DE4445891A1

DE4445891A1 - Rekombinante Proteinase aus Clostridium histolyticum und ihre Verwendung zur Isolierung von Zellen und Zellverbänden

Info

Publication number: DE4445891A1
Application number: DE4445891A
Authority: DE
Inventors: Friederike Dr Hesse; Dorothee Dr Ambrosius; Helmut Dr Burtscher
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1994-12-22
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1996-06-27
Also published as: MX9704586A; AU4346696A; JP2953477B2; US5853976A; CA2208324A1; WO1996019583A1; EP0799316A1; JPH10500581A

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine rekombinante Proteinase (neutrale Protease, NP) aus Clostridium histolyticum und ihre Verwendung zur Isolierung von Zellen und Zellverbänden.

Proteolytische Enzyme aus Clostridium histolyticum, werden zum Verdau von Geweben und zur Gewinnung von Einzelzellen oder Zellverbänden (z. B. Inseln) verwendet (Inseln: Sufton et al., Transplantation 42 (1986) 689-691; Leber: Quibel et al., Anal. Biochem. 154 (1986) 26- 28; Knochen: Hefley et al., J. Bone Mineral Res. 2 (1987) 505-516; Nabelschnur: Hefley et al., Exp. Cell Res. 149 (1983) 227-236. Aus Clostridium histolyticum sind zwei ver schiedene Collagenase-Typen bekannt (M.F. French et al., J. Protein Chemistry 11 (1992) 83- 97).

Neben verschiedenen Isoformen der Collagenase von Typ I und II ist auch eine neutrale Pro tease (NP) aus Clostridium histolyticum bekannt, deren Aktivitäts-Optimum im neutralen pH- Bereich liegt und die sowohl Casein als auch denaturiertes Collagen (Azocoll) spaltet (Mandl et al., J. Clin. Invest 32, 1953, 1323-1329; Sparrow & McQuade, Biochim. Biophys. Acta 302, 1973, 90-94; Hefley, J. Bone Mineral Res. 2, 1987, 505-516). Diese neutrale Protease wird als Hilfsenzym beim Verdau verschiedener Gewebe als notwendig erachtet (Knochen: Hefley et al., Exp. Cell Res. 149, 1983, 227-236; Pankreas: Wolters et al., Diabetologica 35, 1992, 735-742). Die NP hat ein Molekulargewicht von ca. 35 kd (SDS-Gelelektrophorese).

Um neutrale Protease zur Isolierung von Zellen und Zellverbänden in großem Umfang einset zen zu können, ist es erforderlich, die neutrale Protease in reproduzierbarer Qualität und in großen Mengen zur Verfügung zu stellen. Dies wäre durch ein rekombinantes Herstellverfah ren möglich. Die Klonierung der neutralen Protease ist jedoch nicht ohne weiteres möglich. Es sind kaum Sequenzen aus Clostridium histolyticum bekannt (Clostripain, zwei Collagenasen sowie eine ribosomale RNA-Sequenz). Damit sind auch Schlüsse auf die Codon usage und damit die Einengung der Degeneriertheit von verwendbaren Oligonukleotiden nicht möglich.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es demzufolge, die DNA-Sequenz der neutralen Protease aus Clostridium histolyticum sowie deren rekombinanter Herstellung zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein mit der Aktivität der neutralen Protease aus Clostridium hystolyticum codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe

a) der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer hierzu komplementären DNA- Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz hybridisieren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes, mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden.

Die Aktivität der neutralen Protease ist dem Fachmann bekannt und bei Mandel et al. (1953) Sparrow und McQuade (1973) und Haefley (1987) beschrieben. Neutrale Protease spaltet sowohl Casein als auch denaturiertes Collagen.

Unter Hybridisierung, im Sinne der Erfindung, ist eine Hybridisierung unter dem Fachmann geläufigen, üblichen stringenten Bedingungen zu verstehen, wie sie beispielsweise von J. Sambrook in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) und B.D. Hames, S.G. Higgins, Nucleic Acid Hybridization - A practical approach (1985), IRL-Press, Oxford, England, angegeben sind. Üblicherweise werden zur Hybridisierung die Standardprotokolle verwendet, die in diesen Publikationen beschrieben sind.

