PT694562E - Preparacao de alfa-1-antiquimotripsina - Google Patents

Description

- 1 - l/ΐΑη

DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE ALFA-l-ANTIQUIMOTRIPSINA"

Antecedentes da Invenção

Campo:

Esta descrição relaciona-se genericamente com a preparação de proteínas de plasma sanguíneo humano e especificamente com a preparação de antiquimotripsina-alfai (ACT) de uma mistura de ACT, inibidor de proteinase alfaj (PI) e antitrombina III (AT-III) tal como se encontra na suspensão da pasta IV-1 da Fracção de Cohn obtida de plasma humano. Técnica Anterior:

Antes da Segunda Guerra Mundial, os cientistas e médicos descobriram que o plasma humano podia ser utilizado na terapêutica de substituição do sangue. Durante a Guerra, dificuldades de fornecimento e armazenagem de sangue inteiro e de plasma significaram que o choque de guerra não podia ser tratado tão eficazmente quanto possível. A necessidade de proteínas do plasma que pudessem ser armazenadas e utilizadas no campo de batalha levaram Cohn e outros (Pat. U.S. N° 2,390,074 (1954) qJ. Amer. Chem. Soc., 68, p. 459 (1946)) a descobrir que as proteínas presentes no plasma podiam ser fraccionadas por precipitação selectiva na presença de solventes orgânicos ou sais neutros solúveis em água. Para uma revisão do fraccionamento do plasma ver, "The Plasma Proteins", Segunda Edição, Volume III, páginas 548-550, Academic Press, Nova

Iorque, N. 1. (1977). As misturas de proteínas concentradas podiam então ser administradas aos doentes à medida que fosse necessário. Por exemplo, se o problema era o excesso de sangramento, o médico podia injectar uma fracção enriquecida em fibrinogénio. Se o doente sofresse de queimaduras ou de outra lesão traumática em que a perda de plasma excedesse a de glóbulos vermelhos, o médico podia utilizar albumina, o regulador coloido-osmótico do plasma.

No fraccionamento de Cohn, adiciona-se etanol ao plasma e baixa-se o pH a temperaturas abaixo de zero para precipitar selectivamente as proteínas. Após a separação do precipitado do sobrenadante, baixa-se o pH do sobrenadante, e/ou adiciona-se mais álcool para precipitar outra fracção.

Actualmente, este método de fraccionamento ainda é utilizado para separar proteínas biologicamente activas que possuem certas qualidades terapêuticas. Por exemplo, o Factor VIII ou factor anti-hemofílico é útil contra a hemofília; o plasminogénio, um precursor da plasmina, é utilizado no tratamento de doenças tromboembólicas agudas; as gama globulinas, incluindo globulina de soro imune e gama globulina intravenosa, são utilizadas no tratamento da deficiência congénita de gama globulinas, sarampo, poliomielite e hepatite A e B; a fibronectina tem sido identificada como activa no tratamento de queimaduras, choque, cancro, etc.; a anti-trombina III é um inibidor da coagulação; a própria crioprecipitação pode ser utilizada directamente para a hemofília clássica; a Fracção de Proteínas do Plasma e a albumina são úteis no tratamento de choque devido a queimaduras, lesões de esmagamento, emergências abdominais, e qualquer outro trauma produzindo uma perda predominante de fluidos plasmáticos mas não de glóbulos vermelhos; e o inibidor de proteinase-ai pode ser utilizado no tratamento de enfisema. -3- A antiquimotripsina-αι humana (ACT) é um inibidor de protease de serina que, até agora, só foi isolado de plasma ou soro humano. Embora a função biológica exacta da ACT não tenha sido ainda determinada, parece ser uma proteína multifuncional e foi sugerida a sua utilização em várias terapêuticas. (Ver, por exemplo, Pat. U.S. N° 5,008,242 a J. Lezdey, et al.). Há provas que indicam que uma função importante da ACT é a inibição de proteases, tais como a protease semelhante a quimotripsina, quimase de células mastóides, catepsina G de leucócitos (ver Beatty, K. Bieth, J., Travis, J.: Kinetic of association of serine proteinases with native and oxidized aj-proteinase inhibitor and ai-antichymotrypsin, J. Biol. Chem., 1980; 255:3931-3934) e elastase pancreática (ver Laine, A., Davril, M., Rabaud, M., et al.: Human serum arantichymotripsin is an inhibitor of pancreatic elastases, Eur. J. Biochem., 1985; 151: 327-331 e Davril, M. Laine, A., Hayem, A.: Studies on the interactions of human pancreatic elastase 2 with human arproteinase inhibitor and ai-antichymotrypsin, Biochem. J., 1987; 245:699-704).

