FR2852247A1

FR2852247A1 - Utilisation de ligands peptidiques de recepteurs de la membrane plasmique et de leurs analogues pour moduler l'activite des mitochondries

Info

Publication number: FR2852247A1
Application number: FR0302984A
Authority: FR
Inventors: Gerard Morel; Aude Debon; Cecile Vivancos
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Priority date: 2003-03-11
Filing date: 2003-03-11
Publication date: 2004-09-17
Also published as: WO2004083231A2; WO2004083231A3

Abstract

Utilisation d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues comme médicament ou comme produit agroalimentaire pour moduler l'activité des mitochondries, dans le traitement du cancer, de l'obésité, des maladies métaboliques, des troubles de la croissance, des rejets de greffes, des maladies mitochondriales, de la nécrose et de la dégénération, et du vieillissement, ainsi que pour améliorer le développement animal et augmenter la production de viande et de lait.

Description

La présente invention est relative à l'utilisation de ligands peptidiques de récepteurs de la membrane plasmique et de leurs analogues pour moduler (activer/inhiber) l'activité des mitochondries.

Les hormones peptidiques, facteurs de croissance, neuropeptides et cytokines sont des facteurs peptidiques libérés, soit dans le sang, soit à proximité de leur site d'action. Ils agissent via des récepteurs spécifiques présents à la surface de cellules cibles. La liaison de ces ligands peptidiques à leur (s) récepteur(s)entraîne deux événements : d'une part, la transduction d'un signal intracellulaire induit une cascade de phosphorylations de substrats cytoplasmiques impliqués dans différentes voies de signalisation cellulaire, qui conduisent à un effet biologique dans la cellule cible (prolifération, différenciation, effet métabolique, apoptose, sécrétion de facteurs..), et d'autre part, l'internalisation du complexe ligand-récepteur induit la diminution du nombre de récepteurs présents à la surface des cellules cibles et la dégradation du ligand par le système lysosomal ou son exocytose par l'appareil de Golgi, qui conduisent à la désensibilisation des cellules au signal du ligand.

L'étude du devenir de ces peptides, après leur internalisation au niveau de la membrane plasmique, a montré qu'une fraction de ces peptides était également localisée dans le cytoplasme, l'appareil de Golgi et les granules sécrétoires, le noyau et les mitochondries.

Parmi les peptides détectés dans le noyau, on peut citer : des hormones (TRH, somatostatine, GRF, CRH, GH, angiotensine II, vasopressine, VIP, insuline, prolactine, ANP...), des facteurs de croissance (NGF, PDGF, EGF, FGF...), des neuropeptides (NPY, substance P...), des cytokines (interférons a, P, y, interleukines...), (Morel, Biochemical Pharmacology, 1994, 47, 63-76 ; Sadir et al., Cytokine, 2001,14, 19-26). En outre, il a été montré que certains de ces peptides avaient un effet sur l'activité nucléaire, à la fois sur la transcription et le cycle cellulaire, notamment sur : l'activation-par activation de la transduction du signal - de la transcription de certains gènes, incluant des oncogènes comme c-fos, (NGF, TRH, GH...), la synthèse de l'ADN (substances P et K, vasopressine, bombésine) et la prolifération cellulaire (prolactine, FGF, GH,...), la synthèse d'ARN (insuline, GRF,..), la sensibilité de la chromatine à la digestion par les nucléases (EGF, angiotensine II...), la transcription des gènes ribosomaux (FGF...) et l'activation de

l'ARN polymérase I (EGF...), (Morel et al., précité; Lobie et al., J. Biol. Chem., 1994,269,21330-21339).

Certains de ces peptides ont également été détectés dans les mitochondries, notamment l'hormone de croissance (Mertani et al., Neuroendocrinology, 1996,63, 257-268) et l'interféron y (Sadir et al., précité). En revanche, aucune fonction n'a été associée à la présence de ces peptides dans les mitochondries.

Les mitochondries jouent un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique des cellules et la thermogénèse du fait qu'elles possèdent l'ensemble des complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire. En outre, elles sont impliquées dans la différenciation cellulaire et le développement, du fait de leur rôle essentiel dans l'induction de l'apoptose (Loeffler et Kroemer, Exp. Cell Res., 2000,256, 19- 26).

Alors qu'il a été proposé que la régulation du fonctionnement mitochondrial était sous la dépendance de la transduction du signal intracellulaire induit par la liaison des ligands peptidiques à leur (s) de la membrane plasmique, les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, des ligands peptidiques de récepteurs de la membrane plasmique qui sont connus pour exercer leur effet biologique par l'intermédiaire du signal transduit par la liaison ligand- récepteur, sont également capables d'être internalisés et captés par les mitochondries et de réguler directement l'activité de ces mitochondries. Par exemple, les inventeurs ont montré que l'hormone de croissance recombinante peut être captée in vitro par une fraction de mitochondries purifiées. En présence de doses croissantes d'hormone de croissance, cette capture se traduit par une diminution de l'activité de deux des quatre complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire, à savoir : le complexe IV (cytochrome c oxydase (COX)) et le complexe II (succinate déshydrogénase (SDH)), et ce de manière dose dépendante, dans un délai inférieur à 15 minutes.

