JPH03147780A - アポエクオリンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、エクオリン生産菌のアポエクオリン生産能の
維持法及び増強法と該生産菌からの７ボエクオリンの抽
出法及び精製法に関する。

［従来の技術とその問題点］ 発光蛋白エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハ
ーバ−島近郊の海洋に生息する発光オワンクラゲより！
＃離されたカルシウム結合タンパク買である。エクオリ
ンは、自然界においてはタンパク質部分のアポエクオリ
ンと、基質部分であるセレンテラジンが、分子状酸素を
介して複合体を形成しており、この複合体にカルシウム
が結合することにより発光することを特徴とする。この
発光を利用してカルシウム濃度を測定することができる
。

本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲよりアポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、
その１次構造を決定した（特開昭６１−１３５．５８６
）、次いで、このｃＤＮ八を用いて大腸菌を宿主とし、
その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に成功
した（特願昭６０−２８０，２５９．６１−２４９．０
９８）、さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝
子を作威し、その融合タンパク賞の生産に成功した（特
願昭ｅ２−ｔ９ａ、ｏ３ｘ）　、また、エクオリンの発
光を利用した金属の検出方法を開発した（特願昭８１−
１０３，８４９）　、そして、特異的結合タンパク質の
遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成し、その融合
タンパク質の生産に成功した（特願昭８３−３０１１，
４２４）　。

さらに、酵素免疫測定法に利用すべく、その融合タンパ
ク賞の高純度生Ｆｓ、ＰＡ品の調製法を確立しく特願平
１−６９，８６２）、実際に免疫測定法への応用に成功
した（特願平１−７４．７４２）。

現在までに我々は、大腸菌により生産されてなるアポエ
クオリンの培養液上清からの精製法を確立している（特
願昭６２−２９１，６４０）　、　シかし、菌体内から
のアポエクオリンの精製に関する報告は未だにない。

本発明は大腸菌を宿主としたエクオリン生産菌のアポエ
クオリン生産能の安定な維持と増強に間する手法、並び
に該生産菌からのアポエクオリンの抽出と１ｍ製に関す
る手法の確立にある。

ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種の物質を検出するこ
とができる。すなわち、免疫測定法やＤＮＡプローブ、
バイオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できる
ものであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として
有用であることが予測される。

本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
大腸菌を宿主としたエクオリン生産菌のアポエクオリン
生産能の安定な維持と増強、並びに該生産菌からのアポ
エクオリンの抽出法と精製法を確立することができた０
以上の説明から明らかなように、本発明の目的はアポエ
クオリンの生産性の安定な維持と向上、並びにエクオリ
ン生産菌からのアポエクオリンの抽出と精製技術を提供
することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１１〜（１３）の構成を有する。

（１）エクオリン生産菌を縫代培養するに当り、該菌の
培地内における培養温度をコントロールすることを特徴
とする該菌の安定な継代法。

（２）前記第１項に記載の継代法により該生産菌中のア
ポエクオリン生産に関与するプラスミドを安定化する方
法。

（３）前記第１項に記載の継代法により選択されてなる
エクオリン生産菌。

（４）前記第３項に記載のエクオリン生産菌を培養する
ことを特徴とするアポエクオリンの生産方法。

（５）前記第４項に記載のアポエクオリン生産法におい
て培養温度をコントロールすることによるアポエクオリ
ン生産を増強する方法。

（６）前記第４項に記載のアポエクオリン生産法におい
てエアレージ薔ンをコントロールすることによるアポエ
クオリン生産を増強する方法。

（７）前記第３項に記載のエクオリン生産菌を煮沸処理
して該菌体内からアポエクオリンを抽出する方法。

（８）前記第３項に記載のエクオリン生産菌をクロロホ
ルム処理して該菌体内からアポエクオリンを抽出する方
法。

（９）前記第３項に記載のエクオリン生産菌をアルカリ
処理して該菌体内からアポエクオリンを抽出する方法。

（ｌＯ）前記第４項に記載のアポエクオリンの生産法に
より生産されてなるアポエクオリンを等電点沈澱法によ
り濃縮する方法。

（１１）前記第４項に記載のアポエクオリンの生産法に
より生産されてなるアポエクオリンを有機溶媒沈澱法に
より濃縮する方法。

（１２）前記第７項、第８項及び第９項に記載のアポエ
クオリンを抽出する方法、若しくは前記第１Ｏ項及び第
１１項に記載のアポエクオリンを濃縮する方法により、
抽出若しくは濃縮されてなるアポエクオリンをＤＥＡＥ
クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣ＆：より精製する
方法。

