JPH10500581A

JPH10500581A - クロストリジウム・ヒストリティカムからの組換えプロティナーゼ並びに細胞及び細胞群の単離のためのその使用

Info

Publication number: JPH10500581A
Application number: JP8519511A
Authority: JP
Inventors: ヘッセ，フリーデリク; アンブロジウス，ドロティ; ブルシャー，ヘルムート
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-12-22
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-01-20
Anticipated expiration: 2015-12-20
Also published as: MX9704586A; DE4445891A1; EP0799316A1; CA2208324A1; WO1996019583A1; JP2953477B2; US5853976A; AU4346696A

Abstract

(57)【要約】本法は、クロストリジウム・ヒストリティカムからの組換え中性プロテアーゼと共に細胞組織をインキュベーションすることにより、細胞組織を分解し、そして構成細胞又は細胞群を解放するために提案される。着目のプロテアーゼは、（ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な DNA；（ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸；（ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに（ａ）又は（ｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、によりコードされる。本プロテアーゼは、外来核酸の原核又は真核発現の産物である。インキュベーションは、所望の量における細胞又は細胞群の解放及びその細胞組織画分からの細胞又は細胞群の分離が得られるまで、続けられる。

Description

【発明の詳細な説明】クロストリジウム・ヒストリティカムからの組換えプロティナーゼ並びに細胞及び細胞群の単離のためのその使用本発明は、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridiumhistolyticum ）からの組換えプロティナーゼ（中性プロティアーゼ、NP）並びに細胞及び細胞群の単離のためのその使用に関する。クロストリジウム・ヒストリティカムからのタンパク質分解性酵素が、組織を消化し、そして個々の細胞又は細胞群(例えば、島(islets))を単離するために使用される（島：Sutton et al.，Transplantation 42（1986）689-691；肝臓：Qu ibel et al.，Anal.Biochem．154（1986）26-28；骨：Hefley et al.，J.Bone M ineral Res．２（1987）505-516；Holzinger et al.，Immunology Letters 35（ 1993）109-118）。２つの異なるコラゲナーゼ型が、クロストリジウム・ヒストリティカムから知られている（M.F.French et al.，J.Protein Chemistry 11（1 992）83-97）。Ｉ型及びII型コラゲナーゼの各種イソ形態（isoforms）に加えて、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼ（NP）であって、その最適活性が中性pH範囲内にあり、そしてカゼイン及び変性コラーゲン(Azocoll)を解裂するものも、知られている(Mandl et al.，J.Clin.Invest 32，1953，1323-1329 ；Sparrow& McQuade，Biochim.Biophys.Acta 302，1973，90-94；Hefley，J.Bon e Mineral Res．2，1987，505-516)。この中性プロテアーゼは、さまざまな組織の消化における補助的酵素として必要であると認められている（骨：Hefley et al.，Exp.Cell Res．149，1983，227-236；膵臓：Wolters et al.，Diabetologi ca 35，1992，735-74 2)。NPは、約35kDの分子量(SDSゲル電気泳動)をもつ。大規模で細胞及び細胞群を単離するために中性プロテアーゼを使用するために、再現可能な質及び多量においてその中性プロテアーゼを提供することが必要である。これは、組換え製造方法によって可能である。それ故、本発明の目的は、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸及びそれらの組換え製造のための方法を提供することである。本発明は、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸であって、それが、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、及びｃ）その遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれることを特徴とする核酸により達成される。配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965をもつ核酸が好ましい。この核酸に比較して、例えば、約60ヌクレオチド程、好ましくは、その５′末端において短縮又は延長されているものも好適である。ヌクレオチド 970−1965の延長された核酸であって、上記プロテアーゼのプロ形態に対応するものが、特に好ましい。短縮された核酸は、タンパク質分解により、好ましくは、自己タンパク質分解によりプロセスされたタンパク質に対応する。