DE2353318A1 - Verbessertes verfahren zur herstellung von plasminogen-aktivator - Google Patents

Description

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Eli Lilly and Company, Indianapolis/ Indiana, V.,St.A»

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung.von Plasminogen-Aktivator durch Kultivieren von Maramaliagewebezellen in Gegenwart .-bestimmter antimitotischer Alkaloide, wie Cholchicin und mit Cholchicin verwandter Alkaloide, Vincristin und Vinblastin.

Der Plasminogen-Aktivator wird hergestellt, indem man Plasminogen-Aktivator produzierende Mammaliazellen in einer wässrigen Gewebenährkultur züchtet, die assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sov/ie organische Salze enthält, und so. eine .Lebendzellkultur, erhält, die Iiebendzellkultur in einer wässrigen Gewebenährkultür die zwischen 0,1; und %Q rag/ml eines Itlkaloids der Gruppe GhOlchicin, ColcJa.affiid _r DesacetjflelxQleiiiGiin, Desace:tami.clQeoOLchicin^!._f €-Cf aRQColchicfiB _f ViÄblastin· oder Vincristin enthält, bis spra VorliegeiQ. gipar w©se;ntlich.e.R. Elenge Piasiiuirtogen-^Aktiva.tox· zvtoht&t, xpaü- ä&n giebiläe Plasm;in.ogen«AIctivatqr· aag. dem KuiltormediMTO gptf©Knt

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Vor einiger Seit wurde erkannt, das das Blut warzablütiger Säugetiere einen als Plasminogen (Profibrinolysin) bekannten Faktor enthält, der nach Aktivierung in vivo oder in vitro einen als Plasmin (fibrinolysin) bekannten Faktor produziert, der, wie sein Name bereits besagt, Fibrin, wie es in Blutgerinseln vorkommt, auflöst. Streptokinase, ein durch hämolytische Streptokokken gebildetes Enzym, und urokinase aus dem. Urin von Säugetieren erhalten, sind zwei bekannte, Plasminogen aktivierende Substanzen, die sich zur Behandlung thromboembolischer Störungen eignen.

Man weiß ferner bereits seit einiger Zeit, daß Tiergewebezellen eine Substanz bilden und enthalten, die Plasminogen aktivieren kann. So konnten beispielsweise T. Astrup und P. Permin, Nature, 159, 581 (1947); C. H. Lack und S. Yousuf Ali, Mature, 2O1 , 1031 (1964); H. Painter et al., Amer. Physiol., 202, 1125 (1962) und E. V. Barnett, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 103, 308 (1959) Plasminogen aktivierende Substanzen herstellen aus Primärzellen sowie aus ausgewachsenen Linienzellen verschiedener Tiergev/ebe. Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Plasminogen— Aktivator aus Manrnialiazelleri sind jedoch unbefriedigend für die Herstellung klinischer iiengen. Solche Verfallren beschreiben die Herstellung von Zubereitungen mit niederen Titern, die krankheitserregend und unrein sind, jedoch die gewünschte aktivierende Tiiirlcuncf zeigen, was die Fibrxnolys« beweist.

Plasudnogen-Aktivator produzierende Maromaliazelleu and Plasrainagen-Älctivator produzierende Seilen fertil;⁰-:-: SeIlliniaa werben in einer «Bssxi-jea 1+ähr gewebekultur j-^züch— tat, bis JL±<2 Seilen car Kultur zusammengewachsen sz.^3 oder eine iitasdlnale Populations -' tea te erreicht haben, üaz Ge^-ebemecTiuri wird dann: rii. eine;:i Alkaloid, aua der.Gruppe

, Colchastiu, i^sacetylcoichicitx, Leuacctir li^o— u, 4-CYanQcolchivii"t r Vincristiii oaer Viiiblast-in

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versetzt, und zwar in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und IO mg/ml Kulturmedium, und man inkubiert die Kultur etwa 4 bis 14 Tage weiter. Der während der Inkubation und ..Züchtung der i-Iainraaliazellen gebildete Plasminogen-Aktivator wird aus der Kultur gewonnen, indem man zuerst unlösliche Zellfeststoffe und Bruchstücke abtrennt, die Ionenkonzentration des Plasninogen-Aktivator enthaltenden Mediums auf eine Konzentratipn einstellt, bei welcher der Aktivator quantitativ an Hydroxyapatit adsorbiert wird. Ira Anschluß an die Einstellung der Ionenkonzentration des Mediums werden etwa 8 bis 12g Hydroxyapatit pro Liter Kulturmedium zugegeben. Die Hydroxyapatit enthaltende Suspension wird etwa 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 2 Stunden, gerührt, wobei der Plasminogen-Aktivator auf dem Hydroxyapatit adsorbiert wird. Den Hydroxyapatit trennt man aus dem verbrauchten Medium durch Filtration,

Zentrifugation oder Dekantieren ab und. wascht ihn sodann mit destilliertem Wasser sowie Phosphatpuffer vom pH 6. Im Anschluß daran wird der Plasminogen-Aktivator vom gewaschenen Hydroxyapatit mit auf pH 6,3 gehaltenem 0,7-mola rem Phosphatpuffer, eluiert. Das den Plasminogen-Aktivator enthaltene Eluat kühlt man auf etwa 5 bis 15 ⁰C ab und versetzt die kalte Lösung mit einem Salz, beispielsweise Ämmoniumsülfat, Natriumsulfat, Ammoniumchlorid oder Natriumchlorid, und zwar bis zu einer Salzkonzentration von etwa 20-prozentiger Sättigung. Der sich dabei bildende Niedershlag von nicht dazugehörendem Protein wird abfiltriert, und die Salzkonzentration des Jkalten Filtrats stellt man zur Ausfällung des Plasminogen-Aktiva"tors auf etwa 50 % Sättigung ein. Der ausgefallene Aktivator wird in Wasser oder in 0,005-molarem Phosphatpuffer vom pH 6,0 gelöst, und die Lösung dialysiert man zur Entfernung anorganischer Bestandteile. Das aktive Plasminogen-Aktivator-Dialysat wird zur Entfernung weiterer, nicht dazugehöriger proteinischer Verunreinigungen chromatographisch über Diäthylaminoäthylcellulose gereinigt. Die den Aktivator enthaltenden

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Eluatfraktionen worden vereinigt, und man fällt aus diesem Eluat durch Zugabe eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, bis zu einer Salzkorizentration von etwa 75 % Sättigung den gewünschten Plasminogen-Aktivator aus. Der Aktivator fällt hierbei quantitativ aus.

