CN113713059A - 宣肺败毒方用于制备预防和/或治疗甲型h1n1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请实施例提供了宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途，其中，所述宣肺败毒方以重量份计，包括以下成分：生麻黄5‑7份、生石膏28‑32份、生薏苡仁28‑32份、苦杏仁13‑17份、茅苍术8‑12份、广藿香13‑17份、青蒿草10‑14份、干芦根28‑32份、化橘红13‑17份、虎杖18‑22份、马鞭草28‑32份、葶苈子13‑17份和生甘草8‑12份。本申请提供的宣肺败毒方以及其提取物能够降低病毒载量，降低促炎因子表达、促进抗炎因子表达，改善肺部症状，因此可以用于预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎。

Description

宣肺败毒方用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起 的肺炎的药物中的用途

技术领域

本申请涉及宣肺败毒方新用途技术领域，特别是涉及宣肺败毒方用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途。

背景技术

甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病，其病原体是一种新型的甲型H1N1流感病毒，在人群中传播。与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。

目前治疗甲型H1N1流感的西药主要有两种类别药品：1)金刚烷胺药物(adamantanes和remantadine)和2)流感的神经氨酸酶抑制剂(达菲oseltamivir和扎那米韦zanamivir)，然而对于中药对流感的治疗药物，目前还有待研究。

发明内容

发明人在研究中发现，宣肺败毒方能够有效降低病毒载量，降低促炎因子表达和/或促进抗炎因子表达，进一步地，能够减少肺泡内炎症细胞浸润和肺泡壁的增厚，并基于此完成了申请。

本申请第一方面提供了宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途，其中，所述宣肺败毒方以重量份计，包括以下成分：生麻黄5-7份、生石膏28-32份、生薏苡仁28-32份、苦杏仁13-17份、茅苍术8-12份、广藿香13-17份、青蒿草10-14份、干芦根28-32份、化橘红13-17份、虎杖18-22份、马鞭草28-32份、葶苈子13-17份和生甘草8-12份。

本申请第二方面提供了一种用于预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎药物组合物，其包含宣肺败毒方提取物和药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请提供的宣肺败毒方以及宣肺败毒方提取物能够有效降低甲型H1N1流感病毒的病毒载量，降低感染个体促炎因子表达和/或促进抗炎因子表达，进一步地，能够减少肺泡内炎症细胞浸润和肺泡壁的增厚，因此可以用于预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎，进而可以用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。

图1为小鼠体重曲线。

图2为小鼠肺组织HE染色结果。

图3显示了宣肺败毒方对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠肺中病毒滴度的影响。

图4显示了宣肺败毒方对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠炎症因子释放的影响。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本申请进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请第一方面提供了宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途，其中，所述宣肺败毒方以重量份计，包括以下成分：生麻黄5-7份、生石膏28-32份、生薏苡仁28-32份、苦杏仁13-17份、茅苍术8-12份、广藿香13-17份、青蒿草10-14份、干芦根28-32份、化橘红13-17份、虎杖18-22份、马鞭草28-32份、葶苈子13-17份和生甘草8-12份。

在本申请的一些实施方式中，所述宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物通过降低病毒载量，治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎。

在本申请的一些实施方式中，所述宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物通过降低促炎因子表达和/或促进抗炎因子表达，治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎。

在本申请的一些实施方式中，所述药物给予有需要的对象的每日剂量宣肺败毒方生药量计为3-4g/kg体重。

本申请第二方面提供了一种用于预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎药物组合物，其包含宣肺败毒方提取物和药学上可接受的载体或赋形剂。

在本申请的一些实施方式中，所述药物组合物还包括阿比多尔、磷酸氯喹中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述宣肺败毒方提取物包括宣肺败毒方的水提取物或乙醇提取物的至少一种。其中，所述水提取物可以理解为宣肺败毒方的汤剂，示例性地，可以通过用水煎煮所述宣肺败毒方并过滤而得到；或者可以以水为溶剂，通过加热回流并过滤而得到；优选地，可以将甘草与其他组分分别提取，获得水提物后合并获得。所述乙醇提取物可以理解为采用包括乙醇的溶剂提取得到，例如，可以在所述宣肺败毒方水提取物中加入终浓度为65-75％的乙醇，收集乙醇提取物。

本申请的药物组合物可以采用制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分，与一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本申请的药物组合物。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本申请的药物组合物中可用的“药学上可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

根据本发明的药物组合物，其可以为适用于口服给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、乳剂、混悬剂或酊剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、凝胶剂、口服溶液、口服混悬液、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂、混悬剂或酊剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本申请的药物组合物用于口服施用的剂型除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患本申请所述甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的个体或动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的个体或动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本发明所述的个体是人。

本申请的药物组合物的活性成分宣肺败毒方提取物，以生药量计的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的施用剂量可以是3-4g/kg体重/日。然而，本公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。

下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。

小鼠模型给药量计算

宣肺败毒方出膏率为12.6％，宣肺败毒方常用的人口服生药量为238g，小鼠与人的等效剂量比是0.0026:1，按照每只小鼠20g，小鼠的等效服药剂量为238×0.126×0.0026/0.02＝3.89844g/kg，将3.9g/kg定为高剂量，1.95g/kg定为低剂量。

