DD144538A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden} die nach vollständiger bzw. partieller Abspaltung der Schutzgruppen als Wirkstoffe bzw, als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen können. Ziel der Erfindung ist die Herstellung sterisch einheitlicher Peptide, Durch die Erfindung wird die sonst bei enzymatischen Peptidsynthesen in Puffersystemen unter Zusatz von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln auftretende Enzyraschädiguxig entscheidend zurückgedrängt und durch leichte Abtrennung der Protease aus dem Reaktionsansatz eine mehrfache Wiederverwendung des Biokatalysators ermöglicht. Die Peptide werden hergestellt aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, bei denen, die in Reaktion tretende Carbcxygruppe unblockiert ist oder eine Estergruppe trägt, und einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid einschließlich der entsprechenden Amide, bei denen die in Reaktion tretende Aminogruppe ungeschützt ist, in einem protease-spezifischen Puffersystem mit einer löslichen oder immobilisierten Protease unter Zusatz von mit 'Wa'sser nicht mischbaren organischen-Lösungsmitteln oder Mischungen solcher Lösungsmittel. Diese Peptide können nach'-Abspaltung der Schutzgruppen als Pharmaka oder nach partieller Deblockierung.als Zwischenprodukte, zur Synthese anderer therapeutisch nutzbarer Peptidwirkstoffe eingesetzt werden.

Description

~^Λ~ 2 1-38 83

VEEPiHREI ZUR HERSTELLUNG VON PEPTIDEH

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach vollständiger bsw« partieller Abepaltung der SchutBgruppen als Wirkstoffe bzw«, als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen können,,

Charakteristik der bekannten technischen Jjösuneen

Zur Herstellung von Peptiden können verschiedene organischchemische Verföiren, wie die Azid-Methode, das Anhydrid-Verfahren, die Bicyclohex.ylcarbodiiraid-Methode, das variantenreiche Verfahren der Aktivester und viele andere mehr eingesetzt werden (vgl* Übersicht: WÜHBCH,- E* (1974) Synthese von Peptiden, in Houben-Y/eyl, Ed₀ 15* 1/2, Methoden der organischen Chemie, MÜLLER, Ξ« (Hrsg«) Georg Thieme Verlag, Stuttgart)» Bei der Herstellung von Peptiden mit Hilfe dieser genannten Verfahren treten verschiedene Schwierigkeiten auf, die durch !Racemisierung, Nebenreaktionen, aufwendige Temperatursteuerung, komplizierte Reinigungsverfahren usw» gekennzeichnet sind» Sin besonders schwerwiegender Hachteil der 'herkömmlichen Verfahren ist das nach wie vor ungelöste Problem der Vermeidung von Racemisierung, insbesondere bei Pragmentkondensationen· Für den Aufbau'langkettiger biologisch aktiver Peptidwirkstof™ fe ist ein rafseraisierungsfreier Verlauf der Kupplungsreaktion

2 1 3883

von entscheidender Bedeutung, da sich Stereoisomere nicht mehr vollständig abtrennen lassen· Da die optische Reinheit der Syntheseprodukte Voraussetzung für die volle biologische Aktivität der Peptidwirkstoffe ist, ergeben sich eminente Hachteile bei der industriellen Anwendung der genannten organisch-chemischen Verfahren.