中性プロテアーゼの活性は、当業者に知られており、そしてMandle et al.(19 53)Sparrow and McQuade（1973）and Hefley（1989）。中性プロテアーゼは、カゼイン及び変性コラーゲンを解裂させる。本発明の意味におけるハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook in Mo lecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory（1989）及びB.D.Hames，S.G .Higgins，Nucleic Acid Hybridization-A practical approach(1985)，IRL-Pre ss，Oxford，Englandにより言及されているような当業者に馴染みのある通常のストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとして理解される。通常、上記の標準的なプロトコールが、上記刊行物中に記載されたハイブリダイゼーションのために使用される。 “ストリンジェント条件”は、好ましくは、50℃における 2.0×SSC でのその後の洗浄段階を伴う、約45℃における 6.0×SSC 中でのハイブリダイゼーションとして理解される。このストリンジェンシーを調整するために、その洗浄段階において、低ストリンジェンシーのための50℃における 2.0×SSC 〜高ストリンジェンシーのための50℃における 0.2×SSC の塩濃度が選ばれることができる。さらに、その洗浄段階の温度は、室温（22℃、低ストリンジェンシー）〜約65℃（高ストリンジェンシー）の間に設定されることができる。このストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、少なくとも、75％のホモロジー、好ましくは、90％のホモロジーが、そのアミノ酸配列において得られるように選ばれる。 DNA又は RNAが、本発明の意味において、核酸として好適である。この場合、 RNAは、本発明に係る DNAに相補的である。本発明に係る核酸は、合成、半合成又は組換え起源をもつことができる。中性プロテアーゼのクローニングのための通常の方法が、使用されることができないことが判明している。その中性プロテアーゼの精製後、ペプチド配列が決定され、そして縮重 DNA配列が通常のやり方でそれから得られる場合、オリゴヌクレオチドとして、中性プロテアーゼ活性をもつタンパク質をコードしない PCR反応における断片の単離を導く配列が、得られる。例えば、ペプチド配列NP23（その中で、 Aspが Alaの代わりに位置３においても存在することができるところの配列番号：８）及びNP44（配列番号：４）は、上記中性プロテアーゼの部分的配列決定から得られた。これらのペプチドから得られた縮重プライマーを使用して、中性プロテアーゼをコードしない 300bpの断片が、 PCR反応において得られる。ペプチドNP44単独から得られた縮重プライマーを使用して、同じく上記中性プロテアーゼをコードしないサイズ約 400bpの断片が得られる。また、ペプチドNP86（配列番号：10）に基づくプライマー86-1F( 配列番号：11)の使用は、中性プロテアーゼに無関係な 350bp断片をもたらす。このように、ペプチド配列から得られたプライマーを用いてのスクリーニングは、中性プロテアーゼの場合においては有用な結果を簡単には導かない。しかしながら、驚ろくべきことに、プライマー23Ｆ（配列番号：９）と86-1R( 配列番号：12)の組合せが、中性プロテアーゼ遺伝子の一部であり、そして標識付け及びスクリーニングのために使用されることができる約 320bp断片をもたらした。しかしながら、この標識された部分の助けを借りてさえ、上記中性プロテアーゼ遺伝子のさらなる部分をもつクローンを探り出すことはできなかった。そのクローニング方法のさらなる修飾によって始めて、そのコーディング DNAを見つけ出すことができた。上記組換えプロテアーゼの製造は、当業者に馴染みの方法に従って行われることができる。このために、そのプロテアーゼの活性を有するタンパク質を産生することができる DNAが、まず、製造される。ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、及びｃ）その遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれるような DNAが、選択され、そして発現ベクター内に挿入される。このようなベクターは、そのNP配列に加えてその DNAを発現するために必要なプロモーター／オペレーター要素を含む。上記NP配列及び上記プロモーター／オペレーター要素を含む上記ベクターを、NPの DNAを発現することができる宿主株内に伝達させる。この宿主細胞を、そのベクターの増幅に好適な条件下で培養し、そしてNPを単離する。この方法において、好適な手段は、それがNP特性を示すところの活性な３次構造を、そのタンパク質が採用することができることを保証する。この方法においては、その発現されたタンパク質が、配列番号：５中に示すものと全く同じNPアミノ酸配列を含む必要はない。本質的に同一の配列を含み、そして類似の特性をもつタンパク質が、等しく好適である。配列番号：１と配列番号：２は、好ましい DNA断片を示す。配列番号：３からのヌクレオチド1027−19 65の DNAが好ましい。この配列に比較して、好ましくはその５′末端において、例えば、好ましくは約60ヌクレオチド程短縮又は延長された核酸も好適である。ヌクレオチド 970−1965の延長された核酸であって、そのプロテアーゼのプロ形態に対応するものが、特に好ましい。短縮された核酸は、タンパク質分解され、好ましくは、自己タンパク質分解され、プロセスされたタンパク質に対応する。上記タンパク質の核酸配列は、修飾されることもできる。