PT1704234E - Produção do péptido tipo glucagon 2 e de análogos do mesmo - Google Patents

Description

ΡΕ1704234 1

DESCRIÇÃO

"PRODUÇÃO DO PÉPTIDO TIPO GLUCAGON 2 E DE ANÁLOGOS DO MESMO"

Campo do invento

Este invento aplica a biologia molecular no campo da produção de proteínas. Mais particularmente, o invento está relacionado com a produção do péptido recombinante tipo glucagon 2 ou GLP-2 e de análogos do mesmo.

Fundamento do invento GLP-2 é um produto de 33 aminoácidos do gene glucagon. Dados recentes indicam que GLP-2 promove a absorção de nutrientes através da expansão do epitélio da mucosa por estimulação de proliferação das células da cripta e inibição da apoptose no intestino delgado. GLP-2 também reduz a permeabilidade epitelial e diminui a secreção de ácido gástrico estimulada pelas refeições e a mobilidade gastrointestinal. Muitos destes efeitos têm sido atribuídos não só ao péptido selvagem como também aos seus análogos incluindo, particularmente, os tornados resistentes à digestão por enzimas do soro, tais como DPP-IV, através da substituição, por exemplo, da alanina na posição 2 com glicina. Uma variedade de análogos de GLP-2 bio- 2 ΡΕ1704234 activos está descrita, por exemplo, na Patente U.S. N° 5789379.

Com o reconhecimento recente das suas propriedades farmacêuticas, existe uma procura de grandes quantidades de GLP-2 e dos seus análogos para permitir o desenvolvimento e subsequente uso médico destes produtos. Métodos de síntese em fase sólida ou em solução têm sido tipicamente aplicados para produzir as quantidades para pesquisa de GLP-2 e análogos até agora usados. A produção de GLP-2 como produto recombinante de hospedeiros geneticamente manipulados foi sugerida, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5789379 e 6287806 e está descrita na Patente U.S. N° 5629205. No entanto, os sistemas de produção anteriormente descritos possuem limitações em termos de rendimento e qualidade do produto e será desejável conseguir um sistema que produza péptido GLP-2 de qualidade numa forma eficaz em termos de custos. WO 99/64611 AI descreve multimeros de péptidos antimicrobianos que são expressos como um parceiro de fusão do gene purF. O gene codificador do péptido é repetido e transcrito num único mRNA, mas o produto da expressão do gene não está ligado. Assim, o mRNA é traduzido em muitas cópias separadas do produto proteico. WO 03/099848 A2 e WO 03/099854 A2 descrevem ambas um método de produção de polipéptidos de cópias únicas e múltiplas por corte com clostripaína de uma molécula percursora. O corte específico da proteina de fusão é 3 ΡΕ1704234 conseguido através da selecção dos aminoácidos que flanqueiam o local de corte, evitando assim o corte dentro do péptido pretendido.

Lidell et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 (16):13954-13951) descrevem o corte autocatalitico da mucina MUC2 numa ligação Asp-Pro a um pH abaixo de 6,0. WO 03/10022 A2 descreve um polipéptido em tandem que consiste num parceiro de fusão de corpo de inclusão e num polipéptido pré-seleccionado, polipéptido em tandem esse que forma um corpo de inclusão que permite a produção e purificação do polipéptido pretendido.

Sumário do invento

De acordo com o presente invento, é proporcionado um processo através do qual GLP-2 e seus análogos são produzidos não só com um rendimento relativamente elevado como também como produtos estruturalmente autênticos, compreendendo apenas a forma natural dos aminoácidos naturais na sequência que constitui o péptido GLP-2. De preferência, os resíduos N- e C-terminais são "autênticos nos extremos". Em particular, o presente processo origina o GLP-2 pretendido como um péptido tendo resíduos N- e C-terminais que não possuem aminoácidos residuais e outros grupos químicos que, por vezes, resultam dos métodos recombinantes de produção da proteína como um percursor fundido a partir do qual a proteína alvo deve ser libertada. 4 ΡΕ1704234

Mais particularmente, e de acordo com um aspecto do presente invento é proporcionado um precursor poli-peptídico de cadeia única em que duas ou mais cópias do péptido GLP-2 estão acopladas em tandem, através de um elemento de ligação que é cortável para libertar cada uma das unidades do péptido GLP-2 como um produto tendo extremos N e C autênticos. Os péptidos GLP-2 são acoplados usando um elemento de ligação que apresenta locais de corte em ambos os extremos. 0 elemento de ligação apresenta num dos lados um local de corte por ácido e um local de corte por enzimas no outro lado.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona um processo para a produção de um péptido GLP-2 tendo extremos N e C autênticos, em que o presente multimero do péptido GLP-2 é cortado para libertar cada uma das unidades de péptido GLP-2 que o compõem.

Num outro aspecto do presente invento, são proporcionados polinucleótidos úteis para a produção de tais precursores multiméricos de péptidos GLP-2.

