CN110016470A

CN110016470A - 一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法

Info

Publication number: CN110016470A
Application number: CN201910384278.6A
Authority: CN
Inventors: 张春发; 黄超; 秦人胜; 邓柳红; 高海波; 陈吉良; 王胜
Original assignee: Jiangsu Senruipu Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: HAINAN SR-BIOPHARMA Co.,Ltd.
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2019-07-16

Abstract

本发明属医药领域，涉及一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法，是取商陆叶片提取总蛋白后用硫酸铵盐析出得到商陆抗病毒粗蛋白，将商陆抗病毒粗蛋白溶解于Tris‑HCl缓冲液后，采用阴离子交换层析、阳离子交换层析进一步纯化，洗脱得到商陆抗病毒蛋白溶液，超滤浓缩，真空冷冻干燥得到纯度大于或等于99％的商陆抗病毒蛋白。本发明采用盐析粗纯化后进行阴离子交换层析、阳离子交换层析进一步纯化的工艺路径，获得纯度大于或等于99％的商陆抗病毒蛋白，解决了现有技术中提取商陆抗病毒蛋白的纯度低及缺乏高纯度商陆抗病毒蛋白对照品和标准品的问题，具有良好的临床应用前景。

Description

一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法

技术领域

本发明属医药领域，涉及一种从药用植物中提取单一有效成分的方法，更具体地说，涉及一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法，该方法制备的商陆抗病毒蛋白最高纯度可大于或等于99.0％。

背景技术

商陆科植物商陆在《中国药典》和《中华本草》中均有收载。商陆植株含有商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins，PAPs)，PAPs是一类具有酶功能的同功酶，和蓖麻毒素A一样属于核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins，RIP)，其作用机制主要是通过从核糖体RNA上切去单个腺嘌呤而使核糖体失去活性。PAPs对巨细胞病毒(CMV)、流感病毒、脊髓灰质炎病毒(PV)、疱疹病毒(HSV)人体免疫缺损病毒(HIV)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)等多种病毒都有抑制和杀灭作用。

商陆抗病毒蛋白作为原料药，其生产过程包含复杂的化学变化和生物变化过程，往往会产生副产物，因此商陆抗病毒蛋白的提取纯化已成为商陆抗病毒蛋白在医学上应用的关键节点。目前，商陆抗病毒蛋白的提取方法仅限于实验室阶段，产量低，提取物纯度不高，尚未建立高纯度、大批量的工业化提取纯化体系，同时缺乏高纯度商陆抗病毒蛋白对照品和标准品，严重的阻碍了商陆抗病毒蛋白在临床和制剂上的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法，该方法制备的商陆抗病毒蛋白的纯度高，解决了现有技术中提取商陆抗病毒蛋白的纯度低及缺乏高纯度商陆抗病毒蛋白对照品和标准品的问题。

一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法，具体步骤如下：

1、取商陆叶片，采用1:1～3比例加入蛋白提取缓冲液匀浆提取总蛋白，取上清，30～45％硫酸铵盐析离心去除大部分杂质后，再采用80～95％的硫酸铵盐析出得到商陆抗病毒粗蛋白。

2、将商陆抗病毒粗蛋白溶解于PH为7.2～7.7的Tris-HCl缓冲液，脱盐过滤后，先采用阴离子交换层析纯化，洗脱后再采用阳离子交换层析进一步纯化，洗脱得到商陆抗病毒蛋白溶液。

3、商陆抗病毒蛋白溶液采用超滤浓缩，真空冷冻干燥得到纯度大于或等于99％的商陆抗病毒蛋白。

进一步地，所述的商陆是商陆Phytolacca acinosa Roxb和垂序商陆Phytolaccaamericana L.。商陆抗病毒蛋白从上述商陆中的一种或二种商陆中提取。

进一步地，所述阴离子交换层析可以进行多次，把杂质(含杂蛋白)尽量去除。采用的阴离子交换层析柱填料是二乙氨乙基纤维素(DEAE-Cellulose)或二乙氨乙基琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)，优选二乙氨乙基琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)；洗脱液为10～20mmol/L Tris-HCL，PH7.2～7.7，其中洗脱液pH值优选7.6。

进一步地，所述阳离子交换层析采用的阳离子交换层析柱填料是羧甲基纤维素(CM-Cellulose)或羧甲基琼脂糖凝胶(SP-Sepharose)，优选羧甲基琼脂糖凝胶(SP-Sepharose)。

进一步地，所述阳离子交换层析采用不连续的阶段洗脱方式：先用低浓度缓冲液洗脱非特异性吸附，低浓度缓冲液为20～45mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，再用高浓度缓冲液洗脱商陆抗病毒蛋白，高浓度缓冲液为60～90mmol NaCl的磷酸缓冲液。