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Die Aktivator-Ausfällung wird weiter gereinigt durch Gelchromatographie in einem Puffer aus 0,1-molarem Trishydroxymethylaininomethan und 0,1-molarein Kaliumchlorid, vom pH 8,0.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator ergibt ein hochreines Material, welches sich zur Behandlung verschiedener thromboembolischer Zustände eignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt verbesserte Ausbeuten an Plasminogen-Aktivator, und man setzt hierzu Mammaliazellen ein, die zur Bildung von Plasminogen-Aktivator befähigt sind, und vorzugsweise Plasminogen-Aktivator bildende, ausgewachsene Gewebezellinien. Erfindungsgemäß werden als Mammalia-Zellkulturen folgende ausgewachsene Zellinien verwendet:

Schweinenierenzellinien mit der Bezeichnung PK (15); ATCC NO. CCL 33 PK (15);

Schweinenierenzellinien mit der Bezeichnung LLC-PK₁- (Hull); ATCC NO. CL 101;

Hasennierenzellinien mit der Bezeichnung LLC-RK₁ - (Hull); ATCC No. CCL 106;

jtfierenzellinien von Rhesusaffen mit der Bezeichnung LLC-MK₂ (Hull); ATCC No. CCL 7;

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Hierenzellinien von Rhesusaffen aus dem oben genannten ZeIlraaterial abgelenkt mit der Bezeichnung LLC-liK«; ATCC No.CCL 7.1;

Schweinenierenzellinien jnit der Bezeichnung LLC-PTC-; ATCC No. CL 101.1* ■ .■ ■ '

Die Plasminogen-Äktivator produzierenden Mämmaliazellen erhält man aus frisch geschlachteten Tieren, beispielsweise von Verpacküngshäusern, oder man züchtet die entsprechenden Tiere, beispielsweise Hasen oder Schweine, um dann das Gewebe direkt nach dem Schlachten des Tieres im Labor zu erhalten. Die Auswahl und Zubereitung von TiergewebezeIlen, insbesondere des Gewebes spezifischer Organe, beispielsweise der Niere oder der Adrenaldrüsen, wird nach bekannten Verfahren vorgenommen. In ähnlicher Weise erfolgt die Züchtung solcher Gewebe nach bekannten biologischen Verfahren, wie sie für das Züchten von Gewebe allgemein üblich sind.

Die oben angeführten ausgewachsenen Zellinien , die für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt verwendet werden, sind in der ständigen KuItürSammlung der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rickville, Maryland 20352, hinterlegt.

Srfindungsgemäß besonders bevorzugte Mammaliagewebezellen sind die Schweinenierenzellinien . mit der Bezeichnung LLC-PK₁ (Hull) und LLC-PK₁ .

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Plasmogen-Aktivator hergestellt durch Züchtung einer Plasmogen-Aktivator prodizierenden Seile oder Zellinie, und vorzugsweise der oben erwähnten Zellinien, in.einem rJährgewebekulturmeaiui'n bei Temperaturen zwisehen etwa 20 und 3:8 C. Als Medium für das erfindunsgemäße Verfahren kann irgendeines aus

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der Vielzahl der Medien verwendet werdan,- wie sie zum Züchten von Gewebezellen üblich sind; Das wässrige Hährlaedium kann beispielsweise Stickstoffquellen enthalten, beispielsweise natürliche Aminosäuren wie u.a. 1-Arginin, 1-Histiciin, 1-Lysin, 1-Tyrosin, 1-Tryptophan, 1-Methionin, 1-Serin, Glycin oder Cystein, Carbohydrate, wie Glucose, Inosit, Ribose, Desoxyribose und ähnliche Zucker, sowie verschiedene Salze zur Zufuhr von IJa tr ium-, Kalium-, Chlorid-, Eisen-II-, ßisen-III-, Kobalt-, Calcium-, Phosphat- oder ähnlichen Ionen. Dem Gewebekulturraedium können ferner zahlreiche essentielle Spurenelemente beigegeben werden, wobei diese Spurenelemente normalerweise jedoch in ausreichenden Mengen gleichzeitig mit den anderen Zusätzen für das Gewebekulturmedium eingeschleust werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren kann irgendeines aus der Vielzahl der in der GewebeZüchtung bekannten Medien eingesetzt werden. Einzige Voraussetzung ist nur, daß es sich dabei um ein Medium handelt, welches die für ein Wachsen und die Entwicklung der Zellen erforderlichen Nährstoffe liefert. Bestimmte Medien werden dabei jeäoch bevorzugt, da sie höhere Ausbeuten an dem gewünschten Plasminogen-Aktivator ergeben. Eines dieser Medien ist beispielsweise das Medium 199, welches beschrieben und hergestellt wird nach dem Verfahren von Morgan, Morton und Parker, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950). Ein solches Medium läßt sich mit Vorteil abwandeln, indem man beispielsweise .weitere Vitamine, Mineralien, Carbohydrate und Aminosäuren zusetzt. Das Gewebekulturraedium kann ferner verstärkt werden durch Zusatz von etwa 0,5 bis etwa 10 Voluiiprozent eines Mammaliaserums, und zwar bezogen auf das Volumen des Gewebekulturmediums. Die Marnmaliasera begünstigen das Wachsen und die Entwicklung der Maranaliszellen, und im allgemeinen können zur Erhöhung des Wachsens der Zellen irgendwelche Seren verwendet v/erden, beispielsweise S cli ve ine serum,

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Pferdeserum oder Rinderfötusseruin. Seren, die die Produktion von Plasminogen-Aktivator nicht nachteilig beeinflussen, werden bevorzugt. Seren-, die die Produktion von Plasminogen-Aktivator beeinflussen, lassen sich jedoch in der Änfangs- oder Wachstumsstufe der Zellen verwenden, und man kann sie im Anschluß daran vor der Zugabe eines der oben erwähnten Alkaloide entfernen, Rinderfötusserum wirkt beispielsweise sehr günstig zur Verstärkung des Gewebekulturraediums während des Wachstums und"der. Entwicklung"der Seilen. Dieses Rinderfötusserum beeinflußt die Ausbeute an Plasminogen-Aktivator jedoch nachteilig, wenn es in dem Kulturmediumwährend der Inkubation der Zellen in Gegenwart eines Alkaloids vorhanden ist. Zweckmäßigerweise, entfernt man dieses Serum durch Wechseln des Mediums vor der Zugabe eines Alkaloids» ".'"_":

Das Gewebekulturmedium kann ferner verstärkt werden durch Zusatz' von Proteinquellen, wie enzymatisehen Abbauprodukten von Rindfleisch oder Casein» Eine solche Proteinquelle ist ein enzymatisch.es Abbauprodukte von Rindfleisch.

Zur Unterdrückung irgendwelcher bakterieller Verunreinigung der Gewebekultur während des. Wachsens setzt man dem Gewebekulturmedium üblicherweise ein antibakterielles Mittel zu. Besonders geeignet hierfür sind die Antibiotica, wie Streptomycin oder ein Penicillin.