Tanto a descrição geral anterior como a breve descrição dos desenhos e descrição detalhada que se seguem são exemplificativas e explanatórias e destinam-se a proporcionar uma explicação adicional do invento como reivindicado. Outros objectivos, vantagens e novas caracteris-ticas serão facilmente aparentes para os familiarizados com a área a partir da descrição detalhada do invento que se segue. ΡΕ1704234 5

Breve referência aos desenhos A Figura 1 ilustra a construção baseada em PCR de um gene que codifica uma unidade [Gly2]hGLP-2 flanqueada por um local de corte pela trombina e um local de corte por ácido; A Figura 2 ilustra a sequência de DNA esperada do produto de amplificação da Figura 1. A sequência da unidade [Gly2]hGLP-2 está sublinhada; A Figura 3 é um mapa do plasmideo pKS58 portador de um gene que codifica um hexâmero [Gly2]hGLP-2; A Figura 4 proporciona a sequência nucleotidica de pKS58, portadora de uma construção codificadora de um hexâmero de [Gly2]hGLP-2, em que a sequência de aminoácidos está igualmente apresentada, mostrando as unidades do péptido GLP-2 a negrito; e A Figura 5 proporciona uma análise de espectro-metria de massa de um péptido GLP-2 produzido como aqui descrito.

Descrição detalhada do invento

Num aspecto, o presente invento proporciona uma construção genética, na forma de um polinucleótido, 6 ΡΕ1704234 adaptada para produzir um péptido GLP-2 como um precursor de cadeia única multimérico compreendendo pelo menos duas cópias de um péptido GLP-2. Cada um desses péptidos está acoplado ao seguinte através de um elemento de ligação, o qual possui extremos com locais de corte que permitem a libertação dos péptidos GLP-2 como monómeros tendo extremos N e C autênticos e, assim, não possuem resíduos químicos derivados do elemento de ligação ou do processo de corte. Como produto recombinante, o péptido GLP-2 resultante também não possui grupos químicos tais como grupos bloqueadores usados na síntese química em solução ou em fase sólida.

No presente invento, as unidades do péptido GLP-2 dentro do multímero são acopladas usando um elemento de ligação que possui locais de corte nos extremos N e C das unidades de péptido GLP-2 residentes. Estes locais e os agentes usados para os cortar são seleccionados de forma que o péptido GLP-2 permaneça intacto durante o processo de corte, para que o isolamento e purificação originem um péptido GLP-2 tendo os resíduos terminais N e C pretendidos sem necessidade de processamento adicional.

Numa realização preferida do presente invento, o elemento de ligação é uma sequência peptídica relativamente pequena, consistindo em não mais de aproximadamente 25 resíduos, sendo desejável menos de aproximadamente 20 resíduos, sendo adequado menos de aproximadamente 15 resíduos e mais adequadamente menos de cerca de 10 7 ΡΕ1704234 resíduos. A sequência do elemento de ligação é escolhida de forma a evitar a formação de estruturas secundárias complexas que escondam o elemento de ligação relativamente ao agente de corte escolhido. 0 local de corte apresentado pelo elemento de ligação pode ser um local que seja vulnerável ao corte por enzimas ou por condições químicas, tais como pH. 0 elemento de ligação é um que apresente um local de corte por enzimas num extremo e um local de corte por ácido no outro extremo. O local sensível ao corte pela enzima pode ser qualquer local que não exista noutro local do multímero de péptidos GLP-2 e que seja cortado por qualquer enzima ausente noutro passo do processo de produção. Enzimas adequadas para tal corte e sequências reconhecidas e cortadas por essas enzimas incluem enterocinase e a sequência Asp-Asp-Asp-Asp-Lys e o Factor Xa e a sequência Ile-Glu-Gly-Arg. Numa realização preferida, o local de corte pela enzima é um que seja cortado pela trombina e a sequência de corte pela trombina é ValSerGlyProArg.

Um local de corte por ácido apresentado no multímero do péptido GLP-2 é adequadamente a sequência Asp-Pro, a qual é cortada em condições de pH baixo entre os resíduos Asp e Pro.

Em realizações do presente invento, o elemento de ligação proporciona, dentro do multímero, um local de corte por ácido no seu extremo N e um local de corte por trombina ΡΕ1704234 no seu extremo C. Numa realização específica, o elemento de ligação possui a sequência de aminoácidos ProValSerGly-ProArg. Como alternativa, será considerado que o resíduo Pro N-terminal e o local de corte pela trombina C-terminal possam ser separados por uma sequência de aminoácidos adicional que não altera a vulnerabilidade dos extremos às condições de corte pretendidas.

Quando o elemento de ligação particular referido é incorporado no multímero, as unidades do péptido GLP-2 são aquelas que incorporam Asp como resíduo C-terminal e que não possuem um outro local de corte por ácido e um outro local de corte por trombina. Quando ligado entre tais unidades de péptido GLP-2, o resíduo Pro N-terminal do elemento de ligação, juntamente com o resíduo Asp C-terminal da unidade de péptido GLP-2 a montante, formam o local Asp-Pro que é cortável com ácido, i.e., a pH baixo, para dar o extremo C autêntico do péptido GLP-2. Ainda, a sequência do elemento de ligação ValSerGlyProArg apresenta uma sequência de reconhecimento pela trombina que é cortável pela trombina no lado C-terminal do seu resíduo Arg, para dar o resíduo N-terminal autêntico na unidade de péptido GLP-2 a jusante. Ainda que seja apresentada uma sequência específica de corte pela trombina, será entendido que qualquer sequência equivalente reconhecida e cortada pela trombina pode ser incorporada no elemento de ligação, incluindo as sequências descritas por Chang, J. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 217-224. Será igualmente apreciado que qualquer unidade de péptido GLP-2 dentro do multímero não 9 ΡΕ1704234 deverá possuir qualquer sequência de corte pela trombina dentro da estrutura primária da unidade de GLP-2.

