CN109276703A - 植物抗病毒蛋白复合剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物抗病毒蛋白复合剂及其制备方法，特别是在治疗和预防生殖道黏膜病毒感染及其相关疾病中的应用。植物抗病毒蛋白复合剂包括抗病毒蛋白粉和溶解液；其中抗病毒蛋白粉组分包括有植物抗病毒蛋白、植物多糖、赋形剂；溶解液组分包括有水和抑菌剂。本发明使用植物抗病毒蛋白作为主要成份制成的复合剂，能有效清除病毒感染，对由病毒感染引发的生殖道黏膜上皮组织相关疾病，如宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、慢性宫颈炎、宫颈息肉、尖锐湿疣等疾病具有显著疗效，同时可以预防宫颈癌等严重疾病，具有良好的临床应用前景。

Description

植物抗病毒蛋白复合剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地说，涉及植物抗病毒蛋白复合剂及其制备方法，以及在治疗和预防生殖道病毒感染及其相关疾病中的应用。
背景技术
病毒是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。研究发现生殖道黏膜易受人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、疱疹病毒(Herpes viruses，HV)、EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)和巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)等多种病毒感染，而且由病毒感染引发的慢性宫颈炎、宫颈上皮细胞瘤变(CIN)等疾病极难有效转归且易复发，严重者可以导致宫颈癌等严重疾病的发生。目前已有抗病毒西药副作用较大，尚缺乏安全有效的抗病毒治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供了一种植物抗病毒蛋白复合剂，应用在治疗和预防生殖道黏膜病毒感染及其相关疾病中，有效清除病毒，安全无副作用，具有较好的应用前景和经济社会效益。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种植物抗病毒蛋白复合剂，包括抗病毒蛋白粉和溶解液；所述抗病毒蛋白粉包括以下重量百分比的组分：植物抗病毒蛋白0.01％-20％，植物多糖1％-70％、赋形剂5％-96％；所述溶解液包括以下重量百分比的组分：水80％-99.99％、抑菌剂0.01％-1％；
所述植物抗病毒蛋白为植物核糖体失活蛋白，分子量为6-35KD。
较佳的，所述植物抗病毒蛋白从以下的一种或几种植物的叶、根、茎、花、果实和种子中提取：商陆(Phytolacca acinosa Roxb和Phytolacca americana L.)、蓖麻(Ricinuscommunis L)、南瓜(Cucurbita moschata)、苦瓜(Momordica charantia L)、丝瓜(Luffacylindrica)、茶树(Camellia sinensis)、苦丁茶(Folium Ilecis Latifoliae)、栝蒌(Trlchosanthes kirilowii Maxim)、玉米(Zea mays)、椰菜(Brassica oleraceaLinnaeus)。
较佳的，所述植物抗病毒蛋白包括以下的一种或几种：商陆抗病毒蛋白(PAP)、商陆生物活性因子CSE、商陆生物活性因子AVF、蓖麻蛋白、南瓜蛋白、苦瓜蛋白、丝瓜蛋白、茶树蛋白、苦丁茶蛋白、天花粉蛋白、玉米蛋白、椰菜蛋白。
较佳的，所述植物多糖包括以下的一种或几种：虫草多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、香菇多糖、芦荟凝胶、海藻糖。