（１３）前記第１２項に記載のアポエクオリンの精製方
法により精製されてなるアポエクオリン。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明はアポエクオリンの生産に関する安定な維持と増
強、並びにエクオリン生産菌からのアポエクオリンの抽
出及び精製に係るものであり、たとえば後述の実施例に
示す方法で行うことができる。

本発明を添付第１〜１１図及び第１〜４表によって説明
する。

後述の第１表及び第２表はエクオリン生産菌の縫代によ
る培！！温度の影響を示す、第１表及び第２表によって
、エクオリン生産菌のアポエクオリン生産能力の安定な
維持には３０℃以下での継代が必要で、アポエクオリン
生産の場合にのみ培養温度を上げるという培養温度の区
別を要することがわかる。

第１図Ａ〜Ｄはアポエクオリン生産に及ぼす培養温度の
に響を示す、Ａは菌体量、Ｂはタンパク量、Ｃはエクオ
リン活性、Ｄは比活性に対する影響を調べた結果である
。第１図から培養温度が高い方がアポエクオリン生産が
多いことが明らかである（３０℃＜３７℃＜４２℃）。

第２図はアポエクオリン生産に及ぼすエアレーションの
影響を示す、エアレージＢンは菌体量の増加、すなわち
アポエクオリン生産性の向上に有効であることが明らか
にされた。

第３図は、エクオリン生産菌の振盪培養による時間経過
を追跡した結果を示す、　　１９Ｇ培地よりＬＢ培地の
方がアポエクオリン生産に好ましく、培地中に分泌され
たアポエクオリンは安定に保たれることが明らかにされ
た。

第４図は本発明に係る通気静置培養法の装Ｗ概略を示す
０本培養法はエアーレーションを行うことを十分に考慮
したものである。

第５図はＬＢ培地における通気静置培養の時間経過の追
跡結果で、第６図がその５０５−ＰＡＧＥによる分析の
結果である。

第７図は大豆培地における通気静置培養の時間経過の′
Ｊ！１￥ｆＳ結果で、第８図がその５Ｏ５−ｆ’ＡＧＥ
による分析の結果である。

大豆培地よりＬＢ培地の方が、アポエクオリン生産に好
ましいことが明らかにされた。また、本培養法により、
エクオリン活性からの換算で約７００■ｇ／Ｊｌのアポ
エクオリンが生産できることが明らかになった。

第３表（後述）は、菌体からのアポエクオリンの抽出に
関する結果を示し、第９図はその５Ｏ５−ＰＡＧＥによ
る分析を示す。

ＮａＯＨ処理ではｐ）Ｉｌｆ１以上で、アポエクオリン
が失活あるいは分解されることが明らかにされた。

クロロホルム処理、熱処理では、アポエクオリンが効率
よく抽出でき、活性な状態で保たれることが明らかにさ
れた。

第１Ｏ図は、エクオリン生産菌中のアポエクオリンの局
在について模式的に示したものである。

すなわち、ｐｌＰ−ＨＥを含有した大腸菌は、最終的に
ペリプラズム領域と培地中にアポエクオリンを蓄積する
。

第４表（後述）は、有１！［８剤沈殿によるアポエクオ
リンの回収率を示す、メタノールよりエタノールの方が
回収率は高いこと、また、回収されたアポエクオリンは
活性な状態であることがそれぞれ明らかにされた。

第１１図は、絹製アポエクオリンの５０５−ＰＡＧＥに
よる分析の結果を示す、菌体内から精製したアポエクオ
リンも上清から精製したアポエクオリンとほぼ同様の純
度まで、同精製法により精製できることがわかった。