Assim, num aspecto importante do presente invento, é proporcionado um polipéptido de cadeia única que incorpora pelo menos duas unidades do péptido GLP-2, acopladas em tandem através de um elemento de ligação tendo a sequência ProValSerGlyProArg, em que o péptido GLP-2 incorpora um resíduo Asp C-terminal e não possui outra sequência de corte pela trombina e outra sequência de corte por ácido.

Numa realização preferida deste aspecto do presente invento, a unidade de péptido GLP-2 incorporada dentro do multímero é o análogo de GLP-2 humano em que a Ala na posição 2 está substituída por Gly, i.e., [Gly2]hGLP-2, tendo a sequência de aminoácidos ilustrada na Figura 2. Como alternativa, o péptido GLP-2 pode ser GLP-2 selvagem humano tendo a sequência de aminoácidos descrita por Buhl et al. Em J. Biol. Chem., 1988, 2 63(18):8621, um seu homólogo, ou qualquer outro análogo do mesmo que mantenha um resíduo Asp C-terminal e não possua locais de corte por trombina e por ácido. Análogos adequados podem ser seleccionados, por exemplo, de entre os descritos nas Patentes U.S. co-atribuídas Nos 5789379 e 6184201.

Noutras realizações, o precursor multimérico do péptido GLP-2 compreende pelo menos duas unidades do péptido GLP-2 e até 10 ou mais de tais unidades, e.g. até 10 ΡΕ1704234 cerca de 30 unidades e mais adequadamente até cerca de 20 unidades, ligadas em tandem através do elemento de ligação referido. Em realizações especificas, o número de unidades do péptido GLP-2 no precursor é 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Numa realização preferida, o precursor multimérico incorpora seis unidades do péptido GLP-2. Numa outra realização preferida, o precursor incorpora sete unidades do péptido GLP-2.

Será considerado que o multimero do péptido GLP-2, para expressão como produto recombinante, incorpore uma extensão N-terminal que inclui pelo menos um resíduo de metionina inicial. Em realizações, a extensão N-terminal é incorporada como um péptido veículo possuidor do resíduo metionina N-terminal e é cortável do multimero per se. O péptido veículo pode assim ser um sinal de secreção que é cortado pelo hospedeiro no processo de secreção do multimero maduro. Como alternativa e de forma desejável, o péptido veículo não é um sinal de secreção e o produto multimérico acumula-se no citoplasma do hospedeiro de onde é recuperado, facultativamente, na forma de corpos de inclusão. Sempre que o péptido veículo não se destine a ser removido pela célula hospedeira, desejavelmente o péptido veículo ainda incorpora aminoácidos que constituem o mesmo local de corte por enzimas presente dentro do multimero no extremo N-terminal de cada unidade do péptido GLP-2. Neste arranjo, o tratamento do multimero GLP-2 expresso com a enzima seleccionada não só corta o veículo do multimero, como também corta o multimero no extremo N de cada unidade 11 ΡΕ1704234 de péptido GLP-2 ali existente. Numa realização, o péptido veiculo inicia-se com um resíduo de Met e termina com um local de clivagem pela trombina, como seja ValSerGlyProArg. 0 péptido veículo N-terminal do multímero de GLP-2 pode ainda incorporar outras sequências intervenientes funcionais, por exemplo, na purificação do multímero, como seja a cauda de His, para aumentar o nível de expressão do multímero pelo hospedeiro seleccionado ou na promoção da formação do multímero como corpos de inclusão tais como sequências de aminoácidos hidrofóbicas.

Será igualmente considerado que o multímero do péptido GLP-2 possa terminar com uma unidade do péptido GLP-2 ou, caso se pretenda, com uma extensão peptídica útil, por exemplo, na purificação do multímero. Se for incorporada uma extensão peptídica, é desejável incorporar um resíduo Pro como resíduo inicial, de forma que o tratamento do multímero resultante com ácido corte não só a extensão C-terminal como também no extremo C de cada unidade do péptido GLP-2 dentro do multímero.

Numa realização mais preferida do invento, é proporcionado um multímero do péptido GLP-2 tendo a sequência ilustrada na Figura 4, compreendendo 6 unidades de [Gly2]hGLP-2 e incorporando como elemento de ligação a sequência ProValSerGlyProArg. A produção de tal multímero pode ser conseguida em qualquer célula hospedeira para a qual tenham sido 12 ΡΕ1704234 desenvolvidos sistemas de expressão. GLP-2 e os seus análogos não requerem modificação pós-tradução para a actividade e podem assim ser produzidos numa variedade de hospedeiros bacterianos e eucarióticos.

Numa realização, o multimero é expresso em células bacterianas, tais como células de E. coli, usando sistemas de expressão adaptados e bem estabelecidos para este fim. Um polinucleótido codificador do multimero pode, por exemplo, ser incorporado para expressão dentro de cassetes que dirigem a expressão a partir de promotores tais como lac, tac, trp, T7 e similares. A estirpe de E. coli escolhida como hospedeiro pode variar largamente, e inclui DH5, JM101 e BL21, entre outras. Os vectores úteis na transformação do hospedeiro seleccionado incluirão, tipicamente, plasmideos que incorporam origens de repli-cação e marcas seleccionáveis que permitem a detecção e sobrevivência selectiva dos transformantes.

