DE19834308A1

DE19834308A1 - Verfahren zur Herstellung von Säureamiden

Info

Publication number: DE19834308A1
Application number: DE1998134308
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Jakubke; Frank Bordusa
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2018-07-31
Also published as: DE19834308C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung eines organischen Säureamids. DOLLAR A Im Unterschied zu allgemein angewendeten chemischen Verfahren oder solchen, die Amidasen als Enzyme einsetzen, werden Proteasen als Biokatalysatoren eingesetzt. DOLLAR A Der Vorteil besteht in hohen Ausbeuten, nebenproduktfreier Synthese, einfacher Reinigung und des nur minimalen Schutzerfordernisses der Edukte. DOLLAR A Das Syntheseverfahren ist allgemein anwendbar.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen, die eine Säureamidbindung enthalten, und die Verwendung von Biokatalysatoren.

Zur Herstellung von Säureamiden als Vorstufen für verschiedenartige kommerzielle Produkte werden gegenwärtig hauptsächlich verschiedene organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersicht: Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band E5, Carbonsäuren und Carbonsäure-Derivate (Hrsg.: J. Falbe) 1985, S. 934-1312) eingesetzt. Im Verlauf chemischer Amidsynthesen, insbesondere von solchen mit zusätzlichen funktionellen Gruppierungen, werden sehr oft unerwünschte Nebenreaktionen beobachtet, wenn man sich nicht bei den Reaktionen zur Knüpfung der Amidbindung einer selektiven Schutzgruppen-Taktik bedient. Ein besonders schwerwiegender Nachteil herkömmlicher chemischer Verfahren ist das ungelöste Problem des Erhalts der chiralen Integrität. Da sich Stereoisomere äußerst schwierig vollständig separieren lassen, jedoch die optische Reinheit des Syntheseproduktes für eine spezifische Wirkung eine notwendige Voraussetzung ist, besitzt die industrielle Synthese von Säureamiden mittels organisch-chemischer Verfahren erhebliche Nachteile. Demgegenüber existiert ein zunehmender Bedarf an chiralen Amiden und Umweltaspekte fordern darüber hinaus nachdrücklich, milde biokatalytische Produktionsprozesse zu entwickeln.

Gegenwärtig sind zwei biokatalytische Methoden für die Produktion einfacher Amide bekannt. Bei der ersten Methode werden unter der Katalyse der Nitrilhydratase (EC 4.2.1.84) organische Nitrile (im weiteren nur als Nitrile bezeichnet) zu den entsprechenden Amiden hydrolysiert, während beim zweiten Verfahren geeignete Enzyme die Ammonolyse von Carbonsäureestern katalysieren.

Die chemische Konversation von Nitrilen ist mit verschiedenen Nachteilen belastet, wie das Erfordernis von stark sauren oder basischen Reaktionsbedingungen, einen hohen Energieverbrauch, die Bildung unerwünschter Beiprodukte, niedrige Ausbeuten sowie durch Umweltprobleme bei der Generierung der Abfallsalze. Die Biokonversation von Nitrilen (vgl. Übersichten: T. Nagasawa u. H. Yamada (1989) TIBTECH 7, 153-158; J.M. Wyatt u. E.A. Linton, The industrial potential of microbial nitrile biochemistry, in D. Evered und S. Harnett (eds.) Cyanide compounds in biology, Ciba Foundation Symposium 1988, 140, 32-48) wird durch die in der Natur weitverbreiteten Nitril-hydrolysierenden Enzyme katalysiert. Nachteilig ist hierbei, daß z. B. Nitrilhydratase-produzierende Mikroorganismen daneben noch Enzyme synthetisieren, die in einem Folgeschritt das Amid zur Säure hydrolysieren und somit unerwünschte Nebenprodukte bilden (A. de Raadt, N. Klempier, K. Faber, H. Griengl, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1992, 1, (1) 137-140). Außerdem sind selektive Nitril-hydrolysierende Enzyme gegenwärtig nicht als kommerzielle Produkte erhältlich.