第１２図は、エクオリン生産菌の培養液力）らのアポエ
クオリンのＩＩＩ製工程を示す。

上述のようにして得られた本発明のアポエクオリンの生
産並びに精製に関する技術を用し）ることにより、より
安定にアポエクオリンの生産力（保証され、より高収率
にアポエクオリンを精製することが可能となると考えら
れる。

［発明の効果］ 本発明のアポエクオリンに関する安定な生産及び生産性
向上、並びにアポエクオリンの抽出及びＰｉ製の有用性
は、当業者に自明である。

上記の開示により、当業者は特許請求された本発明を実
施できる。しかし、この技術の理解を増すために本発明
に重要なエクオリン生産菌の安定な維持法及び生産能の
増強法、並びにアポエクオリンの該生産菌からの抽出及
び精製法に使われる手順を実施例により以下に明らかに
する。

実施例１［エクオリン生産菌の継代に伴なう培養温度及
び宿主菌の影響］ エクオリン生産に関与するプラス主ドｐｔｐ−ｏεを有
する種々の大腸菌宿主（ＷＡＩ１０２）ＨＢＩＯＩ、　
Ｊ＾２２１、［１１２１０）を３０℃あるいは３７℃で
、ＬＢ培地中で１晩培養し、継代していった。核種々の
培養液の上清についてエクオリン活性を測定した。その
結果を第１表を及び第２表に示す。

第 表 注）全ての継代は３７℃培養で行った。

さらに活性低下した菌からプラス主ドをＴＡ製し、再度
新たな宿主に形質転換した株について、エクオリン活性
の測定を行なった。

その結果、どの宿主に形質転換した株についても、エク
オリン活性の増加は見られなかった。

また、活性低下した株について、　５０５−ＰＡＧＥで
分析した結果アポエクオリンに相当するバンドは、エク
オリン活性に比例して、減少し、より活性の少ない株に
ついては、そのバンドの検出は出来なかった。

第 ２ 表 第１表と第２表の結果の比較から、３７℃で培養した時
とは対照的に、３０℃で培養し、継代してゆくことによ
り、エクオリン生産菌の生産能をより安定に維持するこ
とが出来ると考えられる２アポエクオリン生産能の安定
化には、さらに３０℃よりも低い温度での培養が要求さ
れることが示唆された。また、宿主の這いにより、アポ
エクオリン生産能の安定性に若干の相違が見られる。

Ｄ１２１０株が最も生産能が安定に維持されるようであ
る。

アポエクオリン生産に関しては、　Ｗ＾８０２株が最も
大きな生産能力を有していることがわかる６以上のこと
から、アポエクオリン生産は、３０℃以下で継代しｋ（
前培養を含めた）エクオリン生産菌を種菌として、大腸
菌宿主としてＷＡ１１０２株を用いて、３７℃で培養す
ることが最も好ましいと考えられる。

実施例２［アポエクオリン生産に及ぼす培養温度の影響
］ エクオリン生産菌ｐｌＰ−ＨＥ／ＬＥ３９２の３７℃１
晩培養液を５０あるいは２００ａｊ！　　ＬＢ培地に１
／１０００容量植菌し、５００■１容量の坂ロフラスコ
中で、３０．３７あるいは４２℃にて、１１１時間振盪
培養した。

培養液上清について、エクオリン活性及びタンパク量の
測定を行ｔｌい、培養液については、８６０同にて吸光
度を測定した。その結果を３４１図Ａ。

Ｂ、Ｃ，Ｄに示す。

培養温度の上昇に供ない、エクオリン活性及び比活性は
上昇することがわかる。４２℃培養がアポエクオリン生
産に関して最も好ましいと考えられる。

実施例３［アポエクオリン生産に及ぼすエアレージ殖ン
の影響］ エクオリン生産菌ＰＩＰ−ＨＥ／ＬＥ３９２の３７℃１
晩培養液を５０、ｉｏｏ、２００，３００．４００．５
００ａｊ！　ＬＢ培地に１７１０００容量植菌し、５０
０ｍｊ２容量の坂ロフラスコ中で、３７℃にて、１８時
間振盪培養した。

