HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet: Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein die
Zubereitung menschlicher Blutplasmaproteine und insbesondere die
Zubereitung von α&sub1;-Antichymotrypsin (ACT) aus einer Mischung aus ACT, α&sub1;-
Proteinase-Inhibitor (PI) und aus Antithrombin-III (AT-II) wie aus
derjenigen, die in einer Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension vorliegt, die
aus Humanplasma (menschlichem Plasma) erhalten wird.
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Stand der Technik: Vor dem zweiten Weltkrieg haben Wissenschaftler
und Ärzte herausgefunden, dass Humanplasma in einer Blutersatz-Therapie
angewandt werden konnte. Während des Krieges bedeuteten die Schwierigkeiten
im Zusammenhang mit Nachschub und Lagerung von Gesamtblut und Plasma, dass
ein Schlachtfeld-Schock nicht so wirksam wie möglich behandelt werden
konnte. Der Bedarf an Plasmaproteinen, die gelagert und am Schlachtfeld
angewandt werden konnten, führte Cohn und andere (US 2 390 074 (1945) und
J. Amer. Chem. Soc. 68, S. 459 (1946)) dazu, dass sie herausfanden, dass in
Plasma vorhandene Proteine durch selektive Fällung in der Gegenwart
wasserlöslicher organischer Lösungsmittel oder von Neutralsalzen
fraktioniert werden konnten. Bezüglich einer Übersicht der Plasma-
Fraktionierung siehe: "The Plasma Proteins", 2. Ausgabe, Band III, S. 548-
550, Academic Press, New York, N. Y. (1977). Die konzentrierten Protein-
Mischungen konnten dann den Patienten je nach Bedarf verabreicht werden.
War beispielsweise übermäßiges Bluten das Problem, konnte der Arzt eine
Fibrinogen-angereicherte Fraktion spritzen. Litt der Patient an
Verbrennungen oder einer anderen traumatischen Verletzung, bei denen der
Verlust von Plasma denjenigen der roten Blutzellen übertraf, konnte der
Arzt Albumin, den kolloid-osmotischen Regulator von Plasma, anwenden.
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Bei einer Cohn-Fraktionierung wird Ethanol zum Plasma gegeben, und es
wird der pH-Wert bei Unter-Null-Temperaturen abgesenkt, um Protein selektiv
auszufällen. Nach Abtrennung des Niederschlags vom Überstand werden der pH-
Wert des Überstands abgesenkt und/oder mehr Alkohol zugegeben, um eine
weitere Fraktion auszufällen.
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Auch heute wird dieses Fraktionierungsverfahren noch angewandt, um
biologisch aktive Proteine abzutrennen, die gewisse therapeutische
Eigenschaften besitzen. Beispielsweise sind Faktor-VIII oder Anti-
Hämophilie-Faktor geeignet gegen Hämophilie; Plasminogen, ein Vorläufer von
Plasmin, wird zur Behandlung akuter thromboembolischer Störungen angewandt;
γ-Globuline einschließlich Immunoserumglobulin und intravenöses γ-Globulin
werden zur Behandlung von angeborenem γ-Globulinmangel, Masern,
Poliomyelitis und Hepatitis A und B herangezogen; Fibronectin hat sich als
wirksam bei Behandlung von Verbrennungen, Schock, Krebs usw. erwiesen;
Antithrombin-III ist ein Koagulationsinhibitor; Kryopräzipitat selbst kann
direkt bei klassischer Hämophilie angewandt werden; Plasma-Protein-Fraktion
und Albumin eignen sich bei Behandlung von Schock wegen Verbrennungen,
Quetschverletzungen, Magennotfällen und weiterer Traumata, welche einen
hauptsächlichen Verlust von Plasmaflüssigkeiten, aber nicht von roten
Zellen erzeugen; und α&sub1;-Proteinaseinhibitor kann zur Behandlung von
Emphysemen verwendet werden.
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Human-α&sub1;-Antichymotrypsin (ACT) ist ein Serin-Protease-Inhibitor,
der, bisher, nur aus Humanplasma oder Serum isoliert worden ist. Obwohl die
genaue biologische Funktion von ACT noch nicht ermittelt worden ist,
scheint es ein multifunktionelles Protein zu sein, und seine Verwendung für
verschiedene Therapien ist vorgeschlagen worden (siehe z. B. US 5 008 242
von J. Lezdey et al.)
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Es gibt Belege dafür, dass eine wichtige Funktion von ACT die
Inhibierung von Proteasen ist, wie von Chymotrypsin-artiger Protease,
Mastzellen-Chymase, Leukozyt-Cathepsin G (siehe Beatty K., Bieth J., Travis
J.: Kinetic of association of serine proteinases with native and oxidized
α&sub1;-proteinase inhibitor and α&sub1;-antichymotrypsin, J. Biol. Chem. 1980,
255: 3931-3934) und von pankreatischer Elastase (siehe Laine A., Davril M.,
Rabaud M. et al.: Human serum α&sub1;-antichymotrypsin is an inhibitor of
pancreatic elastases, Eur. J. Biochem. 1985, 151: 327-331, und Davril M.,
Laine A., Hayem A.: Studies on the interactions of human pancreatic
elastase 2 with human α&sub1;-proteinase inhibitor and α&sub1;-antichymotrypsin,
Biochem. J. 1987, 245: 699-704).