Es hat sich gezeigt, daß die üblichen Verfahren zur Klonierung für die neutrale Protease nicht anwendbar sind. Wenn nach der Aufreinigung der neutralen Protease Peptidsequenzen ermit telt werden und hieraus in üblicher Weise degenerierte DNA-Sequenzen abgeleitet werden, werden Sequenzen erhalten, die als Oligonukleotide in PCR-Reaktionen zur Isolierung von Fragmenten führen, die nicht für Proteine codieren, welche eine neutrale Proteaseaktivität ha ben.

Aus der Teilsequenzierung der neutralen Protease wurden beispielsweise die Peptidsequenzen 23F (SEQ ID NO: 3) und 44R (SEQ ID NO: 4) abgeleitet. Mit Primern, die diesen Peptiden entsprechen, erhält man in der PCR-Reaktion ein 300 bp großes Fragment, das nicht für eine neutrale Protease codiert.

Mit einem Primer, entsprechend Peptid 44R, erhält man ein 44 bp großes Fragment, welches ebenfalls nicht für die neutrale Protease codiert. Ebenso falsche Ergebnisse erhält man mit einer Kombination der Primer, entsprechend den Oligonukleotiden 33F (SEQ ID NO: 5) und 44R. Hierbei resultiert ein 560 bp großes Fragment ohne Bezug zur neutralen Protease. Auch die Verwendung von Primern, basierend auf dem Peptid 86-IF (SEQ ID NO: II), ergibt ein 350 bp-Fragment ohne Proteasenaktivität. Auch mit Primern auf Basis der Peptide 23R (SEQ ID NO: 6) und 33R (SEQ ID NO: 7) werden Fragmente (500 bp bzw. 1,5 kbp) erhalten, die nichts mit neutraler Protease zu tun haben.

Daraus ergibt sich, daß Screenen mit Einzelpeptiden im Falle der neutralen Protease nicht zu brauchbaren Ergebnissen führt.

Überraschenderweise ergab sich jedoch bei Kombination der Primer 23F/86-IR (SEQ ID NO: 12) überraschenderweise ein 320 bp-Fragment, das zum Gen der neutralen Protease gehört und zum Markieren und Screenen verwendet werden kann. Auch mit Hilfe dieses markierten Stückes war es jedoch noch nicht möglich, Klone mit weiteren Teilen des neutralen Proteasegens zu fischen. Erst durch eine weitere Modifikation des Klonierungsver fahrens, konnte die codierende DNA gefunden werden. Hierzu wurde Gesamt-DNA aus Clostridium histolyticum mit Pst I geschnitten und mit Ligase behandelt, um die Fragmente zu zyklisieren. Aus dem 320 bp-Fragment wurden zwei nach außen gerichtete Primer (NPC 7, (ccagattgaaatctatattctag) und NPC 8 (5′-tgctctaaatgaagctttttctg)) abgeleitet. Mit Hilfe dieser Primer war es möglich, ein 1,2 kb großes Fragment zu amplifizieren. Ebenso erfolgreich ist es, wenn Gesamt-DNA mit Xba I und Ligase behandelt werden und dann mit den Primern NPC5 (5′-gtgatggagacggagttac) und NPC6 (5′-tgtctaccattccagaaagc) amplifiziert wird. Man erhält dann ein 2,7 kbp großes Fragment, auf welchem das Gen der neutralen Protease enthalten ist.

Die Herstellung der rekombinanten Protease kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho den erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA-Sequenz hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität der Protease besitzt. Eine solche Sequenz, die von

a) der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer hierzu komplementären DNA-Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz hybridisie ren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes, mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden,

wird ausgewählt und in einen Expressionsvektor insertiert. Ein derartiger Vektor enthält zu sätzlich zur NP-Sequenz Operator-Elemente, die zur Expression der DNA-Sequenz erforder lich sind. Dieser Vektor, der die NP-Sequenz und die Operator-Elemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von NP zu exprimieren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und NP gewonnen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es NP-Eigenschaften zeigt.

Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein die exakte NP-Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 enthält. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschalten zeigen. SEQ ID NO: 2 zeigt ein bevorzugtes DNA-Fragment. Besonders bevorzugt wird SEQ ID NO: 1 verwendet.

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:

- Veränderung der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen,
- Veränderung der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle,
- Ergänzung der Nukleinsäure um zusätzliche Operator-Elemente, um die Expres sion in der Wirtszelle zu optimieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches die Eigenschaften einer NP aus Clostridium histolyticum hat, durch Expression einer exogenen DNA-Sequenz in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen und Isolierung des gewünschten Polypeptids, wobei die DNA-Sequenz, welche für das genannte Peptid codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe

a) der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer hierzu komplementären DNA-Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz hybridisie ren,
c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes, mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden.