培養液上清につき、エクオリン活性及びタンパク量の測
定を行ない、培養液の８６０ｎｍにおける吸光度の測定
も行なった。その結果は第２Ｉ５！Ｊに示すとおりであ
る。

エアレージ道ンの適正さに比例して、エクオリン活性、
比活性、菌体量が増加し、またそれぞれは比例的に変動
した。これは、エアレーションが菌体量に影響すること
を示し、エアレーションが適正な方がアポエクオリン生
産に関して好ましいと考えられた。

実施例４［エクオリン生産菌の振盪培養における時間経
通］ Ｍ９Ｃ培地中で、３７℃、１晩培養した培養液の２１１
を２００ｍＡ　　Ｍ２ＣあるいはＬＢ培地に植菌し、５
００ａｊ！容量の坂ロフラスコ中で、３７℃（で振盪培
養した。適当な培養時間にてサンプリングし、エクオリ
ン活性及び６ｆｌＯｎ重における吸光度の測定を行なっ
た。その結果を第３図に示す。

アポエクオリンの生産は菌体量の増加に伴ない、増加し
、アポエクオリンは培地中で安定に保たれていることが
わかる。　ＬＢ培地Ｍ８Ｃ培地では、ＬＢ培地の方がＭ
９Ｃ培地よりも２−３倍量のアポエクオリン生産を帰す
ことがわかる。

アポエクオリン生産にはＬＢ培地を用いた方が有利であ
る。

実施例５［エクオリン生産菌の通気静地培養による時間
経過］ エクオリン生産菌ｐｌＰ−ＨＥ／’ｆｊ＾８０２のグリ
セロール・ストック　１００μぶをＬＢ培地７５■ｌ植
菌し、さらに２００■ｇ／ａｎアンピシリンを２５μｌ
添加したＩｋ、３０ＯｍＪＺ容坂ロフラスコ中で３０℃
、１晩培養した。

これを種菌として、３ＩｔＬＢ培地（０，０２％２％ニ
ラサン’４；ＺホームｃＥ４ｓ１、Ｌｏｔ−Ｎｏ、５１
１６０９ｔｉ加、６１１Ｉ１ｇ／Ｉｔアンピシリン添加
）にて３℃坂ロフラスコ中、３７℃で培養した。

培養装置の概略は第４図に示すとおりで、フラスコ中へ
エアーポンプを用いて、２．７℃／分の容量の空気を０
．２μ讃のニトロセルロース・フィルターを通して通気
した。

送り込まれた空気はエアー・スパージャ−にて分散され
、フラスコ上部から排気される６以上のような通気静止
培！ＩＣよるエクオリン活性の時間経通の結果は第５図
社示した。また、　５ＯＳ−ＰＡＧＥの結果は３４６図
に示した。

さらに、同条件にて大豆培地（３０ｇ／ｆＬＴｒｙｐｔ
ｌｃＳａｙ　Ｂｒｏｔｈ　、　　５ｇ／ぶ酵母エキス）
にて時間経過を追跡した。その結果を第７図に示し、５
Ｏ５−ＰＡＧＥによる分析を第８図に示した。

第４図に示す装置を使用する培養法はエア−ポンプ 一例で、このようにエクオリン生産菌を培養することに
より、大量なアポエクオリン生産が可能となる。

ＬＢ培地と大豆培地で培養した場合のアポエクオリンの
生産量を比較すると、ＬＢ培地の方が大豆培地よりも多
く、培地中への分泌量も多かった。

その反対に菌体量は大豆培地の方が多かった。

アポエクオリン生産に関してはＬＢ培地を用いた方が収
量及び精製の問題から考えて有利である。

実施例６［エクオリン生産菌からのアポエクオリンの抽
出〕 エクオリン生産菌ｐｉＰ−ＨＥ／１１＾８０２の３７℃
１晩培養液をＮａＯＨにてｐｔ＋を１０．１１．１２）
！３にｉｌｌ製するか、クロロホルムを１／１００容量
加えるか、５分間５０．７５．１００℃で処理するかに
よって、アポエクオリンを抽出した。

その抽出液を遠心し、その上清について、エクオリン活
性を測定しに、また、　５０５−ＰＡＧＥによる分析も
行なった。その結果は第３表と第９図に示した。

第 表 ＮａＯＨを用いたアルカリ処理による抽出法では、ｐＨ
１１〜１３ではアポエクオリンが失活あるいは分解した
が、　ｐｎｔｏにおいては、アポエクオリンの失活は見
られず、その抽出率は約４０％であった。

