DD257174A3

DD257174A3 - Verfahren zur herstellung der peptide z-ala-ala-lon-p-nitranilid oder z-asp-phe-ome mit metalloprotease

Info

Publication number: DD257174A3
Application number: DD28488985A
Authority: DD
Inventors: Ulrich Korn; Reiner Grunow
Original assignee: Ve Forschungszentrum Biotechno
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1988-06-08
Also published as: SU1664845A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Metalloprotease. Ziel ist die Entwicklung eines oekonomischen Verfahrens zur Herstellung von Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder L-Asp-L-PheOMe. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Auswahl zwischen Enzym und Zielprodukt zu treffen. Erfindungsgemaess wird Metalloprotease aus B. cereus ZIMET 10 700 fuer die Herstellung des Peptides Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder des Peptides Z-L-Asp-L-PheOMe verwendet. Ueberraschenderweise wurde festgestellt, dass das Enzym als Kulturfiltrat oder nach Reinigung durch einmalige Affinitaetschromatographie, bevorzugt mit Bacitracin-Silochrom, verwendbar ist.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid und Z-L-Asp-L-PheOMe (Aspartam) mit Metalloprotease aus einem Bacillus cereus-Stamm.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Zur Peptidsynthese werden neben verschiedenen organisch-chemischen Methoden Verfahren angewendet, bei denen Proteasen als Katalysatoren für die Knüpfung der Peptidbindung Verwendung finden. Der Vorteil beim Einsatz proteolytischer Enzyme liegt in einer einfachen Prozeßsteuerung und in der Ausschaltung der Racemisierung sowie anderer unerwünschter Nebenreaktionen (Übersicht: ISOWA, Y. (1978) Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi, 36,195-205 sowie insbesondere DE-PS 2647189). .

Es werden neben Serinproteasen mit Esteraseaktivität (z. B. Thermitase aus Thermoactinomyces vulgaris) vorwiegend Metalloproteasen verschiedener biologischer Herkunft verwendet, so z. B. aus Bacillus polymyxa. Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, Streptomyces caespitosus oder Streptomyces griseus. Diese Enzyme müssen vor der Anwendung gereinigt werden, um störende Serinproteasen zu entfernen. Eine Feinreinigung laßt sich vermeiden, wenn teure Serinproteaseinhibitoren (z.B. Kartoffelinhibitor) dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, rohe Enzympräparate oder zellfreie Kulturfiltrate von Mikroorganismen zu verwenden, die nur geringe Mengen oder keine Serinproteasen produzieren, z.B. Aspergillus oryzae oder Bacillus cereus NRRL B-12315 (DE-OS 3203292). Der Nachteil des letztgenannten Verfahrens besteht in der relativ großen Menge an Kulturfiltrat, die für die Synthese von Z-L-Asp-L-PheOMe aufgewendet werden muß.

cc-L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester ist als physiologisch wirksames Peptidderivat mit hoher Süßkraft bekannt. Es kann nach verschiedenen Verfahren, sowohl chemisch als auch unter Verwendung von Metalloproteasen, hergestellt werden. Eine Methode ist die Gewinnung von L-Asp-L-Phe (u.a. durch neukombinierte Gene) und die anschließende Methylierung des freien Säurerestes des Phenylalanine. Eine weitere Möglichkeit ist die Verknüpfung von Z-L-Asp und L-PheOMe mittels Metalloproteasen und anschließende Abtrennung der Carbobenzoxyschutzgruppe durch Palladiumkatalysatoren, wie sie in der DE-OS 3203292 beschrieben wird. Nach diesem Verfahren werden allerdings nur L-Aspartyl-L-Phenylalanin-alkylester durch enzymatische Kupplung einer aminogeschützten L-Asp mit einem carboxylgeschützten L-Phe-alkylester mit der Metalloprotease aus B. cereus NRRL B-12315 hergestellt.

Chromogene Peptide als Substrate für die Analytik verschiedener Proteasen nehmen ständig an Bedeutung zu. So beschreiben u.a. L.A. LJUBLINSKAJA et al. (1982) in Bioorganitscheskaja chimija 8,1620-1624, die Herstellung von p-Nitroanilinenthaltenden Peptiden mit Metalloproteasen aus Bacillus thermoproteolyticus und Bacillus subtilis. Das p-Nitroanilid verschiedener Tripeptide kann u.a. für die Bestimmung von bakteriellen Serinproteasen — z. B. von Subtilisinen, thiolabhängigen Serinproteasen, intrazellulären Serinproteasen usw. — verwendet werden. Mit guter Ausbeute läßt sich Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid produzieren, von dem Subtilisine das p-Nitroanilin durch Hydrolyse abspalten. Die Synthese von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid aus Z-AIa-AIa und Leu-p-Nitroanilid mit Hilfe von Metalloproteasen aus B. thermoproteolyticus und B. subtilis ist jedoch nicht als bloße Umkehr der Hydrolyse anzusehen (vgl. V. M. STEPANOV [1984] Symp. Biol. Hungarica 25,49-55). Die Synthese dieses Produktes mit Metalloprotease aus B. cereus ist bisher noch nicht durchgeführt worden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die ökonomische Herstellung von mehreren Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder Z-L-Asp-L-PheOMe mit einer Metalloprotease aus Bacillus cereus.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Auswahl zwischen Enzym und Zielprodukt zu treffen.

Erfindungsgemäß wird Metalloprotease aus B. cereus ZIMET10700 für die Herstellung des Peptides Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder des Peptids Z-L-Asp-L-PheOMe verwendet.