Das zweite, nur wenig genutzte Verfahren der enzymatischen Amidbildung durch Ammonolyse von Carbonsäureestern ist insofern eingeengt, daß nur am Amidstickstoff unsubstituierte Amide hergestellt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist die biokatalytische Herstellung von organischen Säureamiden unter möglichst vollständigem Ausschluß von Nebenreaktionen.

Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1.

Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die biokatalytische Herstellung eines organischen Säureamids nicht wie gewöhnlich mit Amidasen, sondern entgegen der vorherrschenden Meinung der Fachwelt mit Proteasen, wobei durch eine programmierte Substratmanipulation die übliche Spezifität der eingesetzten Protease ausgeschaltet und dadurch die Katalyse der Knüpfung von Säureamidbindungen auch nichtpeptidischer Edukte ermöglicht. Da Proteasen gewöhnlich Peptidbindungen, d. h. substituierte Amide spalten, und diese proteolytischen Aktivitäten mit der Substratspezifität für spezifische Seitenkettenfunktionen der Aminosäurebausteine gekoppelt sind, sind die erfindungsgemäßen Ergebnisse sehr überraschend.

Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen biokatalytischen Amidsynthesen die bei Amidsynthesen durchaus üblichen Edukte in Form eines Carbonsäure- und eines primären Aminderivates eingesetzt. Als Carbonsäurederivate sind Ester geeignet, deren Abgangsgruppen Spezifitätsdeterminanten der eingesetzten Serin- oder Cysteinprotease enthalten und nachfolgend als Substratmimetika bezeichnet werden (Tab. 1). Dies schließt den Einsatz ladungstragender Esterabgangsgruppen für Proteasen mit einer nativen Spezifität für hydrophobe Aminosäureseitenketten ein, die ebenfalls hochspezifische Enzym-Substratkontakte vermitteln können. Die gesamte Verfahrensweise, d. h. die Wahl der Edukte, des Puffers, des Mediums, der Reaktionszeit, etc., ist verhältnismäßig unkritisch und kann vom Fachmann für biokatalytische Transformationen einfach ermittelt werden.

Tabelle 1

Auswahl von Spezifitätsdeterminanten für die Substratmimetika-vermittelte Proteasekatalyse

Als Carbonsäurederivate können auch chirale Substratmimetika eingesetzt werden. In der Regel müssen an der Umsetzung nicht involvierte funktionelle Gruppen während der enzymatischen Amidknüpfungsreaktion nicht temporär blockiert werden.

Als Aminkomponente eignen sich in Abhängigkeit von der eingesetzten Protease Edukte mit einer vorrangig primären aber auch sekundären Aminofunktion, wobei andere acylierbare Drittfunktionen frei vorliegen können.

Die Wahl eventueller Derivatisierungen und Ausgangssubstrate richtet sich dabei grundsätzlich nach dem gewünschten Endprodukt und dem eventuellen Erfordernis, Nebenreaktionen zu verhindern. Diese Wahl liegt daher im üblichen fachmännischen Handeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart aufgrund der Stereo- und Regioselektivität gegenüber der bisherigen Verwendung chemischer Verfahren den besonderen Vorteil, daß Edukte mit chiralen Zentren und anderen acylierbaren Funktionen ohne experimentell aufwendige und zu zusätzlichen Nebenreaktionen führenden temporären selektiven Blockierungsmaßnahmen eingesetzt werden können.

Erfindungsgemäß werden organische Säureamide bevorzugt hergestellt aus einem Carbonsäurederivat, dessen in Reaktion tretende Carboxylgruppe als Ester mit einer Spezifitätsdeterminante in der Abgangsgruppe vorliegt, die dem eingesetzten Enzym entspricht, und einem organischen Aminderivat, bei dem die in Reaktion tretende Aminofunktion unblockiert ist, in Gegenwart einer Protease, z. B. einer Thiolprotease wie Clostripain in Lösung oder Suspension bei Raumtemperatur, die ggf. Anteile organischer Lösungsmittel und/oder Puffersubstanzen enthält, oder auch bei tieferen Temperaturen.

Vorzugsweise wird die Reaktion in einem wäßrigen Medium durchgeführt, wobei u. U. tiefe Temperaturen vorteilhaft sind.