クロロホルム処理による抽出法では、はぼ１００％のア
ポエクオリンの抽出が可能で、アポエクオリンも活性で
あった。

熱処理による抽出法では、５０℃で約半分、７５℃及び
１００℃で約１００％の抽出率であった。また、抽出さ
れたアポエクオリンは活性であった。

また、全ての抽出法において、アポエクオリン以外の蛋
白質の抽出は、はとんどなかった（他の蛋白質は凝集し
ているものと思われる）、このようにして抽出されたア
ポエクオリンは第１θ図に示すように、大ｎｘｍのペリ
プラズム１ｉｌｉ域に留まっているアポエクオリンで、
外膜タンパク買Ａのシグナルペプチドを欠いている。

なぜなら、その分子量のサイズは、培養液上清のアポエ
クオリンと同じで２５にｄであった０以上のことから菌
体内から抽出されたアポエクオリンは培養上清のものと
同じと考えられた。

抽出法としては、ｐＨ１ｏでのアルカリ処理、クロロホ
ルム処理、７５℃及び１００℃での熱処理が有効である
。

実施例７［有機溶媒によるアポエクオリンの濃縮］ エクオリン生産菌ＰＩＰ−１１Ｅ１０１２１０を坂ロフ
ラスコ５００１容中で２００■Ｊ２　Ｍ９Ｃ培地にて、
３７℃１晩培養した。その培養液を５０００ｒｐ■、１
０分、４℃にて遠心分離し、その上清を得る。上清の分
別した一定量に対して、その９倍量のエタノールあるい
はメタノールを加え、混合した後、室温あるいは氷水中
で４５分間放置した。

１００００ｒｐ冒、１０分、４℃で遠心した後、その沈
殿を乾燥し、３０＋＋Ｍ　Ｔｒｌｓ　［１（ｐＨ７，［
ｉ）、１０ｍＭ　ＥＤＴ＾バッファーの１／１０容量に
溶解した。

その溶液について、エクオリン活性とタンパク量を測定
し、回収量を算出した。その結果を第４表に示す。

第 表 同表の結果からアポエクオリンの回収率はメタノールよ
りエタノールの方が良いようである０回収率が低いのは
（１０〜５０％）、タンパク量が少ないためで、アポエ
クオリン生産が高い時は、より高収率の回収が期待出来
ると思われる。比活性（４７〜１１７％）から考えても
、有機溶媒沈殿後のアポエクオリンは活性であると考え
られる。

実施例８［エクオリン生産菌菌体内からのアポエクオリ
ンの精製］ エクオリン生産菌ｐｌＰ−ＨＥ１０１２１０の３７℃１
晩培養液８１を９０００ｒｐ會、１０分、４℃にて遠心
し、集菌した。菌体をＩｆＬの木に懸濁し、１００℃に
て５分間処理した。　ＩＭ　Ｔｒｌｓ　Ｈｌ：１（ｐ）
１１０）を１／１０容量加えて、混合した後、９０００
ｒｐｍ、　６０分、４℃にて遠心した。　その上清に酢
酸をｐＨが４．４になるまで添加した。　９０００ｒｐ
−５ｌＯ分、４℃にて遠心し、その沈殿を１７１Ｏ容量
のＩＭ　Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ（ｐＨ１０）　にて溶解し、
５　ｍＭ　Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，６）に対して透
析した。エクオリン活性を測定したところ、　５．７Ｘ
　１Ｇ’　ｒ、１．ｕ。

／−１であり、その容積は約１００＠Ｊ！であった。

−２０℃に保存した。

次にＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００クロマトグラ
フィーにかけた。バッファーとして３０５Ｍ　　Ｔｒｌ
ｓＨＣＩ（ｐＨ７，８）　、５ｍＭ　ＣａＣ１ｚを用い
た。溶出は７５■賛ＮａＣ１で行ない、溶出した主ピー
クを集め、−２０℃に保存した。

