CN1397563A

CN1397563A - 商陆抗病毒蛋白的生产工艺

Info

Publication number: CN1397563A
Application number: CN 02136582
Authority: CN
Inventors: 陈石根; 陈新宇
Original assignee: Shanghai Yusheng Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yusheng Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2003-02-19

Abstract

本发明在充分了解PAP的理化性质的基础上，克服了原实验室工艺中的硫酸铵沉淀法不利于大规模生产、工艺复杂、耗时等缺陷，改用本生产工艺提取PAP：商陆叶抽提→酸处理→热处理→用Mono Q或Mono S进行快速液相层析，使工艺路线得以简化，高效省时，产品的纯度及回收率均得到大幅提高。

Description

商陆抗病毒蛋白的生产工艺

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种商陆抗病毒蛋白的生产工艺。

背景技术

商陆作为一种传统中药，其功效早在《纲目》、《本草图经》及《千金方》等著作中就有详细记载，而对于商陆抗病毒蛋白的研究则已成为近年来研究的一项热门课题。商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antiviral Protein，简称PAP)最早发现于美洲商陆叶中，是一种核糖体失活蛋白。该蛋白质具有RNA N-糖苷酶活性，能专一地去除核糖体大亚基上28SrRNA或23SrRNA特定位点上的腺嘌呤核苷的嘌呤环，使核糖体不能和EF因子结合，从而抑制翻译，导致细胞死亡。研究表明，商陆抗病毒蛋白的抗病毒功能主要基于其RNA N-糖苷酶活性。一般认为在细胞被病毒感染后，细胞的质膜会发生一些变化，使得商陆抗病毒蛋白能够很容易进入细胞内，杀死被感染的细胞，中断细胞中病毒的扩增，阻止病毒的进一步感染，达到抗病毒的作用。PAP作为一种具有RNA N-糖苷酶活性的核糖体失活蛋白，对于DNA、RNA病毒感染的细胞具有广谱的杀菌作用，故极具应用价值。例如以PAP为核心成分的“护虾宝”产品成为我国首例针对对虾病毒病的兽药并获得药证。PAP的工业化制备可为“护虾宝”产品提供大量的原料。但是，目前的PAP实验室工艺程序复杂，耗时较多，且纯度较低，回收率也不高，不利于大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于提出一种高效、便捷，且产品纯度高、回收率好的PAP生产工艺。

本发明提出的PAP生产工艺是根据PAP特有的理化性质而设计的。PAP分子量约为31000D，碱性蛋白，等电点(lsoelectric Point，简称pI)＞8.0；PAP对热特别稳定，在100℃10分钟不失活；而且PAP在氯仿、酚或胰蛋白酶处理后仍保持活性，据此本发明设计的PAP生产工艺如下：

对商陆叶进行抽提、酸处理、热处理、快速液相层析(Fast Process LiquidChromatography，简称FPLC)得到高纯度PAP，具体步骤为：

(一)抽提商陆叶加3～5倍体积的缓冲液TEB pH7.5+(0.1～0.2)mol/L NaCl匀浆，在4℃(冷柜)下搅拌抽提，冷置，过滤，于30000～45000g离心20～40分钟，滤液下步备用；

(二)酸处理加入醋酸，调节pH值至4.0，在4℃下保持20～40分钟，于30000～45000g离心20～40分钟，滤液下步备用；

(三)热处理将滤液加热至60～70℃，处理10～20分钟，经冰浴，迅速冷却，于30000～45000g离心20～40分钟，滤液下步备用；

(四)FPLC柱：Mono S HR5/5或Mono Q HR5/5，流速0.8～1.5毫升/分钟，缓冲液：(A)TEB pH8.0+(0.2～0.75)mol/L NaCl，(B)TEB pH8.0+(0.8～1.0)mol/L NaCl，进行梯度洗脱。

上述工艺中，TEB(Tris-EDTA Buffer)的组份如下：

Tris-HCL 5～20mmol/L，

巯基乙醇 0.1～0.4mmol/L，

EDTA 0.1～0.2mmol/L。

由上述工艺制备的PAP，本发明对其进行了蛋白质、分子量、等电点和活力等进行测定。

蛋白质测定采用Bradford法。

分子量测定采用SDS/PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和胶过滤(见Nature227：600，1970)，PAP分子量为30000D。

等电点测定：等电聚焦胶电泳，pI＞8.0.

