JP4959226B2 - スリーフィンガー様蛋白質ライブラリ - Google Patents
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Description
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリを提供する。
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
をランダム化することができる。ここで,C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域とは,例えば,図15の第1列に示される蛋白質CTx3のアミノ酸配列において,5番目のトレオニンから10番目のプロリンまでの領域をいう。同様に,C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域とは,CTx3のアミノ酸配列において,25番目のリジンから34番目のバリンまでの領域をいい,C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域とは,CTx3のアミノ酸配列において,46番目のアラニンから53番目のヒスチジンまでの領域をいう。
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する複数の蛋白質の群を含む。
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;そして
(d)前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し,ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(d)前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し,転写し,および翻訳することにより,第2の蛋白質ライブラリを製造し,ここで前記第2の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(e)前記第2の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(f)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(g)必要により工程(d)−(f)を繰り返し;そして
(h)選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し,ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(d)前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し;
(e)決定された塩基配列に基づい,一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し,転写し,および翻訳することにより,第2の蛋白質ライブラリを製造し,ここで前記第2の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(f)前記第2の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(g)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(h)必要により工程(d)−(g)を繰り返し;そして
(i)選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号2)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する蛋白質,ならびにこの蛋白質を有効成分として含む,IL−6とIL−6レセプターとの結合の阻害剤を提供する。好ましくは,本発明の蛋白質は,以下のいずれかのアミノ酸配列:
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG(配列番号3);
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG(配列番号4);または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG(配列番号5)
を有する。
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)。
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG(配列番号3);
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG(配列番号4);または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG(配列番号5)
を有する蛋白質がIL−6Rに対して高い親和性を示した。したがって,これら蛋白質は,IL−6とIL−6レセプターとの結合の阻害剤として,種々の疾患の治療に有用であると考えられる。
インビトロウイルス(IVV)法による進化分子工学を用いて,標的と結合しうるスリーフィンガー型のポリペプチドを取得するために,3つのループ領域をランダム化した蛋白質ライブラリ(3F−IVVライブラリ)を作製した。スリーフィンガー様スキャフォールドのシステインのフレームワークは,いくつかの短い神経毒の間で保存されていることが知られている。アセチルコリンレセプターへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む部分およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。ループIのT5−P10(6アミノ酸),ループIIのK25−V34(10アミノ酸)およびループIIIのA46−H52(7アミノ酸)をランダム化した(図2)。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更しなかった。
3F−IVVライブラリ用の全長コンストラクトは,ループ部分のアミノ酸配列をランダム化したCTx3遺伝子の5’側にSP6プロモーター,キャップ部位,Xenopusグロブリン非翻訳配列(UTR)および翻訳開始部位を含むSP6−UTRフラグメントを付加し,3’側にスペーサー(GGGS)2,C−末端His6−タグ,スペーサー(GGGS)およびY−タグ配列を付加するよう設計した(図3)。SP6−UTRはCT3x遺伝子のインビトロ転写および翻訳のために,His6−タグ配列はライブラリの精製のために,Y−タグ配列はmRNAとピューロマイシンリンカーへのライゲーションのために,それぞれ付加されている。
F1: 5'-CGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGGGAGGTTCACTTGTATGTTACACA(NNS)6CCTCCTG GAACCTTAGAGACTTG-3' (配列番号32)