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Die biologischen Eigenschaften intakter, gespaltener und
komplexierter Formen von ACT zeigen, dass der Proteolytik-Charakter des
Proteins eine wirksame Rolle zur therapeutischen Steuerung infektiöser
Krankheiten, von Pankreatitis, Lungenkrankheiten und Hautentzündungen zu
spielen vermag (siehe Rubin H.: The biology and biochemistry of
antichymotrypsin and ist potential roles as a therapeutic agent, Biol.
Chem. Hoppe-Sayler 1992, 373(7): 497-502).
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J. Travis et al. reinigten ACT zur Homogenität aus einem
Humanplasmavorrat (Travis J., Garner D., Bowen J.: Human α&sub1;-
antichymotrypsin: purification and properties, Biochemistry 1978; 17: 5647-
5651).
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T. Katsunuma und seine Kollegen reinigten ein DNA-Bindungsprotein,
das für einen Tumor-Marker gehalten wurde, zur Homogenität (Katsunuma T. et
al.: Purification of a serum DNA binding protein (64DP) with a molecular
weight of 64000 and ist diagnostic significance in malignant diseases,
Biochem. and Biophys. Res. Comm. 93(2): 552-557 (1980)). Später hat sich das
DNA-Bindungsprotein als ACT erwiesen. Katsunuma setzte Humanserum als das
Ausgangsmaterial ein. Zuerst eluierten sie 64 DP aus DEAE-Sephadex mit 225
mM NaCl. Nach Dialyse wurde das 64 DP an DNA-Cellulose weiter gereinigt.
Schließlich wurde, um Homogenität zu erreichen, 64 DP mit Ammoniumsulfat
ausgefällt und von kontaminierenden Proteinen an einer
Größenausschlusssäule abgetrennt.
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Zusätzlich zur Abtrennung und Gewinnung aus Gesamtplasma ist Human-
ACT kloniert, sequenziert und in Escherichia coli exprimiert worden (siehe
Rubin H. et al.: Cloning, expression, purification and biological activity
of recombinant native and variant human antichymotrypsins, J. Biol. Chem.
1990, 265: 1199-1207). Rubin et al. verwendeten eine Sepharose-Fast-Q-Säule,
um ACT-Aktivität aus dem Rohbakterienlysat abzutrennen. Das teilweise
gereinigte ACT wurde dann an DNA-Cellulose adsorbiert und in 350 bis 400 mM
KCl eluiert.
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Wegen der potenziellen Verwendungen von ACT besteht nun ein Bedarf
nach wirksameren Wegen und Möglichkeiten zur Herstellung und Zubereitung
großer Mengen von ACT aus Humanplasma, insbesondere aus Plasma-Fraktionen,
die auch noch verschiedene Mengen an PI und AT-III enthalten.
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In unerwarteter Weise ist nun herausgefunden worden, dass ACT aus
Cohn-Fraktion-IV-1 gereinigt werden kann. Fraktion-IV-1 enthält viele
verschiedene Proteine, und Schwierigkeiten bei deren Abtrennung verhindern
in den meisten Fällen eine kommerzielle Nutzung dieser Plasma-Fraktion.
Abtrennung und Gewinnung von ACT würden daher eine vorteilhafte Nutzung
dieser ansonsten weniger genutzten und im Normalfall verworfenen Plasma-
Fraktion darstellen.
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Verglichen mit Humanserum, enthält Cohn-Fraktion-Paste-IV-1 höhere
Konzentrationen an Proteinen wie PI und AT-III, die nahe verwandt mit ACT
sind, und von denen zu erwarten wäre, dass sie mit ACT mitgereinigt werden.
Beim Fraktionierungsverfahren mit IV-1-Paste wird ACT nur auf das 1- bis 2-
Fache konzentriert, während PI auf das 3- bis 10-Fache und AT-III auf das
2- bis 3-Fache konzentriert werden. Die Konzentration der Proteine in der
IV-1-Paste betragen 30 mg PI/g Paste, 5 mg AT-III/g Paste und 5 bis 10 mg
ACT/g Paste. Angesichts der Schwierigkeiten beim Abtrennen von ACT von
diesen weiteren Proteinen und seines Status als geringere Komponente würde
es für unwahrscheinlich gehalten werden, dass Fraktion-IV-1-Paste eine
geeignete Quelle von ACT wäre. In überraschender Weise ist es nun gelungen,
2 bis 3 g ACT in einer Reinheit von ≥ 90% aus annähernd 2,9 kg IV-1-Paste
unter Anwendung einer modifizierten Form des Verfahrens von Katsunuma et
al. abzutrennen und zu gewinnen.