As propriedades biológicas de formas intactas, clivadas e complexadas da ACT indicam que o carácter proteolítico da proteína pode ter um papel potencial para utilização terapêutica na regulação de doenças infecciosas, pancreatite, doenças pulmonares e inflamações da pele (ver Rubin, H.: The biology and biochemistry of antichymotrypsin and its potential roles as a therapeutic agent, Biol. Chem. Hoppe-Sayler, 1992; 373(7): 497-502). J. Travis et al. purificaram ACT até à homogeneidade a partir de um conjunto de plasmas humanos (Travis, J. Gamer, D., Bowen, J.: Human ar antichymotrypsin purification and properties, Biochemistry, 1978; 17:5647-5651). -4- lytÂJL^ T. Kalsunuina e colaboradores purificaram uma proteína de ligação a DNA, que se pensava ser um marcador tumoral, até à homogeneidade (Katsunuma, T. et al.: Purification of a serum DNA binding protein (64DP) with a molecular weight of 64,000 and its diagnostic signifícance in malignant diseases, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 93(2):552-557 (1980)). Mais tarde, verificou-se que a proteína de ligação a DNA era ACT. Katsunuma utilizou soro humano como o material de partida. Primeiro eluíram 64DP de DEAE Sephadex com NaCl 225 mM. Após diálise, a 64 DP foi purificada adicionalmente com DNA celulose. Finalmente para conseguir homogeneidade, a 64DP foi precipitada com sulfato de amónio e separada das proteínas contaminantes numa coluna de exclusão de tamanho.

Para além do isolamento a partir de plasma inteiro, a ACT humana foi clonada, sequenciada e expressa em Escherichia coli (ver Rubin, H. et al.: Cloning, expression, purification and biological activity of recombinant native and variant human antichymotrypsins, J. Biol. Chem. 1990; 265:1199-1207). Rubin et al. utilizaram uma coluna de Sepharose Fast Q para separar a actividade ACT do lisado bacteriano em bruto. A ACT parcialmente purificada foi então adsorvida em DNA celulose e eluída em KC1350-400 mM.

Devido às utilizações potenciais da ACT, existe agora a necessidade de formas mais eficazes para preparar grandes quantidades de ACT a partir de plasma humano especialmente a partir de fracções que também incluem quantidades variáveis de PI e de AT-III.

Inesperadamemnte, verificámos que a ACT pode ser purificada a partir da Fracção IV-1 de Cohn. A Fracção IV-1 contém muitas proteínas diferentes e as dificuldades de separação impedem a maior parte das utilizações -5-

comerciais desta fracção do plasma. O isolamento da ACT constituiria portanto uma utilização benéfica desta fracção de plasma subutilizada e normalmente eliminada.

Comparada com o soro humano, a Pasta da Fracção IV-1 de Cohn contém concentrações mais elevadas de proteínas, tais como PI e AT-ΠΙ, que estão relacionadas de próximo com a ACT e se esperaria que co-purificassem com a ACT. Durante o processo de fraccionamento da pasta IV-1, a ACT só é concentrada 1-2 vezes, enquanto que a PI é concentrada 3-10 vezes e a AT-ΠΙ é concentrada 2-3 vezes. As concentrações das proteínas na pasta IV-1 são de 30 mg de ΡΙ/g de pasta, 5 mg de AT-III/g de pasta e 5-10 mg de ACT/g de pasta. Considerando a dificuldade na separação de ACT destas outras proteínas e a sua posição como um componente minoritário, seria considerado improvável que a pasta da Fracção IV-1 fosse uma fonte adequada de ACT. Surpreendentemente, foi possível isolar 2-3 g de ACT com uma pureza = 90% a partir de aproximadamente 2,9 kg de pasta IV-1 utilizando uma forma modificada do procedimento de Katsunuma, et al..

Além da sua utilização demonstrada como um inibidor de protease de serina in vitro (e.g., pode ser utilizada como um reagente para estudos de PI), propõe-se agora como é que a ACT pode ter utilização terapêutica potencial. Podem ser obtidas preparações farmacêuticas por mistura de ACT com um veículo aceitável, e podem ser preparadas formulações correntes de modo conhecido. A seguir descreve-se os pormenores destas descobertas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O presente método para a preparação de antiquimotripsina-alfaj -6- humana (ACT) a partir de uma solução que também inclui inibidor de proteinase-alfai (PI) e antitrombina (AT-ΠΙ) compreende os passos de (A) fazer contactar a solução contendo ACT com uma resina de permuta iónica a uma condutividade (força iónica) e a um pH suficientes para adsorverACT;

lavar o adsorvente utilizando uma solução com pH e condutividade suficientes para remover substancialmente toda a PI e AT-III ao mesmo tempo que não remove a ACT adsorvida; e (C) eluir a ACT da resina.

Numa forma de realização preferida, o passo (C) é seguido por passos de purificação adicionais em que se faz contactar a solução de eluído do passo (C) com DNA-celulose em condições e pH suficientes para adsorver a ACT e depois eluir a ACT da DNA-celulose.

Noutra forma de realização preferida, a ACT é preparada a partir de uma suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn que inclui uma solução aquosa de ACT, PI e AT-III com uma condutividade de 1,0-2,5 mmho/cm e um pH de cerca de 6,45 a 6,55. A ACT é purificada utilizando o passo (A) por cromatografia numa resina de permuta aniónica (i.e., DEAE-Sepharose®) a cerca de pH 6,5 seguida por lavagem da DEAE-Sepharose® com uma solução de lavagem tendo um pH de cerca de 6,5 e uma condutividade de 7,4 a 7,8 mmho/cm e eluindo a ACT a um pH de cerca de 6,5 e uma condutividade de 9 a 10,5 mmho/cm e, finalmente, por adsorção em DNA-celulose a pH 6,8 antes da eluição final da ACT. -7-

BREVE DESCRICÀO DAS FIGURAS A Figura 1 é um fluxograma geral ilustrando como é que o material de partida preferido (suspensão da pasta da fracção IV-1 de Cohn) é fraccionado a partir de plasma humano. A Figura 2 é um fluxograma ilustrando os passos preferidos do presente processo de purificação da ACT.