さらに、：Ｉスモシル１０Ｃ４（Ｉ　　Ｘ　１５ｃｍ　
）　ニよる逆相ＨＰＬＣにかけた。

水／アセトニトリル（０，１％トリプルオロ酢ａ＞系で
行なった。アセトニトリルの勾配は２０〜８０％とした
。

アポエクオリンのピークを分取し、凍結乾燥した。凍結
乾燥後の標品を３０ｍＭ　Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解し、エクオリン活性を
測定したところ、約４　ｘ　１０”　ｒ、１．ｕ、／ｓ
ｇであった。５ＯＳ−ＰＡＧＥの分析結果を第１１図に
示す、１が、培養液上清から精製した標品であり、２が
菌体内から精製した標品である。

上清からの標品と菌体からの標品を比較すると若干菌体
内からの精製標品の方に不純蛋白の混入が多く見られる
ものの、エクオリン活性はほぼ同等の値が得られ、活性
な状態で精製されたと考えられる。

以上のことから第１２図に示すように、アポエクオリン
は、培養上清から、等電点あるいは有機溶媒沈殿により
濃縮され、透析後、　ＤＥＡＥ−クロマトグラライ−の
ような陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離され
、シリカ系のような逆相ＨＰＬＣにより高純度に精製さ
れることが可能であると推察される。

また菌体からも、煮沸処理、アルカリ処理あるいはクロ
ロホルム処理じよる抽出を行なった後、上清からの精製
工程と同様の手順でアポエクオリンを精製することが可
能であると考えられる。

実施例９［プラスミドＤＮＡの調製］ コロニーあるいは培養液を５■ｕＬＢ培地に植え、３０
℃あるいは３７℃で１晩培養した。上記培養液１．５ｍ
ｉをエツベンドルフチューブに移し、遠心（１２，００
０ｒｐｍ、　２分）した。

上清を除き、ベレットを６０μｌのグルコース溶液（５
０−グルコース、２５ａ＋Ｍトリス・塩酸　（ｐＨ８，
０）、１０ｍＭ　ＥＤＴ＾）に懸濁した。

４０μ℃の１０−ｇ／■１リゾチーム溶液（使用直前に
グルコース溶液にて調製）を加え、穏やかに混合し、室
温で５分間放置した。２００μ℃の０．２ＮＮａＯＨ１
１％ＳＤＳ溶液を加え、穏やかに混合し、氷中で５分間
放置した。

１５０μぶの５Ｍ酢酸カリウム溶液を加え、穏やかに混
合し、水中で少なくとも５分間放置した。

遠心（１２，ＯＱＱｒｐｍ、　ｔｏ分、４℃）した後、
上清を別のエッペンドルフチェーブに移し、フェノール
で１回抽出し、エタノール沈殿した。遠心（１２，００
Ｏｒｐｍ、５分）シ、ベレットを７０％エタノールで洗
浄した後、真空乾燥した。ベレットを５０μ角のＴＥ１
１衝液（ＩＩＨ８，０）に溶解しＩＯμｇ／■ぶ濃度に
なるようにＲＮａｓａ＾（０，６ｔｇ／ｍＪ！溶液をｔ
ＵＵ加え、３７℃で３０分間保温した。

２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　８０００／
２．５ＭＮａＣ１を３０μＡ加え、よく混合し水中で少
なくとも１時間放置した。遠心（１，２００ｒｐ■、５
分）し、上清を除いた。ベレットを７０％エタノールで
１回洗浄し、真空乾燥した。ベレットを適当量のＴＥ（
ｐｎａ、ｏ）　に溶解した。

実施例１０［エクオリン活性の測定］ 反応液２ｏｏμｎ中に３０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣｌ　（
ｐＨ７，６）。

１０５Ｍ　ＥＤＴ＾（ｐＨ７−８）　１１衝液、１　ｍ
ｇ／ａｉセレンテラジン１μ角、２−メルカプトエタノ
ール４μぶ、試料液を含む。

４℃に１晩放置した後、反応液の一部をルミフォトメー
ター（ＴＤ−４０００，ラボサイエンス社）のキュベツ
ト中に移し、　３ＱｍＭ　ＣａＣ１ｔを１００μぶ注入
し、その発光量を測定した。

実施例１１［タンパク質の定量］ タンパク質の定量は、クマジー・ブリリアント・ブルー
を用いた色素結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ。

