CN105087732B - 一种天麻多肽及制备方法和在抗菌抗病毒中的医用用途 - Google Patents
一种天麻多肽及制备方法和在抗菌抗病毒中的医用用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种天麻多肽及制备方法和在抗菌抗病毒中的医用用途，是通过对天麻蛋白的提取、过滤浓缩、酶解、超滤分离而得，然后依据用途和应用领域与适宜的辅料按比例混合,制备成相应制剂。该肽是一种酸性多肽，分子量范围在5.8‑7.8KD,等电点为7.83‑8.15，天麻多肽是从天然资源得到的产物,即使是微量级(10‑ 7mol/L)也有显著的生理活性。经实验证实其具有很好的抗菌抗病毒能力,对常见致病菌及病毒有很强的杀伤力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点,可用于制备具有抗菌功能及抗病毒型流感、乙型肝炎、甲型H1N1流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒的药物。
Description
技术领域
本发明提供一种天麻多肽，同时还提供了其制备方法，本发明进一步公开了天麻多肽在抗菌抗病毒中的医用用途，属于医学生物制药技术领域。
背景技术
天麻作为一种中药材，具有熄风定惊、镇静催眠、镇痛、抗血小板聚集、抗氧化、延缓衰老、降压、抗惊厥、抗癫痫、改善学习记忆，增强非特异性免疫及细胞免疫等功效，然而目前国内外对于天麻多集中于天麻多糖、天麻素、生物碱等有效成分的提取、分离纯化及药理活性方面的研究。经检索未见天麻多肽相关文献报道。
发明内容
本发明提供一种天麻多肽，为天然抗菌抗病毒药物,对大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏杆菌等具有广谱的抗菌活性，能有效抑制病毒型流感、乙型肝炎、甲型H1N1流感病毒、艾滋病病毒、冠状病毒的增殖，同时还能促进皮肤伤口愈合。
本发明提供一种天麻多肽的制备方法，适用于工业化生产，提取率高。
本发明提供一种天麻多肽在抗菌抗病毒中的医用用途，加入其它增溶剂等辅料可制成片剂、胶囊、颗粒等口服制剂；凝胶剂，软膏剂，喷雾剂，洗剂，栓剂等用于皮肤和粘膜的消毒剂、消毒湿巾、消毒纱布、消毒棉棒、创可贴等各种消毒产品。
本发明所述的天麻多肽，其特征在于：
为一种酸性多肽，分子量范围在5.8-7.8KD，等电点为7.83-8.15，其电泳图如图1所示。
本发明的一种天麻多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按料液比1:6-12（g/ml），置于浓度为0.4%-1%的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2-8h；
2)减压过滤后,将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5-1.2（g/ml）的原药浓度；
3)向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入0.2-0.8%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1-3%,胰蛋白酶0.6-1.5%，风味蛋白酶0.5-1%，酶解温度为50-60℃，酶解时间为30min-1.5h , 然后将酶解液过 10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，即得。
本发明一种抗菌抗病毒天麻多肽提取物的制备方法，其特征是，优选的天麻粉碎至80目，料液比1:6（g/ml），0.6%的氯化钠溶液,80℃水浴提取4h，天麻蛋白提取液原药浓度为1g/mL。
本发明中所述天麻多肽提取物可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂,所述制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、消毒湿巾、消毒棉棒、消毒纱布及创可贴等外用剂型；也可以为口服液、颗粒剂、混悬液、乳剂等口服剂型。
本发明积极效果在于:
天麻多肽为天然药物的特性，疗效确切，没有化学品的诸多不良影响和副作用；天麻多肽稳定性非常好，既耐酸碱又耐高温，高温处理及真空干燥后仍保留完整的药理活性；使用简单方便，皮肤渗透性好，无刺激性，不易残留；不仅有很好的治疗作用，还能促进皮肤伤口愈合。本发明具有广谱的抑菌活性，特别是针对常见细菌、引起妇科疾病的真菌及伤口感染的绿脓杆菌表现出极高的抑菌效果，对流感病毒、乙型肝炎病毒、甲型H1N1流感病毒、冠状病毒表现出极强的杀伤力，以天麻多肽为主药成分的药物制剂具有广阔的前景。
附图说明：
图1天麻多肽凝胶电泳图；
其中，左右两侧为标准的marker,即标准分子量蛋白质的电泳图,由左向右依次为实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中天麻多肽凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的内容并不局限于此。
实施例 1 ：
1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至80目，按料液比1:6（g/ml），置于浓度为0.6%的氯化钠溶液中,80℃水浴提取4h；
2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为1（g/ml）的原药浓度；
3)向浓缩液中按体积比加入0.4%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1.5%,胰蛋白酶0.8 %，风味蛋白酶0.6%，酶解温度为55℃,酶解时间为40min,然后将酶解液过10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，所得膜下滤液即为天麻多肽提取物，于 4℃条件下保存备用。
4) 采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD（见附图1）。
实施例2
1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至100目，按料液比1:8（g/ml），置于浓度为0.4%的氯化钠溶液中,80℃水浴提取2h；
2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.8g/mL的原药浓度;
3)向浓缩液中按体积比加入0.2%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶2%,胰蛋白酶0.6 %，风味蛋白酶0.5%，酶解温度为50℃,酶解时间为30min, 然后将酶解液过10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于 4℃条件下保存备用；