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Zusätzlich zu dessen dargelegter Verwendung als ein in vitro-Serin-
Protease-Inhibitor (beispielsweise kann es als Reagens für PI-
Untersuchungen herangezogen werden), wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung vorgeschlagen, auf welche Weise ACT von wirksamen therapeutischen
Nutzen sein kann. Pharmazeutische Zubereitungen können erhalten werden,
indem ACT mit einem geeigneten Trägermittel abgemischt wird, und es können
die üblichen Zubereitungen in bekannter Weise hergestellt werden. Details
der entsprechenden Erkenntnisse werden nun offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von menschlichem
α&sub1;-Antichymotrypsin (ACT) aus einer Lösung, die auch α&sub1;-Proteinase-Inhibitor (PI)
und Antithrombin-III (AT-III) enthält, umfasst die Stufen, in denen man
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(A) die ACT enthaltende Lösung mit einem Ionenaustauschharz bei
einer Leitfähigkeit (Ionenstärke) und bei einem pH-Wert in Kontakt bringt,
welche hinreichen, ACT zu adsorbieren,
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(B) das Adsorbens mit einer Lösung wäscht, die einen pH-Wert und
eine Leitfähigkeit aufweist, die hinreichen, um im wesentlichen alles an PI
und AT-III, aber nicht das adsorbierte ACT zu entfernen, und man
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(C) das ACT aus dem Harz eluiert.
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In einer bevorzugten Ausführungsform folgen auf die Stufe (C) weitere
Reinigungsstufen, in denen man die Eluat-Lösung von Stufe (C) mit DNA-
Cellulose unter Bedingungen und bei einem pH-Wert in Kontakt bringt, die
hinreichen, ACT zu adsorbieren; und man dann das ACT aus der DNA-Cellulose
eluiert.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das ACT aus einer
Suspension von Cohn-Fraktion-IV-1-Paste hergestellt und zubereitet, welche
eine wässrige Lösung des ACT, PI und AT-III enthält, die eine Leitfähigkeit
von 1,0 bis 2,5 (mOhm/cm)&supmin;¹ (mmho/cm) und einen pH-Wert von ca. 6,45 bis
6,55 aufweist. Das ACT wird in der Stufe (A) durch Chromatografie an einem
Anionaustauschharz (d. h. DEAE-Sepharose®) bei einem pH-Wert von ca. 6,5
gereinigt, worauf die DEAE-Sepharose® mit einer Wasch-Lösung, die einen pH-
Wert von ca. 6,5 und eine Leitfähigkeit von 7,4 bis 7,8 (mOhm · cm)&supmin;¹
aufweist, gewaschen und das ACT bei einem pH-Wert von ca. 6,5 und einer
Leitfähigkeit von 9 bis 10,5 (mOhm · cm)&supmin;¹ eluiert werden. Schließlich wird
das Ganze bei einem pH-Wert von 6,8 an DNA-Cellulose adsorbiert, bevor das
ACT endgültig eluiert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1 ist ein verallgemeinertes Fließschema, das zeigt, wie das
bevorzugte Ausgangsmaterial (Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension) aus
Humanplasma fraktioniert wird.
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Fig. 2 ist ein Fließschema, das die bevorzugten Stufen des
vorliegenden ACT-Reinigungsverfahrens zeigt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
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Gereinigtes α&sub1;-Antichymotrypsin, α&sub1;-Antiproteinase-Inhibitor und
Antithrombin-III aus Humanplasma, Kaninchen-Antikörper zu Human-ACT und
Human-Neutrophil-Cathepsin G wurden von Athens Research, Athens, Georgia,
gekauft. DNA-Cellulose (5 ml) wurden von Pharmacia Inc. gekauft. Native
Kalbthymus-DNA und mit dem Cellulose-Verfahren hergestellte DNA-Cellulose-
Zubereitung, Succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilid und Rinder-Chymotrypsin
wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, gekauft. Cohn-Fraktion-IV-1
wurde von Miles Inc. erhalten. DEAE-Sepharose® ist als ein in Perlenform
vorliegendes Agarose-Anionaustauschmaterial eine eingetragene Marke von
Pharmacia Inc..
DNA-CELLULOSE-ZUBEREITUNG FÜR ANREICHERUNGSVERFAHREN
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DNA-Cellulose (3 L) wurde gemäß dem Verfahren von Litman hergestellt
(siehe Litman R. M.: A deoxyribonucleic acid polymerase from Micrococcus
lutens (Micrococcus hysodeikticus) isolated on deoxyribonucleic
acidcellulose, J. Biol. Chem. 1968; 243: 6222-6233). Cellulose (1 kg) wurde 10
min lang mit 1 N HCl (15 L) gewaschen, mit Wasser gespült und an der Luft
getrocknet. Natives Kalbthymus (16 g) wurde mit Cellulose (1 kg) in 8 L 10
mM NaCl vermischt. Die klumpige Mischung wurde ausgebreitet und unter einem
Belüfter 3 bis 5 h lang getrocknet und schließlich über Nacht im Freien
stehengelassen. Die trockene Matrix wurde zerkleinert und in Ethanol
resuspendiert. Die Aufschlämmung wurde dann mit einer UV-Lampe bestrahlt,
um Vernetzungen zur Cellulose zu bilden.