Du fait de leur rôle direct sur l'activité des mitochondries, en l'absence de récepteur membranaire, les ligands peptidiques de récepteurs membranaires et leurs analogues représentent de nouvelles drogues utiles pour moduler (activer ou inhiber) spécifiquement l'activité des mitochondries. De telles molécules ont des applications, dans le domaine médical, notamment pour le

traitement des troubles de la croissance, des maladies métaboliques, de l'obésité, du cancer, des rejets de greffe, des maladies mitochondriales, de la nécrose et de la dégénération, et pour la prévention du vieillissement, ainsi que dans le domaine agro- alimentaire, notamment pour améliorer le développement animal, la production de la viande (par réduction de la lipogénèse) et la production du lait.

L'invention a en conséquence pour objet, l'utilisation d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des maladies dans lesquelles une modulation de l'activité des mitochondries est souhaitable.

Au sens de la présente invention : - on entend par ligand peptidique toute substance peptidique agissant via des récepteurs spécifiques présents à la surface de cellules cibles - on entend par analogue, relativement à un ligand peptidique, un peptide possédant une structure apparentée à celle dudit ligand peptidique mais pouvant posséder une activité similaire (agoniste) ou opposée (antagoniste), vis-à-vis du récepteur dudit ligand peptidique.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les dites maladies sont sélectionnées dans le groupe constitué par : le cancer, les maladies métaboliques, les troubles de la croissance, l'obésité, les rejets de greffe, les maladies mitochondriales, la nécrose et la dégénération et le vieillissement.

La présente invention a également pour objet, l'utilisation à titre de produit agro-alimentaire, d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, pour moduler (activer/inhiber) l'activité des mitochondries.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit ligand peptidique est sélectionné parmi : les hormones peptidiques, les facteurs de croissance, les neuropeptides, les cytokines et leurs analogues.

A titre d'exemple non limitatif de ces ligands peptidiques, on peut citer les suivants : des hormones (somatostatine, GRF, CRH, GH, angiotensine II, vasopressine, VIP, insuline, prolactine, ANP), des facteurs de croissance (NGF,

PDGF, EGF, FGF), des neuropeptides (NPY, substance P) et des cytokines (interférons a, ss, [gamma], interleukines).

Avantageusement, lesdits ligands peptidiques sont pré-sélectionnés par un procédé de criblage comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact d'un ligand peptidique ou de l'un de ses analogues avec une fraction de mitochondries purifiées, - la mesure par tout moyen approprié de l'effet dudit ligand sur l'activité des mitochondries.

Les mitochondries sont purifiées par des moyens connus en eux- mêmes ; par exemple elles sont préparées comme décrit dans Ardail et al., J. Biol.

Chem., 1993, 268, 25985-25992.

L'effet dudit ligand sur l'activité des mitochondries est évalué par tout moyen approprié connu en lui même de l'Homme du métier. Par exemple, l'activité des mitochondries est évaluée par mesure de l'activité respiratoire, des radicaux libres (ROS) ou de l'apoptose.

De manière plus précise, l'activité respiratoire globale est mesurée par oxygraphie et l'activité des complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire (NADH déshydrogénase, succinate déshydrogénase, ubiquinol cytochrome c réductase, cytochrome c oxydase) est mesurée par spectrophotométrie, en présence d'un substrat approprié.

Les radicaux libres (ROS) sont mesurés par dosage des enzymes anti-oxydantes (catalase, gluthation peroxydase, superoxyde dismutase), par quantification de la peroxydation lipidique (dosage du malondialdéhyde) et/ou de l'oxydation des protéines (dosage de dérivés carbonyles). Les radicaux libres sont également mesurés en fluorométrie sur cellules entières, à l'aide d'une sonde diacétate de 2,7-dichlorodihydrofluoroscéine (DCFDA), dont la longueur d'onde d'excitation se situe à 501 nm et d'émission à 521 nm ; l'H202 clive la sonde, libérant ainsi la fluoroscéine, composé émettant à 521 nm. Alternativement, les radicaux libres sont mesurés en fluorométrie sur mitochondries isolées ; l'acide homovanillique réagissant avec H202 utilise la peroxydase de raifort comme catalyseur et permet ainsi de mesurer la production de H202 en mesurant l'émission de fluorescence à 420 nm.

L'activité mitochondriale peut également être évaluée par mesure du degré d'apoptose par l'une des méthodes suivantes : analyse du devenir de l'ADN nucléaire par électrophorèse en gel d'agarose, mesure de la sensibilité du PTP (Permeability Transition Pore) au calcium à l'aide d'une sonde fluorescente non perméante et sensible au calcium (Calcium Green-5N), détection en western-blot, de la présence des protéines Bax et Bcl2 dans les compartiments cytosolique et mitochondrial et de la présence du cytochrome c et de la caspase 9 clivée dans le cytosol, et mesure de l'activité de la caspase 3 par la détection de l'émission de fluorescence résultant du clivage, par cette enzyme, d'un substrat approprié.

En outre, les variations d'autofluorescence du NADH et des flavoprotéines observées en microscopie confocale biphotonique peuvent également donner des indications sur le fonctionnement des mitochondries.

L'invention englobe l'utilisation de peptides isolés et de leurs analogues, de protéines comprenant lesdits peptides et de leurs analogues, ainsi que l'utilisation de vecteurs recombinants codant lesdits peptides, leurs analogues et les protéines précédents.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit ligand peptidique est associé à au moins un moyen permettant sa pénétration dans les cellules et/ou son adressage dans les mitochondries.

De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. On peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt.