MATERIAIS E MÉTODOS

Antiquimotripsina-ai, inibidor de antiproteinase-ai e antitrombina III purificadas de plasma humano, de anticorpos de coelho contra ACT humana e de catepsina G de neutrofilos humanos foram adquiridos a Athens Research, Athens, Georgia. DNA-celulose (5 mL) foi adquirida a Pharmacia, Inc.. DNA nativo de timo de vitelo e celulose para o processo de preparação de DNA-celulose em larga escala, succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida e quimotripsina bovina foram adquiridas a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. A Fracção IV-1 de Cohn foi obtida de Miles Inc.. DEAE-Sepharose® é uma marca registrada de Pharmacia, Inc. para o seu material de permuta aniónica agarose na forma de pérolas.

Preparação de DNA-Celulose para o Processo em Larga Escala

Preparou-se DNA-celulose (3 L) de acordo com o método de Litman (ver Litman, R. Μ.: A deoxyribonucleic acid polymerase from Micrococcus lutens (Micrococcus hysodeikticus) isolated on deoxyribonucleic acid-celulose, J. Biol. Chem. 1968; 243:6222-6233). Lavou-se celulose (1 kg) durante 10 minutos com HC1 1 N (15 L), lavou-se com água e secou-se ao ar. -8- l/uη

Misturou-se timo nativo de vitelo (16 g) com celulose (1 kg) em 8 L de NaCl 10 mM. A mistura grumosa foi espalhada e seca sob um ventilador durante 3-5 horas e finalmente foi deixada em repouso ao ar de um dia para o outro. A matriz seca foi triturada e ressuspensa em etanol. A suspensão foi então irradiada sob uma lâmpada de UV para formar ligações reticuladas à celulose.

Purificação de ACT Humana

Suspendeu-se pasta da Fracção IV-1 de Cohn preparada genericamente de acordo com o método de ffaccionamento de Cohn et ai, J. Amer. Chem. Soc. 1948; 68:459, incluindo ACT, PI e AT-III, em 24 volumes de Tris 0,01 M pH 9,3 e aqueceu-se a 40°C durante uma a uma hora e meia. A suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn foi ajustada para pH 6,5 (70 litros) e carregada numa coluna de 30 kg de DEAE-Sepharose®. A coluna de DEAE foi equilibrada com um volume de coluna de NaKP04 25 mM pH6,5 e lavada de um dia para o outro com mais do que 10 volumes de coluna de NaKP04 75 mM pH 6,5, 1 mM de EDTA, para produzir uma linha de base estável. A ACT parcialmente purificada foi eluída com 3-5 volumes de NaKP04 100 mM pH 6,5. O eluído de NaKP04 100 mM foi ultrafiltrado/diafiltrado contra K2P04 0,01 M pH 6,8 (condutividade de 1-2 mmho/cm) num cartucho de PM-10 de 3 pés quadrados e contactada em "batch" com a DNA-celulose (3 L) no corpo da coluna de DNA durante 90 minutos. A coluna foi lavada de baixo para cima e de um dia para o outro com tampão de lavagem de 85 mM de NaCl em K2HP04 0,01 Μ, 1 mM de EDTA pH 6,8 (conditividade de 8-9 mho/cm). Após ter sido atingido um efluente estável com A2g0 de 0,03, a coluna foi eluída de baixo para cima com tampão de eluição pH 6,8 de NaCl 330 mM em K2HP04 0,01 Μ, 1 mM de EDTA. O eluído foi congelado em alíquotas a -70°C. -9- 1/ΐΛ>η

Doseamento de Actividade Enzimâtica e Inibidora de ACT A actividade esterolítica de catepsina G de neutrofilos humanos e de quimotripsina bovina foram medidas utilizando succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida como substrato (ver DelMar, E. G., Largman, C. Broderick, J. W., et alA sensitive new substrate for chymotrypsin, Anal. Biochem. 1979; 99:316-329). A actividade inibidora foi medida misturando uma quantidade fixa de enzima (catepsina G/quimotripsina) com quantidades variáveis de ACT. Após incubação durante 5 minutos a 25°C as misturas foram doseadas quanto à actividade esterolítica. Utilizou-se um coeficiente de extinção de 6,2 (solução a 1%, 280 mM) determinado com inibidor purificado para a determinação da concentração de proteína (ver Babul, J. Stellwagen, E.: Measurement of protein concentration with interferences optics, Anal. Biochem. 1969; 28:216-221). A actividade inibidora específica foi expressa como a razão de actividade inibidora por concentração de proteína.