Die Züchtung der. Gewebekulturzellen erfolgt in üblicher Weise, beispielsweise in Flaschen, Bottichen, Kolben oder Tanks aus rostfreiem Stahls, die man gewünschten-^ oder erforderlichenfalls auf einem.Rotationsschüttler schütteln oder rotieren kann, oder in denen entsprechende Rührvorrichtungen angeordnet sind. Zur Durchführung von Gewebekulturinkubationen verwendet man bevorzugt ein rohrförmigen Gefäß, das man um seine Längsachse,rotieren läßt. Ein solches Gefäß ergibt eine-Oberfläche-, an der die Zellen

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wehrend des Wachsens fest haften kl5r,nen, und die Zellen sind durch das Rotieren des Rohrs gleichzeitig frei zugänglich für das Gewebekulturmadiuia. Wahlweise kann wan die Zellen auch auf irgendeinem geeigneten inerten festen Träger mit hoher überfläche aus- bzw.zusammenwachsen lassen, z.B. auf Glaskugeln, Stäbchen, iletallkügelchon, wie Titankugeln, oder eineia inerten, im Medium unlöslichen organischen Träger, wie kleinen Kügelchen oder kugelförmigen Gebilden aus einera raodifizierten Dextrangel, wie Sephadex. .

In den Tanks oder den großen Flaschen können die Zellen nach dem Subruersverfahren unter Bildung von Plasminogenaktivator kultiviert werden.

Werden Mammaliazellen in Gegenwart eines inerten Trägers, z.B. eines Trägers der oben erwähnten Art und vorzugsweise in einer Rollerflasche oder einem Strömungsrohr inkubiert, die für eine entsprechende Oberfläche sorgen, dann läßt man die Zellen bis zur Bildung einer zusammengewachsenen Monozellschicht auf der Oberfläche wachsen. Erfolgt das Wachsen der Zellen jedoch nach der sogenannten Zeilsuspensionstechnik, dann inkubiert man.die Zellen bis zum Erreichen der maximalen Populationsdichte, die man durch Zählen der Zellen ermittelt.. ,

Das Gewebekulturmedium. wird mit einer Saatkultur einer Mammaliazelle oder -zellinie beimpft, und die Kultur inkubiert man bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 38 ⁰C, vorzugsweise zwischen etwa 35 und 37 ⁰C. Während der Inkubierung kann das Gewebekulturmedium durch Rühren, Schütteln oder, im Fall einer rohrförmigen Vorrichtung, durch Rotation des Rohres bewegt werden. Die Menge des Saatinokulats schwankt in Abhängigkeit bestimmter Faktoren wie der verwendeten Zellart, dem Volumen

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an eingesetztem Medium sowie der Menge an gebildeten Plasminogen-Aktivator. Die Menge an eingesetztem Inokulum ist vorzugsweise, ausgedrückt als Anzahl Zellen pro ml Medium, diejenige Menge, mit welcher man innerhalb von etwa J Tagen ein dichtes Zusammenwachsen der Zellen oder eine maximale Populationsdichte erhält. Ein. zweckmäßiges Verhältnis von Inokulum zu Medium liegt beispielsweise bei etwa 2/5 χ 10 Seilen pro ml Medium.

Das beimpfte Medium wird dann wie oben beschrieben etwa 5 bis etwa 9 Tage inkubiert. Während der Inkubationszeit ändert man das Medium zweckmäßigerweise periodisch, so daß den Zellen während ihrer Entwicklung frische Nährstoffe zugesetzt wird und metabolische Produkte bei jedem Mediumwechsel gleichzeitig ausgewaschen oder verdünnt werden. Normalerweise werden die Zellen eine Woche inkubiert, und während dieser Zeit ändert man das Medium bei 48, bei 96 sowie bei 120 Stunden. Nach der Inkubationszeit von etwa einer Woche, die je nach Art der Zellen schwankt, sind die Zellen zusammengewachsen oder haben eine maximale Populationsdichte erreicht. Während der Inkubation verstärkt man das Medium zweckmäßigerweise durch Zugabe von etwa 3 Volumprozent Mammaliaserum.

"Nach Erreichen eines zusammenhängenden Z el !wachs turas oder einer maximalen Populationsdichte wird das Medium wiederum gegen frisches, serumfreies Medium ausgetauscht, beispielsweise gegen Medium 199, Waymouth Medium 705/1 CP·A. Kitos et al, Exp. Cell Res., 27, 307-316 (1962)),oder gegen ein anderes geeignetes Medium, das ein Alkaloid aus der Gruppe Colchicin, Cölchamid, Desacetylcolchicin, Desacetamidocolchicin, 4-Cyanocolch.icin, Vincristin oder Vinblastin enthält. Die Kultur wird dann weitere 4 bis 14 Tage inkubiert.. Die den Kulturmedium zugesetzte Alkaloidmenge läßt sich variieren. Gute Ergebnisse erhält man jedoch bei Zusatz von etwa 0,1 mg pro ml bis etwa 10 mg pro ml,

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bezogen auf das Kulturmedium. Bevorzugt wird eine Älkaloiclraenge von etwa 1 ag pro ml Kulturmedium.

Führt man die Inkubation von ^ammaliazellen in einen mit Rinderfötusserum verstärkten Gewebekulturmedium durch, dann ersetzt man das i-ledium vorzugsweise durch ein frisches, mit Pferdeseruja verstärktes* Medium und setzt die Inkubation v/eitere 2 bis 3 Tage fort, bevor man das alkaloidhaltige serumfreie Heaium zugibt. Auf diese Weise vermeidet man den oben erwähnten nachteiligen Einfluß des Rinderfötusserums auf die Bildung von Plasminogen-Aktivator, und es korarat doch zur Ausnutzung des Rinderfötusserums auf das Zellwachstuia. Das Pferdeserum wird in diesem Fall üblicherweise dem dazwischen liegenden Replacement-Medium zugegeben, und zwar in einer Konzentration zwischen etwa t und 5 Volumprozent, bezogen auf das Kulturmedium.

Die erfindungsgemäß verwendeten Alkaloide stellen alle bekannte Substanzen dar, die verschieden stark antibiotisch wirken. Das Desacetylcolchicin ist in J. Ämer. Chem. Soc. , 75, 5292 (1953) beschrieben. Das Desacetamidocolchicin ist aus Tetrahedron Lett. 14, 8 (1961) bekannt. Das 4-Cyanocolchicin ist in Justus Liebigs Ann. Chem. 662, 1O5 (1963) erwähnt. Vincristin und Vinblastin sind ira Merck Index, 8. Auflage, Seiten 1108 bzw. 1107, beschrieben.

Die Beziehung der antimitotischen Aktivität der oben erwähnten Alkaloide und der damit erhaltenen, verbesserten Ausbeuten an Plasminogen-Aktivator läßt sich zur Seit noch nicht klar interpretieren.

Die Seit, zu welcher das Alkaloid während der. Inkubation der Gewebekultur zugegeben werden kann, läßt sich variieren. Für die Bildung von Plasminogen-Aktivator ist es beispielsweise nicht wesentlich, daß iaan das Colchicin oder ein

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anderes Alkaloid gerade dann zugibt, v?enn die Zellen zusammengewachsen sind oder eine maximale Populationsdichte erreiche haben. Das Alkaloid kann vor dieser Zeit zugesetzt werden. Größere Ausbeuten an Plasminogen-Aktivator erhält man jedoch bei Zugabe des Alkaloids zu dein Gewebekulturmedium nach beendetem Zusammenwachsen oder lirreichen einer maximalen Populationsdichte der Seilen.