4) 采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD（见附图1）。
实施例3
1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至40目，按料液比1:12（g/ml），置于浓度为1%的氯化钠溶液中,80℃水浴提取6h；
2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.5g/mL的原药浓度；
3)向浓缩液中按体积比加入0.8%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3%,胰蛋白酶1.5%，风味蛋白酶1%，酶解温度为60℃,酶解时间为1.5h, 然后将酶解液过10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于 4℃条件下保存备用；
4) 采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD（见附图1）。
实施例4
1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至60目，按料液比1:10（g/ml），置于浓度为0.8%的氯化钠溶液中,80℃水浴提取8h；
2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为1.2g/mL的原药浓度；
3)向浓缩液中按体积比加入0.5%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1%,胰蛋白酶1.2 %，风味蛋白酶0.8%，酶解温度为55℃,酶解时间为1h, 然后将酶解液过10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于 4℃条件下保存备用；
4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD（见附图1）。
以天麻多肽作为活性成分，按照常规卫生用品制备工艺，可制成创可贴、消毒湿巾、消毒棉棒、消毒纱布等卫生消毒材料。
对本发明天麻多肽进行的主要药效学实验及结果如下：
一、体外抗菌试验
本发明所提供的天麻多肽提取物具有很好的抗菌性能，在体外对临床常见耐药菌株进行溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能测试（实验方法参见2002年《消毒技术规范》），数据结果如下：
二、天麻多肽提取物抗病毒实验
(l)天麻多肽提取物抗流感病毒实验
在96孔细胞培养板上,将本发明的天麻多肽提取物用完全培养基进行2倍倍比稀释,共6个稀释度,每孔1O0ul,同时设置正常细胞对照,流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200TCID50的流感病毒,每孔的总体积为200ul。置37℃,5%CO2培养箱内培养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下,选取5个不重叠的视野,计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC5O是对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度,治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
(2) 天麻多肽提取物抗乙型肝炎病毒的实验
在96孔细胞培养板上,将本发明的天麻多肽提取物用完全培养基进行2倍倍比稀释,共6个稀释度,每孔1O0UL,同时设置正常细胞对照,乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和3OOTCID50的乙肝病毒,每孔的总体积为200ul。置37℃,5%CO2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下,选取5个不重叠的视野,计数乙肝病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC5O为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC5O是对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度,治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
(3) 天麻多肽提取物抗H1N1流感病毒的实验
在96孔细胞培养板上,将本发明的天麻多肽提取物用完全培养基进行2倍倍比稀释,共6个稀释度,每孔100ul,同时设置正常细胞对照,H1N1流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200TCID50的艾滋病病毒,每孔的总体积为200ul。置37℃,5%CO2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下,选取5个不重叠的视野,计数H1N1流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC5O为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC5O是对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度,治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
(4) 天麻多肽提取物抗冠状病毒的实验
在96孔细胞培养板上,将本发明的的天麻多肽提取物用完全培养基进行2倍倍比稀释,共6个稀释度,每孔100ul,同时设置正常细胞对照,冠状病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200TCID50的冠状病毒,每孔的总体积为200ul。置37℃,5%CO2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下,选取5个不重叠的视野,计数冠状病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC5O为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC5O是对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度,治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