REINIGUNG VON HUMAN-ACT
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Cohn-Fraktion-IV-1-Paste, ganz allgemein hergestellt gemäß dem
Fraktionierungsverfahren von Cohn et al., J. Amer. Chem. Soc. 1948; 68: 459,
enthaltend ACT, PI und AT-III, wurde in 24 Volumina 0,01 M Tris, pH = 9,3,
suspendiert und bei 40ºC 1 bis 1 1/2 h lang erwärmt. Die Fraktion-IV-1-
Pastensuspension wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt (70 Liter) und
auf eine 30 kg DEAE-Sepharose®-Säule gegeben. Die DEAE-Säule wurde mit 1
Säulenvolumen von 25 mM NaKPO&sub4;, ph = 6,5, äquilibriert und über Nacht mit
mehr als 10 Säulenvolumina von 75 mM NaKPO&sub4;, pH = 6,5, 1 mM EDTA,
gewaschen, um eine stabile Basislinie zu ergeben. Das teilgereinigte ACT
wurde mit 3 bis 5 Volumina 100 mM NaKPO&sub4;, pH = 6,5, eluiert. Das 100 mM
NaKPO&sub4;-Eluat wurde gegen 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;, ph = 6,8 (Leitfähigkeit: 1-2 (mOhm
· cm)&supmin;¹), in einer PM-10-Kartusche von 3 Quadratfuß
ultrafiltriert/diafiltriert und als Charge mit der DNA-Cellulose (3 L) im
Fass der DNA-Säule 90 min lang in Kontakt gebracht. Die Säule wurde von
unten nach oben mit 85 mM NaCl in einem Wasch-Puffer von 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;, 1 mM
EDTA, pH = 6,8 (Leitfähigkeit: 8 bis 9 (mOhm · cm)&supmin;¹) über Nacht gewaschen.
Nach Erreichen eines stabilen Effluens mit A&sub2;&sub8;&sub0; von 0,03 wurde die Säule von
unten nach oben mit 330 mM NaCl in einem Elutions-Puffer von 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;,
1 mM EDTA, pH = 6,8, eluiert. Das Eluat wurde bei -70ºC in gleichen
Mengenanteilen eingefroren.
ENZYM- UND INHIBITOR-AKTIVITÄTSASSAY VON ACT
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Die Esterspaltungsaktivität von Human-Neutrophil-Cathepsin G und
Rinder-Chymotrypsin wurde mit Succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilid als
Substrat gemessen (siehe DelMar, E. G., Largman C., Broderick J. W, et al.: A
sensitive new substrate for chymotrypsin, Anal. Biochem. 1979; 99: 316-329).
Die Inhibitoraktivität wurde gemessen, wobei eine festgelegte Menge von
Enzym (Cathepsin G/Chymotrypsin) mit verschiedenen Mengen von ACT vermischt
wurde. Nach Inkubation über 5 min bei 25ºC wurden die Mischungen bezüglich
der Esterspaltungsaktivität analysiert. Ein Extinktionskoeffizient von 6,2
(1%-ige Lösung, 280 nm), bestimmt mit gereinigtem Inhibitor, wurde zur
Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt (siehe Babul J., Stellwagen
E.: Measurement of protein concentration with interferences optics, Anal.
Biochem. 1969; 28: 206-221). Die spezifische Inhibitoraktivität wurde als
das Verhältnis der Inhibitoraktivität pro Proteinkonzentration ausgedrückt.
ANTIGENE AKTIVITÄT VON ACT, BESTIMMT MIT RID UND ELISA
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Die antigene Aktivität des ACT wurde mit einem
Radialimmunodiffusionskit (RID) (San Diego CA) von der Bindungsstelle aus
bestimmt. Die antigene Aktivität wurde auch mit einem Enzym-gebundenen
Immunosorbensassay (ELISA) bestimmt. Gereinigter ACT-Standard in einem
Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10 ng/ml oder gereinigte ACT-
Zubereitungsproben wurden mit mit Kaninchen-Antikörpern zu ACT überzogenen
Platten gefangengehalten. Ein biotinylierter Kaninchen-Antikörper zu ACT
wurde zu den Platten gegeben, dann erfolgte eine Inkubation mit
Peroxidasekonjugiertem Streptavidin und Substrat (Tetramethylbenzidin) zum Nachweis
der Aktivität. Die spezifische antigene Aktivität wurde als das Verhältnis
von antigener Aktivität pro Proteinkonzentration gemessen.
ANTIGENE AKTIVITÄT VON PT, BESTIMMT MIT ELISA
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Die antigene Aktivität von PI wurde mit einem Enzym-gebundenen
Immunosorbensassay (ELISA) bestimmt. Ziegen-Anti-Human-α&sub1;-Antiproteinase-
Inhibitor (Cappel, NC) wurde als Überzugsantikörper verwendet. Gereinigter
PI (Athens Research), gereinigte ACT-Zubereitungsproben oder
lyophilisierter Plasma-Standard von 1,3 mg/mL in einem
Konzentrationsbereich von 0,78 bis 25 ng/mL wurden mit mit Ziegen-Anti-
Human-α&sub1;-Antiproteinase-Inhibitor überzogenem Antikörper gefangengehalten.
Peroxidase-konjugierter Ziegen-Anti-Human-α&sub1;-Antiproteinase-Inhibitor wurde
zu den Platten gegeben, dann erfolgte eine Inkubation mit Substrat
(Tetramethylbenzidin) zum Nachweis der Aktivität. Proben wurden mit einer
Absorption/Antigenkonzentration-Standardkurve verglichen.