Die Seitdauer, während der die Gewebekulturzellen in Gegenwart des Alkaloids inkubiert werden, wird bestimmt, indem man kleine Teilmengen ,des Gewebekulturrnediums bezüglich der in ihnen enthaltenen Menge an Plasminogen-Aktiyator untersucht. Auf diese Weise läßt sich die Zeit maximaler Plasminogen-Aktivator-Konzentrationen ermitteln, die Inkubation anhalten und der Aktivator gewinnen. Nach Erreichen der maximalen Plasminogen-Aktivator-Konzentration kommt es mit der Zeit zu einem schrittweisen Abfall dieser Maximalwerte. Die zur Entdeckung und Bestimmung des Gehalts an Plasminogen- . Aktivator verwendete Arbeitsweise ist das sogenannte Fibrin-Plattenverfahreri von Astrup-Mullertz (Acta Physiol. Scand., Bd. 25, S. 93 (1952)).

Der gebildete Plasminogen-Aktivator findet sich in dein wässrigen Nährmedium. Nur unbedeutende Mengen hiervon sind zusammen mit den intakten Zellen sowie Zellbruchstücken zu finden. Die vor dem Ernten, nämlich nach der Inkubation in Gegenwart eines Alkaloids, erhaltenen Konzentrationen an Plasminogen-Aktivator liegen bei etwa 300 bis etwa 1200 CTA-Aktivitätseinheiten pro ml oder darüber, und zwar mit den bevorzugten Zellinien. Unter CTA-Einheit ' wird die vom Committee on Thrombolytic Agents des National Heart Instituts festgelegte Einheit verstanden, die auf der Aktivität von Urokinase bzw. Arginyllysinmethylester beruht (S. Sherry et al, J. "Lab. und Clin. Med., 64, 145 (1964)).

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üer Plasminogen-Aktivator wira aus de^n Gewebekulturmedium gewonnen, indem raan zuerst die Seilbruchstücke und anderen Feststoffe aus der Gewebekulturflüssigkeit abtrennt und dann den Plasminogen-Aktivator an Hydroxyapatit adsorbiert. Der Plasninogen-Aktivator wird anschließend von dem Hydroxyapatit eluiert und durch Dialyse, Chromatographie sowie Gelfiltration gereinigt.

Das den Plasminogen-Aktivator enthaltende Gewbekulturmedium wird zur Entfernung von Zellbruchstücken und anderen unlöslichen Stoffen filtriert oder vorzugsweise zentrifugiert. Um den Plasminogen-Aktivator völlig am Hydroxyapatit zu adsorbieren, verdünnt man die filtrierte Flüssigkeit mit. Wasser, um hierdurch die Ionenkonzentration der Flüssigkeit auf einen geeigneten Wert einzustellen. Dies erfolgt durch Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Lösung . und Einstellung der Leitfähigkeit durch Verdünnen der Lösung mit destilliertem Wasser auf eine spezifische Leitfähigkeit zwischen etwa 5 und 8 Millimhos. Wenn die Ionenkonzentration der filtrierten, Plasminogen-Aktivator enthaltenden Lösung auf diese Weise eingestellt ist, dann kommt es zu einer praktisch vollständigen Adsorption des Plasrciinogen-Aktivators an Hydroxyapatit. Ist die Ionenkonzentration zu hoch, was sich'beispielsweise durch eine spezifische Leitfähigkeit von über etwa 8 Millmhos feststellen läßt, dann wird nur wenig Plasminogen-Aktivator an Hydroxyapatit adsorbiert, und infolgedessen gewinnt man auch nur eine geringere Menge hiervon aus dem Gewebekulturmedium.

Im Anschluß an die Einstellung der Ionenkonzentration der Lösung gibt man so viel Hydroxyapatit zu, daß hierdurch der vorhandene Plasminogen-Aktivator adsorbiert wird. Im allgemeinen reicht eine Menge zwischen etwa 8 und 12 g Hydroxyapatit pro Liter Plasminogen-Aktivator-Lösung aus.

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um hierdurch den gesamten, in der Lösung vorhandenen Plasminogen-Aktivator zu adsorbieren. Die Adsorption wird vorzugsweise unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 0 bis 10 °C durchgeführt. Das'kalte Gemisch wird vorzugsweise nicht länger als etwa 2 Stunden gerührt ,'wodurch es unter den beschriebenen Bedingungen zu einer maximalen Adsorption kommt. Durch ein längeres Rühren bis zu 24 Stunden kommt es zu einer schwächeren Adsorption des Aktivators, man gewinnt jedoch trotzdem die Hauptmenge des Aktivators. Am besten verläuft die Adsorption während eines Zeitraums von etwa 2 Stunden.

Der Hydroxyapatit, an den der Plasminogen-Aktivator adsorbiert ist, wird dann filtriert, oder man dekantiert die überstehende Flüssigkeit von dem Hydroxyapatit. Der Hydroxyapatit wird hierauf wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, und man gewinnt ihn nach jedem Waschen entweder durch Dekantieren oder durch Filtrieren. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, wird der Hydroxyapatit vorzugsweise mit 0,01-molarem Phosphatpuffer vom pH 6 gewaschen. Nach dem Waschen eluiert man den Plasminogen-Aktivätor mit 0,7-molarem Phosphatpuffer vom pH 6,8 vom Hydroxyapatit. Die Menge an Eiuierungsmittel ist nicht kritisch, und man kann für eine sichere und vollständige Eluierung des Plasmihogen-Aktivators einen Überschuß hiervon verwenden! Die Eluierung wird jedoch am besten mit einem minimal erforderlichen Volumen an Eluiermittel vorgenommen, um auf diese Weise die nachfolgenden Isolierverfahren zu vereinfachen.

Das auf diese Weise erhaltene, Plasminogen-Aktivator enthaltende Eluat wird auf eine Temperatur zwischen etwa 5 und 15 ⁰C abgekühlt. Aus dem kalten wässrigen Eluat werden proteinartige Verunreinigungen ausgesalzen, indem man das Eluat mit einem Salz, und vorzugsweise einem anorganischen Salz,

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versetzt, bis die Salzkonzentration etwa 20 % Sättigung erreicht. Die proteinartigen Verunreinigungen fallen etwa bei dieser Salzkonzsntration als Wiederschlag aus, und sie werden aus dem kalten Eluat durch Abfiltrieren entfernt. Typische Salze zum Aussalzen der Verunreinigungen sind Ammoniumsulfat, iSiatriumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Ammoniumorthophosphat und ähnliche Sulfat-, Chlorid- und Phosphatsalze. Ein bevorzugstes Salz ist das Ammoniumsulfat.