Heben den chemosynthetischen Peptidsynthese-Methoden wurden auch Verfahren beschrieben, bei denen Proteasen als Katalysatoren für die Knüpfung der Peptidbindung Verwendung fanden (BERGMÄHN, M₄₅ u. KUMKBL-CQMAT, H* (1937), ;'J. Biol. Chern,, JLlä» 707)* Durch den Einsatz von proteolytischen Enzymen als Katalysatoren bei der Peptidknüpfungsreaktion wird eine Ausschaltung der Racemisierung sowie anderer Nebenreaktionen erreicht und darüber hinaus ist eine einfache Prozeßsteuerung möglich«. Bei den bekannten Verfahren der enzymatischen Peptid» synthese (Übersichts ISOWA, Y. (1978)„ Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi, "26,; 195 - 205) erfolgt die Knüpfung der Peptidbindung in. Gegenwart proteolytischer Enzyme unter Verwendung geeigneter Puffersysteme unter Zusatz von mit 'Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, um die Reaktanden "weitgehend in Lösung zu halten© Weiterhin hat es sich gezeigt, daß durch mit Wasser mischbare organische Cosolventien das Gleichgewicht der proteasekatalysierten Reaktion in Richtung der Synthese verschoben wird (G. A« HOMMDBSRG_} J» A* MATT-IS u. M„ LASKOWSKI, Sr. (1978)ν Biochemistry, Η., 5220; K. 'HSfOUYB et al_e (I979)e J· Amer* Chem. Soc_e,:J01, 751)« Die Verwendung von mit .'Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln besitzt aber den Hachteil, daß a) durch den Zusatz hoher Anteile solcher Lösungsmittel, wie Methanol, Dimethylformamid, Dirne thylsulfoxid, Tetrahydrofuran u« a. die eingesetzte Protease geschädigt wird und b) eine Rückgewinnung des Biokatalysators zum Zweck eines wiederholten Einsatzes aus solchen Reaktionsmischungen bei industriellen Prozeßführungen praktisch nichtrröglich. ist. Darüber hinaus können Alkohole als Cosolventien bei der ·. enzymatischem Peptidsynthese, wenn sie in'sehr hohen Anteilen zugesetzt werden, auch, als Reaktiohs- partner fungieren (E. G, BiGALLS et al. (1975)« Biotech»

2 1:38 83

Bioeng·, 22, 1627 - 1637) und durch die resultierenden Ester™ derivate das Endprodukt verunreinigen*

Ziel der Erfindung . ' : ^:

Ziel der Erfindung ist die Herstellung von optisch einheitlichen Peptiden durch den Einsatz von löslichen und immobi». lisierten Proteasen unter Reaktionsbedingungen, die eine mehrfache Wiederverwendung der Biokatalysatoren gewährleisten·

Durch die Erfindung soll die sonst bei enzymatischen Peptid--' Synthesen unter Zusatz mit Wasser mischbarer organischer Coßolventien .mögliche Schädigung des Enzyms und die damit ver~ bundene Verminderung der katalytischen Wirksamkeit entscheidend reduziert und gleichzeitig eine mehrfache Wiederverwendung des Biokatalysators ermöglicht werden« .Erfindungsgemäß'werden .Peptide- hergestellt aus einer selektiv geschützen- Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, deren in Reaktion tretende Garboxygruppe unblockiert ist oder eine Estergruppierung trägt, und einer selektiv geschützten ^aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid einschließlich der entsprechenden imide., bei denen die in Reaktion tretende iminogruppe unblockiert ist, in einem proteasespezifische PufferBystem unter Zusatz von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln oder Mischungen solcher Lösungsmittel in Gegenwart '.löslicher oder immobilisierter .Proteasen· Sfach beendeter .-Peptidsynthese, Produkt ab trennung und Aufarbeitung können die Schutzgruppen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partiell oder total abgespalten werden. Im Gegensatz zu bekannten enzymatischen Peptidsynthesen in Puffersystemen unter Zusatz von mit Wasser mischbaren'organischen Lösungsmitteln v/ird durch die erfindungsgemäße Verwendungvon .slit Wasser nicirit mischbaren Cosolventien das in der Puff er phase befindliche? Enzym .keinen schädigenden Einflüssen ausgesetzt^ und gleichzeitig kann-das'. Enzym nach der Kupplungsreaktion durch Phas.entrennung zurückgewonnen werden· Durch die