このような修飾は、例えば： −ライゲーション、クローニング及び突然変異誘発の段階を容易にするための制限酵素のさまざまな認識配列を導入するための核酸の修飾、 −宿主細胞のための好ましいコドンを取り込むための核酸の修飾、 −宿主細胞内での発現を最適化するための追加のオペレーター要素による核酸の延長、である。本発明は、さらに、原核又は真核宿主細胞内での外来核酸の発現によるクロストリジウム・ヒストリティカムからのNPの特性をもつポリペプチドの生産及びその所望のポリペプチドの単離方法であって、そのペプチドをコードする DNAが：ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）その遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれることを特徴とする方法に関する。配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAが、好ましくは使用される。生物学的に機能性のプラスミド又はウイルスDNAベクターであって、本発明に係る核酸を含むものが、上記の発現のために使用される。真核又は原核宿主細胞は、このベクターにより安定的に形質転換され又はトランスフェクトされる。上記タンパク質は、好ましは、微生物、特に原核細胞内で、そして本願においては、Ｅ．コリ(E．coli)内で発現される。発現ベクターは、上記宿主生物内での上記タンパク質の発現を可能にするプロモーターを含まなければならない。このようなプロモーターは、当業者に知られており、そして例えば、 lacプロモーター（Chang et al.，Nature 198（1977） 1056）、trp(Goeddel et al.，Nuc.Acids Res．8（1980）4057)、λ_PLプロモーター(Shimatake et al.，Nature 292（1981）128)及びＴ５プロモーター（米国特許第 4,689,406号）である。例えば、 tacプロモーター（米国特許第 4,551,4 33号）のような合成プロモーターも好適である。結合プロモーター系、例えばT7 -RNAポリメラーゼ／プロモーター系（Studier et al.，J.Mol.Biol．189（1986 ）113）も好適である。バクテリオファージ・プロモーターと上記微生物のオペレーター領域から成るハイブリッド・プロモーター（EP-A 0 267 851）も等しく好適である。有効なリボソーム結合性部位も、上記プロモーターに加えて必要である。Ｅ．コリの場合においては、このリボソーム結合性部位は、シャイン−ダルガルノ(Shine-Dalgarno(SD))配列と言われる(Sambrook et al.，“Expression of cloned genes in E．coli”in Molecular Cloning：A laboratory manual（ 1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA)。発現を改善するために、そのタンパク質を融合タンパク質として発現させることもできる。この場合、内因性のバクテリア・タンパク質のＮ−末端部分と他の安定性タンパク質をコードする DNA配列が、通常、NPをコーディングする DNAの５′末端に融合される。この例は、例えば、lacZ(Phillips and Silhavy，Natur e 344（1990）882-884)，trpE（Yansura，Meth.Enzymol．185（1990）161-166）である。発現後に得られる融合タンパク質は、好ましくは、酵素（例えば、因子Xa）により解裂される(Nagai et al.，Nature 309（1984）810)。解裂部位のさらなる例は、 IgAプロテアーゼ解裂部位(WO 91／11520，EP-A 0 495 398) 及びユビキチン解裂部位(Miller et al.，Bio／Technology 7（1989）698)である。バクテリア内でこのやり方で発現されるタンパク質は、そのバクテリアを溶解し、そしてタンパク質を単離することにより、通常、単離される。さらなる態様においては、微生物から活性タンパク質としてそのタンパク質を分泌させることができる。このために、使用される宿主生物内でのタンパク質の分泌に好適なシグナル配列及びそのタンパク質をコードする核酸から成る融合生成物が、好ましくは、使用される。この方法においては、そのタンパク質は、（グラム陽性バクテリアの場合には）培地中に又は（グラム陰性バクテリアの場合には）細胞周辺腔内に分泌される。そのシグナル配列と、プロセッシングの間又は追加の段階のいずれかにおいてそのタンパク質の解裂を可能にするNPをコーディングする配列との間に解裂部位を配置することが好都合である。このようなシグナル配列は、例えば、ompA(Ghrayeb et al.，EMBO J．3（1984）2437)又はpho A（Oka et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 82（1985）7212）から得られる。これらのベクターは、さらに、ターミネーターも含む。ターミネーターは、転写過程の終結を指令する DNA配列である。それらは、通常、２つの構造的特徴：分子内で２本鎖を形成することができる逆反復のＧ／Ｃに富む領域及び多数のＵ（又はＴ）残基、を特徴とする。例は、ファージfdとrrnBの DNA内の trpアテニュエーターとターミネーターである（Brosius et al.，J.Mol.Biol．148（1981 ）107-127）。さらに、上記発現ベクターは、通常、その形質転換された細胞を選択するための、選択マーカーを含む。このような選択マーカーは、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラマイシンについての耐性遺伝子である(Davies et al.，Ann.Re v.Microbiol．