On peut également introduire lesdits peptides, leurs analogues et les molécules d'acides nucléiques codant lesdits peptides et leurs analogues (isolées ou insérées dans un vecteur plasmidique) dans des cellules-hôtes, soit en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection, soit en les

associant à toute (s) permettant le passage de la membrane plasmique et/ou l'adressage mitochondrial, tels que des transporteurs comme les nanotransporteurs, des liposomes, des lipides ou des polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.

Parmi les séquences d'adressage mitochondrial, on peut citer de façon non-limitative : - RRIVVLHGYKAVKEVLLNHK (SEQ ID NO : 1), correspondant aux positions 74 à 95 de la séquence du cytochrome P450 2E1 de rat (CYP2E1), - MLSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQ (SEQ ID NO: 2), correspondant aux positions 1 à 24 de la séquence de la superoxyde-dismutase humaine contenant du manganèse (MnSOD), et - MASVWQRLGFYASLLKRQLNGGPDVIKWERRVIPGCTRS (SEQ ID NO : 3), correspondant aux positions 1 à 39 de la séquence de la Leucyl- ARNt synthétase humaine.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation de l'hormone de croissance pour moduler l'activité des mitochondries selon la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre l'incorporation d'125I-hGH, in vivo, par le foie total (A) ou la fraction mitochondriale (B), 15 min après l'injection intraveineuse. A : 35 % de 1'125I-hGH incorporée par le foie est détecté dans la fraction mitochondriale.

B : Analyse par un test en compétition comme décrit à l'exemple 1, de la liaison de 1'125I-hGH aux mitochondries de rat adultes isolées ; 90 % de l'hormone de croissance sont incorporés de façon spécifique par la fraction mitochondriale. Les valeurs représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes erreur standard à la moyenne (SEM). * valeur statistiquement significative P < 0,01, - la figure 2 illustre l'incorporation d'125I-hGH, in vitro, par la fraction mitochondriale, comme décrit à l'exemple 1. A : cinétique d'incorporation de 1'125I-hGH par les fractions mitochondriales ; maximale correspond à une durée d'incubation comprise entre 10 min et 30 min. Les valeurs représentent la

moyenne de 3 mesures SEM. * valeurs statistiquement significatives P < 0,01 . B : incorporation d'125I-hGH par des fractions mitochondriales incubées pendant 10 min avec des concentrations croissantes de rGH (10 nM à 500 nM), en présence d'125I- hGH utilisé comme traceur ; la courbe de saturation atteint un plateau pour des concentration supérieures à 300 nM. Les valeurs représentent la moyenne de 4 mesures indépendantes erreur standard à la moyenne (SEM). * valeurs statistiquement significatives P < 0,05, - la figure 3 illustre l'analyse par SDS-PAGE, de l'incorporation d'125I-hGH par les mitochondries. La translocation mitochondriale a été effectuée comme décrit à l'exemple 1. La fraction mitochondriale isolée à partir du foie a été incubée, 30 min à 37 C, en présence de rGH et d'125I-hGH puis séparée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Piste 1 : fraction mitochondriale incubée avec de l'125I-hGH et 100 nM de rGH. Piste 2 : fraction mitochondriale incubée avec de l'125I-hGH et 300 nM de rGH. Piste 3 : 125I- hGH, - la figure 4 illustre l'analyse par immunomarquage en microscopie électronique de la localisation de l'hormone de croissance dans les mitochondries : des mitochondries purifiées à partir de foie de rat ont été incubées avec 100 nM de rGH (A) ou sans rGH (B) puis incluses dans de la résine hydrophile, comme décrit à l'exemple 1 ; l'immunomarquage à l'aide de particules d'or de 10 nm de diamètre est détecté à l'intérieur des mitochondries, dans la matrice et dans la membrane interne, à la fois dans le contrôle (B) et dans les mitochondries incubées pendant 10 min avec rGH (A) et la densité du marquage augmente avec la concentration en rGH, - la figure 5 illustre l'effet inhibiteur de l'hormone de croissance sur la respiration (état 3), analysé par oxygraphie comme décrit à l'exemple 1. Des mitochondries isolées correspondant à 750 g de protéines ont été introduites dans la chambre électrochimique (volume de 1500 l) et pré-incubées pendant 0,5 et 10 min à 37 C, avec ou sans rGH. Du succinate et de l'ADP ont ensuite été ajoutés à des concentrations finales de respectivement, 5 mM et 100 M. # : Contrôle. ICI GH lOnM. # : GH 50 nM. # : GH 100 nM. * valeurs statistiquement significatives P < 0,05,

- la figure 6 illustre les effets directs de l'hormone de croissance sur les 4 complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire. A : NADH déshydrogénase.

B : Succinate déshydrogénase (SDH). C : Ubiquinol cytochrome c réductase. D : cytochrome c oxydase (COX). Les activités enzymatiques ont été mesurées par spectrophotométrie, à partir de fractions de mitochondries hépatique isolées, comme décrit à l'exemple 1. Pour chaque expérience, les mitochondries ont été incubées à 37 @ C en présence de concentrations croissantes d'hormone de croissance (rGH). Les résultats exprimés en pourcentage par rapport au contrôle, représentent la moyenne SEM. # : incubation sans rGH. : incubation en présence de 10 nM rGH. # : incubation en présence de 50 nM rGH. # : incubation en présence de 100 nM rGH, - la figure 7 illustre l'effet de l'hormone de croissance sur l'inhibition de l'activité cytochrome c oxydase (COX), analysée par une méthode polarographique, comme décrit à l'exemple 1. Les fractions mitochondriales ont été pré-incubées sans rGH (#) ou en présence de 100 nM rGH, pendant 1 min (#), 5 min (#) et 10 min (#) et l'activité COX a été enregistrée pendant 15 min . Les résultats exprimés en pourcentage par rapport au contrôle, représentent la moyenne SEM de 3 expériences indépendantes. * valeurs statistiquement significatives P < 0,05, et - la figure 8 illustre la cinétique d'activation de la cytochrome c oxydase par l'hormone de croissance, mesurée sur la lignée BRL-GHR1-638. Les cellules ont été incubées en présence de 50 nM ou en l'absence d'hormone de croissance ; la stimulation maximale de l'activité cytochrome c oxydase correspond à un période d'incubation de 10 min. Les valeurs représentent la moyenne SEM de 5 expériences indépendantes. * différence significative (P< 0,05).

