快速浓缩纯化试剂盒纯化后的转录产物使用5％变性丙烯酰胺胶检测RNA的生成。

3.mRNA与Linker连接

连接子(Linker)的序列为：补骨脂素(psoralen)-TAGCCGGTGAAAAAAAAAAAAAAA-(PEG)₂-ACC-嘌呤霉素(puromycin)。RNA(500ng/μL)60μL，Tris-Hcl(pH7.4，250mM)30μL，NaCl(1M)30μL，Linker(50mM)30μL，DEPC水150μL混匀，80℃水浴5min后，室温静置15min。然后用移液枪将反应液转移至96孔板中，在365nm紫外光下照射96孔板15min，乙醇沉淀回收产物，将其上样到5％变性丙烯酰胺胶并切下RNA-Linker条带，切割的凝胶使用UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒进行回收。

4.体外翻译获得mRNA-多肽融合分子

利用体外翻译试剂盒(Rabbit Reticulocyte Lysate System，普洛麦格)，加入24.5μLmRNA-Linker复合物及RNA抑制剂RNasin 1.5μL，30℃水浴1h，然后加入1M MgCl₂ 5μL，2M CH₃COOK 17μL，混匀，轻微离心，冰上孵育15min，-20℃过夜，采用Oligo-dTcellulose法纯化翻译产物。

5.反转录获得cDNA-mRNA-多肽融合分子

使用纯化过的mRNA-多肽库进行反转录，依次加入1μL下游引物、2μL mRNA-多肽库、4μL dNTP和5μL DEPC水。70℃变性5min，快速放冰上冷却，加入：5×first-stand缓冲液4μL、0.1M DTT 2μL和RNA抑制剂RNasin 1μL。42℃孵育2min后加入反转录酶1μL，混匀。25℃孵育2min，42℃孵育50min。随后进行His-Tag标签纯化，移取100μL树脂Ni-superflow于小柱中，取200μL lysis Buffer(pH 7.4)激活树脂Ni-superflow，12000rpm离心2min后弃滤液，重复一次，弃去滤液。加入反转录复合体系，冰浴30min，加入200μL wash Buffer(pH7.4)于小柱中洗去非特异性结合，12000rpm离心2min弃滤液，重复一次。再加入100μLElution Buffer(pH 7.4)于小柱中，12000rpm离心2min后收集滤液，并重复一次。

6.六赖氨酸的磁珠固定

通过链霉亲和素磁珠(无锡百迈格生物科技有限公司)进行磁珠固定。取100μL(1mg)链霉亲和素磁珠充分混匀后，于磁力架上，磁液分离后，弃上清。移取500μL PBS(pH7.4)重悬磁珠，放于磁力架，磁液分离后，弃上清，重复两次。之后用100μL PBS重悬磁珠，加入生物素化修饰的六赖氨酸(南京艾特生物科技有限公司)到磁珠管内，室温震荡30min，过程中应保持磁珠处于悬浮状态，之后经磁力架，磁液分离后，将上清移至干净离心管内加入1mL PBS重悬磁珠，磁液分离后移除上清，重复两次，最后加入80μL PBS重悬磁珠，进行亲和肽的筛选。

7.亲和肽的筛选和测序

混合生物素化的六赖氨酸、1.5mg谷氨酰胺转氨酶和cDNA-mRNA-多肽产物，在室温下振荡30min，在磁力架上经磁液分离后移除上清，使用PBS溶液(pH 7.4)300μL反复冲洗磁珠3次，最后一次冲洗完成后加入PBS溶液100μL重悬磁珠并加入2μL Rnase A在37℃孵育1h，酚氯仿法提取DNA。获得的DNA经过PCR扩增进入下一轮筛选，经过连续3轮筛选，目标蛋白及其编码的基因序列最终得到富集和分离。对最终获得的DNA进行高通量(BGIseq500)测序(武汉华大医学检验所有限公司)。