Vorzugsweise wird als DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 verwendet. Zur Expression wird ein biologisch funktionelles Plasmid oder ein viraler DNA-Vektor verwendet, der eine erfindungs gemäße DNA-Sequenz enthält. Mit diesem Vektor wird eine eukaryontische oder prokaryon tische Wirtszelle stabil transformiert oder transfiziert.

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Prokaryonten, und dort in E. coli.

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977)1056), trp (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), ^λPL Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981)128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promotoren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433). Ebenso geeignet sind gekoppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacterio phagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusätz lich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5′-Ende der für die NP codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z. B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Weitere Beispiele für die Spaltstellen die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398) und die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698).

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sekretieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirtsorganismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sekretiert. Zwischen der Signalse quenz und der für die NP codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die entweder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen sind beispielsweise ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Reglon, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U- (bzw. T)-Resten. Beispiele sind trp- Attenuator und Terminator in der DNA des Phagen fd sowie rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).

Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Ebenso geeignete selektier bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not wendigen Stoffen wie z. B. Histidin, Tryptophan und Leucin.

Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056).

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto ren sind in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. beschrieben.

Eine Expression von rekombinanter NP ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YI_P (yeast integra ting plasmids)-Vektoren, replizierende YR_P (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YE_P (yeast episomal plasmids)-Vektoren erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auflösung von Zellgewebe und Freisetzung von darin enthaltenen Zellen oder Zellverbänden durch Inkubation des Zellgewe bes mit einer neutralen Protease aus Clostridium histolyticum, welche codiert wird von

und das Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist, bis zur Freisetzung der Zellen oder Zellverbände im gewünschten Umfang und Abtrennung der Zellen oder der Zellverbände von den Zellgewebeanteilen. Die Abtrennung der Zellen oder Zellverbände von den Zellgewebsanteilen erfolgt bevorzugt durch Zentrifu gation mit einem Dichtegradienten.

Eine Isolierung von Zellen bzw. Zellverbänden aus Geweben (z. B. Pankreas, Leber, Haut, Endothel, Nabelschnur, Knochen) erfolgt im allgemeinen durch Inkubation von Organen, Organteilen oder Geweben mit Enzymen, die die umgebende extrazelluläre Bindegewebe- Matrix auflösen (Inseln: Sutton et al., Transplantation 42 (1986) 689-691; Leber: Quibel et al., Anal. Biochem. 154 (1986) 26-28; Knochen: Hefley et al., J. Bone Mineral Res. 2 (1987) 505-516; Nabelschnur: Hefley et al., Exp. Cell Res. 149 (1983) 227-236. Eine Gewebsin tegration kann auch durch Perfusion des gesamten Organs (Ricordi et al, Diabetes 37 (1988) 413-420) mit Enzymlösung erfolgen. Entscheidend neben der Zusammensetzung des Enzymgemisches ist dabei die Dauer, der pH-Wert und die Temperatur des Verdaus sowie auch die mechanische Einwirkung, z. B. durch Schütteln und Zusatz von Metallkugeln. Da extrazelluläre Bindegewebsmatrix oft einen hohen Collagen-Anteil aufweist, kommt den Collagenasen und der neutralen Protease eine besondere Rolle zu. (Wolters, Hormone and Metabolic Research 26 (1994) p. 80).

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Inseln oder Inselzel len aus Pankreasgewebe verwendet.

Daneben kann der Zusatz weiterer Enzyme, wie Collagenasen, Elastase, Trypsin, Chymotryp sin oder Hyaluronidase für die Qualität des Verdaus von Vorteil sein.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele und Sequenzprotokolle näher erläutert.

In den Sequenzprotokollen bedeuten:
SEQ ID NO: 1: DNA-Fragment der neutralen Protease
SEQ ID NO: 2: DNA-Fragment der neutralen Protease
SEQ ID NO: 3-5, 8, 10, 13, 14: Peptide zur Ableitung von Primern
SEQ ID NO: 6, 7, 9, 11 und 12: Primersequenzen.