Actividade Antigénica de ACT Determinada por RID e ELISA A actividade antigénica de ACT foi determinada por um "kit" de imunodifusão radial de The Binding Site (San Diego, CA). A actividade antigénica também foi determinada por doseamento da enzima ligada a imunos-sorvente (ELISA). Padrão de ACT purificada numa gama de concentrações de 0.1-10 ng/mL ou amostras de preparação de ACT purificada foram captados com anticorpos de coelho em placas revestidas com ACT. Adicionou-se às placas um anticorpo de coelho contra ACT biotinilado, após a incubação com estreptavidina conjugada com peroxidase e substrato (tetrametil benzidina) para detectar a actividade. A actividade antigénica específica foi medida como a razão de actividade antigénica por concentração de proteína. -10-

Actividade Antigénica de PI Determinada por ELISA A actividade antigénica de PI foi determinada por doseamento da enzima ligada a imunossorvente (ELISA). Utilizou-se inibidor de antiproteinase-oii anti-humano de cabra (Cappel, NC) como o anticorpo de revestimento. PI purificada (Athens Research), amostras de preparação de ACT purificada ou padrão de plasma liofílizado de 1,3 mg/mL numa gama de concentrações de 0,78-25 ng/mL foram captadas com anticorpo de revestimento inibidor de antiprotei-nase-ai anti-humano de cabra. Adicionou-se às placas inibidor de antiprotei-nase-oq anti-humano de cabra conjugado com peroxidase, após a incubação com substrato (tetrametil benzidina) para detectar a actividade. As amostras foram comparadas com uma curva padrão de absorvância vs. concentração de antigénio.

Doseamento de Actividade Enzimática e Inibidora de AT-III fAnti-trombina ΙΙΏ

Este é um doseamento de dois passos em que padrão de plasma ou uma concentração de actividade de AT-III conhecida e amostras são diluídas num tampão contendo heparina e incubadas com trombina bovina (Passo I). O substrato cromogénico S-2238 (H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-arginino-P-nitroanilina 2 HC1, Chromogenix AB, Suécia) é então adicionado, e hidrolizado por qualquer excesso de trombina que não foi inibida por AT-III, sendo a P-nitroanilida liberta e quantificada a uma absorvância de 405 nm. A concentração de AT-III é inversamente proporcional ao grau de hidrólise (absorvância) por medição da absorvância a 405 nm. SDS PAGE e "Western Blotting"

Realiza-se a electroforese analítica em placas de gel de gradiente de Tris-glicina 8-16% poliacrilamida (adquiridas a Novex System, San Diego, CA) -11- utilizando o sistema tampão de gel da Novex contendo Tris-glicina, 0,1% de SDS, pH 8,3. Preparou-se padrão purificado de ACT e preparações de amostras em tampão de amostra contendo Tris-glicina, 2% de SDS, 10% de β-mercapto-etanol durante 10 minutos em água a ferver. Utilizou-se "kits" de electroforese de calibração de pesos moleculares da Novex Systems para a determinação de pesos moleculares. As proteínas foram detectadas por Coomassie Brilliant Blue G-250. O "Western blotting" foi realizado a partir de gel para membrana de nitrocelulose e detectado por antissoro de coelho contra ACT humana e IgG anti coelho de cabra conjugado com fosfato alcalino.

Análise por HPLC

Padrão de ACT de Athens Research e ACT purificada do processo em larga escala foram analisadas em TSK 3000 SW com 0,05 M de Na2HP04, 0,15 M de NaCl pH 6,5 como a fase móvel.

RESULTADOS

Para preparar ACT humana, utilizou-se como material de partida suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn. A pasta da Fracção IV-1 contém aproximadamente os seguintes mg/g de pasta dos três inibidores de proteinase: inibidor de proteinase-αι (PI) - 30,0; ACT - 5-10,0 determinado por ELISA de actividade antigénica e AT-III - 5,0 medidos por actividade inibidora enzimática. A purificação de ACT por precipitação com PEG, cromatografia em S-Sepharose® e Q-Sepharose® foi desfavorável porque não houve melhoria da pureza. O fraccionamento com sulfato de amónio, coluna quelante e coluna de Cibatochrome Blue® para o processo de purificação eram inaceitáveis devido ao -12- baixo rendimento e baixa pureza da ACT.

Quando se utilizou suspensão da pasta da Fracção IV-1 (20733-91-1) em Tris 0,01 M pH 6,5 a baixa condutividade (1,0-2,5 mmho/cm) em DEAE-Sepharose®, mais do que 91% da proteína total estava presente na fracção eluída com NaKP04 0,025 M pH 6,5 (20767-36-1 e -2) e na fracção de lavagem com NaKP04 0,075 M pH 6,5 (20767-36-3). (Tabela 1). TABELA 1

Coluna de DEAE-Sepharose (10 mL)

Amostra ACT Total pg % de Rendimento de ACT Total Actividade Específica mg de ACT/mg de Proteína Suspensão da Pasta FIV-1 (20733-91-1) 4.326 100 0,023 Eluído com NaKP04 0,025 M pH 6,5 (20767-36-1 & -2) 257,2 6,0 0,004 Lavagem com NaKP04 0,075 M pH 6,5 (20767-36-3) 166,5 3,8 0,003 Eluído com NaKP04 0,1 M pH 6,5 (20767-36-4 & -5) 2.188,3 50,6 0,169 Eluído com NaKP04 0,2 M pH 6,5 (20767-36-6) 732 16,9 0,04 -13-