32（1978）469)。同じく好適である選択マーカーは、その細胞のために必要な物質、例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生合成に不可欠な物質のための遺伝子である。多くの好適なバクテリアのベクターが知られている。ベクターは、例えば、以下のバクテリア：バチルス・サブチリス(B acillus subtitis)(Palva et al.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 79（1982）5582) 、Ｅ．コリ(E．coli)(Aman et al.，Gene 40（1985）183；Studier et al.，J.M ol.Biol．189（1986）113)、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus c remoris)(Powell et al.，Appl.Environ.Microbiol．54（1988）655)、ストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）及びストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)(米国特許第 4,747,056号)について記載されてきた。好適なベクターの構築及び発現のためのさらなる遺伝子操作方法は、J.Sambro ok et al.，Molecular Cloning：A laboratory manual(1989)，Cold Spring Har bor Laboratory Press，New York，N.Y.中に記載されている。原核微生物に加えて、組換えNPは、真核生物（例えば、 CHO細胞、酵母又は昆虫細胞）内で発現されることもできる。酵母系又は昆虫細胞は、真核発現系として好ましい。酵母における発現は、３つのタイプの酵母ベクター：組み込みYIp( 酵母組み込みプラスミド)ベクター、複製YRp(酵母レプリコン・プラスミド)ベクター及びエピソーム性YEp(酵母エピソーム性プラスミド)ベクター、により達成されることができる。これについての詳細は、例えば、 S.M.Kin gsman et al.，Tibtech 5（1987）53-57中に記載されている。本発明は、さらに、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、又はｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、によりコードされた、そして外来 DNAの原核又は真核発現の産物であるクロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼと共に、その細胞又は細胞群が所望の程度まで放出されるまで、細胞組織をインキュベートし、そしてその細胞組織画分からその細胞又は細胞群を分離することにより、その細胞組織を分解（disintegration）し、そしてその中に含まれる細胞又は細胞群を放出するための方法にも関する。クロストリジウム・ヒストリティカムとは異なる宿主細胞内での組換え生産のために、このプロテアーゼは、クロストリジウム・ヒストリティカムからの他のタンパク質から遊離しており、この細胞組織画分からの細胞又は細胞群の分離は、好ましくは、密度勾配を使用した遠心分離により行われる。プロテアーゼであって、配列番号：３のヌクレオチド1027−1965によりコードされたもの又は約20アミノ酸程Ｎ末端において延長又は短縮された形態が、好ましくは、使用される。延長されたプロテアーゼであって、配列番号：３のヌクレオチド 970−1965の DNAによりコードされ、そしてそのプロテアーゼのプロ形態に対応するものが、特に好ましい。このような延長されたプロテアーゼは、その膜を通してのその細胞周辺腔又は培地中への輸送の間に、短縮形態（例えば、アミノ酸配列番号：５をもつタンパク質）に分解される。Ｎ−又はＣ−末端で短縮された形態であって、例えば、自己触媒作用により形成されることができるものも、好ましい。細胞又は細胞群は、臓器、臓器又は組織の部分を、その周囲の細胞外結合組織マトリックスを溶解させる酵素と共にインキュベートすることにより、組織（例えば、膵臓、肝臓、皮膚、内皮、臍帯、骨）から、通常、単離される(島：Sutto n et al.，Transplantation 42（1986）689-691；肝臓：Quibel et al.，Anal.B iochem．154（1986）26-28；骨：Hefley et al.，J.Bone Mineral Res．2（1987 ）505-516)。本発明に係るプロティナーゼは、筋肉細胞（Maruyama et al.，J.Pharmacol.M ethods 19，1988，155-164）、脂肪細胞(Vendrell & Alemany，J.Biochem.Bioph ys.Methods 16，1988，49-54)、卵巣又は子宮組織(Marcus et al.，Endocrine R es．10，1984，151-162)、上皮細胞(Kaunitz，Am.J.Physiol．254，1988，6502- 6512)、心臓細胞（Haworth et al.，Cell Calcium 10，1989，57-62）及び胎盤組織(Morrish & Siy，Endocrine Res．12，1986，229-253)の調製のためにも使用されることができる。組織分解は、酵素溶液で臓器全体を灌注することにより（Ricordi et al.，Di abetes 37（1988）413-420）行われることもできる。上記酵素混合物の組成に加えて、この方法において重要な要因は、その消化の経過時間、pH値及び温度並びに例えば、振とう及び金属ボールの添加による機械的作用である。