Beispiel 1 Isolierung von neutraler Protease Reinigung der NP aus Kulturüberstand von Clostidium histolyticum a) Erstes Verfahren

Die Isolierung der NP erfolgte durch eine Chromatographie an Q-Sepharose, einem starken Anionentauscher, mit einem Gradienten von 1-150 mM CaCl₂. Fraktionen mit der höch sten caseinolytischen Aktivität (Elution bei ca. 100 mM CaCl₂) wurden vereinigt und über eine Butyl 650 C Säule von weiteren Verunreinigungen befreit (braunes Pigment, Doppel bande bei 50 kD etc.). Die Elution erfolgte mit 10 oder 30% Isopropanol, das unter ande rem einen stabilisierenden Einfluß auf die NP ausübt. Diese hochreine NP Präparation (Steigerung der spezifischen Aktivität von gegen Resorufin-Casein um den Faktor 100) wurde mit Trypsin verdaut und die Peptide über eine Reversed-Phase-HPLC-Säule (C8) aufgetrennt. Nach Einengen der Peptide bis zur Trockene wurde die Aminosäuresequenz bestimmt.

b) Zweites Verfahren

Lyophilisat der Collagenase P (BM) wurde in 5 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl₂ gelöst und abzentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Q-Sepharose-Säule, die mit demselben Puffer äquilibriert war, aufgepumpt (Beladung: max. 20 mg Lyo/ml Säulenmaterial). Nach Waschen der Säule bis zum Erreichen der Basislinie wurde die NP mit einem steigenden CaCl₂-Gradienten (1-150 mM, 10fach) eluiert. Die Fraktionen mit hoher caseinolytischer Aktivität (Resorufin-Casein) wurden vereinigt. Auf dem SDS-Gel ist eine deutliche Bande bei ca. 33 kD zu erkennen, als Verunreinigungen treten Banden bei ca. 50 kD (chargenabhängig) sowie im niedermolekularen Bereich (< 10 kD) auf.

Die NP-Fraktion wird bei 4°C auf eine Butyl 650 C-Säule (äquilibriert mit 10 mM Tris, pH 7.5, 5 mM CaCl₂) aufgezogen. Während sich die Verunreinigungen im Durchbruch befin den, wird die NP unter diesen Bedingungen an das hydrophobe Säulenmaterial gebunden. Eine Elution erfolgte bei 4°C mit 10 mM Tris, pH 8.3, 5 mM CaCl₂ + 10% Isopropanol. Das so erhaltene Protein ist gemäß SDS-PAGE homogen (< 95% sauber).

c) Drittes Verfahren

Collagenase P wird in 5 mM HEPES-Puffer, pH 7.5, 1 mM CaCl₂ gelöst (c = 50 mg/ml und abzentrifugiert. Ein Aliquot (10 mg) wird auf eine MonoQ-Säule (Pharmacia) aufge spritzt (FPLC) und mit einem CaCl₂-Gradienten (bis 150 mM in 20 min) eluiert. Die Frak tion mit der höchsten spezifischen casinolytischen Aktivität (bestimmt über Resorufin-mar kiertes Casein, Boehringer Mannheim GmbH) enthielt ein Protein mit einem MW von 30- 35 kDa (SDS-Gel). Nach Carboxymethylierung und LysC-Verdau wurden die entstandenen Peptide über Reversed-Phase HPLC an einer C₈-Säule aufgetrennt, zur Trockene ein geengt und sequenziert. Alternativ dazu wurden die Proteinfraktionen mit hoher caseinolytischer Aktivität über ein SDS-Gel aufgetrennt, auf PVDF-Membranen (Millipore) transferiert (Western-Blot; Transferpuffer 50 mM Tris, 50 mM Borsäure, pH 8.3) und nach Amidoschwarz-Färbung die entsprechende Bande ausgeschnitten. Nach LysC-Verdau des immobilisierten Proteins wurden die Peptide mit HCOOH abgelöst und, wie oben beschrieben, getrennt und sequenziert.

Beispiel 2 Klonierung von neutraler Protease

Von nach der Aufreinigung der Neutralen Protease gemäß Beispiel 1 ermittelten Peptidse quenzen ausgehend wird die zugehörige (degenerierte) DNA-Sequenz abgeleitet. Sequenzen, die eine vorteilhafte (geringe) Denaturierung zeigen, werden verwendet, um z. B. via PCR eine markierte DNA Probe zum Screenen von Genbanken herzustellen.

Besonders geeignet sind z. B. 2 Peptide NP 23 und NP 86, von denen sich folgende Primer ableiten lassen:
Peptid NP 23: (SEQ ID NO: 8)
Primer NP 23F: (SEQ ID NO: 9
Primer NP 23R: (SEQ ID NO: 6)
Peptid NP 86: (SEQ ID NO: 10)
Primer NP 86-IF: (SEQ ID NO: 11)
Primer NP 86-IR: (SEQ ID NO: 12).