De forma semelhante, uma variedade de hospedeiros e de sistemas de expressão eucarióticos pode ser explorada. Estes incluem Saccharomyces cerevisiae e sistemas de expressão baseados no sistema do factor de conjugação alfa, hospedeiros Aspergillus nidulans que utilizam o sistema de desidrogenase do álcool (alcA) ou Aspergillus nidulans que utiliza o sistema de expressão baseado no gene da glucoamilase, assim como sistemas de células de mamífero, tais como os sistemas de células COS e os sistemas baseados em CHO. 13 ΡΕ1704234

Os polinucleótidos codificadores do multimero de GPL-2 podem certamente ser produzidos por síntese química de novo ou podem ser preparados a partir de DNA codificador da unidade péptido GLP-2 seguindo uma série de passos de amplificação e ligação, todos de acordo com procedimentos convencionais e como aqui exemplificado.

As condições de cultura escolhidas para a célula hospedeira transformada também dependerão da espécie hospedeira e do sistema de expressão utilizado. Numa realização, sempre que o hospedeiro seja E. coli e o sistema de expressão se baseie no promotor tac, o transformante será cultivado em escala comercial na presença de antibiótico para manter a pressão selectiva nos transformantes. Na fase de crescimento logarítmica ou perto dela, a cultura receberá IPTG para retirar a repressão do promotor e permitir que se inicie a expressão. A cultura pode ser realizada à escala comercial de 200 ou mais litros.

Após cultura, o multimero de GLP-2 expresso pode ser isolado por cromatografia de selecção pelo tamanho, por cromatografia de permuta iónica ou por cromatografia de afinidade, particularmente no caso de ser incorporada uma marca de afinidade no multimero. Quando o multimero é produzido como um produto intracelular, as células em cultura podem ser tratadas num primeiro passo para lise das células e libertação do multimero e de outros produtos 14 ΡΕ1704234 intracelulares, por exemplo usando ureia 8M ou hidrocloreto de guanidina 6M ou disrupção mecânica das células, como seja com um homogeneizador ou sonicador. Não é necessário separar o conteúdo para posterior processamento. Numa realização do invento, os produtos de lise são tratados in situ de forma a estabelecer as condições de dissociação, como seja pela adição de cloreto de guanidina, e o pH da mistura é então ajustado com HC1 ou outro ácido equivalente, para introduzir condições ácidas, na gama de pH entre cerca de 1-3. A este pH, o local Asp-Pro é cortado em cada uma das interfaces entre o extremo C de uma unidade de péptido GLP-2 e o extremo N do elemento de ligação. Os produtos de corte resultantes, incluindo as unidades do péptido GLP-2 portadoras de resíduos do elemento de ligação no extremo N, podem então ser isolados por quaisquer meios convencionais tais como HPLC, cromatografia de exclusão por tamanho, por cromatografia de permuta iónica ou por cromatografia de afinidade. Os produtos recuperados podem então ser sujeitos a um passo de corte com enzimas em que a exposição à trombina resulta na remoção de um elemento de ligação residual no extremo N de cada unidade de GLP-2. 0 resultado é um rendimento multimolar de péptidos GLP-2, cada péptido GLP-2 tendo extremos N e C que, como pretendido, são autênticos e não possuem qualquer modificação química indesejável.

Como referido nos exemplos que se seguem, a produção por este métodos produziu [Gly2]hGLP-2 como um produto com extremos autênticos tendo uma massa (3752,59) que é essencialmente equivalente à teórica (3751,99). 15 ΡΕ1704234 O péptido GLP-2 assim produzido é formulado para utilização farmacêutica através da formação de uma composição farmacêutica em que uma quantidade terapeuticamente útil do péptido é combinada com um veiculo farmaceu-ticamente aceitável. A composição é formulada para administração parentérica e compreende uma dose unitária do péptido GLP-2 e um veiculo aquoso que é tamponado dentro de uma gama de pH e tonicidade fisiologicamente tolerável, e.g. pH 4-8, usando, por exemplo, soro fisiológico tamponado com fosfatos como veiculo. A formulação pode também compreender um agente estabilizador, como seja histidina, como descrito em WO 01/49314 ou um agente de depósito como seja gelatina como descrito na Patente U.S. N° 5789379. As doses unitárias do péptido GLP-2 situam-se tipicamente na gama entre 0,1 e 50 mg num volume de injecção de cerca de 1 ml.

Os exemplos que se seguem são dados a titulo ilustrativo do presente exemplo. Deverá ser entendido, no entanto, que o invento não está limitado a condições ou detalhes específicos descritos nestes exemplos.

Exemplos Várias construções de multimeros do gene [Gly2]hGLP-2 podem ser feitas num tubo de reacção tirando partido da endonuclease de restrição Bsal. Esta endonu-clease reconhece a sequência não palindrómica (GGTCTC), de 16 ΡΕ1704234 forma que o elemento de ligação e os genes [Gly2]hGLP-2 podem ser ligados apenas numa direcção, ligação cabeça com cauda.