F2: 5'-ACGCATGAGAACAATACTGGGTAAC(SNN)10TTTTTTAACACATGTGAAATCATCTGGACAA GTCTCTAAGGTTCCAGG-3' (配列番号33)
F3: 5'-TCCGTTGCATTTGTCTGTTTGGCAACA(SNN)7AAACTCATAGGACGCCGGTATCGCACACGC ATGAGAACAATACTGGGT-3' (配列番号34)
F4: 5'-tttccccgccgccccccgtcctTGAGCCACCTCCAGAACCACCGCCATGGTGGTGATGATGGTGAGACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCTCCGTTGCATTTGTCTGTTTGG- 3' (配列番号35)
SP6−UTR: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACG CTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3' (配列番号36)
工程1 最初の3つのフラグメント(ランダム化配列を含む)のPCRによりF1−F2−F3を生成する。
工程2 F1−F2−F3とF4とのPCRによりF1−F2−F3−F4を生成する。
工程3 SP6−UTRとF1−F2−F3−F4とのPCRにより全長コンストラクトを生成する。
次に,上述で得られた全長コンストラクトを直接配列決定してループ領域のランダム化の程度を評価した。図5に示されるように,ランダム化ヌクレオチド(ループに対応)は,非ランダム化ピークと比較して短いピークを有していた。ランダム化部分における短いピークは,種々のヌクレオチドが種々のDNAコピーの同じ位置に存在するための不適切なシグナルによるものであり,一方非ランダム化部分においてはDNAのすべてのコピーに単一のヌクレオチドが存在して,鋭い明確なピークを与える。このことは,コンストラクト中にランダム化部分が首尾良く挿入されたことを示す。
IVVは,リボソーム上の発生しつつあるペプチドと,これをコードするmRNAとがピューロマイシンを介して結合している複合体である。IVVを形成するためのピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を図6に示す。ビオチン・ループの3’末端は,ライゲーションしたmRNAからの逆転写の際のプライマーとして機能する。ビオチンは,IVVの精製のために用い,制限酵素部位におけるDNAの切断により,IVVを回収することができる。
Puro-F-S:5’-(S)-TC(F)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-CC-(Puro)-3’
ビオチン・ループ:5’-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC(T-B)CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3’(配列番号37)
(S)は5’−チオール−モディフィアーC6,(F)はフルオレセイン−dT,(Puro)はピューロマイシンCPG,(Spc18)はスペーサーホスホルアミダイト18,(T)はアミノ−モディフィアーC6dT,(T−B)はビオチン−dTを表す。すべての修飾ホスホルアミダイト試薬はGlen Research(Sterling,VA,USA)から購入した。
ランダム化CTx3遺伝子の全長コンストラクトDNAを94℃に加熱し,ゆっくり冷却することによりアニーリングさせて,適切に塩基対形成した二本鎖DNAを形成した。テンプレートDNAを,Ribo MAX大量合成システム(Promega,Madison,USA)を用いて,SP6RNAポリメラーゼにより転写させて,mRNAを生成した。DNaseIを加えることにより反応を停止させ,フェノール/クロロホルム法により精製した。RNA濃度は分光光度計により260nmで測定した。
mRNAのYタグ配列をリンカーにアニーリングさせ,ライゲーション部位でT4 RNAリガーゼによりライゲーションさせて,mRNAとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとを結合させた。mRNAは,1xリガーゼバッファ(Takara,Japan)中で94℃に加熱し,ゆっくり冷却することにより,Y−タグ配列を介してピューロマイシン・ビオチン・リンカー(1:1比)とアニーリングさせた。T4キナーゼおよびT4RNAリガーゼ(Takara,Japan)を加え,25℃で1時間反応させることにより,mRNAとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとをライゲーションさせた(図6B)。生成したmRNA−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは,RNeasyキット(Qiagen)を用いて精製した。ライゲーション効率および生成物の純度はポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
mRNA−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを,Rectic Lysate IVT Kit(Ambion,Texas,USA)を用いて30℃で10分間翻訳させた。翻訳後,65mM MgCl2および750mM KClの存在下で37℃で2時間インキュベートすることにより,mRNA−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質の複合体を形成させた。この複合体をビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して精製し,続いてM−MLV逆転写酵素(Takara,Japan)反応により,DNA/RNAハイブリッドを形成した。次に,DNA/mRNA−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質を制限酵素PvuIIで消化することにより,ビオチン−ストレプトアビジン複合体から切断した。得られたDNA/mRNA−ピューロマイシン−蛋白質を,C−末端His6−タグを利用してNi−NTA磁気ビーズ(Qiagen)により精製し,Beacon2000(Panvera,Wisconsin,USA)により定量した。以上のようにして,3F−IVVライブラリを形成した。推計サイズ1×1011の分子が得られ,これを以後の実験においてIL−6R結合蛋白質の選択の出発物質として用いた。
初代3F−IVVライブラリのアフィニティーを固定化IL−6RおよびCTx3の天然のリガンドであるAChBPに対する結合アッセイにより調べて,ライブラリの質を評価した。等量の3F−IVVライブラリを250nMの固定化IL−6RまたはAChBPとともにPBS中で室温で30分間インキュベートした。PBS−Tで数回洗浄した後,結合した物質を溶出し,PCR増幅し,ゲル電気泳動により分析した。PCRプライマーの配列は以下のとおりである:
PCR-フォワード: 5'-GAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCT-3' (配列番号38)