細胞外結合組織マトリゥクスは、しばしば、高い割合のコラーゲンをもつので、コラゲナーゼ及び上記中性プロティナーゼは、特別な役割を演じる(Wolters，Hormone and Me tabolic Research 26(1994)，p.80)。本発明に係る方法は、好ましくは、膵臓組織から島又は島細胞を単離するために使用される。さらに好ましい適用は、遺伝子治療のために又は細胞治療目的（細胞工学）のために使用される、細胞培養物を設定し又は細胞を単離するために、全ての種類の組織から細胞を単離することである。本発明に係るプロティナーゼ及び本発明に係る方法は、腫瘍組織を、好ましくは、生体外において分解するために使用されることもできる。この場合においては、このやり方で単離された腫瘍細胞は、例えば、その腫瘍に対する免疫感作に影響を及ぼす、例えば、養子免疫療法を行うために、遺伝子修飾後に患者に戻される。さらに、さらなる酵素、例えば、コラゲナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン又はヒアルロニダーゼの添加は、上記消化の品質のために有利であることができる。寄託されたプラスミド、並びに以下の実施例、刊行物、配列プロトコール及び図面は、本発明をさらに明確にし、そしてその保護範囲は、特許請求の範囲から生じるものである。説明された方法は、例示として理解されるべきであり、これは、修正後でさえも、同じく本発明の主題を説明する。プラスミド pNP-86-IR／23F を、受託番号DSM 9578の下、“Deutsche Sammlun g von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D- 38124 Braunschweig”に、1994年12月 9日に寄託した。配列番号：３の塩基 933−2100を含むプラスミドpUC21-E-NPを、受託番号 DSM 10341の下、“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb H(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig”に、1995年11月23日に寄託した。図１は、本中性プロテアーゼの概略制限酵素地図を示す。配列プロトコールは：配列番号：１：中性プロテアーゼの DNA断片、配列番号：２：中性プロテアーゼのDNA 断片、配列番号：３：フランキング領域をもつ中性プロテアーゼの DNA、配列番号：５：中性プロテアーゼのタンパク質配列、配列番号：４，８，10，13，14及び16：プライマーを得るために使用したペプチド、配列番号：６，７，９，11，12，15，17−20：プライマー配列、を示す。実施例１中性プロテアーゼの単離クロストリジウム・ヒストリティカムの培養上清からのNPの精製コラゲナーゼＰ凍結乾燥物（BM／Order No.1213857）を、５mM HEPESバッファー、pH 7.5、１mM CaCl₂中に溶解し、そして遠心分離した。この上清を、同一バッファーで平衡にしてある Q-Sepharoseカラム上にポンプ供給した（ローディング：最大20mg凍結乾燥物／mlカラム材料）。そのベース・ラインに達するまで平衡バッファーでそのカラムを洗浄した後、NPを、増加 CaCl₂グラジエント（１〜 150mM 、10倍）を用いて溶出した。高カゼイン分解活性をもつ画分（resorufin- casein）をプールした。明確なバンドが、 SDSゲル上約33kDにおいて認識されることができ、可視性バンドが、不純物として約50kD（ロット−依存性）において、そして“茶色顔料(blown pigment)”の添加においてより低い分子量範囲（＜1 0kD）において、現れた。 NP画分を、ブチル650Cカラム(10mM Tris、pH 7.5、５mM CaCl₂で平衡にされたもの)に４℃において適用する。これらの条件下、上記不純物（茶色顔料、約50k Dにおける２重バンド）をその溶出液中に置きながら、NPを、上記疎水性カラム材料に結合させる。それを、４℃において、 10mM Tris、pH 8.3、５mM CaCl₂及び10％イソプロパノール又は30％イソプロパノールで溶出させる。この方法で得られたタンパク質は、SDS- PAGEによれば均質である（＞95％純度）。この高純度NP調製物（resorufin-case inとの比活性において 100倍の増加）を、トリプシンで消化し、そしてそのペプチドを、逆相HPLCカラム（Ｃ８）で分離した。そのアミノ酸配列を、そのペプチドを蒸発乾固させた後に、決定した。実施例２中性プロテアーゼのクローニング対合(縮重)DNA配列を、上記中性プロテアーゼの精製後に実施例１に従って決定したペプチド配列から得る。有利な（低い）変性を示す配列を、例えば、 PCR を介して、ジーン・バンクをスクリーニングするための標識された DNAプローブを構築するために使用する。それから、以下のプライマー：ペプチドNP23（配列番号：８）、プライマーNP23F(配列番号：９)、プライマーNP23R(配列番号：６)、ペプチドNP86（配列番号：10）、プライマーNP86-1F(配列番号：11)、プライマーNP86-1R(配列番号：12)、が得られることができる２つのペプチドNP23とNP86が、例えば、特に好適である。互いに対しての上記２つのペプチドの位置は、上記実施の開始時に知られていないので、２つの異なるプライマーの組合せ： 23F／86-1R と 23R／86-1F が、クロストリジウム・ヒストリティカムのゲノム DNAからの対応遺伝子の PCR断片を増幅するために使用されなければならない。これらの組合せの中の１は、上記実験が、成功している場合 PCRにおいてある断片をもたらし、上記第２の組合せは、その時、同時に、ネガティブ・コントロールを提示する。常法により単離されたクロストリジウム・ヒストリティカムからの DNAを用いた PCR後にプライマー NP23Fと NP86-1Rを使用して長さ約 320bpの断片を得ることも実際に可能である。