Enzym- und Inhibitoraktivitätsassay von AT-III (Antithrombin-III)
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Dies ist ein zweistufiges Assayverfahren, wobei ein Plasma-Standard
oder eine Konzentration bekannter AT-III-Aktivität und entsprechende Proben
in Heparin enthaltendem Puffer verdünnt und mit Rinderthrombin inkubiert
werden (Stufe I). Chromogenes Substrat S-2238 (H-D-Phenylalanyl-L-
pipecolyl-L-arginin-p-nitroanilin · 2 HCl, Chromogenix AB, Schweden) wird
dann zugegeben, und man hydrolysiert mit überschüssigem Thrombin, das durch
AT-III nicht inhibiert worden ist, worauf freigesetztes p-Nitroanilid bzw.
dessen Absorption bei 405 nm quantitativ bestimmt werden. Die AT-III-
Konzentration ist umgekehrt proportional zum Grad der Hydrolyse
(Absorption) gemäß Messung der Absorption bei 405 nm.
SDS-PAGE UND WESTERN BLOTTING
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Analytische Elektrophorese wurde an Tris-Glycin in 8 bis 16%
Polyacrylamid-Gradient-Plattengelen (verkauft von Novex System, San Diego,
CA) unter Verwendung des Gel-Puffersystems von Novex, enthaltend Tris-
Glycin, 0,1% SDS, pH = 8,3, durchgeführt. Gereinigter ACT-Standard und
Probenzubereitungen wurden in Proben-Puffer, enthaltend Tris-Glycin, 2% SDS
und 10% β-Mercaptoethanol, 10 Minuten lang in siedendem Wasser zubereitet.
Molekulargewicht-Elektrophorese-Kalibrations-Kits von Novex Systems wurden
zur Moekulargewichtsbestimmung verwendet. Die Proteine wurden mit
Coomassie-Brilliant-Blau G-250 nachgewiesen. Western Blotting wurde aus Gel
gegen eine Nitrocellulose-Membran durchgeführt, und es wurde der Nachweis
mit Kaninchen-Antiseren zu Human-ACT und Alkaliphosphat-konjugiertem
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG durchgeführt.
HPLC-ANALYSE
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ACT-Standard von Athens Research und gereinigtes ACT aus dem
Anreicherungsverfahren wurden an TSK 3000 SW mit 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,15 M
NaCl, pH = 6,5, als die bewegliche Phase analysiert.
ERGEBNISSE
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Zur Herstellung von Human-ACT wurde Cohn-Fraktion-IV-1-
Pastensuspension als Ausgangsmaterial eingesetzt. Fraktion-IV-1-Paste
enthält ungefähr die folgenden Mengen mg/g Paste der drei Proteinase-
Inhibitoren: α&sub1;-Proteinase-Inhibitor (PI) mit 30,0; ACT mit 5 bis 10,0,
bestimmt durch antigenen Aktivitäts-ELISA und AT-III mit 5,0, gemessen
durch Enzym-Inhibitoraktivität. ACT-Reinigung durch PEG-Fällung, S-
Sepharose®- und Q-Sepharose®-Chromatografie war ungünstig, da sich keine
Verbesserung bezüglich der Reinheit ergab. Ammoniumsulfat-Fraktionierung,
Chelatier-Säulen und Cibachrome Blau®-Säule für das Reinigungsverfahren
waren ungeeignet wegen geringer Ausbeute und geringer Reinheit von ACT.
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Bei Einsatz von Fraktion-IV-1-Pastensuspension (20733-91-1) in 0,01 M
Tris, pH = 6,5, bei niedriger Leitfähigkeit (1,0 bis 2,5 (mOhm · cm)&supmin;¹) an
DEAE-Sepharose® waren mehr als 91% Gesamtprotein in der Durchflussfraktion
(20767-36-1 und -2) mit 0,025 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5, und in der Waschfraktion
(20767-36-3) mit 0,075 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5, vorhanden (Tabelle 1).
Tabelle 1
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Mehr als 50% ACT eluierten bei 0,1 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5 (20767-36-4 und
-5), und es gab einen 7-fachen Anstieg der spezifischen ACT-Aktivität.
Allerdings ergab das Aufgeben der Fraktion-IV-1-Pastensuspension in 0,01 M
K&sub2;HPO&sub4;, pH = 6,8, direkt auf eine DNA-Cellulose-Säule (5 ml) nur eine 10%-
ige Gewinnungsausbeute bei einem 4- bis 10-fachen Anstieg bei der Reinheit
nach Elution mit 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;, 0,33 M NaCl, pH = 6,8. Daher ist DEAE-
Sepharose® die bevorzugte erste Stufe für aus Fraktion-IV-1-
Pastensuspension hergestelltes ACT.
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Die folgenden Beispiele wurden mit Cohn-Fraktion-IV-1-
Pastensuspension in 0,01 Tris, pH = 6,5, bei einer Leitfähigkeit von 1,0
bis 2,5 (mOhm · cm)&supmin;¹ und anschließender DEAE-Sepharose® und DNA-Cellulose-
Chromatografie durchgeführt.