PCR-リバース: 5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3' (配列番号39)
3F−IVVライブラリの出発量の1/50および1/250の希釈物を用いたPCR産物も同様にゲル電気泳動して,シグナル強度の比較により,IL−6に結合した3F−IVVライブラリのパーセントを求めた。
上述のようにして構築した3F−IVVライブラリを用いて,新規なIL−6Rの結合分子および/または阻害分子の発見を試みた。選択圧を順次高くする条件下で,3F−IVVライブラリの生成と選択との一連のラウンドを繰り返すことにより,IL−6Rに結合する蛋白質を選択した。
IL−6RをアミンカップリングによりNHS活性化セファロース4 Fast Flow(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)に固定化した。同様にして,IL−6RなしのIL−6R(−)誘導化セファロース4 Fast Flowビーズを同時に調製した。カップリング効率は,初期および未結合レセプターの吸光度を280nmで測定することにより評価した。
3F−IVVライブラリからIL−6Rに結合する分子を選択した。選択の各ラウンドは,IL−6R(−)誘導化およびIL−6R誘導化セファロースビーズを用いて,100mMNaClおよび0.1%Tween−20を含むPBS中でバッチ選択モードで行った。
ラウンド10のIVVプール(R10プール)のIL−6Rに対する結合能力および特異性を評価するために,種々の条件下で結合分析を行った。結果を図9に示す。図中,1/50は出発量の50倍希釈を示し,1/250は250倍希釈を示し,1/1は希釈なしを示す。R10プールは,非誘導化セファロース(ダミービーズ)について無視しうるアフィニティー(〜0.2%)を示したが,IL−6Rセファロースには有意に結合した(〜2%)。このことは,このプールがR10プールとIL−6Rとの間のアフィニティーにより濃縮されたことを示す(図9−1,2)。
R10プールをクローン化し,無作為に選択した20個のクローンの一次配列を決定してアライメントにより分析した。3つのループ配列は異なるが,残りの配列はほぼ同一であった。Rはラウンドを示し,10は10番目のラウンドを示し,続く数字はクローン番号を示す。配列の分析により,プールはループ配列の類似性に基づいて5つのグループに分けることができた(図10)。ほぼ同一の配列を含むクローンの組をグループIとしてグループ化し,これは配列決定されたクローンの70%を占めた。グループIIおよびIIIがこれに続き,それぞれ約10%を含み,グループIVおよびVはそれぞれ約5%を含んでいた。非ランダム化配列は数個の変異を除いてほとんど変化していなかった。わずかの変異の存在は,おそらくはライブラリが650サイクルのPCRに供されたためにポリメラーゼのプルーフリーディングに失敗があったためであろう。
得られたIL−6R結合蛋白質についてさらに詳細に調べるために,クローンR10−15から蛋白質を調製した。蛋白質は,pBAD/TOPOThio融合発現キット(Invitrogen,Carlsbad)を用いてチオレドキシン融合蛋白質として調製した。また,対照実験において用いるためにチオレドキシンも調製した。プールのクローン化DNAをPCR増幅し(C−末端His6−タグをコード),pBAD/TOPOThio融合発現ベクター中にクローニングし,大腸菌をトランスフォームした。配列決定によりフレームの確認を行った。
精製した蛋白質を7,70および700nMの濃度で,1xPBS中で1μMビオチン化IL−6Rとともに室温で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを混合物に加え,さらに15分間インキュベートした。ビーズをPBS−T(Tween0.1%)で数回洗浄し,溶出し,抗His抗体(Penta..HisHRP,Qiagen)およびECL検出システム(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)を用いて,ウエスタンブロッティングによりペプチドのHis6−タグについて分析した。バックグラウンドをモニターするために,蛋白質のSAビーズに対するアフィニティーも測定した。
融合ペプチドの結合アフィニティー(Kd)は,Friguetら(Friguet, B., Chaffotte, A. F., Djavadi-Ohaniance, L. and Goldberg M. E. (1985), J. Immunol. Methods., 77, 305-319)に記載の方法にしたがい,いくつかの改変を加えて測定した。PBS中の一定量のペプチド(50nM)を種々の量のIL−6R(1nM−1μM)とともに,平衡に達するまでインキュベートした。また,チオレドキシンもアッセイしてバックグラウンドをモニターした。混合物を一定量の固定化IL−6R(200nM)に加え,さらに30分間インキュベートした。PBS−Tで数回洗浄した後,固定化IL−6Rに結合したペプチド(すなわち,可溶性IL−6Rに結合しない)を溶出し,抗His抗体(Penta..HisHRP,Qiagen)およびBio−rad Chemicdoc(Bio−rad,Hercules,USA)のECL検出システムを用いて,ウエスタンブロッティングによりペプチドのHis6−タグについて分析した。シグナルはデンシトメトリによりBio−rad Quantity Oneソフトウエアを用いて定量した。結果を図12に示す。検出シグナルは,可溶性レセプター濃度の増加にともなって減少し,このことは,ペプチドの可溶性レセプターへの結合は濃度依存的であることを示す。Graph Pad Prism 4(GraphPad software Inc.,SanDiego,USA)を用いてシグナル強度(Y−軸)を可溶性IL−6R濃度(X−軸)に対してプロットし,非線形回帰曲線への当てはめにより解離定数を計算した。その結果,R10−15について解離定数115nMを得た。この範囲の解離定数での相互作用は非常に強く,イムノグロブリンに匹敵する。このことは,本発明にしたがう3F−IVVライブラリから未知の高分子標的に対して強く結合する分子を取得することが可能であることを実証する。同様にして、ペプチドR10−13およびR10−14の解離定数を求めたところ、それぞれ100nMおよび55nMであった。
競合阻害実験によりペプチドR10−15によるIL−6とIL−6Rとの相互作用の阻害をアッセイした。一定量のビオチン化IL−6(45nM)および種々の量のペプチド(1nM−2μM)を一定量の固定化IL−6R(350nM)とともにインキュベーションして,IL−6Rについて競合させた。IL−6の濃度は,予め間接結合法により決定したIL−6Rの解離定数(20nM)の約2倍高い45nMと設定した。数回の洗浄の後,生成物を溶出してビオチン化IL−6(阻害分析用)およびHis6−タグペプチド(結合分析用)について,ウエスタンブロッティングおよびECL検出システムにより分析した。グラフは上述のようにしてプロットした。