筛选多肽经测序所得序列的氨基酸分布特征如图1所示，横坐标表示所筛选八肽序列中氨基酸相的位置，纵坐标中表示不同氨基酸在该位点出现的比例。从中可以看出，序列具有明显的特征，从N端起N1位置氨基酸绝大部分为酪氨酸或者组氨酸；N2位置绝大部分为半胱氨酸或者色氨酸；N1-N7位置所含氨基酸的种类包括组氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸和谷氨酸，多肽序列的羧基端位点C1位置为酪氨酸、亮氨酸或者组氨酸。八肽序列中氨基酸位置的命名为：从N段开始各个氨基酸位置依次为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、C1。筛选多肽中亲和度最高的十种八肽序列，包括HWHQYCPY、YCSWQYYH、YCAYSQPH、YCPIDQAY、HCKQCDPY、YWTQGEEY、YCGGQTVY、YWSVGQMY、HWGANYQH和YCPELPQY。氨基酸缩写对应关系为：组氨酸，H；丝氨酸，S；天冬氨酸，D；半胱氨酸，C；谷氨酰胺，Q；亮氨酸，L；赖氨酸，K；丙氨酸，A；脯氨酸，P；甘氨酸，G；谷氨酸，E；异亮氨酸，I；缬氨酸，V；苏氨酸，T；甲硫氨酸，M；

色氨酸，W；酪氨酸，Y。氨基酸序列书写顺序为从N端到C端。

实施例2：谷氨酰胺转氨酶对八肽交联肽的交联效果

1.化学合成筛选获得的八肽交联肽HWHQYCPY、YCSWQYYH、YCAYSQPH、YCPIDQAY和HCKQCDPY。

2.实验组加入六赖氨酸(200μM)后，分别加入上述五种交联肽(200μM)，谷氨酰胺转氨酶(40μg)；对照组为单独的五种交联肽(200μM)或单独的六赖氨酸(200μM)，37℃水浴1h后，沸水浴5min终止反应，4℃13000rpm离心15min，取上清液用于LC-MS检测，根据交联肽的消耗量计算其交联转化率。

3.交联转化率测定结果如图2所示。在交联肽添加量为200μM时，谷氨酰胺转氨酶对多肽HWHQYCPY的交联转化率为86.3％，多肽YCSWQYYH的交联转化率为98.75％，多肽YCAYSQPH的交联转化率为64.12％，多肽YCPIDQAY交联转化率为46.06％，多肽HCKQCDPY的交联转化率为88.16％，该结果也证明了mRNA体外展示技术可以有效筛选谷氨酰胺转氨酶的交联肽，揭示了短肽(八肽)水平上谷氨酰胺转氨酶交联时序列的选择性，有望提高谷氨酰胺转氨酶的应用水平。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 新型谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选

<130> 2020

<141> 2020-01-06

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(100)

<223> y is t,u or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(99)

<223> s is g or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(98)

<223> n is a, g, c or t

<400> 1

ttctaatacg actcactata gggacaatta ctatttacaa ttacaatgga ctacaaagac 60

gacgacgata agaagactya ctgsnnsnns nnsnnsnnsy actggtcagc gagctgccat 120

catcatcatc atcatcaccg gctat 145

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttctaatacg actcactata gggacaatta ctatttacaa ttaca 45

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atagccggtg atgatgatga tgatgatggc 30

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

His Trp His Gln Tyr Cys Pro Tyr

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Tyr Cys Ser Trp Gln Tyr Tyr His

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Tyr Cys Ala Tyr Ser Gln Pro His

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Tyr Cys Pro Ile Asp Gln Ala Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

His Cys Lys Gln Cys Asp Pro Tyr

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 9

Tyr Trp Thr Gln Gly Glu Glu Tyr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 10

Tyr Cys Gly Gly Gln Thr Val Tyr

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 11

Tyr Trp Ser Val Gly Gln Met Tyr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 12

His Trp Gly Ala Asn Tyr Gln His

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 13

Tyr Cys Pro Glu Leu Pro Gln Tyr

1 5

Claims

1.通过体外RNA展示技术筛选获得的谷氨酰胺转氨酶交联肽，其特征在于：序列分别为HWHQYCPY、YCSWQYYH、YCAYSQPH、YCPIDQAY和HCKQCDPY，氨基酸缩写对应关系为：组氨酸，H；丝氨酸，S；天冬氨酸，D；半胱氨酸，C；谷氨酰胺，Q；亮氨酸，L；赖氨酸，K；丙氨酸，A；脯氨酸，P；甘氨酸，G；谷氨酸，E；异亮氨酸，I；缬氨酸，V；苏氨酸，T；甲硫氨酸，M；色氨酸，W；酪氨酸，Y；氨基酸序列书写顺序为从N端到C端。