较佳的，所述赋形剂包括以下的一种或几种：纤维素衍生物、海藻酸钠、卡拉胶、羧甲淀粉钠、环糊精。
较佳的，所述抑菌剂包括以下的一种或几种：葡萄糖酸氯已定、醋酸氯已定、盐酸氯已定、三氯生、苯扎溴胺、聚六亚甲基双胍盐酸盐。
本发明的另一目的在于提供一种植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取植物植株，采用1:1-5w/v蛋白提取缓冲液匀浆提取总蛋白，采用浓度30％-95％硫酸铵盐析沉淀目的蛋白，目的蛋白脱盐后冻干即得植物抗病毒蛋白粗品，植物抗病毒蛋白粗品经柱层析再次纯化冻干，得到精品的植物抗病毒蛋白；
(2)按上述配比，将植物抗病毒蛋白、植物多糖、赋形剂混合均匀，得到抗病毒蛋白粉；
(3)按上述配比，将水、抑菌剂混合均匀，得到溶解液；
(4)将抗病毒蛋白粉装入推注器中，加入溶解液后混合，得到植物抗病毒蛋白复合剂。
所述植物抗病毒蛋白复合剂在清除生殖道病毒感染的用途，包括以下的一种或几种病毒：人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)、单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)、疱疹病毒(Herpes viruses，HV)、EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)和巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)。
所述植物抗病毒蛋白复合剂，具有包括以下的一种或几种效果：杀灭脊髓灰质炎病毒、抑制或杀灭疱疹病毒、抑制无细胞蛋白质生物合成(兔网织红细胞系统和麦胚提取物系统)。
所述植物抗病毒蛋白复合剂在治疗生殖道黏膜上皮组织疾病和阻止或逆转癌前病变发展进程的用途，包括以下的一种或几种：宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)、阴道上皮内瘤变(vaginal intraepithelialneoplasia，VAIN)、外阴上皮内瘤变(vulvar ginal intraepithelial neoplasia，VIN)、慢性宫颈炎、宫颈息肉、尖锐湿疣。
所述抗病毒蛋白粉装入推注器中，与溶解液复配成复合剂后使用。
所述植物抗病毒蛋白加入药用辅料后制成冻干粉剂、泡腾剂、散剂、片剂、凝胶、胶囊、涂抹剂、栓剂、膏剂、喷剂、滴丸剂、乳液、溶液或悬浮液剂。
本发明植物抗病毒蛋白复合剂及其制备方法具有以下的有益效果：
1、本发明从植物中分离出抗病毒蛋白，并将这些抗病毒蛋白应用在治疗和预防生殖道黏膜病毒感染及其相关疾病中，有效清除病毒，安全无副作用，具有较好的应用前景和经济社会效益。
2、本发明植物抗病毒蛋白加入药用辅料后制成粉剂，装入推注器中，与含有抑菌剂的溶解液复配成复合剂后使用，达到既能有效清除病毒感染，又能清除细菌、真菌等病原菌的感染的目的；对由病毒感染引发或细菌、真菌和病毒等混合感染引发的生殖道黏膜疾病具有显著疗效。
3、本发明植物抗病毒蛋白复合剂采用抗病毒蛋白粉与溶解液独立包装，在常温下更稳定，易于保存。使用前将抗病毒蛋白粉加入含有抑菌剂的溶解液，将抗病毒蛋白粉调成复合剂，既能有效清除病毒感染，又能清除细菌、真菌等病原菌的感染；对由病毒感染引发或细菌、真菌和病毒等混合感染引发的生殖道黏膜疾病，如如宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)、阴道上皮内瘤变(vaginal intraepithelialneoplasia，VAIN)、外阴上皮内瘤变(vulvar ginal intraepithelial neoplasia，VIN)、慢性宫颈炎、宫颈息肉、尖锐湿疣等疾病均具有显著疗效，同时可以预防宫颈癌等严重疾病的发生，具有较好的临床应用前景。
具体实施方式
实施例1
本发明植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)商陆生物活性因子AVF的制备