EXEMPLE 1 : ET METHODES 1) Matériels
L'hormone de croissance humaine (hGH) marquée à l'iode 125 a été fournie par NEN ; spécifique correspond à 100-150 Ci/ g de protéine.

L'hormone de croissance recombinante humaine (rGH) et l'anticorps primaire dirigé contre l'hormone de croissance humaine ont été fournis, respectivement par le NHPP (National Hormone of Pituitary Program) et par DAKO.

Les marqueurs de poids moléculaire prémarqués ont été fournis par BIORAD. Les membranes de nitrocellulose (Hybond-C), le système de détection pour

Western-blot (ECL plus) et les immunoglobulines de chèvre anti-IgG de lapin couplées à la peroxydase ont été fournis par AMERSHAM BIOSCIENCES EUROPE GmbH. Tous les réactifs utilisés pour les analyses biochimiques et polarographiques ont été fournis par SIGMA-ALDRICH.

2) Traitement des rats à 1'125I-hGH
Des rats mâles WISTAR (IFFA-CREDO) de 250 à 300 g sont élevés à température ambiante avec une alternance de 12h de lumière et de 12h d'obscurité.

Les animaux reçoivent une alimentation à base de granulés et de l'eau à volonté. Pour les expériences avec un traceur, les animaux ont été anesthésiés avec de l'halothane et ont reçu une injection intraveineuse de 0,5 ml de PBS contenant 4,4x10 cpm d'125I- hGH avec ou sans un excès d'un facteur 100 d'hormone de croissance recombinante non-marquée. Les rats ont été sacrifiés par décapitation 15 min après l'injection. Les foies des rats ont ensuite été prélevés puis lavés dans du tampon d'isolement (250 mM sucrose, 10 mM Hepes, pH 7,4, 1 mM EDTA).

3) Transfection de l'ADNc codant pour le récepteur de l'hormone de croissance
L'ADNc codant pour le récepteur de l'hormone de croissance (Mathews et al., J. Biol. Chem., 1989,264, 9905-9910) a été cloné dans un vecteur d'expression contenant l'enhancer de SV40 et le promoteur de la métallothionéine IIa humaine. Le vecteur ainsi obtenu et le plasmide pIPB-1 contenant le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de la thymidine kinase (Môller et al., J. Biol. Chem., 1992,267, 23403-23408) ont été co- transfectés dans des cellules BRL 3A, à l'aide de lipofectine.

Des cellules transfectées de façon stable ont ensuite été sélectionnées en présence de G418 (1 mg/ml). La lignée de cellules BRL 3A exprimant de façon stable la protéine correspondant aux positions 1 à 638 de la séquence en acides aminés du récepteur de l'hormone de croissance ainsi obtenue, est dénommée ci-après BRL-GRHi-638.

4) Préparation de mitochondries hépatiques
Les mitochondries de foie de rat sont préparées comme décrit dans Ardail et al., J. Biol. Chem., 1993,263, 25985-25992.

De manière plus précise, les foies sont plongés dans du tampon d'isolement glacé et les mitochondries sont séparées par centrifugations différentielles puis lavées extensivement dans du milieu d'isolement avant d'être purifiées.

L'extrait brut de mitochondries est déposé sur un gradient de 20 ml de tampon Hepes 25 mM, pH 7,4 contenant 225 mM mannitol, 1 mM EDTA, 1 % BSA et 30 % Percoll. Les gradients sont centrifugés 30 min à 95 000 g comme décrit dans Vance, J. Biol. Chem., 1990, 265, 7248-7256, puis une bande épaisse contenant les mitochondries purifiées est prélevée à partir des 2/3 inférieurs du tube. Les mitochondries purifiées sont lavées extensivement dans du tampon d'isolement, de façon à éliminer le Percoll. La concentration en protéines mitochondriales, déterminée à l'aide du kit de dosage de protéines (BIORAD référence 500-0113) et d'un étalon de BSA, est d'environ 60 à 90 mg/ml. L'intégrité des mitochondries isolées a été déterminée par oxygraphie à l'aide d'une électrode à oxygène du type Clark. Les rapports respiratoires contrôles (état 3 de la respiration/état 4 de la respiration) mesurés à partir de différentes préparations de mitochondries sont de l'ordre de 5,5 à 6,5.

5) Immunomarquage en microscopie électronique
Des fractions de mitochondries purifiées ont été stimulées pendant 10 min à 37 C en présence de 100 nM de GH dans du tampon d'isolement, ou non stimulées.