Die gebildeten Amide können mit geeigneten chromatographischen oder extraktiven Techniken präparativ separiert werden. Nach beendeter Aufarbeitung können ggf. vorhandene Schutzgruppen nach bekannten Methoden entfernt werden.

Im Gegensatz zu beschriebenen Verfahren zur Synthese von Amiden unter Nutzung anderer Enzyme wird durch den erfinderischen Einsatz von Proteasen in Kombination mit den Substratmimetika die Gefahr unerwünschter Amidspaltungen verhindert. Erstmalig wird für die Stoffklasse der organischen Säureamide ihre biokatalytische Synthese mit Proteasen durchgeführt. Der Effekt der Erfindung ist insofern überraschend als mit proteolytischen Enzymen eine nichtpeptidische Amidknüpfung nicht erwartet werden konnte.

Die mit der vorliegenden Erfindung herstellbaren Amide eignen sich, ggf. nach Abspaltung von essentiellen Schutzgruppen, z. B. als Wirkstoffe bzw. Zwischenprodukte von Wirkstoffen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher ausgeführt.

Beispiel 1 Synthese von Phenylbutterylargininamid mit Chymotrypsin

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 34 mM Argininamid (effektiver Anteil: 1/1,72) und 30 µM Chymotrypsin werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 10 min wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 90% d. Th. Parallelansätze nach 1, 2 und 5h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Beispiel 2 Synthese von Phenylbutterylalanylalaninamid mit Chymotrypsin

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 39 mM Alanylalaninamin (effektiver Anteil: 1/1,96) und 30 µM Chymotrypsin werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 10 min wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 80% d. Th. Parallelansätze nach 1, 2 und 5h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Beispiel 3 Synthese von Phenylbutterylpentylamid mit Clostripain

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 109 mM Pentylamin (effektiver Anteil: 1/448) und 7 µM Clostripain werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 1h wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 81.5% d. Th. Parallelansätze nach 2, 5 und 24h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Beispiel 4 Synthese von Phenylbutteryl-3-propanol-1-amid mit Clostripain

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 38 mM 1-Amino-3-propanol (effektiver Anteil: 1/92) und 7 µM Clostripain werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 1 h wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1:1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 39.0% d. Th. Eine O-Acylierung wurde nicht festgestellt. Parallelansätze nach 2, 5 und 24h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Beispiel 5 Synthese von Phenylbutteryl-1,2-propandiol-3-amid mit Clostripain

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 25 mM 3-Amino-1,2-propandiol (effektiver Anteil: 1/27) und 7 µM Clostripain werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 1h wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 81.1% d. Th. Eine O-Acylierung wurde nicht festgestellt. Parallelansätze nach 2, 5 und 24h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Beispiel 6 Synthese von Phenylbutteryl-1,3-diaminopentan-1-amid mit Clostripain

1 ml 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8, enthaltend 0,1 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 2 mM Phenylbuttersäure-4-guanidinophenylester, 51,7 mM 1,3-Diaminopentan (effektiver Anteil: 1/160) und 7 µM Clostripain werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 1h wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz. Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt und beträgt 35% d. Th. Eine N-Acylierung der primären Aminofunktion in Position 3 wurde nicht festgestellt. Parallelansätze nach 2, 5 und 24h führten zu den gleichen Ausbeuten.

Claims

1. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung eines organischen Säureamids, dadurch gekennzeichnet, daß man als Biokatalysator eine geeignete Protease gekoppelt mit einem Substratmimetikum, einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Säureamid aus einem Carbonsäureester mit der Spezifitätsdeterminante der eingesetzten Protease in der Esterabgangsgruppe und einem Aminderivat aufbaut.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in einem wäßrigen Medium durchführt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease Clostripain, Trypsin, Chymotrypsin, V8 Protease, Subtilisin bzw. Mutanten dieser Enzyme und als Substratmimetika Carbonsäureester mit den enzymspezifischen Spezifitätsdeterminanten in der Esterabgangsgruppe einsetzt.

5. Verwendung von Proteasen als Biokatalysatoren, dadurch gekennzeichnet, daß durch Proteasen in Verbindung mit Carbonsäureestern die Herstellung von organischen Säureamiden katalysiert wird, soweit die Carbonsäureester ihrerseits Substratmimetika darstellen.