100nMのペプチドR10−15を1μMの種々の可溶性蛋白質(IL−6R,AChBPおよびIgG)とともに室温で1時間インキュベーションした。混合物をさらに300nMのIL−6Rセファロースとともに1時間インキュベーションして,未結合蛋白質を捕捉した。よく洗浄した後に溶出し,ウエスタンブロッティングによりペプチドのHis6−タグについて分析した。結果を図14に示す。IL−6Rのレーンは弱いバンドを含むが,AChBPおよびIgGは強いバンドを含み,このことは,R10−15がIL−6Rに特異的に結合するがAChBPおよびIgGには結合しないことを示す。
Claims (15)
- スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリ。 - 前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している,請求項1記載の蛋白質ライブラリ。
- 前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している,請求項2記載の蛋白質ライブラリ。
- 前記蛋白質ライブラリが,以下のアミノ酸配列:
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する複数の蛋白質の群を含む,請求項1−3のいずれかに記載の蛋白質ライブラリ。 - 請求項1−4のいずれかに記載の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリ。
- 標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって,
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;そして
(d)前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する,
の各工程を含む方法。 - 工程(a)の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており,蛋白質のアミノ酸配列を決定する工程(d)が,その蛋白質に結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる,請求項6記載の方法。
- 前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している,請求項7記載の方法。
- 前記蛋白質ライブラリが,以下のアミノ酸配列:
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである,請求項6−8のいずれかに記載の方法。 - 標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって,
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し,ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(d)前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し,転写し,および翻訳することにより,第2の蛋白質ライブラリを製造し,ここで前記第2の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(e)前記第2の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(f)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(g)必要により工程(d)−(f)を繰り返し;そして
(h)選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する,
の各工程を含む方法。 - 前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している,請求項10記載の方法。
- 前記蛋白質ライブラリが,以下のアミノ酸配列:
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである,請求項10または11に記載の方法。 - 標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって,
(a)スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって,以下の領域:
(i)C1−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2−CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域;
(ii)C3−CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4−CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域;および
(iii)C5−CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6−CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し,ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(b)前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(c)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(d)前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し;
(e)決定された塩基配列に基づいて,一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し,転写し,および翻訳することにより,第2の蛋白質ライブラリを製造し,ここで前記第2の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており;
(f)前記第2の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ;
(g)前記標的と結合した蛋白質を選択し;
(h)必要により工程(d)−(g)を繰り返し;そして
(i)選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する,
の各工程を含む方法。 - 前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が,ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している,請求項13記載の方法。
- 前記蛋白質ライブラリが,以下のアミノ酸配列:
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG(配列番号1)
(式中,Xは任意のアミノ酸残基である)
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである,請求項13または14に記載の方法。
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