Para se obter o nível máximo de expressão, as construções de genes multiméricos foram inseridas num plasmídeo sob o controlo do promotor do bacteriófago T7. Usando esta estratégia, foram obtidas sete construções multiméricas, contendo 2 a 7 unidades de gene [Gly2]hGLP-2 (de dímero até heptâmero). Os genes multiméricos foram expressos após indução por IPTG. 0 maior nível de expressão foi encontrado a partir das construções de hexâmeros e de heptâmeros.

Foi igualmente desenvolvido um método conveniente de lise celular e de clivagem com ácido. Após indução, o sedimento de células foi lisado com hidrocloreto de guanidina 6M e centrifugado. A solução do sobrenadante foi ajustada a pH 1,8 pela adição de HC1. Assim, a lise celular e a clivagem com ácido foram conseguidas em passos muito simples sem qualquer purificação entre a lise e a clivagem com ácido. Pode ser possível conseguir a lise celular e a clivagem com ácido numa única reacção, se o hidrocloreto de guanidina 6M for ajustado a pH 1,8 com HC1 e depois for adicionado ao sedimento de células E. coli. Os produtos clivados com ácido foram purificados por HPLC usando uma coluna C18 e depois tratados com trombina para se obter [Gly2]hGLP-2 madura, a qual foi ainda purificada por HPLC usando a mesma coluna Cis- Apenas dois passos de HPLC (pri- 17 ΡΕ1704234 meiro após a clivagem com ácido e depois após a clivagem com trombina) foram necessários para purificar [Gly ]hGLP-2 e o [Gly2]hGLP-2 purificado foi confirmado como sendo [Gly2]hGLP-2 autêntico por espectrometria de massa.

Exemplo 1 - Construção dos genes

Para construir multímeros do gene [Gly ]hGLP-2, um gene de [Gly2]hGLP-2, como mostrado abaixo, foi primeiro amplificado por PCR usando um plasmídeo, pG3M, o qual é portador de um gene [Gly2] hGLP-2 com codões optimizados e que recebeu a nova designação de pEW3G.

Como se mostra na Figura 1, a sequência iniciadora directa do PCR (Sequência iniciadora KS1-5) continha locais de reconhecimento pelas endonucleases de restrição Ndel e Bsal e o local de corte pela trombina, o qual é seguido de 18 nucleótidos codificadores dos primeiros seis aminoácidos de [Gly2]hGLP-2. A sequência iniciadora inversa (Sequência iniciadora KS2-3) continha locais de reconhecimento pelas endonucleases de restrição BamHI e Bsal, local de corte por ácido e uma sequência de 18 nucleótidos que codifica os últimos seis resíduos de aminoácidos de [Gly2]hGLP-2.

Para a reacção de PCR, a mistura de reacção de PCR inferior foi primeiro preparada num tubo de PCR. A mistura inferior continha 41 μΐ de água, 5 μΐ de tampão Tsg 18 ΡΕ1704234

Plus 10X, 2 μΐ da mistura de desoxinucleótidos (2,5 mM cada), 1 μΐ da sequência iniciadora KS1-5 (100 μΜ) e 1 μΐ da sequência iniciadora KS2-3 (100 μΜ). À mistura inferior, foi adicionado um pedaço de Ampliwax® e aqueceu-se a 65°C durante 5 min e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente na bancada. Após se formar uma camada fina de cera, a mistura superior continha 43,5 μΐ de água, 5 μΐ de tampão Tsg Plus 10X, 0,2 ng do plasmídeo pG3M em 1 μΐ e 0,5 μΐ de enzima TsgPlus. A enzima Tsg Plus consiste numa mistura de Polimerase de DNA Tsg e Polimerase de DNA Pfu. O tampão Tsg Plus 10X continha Tris-HCl 200 mM (pH 8,8), KC1 100 mM, (NH4)2S04 100 mM, MgS04 20 mM, 1% Triton X-100 e 1 mg/ml de albumina sérica bovina.

As condições do termociclador foram as seguintes:

Passo 1: 95°C durante 2 min Passo 2: 95°C durante 1 min Passo 3: 50°C durante 1 min Passp 4: 72°C durante 15 seg

Passo 5: Voltar para o passo 2 e repetir os Passos 2 a 4 mais nove vezes

Passo 6: 95°C durante 1 min Passo 7: 65°C durante 30 seg Passo 8: 72°C durante 15 seg

Passo 9: Voltar ao Passo 6 e repetir os Passos 6 a 8 mais dezanove vezes

Passo 10: 72°C durante 5 min

Passo 11: 4°C durante a noite 19 ΡΕ1704234

Após completados os ciclos de reacções de PCR, como descrito atrás, o produto esperado (uma banda de DNA de aproximadamente 140 pb), como se mostra na Figura 2, foi confirmado por electroforese em gel de 1,5% de agarose.

Quarenta μΐ dos 100 μΐ da mistura de reacção de PCR foram purificados usando um kit QIA ExII de acordo com as instruções do fabricante e depois digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Ndel. O DNA digerido foi separado por electroforese em gel de 2% de agarose, a banda de DNA foi cortada do gel e depois purificada usando QIA ExII. 0 produto de PCR purificado digerido com as duas enzimas e purificado foi ligado a pET29a, o qual foi previamente digerido com as mesmas duas enzimas de restrição, Ndel e BamHI. A ligação foi efectuada usando ligase de DNA QuickT4 à temperatura ambiente durante 6 minutos.