La suspension de mitochondries a été centrifugée à 8 500 g et le culot a été lavé 2 fois dans du tampon 0,1 M phosphate pH 7,4, à +4 C. Le culot a ensuite été coupé en petits morceaux et fixé pendant 30 min à température ambiante dans du tampon 100 mM phosphate pH 7,4 contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,1 % de glutanoldéhyde. Puis les échantillons ont été lavés 3 fois dans du tampon 0,1 M phosphate, pH 7,4, déshydratés par des incubations successives de 15 min, en présence de concentrations croissantes d'alcool : 30 %, 50 %, 70 % et 95 % et incluses progressivement, à température ambiante, dans des mélanges résine hydrophile (LR- White, FLUKA) /alcool à 95 % : 3 bains de 60 min dans des mélanges 1:2, 1:1 et 2 :2.

Les échantillons ont enfin été inclus dans la résine pure pendant 90 min et la polymérisation a été réalisée dans des capsules de gélatine, pendant 24 h à 60 C.

Des coupes ultrafines (70 nm) ont été réalisées à l'aide d'un microtome (Ultracut S, LEICA) puis transférées sur des grilles de nickel de 200 mesh recouvertes de collodion et carbonées. La détection immunocytologique de la rGH a été réalisée à l'aide d'une IgG de cochon d'Inde anti-rGH à la dilution 1/100, dans du tampon 100 mM phosphate, pH 7,4 contenant 300 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 et 0,5 % BSA. Le marquage est révélé par des immunoglobulines anti-IgG de cochon d'Inde couplée à des particules d'or de 10 nm de diamètre. Les réactifs d'immunomarquage (BRITISH BIOCELL) sont utilisés au 1/50e dans du tampon 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 0,05 % Tween-20,0,5 % BSA, pH 8,2. Le contraste a été réalisé par incubation, pendant 30 min dans une solution d'acétate d'uranyle (4 %, pH 7,0) puis les grilles ont été analysées à l'aide d'un microscope électronique (CM120, PHILIPS), fonctionnant à 80 kV.

6) Incorporation de l'hormone de croissance par les mitochondries
Des mitochondries intactes couplées ont été remises en suspension dans du tampon d'incubation (250 mM sucrose, 20 mM KC1, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HP04/KH2P04, pH 7,4) à une concentration de 60 mg/ml de protéines mitochondriales. Pour les expériences dose-effet avec un traceur radioactif, les fractions mitochondriales ont été traitées avec du succinate et de l'ADP pour stimuler la respiration. Les mitochondries sont incubées en présence de concentrations croissantes d'hormone de croissance non marquée (10 nM à 500 nM) et d'125I-hGH comme traceur, pendant 10 min à 37 C, sous agitation. L'hormone de croissance liée de façon non-spécifique à la membrane externe des mitochondries est éliminée par centrifugation à 8500 g pendant 10 min dans un tampon acide (Glycine-HCI, pH 3,0).

Puis les mitochondries sont lavées une fois dans du tampon d'isolement et solubilisées dans 100 mM NaOH, 0,1 % SDS et transferrées dans des tubes adaptés à la spectrométrie y. Les cinétiques sont réalisées dans les mêmes conditions ; les mitochondries étant incubées pendant 0 min à 30 min en présence de 150 nM rGH.

7) Analyse par SDS-PAGE de 1'125I-hGH captée par les mitochondries
Le poids moléculaire de 1'125I-hGH captée par les mitochondries a été déterminé par SDS-PAGE, à partir de mitochondries hépatiques de rats traitées à

1' zs1-hGH et de fractions de mitochondries hépatiques incubées en présence d,I25I- hGH comme précisé ci-dessus. Les échantillons et l'hormone iodée ont été dilués

dans 50 mM Tri-HCl, pH 6 ,8 contenant 90 % (V/V) glycérol, 0,05 % Bleu de Bromophénol, 3 % (P/V) SDS, dénaturés par chauffage à 95 C pendant 5 min et chargés sur un gel de polyacrylamide contenant un gel de concentration à la concentration de 4 % et un gel de séparation à la concentration de 15 %. La migration des échantillons a été réalisée pendant 1 h à 40 mA, puis les gels ont été séchés et autoradiographiés (film AR-5, KODAK).

8) Analyse de l'activité cytochrome c oxydase dans la lignée BRL-GRH 1-638
Les cellules BRL sont cultivées à confluence dans du milieu F12 de Ham additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 50 UI/ml pénicilline et 50 g/ml streptomycine. Les cellules confluentes sont incubées à 37 C, pendant 12 h dans du milieu sans sérum avant l'addition de rGH (50 nM) aux temps indiqués. Après stimulation par la rGH, toutes les étapes sont réalisées à + 4 C. Le milieu est enlevé et les cellules sont lavées avec 50 mM Tris, pH 7,4,9 %o NaCl et récoltées à une concentration finale de 106 cellules/ml. Les cellules sont ensuite centrifugées à 2000 g pendant 10 min, et le culot est remis en suspension dans 250 l de 25 mM Tris-HCl, pH 7,4. La concentration en protéines, déterminée à l'aide du kit (500-0113, BIORAD) et d'un étalon de BSA est d'environ 10 mg/ml. L'extrait de cellules a été hydrolysé pendant 1 h sur la glace, dans du tampon Tris contenant 3 % de dodécyle maltoside puis centrifugé 5 min à 3000 g. Le surnageant a été récolté et l'activité cytochrome c oxydase a été évaluée par mesure spectrophotométrique de l'oxydation du cytochrome c à 550 nm. Le substrat réduit a été obtenu par chromatographie échangeuse d'ions (colonne Sephadex G25, PHARMACIA). Une solution incluant 10 mM KH2P04, pH 7,4,100 mM acide L-ascorbique et 10 % du cytochrome c oxydé a été chargée sur la colonne puis le substrat a été élué en présence de tampon phosphate.