a、商陆植株和蛋白提取缓冲液按比例1：1(w/v)研磨匀浆，过滤；
b、离心取上清液，加入硫酸铵固体，浓度40％和95％两次盐析，再经柱层析纯化后，冷冻干燥制成。
(2)抗病毒蛋白粉的制备
加入商陆生物活性因子AVF 0.03份、虫草多糖5.97份，羧甲纤维素钠94份，混合后制得。
(3)溶解液的制备
加入醋酸氯已定0.15份、水99.85份，混合均匀制成。
抗病毒蛋白粉装入推注器中，加入溶解液后，混合成复合剂后使用。
实施例2
本发明植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)商陆生物活性因子CSE的制备
a、商陆植株和蛋白提取缓冲液按比例1：2(w/v)研磨匀浆，过滤；
b、离心取上清液，加入硫酸铵固体，浓度30％和80％盐析后，经层析纯化后，冻干制成。
(2)抗病毒蛋白粉的制备
加入商陆生物活性因子CSE 0.03份、芦荟多糖10.97份，卡拉胶89份，混合后制得。
(3)溶解液的制备：
加入葡萄糖酸氯己定0.15份、水99.85份，混合均匀制成。
将植物抗病毒蛋白装入推注器中，加入溶解液后，混合成复合剂后使用。
实施例3
本发明植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)苦瓜抗病毒蛋白的制备
a、苦瓜和蛋白提取缓冲液按比例1：2(w/v)研磨匀浆，过滤；
b、离心取上清液，加入硫酸铵固体，浓度45％和90％两次盐析，过柱纯化，冷冻干燥制成。
(2)苦瓜抗病毒蛋白粉的制备：
加入苦瓜抗病毒蛋白1份、灵芝多糖15份，海藻酸钠5份、环糊精79份，混合后制得。
(3)溶解液的制备：
加入葡萄糖酸氯己定0.15份、水99.85份，混合均匀制成。
植物抗病毒蛋白装入推注器中，加入溶解液后，混合成复合剂后使用。
实施例4
本发明植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)茶树抗病毒蛋白的制备
a、茶树植株和蛋白提取缓冲液按比例1：2(w/v)研磨匀浆，过滤；
b、离心取上清液，加入硫酸铵固体，浓度40％和95％两次盐析，再过柱纯化，冷冻干燥制成。
(2)茶树抗病毒蛋白粉的制备：
加入茶树抗病毒蛋白2份、海藻糖18份，羟丙甲纤维素60份，环糊精20份，混合后制得。
(3)溶解液的制备：
加入醋酸氯己定0.15份、水99.85份，混合均匀制成。
植物抗病毒蛋白装入推注器中，加入溶解液后，混合成复合剂后使用。
上述实施例制备的抗病毒蛋白复合剂的批号为110910001、110910002、11091003、11091004。
一、利用麦胚体外蛋白质生物合成体系测定蛋白活性
将上述实施例制备的样品(110910001、110910002、11091003、11091004)处理后加入1ml含荧光素蛋白DNA的麦胚体外蛋白质生物合成体系中，于30度反应2小时后终止反应，分别取出5ul，采用荧光酶标仪检测荧光吸收值。IU定义为抑制1ml麦胚体外蛋白质生物合成的50％所需要的商陆抗病毒蛋白量。如表1所示为麦胚体外蛋白质生物合成体系测定样品蛋白活性。
表1麦胚体外蛋白质生物合成体系测定样品蛋白活性
样品批号 含量(ug) 蛋白活力(IU)
110910001 100 10
110910002 100 10
110910003 100 10
110910004 100 10
二、抗病毒蛋白复合剂对脊髓灰质炎病毒的杀灭作用
依据卫生部《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.10.7。将上述实施例制备的样品(110910001、110910002、11091003、11091004)样品配制成待测液，吸取900μL待测液于管中，加入100μL病毒悬液与其反应，反应结束后，1mL反应液加到预先装填好的层析柱里，充分滤过后，将滤液接种到细胞中。连续观察3d。结果如表2.