Em seguida, células competentes de E. coli DH5a foram transformadas com o produto de ligação. A 50 μΐ de células competentes descongeladas num tubo de microcen-trífuga (capacidade 1,8 ml), foram adicionados 3 μΐ dos 21 μΐ da mistura de ligação. A mistura de células competentes foi mantida em gelo durante 30 minutos, sujeita a choque térmico a 37°C durante 20 seg e depois mantida em gelo durante 2 minutos. Às células sujeitas a choque térmico, foram adicionados 900 μΐ de meio Super Optimal Catabolite ("SOCS") pré-aquecido (37°C). Após agitação da suspensão de células a 225 rpm, 37°C, durante 1 hora, 50 μΐ de 200 μΐ da 20 ΡΕ1704234 suspensão celular foram espalhados em placas de agar LB contendo canamicina (50 yg/ml) e incubados a 37°C durante a noite.

No dia seguinte, colónias isoladas foram retiradas das placas de agar e cultivadas em 7 ml de meio LB contendo canamicina (50 yg/ml) a 37°C, 225 rpm, durante a noite. Seis ml dos 7 ml de cultura foram centrifugados a 3000 rpm durante 15 min e o plasmideo foi isolado do sedimento de células usando o kit QIAprep Spin Plasmid Miniprep.

Para identificar se o plasmideo era portador do inserto, o plasmideo isolado foi digerido com uma enzima de restrição, Pmll, a 37°C durante 2 horas e depois separado por electroforese em gel de 0,8% de agarose. O plasmideo foi igualmente digerido pela enzima de restrição Bsal a 50°C durante 2,5 horas e analisado num gel de 1,5% de agarose. Como se pode observar na Figura 2, o inserto amplificado por PCR possuia um único local Pmll e dois locais Bsal, mas o vector pET29a não possuia aqueles locais de restrição. Assim, apenas o plasmideo, possuidor do inserto, foi digerido por Pmll e Bsal. A porção do inserto do plasmideo foi então sequenciada em ambas as direcções usando as duas sequências iniciadoras mostradas abaixo (sequências iniciadoras directa e inversa) para confirmar a sequência correcta do inserto no plasmideo. Um dos plasmideos, o qual possuia um 21 ΡΕ1704234 único inserto com a sequência de nucleótidos correcta, foi designado pKS35.

Exemplo 2 - Construção do vector

Para construir multimeros de [Gly2]hGLP-2, pKS35 foi digerido com Bsal a 50°C durante 2,5 horas e separado num gel de 1,5% de agarose. A banda de DNA maior (a porção do vector) foi cortada do gel e o DNA extraído do pedaço de gel usando o kit de extracção do gel QIA quick. A banda de DNA mais pequena (o inserto, aproximadamente 110 pb) foi cortado gel e o DNA foi extraído usando QIA ExII. A porção grande do vector foi ainda tratada com fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIP) para minimizar a auto-ligação do vector e purificada com o kit de purificação QIAPCR. 0 DNA do vector tratado com CIP e o DNA do inserto mais pequeno foram misturados e ligados usando a ligase de T4 Quick. A mistura de ligação foi usada para transformar DH5a, como atrás descrito, e depois as bactérias foram semeadas em placas de agar com extracto de levedura 2X (2x YE) contendo canamicina (30 yg/ml).

Para avaliar o número de unidades do gene [Gly2]hGLP-2 presentes no plasmídeo em cada transformante, os insertos foram amplificados directamente das células E. coli lisadas pelo calor por PCR e examinadas por electroforese em gel de agarose. Como se mostra abaixo, a sequência iniciadora directa usada para o PCR (KS003-5) foi 22 ΡΕ1704234 um oligonucleótido de 20 bases, o qual emparelhou com a região do promotor do fago T7 em pET29a. A sequência iniciadora inversa (KS004-3) era um oligonucleótido de 19 bases, o qual se liga à região do terminador de transcrição de T7 no plasmideo.

Sequência iniciadora directa: TAATACGACTCACTATAGGG Sequência iniciadora inversa: GCTAGTTATTGCTCAGCGG A mistura de PCR inferior continha 42 μΐ de água, 5 μΐ de tampão Tsg Plus lOx, 2 μΐ de mistura de desoxinucleótidos (2,5 mM cada), 0,5 μΐ de sequência iniciadora directa 100 μΜ KS003-5 e 0,5 μΐ de sequência iniciadora reversa KS004-3 100 μΜ no total de 50 μΐ. Um pedaço de Ampliwax foi adicionado à mistura inferior num tubo de PCR, aqueceu-se a 63°C durante 5 min e depois deixou-se solidificar à temperatura ambiente. No cimo da cera solidificada foi adicionada a mistura superior (50 μΐ) . A mistura superior continha 44,5 μΐ de água, 5 μΐ de tampão Tsg Plus 10X e 0,5 μΐ de enzima Tsg Plus. Em seguida, uma colónia isolada entre os muitos transformantes foi picada com um palito estéril da placa de agar e suspensa na mistura superior. O tubo de PCR foi então sujeito aos ciclos de aquecimento do PCR usando um termociclador, como descrito abaixo.