Mais do que 50% da ACT eluiu com NaKP04 0,1 M pH 6,5 (20767-36-4 e -5) e houve um aumento de sete vezes na actividade específica de ACT. Contudo, carregando a suspensão da pasta da Fracção IV-1 em K2HPO4 0,01 M pH 6,8 directamente numa coluna de DNA-celulose (5 mL) deu apenas 10% de rendimento de recuperação com um aumento de quatro até dez vezes em pureza após eluição com. K2HPO4 0,01 M, NaCl 0,33 M pH 6,8. Portanto, a DEAEt, Sepharose® é é primeiro passo preferido para a preparação de ACT a partir de suspensão da pasta da Fracção IV-1.

Os exemplos seguintes foram realizados com suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn em Tris 0,01 M pH 6,5 a uma condutividade de 1,0-2,5 mmho/cm, seguida por cromatografia em DEAE-Sepharose® e DNA-celulose.

Exemplo 1 ACT na pasta da Fracção IV-1 de Cohn foi suspensa em Tris 0,01 M pH 6,5 e purificada através de uma coluna de DEAE-Sepharose®. A coluna foi lavada com fosfato de sódio (NaHP04) 0,025 M até 0,075 M pH 6,5, condutividade =1,9 até 5,3 mmho/cm de tampão e 3,6% da ACT total foi eluída com fosfato de sódio 0,1 M pH 6,5 (condutividade: 6,5 mmho/cm) (21864-4-C) e 46% da ACT total com um aumento três vezes e meio de actividade específica (0,072 mg ACT/mg de proteína) foi eluída com fosfato de sódio 0,2 M pH 6,5 (condutividade 13,0 mmho/cm) (21864-4-D) (Tabela 2). - 14- ΤAPELA 2

Comparação do Sistema Tampão de Eluição em Coluna de DEAE-Sepharose

para Purificação de ACT

Amostra ACT Total pg Rendimento % Actividade Específica mg de ACT/mg de Proteína A. Suspensão da Pasta FIV-1 10.250 100 0,021 Eluído com NaHP04 0,025 M pH 6,5 (21864-4-A) 1.147 11,2 0,007 Lavagem com NaHP04 0,075 M pH 6,5 (21864-4-B) 335 3,3 0,003 Eluído com NaHP04 0,1 M pH 6,5 (21864-4-C) 372 3,6 0,009 Eluído com NaHP04 0,2 M pH 6,5 (21864-4-D) 4.760 46,4 0,072 B. Suspensão da Pasta FIV-1 DP 1279 4,580 100 0,024 Eluído com NaKP04 0,025 M pH 6,5 (21893-17A) 457,6 10,0 0,009 Lavagem com NaKP04 0,075 M pH 6,5 (21893-17B) 1.200,5 26,2 0,013 Eluído com NaKP04 0,1 M pH 6,5 (21893-17C) 2.059,6 45,0 0,134 Eluído com NaKP04 0,2 M pH 6,5 (21893-17D) 235,6 5,1 0,03

Contudo, com fosfato de sódio e potássio (NaKPO^ 0,025 M até 0,075 M pH 6,5, condutividade: 2,8 até 7,4 mmho/cm de tampão de lavagem, ACT parcialmente purificada eluiu com NaKP04 0,1 M pH 6,5 (condutividade: 9-10 mmho/cm) (21893-17-C) de DEAE-Sepharose® e deu 45% de rendimento com um aumento de 5,6 vezes da actividade específica (0,134 mg de ACT/mg de proteína) (Tabela 2). Os resultados da Tabela 2 indicam que utilizando o sistema tampão equilibrado de NaKP04 0,025 M pH 6,5 (condutividade: 2,8-3,0 mmho/cm) para DEAE Sepharose® e carregando a suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn (condutividade 1,0-2,5 mmho/cm) numa coluna de DEAE-Sepharose®, são removidas proteínas indesejadas por lavagem com NaKP04 0,075 M pH 6,5 (condutividade: 7,0-7,8 mmho/cm) e ACT parcialmente purificada (eluído de DEAE) elui com NaKP04 0,1 M pH 6,5 (condutividade: 10 mmho/cm) para purificação adicional através de uma coluna de DNA-celulose.