Da am Beginn der Experimente die Lage der beiden Peptide zueinander unbekannt ist, muß man, um ein PCR-Fragment des zugehörigen Gens aus genomischer DNA von Clostridium histolyticum amplifizieren zu können, zwei verschiedene Primerkombinationen verwenden: 23F/86-IR und 23R/86-IF. Eine dieser Kombinationen sollte bei Gelingen des Experiments ein Fragment in der PCR ergeben, die zweite Kombination stellt dann gleichzeitig eine Nega tivkontrolle dar.

Mit Primer NP 23F und NP 86-IR erhält man tatsächlich nach PCR mit nach herkömmlichen Methoden isolierter DNA aus Clostridium histolyticum ein Fragment von ca. 320 bp Länge. Die Kombination 23R/86-IF ergibt kein Fragment.

Dieses ca. 320 bp lange Fragment kann gut mit dig-dUTP markiert werden, z. B. ebenfalls in einer PCR Reaktion, und dient als Sonde zur Identifizierung positiver Klone aus einer Genbank. Die Genbank kann in allgemein bekannter Weise aus Clostridium histolyticum DNA nach Verdau mit Restriktionsenzymen hergestellt werden.

Das ca. 320 bp lange Fragment wurde sequenziert und enthält DNA der Sequenz SEQ ID NO: 2. Diese Sequenz ist auch im Plasmid pNP-86-1R/23F enthalten, welches bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DSM) unter Nr. 9578 am 09. 12. 1994 hinterlegt wurde.

Ausgehend von bekannten Sequenzen des ca. 320 bp langen Fragments wurden weitere Primer entworfen, die im Zuge einer zirkulären PCR Fragmente der Länge 580 bp (Hind III Verdau + Ligation) bzw. 2,7 kbp (XbaI Verdau + Ligation) ergeben.

Sequenzierung des ca. 580 bp langen Fragments ergibt Sequenz SEQ ID NO: 1, die den Großteil der Sequenz der oben beschriebenen Sonde enthält:

In dieser Sequenz sind neben Peptid NP23 und einem Teil von Peptid NP86 auch folgende weitere Peptide aus dem Proteinverdau enthalten, die zur Identifizierung des Leserahmens verwendet werden können:
NP-NT2: (SEQ ID NO:13)
NP58: (SEQ ID NO: 14)

Beispiel 3 Expression von neutraler Protease

DNA-Fragmente, die das Gen für Neutrale Protease oder Teile davon enthalten, werden in geeigneter Weise an den Enden modifiziert (z. B. via PCR) und als Ganzes oder in Kombina tion in einen Expressionsvektor für E. coli eingesetzt. Als Promotoren werden bevorzugt solche verwendet, die gut reguliert werden können wie z. B. lac, tac, trc, mgl; Verwendung anderer Promotoren ist jedoch durchaus denkbar. Zur Sekretion kann entweder das eigene Signalpeptid der Neutralen Protease oder ein heterologes (wie z. B. mgl, PhoA) verwendet werden.

Ein E. coli Stamm, der mit einem Expressionsplasmid transformiert worden ist, wird entweder in Minimalmedium oder LB Medium unter Antibiotika-Selektion über Nacht bei 30 oder 37°C angezogen (z. B. in 5 ml Kultur). Die Übernachtkultur wird in ein größeres Volumen (z. B. 1 l) überimpft und weiterwachsen lassen. Verwendet man dieses Volumen bereits zur Biomas sengewinnung kann man z. B. bei Verwendung eines lac-Promoters bei einer OD⁵⁵⁰ von 0.2 bis 2 mit IPTG induzieren und die Zellen weiterwachsen lassen, bis die OD und/oder die gebil dete Enzymaktivität nicht weiter zunimmt. Zu diesem Zeitpunkt wird abzentrifugiert und die Biomasse zur Aufreinigung von Neutraler Protease verwendet.

Es kann sich aber auch ein erheblicher Teil der Neutralen Protease-Aktivität im Medium befinden; dann wird auch das Medium gesammelt und Neutrale Protease daraus aufgereinigt.