上記組合せ 23R／86-1F は、断片をもたらさない。この約 320bpの断片は、例えば、同じく PCR反応において、dig-dUTPを用いて容易に標識付けされることができ、そしてジーン・バンクから陽性クローンを同定するためのプローブとして役立つ。ジーン・バンクは、制限酵素による消化の後、クロストリジウム・ヒストリティカム DNAから一般に知られた方法に従って調製されることができる。上記の約 320bp断片は、配列決定され、そして配列番号：２の DNAを含んでいる。この配列は、受託番号：9578下、“Deutsche Sammlung von Mikroorganisme n und Zellkulturen GmbH”，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig（DSM）に1994年12月９日に寄託されたプラスミド pNP-86-1R／23F 中にも存在する。クロストリジウム・ヒストリティカムからのゲノム DNAを、HindIIIで消化し、そしてその後、それらの断片を、 DNAリガーゼでライゲートした。２つの外側に向けられたプライマーNPC5（配列番号：５）とNP6C（配列番号：15）を、上記 320bp断片から得て、そして PCR反応において使用した。 586bpの断片（配列番号：１）であって、配列番号：２の大部分を含むものを得た。しかしながら、この方法で、中性プロテアーゼのための遺伝子のさらなる部分を発見することはできなかった。上記 586bp断片は、ペプチドNP23に加えて上記タンパク質消化からのさらなるペプチド及びそのリーディング・フレームを同定するために使用されることができるペプチドNP86の一部をも含む。 NP-NT2：（配列番号：13） NP58：（配列番号：14） PCRプライマーNP-19R（配列番号：17）を、新規ペプチド、NP19（配列番号： 16）から得た。上記 320bp断片から得られていたプライマーNP-19Rとプライマー 416(配列番号：18)を用いての PCR反応は、中性プロテアーゼのさらなる配列情報（配列番号：２よりも約 350bp大きい）を含んでいた 488bp断片を作り出した。その３′末端におけるリーディング・フレームは未だ開いていたので、その遺伝子のさらに小さな部分は、未だ未知でなければならなかった。サザン分析の助けを借りて中性プロテアーゼ遺伝子の領域をマッピングすることにより、概略制限酵素地図（図１）を確立することが既に可能であった。中性プロテアーゼの３′末端全体を単離するために、クロストリジウム・ヒストリティカムからのゲノム DNAを、EcoRＶと ScaＩで解裂させ、そしてそれらの断片を、アガロース・ゲル中で分離し、そしてサザン・ブロットにより分析した。サイズ約1000bpの断片を、そのゲルから単離した。なぜなら、このような DNA セクションは、上記制限酵素地図に基づく残りの３′配列を含むはずであるからである。このゲルから単離された DNA断片をライゲート（ブラント末端に）した。外側に向けられたプライマー428(配列番号：19)と429(配列番号：20)を使用して逆 PCRを再び行い、そしてサイズ 950bpの DNA断片であって、中性プロテアーゼ遺伝子の３′末端並びにさらに 470bpの下流配列を含むものを得た。このように、中性プロテアーゼ遺伝子は、完全に単離された（配列番号：３）。配列番号：３の塩基 933−2100を含むプラスミドpUC21-E-NPは、受託番号 DSM 10341号の下、“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Ze llkulturen GmbH”，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweigに1995年11月2 3日に寄託された。実施例３中性プロテアーゼの発現中性プロテアーゼ又はその一部のための遺伝子を含む DNA断片を、好適なやり方で（例えば、 PCRを介して）それらの末端において修飾し、そしてそれらを、 E．coliのための発現ベクター内で、全体として又は組合せて使用する。よく調節されることができるそれらのプロモーター、例えば、lac，tac，trc，mglを、好ましくは、使用する；しかしながら、他のプロモーターの使用も、考慮されることができる。その分泌のために、それ自体の、中性プロテアーゼのシグナルペプチド又は外来のもの（例えば、 mgl，PhoA）を使用することもできる。発現プラスミドにより形質転換されている E．coli株を、抗生物質選択下、最小培地又はLB培地中で（例えば、５mlのカルチャー中）30又は37℃において一夜培養する。その一夜培養物を、より大きな容量（例えば、１ｌ）に接種し、そしてさらに成長させる。この容量がバイオマスを得るために既に使用された場合、それは、例えば、 lacプロモーターを使用するときIPTGにより 0.2〜２の OD₅₅₀ において誘導されることができ、そしてそれらの細胞は、そのOD及び／又は形成する酵素活性におけるさらなる増加が存在しなくなるまで、さらに成長に供される。この時、それを遠心分離し、そしてそのバイオマスを、中性プロテアーゼを精製するために使用する。しかしながら、中性プロテアーゼ活性のかなりの割合が、その培地中に存在することができ；その時、その培地をも集め、そして中性プロテアーゼをそれから精製する。実施例４ブタ膵臓からの島の単離膵臓を、新たに屠殺したブタから調製し、そしてさらに加工するに挿入し、そしてそこで固定し、その膵臓の水密性を、HBSSバッファーを使用してテストする。クロストリジウム・ヒストリティカムからの精製された組換え中性プロテアーゼを単独で又は精製されたコラゲナーゼＩ型又はII型と混合されて含むHBSSバッファー＋Ca²⁺中の酵素溶液を注射する。この方法で処理された膵臓を、上述の酵素溶液を同じく含む灌流装置に接続する（不連続灌流）。