2138 83

verwendeten inerten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel werden unerwünschte Uebenreaktionen, wie sie z· B· bei der literaturbekannten Verwendung von Alkoholen möglich sind, vollständig ausgeschlossen. Der Einsatz immobilisierter Proteasen ermöglicht weiterhin enzymatisch^ Peptidsynthese ohne Produktausfällung* Die nachgewiesene mehrfache Wiederverwendung sowohl des löslichen als auch des immobilisierten Enzyms besitzt eine hohe ökonomische Relevanz Die Erfindung eignet sich sowohl für den schrittweisen Aufbau eines Peptids als auch für Fragmentkondensationen, wobei zur Blockierung derjenigen funktionellen Gruppen, die selektiv geschützt werden sollen» die in der Peptidchemie gebräuchlichen Schutzgruppen einschließlich polymere Harze mit geeigneten Ankergruppen herangezogen werden können. Als Enzym sind alle bekannten Proteasen einsetzbar, wobei die Auswahl des als Katalysator verwendeten Enzyms in Abhängigkeit vom Syntheseobjekt aufgrund der Substratspezifität erfolgen muß· Interesaanterweise konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auch H^terte-Butyloxy-carbonyl-geschützte Car™ boxykomponenten mit Chymotrypsin als Katalysator erfolgreich verknüpft werden, obgleich in der Literatur solche Umsetzungen nicht gelangen.

Die Erfindung soll nachstehend an 6 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden«

In den Beispielen werden die Aminosäurennach den international gültigen Regeln abgekürzt» Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet;

Ac Acetyl

Z · Benzyloxycarbonyl

Boc tert·-Butyloxycarbonyl

OMe Methylester '

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

HOBt I-Hydroxybenaotriazoi

2 138 83

·. . : . . ...; ;. . . - 5 --

Beispiel 1

g^nt he se,,,, ,von Ac_n-Le u-P fce -Le u-

a) mit gelöstem,, Chymotrypsin

66,9 mg (Ο,,2 inraol) Ac-Leu-Piie-OMe und 26 mg (0,2 romol) Leu-IHp werden in 1,5 ml 1,1,2-Trichlorethen gelöst, imter Rühren mit 0,5 ml einer 0,1 mil Lösung von Chymotrypsin in HaHCO₃ZNa₂CO₃-PUffer (0,2 M₅ pH 10) versetzt und 20 Min« bei Raumtemperatur gerührte Das ausgefallene Produkt wird abgefrittet und nacheinander mit Wasser, 1'N HGl, Wasser, HaHGOo-Lösung sowie noch zweimal mit Wasser 'gewaschen·· Anschließend wird das Produkt bei 110 ⁰G 1 Std» getrocknet· Ausbo 72,8 mg (84 % d, Th·) P_e 284 - 285 ⁰G

Zu einer Suspeneion von 100 mg an Kieselgel fixiertem Ghyiüotrypsin (entsprechend ca» 2 mg Chymotrypsin) in 1 ml 0,2 1 Garbonatpuffer (pH 9,7) v/erden 66,9 mg (0,2 mmol) Ac-Leu-Phe-OMe und 26 mg (0,2 mmol) Leu-lHp» gelöst in 1,5 ml Dichlormethan, gegeben und 1,5 Std« bei Raumtemperatur intensiv gerührt» Die Reaktionsmischung wird auf eine Glasfritte gebracht und das geschätzte Peptid mit 7mal T ml Methanol vom immobilisierten Enzym abgelöst· Das Piltrat wird i« Yak« zur irockne gebracht, auf eine Pritte Uberführt' und wie unter a) sufgearbeitete Ausb« 55 mg (64 %).'/ P* 284 - 285 ⁰C

Beispiel 2

- 6- - , . : . . .,

213883

Z- Ala-Phe ,-Le u-HEU

a) mit,

76,9 mg (0,2 imnol) Z-Ala-Phe~OMe und 26 mg (0,2 mmol) LeU-HH₉ werden mit 0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff und 0,5 ml einer 0,6 mM Lösung von Chymotrypsin in NaHCOo/lTapCOo-Puffer (0,2 M, pH 10) versetzt und bei Raumtemperatur 1,5 Stde gerührt» Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert und nacheinander mit Wasser, 1 U HGl, Wasser, UaHCOo-Lö-Bung sowie noch zweimal mit Wasser gewaschen« Anschließend •wird das Produkt bei 110 ⁰C 1 Std* getrocknet, Ausb, 69,8 mg (72 $S.d· Th«) I¹. 224 - 226 ⁰G

b)