L'essai a été réalisé dans du tampon 100 mM phosphate pH 7,0 contenant 5 à 10 l d'homogénat cellulaire (50 à 100 g de protéines) et 30 l de cytochrome c réduit ont été ajoutés pour initier la réaction.

9) Analyse de l'activité des marqueurs enzymatiques de la chaîne respiratoire
L'activité enzymatique des différents complexes de la chaîne respiratoire a été analysée par spectrophotométrie, à 37 C, à partir de fractions mitochondriales incubées pendant 5,10 ou 15 min en présence de concentrations croissantes de rGH (10,50 et 100 nM).

L'activité NADH déshydrogénase (complexe I) a été évaluée, à l'aide d'un tampon phosphate (10 mM K-phosphate, pH 8,0,5 mM NADH, 20 mM phosphatidylcholine) et de 20 Il à 40 III d'homogénat (100 g à 200 g de protéines mitochondriales). La réaction a été initiée après équilibration par addition de 10 mM d'ubiquinone, puis suivie à 340 nm.

L'activité succinate déshydrogénase (complexe II) a été mesurée à 600 nm. Le milieu réactionnel contenant 50 mM KH2P04, pH 7,4, 1# Triton X-100, 3 mM KCN, 20 g/ml roténone et 10 l à 20 l d'homogénat a été incubé 10 min à 37 C, puis additionné de 0,18 mM DCIP et 1,3 mM PMS et la la réaction a été initiée par addition de succinate (20 mM).

L'activité ubiquinol cytochrome c réductase (complexe III) a été évaluée par mesure de la réduction du cytochrome c, à 550 nm pendant 2 min. La solution de décylubiquinol a été préparée à la concentration de 21,4 mM, comme décrit dans Rieske et al., Methods,Enzymal., 1967, 10, 239-245. Le milieu réactionnel contient 35 mM KH2PO4, pH 7,2,5 mM MgCl2, 2,5 mg/ml BSA, 0,2 mM KCN, 20 M cytochrome c oxydé, 10 pg/ml roténone et 15 g à 30 g de protéines mitochondriales. La réaction a été équilibrée pendant 5 min à 37 C et initiée par addition de décylubiquinol (20 M).

L'activité cytochrome c oxydase (complexe IV) a été évaluée par mesure de l'oxydation du cytochrome c à 550 nm, pendant 1 min. Une solution de cytochrome c oxydé (1 mM) a été diluée à la concentration de 50 M dans un volume de 10 ml de tampon 25 mM KH2P04, pH 7,4. Un ml de cette solution a été réduit par un léger excès de dithionite de sodium. Puis de petites quantités de la solution réduite ont été ajoutées à 9 ml de la solution initiale de cytochrome c oxydé (50 M) jusqu'à atteindre 80 à 90 % de réduction. L'essai a été réalisé à partir d'un ml de cytochrome c réduit auquel 5 à 10 III d'homogénat (5 à 10 g de protéines) ont été ajoutés pour initier la réaction.

10) Analyse polarographique de la consommation d'oxygène
L'oxygène a été dosé à l'aide d'une électrode à oxygène du type Clark (modèle DW1, HANSATECH INSTRUMENTS LABORATORIES), dans une chambre en verre d'un volume de 1,5 ml, thermostatée (37 C 2 C), sous agitation constante. Le milieu réactionnel pour la mesure de la respiration est un milieu saturé

en air ambiant contenant 250 mM sucrose, 1 mM EGTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 et 1 mg/ml de BSA dépourvue d'acides gras libres. Les substrats de la respiration (sous forme de sels de sodium) sont : le succinate (5 mM) et le glutamate (5 mM) additionné de malate (2,5 mM). Des inhibiteurs du transport des électrons de la chaîne respiratoire sont utilisés de façon à mesurer les paramètres de la phosphorylation oxydative de sites de couplages spécifiques ; l'addition de roténone (5 M) pour inhiber le site 1, permet la mesure des sites 2 et 3 en présence de succinate (10 mM), et l'addition de malonate (10 mM) qui inhibe le site 2 permet la mesure des sites 1 et 3 en présence de malate/pyruvate. 75 g de protéines mitochondriales ont été ajoutés dans la chambre contenant 1,5 ml de tampon d'incubation puis le mélange a été incubé pendant 0,5, et 10 min en présence de 10,50 et 100 nM rGH. L'état contrôle de la respiration (état 4) a été initié par addition de 15 l de substrat. Après une min d'incubation, l'état actif de la respiration (état 3) a été initié par addition de 100 M d'ADP. L'électrode a été calibrée à l'aide d'eau déminéralisée et de tampon d'incubation, en fonction du contenu en oxygène de l'eau (Hizuka et al., J. Biol.

Chem. 256,4591-4597). La consommation d'oxygène a été calculée à partir du tracé d'enregistrement et exprimée en nmol d'atomes d'oxygène, par min, par mg de protéines (Postel-Viany et al., Endocrinology, 1982, 111, 244-251). Le rapport ADP/O a été calculé en mesurant la consommation totale d'oxygène pendant le puise de phosphorylation.

11) Analyse statistique
Toutes les valeurs expérimentales sont exprimées par la moyenne SEM. Les résultats sont analysés par le test ANOVA ou par le t-test. Les résultats sont considérés comme significatifs pour P < 0,05.