Beispiel 1
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ACT in Cohn-Fraktion-IV-1-Paste wurde in 0,01 M Tris, pH = 6,5,
suspendiert und durch eine DEAE-Sepharose®-Säule gereinigt. Die Säule wurde
mit 0,025 bis 0,075 M Natrium-Phosphat (NaHPO&sub4;)-Puffer, pH = 6,5,
Leitfähigkeit = 1,9 bis 5,3 (mOhm · cm)&supmin;¹, gewaschen, und es wurden 3,6% des
Gesamt-ACT mit 0,1 M Natrium-Phosphat, pH = 6,5 (Leitfähigkeit: 6,5 (mOhm ·
cm)&supmin;¹ (21864-4-C), und 46% des Gesamt-ACT mit 3 1/2-fachem Anstieg der
spezifischen Aktivität (0,072 mg ACT/mg Protein) mit 0,2 M Natrium-
Phosphat, pH = 6,5 (Leitfähigkeit: 13,0 (mOhm · cm)&supmin;¹ (21864-4-D) eluiert
(Tabelle 2).
Tabelle 2 Vergleich des Elutions-Puffersystems an einer DEAE-Sepharose-Säule zur ACT-Reinigung
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Bei einer Puffer-Wäsche mit 0,025 bis 0,075 M Natrium-Kalium-Phosphat
(NaKPO&sub4;), pH = 6,5, Leitfähigkeit: 2,8 bis 7,4 (mOhm · cm)&supmin;¹, eluierte
teilgereinigtes ACT mit 0,1 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5 (Leitfähigkeit 9 bis 10
(mOhm · cm)&supmin;¹) (21893-17-C) aus DEAE-Sepharose® und ergab 45% Ausbeute mit
einem 5,6-fachen Anstieg bei der spezifischen Aktivität (0,134 mg ACT/mg
Protein) (Tabelle 2). Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass bei
Anwendung des äquilibrierten Puffersystems von 0,025 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5
(Leitfähigkeit: 2,8 bis 3,0 (mOhm · cm&supmin;¹)), zur DEAE-Sepharose® und Aufgeben
der Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension (Leitfähigkeit: 1,0 bis 2,5 (mOhm x
cm)&supmin;¹) auf die DEAE-Sepharose®-Säule und Entfernen von ungewünschtem Protein
durch Wäsche mit 0,075 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5. (Leitfähigkeit: 7,0 bis 7,8 (mOhm
· cm)&supmin;¹), teilgereinigtes ACT (DEAE-Eluat) mit 0,1 M NaKPO&sub4;, pH = 6,5
(Leitfähigkeit: 10 mOhm · cm)&supmin;¹) zur weiteren Reinigung durch eine DNA-
Cellulose-Säule eluiert.
Beispiel 2
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Bei Einsatz von Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension (DP 1279) mit
niedriger spezifischer antigener Aktivität (0,024 mg ACT/mg Protein) als
Ausgangsmaterial zur Reinigung durch DNA-Cellulose (Pharmacia) ergaben sich
eine niedrige Ausbeute an ACT (17%), eine niedrige Reinheit (spezifische
antigene Aktivität: 0,12 bis 0,32 mg ACT/mg Protein) und ein niedriges ACT-
Bindungsvermögen (0,1-0,2 mg ACT/mL DNA-Gel, Tabelle 3).
TABELLE 3 F-IV-1-Pastensuspension an einer DNA-Cellulose-Säule (5 ml)
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Allerdings ergab teilgereinigtes ACT in DEAE-Eluat (20767-93-1,
21893-15-1) mit höherer spezifischer antigener Aktivität (0,16 bis 0,25 mg
ACT/mg Protein) als Ausgangsmaterial eine höhere Ausbeute (61,2 bis 67,%),
eine höhere Reinheit (spezifische antigene Aktivität: 1,07 bis 1,47 mg
ACT/mg Protein) und ein höheres ACT-Bindungsvermögen (0,6 bis 1,2 mg ACT/mL
DNA-Gel, Tabelle 4). Auf der Grundlage dieser Daten ist die DNA-Cellulose-
Chromatografie die zweite Stufe für gereinigtes ACT, das aus
teilgereinigtem DEAE-Eluat hergestellt und zubereitet wird.
Tabelle 4 DEAE-Eluat an einer DNA-Cellulose-Säule
Beispiel 3
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Das insgesamt bevorzugte Verfahren zur Herstellung und Zubereitung
von ACT aus Plasma ist in Fig. 2 dargestellt. In einem vorgeschlagenen
Anreicherungsverfahren ergaben zwei Anteilsmengen von teilgereinigtem ACT,
hergestellt aus Fraktion-IV-1-Pastensuspension (70 kg) bei pH = 6,5,
Leitfähigkeit = 1,0 bis 2,0 (mOhm · cm)&supmin;¹, durch eine DEAE-Sepharose®-Säule
(30 L) eine Ausbeute von 17 bis 34% mit einem Eluat in 0,1 M NaKPO&sub4;, pH =
6,5 (Leitfähigkeit = 9,5 bis 10,5 (mOhm · cm&supmin;¹) mit einer spezifischen
antigenen Aktivität, die von 0,022 auf 0,108 bis 0,194 mg ACT/mg Protein
angestiegen war und mit einem 4- bis 9-fachen Anstieg der Reinheit (Tabelle
5).