进一步地，所述的商陆抗病毒蛋白分子量为29～30KD，等电点为8。

本发明采用盐析粗纯化后进行阴离子交换层析、阳离子交换层析进一步纯化的工艺路径，获得纯度大于或等于99％的商陆抗病毒蛋白。解决了现有技术中提取商陆抗病毒蛋白的纯度低及缺乏高纯度商陆抗病毒蛋白对照品和标准品的问题，为建立高纯度商陆抗病毒蛋白的工业化提取纯化体系提供依据，所制备的商陆抗病毒蛋白可以用作高纯度商陆抗病毒蛋白对照品和标准品，可以应用于预治病毒感染及其引起的相关疾病，特别是在治疗和预防HPV病毒感染及其相关疾病中的应用，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1高效液相色谱法定量分析实施例1获得的商陆抗病毒蛋白的高效液相色谱图。

图2高效液相色谱法定量分析实施例2获得的商陆抗病毒蛋白的高效液相色谱图。

图3高效液相色谱法定量分析实施例3获得的商陆抗病毒蛋白的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、商陆抗病毒蛋白的制备

实施例1

(1)商陆叶片和提取液按比例1：1(w/v)研磨匀浆，过滤，离心取上清液，加入硫酸铵固体，分别进行30％和85％两次盐析，室温放置过夜。

(2)离心取沉淀，沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液(PH7.5)，脱盐过滤后用DEAE-Sepharose阴离子过柱去除杂质，缓冲液为10mmol/L Tris-HCL缓冲液(PH7.5)；脱盐浓缩后再过SP-Sepharose阳离子柱，阶段洗脱：先用缓冲液为25mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱非特异性吸附，再用缓冲液为60mmol NaCl的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白(商陆抗病毒蛋白)。收取样品峰超滤，真空冷冻干燥制成。HPLC检测：TSKgel SP-5PW阳离子柱(7.5×75mm)；流动相为20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，0-300mM KCl。

实施例2

(1)商陆叶片和提取液按比例1：2(w/v)研磨匀浆，过滤，离心取上清液，加入硫酸铵固体，分别进行35％和90％两次盐析，室温放置过夜。

(2)离心取沉淀，沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液(PH7.6)，脱盐过滤后用DEAE-Sepharose阴离子过柱去除杂质，缓冲液为10mmol/L Tris-HCL缓冲液(PH7.6)；脱盐浓缩后再过SP-Sepharose阳离子柱，阶段洗脱：先用缓冲液为40mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱非特异性吸附，再用缓冲液为70mmol NaCl的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白(商陆抗病毒蛋白)。收取样品峰超滤，真空冷冻干燥制成。HPLC检测：TSKgel SP-5PW阳离子柱(7.5×75mm)；流动相为20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，0-300mM KCl。

实施例3

(1)商陆叶片和提取液按比例1：3(w/v)研磨匀浆，过滤，离心取上清液，加入硫酸铵固体，分别进行40％和95％两次盐析，室温放置过夜。

(2)离心取沉淀，沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液(PH7.5)，脱盐过滤后用DEAE-Sepharose阴离子过柱去除杂质，缓冲液为10mmol/L Tris-HCL缓冲液(PH7.5)；脱盐浓缩后再过SP-Sepharose阳离子柱，阶段洗脱：先用缓冲液为45mmol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱非特异性吸附，再用缓冲液为85mmol NaCl的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白(商陆抗病毒蛋白)。收取样品峰超滤，真空冷冻干燥制成。HPLC检测：TSKgel SP-5PW阳离子柱(7.5×75mm)；流动相为20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，0-300mM KCl。

商陆抗病毒蛋白的含量测定：

分别对实施例1、2和3获得的商陆抗病毒蛋白用高效液相色谱仪进行含量测定，结果见图1、2、3。液相色谱条件：TSKgel SP-5PW阳离子柱(7.5×75mm)；流动相为20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，20分钟0-300mM氯化钾梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为280nm。

结果表明，采用本发明方法从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白，所获得的商陆抗病毒蛋白含量为100％。

二、商陆抗病毒蛋白的活性测定

对实施例1、2和3获得的商陆抗病毒蛋白采用麦胚离体系统进行活性测定：将实施例1、2和3获得的商陆抗病毒蛋白样品处理后分别加入1ml含荧光素蛋白DNA的麦胚体外蛋白质生物合成体系中，于30℃反应2小时后终止反应，分别取出5ul，采用荧光酶标仪检测荧光吸收值，结果见表1。IU定义为抑制1ml麦胚体外蛋白质生物合成的50％所需要的商陆抗病毒蛋白量。