(5) 天麻多肽提取物抗艾滋病病毒的实验
在96孔细胞培养板上,将本发明的的天麻多肽提取物用完全培养基进行2倍倍比稀释,共6个稀释度,每孔100ul,同时设置正常细胞对照,艾滋病病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200TCID50的艾滋病病毒,每孔的总体积为200ul。置37℃,5%CO2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下,选取5个不重叠的视野,计数艾滋病病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC5O为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC5O是对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度,治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。
表1天麻多肽提取物抗流感病毒增殖的作用:
| IC50（vg/ml） | EC50 | SI | |
| 实施例1 | 14.5 | 1.7 | 8.53 |
| 实施例2 | 14.9 | 1.8 | 8.27 |
| 实施例3 | 15.6 | 1.9 | 8.21 |
| 实施例4 | 15.1 | 1．8 | 8.38 |
表2天麻多肽提取物抗乙型肝炎病毒增殖的作用
| IC50（vg/ml） | EC50 | SI | |
| 实施例1 | 13.0 | 1.5 | 8.67 |
| 实施例2 | 13.2 | 1.7 | 7.76 |
| 实施例3 | 12.8 | 1.6 | 8.00 |
| 实施例4 | 13.6 | 1.8 | 7.55 |
表3天麻多肽提取物抗H1N1流感病毒增殖的作用
| IC50（vg/ml） | EC50 | SI | |
| 实施例1 | 12.8 | 1.6 | 8.00 |
| 实施例2 | 13.1 | 1.8 | 7.71 |
| 实施例3 | 12.4 | 1.6 | 7.75 |
| 实施例4 | 12.9 | 1.7 | 7.59 |
表4天麻多肽提取物抗冠状病毒增殖的作用
| IC50（vg/ml） | EC50 | SI | |
| 实施例1 | 11.9 | 1.6 | 7.31 |
| 实施例2 | 12.1 | 1.7 | 7.12 |
| 实施例3 | 11.6 | 1.7 | 6.82 |
| 实施例4 | 12.0 | 1.8 | 6.67 |
表5天麻多肽提取物抗艾滋病病毒增殖的作用
| IC50（vg/ml） | EC50 | SI | |
| 实施例1 | 13.2 | 1.7 | 7.76 |
| 实施例2 | 13.1 | 1.8 | 7.27 |
| 实施例3 | 12.9 | 1.8 | 7.16 |
| 实施例4 | 13.5 | 1.9 | 7.11 |
上述实验表明:本发明的天麻多肽提取物能显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒、H1N1流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒的增殖,可用于制备治疗这些病毒的药物。
三、皮肤刺激性实验
采用多次完整皮肤刺激试验法,选用4只皮肤完好、重约3kg新西兰白兔,试验前24h,脱去其背部脊柱两侧各约3cm×3cm的毛,次日分别将本发明制备的实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的天麻多肽提取物0.5ml 擦于一侧去毛皮肤表面, 敷贴2.0cm×2.0cm的2层无菌纱布并用无刺激胶布固定,另一侧以0.5ml提取溶剂作为空白对照。4h后去除敷贴物,用水清洗除去残留物。每天涂抹一次,连续涂抹14d。分别于去除受试物后24h观察皮肤局部反应,进行刺激反应评分。
皮肤刺激试验结果:
采用多次完整皮肤刺激试验法,对4只新西兰种白兔进行试验,以检测不同原药浓度天麻多肽提取物对实验动物皮肤的刺激作用和强度。分别于24h后观察受试兔子脊柱两侧皮肤局部反应,观察结果为试验兔两侧皮肤均无红肿和红斑,评分均为0,皮肤刺激强度分级为无刺激性级别。
Claims (2)
1.一种天麻多肽的制备方法，包括以下步骤：
1) 天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按1 g：6毫升-12毫升的料液比，置于浓度为 0.4%-1% 的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2-8h；
2) 减压过滤后, 将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5-1.2g/ml的原药浓度；
3) 向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入 0.2-0.8% 的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶 1-3%, 胰蛋白酶 0.6-1.5%，风味蛋白酶 0.5-1%，酶解温度为50-60℃，酶解时间为 30min-1.5h , 然后将酶解液过 10KDa 膜进行超滤，8000r.p.m 离心 20min，即得天麻多肽，
为酸性多肽，分子量范围在 5.8-7.8KD，等电点为 7.83-8.15。
2.权利要求1 所述方法制备的天麻多肽在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌的生长及其抗病毒药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170818 Address after: The 134003 Tonghua ducks in Jilin province Erdaojiang District West Village Hot Town Park Patentee after: Tonghua Shengyuan biological Polytron Technologies Inc Address before: 130011 Changchun Qianjin Street, Jilin, No. 2699 Patentee before: Jilin University |
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| TR01 | Transfer of patent right |