Überraschenderweise wurde fest gestellt, daß das Enzym auch als Kulturfiltrat oder nach Reinigung durch einmalige Affinitätschromatographie verwendbar ist.

Der verwendete Mikroorganismus ist im DD-WP 226156 charakterisiert.

Es wurde festgestellt, daß sich Z-AIa-AIa mit Leu-p-Nitroanilid und Z-L-Asp mit L-PheOMe mit hoher Ausbeute bereits durch

geringe Enzymmengen verknüpfen lassen, unabhängig davon, ob das Enzym als Bestandteil des Kulturfiltrats oder in gereinigter Form vorliegt.

Die Effektivität des Syntheseverfahrens ist verständlicherweise höher, wenn gereinigtes Enzym verwendet wird, da neben der Reaktionsgeschwindigkeit auch die Konzentration der Reaktanden pro Volumeneinheit wesentlich erhöht werden kann. Ein sehr wirksames Reinigungsverfahren für die Metalloprotease aus B. cereus ZIMET10700 ist die Affinitätschromatographie mit Bacitracin-Silochrom (US-PS 4264738). Mit ihrer Hilfe kann bereits nach einmaligem Durchlaufen des Kulturfiltrates ein fast kohlenhydrat- und fremdproteinfreies Enzym gewonnen werden, das bis zu 6fach konzentriert vorliegt. Mit diesem Enzym lassen sich pro Volumeneinheit höher konzentrierte Reaktanden bei kürzerer Reaktionsdauer mit gleicher und besserer Ausbeute umsetzen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

74mg Z-AIa-AIa und 62 mg Leu-p-Nitroanilid wurden in 250μΙ Dimethylformamid gelöst und mit 500μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt. Nach Temperierung auf 35°C wurden 180μΙ Kulturfiltrat aus Bacillus cereus ZIMET10700, das etwa 140/ig Enzym enthielt, zugegeben. Die Konzentration der Substrate betrug danach jeweils 200μΜοΙ und nach 25 Stunden rühren bei 35°C wurden 51 % Produkt erhalten. Die qualitative Bestimmung des Endproduktes erfolgte durch DC auf Kieselgelplatten im System n-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser=10:15:3:12 und die Detektion im UV-Licht, nach Ninhydrinbehandlung und durch KJ nach Chlorierung. Des weiteren wurde die HPLC zur qualitativen und quantitativen Ermittlung des Endproduktes verwendet. Die Detektion erfolgte beim Absorptionsmaximum von p-Nitroanilin (315nm) anch Trennung von Substrat und Produkt an einer Ci₈-SaUIe im Acetonitrilgradienten.

Zusätzlich wurde die Ausbeute an Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid gravimetrisch nach mehrfachem Waschen mit NaHCO₃ und Wasser bestimmt.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei jedoch 74mg Z-AIa-AIa und 62mg Leu-p-Nitroanilid 250μΙ Dimethylformamid gelöst und Γηίί300μΙ 5OmM Tris-HCI,pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt werden. Das Gesamtvolumen beträgt 900μΙ und die Konzentration der Substrate jeweils 250μΜοΙ. Nach Temperierung werden 10μg eines durch Affinitätschromatographie gereinigten Enzymsaus B.cereus ZIMET 10700 zugegeben und 18 Stunden bei 35°C gerührt. Die Ausbeute an Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid betrug 72%.

Beispiel 3

24,4mgZ-Aspwerdenin30μl6N NaOH und 42,2mg PheOMe-HCI ίη200μΙ Dimethylformamid gelöst und ηηΗ:300μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt. Nach Temperierung auf 35°C wurden 100μΙ Kulturfiltrat, das etwa 110μg Enzym enthielt, zugegeben. Die Ausbeute betrug nach 24stündigem Rühren 38%. Die qualitative und quantitative Bestimmung des Z-Aspartams erfolgte wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß die Detektion des mittels HPLC getrennen Produktes bei 220 nm durchgeführt wurde.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 3 wird wiederholt, wobei jedoch 122 mg Z-Asp in 160μΙ 6 N NaOH und 211 mg PheOMe-HCI in 800μΙ 5OmMTHs-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gelöst werden. Nach Temperierung auf 35°C wurde 1 mg affinitätschromatographisch gereinigtes Enzym in 100μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren konnten 54% Ausbeute an Z-Aspartam erzielt werden.

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, wobei jedoch die vierfache Menge der Reaktanden in 2,5 ml 50 mMTris-HCI-Puffer, pH 7,0, mit 1,OmM Ca-Azetat gelöst werden. Nach Temperierung auf 35⁰C werden 3 mg affinitätschromatographisch gereinigtes Enzym zugefügt. Nach 5 h Rühren wird derfeste Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand erneut inkubiert. Nach weiteren 5 h wird der neu entstandene Niederschlag zentrifugiert und quantitativ Z-Aspartam bestimmt. Die Gesamtausbeute beträgt 85%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung der Peptide Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitranilid oder Z-Asp-Phe-OMe durch Verknüpfen von Z-AIa-AIa mit Leu-p-Nitranilid bzw. Z-L-Asp mit L-Phe-OMe-HCl mit Metalloprotease, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloprotease von Bacillus cereus ZIMET 10700 verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloprotease als Bestandteil des Kulturfiltrates oder nach affinitätschromatographischer Reinigung, bevorzugt mit Bacitracin-Silochrom, eingesetzt wird.