As condições do termociclador foram as seguintes:

Passo 1: 95°C durante 5 min 23 ΡΕ1704234

Passo 2: 95°C durante 1 min Passo 3: 55°C durante 30 seg Passp 4: 72°C durante 1 min

Passo 5: Voltar para o passo 2 e repetir os Passos 2 a 4 mais vinte e nove vezes

Passo 6: 72°C durante 10 min Passo 7: 4°C durante a noite

Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de 1,5% de agarose e sete produtos de PCR com tamanhos diferentes foram detectados no gel. Por comparação com os marcadores de tamanho de DNA (escada de 100 pb), foram identificados como monómeros, dimeros, trimeros, tetrâmeros, pentâmeros hexâmeros e heptâmeros. Estes multimeros foram igualmente sujeitos a análise de sequenciação de nucleótidos, a qual demonstrou que todos tinham sequências dos multimeros correctas.

Exemplo 3 - Transformação e cultura

As construções do multimero de [Gly2]hGLP-2 foram clonadas num plasmideo pET29a de forma a serem expressos sob o controlo do promotor do fago T7. A Polimerase de RNA de E. coli não pode reconhecer o promotor de T7. A Polimerase de RNA de T7 é necessária para a transcrição a partir do promotor de T7. A estirpe de E. coli BLR (DE3) , possui um gene da RNA polimerase do fago T7 no seu cromossoma. Ainda, o gene recA em BLR(DE3) está inactivado de forma que a probabilidade de perder unidades do gene 24 ΡΕ1704234 [Gly2]hGLP-2 nas construções de multímeros por recombinação homóloga é mínima nesta estirpe. Tanto a estirpe DH5oí como BLR(DE3) podem ser compradas, tal como o sistema aqui usado. 0 pET29a portador da construção de hexâmero de [Gly2]hGLP-2 foi designado pKS58 e isolado a partir das células transformantes usando o kit Qiagen Plasmid Midi Prep. As células competentes congeladas de BLR(DE3) (20 μΐ) foram descongeladas, misturadas com 1 μΐ de pKS58, mantidas em gelo durante 5 minutos, sujeitas a choque térmico a 42°C durante 30 seg e depois mantidas em gelo durante 2 minutos. À mistura de células, foram adicionados 80 μΐ de meio SOC e incubou-se a 37°C a 250 rpm durante 1 hora. Porções da suspensão de células (20 e 50 μΐ) foram semeadas em placas de agar YE 2X contendo canamicina (30 pg/ml) e incubadas a 37°C durante a noite.

Para a expressão, uma colónia isolada de cada uma das placas de transformação de BRL(DE3) portadoras de uma unidade de multímeros do gene [Gly2]hGLP-2, foi suspensa em 50 ml de meio líquido YE 2X contendo canamicina (30 pg/ml) num frasco Erlenmeyer de 250 ml e agitada a 37°C, a 300 rpm, durante a noite. Uma alíquota (200 μΐ) da cultura foi adicionada a 50 ml de meio líquido YE 2x pré-aquecido contendo canamicina (30 pg/ml) e agitada a 37°C a 300 rpm. Após 2 horas e 10 minutos, quando a DO a 600 nm era de aproximadamente 0,35, adicionou-se IPTG para uma concentração final de 2 mM para induzir o gene dos multímeros. 25 ΡΕ1704234 Às 2 e 3 horas após adição de IPTG, colheu-se 2 ml da suspensão de células e centrifugou-se a 15000 rpm durante 15 minutos. Os sedimentos de células foram Usados com 50 μΐ de tampão de lise celular a 100°C durante 5 minutos. Uma porção do lisado celular (12 μΐ) foi misturada com 3 μΐ de tampão de aplicação de SDS-PAGE e as proteínas foram separadas por SDS-PAGE. As proteínas nos géis foram coradas com azul Coomassie. A expressão das construções de mutímeros foi avaliada por comparação com os marcadores de massa molecular de proteínas e com o perfil proteico das células não induzidas.

Exemplo 4 - Processamento de multímeros e isolamento de péptidos

Após indução, as células foram colhidas por centrifugação e um grama dos sedimentos de células frescas foi lisado em 20 ml de hidrocloreto de guanidina 6M. A suspensão de células foi incubada em gelo durante 1 hora com mistura ocasional e centrifugada a 12000 xg durante 30 min. Após adição de 30 ml de hidrocloreto de guanidina 6M à solução do sobrenadante, o pH da solução do sobrenadante foi ajustado a 1,8, primeiro pela adição de gotas de HC1 IN e depois de HC1 0,1N e em seguida incubou-se a 65°C, durante 12-14 horas, com agitação suave. A mistura de reacção foi então separada por HPLC usando uma coluna C18 e eluição com um gradiente de acetonitrilo entre 30 e 60% em 0,1% de ácido trifluoroacético. 26 ΡΕ1704234 χ 2 O pico de produto cortado com ácido ([Gly ]hGLP-2 com um pequeno elemento de ligação peptidico) foi colhido e seco. Em seguida, o material seco foi dissolvido em tampão de trombina (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM, pH 8,4) e tratado com trombina a 37°C durante a noite e a reacção foi então parada pela adição de ACN 20 para o volume final. O produto de digestão foi então purificado por HPLC usando as mesmas condições atrás descritas. 0 produto de digestão foi então sujeito a análise por espectroscopia de massa, usando um espectrómetro de massa Micromass Quattro Micro™ equipado com uma fonte de Z-spray operando no modo de iões positivos com os seguintes parâmetros: Gama de dados: m/z 400-1600; Voltagem do cone: 30-35V; Temperatura da fonte: 80°C; Temperatura de remoção do solvente: 200°C; a injecção do fluxo foi via um HP1100; Solvente: 50:50 Acetonitrilo: Água + 0,1% de ácido fórmico; Software: Os dados foram adquiridos usando MassLynx 4.0. A calibração foi realizada usando um espectro MS de mioglobina e histatina 5.