表2抗病毒蛋白复合剂对脊髓灰质炎病毒的杀灭作用
注：阴性对照稀释液、中和剂、中和产物均对细胞生长无影响。
三、抗病毒蛋白复合剂对疱疹病毒的杀灭作用
表3样品体内治疗小鼠疱疹病毒Ⅱ型药效学试验
四、抗病毒蛋白复合剂对HPV16型细胞所致肿瘤生长的抑制效果
将上述实施例制备的样品(110910001、110910002、11091003、11091004)作用TC-1细胞(含HPV16型肿瘤)72小时后，分别注射SCID小鼠右侧腋下2次，四周后解剖小鼠，剥离瘤块称瘤重，实验结果表明抗病毒蛋白复合剂对HPV16型细胞所致肿瘤生长有明显的抑制作用(表4)。
表4抗病毒蛋白复合剂对HPV16型细胞所致肿瘤生长有明显的抑制作用
样品 小鼠个数 瘤重(克) 抑制率 P
110910001 20 0.26±0.03 90.01％ ＜0.05
110910002 20 0.31±0.05 87.65％ ＜0.05
110910003 20 0.49±0.06 83.13％ ＜0.05
110910004 20 0.55±0.09 80.01％ ＜0.05
对照 20 3.52±0.27
五、试用效果
对本发明的抗病毒蛋白复合剂治疗不同地区高危HPV病毒(含低危和高危HPV病毒)感染阳性患者及相关疾病做了初步试用观察，结果表明，该制剂能有效治疗HPV病毒对女性生殖器感染，并对由HPV病毒感染引发的宫颈上皮细胞瘤变(CIN)、慢性宫颈炎、尖锐湿疣等均有确切的治疗效果，无任何刺激和不良反应，方便患者自行给药。
1、抗病毒蛋白复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒持续性感染的的结果观察
目的:观察高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染女性使用抗病毒蛋白复合剂后治疗宫颈HPV感染的结果。方法：经LCT或宫颈刮片检查正常，同时经HC2方法检测高危型HPV-DNA(+)的妇女，分为五组，其中1-4组分别采用抗病毒蛋白复合剂110910001、110910002、11091003、11091004，第5组阴性对照组，不使用任何药物。停药后1个月观察高危型HPV DNA的转阴率，以HPV转阴为有效。结果见表5。
表5抗病毒蛋白复合剂治疗宫颈高危型HPV病毒结果
组别 总例数 阳性例数 转阴例数 转阴率％
1组 30 5 25 83.33
2组 30 6 24 80.00
3组 30 7 23 76.66
4组 30 6 24 80.00
5组 30 24 6 20.00
2、CIN伴高危型HPV感染患者的试用观察
方法：CIN2患者使用110910001、110910002、11091003、11091004，隔天1次，连续使用6个月，1个月后，检测其宫颈HPV-DNA的负荷量，并进行阴道镜检查及宫颈活检。
病理学评价：
有效：CIN转为炎症或痊愈
无效：病理学无变化或病变有所进展
HPV感染评价：
转阴：HPV检测阴性
无效：HPV检测阳性
结果见表6，说明本申请制备的药物可以有效治疗宫颈CIN病变，促进CIN转归，同时能有效清除高危型HPV感染。
表6 CIN2伴高危型HPV感染患者疗效观察结果
3、抗病毒蛋白复合剂治疗尖锐湿疣及低危型HPV感染的结果观察
目的：观察抗病毒蛋白复合剂治疗尖锐湿疣的结果。
治疗方法：生殖器尖锐湿疣患者，采用物理治疗去除赘物后，阴道后穹窿内置及外阴部，分4组，每组30人，分别涂抹抗病毒蛋白复合剂(110910001、110910002、11091003、110910004)隔日一次，连用一个疗程，停药1-3周复查。
疗效判定：
痊愈：宫颈HPV-DNA转阴，生殖器尖锐湿疣无复发。
有效：宫颈HPV-DNA复查结果下降。
无效：宫颈HPV-DNA复查未下降或上升，生殖器疣反复发作。
结果：120例患者中，单纯生殖器尖锐湿疣，低危性HPV患者，使用商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂一个疗程后，全部转阴，无复发。
4、抗病毒蛋白复合剂治疗宫颈糜烂的结果观察
方法：
(1)诊断标准：按照《妇产科学》第6版宫颈糜烂的分类标准，根据糜烂面积分为：①轻度糜烂(Ⅰ度)：糜烂面积小于整个子宫颈面积的1/3；②中度糜烂(Ⅱ度)：糜烂面积占整个子宫颈面积的1/3-2/3；③重度糜烂(Ⅲ度)：糜烂面积占整个子宫颈面积的2/3以上。
(2)治疗方法和疗效标准
患者分成4组，分别给予抗病毒蛋白复合剂治疗(110910001、110910002、11091003、11091004)隔日一次，共三个疗程后，复诊进行疗效观察。