Die Konzentration des Salzes in dem Eluat wird dann auf einen Wert zwischen etwa 45 und 55 %, und vorzugsweise auf etwa 50 % Sättigung angehoben, um hierdurch den Plasniinogen-Aktivator auszufällen. Zum Ausfällen des Aktivators aus dem Eluat kann man auch höhere Salzkonzentrationen verwenden, beispielsweise bis hinauf zu etwa 90 % Sättigung.

Der Plasminogen-Aktivator ist an dieser Stelle des Isolierungsverfahrens zwar etwas gereinigt, zur Entfernung anorganischer Salze wird er jedoch durch Dialyse weiter gereinigt und dann chromatographisch aufgearbeitet. Der aus dem Eluat ausgefallene Plasminogen-Aktivator wird daher filtriert und erneut in einem Phosphatpuffer, beispielsweise mit einer Konzentration von 0,001 bis O,OO5 Mol, gelöst. Die Pufferlösung dialysiert man hierauf bei etwa 0 ⁰C unter Verwendung einer Cellophanmembran oder sonstigen geeigneten Membran gegen den Puffer allein, um auf diese Weise Spuren von Salz und insbesondere des zum oben erwähnten Aussalzen verwendeten "Salzes zu entfernen.

Die dialysierte Lösung des Plasminogen-Aktivators im Phosphatpuffer, und vorzugsweise einem 0,005-molaren Puffer vom pH 6,0, wird hierauf über Diäthvlaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose) chromatographiert, um das Produkt auf diese Weise weiter zu reinigen.

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Das Chormatographieren wird durchgeführt, indem man die Plasminogen-Aktivator-Lösung über eine mit DEAE-Cellulose gepackte Säule leitet und den Plasminogen-Aktivator dann mit O,005-molarem Phosphatpuffer von der Säure eluiert. Es werden verschiedene Eluatfraktionen aufgefangen, und jede Fraktion wird zur Bestimmung der aktiven Fraktionen nach dem Fibrin-Plattenverfahren untersucht... Der Plasminogen-Aktivator wird von der Säule in den ersten Fraktionen eluiert, wobei in den späteren Fraktionen sehr kleine Mengen an Aktivator vorhanden sind. Die späteren Fraktionen enthalten vorwiegend nicht dazu gehörende, proteinische Verunreinigungen. Wegen der geringen Menge an in diesen späteren Fraktionen enthaltenem Plasminogen-Aktivator lohnt es sich nicht, aus diesen Fraktionen weiteren Plasminogen-Aktivator zu gewinnen. Die aktiven Eluatfraktionen werden vereinigt, und den Plasminogen-Aktivator fällt man durch Zugabe eines Salzes bis zu 75 % Sättigung aus. Als Salz wird Ammoniumsuifat bevorzugt. Der "Plasminogen-Aktivator-Niederschlag wird abzentrifugiert, und man löst ihn dann in einem Puffer aus 0,1-mölarem Trihydroxymethylarainoäthan (Z-Amino-Z-hydroxymethyl-1,3-propandiol) und 0,1-molarem Kaliumchlorid vom pH 8,0. Die gepufferte Lösung wird hierauf gegen den gleichen Trishydroxymethylaminomethan-Kaliumchlorid-Puffer zur Entfernung von Phosphat dialysiert.

Der Plasminogen-Aktivator kann weiter gereinigt werden durch Gelfiltration der dialysierten Plasminogen-Aktivator-Lösung, und vorzugsweise durch Chromatographieren über einem modifizierten Dextran, beispielsweise einem quer- ■ vernetzten Dextran-Gel. Man kann hierzu jedoch auch andere Gele verwenden, beispielsweise ein Acrylamid-Gel oder ein modifiziertes Acrylamid-Gel, welches man als Gel zur weiteren Reinigung des Plasminogen-Aktivators bevorzugt. Die dialysierte Lösung gießt man in eine mit dem Gel gepackte

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Säule und eluiert den Plasrninogen-Aktivator mit dem gleichen Puffersystem, nämlich einem Puffer aus O,1-molarem Kaliumchlorid und 0,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan vom pH 8,0. Es werden zahlreiche Eluatfraktionen aufgefangen, und jede davon untersucht man bezüglich ihrer Aktivität nach dem Fibrin-Plattenverfahren. Die Fraktionen mit fibrinolytischer Wirkung werden vereinigt. Hierbei handelt es sich gewöhnlich um die nach den frühen Fraktionen, welche proteinartiges Material enthalten, kommenden Fraktionen, und diese enthalten den. Großteil an Plasminogen-Aktivator. Die vereinigten, Plasminogen-Aktivator enthaltenden Fraktionen werden hierauf lyophilisiert und in flüssiger Form gelagert.

Den Ergebnissen analytischer Bestimmungen zufolge handelt es sich bei der auf obige Weise hergestellten, lyophilisierten Zubereitung von Plasminogen-Aktivator um einen hochwirksamen Plasminogen-Aktivator.mit einer Reinheit von etwa 90 %. Die hierin beschriebene Plasminogen-Aktivator-Substanz stellt ein wasserlösliches Polypeptid dar, welches aufgrund gelchromatographischer Bestimmung bei 25 ⁰C ein Molekulargewicht von etwa 30 000 hat. Wie die meisten Polypeptide so absorbiert auch der Plasminogen-Aktivator im UV bei etwa 280 m,xi. Die Absorption^von Plasminogen-Aktivator-Lösungen bei 280 m,u im UV ergibt eine bequeme Methode zur Angabe der Aktivität des isolierten Aktivators. Die nach dem Fibrin-Plattenverfahren ermittelte Aktivität steht beispielsweise in Beziehung zu der optischen Dichte (OD) im UV bei 280 m,u für eine gegebene Lösung, und sie wird ausgedrückt als CTA ,\ι/0Ό₂%₀·

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Plasminogen-Aktivator hat normalerweise eine Aktivität zwischen etwa 15 000 und 20 000 CTA /^u/°^D28o ^oder darüber.

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Der erfindungsgemäß erhaltene Plasminogen-Äktivator eignet sich zur Behandlung verschiedener thromboembolischer Zustände, wenn man ihn an warmblütige Säugetiere in einer nicht-toxischen Dosis zwischen etwa 15 000 und 50 000 CTA-Einheiten pro leg Körpergewicht intravenös verabreicht- Der Aktivator wird in einer geeigneten pharmazeutischen Form verabfolgt, beispielsweise als isotonische Salzlösung. Die Dosis an verabreichtem Aktivator kann nach Ermessen des Arztes variiert werden, und zwar je nach der Schwere der Krankheit, beispielsweise der Lage des Gerinseis sowie seiner Größe, der Verträglichkeit des jeweiligen Empfängers gegenüber dem Aktivator und dem allgemeinen Gesundheitszustand des jeweilige Patienten. Der Plasminogen-Aktivator kann wegen seiner Wasserlöslichkeit in jede bekannte, gewünschte pharmazeutische Form gebracht werden, so daß man ihn in dieser Form durch Infusion verabreichen kann.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Die in diesen Beispielen angewandten Zeilkultivierungsverfahren werden durchwegs unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt, wie sie normalerweise für Gewebekulturen zur Anwendung gelangen. Alle Gewebekulturen sowie alle zur Herstellung von Zellkulturen zur Inkubation verwendeten Medien enthalten etwa 100 Einheiten Natrium-Penicillin G pro ml und etwa 100 mg Streptomycinsulfat pro ml, um eine bakterielle Verunreinigung zu verhindern«