表1

样品	翻译抑制活性IC50(ng/ml)
		实施例1	10
实施例2	10
		实施例3	10

三、试用效果

以本发明提取的商陆抗病毒蛋白为活性成分制备成制剂(实施例1、2和3制备的商陆抗病毒蛋白制备成制剂的编号为1101001、1101002、1101003。)，治疗不同地区HPV病毒(含低危和高危HPV病毒)感染阳性患者及相关疾病做了初步试用观察，结果表明，该制剂能有效清除高危HPV病毒，无任何刺激和不良反应，方便患者自行给药治疗。

1、商陆抗病毒蛋白制剂治疗高危型HPV病毒持续性感染的临床疗效观察

目的：观察高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染女性使用商陆抗病毒蛋白制剂后治疗宫颈HPV感染的临床效果。方法：对临床上经LCT或宫颈刮片检查正常，同时经HC2方法检测高危型HPV-DNA(+)的300名妇女，随机分为五组，试验组300例采用阴道推注商陆抗病毒蛋白制剂的方法给药(其中试验组1采用商陆抗病毒蛋白制剂1101001，试验组2采用商陆抗病毒蛋白制剂1101002，试验组3采用商陆抗病毒蛋白制剂1101003)，阴性对照组100例，不使用任何药物。停药后第3个月和第6个月观察高危型HPV DNA的转阴率，以HPV转阴为有效。结果：商陆抗病毒蛋白制剂1101001、1101002、1101003对治疗宫颈高危型HPV感染患者转阴率分别为70％、73％、68％；阴性对照自愈率为17％。结论：商陆抗病毒蛋白制剂对妇女宫颈高危型HPV感染具有明显的临床疗效。

2、商陆抗病毒蛋白制剂治疗宫颈高危型HPV病毒一过性感染的临床疗效观察

目的：探讨商陆抗病毒蛋白制剂阴道用药治疗高危型人乳头瘤病毒(HPV)宫颈感染的临床效果。方法.研究对象为排除宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的240例高危型HPV宫颈感染的患者，其中180例高危型HPV宫颈感染的患者使用商陆抗病毒蛋白制剂治疗作为试验组(其中试验组1采用商陆抗病毒蛋白制剂1101001，试验组2采用商陆抗病毒蛋白制剂1101002，试验组3采用商陆抗病毒蛋白制剂1101003)，阴道内隔日用药，10次为一个疗程，共6疗程；另60例高危型HPV宫颈感染的未行任何治疗患者作为对照组。两组患者均知情同意。停药后第6个月和第9个月观察高危型HPV DNA的转阴率，以HPV转阴为有效。结果显示商陆抗病毒蛋白制剂1101001、1101002和1101003治疗高危型HPV宫颈感染6月后高危型HPV转阴性率分别为93.0％、90％、91％，9月后转阴性率分别为98％、95％、96％，显著高于对照组(58％，63％)。结论：商陆抗病毒蛋白制剂治疗高危型HPV宫颈感染临床效果满意，具有临床推广应用的意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)取商陆叶片，采用1:1～3比例加入蛋白提取缓冲液匀浆提取总蛋白，取上清，30～45％硫酸铵盐析离心去除大部分杂质后，再采用80～95％的硫酸铵盐析出得到商陆抗病毒粗蛋白；

2)将商陆抗病毒粗蛋白溶解于PH为7.2～7.7的Tris-HCl缓冲液，脱盐过滤后，先采用阴离子交换层析纯化，洗脱后再采用阳离子交换层析进一步纯化，洗脱得到商陆抗病毒蛋白溶液；

3)商陆抗病毒蛋白溶液采用超滤浓缩，真空冷冻干燥得到纯度大于或等于99％的商陆抗病毒蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的商陆是商陆Phytolacca acinosaRoxb或垂序商陆Phytolacca americana L.。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换层析采用的阴离子交换层析柱填料是二乙氨乙基纤维素或二乙氨乙基琼脂糖凝胶；洗脱液为10～20mmol/L Tris-HCL，PH7.2～7.7。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析采用的阳离子交换层析柱填料是羧甲基纤维素或羧甲基琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析采用不连续的阶段洗脱方式：先用低浓度缓冲液洗脱非特异性吸附，低浓度缓冲液为20～45mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，再用高浓度缓冲液洗脱商陆抗病毒蛋白，高浓度缓冲液为60～90mmol NaCl的磷酸缓冲液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的商陆抗病毒蛋白分子量为29～30KD，等电点为8。