消化を、５〜120 分間の時間期間にわたり４℃〜37℃の間で行い、この間に、その容器内に存在する酵素溶液を、上記膵臓内に連続的にポンプ供給する。このポンプを、最適であると推定される時（その島が解放されるまで通常20〜30分間）の後に、停止し、そしてその膵臓を含む容器を、手で３〜20分間注意して振とうする。金属ボールの事前添加は、その組織の機械的分解及びその周囲外分泌組織からの島の解放を、さらに容易にする。上記消化の進行を、一定間隔で採取されたサンプルのジチオゾン染色の後に顕微鏡で観察する。消化を、氷冷HBSS／10％ FCS（胎児ウシ血清）の添加により停止させ、そしてその懸濁液を、粗粒子を分離するために篩（メッシュ・サイズ 300μｍ）を通して濾過する。濾液中に存在する島を、 250mlの Nalgene丸底フラスコ内で 100ｇにおいて10分間遠心分離する。この上清を、デカンテーションし、そして島を含むペレットを、50ml FCSに再懸濁させる。島を、手で作った密度勾配によりさらに精製することができる。最初に、７ml の島懸濁液を、 250ml Nalgene丸底フラスコに添加す、そして次に50ml培地(RPMI 1640)を、重層する。これらのグラジエントを、スウィング−アウト・ローター内で 100ｇにおいて10分間遠心分離する。10mlの画分を、集め、ジチオゾンにより染色された島のサイズ、純度及び収量を、各画分において顕微鏡により又は画像分析の力を借りて、測定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９７年１月２４日【補正内容】請求の範囲１．クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質のコードする単離された核酸であって、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれた核酸。２．配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAを含む、請求項１に記載の核酸。３．請求項１又は２に記載の外来核酸を原核又は真核宿主細胞内で発現させ、中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質を単離し、そして細胞又は細胞群が所望の量まで解放されるまで、その中性タンパク質と共にその細胞組織をインキュベートし、そしてその細胞組織画分からその細胞又は細胞群を分離することにより、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質と共にその細胞組織をインキュベートすることによりその細胞組織を分解し、そしてその中に含まれる細胞又は細胞群を解放するための方法。４．請求項３に記載の方法であって、その分離が、密度勾配及び遠心分離により達成されるもの。５．請求項３又は４に記載の方法であって、膵臓組織が、その組織として使用され、その単離された細胞が、島細胞であり、そしてその細胞群が、島であるもの。６．請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、肝臓、皮膚、臍帯、内皮、骨、筋肉、心臓、卵巣、子宮、脂肪又は胎盤の組織が、その細胞組織として使用されるもの。７．請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、腫瘍組織が、その細胞組織として使用されるもの。８．原核及び真核宿主細胞内で外来核酸を発現させ、そして所望のポリペプチドを単離することにより、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼの特性をもつポリペプチドを製造する方法であって、その核酸が、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質をコードしており、そしてその配列が、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）において述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれることを特徴とする方法。９．細胞組織の分解及びその中に含まれる細胞又は細胞群の解放のための、請求項８に記載されたように得られた、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの使用。 10．請求項９に記載の方法であって、配列番号：３からのヌクレオチド1027− 1965の DNAが、使用されるような方法。 11．請求項９又は10に記載の方法であって、その宿主が、Ｅ．コリ(E．coli) であるような方法。 12．請求項９又は10に記載の方法であって、その宿主細胞が、酵母細胞又は昆虫細胞であるような方法。 13．請求項１又は２に記載の DNAを含む、生物学的に機能的なベクター又はウイルス DNAベクター。 14．請求項13に記載の DNAベクターにより安定して形質転換又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞。【手続補正書】【提出日】１９９７年６月２３日【補正内容】請求の範囲１．クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium hlstolyticum）からの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質のコードする単離された核酸であって、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれた核酸。２．