（１９７１ｉ）、＾ｎａ１．Ｂｌｏｃｈｅｍ、７２，２
４８）で行なった。すなわち、市販品のプロティンアッ
セイキットＩを用いて行なった。適当に希釈した試料２
．４ｍｊｌに染色液０．６■Ａ加えて、混合後、１５分
後に５９５ｎｍの吸光度を測定した。スタンダードとし
てはウシ・ｒグロブリンを用いた。

実施例１２［菌体量の測定］ 培養液について、吸光度計で測定した。測定波長は６８
０ｎ園を用いた。

実施例１３［５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）による分析］ 検体はＬａａｍｍｌｌ法（Ｌａａｍｍｌｌ、Ｕ、に、（
１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ２２７、８８０）によるＳＤ
５ポリアクリル７ミド電気電気心動け分離した。ゲルは
、クマジーブリリアントブルート２５０にて染色された
。東色後、１０％エタノール／酢酸で脱色した。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第１２図は本発明の説明図である。 ′ｓ１図は、アポエクオリン生産に及ぼす培養温度の影
響を示す、′ｓ２図は、アポエクオリン生産に及ぼすエ
アレージ真ンの影響を示す、第３図は、振盪培養による
アポエクオリン生産の時間経過を示す。 第４図は通気静置培養装置の概略を示す、第５図及び第
７図は通気静置培養によるアポエクオリン生産の時間経
過を示す。 第６図と第８図は、通気静置培養による時間経過に関す
る５０５−ＰＡＧＥの分析を示す。 第９図は、アポエクオリン抽出に関する５０５−ＰＡＧ
Ｅの分析を示す、第１０図は、アポエクオリンの局在化
の模式図を示す、第ｔｉ図は、精製アポエクオリンに関
する５０５−ＰＡＧＥの分析を示す。 第１２図は、アポエクオリンの精製工程を示す。 以上

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）エクオリン生産菌を継代培養するに当り、該菌の
   培地内における培養温度をコントロールすることを特徴
   とする該菌の安定な継代法。
2. （２）特許請求の範囲第１項に記載の継代法により該生
   産菌中のアポエクオリン生産に関与するプラスミドを安
   定化する方法。
3. （３）特許請求の範囲第１項に記載の継代法により選択
   されてなるエクオリン生産菌。
4. （４）特許請求の範囲第３項に記載のエクオリン生産菌
   を培養することを特徴とするアポエクオリンの生産方法
   。
5. （５）特許請求の範囲第４項に記載のアポエクオリン生
   産法において培養温度をコントロールすることによるア
   ポエクオリン生産を増強する方法。
6. （６）特許請求の範囲第４項に記載のアポエクオリン生
   産法においてエアレーションをコントロールすることに
   よるアポエクオリン生産を増強する方法。
7. （７）特許請求の範囲第３項に記載のエクオリン生産菌
   を煮沸処理して該菌体内からアポエクオリンを抽出する
   方法。
8. （８）特許請求の範囲第３項に記載のエクオリン生産菌
   をクロロホルム処理して該菌体内からアポエクオリンを
   抽出する方法。
9. （９）特許請求の範囲第３項に記載のエクオリン生産菌
   をアルカリ処理して該菌体内からアポエクオリンを抽出
   する方法。
10. （１０）特許請求の範囲第４項に記載のアポエクオリン
    の生産法により生産されてなるアポエクオリンを等電点
    沈澱法により濃縮する方法。
11. （１１）特許請求の範囲第４項に記載のアポエクオリン
    の生産法により生産されてなるアポエクオリンを有機溶
    媒沈澱法により濃縮する方法。
12. （１２）特許請求の範囲第７項、第８項及び第９項に記
    載のアポエクオリンを抽出する方法、若しくは特許請求
    の範囲第１０項及び第１１項に記載のアポエクオリンを
    濃縮する方法により、抽出若しくは濃縮されてなるアポ
    エクオリンをＤＥＡＥクロマトグラフィー及び逆相ＨＰ
    ＬＣにより精製する方法。
13. （１３）特許請求の範囲第１２項に記載のアポエクオリ
    ンの精製方法により精製されてなるアポエクオリン。