76,9 mg (0,2 ramol) Z-Ala-Phe-OMe werden in 1,5 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst und dazu 26 mg (0,2 mmol) Leu-ϊΤΗ, gelöst in 1,2 ml NaIlGO₃A^Ta₂CO₃-Puffer (0,2 M,- pH 10), sowie 250 mg an Kieselgel gebundenes Chymotrypsin (entsprechend ca. 5 mg Chymotrypsin) zugefügt,, lach 2stdg_β Rühren bei Raumtemperatur Y^ird der niederschlag auf eine Glasfritte überführt, das Produkt mit 8mal 1 ml-Methanol vom immobilisierten Enzym abgetrennt und wie unter 1b) aufgearbeitet

Ausb. 67,6 mg (70 %d« Th«) P. 224 - 226 ⁰C

Synthes

a) mit geIö_i6_item_ii<Chymp_rtr^jDgi_;n

78,5 mg (0,2 mmol) Boc-Leu-Pne-OMe und 260 mg (2 mmol) . LeU-HH₂ werden mit 1,5 sil einer Mischung aus 1,1,2-ü?ri chiorethen und Petrolether (30 - 50 ⁰G) im Verhältnis

1 : 2 sowie 1 ml einer 0,6 ml Lösung von Chymotrypsin in lTäHCO₃/Ha₂CO₃-Puffer (0,2 M, pH 10) versetzt und 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Pro dukt wird abgefrittet und nacheinander mit Wasser, 1 HCl, Wasser, NaHCO^-Lösung sowie mit der für die Reak tion verblendeten organischen Lösimgsmitte!mischung ge waschen· Das Produkt wird über ?p^5 ^^m Exsikkator getrocknet* Ausb_e 84,2 mg (86 % a« Th.) F. 205-208 ⁰G

b) lit i

IP - 48 ° (c = 0,5, Ethanol)

78,5 sag (0_s2 mmol) Boc-Leu-Phe-OHe werden in 1 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst und dazu 109,7 mg (0,845 mmol) LeU-UH₂, gelöst in 1 ml Carbonatpuffer (0,2 M, pH 10), sowie 250 rag an Kieselgel fixiertes Chymotrypsin (entsprechend ca« 5 Big Bnssym) gegeben und 4 Stdn· bei Raumtemperatur gerührt» lach Abtrennen des Reaktionsproduktes vom immobilisierten Enzym mit 5mal 1 nil Methanol und Einengen des Filtrates wird wie üblich aufgearbeitete 35,3 mg (36 ld« Th_e) F. 203 - 208 ⁰C

|³ - 49 ° Cc= 0,45, Ethanol)

75,6 mg (0,2 mmol) Boc-Leu-Phe-OH und 26 mg (0,2 mmol) LeU=KH₂ werden iri.0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst, unter '-Rühren mit 1,5 ial einer 1,5 raM Lösung von Papain (12 IS/mg) in McIlvaine»Puffer versetzt und 24 Std»-.bei'.' 30 ⁰C: gerührt« Des ausgefallene Produkt wird abgefrittet und-nacheinander mit Wasser, 0,5 IT. HCl, 7pro7_Je Ammoniak« lösung und. Wasser .gewaschen· Das Peptid wird über PpO₁-getrocknet*' ' '- ... , ;

Ausb. 76 mg (78 % d. Th.) P. 205 - 207 ⁰C ⁵ - 48,8 °(c -0,5, Ethanol)

Ein chemosynthetiech nach der DCC/HOBt-Methode erhaltenes Vergleichspeptid wurde in 6iproz. Ausb. erhalten:

P. 205 - 207 ⁰G [⁰⁴Jd⁵ - 44,3 ° (c= 0,5, Ethanol)

Synthese von Boc-Ala-Phe-»Leu-IT£U

Analog dem Beispiel 3a) werden 70,1 mg (0,2 ramol)Boc-Ala

Phe-OMe und 260 mg (2 mraol) Leu-HHp mit Chymotrypein-als Katalysator umgesetzt» Ausb. 68_S6 mg (76,5 % d_e Th.) P. 186 -188 ⁰C