Bei spie 1

Eine gefrorene Kultur Schweinenierenzellen, LLC-PK₁ (Hull), ATCC No.. Cl 101, die etwa 1' bis 2xlO⁶ Zellen enthält, wird in

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einem Wasserbad von 37 C aufgetaut, und die Zellen suspendiert man in IO ml Medium 199 , das 2 % Glycerin enthält. Die Suspension wird zentrifugiert, und die überstehende Lösung verwirft man. Die Zellen werden in Medium 199 resuspendiert., das 3 % Pferdeserum enthält, und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise gewaschenen und zur Inkubation hergestellten Zellen suspendiert man hierauf in 3O ml Medium 199 , das 3 % Pferdeserum enthält, und die Zellsuspensidn wird 7 Tage bei einer Temperatur zwischen 35 und 37 ⁰C inkubiert. Die Inkubation wird chixchgefühxt in einer 6O,6 Lifce.r fassenden Inkubatorflasche mit zwei flachen Seiten _r von denen eine von der Suspension bedeckt ist, um auf diese Weise einen Oberflächenträger zu erhalten, auf dem sich die Zellen bis zum Zusammenwachsen entwickeln können. Während der Inkubationszeit ersetzt man das Medium in Abständen von 48 Stunden, bis die Zellen, einen zusammengewachsenen Belag bilden, der die den wachsenden Zellen ausgesetzte Oberfläche der Inkubatorflasche bedeckt.

Sobald alles verwachsen ist, wird das Medium dekantiert, und man wäscht die Zellsehiclit mit IO ml Medium 199 _r das 0,2 % Trypsin enthält. Die mit Trypsin-Medium befeuchtete Zellschicht wird 5 Minuten bei 37 ⁰C inkübiert, um hierdurch die Zellen zu disaggregieren. Die Zellen werden sodann in 30 ml Medium 199 suspendiert, das 3 % Pferdeserum enthält, und man zählt die Zellen, indem man eine kleine Teilmenge (1 ml) aus der Suspension entnimmt. Die Zellsuspension wird hierauf mit Medium 199 verdünnt, das mit 3 % Pferdeserum auf ein Gesamtvolumen von IQO ml verstärkt ist. Die auf diese Weise erhaltene Zellsuspension enthält etwa IO Zellen pro ml Medium.

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Die nach obiger Arbeitsweise hergestellte Zellsuspension verwendet man dann als Inokulum zum Ansetzen von -10 weiteren Inkubator-Flaschen mit 6O,6 Liter Fassungsvermögen. Jede der 10 Kulturen wird hierauf inkubiert, und man läßt die Zellen bis zum Verwachsen in der oben beschriebenen Xieise weiter wachsen, um hierdurch die erste Zellpopulation zu entwickeln. .

Nach abgeschlossenem Verwachsen der Zellen in jeder der 10 Flaschen, wobei das Trypsin enthaltene Medium in der oben beschriebenen iieise wieder verwendet wird, werden die Zellen mit 10 ml Medium pro Flasche resuspendiert, und nach der Resuspension zählt man die in jeder Flasche enthaltenen abgetrennten Zellen- Bei diesem Wechsel des Mediums verwendet man als Resuspensionsmedium jedoch Medium 199, das mit 3 % Rinderfötusserum verstärkt ist.

Die in jeder der 10 Kulturen enthaltenen Zellen werden gezählt, und jede Kultur wird dann entsprechend mit Medium 199 verdünnt, das mit Rinderfötusserum verstärkt

ist, wodurch man eine Zellkonsientration von etwa 10 Zellen pro ml Medium erhält. Jede der auf diese Weise hergestellten Zellsuspensionen hat ein Volumen von etwa 100 ml.

Jede der 10 Zellsuspensionen wird in Glasinkubatorrohre gegeben, die 685 mm .lang sind und einen Durchmesser von 64 mm haben, und die Zellsuspensionen werden darin bei einer Temperatur zwischen 35 und 37 ⁰C inkubiert. Die Rohre werden kontinuierlich längs der Horizontalachse -rotiert, wodurch man eine Wachstumsauflagefläche für die Zellen längs des Rohres erhält.

Während der Inkubation ersetzt man das Medium durch 100 ml frisches Medium 199/ das mit 3 % Rinderfötusserum verstärkt ist, und zwar nach 2 Tagen und dann

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wiederum nach 5 Tagen, gerechnet vom Beginn der Rohrinkubation. Nach 7-tägiger Inkubation sind die Zellen in jedem Rohr auf der Rohroberfläche zusammengewachsen.

Das das Rinderfötusserum enthaltende Medium, welches während des Wachsens bis zum Zusammenwachsen verwendet wird, wird in jedem Rohr durch 100 ml Medium 199 ersetzt, das mit 3 % Pferdeserum verstärkt ist, und man inkubiert weitere 2 Tage. Sodann wird das Medium aus jedem Rohr entnommen und durch 100 ml Serum freies Medium 199 ersetzt, das 1 mg Colchicin pro ml Medium enthält. Die Inkubation wird fortgesetzt, und man entnimmt periodisch eine kleine Teilmenge des Mediums und untersucht sie bezüglich ihres Plasrainogen-Aktivator-Titers. Nach 9-tägiger Inkubation erhält man das Titermaximum, und die an der Rohroberfläche haftende, zusammengewachsene Zellschicht zersetzt sich allmählich. Die Inkubation wird unterbrochen, und den gebildeten Plasminogen-Aktivator trennt man in der im folgenden angegebenen Weise von den in jedem Inkubatorrohr enthaltenen Gewebekulturmedium.

Der Inhalt eines jeden Inkubatorrohres wird zentrifugiert, um auf diese Weise Zellen und Zellbruchstücke abzuzentrifugieren, und die überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt.

Die überstehenden Kulturmedien werden vereinigt,- und sie ergeben ein Gesamtvolumen von etwa einem Liter.

Die dabei insgesamt erhaltene, Plasminogen-Aktivator enthaltende Flüssigkeit wird mit einem Liter destilliertem Wasser mit niedriger Leitfähigkeit verdünnt, und man erhält so eine Lösung mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 8 Millimhos, bestimmt mit einem Konduktometer.

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Die verdünnte Lösung wird mit 10 g gereinigtem Hydroxyapatit versetzt, und das Gemisch rührt man 2 Stunden bei Raumtemperatur. Im Anschluß daran läßt man den Hydroxyapatit , an den der Plasminogen-Aktivator adsorbiert ist, absitzen, und dekantiert das überstehende Medium. Der Hydroxyapatit wird zweimal mit jeweils 100 ml Wasser und dann einmal mit 100 ml 0,01-molarem Phosphatpuffer vom pH 6,0 gewaschen.