Exemplo 2

Quando se utilizou suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn (DP 1279) com actividade específica antigénica baixa (0,024 mg de ACT/mg de proteína) como material de partida para purificação através de DNA-celulose (Pharmacia), obteve-se um baixo rendimento de ACT (17%), baixa pureza (actividade específica antigénica 0,12-0,32 mg de ACT/mg de proteína) e baixa capacidade de ligação de ACT (0,1-0,2 mg de ACT/mL de DNA-gel, Tabela 3). -16- lAAVj TABELA 3

Suspensão da Pasta de FIV-1 em Coluna de DNA-Celulose (5 mL)

Amostra ACT Total Mg % de Rendimento de ACT Total Actividade Específica mg de ACT/mg de Proteína Suspensão da Pasta FIV-1 (DP1279) (21893-20-1-) 4.580 100 0,024 Eluído (21893-20-A) 1.775,2 38,8 0,012 Lavagem com NaCl 0,085 M (21893-20-B) 356 7,8 0,017 Eluído com NaCl 0,33 M (21893-20-33,34,35) 765,6 16,7 0,324

Contudo, ACT parcialmente purificada em eluído de DEAE (20767-93-1, 21893-15-1) com actividade antigénica específica mais elevada (0,16-0,25 mg de ACT/mg de proteína) como material de partida resultou em rendimento mais elevado (61,2-67,1%), pureza superior (actividade antigénica específica de 1,07-1,47 mg de ACT/mg de proteína) e capacidade de ligação de ACT mais elevada (0,6-1,2 mg de ACT/mL de DNA-gel, Tabela 4). Com base nestes resultados, a DNA-celulose é o segundo passo para a preparação de ACT purificada a partir de eluído de DEAE parcialmente purificado. -17-

TABELA 4

Eluído de DEAE em Coluna de DNA-Celulose

Amostra ACT Antigénico Total % de Rendimento % Actividade Específica mg de ACT/mg de Proteína EXPERIÊNCIA 1 Cone. de Eluído de DEAE (20767-93-1) 1.605,5 100 0,248 Eluído (20767-93-A) 30,6 1,9 0,004 Lavagem com NaCl 0,085 M (20767-93-B) 38,3 2,4 0,07 Eluído com NaCl 0,33 M (20767-93-C&D) 982 61,2 1,07 EXPERIÊNCIA 2 Cone. de Eluído de DEAE (21893-15-1) 4.230 100 0,164 Eluído (21882-29-A) 51,4 1,2 0,003 Lavagem com NaCl 0,085 M (21882-29-B) 29,4 0,7 0,03 Eluído com NaCl 0,33 M (21882-29-21,22,23) 2.837,2 67,1 1,47 -18-

U 7

Exemplo 3 O processo global preferido para a preparação de ACT a partir de plasma está ilustrado na Figura 2. Num processo proposto em larga escala, 2 lotes de ACT parcialmente purificada preparada a partir da suspensão da pasta da Fracção IV-1 (70 kg) a pH 6,5, condutividade de 1,0-2,0 mmho/cm, através de uma coluna de DEAE-Sepharose® (30 L) resultou num rendimento de 17-34% com eluído de NaKPC>4 0,1 M pH 6,5 (condutividade de 9,5-10,5 mmho/cm) com actividade específica antigénica acrescida desde 0,022 até 0,108 - 0,194 mg de ACT/mg de proteína e um aumento de quatro até nove vezes da pureza (Tabela 5). -19- Ι/Λη TABELA 5 ACT Purificada Preparada por Processo em Larga Escala

Amostra ACT Antigénico Total mg Rendimento % Actividade Específica Antigénica mg de ACT/mg de Proteína EXPERIÊNCIA 1 Passo 1: DEAE-Sepharose (30 L) Suspensão da Pasta da FIV-1 (21893-58-2) 25.690 100 0,022 Eluído de DEAE (21893-58-3) 885 3,4 0,003 Lavagem de DEAE (21893-58-4) 4.985 18,9 0,015 Eluído de DEAE (21893-58-5) 8.710 33,9 0,194 Passo 2: DNA-Celulose (3 L) DF/UF Cone. de eluído de DEAE (21893-58-6) 8.494 33,1 0,187 Eluído de DNA (21869-35) 3.464 13,5 1,24 EXPERIÊNCIA 2 Passo 1: DEAE-Sepharose (30 L) Suspensão da Pasta da FIV-1 (21882-65-1) 31.150 100 0,025 Eluído de DEAE (21882-65-2) 1.854 6,0 0,008 Lavagem de DEAE (21882-65-3) 6.470 20,8 0,008 Eluído de DEAE (21882-65-4) 5.265 16,9 0,108 Passo 2: DNA-Celulose (3 L) DF/UF Cone. de eluído de DEAE (21882-65-5) 4.939 15,9 0,094 Eluído de DNA (21869-37) 2.142 6,9 1,24 -20-

Obteve-se uma perda insignificante de actividade de ACT através do passo de DF/UF. O eluído de DEAE foi adicionalmente purificado através de uma coluna de DNA-celulose (3 L) e deu um rendimento global de 6,9-13,5% com actividade específica antigénica acrescida desde 0,108-0,194 mg de ACT/mg de proteína. Dois lotes de eluído de DNA (21869-35, 21869-37) foram adicionalmente diafiltrados e ultrafíltrados, formulados em tampão PBS pH 7,0 a 10-20 mg/mL (21893-61-3 e 21882-68) e armazenados a -70°C para estudos in vitro e in vivo adicionais.