Tabelle 5 Herstellung von gereinigtem ACT durch ein Anreicherungsverfahren
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Ein unbedeutender Verlust an Aktivität von ACT wurde durch die DF/UF-
Stufe erhalten. DEAE-Eluat wurde weiter durch eine DNA-Cellulose-Säule (3
L) gereinigt und ergab eine Gesamtausbeute von 6,9 bis 13,5% mit einer
spezifischen antigenen Aktivität, die von 0,108 bis 0,194 auf 1,24 mg
ACT/mg Protein angestiegen war. Zwei Anteilsmengen von DNA-Eluat (21869-35,
21869-37) wurden weiter diafiltriert und ultrafiltriert, in PBS-Puffer, pH
= 7,0, mit 10 bis 20 mg/mL formuliert (21893-61-3 und 21882-68) und bei
-70ºC für weitere in vitro- und in vivo-Untersuchungen aufbewahrt.
Charakterisierung von gereinigtem ACT
A. Antigene und Inhibitoraktivität
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Gereinigtes ACT (21893-61-3, 21882-68), hergestellt aus Cohn-
Fraktion-IV-1 mit einem Anreicherungsverfahren, einschließlich der im Hause
angewandten DNA-Cellulose-Säule, ergab eine spezifische Aktivität von > 1
mg/mg Gesamtprotein Inhibitoraktivität sowohl gegenüber Human-Cathepsin G
und gegenüber Rinder-Chymotrypsin, verglichen mit gereinigtem ACT-Standard
(gefriergetrocknete Form), verkauft von Athens Research, Atlanta, GA
(Tabelle 6).
Tabelle 6 Antigene und Inhibitoraktivitäten von gereinigtem ACT
B. SDS-PAGE- und HPLC-Analyse
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Bei Anwendung von 5, 10 und 20 ug pro Bahn an 6 bis 18% SDS-PAGE
unter reduzierenden Bedingungen wiesen ACT-Standard, hergestellt aus
Plasma, und gereinigtes ACT (21893-61-3), hergestellt aus Fraktion-IV-1-
Paste, ähnliche Molekulargewichtsbereiche (59,2 bis 61,9 kD) und ähnliche
Reinheit (≥ 90%) auf. Mit Western Blotting konnte ACT, hergestellt aus
Plasma und Fraktion-IV-1-Paste, mit Anti-Human-ACT-Antikörper nachgewiesen
werden, aber es gab keine signifikanten Banden, die in Zubereitungen mit
entweder Anti-α&sub1;-PI- oder Anti-AT-III-Antikörper nachgewiesen wurden.
Gereinigtes ACT (21893-61-3) enthielt eine Spurenmenge von abgebautem
Fragment (25,5 kD), das an Anti-Human-ACT-Antikörper beim Western-Blotting-
Verfahren gebunden wurde. HPLC-Analyse zeigte, dass gereinigtes ACT aus
sowohl Plasma als auch Fraktion-IV-1-Paste ähnliche Retentionszeiten und
mehr als 90% Reinheit aufwiesen.
C. IEF
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ACT-Standard von Athens Research und gereinigtes ACT aus Fraktion-IV-
1-Paste (21893-61-3, 21882-68) wurden an Novex-IEF (pH = 3 bis 10, Novex
System, San Diego, CA) analysiert. Sowohl ACT aus Plasma (siehe Laursen, I.
und Lykkesfeldt A. E.: Purification and characterization of an α&sub1;-
antichymotrypsin-like 66 kD Protein from the human brest cancer cell line,
MCF-7, Biochem. Biophys. Acta 1992; 1121: 119-129) als auch aus Fraktion-IV-
1-Paste wiesen ähnliche pI-Werte von ca. 3,8 bis 4,3 auf, verglichen mit
pI-Werten von ca. 4,6 bis 5,1 für AT-III und von 4 bis 5 für PI.
D. Spezifikationen von gereinigtem ACT (21882-68)
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2,4 g gereinigtes ACT (21882-68), 10 mg/ml in PBS-Puffer, hergestellt
aus zwei Durchgängen des Anreicherungsverfahrens, sind charakterisiert
worden. Das gereinigte ACT weist ≥ 90% Reinheit gemäß IEF, SDS-PAGE und
HPLC, eine biologische Aktivität, die mit ACT-Standard (verkauft von Athens
Research) vergleichbar ist, auf und enthält 0,7 Endotoxin-Einheiten pro mg
Azeo-Protein gemäß LAL-Assay (Tabelle 7).
Tabelle 7 Charakteristische Eigenschaften von gereinigtem ACT (21882-68)
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* gekauft von Athens Research
DISKUSSION
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Cohn-Fraktion-IV-1-Paste enthält eine geringfügig höhere Konzentration an
ACT (5 bis 10 mg/g Paste) als Plasma (4 bis 5 mg/g Protein). Daher ist
Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension, die aus Humanplasma fraktioniert wird,
das bevorzugte Ausgangsmaterial zur weiteren Reinigung. Human-ACT ist zur
Homogenität aus einem Humanplasmavorrat mit verschiedenen Verfahren
gereinigt worden, wie mit Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Cibacron Blau®-
Chomatografie, SP-Sephadex® oder CAE-Sephadex®-, DNA-Cellulose- und mit S-
300-Chromatografie. Allerdings ist, im Gegensatz zu von anderen
veröffentlichten Ergebnissen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung
herausgefunden worden, dass die ACT-Reinigung durch Ammoniumsulfat-
Fraktionierung oder direkte DNA-Cellulose-Chromatografie nur zu geringer
Ausbeute und zu geringer Reinheit führte, wenn Fraktion-IV-1-Paste als
Ausgangsmaterial angewandt wird.