Como se observa na Figura 5, a massa do pico predominante, representando [Gly2]hGLP-2 autêntica recombi-nante (produzida geneticamente) possui uma massa que é 3752,59, a qual é essencialmente a mesma da massa teórica de 3751,99. A recuperação do monómero de GLP-2 a partir do 27 ΡΕ1704234 multímero pode também ser convenientemente conseguida numa reacção de "tubo único" usando o multímero como reagente e proporcionando como produto final o monómero autêntico maduro, sem necessidade de numerosos passos de separação e transferência de produtos intermediários.

Relativamente ao exemplo atrás proporcionado, o processo de tubo único elimina o passo de lise celular com guanidina HC1 6M e primeiro destrói mecanicamente as células hospedeiras de expressão usando, por exemplo, um homogeneizador ou um sonicador. Após disrupção celular, o pH da suspensão é baixado, por exemplo para pH 1-3, pela adição, por exemplo, de HC1. Como descrito atrás, a suspensão é então incubada a uma temperatura adequada, como seja 40-80°C, e.g. 65°C, para completar o corte com ácido do multímero e produzir os intermediários de monómeros portadores dos elementos de ligação peptídicos N-terminais. 0 pH da mistura de reacção é então aumentado, por exemplo usando Tris-HCl, para o pH na gama adequada à actividade da trombina, e.g. 7,5-9,0 e, de preferência cerca de 8,4. A trombina é então adicionada para causar o corte dos elementos de ligação peptídicos N-terminais, gerando assim o produto GLP-2 maduro portador de extremos autênticos.

Lisboa, 16 de Abril de 2012

Claims (14)

1. ΡΕ1704234 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um multímero proteico de cadeia única compreendendo pelo menos duas unidades de um péptido GLP-2 acoplado em tandem por um elemento de ligação que proporciona dentro do multimero um local de corte por ácido no seu extremo N e um local de corte por enzimas no seu extremo C, em que o corte do referido multimero com um ácido e uma enzima liberta as referidas unidades do péptido GLP-2, cada uma delas tendo residuos N- e C-terminais autênticos e em que o local de corte com ácido possui a sequência Asp-Pro e o local de corte enzimático é seleccionado entre um local de corte por enterocinase tendo a sequência Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, um local de corte pelo Factor Xa tendo a sequência Ile-Glu-Gly-Arg e um local de corte pela trombina tendo a sequência Val-Ser-Gly-Pro-Arg.
2. 2. Um multimero proteico de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, em que o referido elemento de ligação consiste em não mais de 25 residuos, menos de 20 residuos, menos de 15 residuos ou menos de 10 residuos.
3. 3. Um multimero proteico de cadeia única de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido elemento de ligação tem a sequência ProValSerGlyProArg.
4. 4. Um multimero proteico de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido péptido GLP-2 é [Gly2]hGLP-2. 2 ΡΕ1704234
5. 5. Um multímero proteico de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda uma proteína veiculo acoplada de forma removível ao seu extremo N, a proteina veiculo proporcionando um residuo Met no seu extremo N e no seu extremo C um local de corte pela referida enzima.
6. 6. Um multimero proteico de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo ainda uma extensão peptidica C-terminal.
7. 7. Um processo para a preparação de um multimero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo o passo de cultura de uma célula hospedeira que incorpora uma construção de expressão, em que uma molécula de DNA codificadora do referido multimero está ligada operacionalmente a DNA que proporciona a sua expressão.
8. 8. 0 processo de acordo com a reivindicação 7, em que o referido hospedeiro é um hospedeiro de E. coli.
9. 9. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, em que a construção de expressão ainda compreende elementos de controlo da expressão do gene de T7.
10. 10. Um polinucleótido codificador de multimeros de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4. 3 ΡΕ1704234
11. 11. Um processo para a preparação de um péptido GLP-2, compreendendo os passos de obtenção de um multímero de acordo com qualquer uma das reivindicações a 1 6, tratamento do multimero com ácido e com enzima para cortar o elemento de ligação residente e depois isolamento das unidades peptídicas de GLP-2 resultantes.
12. 12. 0 processo de acordo com a reivindicação 11, em que o multimero é cortado primeiro com ácido, o multimero cortado resultante é isolado e depois cortado com enzima e as unidades de péptido GLP-2 resultantes tendo extremos autênticos são então isoladas.
13. 13. 0 processo de acordo com a reivindicação 12, em que o passo de corte com ácido é realizado na altura da extracção do multimero de péptidos GLP-2 a partir de uma célula hospedeira produtora do referido multimero.
14. 14. 0 processo de acordo com a reivindicação 11, em que o passo de tratamento do multimero com ácido e com enzima é realizado sem separação dos produtos de reacção antes do tratamento com enzima. Lisboa, 16 de Abril de 2012