EXEMPLE 2: MISE EN EVIDENCE DE L'INCORPORATION DE L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE (hGH) PAR DES MITOCHONDRIES ISOLEES (figures 1 à 4)
L'internalisation spécifique de l'hormone de croissance, in vivo, dans les mitochondries hépatiques a été démontrée par co-injection d'hormone de croissance humaine radiomarquée (125I-hGH) avec un excès d'hormone de croissance recombinante (rGH). Les résultats présentés aux figures 1A et 1B montrent que la quantité de radioactivité détectée dans la fraction mitochondriale représente 35 % de

la radioactivité totale incorporée par le foie (figure 1B). 15 min après l'injection, le signal spécifique détecté dans les mitochondries (figure lA) représente 91 % de la radioactivité totale détectée dans la fraction mitochondriale, et ce de manière hautement significative (P < 0,01), démontrant la capacité des mitochondries à accumuler l'hormone de croissance de façon précoce.

L'incorporation spécifique de l'hormone de croissance, in vitro, dans les mitochochondries, a été démontrée par incubation de fractions mitochondriales isolées en présence d'hormone de croissance recombinante non- marquée (rGH) et d'125I-hGH utilisée comme traceur. Chaque expérience a été réalisée avec des mitochondries fonctionnelles, incubées dans un environnement favorable à la respiration. La radioactivité effectivement présente dans les mitochondries a été analysée après des lavages acides permettant d'éliminer l'excès d'hormone et l'hormone fixée à la surface des mitochondries. La cinétique d'incorporation d'125I- hGH (figure 2A) suit une courbe de saturation présentant une augmentation rapide entre t = 0 min et t = 5 min (80 %) puis une stabilisation entre t = 10 min et t = 30 min ; l'analyse statistique montre que la capture est significative dès 5 min par rapport à t = 0 min, reflétant le niveau basal (P < 0,01). L'incorporation d'125I-hGH par des fractions mitochondriales, en présence de concentrations croissantes de rGH, suit une courbe du type sigmoïde (Figue 2B) qui atteint un plateau aux concentrations comprises entre 300 nM et 500 nM. La concentration optimale de rGH permettant d'obtenir 50 % d'incorporation d'125I-hGH (point d'inflexion) correspond à une valeur de 200 nM. L'analyse statistique montre que la capture est significativement différente du taux basal à partir de 150 nM et jusqu'à à 500 nM de rGH (P < 0,05).

Pour déterminer la forme de l'hormone de croissance qui est internalisée, le poids moléculaire du produit radioactif détecté dans la fraction mitochondriale a été déterminé, à partir des mitochondries incubées, in vitro, en présence de rGH, par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et révélé par autoradiographie. La figure 3 montre que les échantillons migrent avec un poids moléculaire apparent correspondant à celui de l'hormone de croissance native mono-iodée (22 kDa) et que l'intensité du signal augmente avec la concentration en GH. Ces résultats indiquent que la radioactivité émise par les mitochondries provient d'125I-hGH native.

Ces résultats ont été confirmés par immunocytologie en microscopie électronique, sur des fractions miotochondriales hautement purifiées incluses en résine hydrophile. L'immunoréactivité correspondant à l'hormone de croissance, visualisée par des particules d'or de 10 nm, est localisée à l'intérieur des mitochondries, dans la matrice et/ou la membrane interne (figure 4). Le signal détecté dans les contrôles, et qui est augmenté de façon significative par incubation avec de l'hormone de croissance exogène (rGH), correspond a celui de l'hormone de croissance endogène.

La mise en évidence, à partir de fractions de mitochondries hautement purifiées, de sites internes de la mitochondrie accessibles par la rGH confirme donc les résultats obtenus avec 1'125I-hGH.

L'ensemble de ces résultats démontre que les mitochondries sont capables d'incorporer l'hormone de croissance in vitro et in vivo, indiquant que la mitochondrie pourrait représenter une cible directe des effets de cette hormone.

EXEMPLE 3: MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET DIRECT DE L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE SUR L'ACTIVITE RESPIRATOIRE DE MITOCHONDRIES ISOLEES 1) Effet global de l'hormone de croissance, in vitro, sur la chaîne respiratoire (figure 5)
La consommation d'oxygène par les fractions mitochondriales a été mesurée par oxygraphie en utilisant le succinate comme substrat de la respiration.

D'une manière classique, les mitochondries ont été conservées dans un milieu contenant de l'albumine bovine dépourvue d'acides gras libres (free- fatty- acid- BSA) susceptibles d'induire un découplage des mitochondries. Les résultats présentés à la figure 5 montrent que l'état 3 de la respiration (respiration en présence d'ADP) est diminué en présence d'hormone de croissance alors que l'état 4 (respiration basale) n'est pas affecté. L'effet de l'hormone de croissance sur l'efficacité des phosphorylations oxydatives est immédiatement détectable pour les concentrations de 50 nM et 100 nM et significativement différente des contrôles (P< 0 ,05). L'inhibition est maximale (40 %) après 10 min d'incubation. Une réduction de l'état 3 a également été observée avec une concentration de 10 nM mais aucune différence significative n'a pu être montrée dans ces conditions.

Ces résultats indiquent que la mitochondrie est une cible directe des effets de l'hormone de croissance sur la respiration cellulaire.