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Prolastin®, eine im Handel erhältliche Plasma-stämmige PI-Zubereitung
(Miles Inc.), gereinigt durch PEG-Fällung und DEAE-Sepharose® aus Fraktion-
IV-1-Pastensuspension, setzt sich aus 600 ug PI pro mg Protein und einer
kleinen Menge ACT, nämlich 29 ug pro mg Protein, zusammen. Dies bestärkt
die vorliegenden Erkenntnisse, dass die PEG-Fällung von Fraktion-IV-1-Paste
nur zu geringer Ausbeute und geringer Einheit von ACT führt. Eine weitere
handelsübliche Plasma-Protein-Zubereitung ist Antithrombin-III (Thrombate®,
Miles Inc.), hergestellt aus Fraktion-IV-1-Pastensuspension durch Heparin-
Agarose-Chomatografie. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigten und
ergaben, dass mehr als 91% ACT nicht an die Heparin-Agarose-Säule gebunden
wurden. Dies würde es nahelegen, dass ACT über das Potenzial verfügt, als
ein AT-III-Nebenprodukt hergestellt zu werden.
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Cohn-Fraktion-IV-1-Paste enthält drei wesentlichere Proteinase-
Inhibitoren: PI (30 mg/g Paste), AT-III (5 mg/g Paste) und ACT (5 bis 10
mg/g Paste). Diese Proteine haben sehr ähnliche PI-Werte: 4,6 bis 5,1 für
AT-III, 4 bis 5 für PI, 3,8 bis 4,3 für ACT, und ähnliche
Molekulargewichte: 58 kD für AT-III, 53 kD für nativen PI und 58 bis 68 kD
für natives ACT. Eine optimale Abtrennung von ACT von PI und von AT-III aus
Cohn-Fraktion-IV-1-Paste hing davon ab, dass die richtige Art eines
Anionaustauschharzes mit der richtigen Art von Puffer, des pH-Wertes und
der Ionenstärke (Leitfähigkeit) angewandt wurden, um PI und AT-III in der
gereinigten ACT-Zubereitung zu entfernen. Das ACT-Reinigungsverfahren
entfernt aus Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension bei pH = 6,5 und einer
Leitfähigkeit von 1 bis 2,5 (mOhm · cm)&supmin;¹ durch DEAE-Sepharose (aber nicht
durch Q-Sepharose®), vor-äquilibriert mit Puffer aus 0,025 M NaKPO&sub4;, pH =
6,5 (Leitfähigkeit = 2,5 bis 3 (mOhm · cm)&supmin;¹), den meisten PI mit 0,075 M
NaKPO&sub4;, pH = 6,5 (Leitfähigkeit = 7,4 bis 7,8 (mOhm · cm)&supmin;¹), und ACT wurde
mit 0,1 M NaKPO&sub4;, pH ≤ 6,5, 9 bis 10,5 (mOhm · cm)&supmin;¹ Leitfähigkeit eluiert.
Das aus DEAE-Eluat teilgereinigte ACT, das AT-III und Spuren von PI
enthielt, wurde durch DNA-Cellulose noch weiter gereinigt. Das weiste des
AT-III und der Spuren des PI wurden nicht an DNA-Cellulose gebunden, als
die Säule mit 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;-Puffer, 0,085 M NaCl, pH = 8,0, Leitfähigkeit =
8 bis 9 (mOhm · cm)&supmin;¹ gewaschen wurde, und nur aktiviertes ACT wurde
spezifisch an DNA-Cellulose adsorbiert und mit 0,33 M NaCl in 0,01 M K&sub2;HPO&sub4;,
pH = 6,8 (Leitfähigkeit = 24 bis 25 (mOhm · cm)&supmin;¹) eluiert.
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Gesamtausbeute und Reinheit von ACT im Anschluß an die DNA-Cellulose-
Säule hängen von der Reinheit der auf die Säule aufgegebenen ACT-Lösung ab.
DNA-Cellulose entfernte ungebundene AT-III und PI, als teilgereinigtes ACT
(DEAE-Eluat), aber nicht Cohn-Fraktion-IV-1-Pastensuspension auf die Säule
aufgegeben wurden. Dies ergab ein hoch gereinigtes ACT mit einer
spezifischen Aktivität von > 1 mg/mg Protein einer Inhibitoraktivität
sowohl gegenüber Human-Cathepsin G als auch gegenüber Rinder-Chymotrypsin.
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Gereinigtes ACT, hergestellt aus Cohn-Fraktion-IV-1-Paste, zeigte
einen ähnlichen Molekulargewichtsbereich gemäß SDS-PAGE- und HPLC-Analyse
und ähnliche isoelektrische Punkte, verglichen mit aus Humanplasma
hergestelltem ACT-Standard. Das antigen intakte und aktive ACT kann aus
Cohn-Fraktion-IV-1-Paste gereinigt werden, und es sind weitere
Untersuchungen bezüglich seiner biologischen Aktivität in vivo
erforderlich, um seine therapeutische Anwendung zu stützen.
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Im Lichte der obigen Beispiele sollten Variationen für den auf dem
einschlägigen Gebiet tätigen Durchschnittsfachmann klar erkennbar sein.
Demnach soll die hier offenbarte Erfindung nur auf die folgenden Ansprüche
eingeschränkt sein.