疗效标准:①痊愈：子宫颈光滑，糜烂面消失；②显效：糜烂面积缩小>50％或Ⅱ度转为Ⅰ度，Ⅲ度转为Ⅱ度；③有效：糜烂面积缩小<50％，糜烂面积明显缩小但好转不足Ⅰ度或糜烂面积无明显缩小而颗粒型变为单纯型，乳头型变为颗粒型；④无效：治疗前后糜烂面无变化或有发展。
(3)统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果见表7，抗病毒蛋白复合剂对宫颈糜烂的有效率为90％，使用方便、安全、不良反应小、疗效高，患者易于接受，值得临床应用。为增强和巩固疗效以用药3个疗程以上为好。
表7抗病毒蛋白复合剂对宫颈糜烂的疗效
组别 例数 痊愈 显效 有效 无效 总有效率
1组 30 20 6 2 2 93.33％
2组 31 22 5 3 1 96.77％
3组 30 16 6 5 3 90.00％
4组 30 16 7 4 3 90.00％
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于：包括抗病毒蛋白粉和溶解液；所述抗病毒蛋白粉包括以下重量百分比的组分：植物抗病毒蛋白0.01％-20％，植物多糖1％-70％、赋形剂5％-96％；所述溶解液包括以下重量百分比的组分：水80％-99.99％、抑菌剂0.01％-1％；
所述植物抗病毒蛋白为植物核糖体失活蛋白，分子量为6-35KD。
2.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述植物抗病毒蛋白从以下的一种或几种植物的叶、根、茎、花、果实和种子中提取：商陆、蓖麻、南瓜、苦瓜、丝瓜、茶树、苦丁茶、栝蒌、玉米、椰菜。
3.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述植物抗病毒蛋白包括以下的一种或几种：商陆抗病毒蛋白PAP、商陆生物活性因子CSE、商陆生物活性因子AVF、蓖麻蛋白、南瓜蛋白、苦瓜蛋白、丝瓜蛋白、茶树蛋白、苦丁茶蛋白、天花粉蛋白、玉米蛋白、椰菜蛋白。
4.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述植物多糖包括以下的一种或几种：虫草多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、香菇多糖、芦荟凝胶、海藻糖。
5.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述赋形剂包括以下的一种或几种：纤维素衍生物、海藻酸钠、卡拉胶、羧甲淀粉钠、环糊精。
6.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述抑菌剂包括以下的一种或几种：葡萄糖酸氯已定、醋酸氯已定、盐酸氯已定、三氯生、苯扎溴胺、聚六亚甲基双胍盐酸盐。
7.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取植物植株，采用1:1-5w/v蛋白提取缓冲液匀浆提取总蛋白，采用浓度30％-95％硫酸铵盐析沉淀目的蛋白，目的蛋白脱盐后冻干即得植物抗病毒蛋白粗品，植物抗病毒蛋白粗品经柱层析再次纯化冻干，得到精品的植物抗病毒蛋白；
(2)按上述配比，将植物抗病毒蛋白、植物多糖、赋形剂混合均匀，得到抗病毒蛋白粉；
(3)按上述配比，将水、抑菌剂混合均匀，得到溶解液；
(4)将抗病毒蛋白粉装入推注器中，加入溶解液后混合，得到植物抗病毒蛋白复合剂。
8.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述植物抗病毒蛋白复合剂在清除生殖道病毒感染的用途，包括以下的一种或几种病毒：人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、疱疹病毒、EB病毒和巨细胞病毒。
9.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于，所述植物抗病毒蛋白复合剂在治疗生殖道黏膜上皮组织疾病和阻止或逆转癌前病变发展进程的用途，包括以下的一种或几种：宫颈上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、慢性宫颈炎、宫颈息肉、尖锐湿疣。
10.根据权利要求1所述的植物抗病毒蛋白复合剂，其特征在于：所述抗病毒蛋白粉装入推注器中，与溶解液复配成复合剂后使用。
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