宣肺败毒方提取物生理盐水溶液制备

宣肺败毒方由13味中药组成，包括生麻黄6g、生石膏30g、生薏苡仁30g、苦杏仁15g、茅苍术10g、广藿香15g、青蒿草12g、干芦根30g、化橘红15g、虎杖20g、马鞭草30g、葶苈子15g、生甘草10g。13味药材均购于其道地产地或主产区，经天津中医药大学中药学院马琳教授对多个批次药材进行鉴定后使用。将饮片粉碎，过60目筛，按处方比例精密称取每批药味共500g，混匀，加入5L水，称重，浸泡30min，加热回流提取60min，补足失重，过3层纱布，得到宣肺败毒方标准煎液，通过UHPLC法建立宣肺败毒方标准汤剂指纹图谱进行质量控制，加入乙醇使含醇量达70％，静置，过滤，回收乙醇得到浓缩液，将浓缩液冷冻干燥，得到宣肺败毒方提取物冻干粉。

所述宣肺败毒方提取物冻干粉溶于生理盐水，分别制备成浓度为0.39g/ml和0.195g/ml的宣肺败毒方提取物的生理盐水溶液。

甲型H1N1流感病毒引起的肺炎小鼠模型建立

选用健康8周龄C57BL/6J雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)50只，体质量(18～20)g，随机取10只作为对照组，每只经鼻滴注PBS，其余小鼠通过经鼻滴注H1N1鼠肺流感适应株A/Puerto Rico/8/1934(美国genex公司，以下简称PR8)，并随机分为模型组、宣肺败毒方低剂量组(XF-L组)、宣肺败毒方高剂量组(XF-H)和阳性药奥司他韦组。其中，感染当天，XF-H组给予0.39g/ml宣肺败毒方提取物生理盐水溶液，XF-L组给予0.195g/ml宣肺败毒方提取物生理盐水溶液，奥司他韦组给予6.1mg/ml奥司他韦生理盐水溶液，对照组给予生理盐水，各组小鼠通过灌胃给药，每天给予0.2ml，连续给药3天；每组小鼠中随机选取5只，从第一次给药(或感染完成)开始监测7天体重；其余5只小鼠在给药3天后，以EDTA-生理盐水进行肺部灌流，收集肺泡灌洗液；后脱颈处死，取血液样品及肺组织样品。

检测方法

1、HE染色实验

(1)制备小鼠肺组织石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min；二甲苯Ⅱ20min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；75％酒精5min；自来水洗。

(2)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

(3)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

(4)脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。

(5)显微镜镜检，图像采集分析。

2、实时定量PCR(RT-PCR)测定小鼠肺脏中病毒滴度及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1mRNA表达

(1)总RNA的提取

①准备50-100mg肺组织，剪碎，去除脂肪，预冷PBS清洗2次，迅速加入1mL Trizol裂解液，剪碎，转移至1.5mL离心管，混匀，冰上裂解5min。

②每个离心管内加入200μL氯仿，涡旋振荡30s，至溶液变为乳白色并且无分相，室温放置15min。

③4℃，12000rpm，离心5min，样品分为无色水相、中间层、红色有机相，将上层水相转移至无RNase离心管中。

④缓慢加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置2h，充分沉淀RNA。

⑤4℃，12000rpm，离心10min，弃上清。

⑥每个离心管内加入500μL 75％乙醇，使沉淀重新悬浮，洗涤，4℃，12000rpm，

离心5min，弃上清。

⑦重复步骤⑥

⑧弃上清，吸净残留乙醇，冰上静置，放于通风处晾干，约20-30min左右。

⑨每个离心管内加入50μL无酶水，反复轻柔吹打沉淀使其混匀。

(2)RNA样品的浓度及纯度测定

①浓度测定：运用超微量核酸分析仪测定mRNA浓度。

②纯度测定：运用超微量核酸分析仪测定A260/A280，纯净RNA的比值应为2.0，若低于1.8说明有酚或蛋白质污染，高于2.2说明RNA已经水解生成单核酸。

(3)反转录

表1反转录反应体系(20μL)

反转录条件：25℃10min；37℃120min；85℃5min；4℃保温。

(4)扩增反应

扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表2所示，其中GAPDH作为内参照基因；扩增体系如表3所示。分别采用以下基因的引物对反转录体系进行扩增。

表2 RT-PCR所用引物序列

表3扩增反应体系(20μL)

反应条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s，40个循环。

(5)数据分析

Ct值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，与拷贝量呈反对数关系。应用BIO-RAD实时定量PCR仪(CFX Connect)，查看并分析反应板数据，获得每个样品每次反应的Ct值，计算△Ct，进行统计。

ΔCt(目的基因)＝Ct(目的基因)–Ct(内参)

ΔCt(对照)＝Ct(对照)–Ct(内参)

ΔΔCt＝ΔCt(目的基因)–ΔCt(对照)