Beispiel 4 Inselisolierung aus Schweine-Pankreas

Aus einem frisch geschlachteten Schwein wird der Pankreas präpariert und in eiskaltem HBSS-Puffer (Gibco) bis zur weiteren Verarbeitung gekühlt. In den Ductus pancreaticus wird eine Braunüle eingeführt und befestigt, die Dichtigkeit des Pankreas wird mit HBSS-Puffer geprüft. Eine Enzymlösung in HBSS-Puffer + Ca²⁺, die rekombinante neutrale Protease aus Clostridium histolyticum allein oder in Mischung mit gereinigter Collagenase Typ I oder II enthält, wird eingespritzt. Der so behandelte Pankreas wird an die ebenfalls obige Enzymlö sung enthaltende Perfusionseinheit (diskontinuierliche Perfusion) angeschlossen. Der Verdau erfolgt zwischen 4°C-37°C in einem Zeitraum von 5 bis 120 Minuten, wobei die im Gefäß vorhandene Enzymlösung ständig in den Pankreas hineingepumpt wird. Nach der als optimal angenommenen Zeit wird die Pumpe gestoppt und das den Pankreas enthaltende Gefäß 3 bis 20 Minuten lang vorsichtig per Hand geschüttelt. Im Bedarfsfall vorher zugegebene Metall kugeln erleichtern zusätzlich die mechanische Dissoziation des Gewebes und die Freisetzung der Inseln aus dem umgebenden exokrinen Gewebe.

Der Verdau wird durch Zugabe von eiskaltem HBSS/10% FKS (fötales Kälberserum) gestoppt und die Suspension durch ein Sieb (Maschengröße 300 µm) filtriert, um die Grob teile abzutrennen. Die im Durchfluß befindlichen Inseln werden 10 Minuten bei 100 g in 250 ml Nalgene-Rundbodenflaschen abzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und das die Inseln enthaltende Pellet in 50 ml FKS resuspendiert.

Eine weitere Aufreinigung der Inseln kann über einen per Hand hergestellten Dichtegradienten erfolgen. In 250 ml Nalgene-Rundbodenflaschen werden zunächst 7 ml der Inselsuspension gegeben. Diese wird zunächst mit 93 ml einer Ficoll-Lösung® (ϕ = 1.077 g/cm³), darauffol gend mit 50 ml Medium (RPMI 1640) überschichtet. Diese Gradienten werden im Aus schwingrotor bei 100 g für 10 Minuten zentrifugiert. Fraktionen á 10 ml werden abgenommen, die Größe, Reinheit und Ausbeute der mit Dithiozon gefärbten Inseln wird in jeder Fraktion mikroskopisch oder mit Hilfe der Bildanalytik bestimmt.

Sequenzprotokoll

Claims

1. DNA-Sequenz, welche für ein Protein mit der Aktivität der neutralen Protease aus Clos tridium hystolyticum codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz.

3. Verfahren zur Auflösung von Zellgewebe und Freisetzung von darin enthaltenen Zellen oder Zellverbänden durch Inkubation des Zellgewebes mit einer neutralen Protease aus Clostridium histolyticum, welche von SEQ ID NO: 1 oder einer Sequenz, welche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes für die gleiche Aminosäuresequenz codiert wird und das Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist, bis zur Freisetzung der Zellen oder Zellverbände im gewünsch ten Umfang und Abtrennung der Zellen oder der Zellverbände von den Zellgewebeantei len.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung über einen Dichtegradient und Zentrifugation erfolgt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebe Pankreasgewebe verwendet wird, die isolierten Zellen Inselzellen und Zellverbände Inseln sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellgewebe Leber-, Haut-, Nabelschnur-, Endothel- oder Knochengewebe verwendet wird.

7. Verwendung einer neutralen Protease aus Clostridium histolyticum, welche von SEQ ID NO: 1 oder einer Sequenz, welche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes für die gleiche Aminosäuresequenz codiert wird und das Produkt einer prokaryon tischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist, zur Auflö sung von Zellgewebe und Freisetzung von darin enthaltenen Zellen oder Zellverbänden.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches die Eigenschaften einer neutralen Protease aus Clostridium histolyticum hat, durch Expression einer exogenen DNA- Sequenz in prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen und Isolierung des gewünschten Polypeptids, wobei die DNA-Sequenz welche für ein Protein mit der Aktivi tät der neutralen Protease aus Clostridium hystolyticum codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 enthält.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt E. coli ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Hefezelle oder eine Insektenzelle ist.

12. Biologisch funktionelles Plasmid oder viraler DNA-Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

13. Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, welche mit einem DNA-Vektor nach Anspruch 12 stabil transformiert oder transfiziert ist.