2) Effet direct de l'hormone de croissance, in vitro, sur les complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire (figures 6 et 7)
Les effets à court terme de l'hormone de croissance, in vitro, sur l'activité des mitochondries ont été évalués par l'analyse biochimique, en spectrophotométrie, des 4 complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire, à savoir : complexe 1 (NADH déshydrogénase), complexe II (succinate déshydrogénase), complexe III (ubiquinol cytochrome c réductase) et complexe IV (cytochrome c oxydase). Les cinétiques de réponse à la stimulation par l'hormone de croissance ont été réalisées pendant 15 ou 30 min à 37 C. Dans chaque essai, les contrôles effectués correspondant à l'incubation de fractions mitochondriales dans les mêmes conditions expérimentales avec omission de l'hormone de croissance. Ces contrôles n'étant pas affectés par la température et la durée d'incubation, ont servi de référence pour l'analyse statistique (figure 6). Deux des quatre activités enzymatiques testées, celles des complexes I et II, n'ont montré aucune variation significative quelque soit la période d'incubation testée et la concentration de l'hormone de croissance utilisée (Figure 6A et 6C). En revanche, l'incubation de fractions mitochondriales en présence de l'hormone de croissance conduit à une importante réduction des activités enzymatiques de la cytochrome c oxydase (COX) et de la succinate déshydrogénase (SDH), (Figure 6B et 6D). Les effets de l'hormone de croissance sur ces deux complexes dépendent à la fois du temps et de la concentration d'hormone utilisée.

L'inhibition de l'activité cytochrome c oxydase est maximale et statistiquement significative dès 5 min avec une concentration d'hormone de croissance de 10 nM (30 %, P< 0 ,05). Pour des concentrations de 50 nM et 100 nM, l'hormone de croissance est efficace pendant 15 min alors que 30 min sont nécessaires à la restauration du taux basal de l'activité de la cytochrome c oxydase avec une concentration de 10 nM.

L'inhibition de l'activité succinate déshydrogénase, en termes de temps et d'intensité, est similaire à celle obtenue sur l'activité de la cytochrome c

oxydase en présence de doses croissantes d'hormone de croissance, dans les mêmes conditions expérimentales. L'inhibition maximale est atteinte en 5 min avec une concentration de 100 nM (30 %) et en 15 min avec une concentration de 10 nM (25 %). L'intensité des effets de l'hormone de croissance sur les activités de la cytochrome c oxydase et de la succinate déshydrogénase sont fonction de la concentration et de la durée d'incubation.

L'activité de la cytochrome c oxydase (COX) a également été analysée sur des mitochondries découplées (non-phosphorylées), par une méthode polarographique, à l'aide du substrat TMPD/ascorbate. Avec les mitochondries incubées en présence de 100 nM de rGH, on observe une diminution de la consommation d'oxygène dépendante de la durée d'incubation, qui confirme les résultats de l'analyse biochimique précédente. L'effet est rapide et transitoire (5 min), étant donné que l'effet sur l'activité de la cytochrome c oxydase n'est plus détectable pour les durées de pré-incubation supérieures à 10 min (figure 7). Pour les durées de pré-incubation inférieures à 10 min, la diminution de la consommation d'oxygène est fonction de la durée pré-incubation et l'action de l'hormone de croissance persiste uniquement pendant les 15 premières minutes de l'incubation (P < 0,05).

Ces résultats confirment que l'hormone de croissance induit une diminution de l'activité de la cytochrome c oxydase.

3) Effet de l'hormone de croissance sur l'activité de la cytochrome oxydase, in vitro, sur des cellules entières exprimant le récepteur de l'hormone de croissance (figure 8)
L'effet de l'hormone de croissance sur l'activité de la cytochrome c oxydase a également été analysée in vitro sur la lignée BRL-GH 1-638 exprimant le récepteur de l'hormone de croissance, après une stimulation de 60 min par l'hormone de croissance. L'analyse cinétique présentée à la figure 8 montre que la stimulation de l'activité basale, en réponse à l'hormone de croissance est significative à t = 5 min et maximale à t = 10 min (50 % au dessus de la valeur des contrôles, P< 0,05). Avec les durées d'incubation supérieures, l'activation diminue progressivement et n'est plus détectable à t = 60 min. La stimulation de l'activité respiratoire via la transduction du signal est transitoire et peut vraisemblablement être inhibée par l'internalisation du peptide.

Ces résultats démontrent que la capture in vitro de l'hormone de croissance par les mitochondries isolées à une signification fonctionnelle qui se traduit par une action directe sur l'activité mitochondriale. D'une manière plus générale, ils montrent qu'un ligand peptidique pénètre dans la mitochondrie et agit à l'intérieur même de l'organite sans interaction avec le récepteur spécifique membranaire.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 ) Utilisation d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des maladies dans lesquelles une modulation de l'activité des mitochondries est souhaitable.

2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dites maladies sont sélectionnées dans le groupe constitué par : le cancer, l'obésité, les maladies métaboliques, les troubles de la croissance, les rejets de greffes, les maladies mitochondriales, la nécrose et la dégénération, et le vieillissement

3 ) Utilisation à titre de produit agro-alimentaire, d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, pour moduler l'activité des mitochondries.

4 ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit produit est destiné à l'amélioration du développement animal.

5 ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit produit est destiné à l'augmentation de la production de viande.

6 ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit produit est destiné à l'augmentation de la production de lait.

7 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit ligand peptidique est sélectionné parmi : les hormones peptidiques, les facteurs de croissance, les neuropeptides, les cytokines et leurs analogues.

8 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit ligand peptidique est associé à une séquence d'adressage mitochondrial sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1 à3.