其中，Ct(目的基因)代表模型组和各给药组样品中各目的基因的Ct值，Ct(对照)代表对照组样品中各目的基因的Ct值，Ct(内参)代表各样品中内参照基因的Ct值，各基因的ΔCt值为各组样品中各目的基因的Ct值与该样品中内参照基因的Ct值的差值。

mRNA的相对表达量＝2^-ΔΔCt

3、ELISA法测定小鼠肺泡灌洗液、血清中TNF-α、IL-6含量

使用武汉云克隆科技股份有限公司ELISA试剂盒SEA133Mu及SEA079Mu分别测定小鼠肺泡灌洗液、血清中TNF-α和IL-6的含量，具体操作步骤参照试剂盒使用说明书。

实施例1宣肺败毒方对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠体重和肺脏的影响

小鼠建模、分组给药后，观察各组小鼠7天体重变化情况，结果如图1所示，给药3天后，各组小鼠肺组织HE染色结果如图2所示。

从图1中可以看出，与对照组比，模型组小鼠体重明显降低，与模型组比，宣肺败毒方能够明显抑制流感病毒感染小鼠体重的降低。

从图2中可以看出，对照组肺泡结构完整，形态规则，周围组织无炎性细胞浸润(如图2中对照组中的箭头所示)，模型组小鼠肺泡内有明显的炎症细胞浸润，肺泡壁增厚(如图2中模型组中的箭头所示)；与模型组相比，宣肺败毒方给药后能够减少肺泡内炎症细胞浸润和肺泡壁的增厚(图2中XF-L组和XF-H组中的箭头所示)。以上结果说明，本申请的宣肺败毒方能够明显改善感染小鼠的肺部症状。

实施例2宣肺败毒方对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠肺中病毒滴度的影响

用RT-PCR的方法检查流感病毒感染的小鼠肺中PR8-HA mRNA水平，以反映病毒滴度。各组小鼠肺部病毒滴度相比于对照组的相对滴度结果如图3所示(以对照组相对滴度为1)。从图3中可以看出，给药3天后，与对照组比，模型组小鼠肺中病毒滴度明显升高(P<0.001)。与模型组相比，宣肺败毒方能够明显降低流感病毒感染的小鼠肺中的病毒载量(P<0.05)。说明宣肺败毒方具有抗击甲型H1N1流感病毒入侵，降低病毒滴度的作用。

实施例3宣肺败毒方对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠炎症因子释放的影响

采用RT-PCR法检测感染3天小鼠肺组织中炎症因子mRNA水平变化情况，结果如图4的A图至E图所示，从图中可以可看出，与对照组比，模型组小鼠肺组织中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1的mRNA明显升高(P<0.05)。与模型组比，宣肺败毒方明显降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA的水平，此外，还能够升高抗炎细胞因子IL-10、Arg-1的mRNA(P<0.05)。说明本申请的宣肺败毒方能够降低肺部促炎因子表达，促进抗炎因子表达。

采用ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中促炎细胞因子TNF-a、IL-6的表达情况，结果如图4的F图和G图所示，血清中促炎细胞因子TNF-a、IL-6的表达情况，结果如图4的H图和I图所示。

从图中可以看出，与对照组比，模型组小鼠肺泡灌洗液和血清中促炎细胞因子TNF-a、IL-6含量明显升高(P<0.05)。与模型组比，宣肺败毒方明显降低小鼠肺泡灌洗液和血清中TNF-a、IL-6的表达(P<0.05)。进一步说明了本申请的宣肺败毒方能够降低小鼠体内促炎因子表达。

以上实施例说明，本申请的宣肺败毒方能够有效降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺部的病毒载量，抑制炎症因子表达，促进抗炎因子表达，明显改善感染小鼠的肺部症状，从而可以用于治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎，进而能够用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (10)

1.宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物用于制备预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎的药物中的用途，其中，所述宣肺败毒方以重量份计，包括以下成分：生麻黄5-7份、生石膏28-32份、生薏苡仁28-32份、苦杏仁13-17份、茅苍术8-12份、广藿香13-17份、青蒿草10-14份、干芦根28-32份、化橘红13-17份、虎杖18-22份、马鞭草28-32份、葶苈子13-17份和生甘草8-12份。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述宣肺败毒方提取物包括宣肺败毒方的水提取物或乙醇提取物的至少一种。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物通过降低病毒载量，治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，宣肺败毒方或宣肺败毒方提取物通过降低促炎因子表达和/或促进抗炎因子表达，治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物给予有需要的对象的每日剂量以宣肺败毒方生药量计为3-4g/kg体重。

6.一种用于预防和/或治疗甲型H1N1流感病毒引起的肺炎药物组合物，其包含宣肺败毒方提取物和药学上可接受的载体或赋形剂。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述宣肺败毒方提取物包括宣肺败毒方的水提取物或乙醇提取物的至少一种。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其还包括阿比多尔、磷酸氯喹中的至少一种。

9.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂中的至少一种。

10.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、乳剂、混悬剂、酊剂中的任意一种剂型。

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