Den Plasminogen-Aktivator eluiert man hierauf von dem gewaschenen Hydroxyapatit, indem man eine Suspension des Adsorbens in 500 ml 0,7-molarem Phosphatpuffer vom pH 6 ,8 rührt. Die Suspension wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wodurch es zu einer quantitativen Eluierung des Plasminogen-Aktivators kommt.

Das Eluat kühlt man auf etwa 5 C ab und versetzt es dann mit Ammoniumsulfat bis zu einer Salzkonzentration von 20 % Sättigung. Der hierbei entstehende Polypeptid-Niederschlag wird aus der Plasminogen-Aktivator enthaltenden flüssigen Phase abzentrifugiert.

Die flüssige Phase wird, mit weiterem Ammoniumsulfat bis zu einer Salzkonzentration von etwa 50 % Sättigung versetzt. Aus der Salzlösung fällt unreiner Plasminogen-Aktivator aus, den man abtrennt und als unreinen Feststoff durch Zentrifugieren gewinnt.

Der unreine Plasminogen-Aktivator wird in 0,001-^molarem Phosphatpuffer vom pH 6 gelöst, und die Lösung dialysiert man gegen wässrigen Puffer allein, und zwar unter Verwendung einer Cellophanmembran.

Die dialysierte Pufferlösung von unreinem Plasminogen wird hierauf über DEAE-CeHulose (Diäthylaminoäthylcellulose)

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chromatographiert. Das Chromatographieren wird durchgeführt , indem man die dialysierte Lösung des Plasminogen-Aktivators in eine mit dem Adsorbens, das man mittels 0,001-molarem Phosphatpuffer vom pH 6 vorher ins Gleichgewicht bringt, gepackte Säule gießt und hierbei zahlreiche Fraktionen auffängt. Die Eluatfraktionen werden bezüglich ihrer Ultraviolett-Absorption bei 280 m,u überwacht,. Sobald das Eluat keinen weiteren Plasminogen-Aktivator mehr erhält, was sich durch Abwesenheit einer Absorption bei 28Ο m .u im UV feststellen läßt, eluiert man die Säule weiter mit 0,005-molarem Phosphatpuffer, der mit einem gleichen Volumen einer einmolaren Natriumchloridlösung verdünnt ist. Es werden- zahlreiche Eluatfraktionen aufgefangen, die Fraktionen mit einer Absorption bei 28Ο m .u im Ultraviolett vereinigt man mit den Eluatfraktionen, die man mit dem ersten Eluiermittel erhält, und die vereinigten Eluate werden lyophilisiert.

Die gefriergetrocknete Zubereitung von gereinigtem Plasminogen-Aktivator wird in einem Minimalvolumen eines Gemisches aus gleichen Volumina an O,1-molarem Trishydroxy-" methylaminomethan und 0,1-molarem Kaliumchlorid vom pH 8 gelöst. Die Lösung dialysiert man gegen die gleiche Lösung aus einem 0,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan und 0,1-molarem Kaliumchlorid, um auf diese Weise Phosphat zu entfernen, welches durch das Chromatographieren mit der DEAE-Cellulose in die lyophile Zubereitung eingeschleppt wurde.

Die dialysierte Lösung von Plasminogen-Aktivator wird hierauf über eine Säule chromatographiert/ die mit modifiziertem vernetztem Dextran in O,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan / O,1-molarem Kaliumchlorid vom pH-8 bepackt ist. Der Plasminogen-Aktivator wird aus der Säule mit der gleichen Pufferlösung aus 0,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan und 0,1-molarem Kaliumchlorid vom

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pH 8 eluiert, und man fängt zahlreiche Fraktionen auf. Jede Fraktion wird im UV sowie nach dem Fibrin-Plattenverfahren untersucht, um auf diese Weise die aktiven Fraktionen zu ermitteln. Die letzten Fraktionen, die den Plasminogen—Aktivator enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man 20 mg eines trockenen, amorphen Pulvers erhält, das über etwa 35Ο 000 CTA-Einheiten an Plasmiriogen-Aktivator-Aktivität verfügt.

Beispiel 2

Nach den im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren und Techniken läßt man eine gefrorene Kultur von Schweinenierenzellen, PK "(15), ATCC No. CCL 33 PK (15), bis zum Zusammenwachsen in einem mit Pferdeserum verstärkten Medium 199 wachsen. Die Zellen werden dann 10 Tage in serumfreiem Medium 199 kultiviert, das 1 mg/ml Vinblastin enthält, um auf diese Weise Plasminogen-Aktivator zu produzieren. Der Aktivator wird aus dem Gewebekulturmedium gewonnen und isoliert, und man reinigt ihn durch Aussalzen und Chromatographieren wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Züchtungsverfahren läßt man Hasennierenzellen, LLC^RK, (Hull) , ATCC Uo. CCL 106, bis zum verwachsen in Inkubatorrohren in einem Pferdeserum enthaltenden Medium 199 wachsen. Die Zellen werden hierauf IO Tage in serümfreiem Medium *θθ- inkubiert, das /ml Vincristin enthält, und den hierdurch produzierten Plasminogen-Akfcivator gewinnt und reinigt man nach den im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.

nachträglich
geändert

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Beispiel 4

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Züchtungsverfahren werden Zellen von Rhesusaffennieren bis zum Zusammenwachsen in Medium 199 gezüchtet, das 3 % Rinderfötusserum enthält, worauf man das Medium durch Medium 199 ersetzt, das 3 % Pferdeserum enthält, und weitere 4 Stunden inkubiert. Das Medium ersetzt man durch serumfreies Medium 199 , das 1 mg/ml Colchamid enthält, und inkubiert weitere 9 Tage zur Bildung von Plasminogen-Aktivator. Der so hergestellte Plasminogen-Aktivator wird wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und gereinigt.

Beispiel 5

Eine gefrorene Kultur Schweinenierenzellen, LLC-PK₁-, ATCC No. CL 101,1, wird in einem Wasserbad von 37 ⁰C aufgetaut, worauf man die Zellen wäscht und zur Inkubation vorbereitet, indem man sie zuerst in Medium 199 suspendiert, das

2 % Glycerin enthält. Die Zellsuspension wird zentrifugiert, und die Zellen werden hierauf in Medium 199 resuspendiert, das 3 % Pferderserum enthält. Die Zellsuspension wird zentrifugiert, und die gewaschenen Zellen werden als Inokulum für 50 ml steriles Medium 199 verwendet, das

3 % Pferdeserum enthält. Das beimpfte Medium inkubiert man hierauf bei einer Temperatur von 35 bis 37 ⁰C in einer 1OO ml fassenden Inkubationsflasche, die auf einem Rotationsschüttler angeordnet ist. Die Kultur wird 7 bis 9 Tage unter ständigem Schütteln inkübiert, bis man eine maximale Zellpopulationsdichte erhält, was man durch Zählen der Zellen feststellt.