Synthese yon, BpC-GIy₁-Gly-Phe~^

Analog dem Beispiel 3a) werden 78,7 mg (0,2 mmol)· Boc-Gly-.Gly-Phe-OMe und 260 mg (2 mmol) Leu-KHo mit Chymotrypsin als Katalysator umgesetzt (Reaktionszeit: 1 Std_e)_e Ausb. 59,1 mg (60 fr ύ. Th.) P. 163 - 165 ⁰C

Bjlg^JjXJj

e^sEnzymszur Synthese von

a) mit, gelöstem Chymotrypsin

200,7 mg (0,6 mmol) Ac-Leu-Phe-OMe und 78 rag (0,6 mmol) Leu-ϊίΗ^ werden mit 0,5 ml Dichlormethan und 1,5 ml einer 0,1 mM Lösung von Chymotrypsin in Carbonatpuffer (0,2 M, pH 10) versetzt und 20 Min. bei Raumtemperatur gerührt« Das ausgefallene Produkt wird abgefrittet und analog Beispiel 1a) aufgearbeitet..

Ausbe 202,0 mg (78 % d« Th.) P· 284 - 285 ⁰C Dem nach der Abtrennung des Produktes erhaltenen 3?iltrat wird die wäßrige Phase entnommen und diese zur Umsetzung von 133V⁸ mg (0,4 mmol) Ac-»Leu-Phe»OMe mit 52 mg (0,4 mmol) Leu-ML in 0,25 ml Dichlormethan verwendete Ausbo 131,2 mg (76 % d. Th.) F. 284 - 285 ⁰C

Das bei der Abtrennung des Produktes erhaltene wäßrige Filtrat wird einem dritten Ansatz zur Reaktion von 66,S mg (0,2 .mmol) Ac-Leu-Phe-OMe und 26 mg (0,2 mmol) LeU-UH₂ in Gegenwart von 0,2 ml Dichlormethan zugegeben« Ausb. 64,6 mg (74 % d. Th₉) ' F.; 284.- 285 ⁰C

Das bei Beispiel Ib) nach der Produktabtrennung resultierende immobilisierte Chymotrypsin wird zur Umsetzung von 66,9 mg (0,2 mmol) Ac-Leu-Phe-OMe mit 26 mg (0,2 mmol) Leu-lHo verwendet« Es wird wie unter Ib) beschrieben aufgearbeitet. 53₅6 Big (62 % d_e Th.) P₈ 284 - 285 ⁰C

Claims (3)

1· Verfahren zur Herstellung von Peptiden, bei welchem eine selektiv geschützte Aminosäure oder ein selektiv geschütztes Peptid, deren in Reaktion tretende Carboxygruppe unblockiert ist oder eine Estergruppierung trägt, mit einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid einschließlich der entsprechenden Amide, bei denen die in Reaktion tretende Aminogruppe unblockiert ist, in einem proteasespezifischen Puffersystem mit einem proteolytischen Enzym umgesetzt wird, wobei nach beendeter Kupplung und beschriebener Aufarbeitung erforderlichenfalls die Schutsgruppen nach bekannten Methoden partiell oder total abgespalten werden, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, daß die Umsetzung unter Zusatz von mit V/asser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln oder Mischungen solcher Lösungsmittel durchgeführt wird·

2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch g e ke nn ζ eichn e t, daß immobilisierte Proteasen eingesetzt werden·

-"- 2 13883

E rf in d -u η g s a ns d r u c h

3« Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch g e k e η η - · ' ζ e ich η e t, daß gelöste oder immobilisierte Proteasen mehrfach wiederverwendet werden»

4c Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch g e k. e η η zeichne t_s daß als mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel vorzugsweise die folgenden Solventien eingesetzt werden; Dichlorme than, Tetrachlorkohlenstoff s 1, t, 2-Triehlor-= ethen, Petrolether· ; ,