活力测定：参见Biochem J.，216：617，1983。

测定对兔网织红细胞体处蛋白质生物合成体系的抑制。将不同浓度的一种PAP样品加入50ml含³⁵S-Met的兔网织红细胞体外蛋白质生物合成体系中，于37℃反应一小时(反应终止用0.1mol/L KOH)；分别取5μl反应液点于WhatmannIII号滤纸，用二甲苯闪烁液处理进行液闪计数。IC₅₀从线性阻遏分析计算。IU定义为抑制1ml兔网织红细胞体外蛋白质生物合成体系抑制50％所需要的蛋白量。下面是原硫酸铵分级沉淀工艺与本发明工艺的纯化收支表比较：(一)原硫酸铵分级沉淀工艺原料：2Kg仲夏商陆新鲜叶步骤蛋白质总活力产量纯化倍数

(g) (10^-6U) (％)抽提 72.8 40.5 (100) (1)硫酸铵分级沉淀 1.73 25.1 62 26DEAE-纤维素柱 0.23 9.7 24 76磷酸纤维素柱 0.115 6.1 15 95(二)本发明工艺原料：9Kg仲夏商陆新鲜叶步骤蛋白质总活力产量纯化倍数

(g) (10^-6U) (％)抽提 360 132 (100) (1)酸处理 20.8 108 82 14热处理 4.1 64.5 49 42FPLC 0.45 27 20.5 163本工艺和原工艺相比较，其特点是：

(1).避免了使用大量硫酸铵，解决了离心操作、脱盐的不便以及三废处理上的困难，同时也提高了回收率和纯化倍数；

(2).采用酸处理和选择热处理在操作上简便，而且可一举除去大量杂蛋白；

(3).FPLC分离省时、分辨率高、可在短时间内获得大量纯化产品。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

实施例1

(1).20公斤新鲜商陆叶加4倍体积TEB pH7.5+0.14mol/L NaCl匀浆；在4℃下搅拌抽提过夜，过滤，于30000g离心30分钟，滤液下步备用；

(2).加醋酸调节PH至4.0；4℃下处理30分钟，离心如前，滤液下步备用；

(3).滤液加热至65℃处理15分钟，经冰浴，迅速冷却，离心如前，滤液下步备用；

(4).将滤液进行FPLC层析柱：Mono S HR5/5，流速：1.0毫升/分钟，用缓冲液：(A)TEB pH8.0加上0.75mol/L NaCl；(B)TEB PH8.0加上0.85mol/L NaCl，进行梯度洗脱，即得高纯度PAP产品。

实施例2

(1).10公斤新鲜商陆叶加3倍体积TEB pH7.5+0.1mol/L NaCl匀浆；在4℃下搅拌抽提过夜，过滤，于40000g离心35分钟，滤液下步备用；

(2).加醋酸调节pH至4.0；4℃下处理25分钟，离心如前，滤液下步备用；

(3).滤液加热至70℃处理20分钟，经冰浴，迅速冷却，离心如前，滤液下步备用；

(4).将滤液进行FPLC层析柱：Mono S HR5/5，流速：1.0毫升/分钟，用缓冲液：(A)TEB pH8.0加上0.5mol/L NaCl，(B)TEB PH8.0加上0.8mol/L NaCl，进行梯度洗脱，即得高纯度PAP产品。

实施例3

(1).20公斤新鲜商陆叶加5倍体积TEB pH7.5+0.2mol/L NaCl匀浆；在4℃下搅拌抽提过夜，过滤，于45000g离心40分钟，滤液下步备用；

(2).加醋酸调节pH至4.0；4℃下处理40分钟，离心如前，滤液下步备用；

(3).滤液加热至60℃处理10分钟，经冰浴，迅速冷却，离心如前，滤液下步备用；

(4).将滤液进行FPLC层析柱：Mono S HR5/5，流速：1.5毫升/分钟，用缓冲液：(A)TEB pH8.0加上0.65mol/L NaCl(B)TEB PH8.0加上0.9mol/L NaCl进行梯度洗脱，即得高纯度PAP产品。

上述实施例制备获得的PAP产品，经蛋白质、分子量、活力以及其产率和纯化率指标与前表(二)相近。可见其产品纯度高，回收率好。

Claims

1.一种商陆抗病毒蛋白的生产工艺，其特征在于对商陆叶进行抽提、酸处理、热处理和FPLC，得到高纯度的PAP产品，具体步骤为：

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于所用的TEB的组份如下：

Tris-HCL 5～20mmol/L，

巯基乙醇 0.1～0.4mmol/L，

EDTA 0.1～0.2mmol/L。