Die Zellsuspension wird zur Entfernung von verbrauchtem Medium zentrifugiert, und die Zellen suspendiert man in

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Medium 199, das 3 % Pferdeserum enthält, wodurch man zu einer Zelldichte von etwa IO Zellen pro ml Kulturmedium gelangt. Die Zellsuspension wird hierauf in einer 1 Liter fassenden Schüttelflasche wie vorher unter ständigem Rühren bei 35 bis 37 °C inkubiert, bis man die maximale Zellpopulationsdichte erhält. Die Kultur wird zur Entfernung von verbrauchtem Medium zentrifugiert, das man aus der abzentrifugierten Zellpopulation dekantiert.

Die Zellen werden sofort darauf in serumfreiem Medium resuspendiert, das 1 mg/ml Colchicin enthält, wodurch man zu einer
gelangt.

zu einer Zelldichte von etwa 10 Zellen pro ml Medium

Die Zellen inkubiert man hierauf in dem Colchicin enthaltenden Medium etwa 9 Tage bei 37 ⁰C unter ständiger Bewegung. Während der letzten Inkubation in Gegenwart von Cholchicin bestimmt man die in der Kultur vorhandene Menge an Plasminogen-Aktivator, indem man eine kleine Teilmenge bezüglich ihrerfibrinolytischen Wirksamkeit untersucht. Zu maximalen Titern an Plasminogen-Aktivator scheint es zwischen etwa 6 und 10 Tagen nach Beginn der Inkubation zu kommen.

Die Zellkultur wird abzentrifugiert, und den in dem überstehenden Medium enthaltenen Plasminogen-Aktivator gewinnt und reinigt man, indem man ihn nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aussalzt, dialysiert und chromatographiert. .

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Claims (16)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von Plasmlnogen-Aktivator, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) Plasminogen—Aktivator produzierende Mammaliazellen in einem wässrigen Nährgewebekulturmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, unter Bildung einer lebenden Zellkultur züchtet,

   (b) die dabei erhaltene lebende Zellkultur in einem wässrigen Nährgewebekulturmedium kultiviert, das O,l bis 10 mg/ml eines Alkaloids aus der Gruppe Colchicin, Colchamid, Desacetylcolchicin, Desacetamldocolchicin, Cyanocolchicin , Vinblastin oder Vincristin enthält, bis eine wesentliche Menge an Plasminogen-Aktivator in diesem Medium vorhanden ist, und

   (c) den Plasminogen-Aktivator aus diesem Gewebekulturmedium gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mammaliazellen in Gegenwart eines inerten, festen Trägers unter Bildung einer lebenden Kultur zusammenhängender Zellen auf diesem Träger züchtet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mamiaaliazellen bis zu maximaler Populationsdichte in einer lebenden, submersen Zellensuspensionskultur züchtet.

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4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mammaliazellen Mamiftalianierenzellen verwandet. .
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mammaliazellen Schweinenierenzellen PK (15); ATCC No. CCL 33 PK (15), verwendet.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mammaliazellen Schweinenierenzellen LLC-PK, (Hull) , ATCC No. CL 101, verwendet.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mammaliazellen Hasennierenzellen, LLC-RK, (Hull), ATCC No. CCL 106, verwendet.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mammaliazellen Rhesusaffennierenzellen, LLC-MK₂ (Hull), ATCC No. CCL 7, verwendet.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mammaliazellen Rhesusaffenierenzellen, LLC-MK₂, ATCC No. CCL 7,1, verwendet.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man- als Mammaliazellen Schweinenierenzellen, LLC-PK.^, ATCC No. CL 101,1, verwendet.

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11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaloid Colchicin verwendet.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis IO_f dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaloid Colchamid verwendet.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis IO, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaloid Vinblastin. verwendet .
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaloid Vincristin verwendet.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gereinigten Plasminogen-Aktivator aus einem wässrigen Nährgewebekulturmedium gewinnt, indem man

    (a) unlösliche Bestandteile aus dem den Plasminogen-Aktivator enthaltenden wässrigen Gewebemedium abtrennt,

    (b) das abgetrennte Medium mit destilliertem Wasser unter Einstellung der spezifischen Leitfähigkeit dieses Mediums auf 8 Millimhos oder darunter verdünnt,

    (c) das dabei erhaltene Plasminogen-Aktivator enthaltende Medium 1 bis 24 Stunden mit 8 bis 12 g Hydroxyapatit pro Liter Medium zusammenbringt,

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    <d) den Hydroxyapatit, an den der Plasminogen-Aktivator adsorbiert ist, aus diesem Medium abtrennt,

    (e) den Hydroxyapatit wäscht,

    (f) den Plasminogen-Aktivator aus dem gewaschenen Hydroxyapatit mit Q,7-molarem Phösphatpuffer vom pH,6,8 eluiert,

    (g) das den Plasminogen-Aktivator enthaltende Eluat mit einem wasserlöslichen anorganischen Salz bis zu einer Kon-

    zentration von etwa 20 % Sättigung versetzt,

    (h) die ausgefallenen Verunreinigungen aus diesem Eluat abtrennt,

    (i) das hierbei erhaltene Eluat mit einer weiteren Menge des erwähnten Salzes bis zu einer SalzkohzentratiOn von etwa_; 45 bis 90 % Sättigung versetzt,

    (j) den ausgefallenen Plasminogen-AktivatQr aus diesem salzhaltigen Eluat abtrennt,

    (fcj " den Plasminogen-'Aktivator in einem Phosphatpuffer mit einer Molarität zwischen etwa 0,001 und 0,005 löst und diese Pufferlösung diaiysiertr

    (1) die dialysierte Lösung von Plasminogen-Aktivator mit Diäthylaminoäthylcellulose-Adsorbens zusammenbringt,

    (m) den adsorbierten Plasminogen-AktivatQr aus diesem Adsorbens mit 0,005-molarem Phosphatpuffer eluiert, .

    (n) das den Plasminogen--Aktivator enthaltende Eluat mit einem wasserlöslichen Salz bis zu einer Salzkonzentration von etwa 75 % Sättigung versetzt,

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    (ο) den Niederschlag an Plasminogen-Aktivator abtrennt ,

    (p) den Plasminogen-Aktivator in einem Puffer aus 0,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan und 0,1-molarem Kaliumchlorid vom pH 8,0 löst und die Pufferlösung gegen diesen Puffer allein dialysiert,

    (q) die dialysierte Pufferlösung mit einem modifizierten Dextrangel zusammenbringt,

    (r) den adsorbierten Plasminogen-Aktivator von diesem Gel mit einem Puffer aus 0,1-molarem Trishydroxymethylaminomethan und 0,1-molarem Kaliumchlorid vom pH 8,0 eluiert, und

    (s) das Plasminogen-Aktivator enthaltende Eluat lyophilisiert und so zu einer gereinigten, festen Form des Plasminogen-Aktivator s gelangt.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als wasserlösliches anorganisches Salz Ammoniumsulfat verwendet.

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