Caracterização de ACT Purificada A. Actividade Antigénica e Inibidora ACT purificada (21893-61-3, 21882-68) preparada a partir da Fracção IV-1 de Cohn pelo processo em larga escala incluindo a coluna de DNA-celulose preparada intemamente resultou numa actividade específica de >1 mg/mg de proteínas totais de actividade inibidora tanto de catepsina G humana como de quimotripsina bovina quando comparada com ACT purificada corrente (na forma liofilizada) adquirida a Athens Research, Atlanta, GA (Tabela 6). -21 - Ι/ϋιη TABELA 6

Actividades Antigénica e Inibidora de ACT Purificada

Actividade de ACT (mg/mL) Act. Espec. mg de ACT/mg de Proteína ACT Purificada Concentr. de Proteína Antigénica Inibidora Antigénica Inibidora (mg/mL)

Catepsína Químo- Catepsína Quimo- G tripsina G tripsina 21893-61-3 21,7 26,2 24,3 — 1,2 1,1 — 21882-68 9,7 9,6 12,1 14,1 0,99 1,36 1,45 Padrão de ACT 2,63 2,53 2,9 2,8 0,96 1,1 1,05 (Athens Research)

B. Análise por SDS PAGE e HPLC

Quando 5 gg, 10 gg, 20 gg por tira foram aplicados em SDS-PAGE 6-18% em condições de redução, o padrão de ACT preparado a partir de plasma e ACT purificada (21893-61-3) preparada a partir da pasta da Fracção IV-1 tinham gamas de peso molecular semelhantes (59,2-61,9 kD) e pureza semelhante (=90%). Por "Western blotting", a ACT preparada a partir de plasma humano e pasta da Fracção IV-1 puderam ser detectadas com um anticorpo de ACT anti-humano, mas não houve bandas significativas detectadas em qualquer das preparações com anticorpo anti-αι-ΡΙ ou anti-AT-III. A ACT purificada (21893-61-3) continha quantidades vestigiais de fragmento degradado (25,5 kD) que se -22- /

ligou a anticorpo de ACT anti-humano em "Western blotting". A análise por HPLC mostrou que a ACT purificada tanto de plasma como da pasta da Fracção IV-1 tinham tempos de retenção semelhantes e mais do que 90% de pureza.

C. IEF

Analisou-se padrão de ACT da Athens Research e ACT purificada a partir de pasta da Fracção IV-1 (21893-61-3, 21882-68) em IEF Novex (pH 3-10, Novex System, San Diego, CA). Tanto a ACT de plasma (ver Laursen, I. e Lykkesfeldt, A. E.: Purification and characterization of an ai-antichymotrypsin-like 66 kD protein from the human breast câncer cell line, MCF-7, Biochem. Biophys. Acta 1992; 1121:119-129) e da pasta da Fracção IV-1 tinham pl's semelhantes de cerca de 3,8-4,3 comparados com pl's de cerca de 4,6-5,1 para AT-ΠΙ e 4-5 para PI. D. Especificações da ACT Purificada (21882-681

Caracterizou-se 2,4 g de ACT purificada (21882-68), 10 mg/mL em tampão PBS preparada a partir de duas operações do processo em larga escala. A ACT purificada tem =90% de pureza por IEF, SDS PAGE e HPLC, actividade biológica comparável com padrão de ACT (adquirido a Athens Research) e contém 0,7 unidades de endotoxina por mg A2so de proteína por ensaio de LAL (Tabela 7). -23-buy TABELA 7

Características de ACT Purificada (21882-68)

Volume

Características

Aspecto (Visual)

Cone. Proteína (A28o) 0,1% Elcm = 0,62

Tampão PBS pH

Identificação

Focagem Isoeléctrica

Pureza

SDS PAGE (6-18%) - Reduzida HPLC

Endotoxinas (LAL)

Actividade biológica (antigénica, inibidora de catepsina G humana e quimotripsina bovina)catepsina G ♦Adquirido a Athens Research 259 mL, 50 frascos (5 mL/frasco)

Solução límpida, incolor

10.1 ±0,4mg/mL 7.1 ± 0,1

Espectrotipo IEF corresponde em cerca de 90% com o padrão de ACT* =90% de ACT padrão com quantidade vestigial de fragmento degradado (25,5 kD) Área % de ACT padrão =90% 0,7 UE por mg de proteína A28o Comparável a ACT padrão