請求項１に記載の外来核酸を原核又は真核宿主細胞内で発現させ、中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質を単離し、そして細胞又は細胞群が所望の量まで解放されるまで、その中性タンパク質と共にその細胞組織をインキュベートし、そしてその細胞組織画分からその細胞又は細胞群を分離することによって、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質と共にその細胞組織をインキュベートすることによりその細胞組織を分解し、そしてその中に含まれる細胞又は細胞群を解放するための方法。３．原核及び真核宿主細胞内で外来核酸を発現させ、そして所望のポリペプチドを単離することにより、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼの特性をもつポリペプチドを製造する方法であって、その核酸が、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質をコードしており、そしてその配列が、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）において述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＡ 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＡＤＵ 9735−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブルシャー，ヘルムートドイツ連邦共和国，デー−82392 ハバッハ，アムエーレナンカー

Claims

【特許請求の範囲】１．クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質のコードする核酸であって、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）に述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれた核酸。２．配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAを含む、請求項１に記載の核酸。３．以下の、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）において述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、によりコードされ、そして外来核酸の原核又は真核発現の産物であるクロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼと共に、細胞又は細胞群が所望の程度まで解放されるまで、細胞組織をインキュベーションし、そしてその細胞組織画分からその細胞又は細胞群を分離することにより、細胞組織を分解し、そしてその中に含まれる細胞又は細胞群を解放するための方法。４．請求項３に記載の方法であって、その分離が、密度勾配及び遠心分離により達成されるもの。５．請求項３又は４に記載の方法であって、膵臓組織が、その組織として使用され、その単離された細胞が、島細胞であり、そしてその細胞群が、島であるもの。６．請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、肝臓、皮膚、臍帯、内皮、骨、筋肉、心臓、卵巣、子宮、脂肪又は胎盤の組織が、その組織として使用されるもの。７．請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、腫瘍組織が、その細胞組織として使用されるもの。８．細胞組織を分解し、そしてその中に含まれる細胞又は細胞群を解放するための、以下の、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、又はｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）において述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、によりコードされ、そして外来核酸の原核又は真核発現の産物である、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）の使用。９．原核及び真核宿主細胞内で外来核酸を発現させ、そして所望のポリペプチドを単離することにより、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）からの中性プロテアーゼの特性をもつポリペプチドを製造する方法であって、その核酸が、クロストリジウム・ヒストリティカムからの中性プロテアーゼの活性をもつタンパク質をコードしており、そしてその配列が、ａ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNA又はそれに相補的な D NA、ｂ）配列番号：３からのヌクレオチド1027−1965の DNAとハイブリダイズする核酸、ｃ）遺伝子コードの縮重を伴わずに、ａ）又はｂ）において述べた核酸の中の１とハイブリダイズするであろう核酸、から成る群から選ばれることを特徴とする方法。 10．請求項９に記載の方法であって、配列番号：３からのヌクレオチド1027− 1965の DNAが、使用されるような方法。 11．請求項９又は10に記載の方法であって、その宿主が、Ｅ．コリ(E．coli) であるような方法。 12．請求項９又は10に記載の方法であって、その宿主細胞が、酵母細胞又は昆虫細胞であるような方法。 13．請求項１又は２に記載の DNAを含む、生物学的に機能的なベクター又はウイルス DNAベクター。 14．請求項13に記載の DNAベクターにより安定して形質転換又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞。 15．配列番号：13からのヌクレオチド1027−1965の DNAとは異なるが、この D NAとハイブリダイズする DNAによりコードされる中性プロテアーゼの活性をもつポリペプチド。