DISCUSSÃO A pasta da Fracção IV-1 de Cohn contém uma concentração ligeiramente mais elevada de ACT (5-10 mg/g de pasta) do que o plasma (4-5 mg/g de proteína). Consequentemente, a suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn fraccionada a partir de plasma humano é o material de partida preferido -24- para purificação adicional. A ACT humana foi purificada até à homogeneidade a partir de uma combinação de plasma humano por vários procedimentos, tais como fraccionamento com sulfato de amónio, cromatografía com Cibacron Blue®, cromatografía em SP-Sephadex® ou QAE-Sephadex®, DNA-celulose, e S-300. Contudo, contrariamente aos resultados publicados de outros, verificámos que a purificação de ACT com fraccionamento com sulfato de amónio oq cromatografía directa em DNA-celulose resultou em baixo rendimento e baixa pureza quando se utilizou a Fracção IV-1 como o material de partida. A Prolastin®, uma preparação PI derivada de plasma comercialmente disponível (Miles Inc.) purificada por precipitação com PEG e DEAE-Sepharose® a partir da suspensão da pasta da Fracção IV-1, é constituída por 600 μg de PI por mg de proteína e uma pequena quantidade de ACT, 29 pg por mg de proteína. Isto reforça a nossa constatação de que a precipitação com PEG da pasta da Fracção IV-1 resulta em baixo rendimento e baixa pureza de ACT. Outra preparação comercial de proteína do plasma é antitrombina III (Thrombate®, Miles Inc.) preparada a partir da suspensão da pasta da Fracção IV-1 por cromatografía em heparina-agarose. Os nossos estudos mostraram que mais do que 91% da ACT não se ligava à coluna de heparina-agarose. Isto implicaria que a ACT tem o potencial para ser preparada como um produto secundário da AT-III. A pasta da Fracção IV-1 de Cohn contém três inibidores de proteinase maioritários; PI (30 mg/g de pasta), AT-III (5 mg/g de pasta) e ACT (5-10 mg/g de pasta). Estas proteínas têm valores de pi muito semelhantes; 4,6-5,1 para At-III, 4-5 para PI, 3,8-4,3 para ACT; e pesos moleculares semelhantes: 58 kD para AT-III, 53 kD para PI nativa, e 58-68 kD para ACT nativa. A separação optimizada de ACT de PI e AT-III a partir da pasta da Fracção IV-1 de -25- Ι/υη

Cohn dependia da utilização do tipo adequado de resina de permuta aniúniea eom o tipo adequado de tampão, pH e força iónica (condutividade) para remover PI e At-III na preparação de ACT purificada. A purificação de ACT a partir da suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn a pH 6,5 e condutividade de 1-2,5 mmho/cm através de DEAE-Sepharose® (mas não de Q-Sepharose®), pré-equilibrada com tampão de NaKP04 0,025 M pH 6,5 (condutividade de 2,5-3 mmho/cm) removeu a maior parte do PI com NaKP04 0,075 M pH 6,5 (condutividade 7,4-7,8 mmho/cm) e a ACT eluiu com NaKP04 0,1 M pH 6,5, 9-10 mmho/cm de condutividade. A ACT parcialmente purificada do eluído de DEAE contendo AT-ΠΙ e vestígios de PI foi adicionalmente purificada através de DNA-celulose. A maior parte da AT-III e vestígios do PI não se ligaram à DNA-celulose quando a coluna foi lavada com tampão de K2HP04 0,01 M, NaCl 0,085 M pH 8,0 condutividade de 8-9 mmho/cm, e só a ACT activada absorveu especifícamente à DNA-celulose e eluiu com NaCl 0,33 M em K2HP04 0,01 M pH 6,8 (condutividade de 24-25 mmho/cm). O rendimento global e a pureza da ACT após a coluna de DNA-celulose dependem da pureza da solução de ACT que é carregada na coluna. A DNA-celulose removeu AT-III e PI não ligadas quando se carregou na coluna ACT parcialmente purificada (eluído de DEAE) mas não a suspensão da pasta da Fracção IV-1 de Cohn. Isto resultou em ACT altamente purificada com actividade específica de > lmg/mg de proteína de actividade inibidora tanto para catepsina G humana como quimotripsina bovina. A ACT preparada a partir da pasta da Fracção IV-1 de Cohn apresenta uma gama de pesos moleculares semelhante por análise por SDS PAGE e HPLC e pontos isoeléctricos semelhantes quando comparada com ACT padrão -26- preparada a partir de plasma humano. A ACT antigenicamente intacta e activa pode ser purificada a partir da pasta da Fracção IV-1 de Cohn e são necessários estudos adicionais in vivo da sua actividade biológica para apoiar a sua utilização terapêutica.

Apresentados os· exemplos acima, é evidente para os especialistas na matéria que poderão ocorrer variações. Em conformidade, entender-se-á que a invenção aqui descrito será limitada apenas pelas reivindicações anexas.

Lisboa, 12 de Janeiro de 2001

LUIS SILVA CARVALHO Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 14 1200 LISBOA

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de antiquimotripsina-alfa-1 (ACT) humana a partir de pasta da Fracção IV-1 de Cohn que inclui ACT humana e inibidor de proteinase (PI) alfa humana e anti-trombina III (AT-III) humana comprendendo os passos de: (A) obtenção de uma solução aquosa da pasta da Fracção IV-1 de Cohn que inclui ACT, PI e AT-III; (B) fazer contactar a solução com uma resina de permuta aniónica a uma condutividade de cerca de 1,0 até 2,5 mmho/cm e um pH de cerca de 6,5 para adsorver a ACT, PI e AT-III; (C) lavar a resina em condições de pH de cerca de 6,5 e condutividade de 7,0 até 7,8 mmho/cm para eluir substancialmente todo o PI e AT-III; (D) eluir a ACT da resina para formar uma solução de eluído; (E) fazer contactar a solução de eluído a um pH de cerca de 6,8 e uma condutividade de 1,0 até 2,0 mmho/cm com DNA-celulose para adsorver a ACT; e (F) eluir a ACT da DNA-celulose. Lisboa, 12 de Janeiro de 2001 luís silva carvalho c~Tn Agente Oficial da Propriedade Industriaf RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA