JP2018513124A - アルブミン融合タンパク質を精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年3月12日に作成され、228キロバイトのサイズを有する、「CD40L−300P1_SL.TXT」という名称のテキストファイルとしてEFS−Webを介して本願とともに提出された配列表を参照により援用する。
アルブミン融合タンパク質の精製プロセス中、特定のアミノ酸残基が酸化を受けやすくなる場合があり、それによりアルブミン融合タンパク質の生物活性および相対効力が阻害され得る。例えば、1つ以上のトリプトファン残基および/またはメチオニン残基が酸化を受けやすくなる場合がある。本発明によると、アルブミン融合タンパク質の感受性アミノ酸残基の酸化は、アルブミン融合タンパク質を含む溶液に適切な条件下で親和性クロマトグラフィーマトリックスおよびアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスに供することにより低減される。
親和性クロマトグラフィーステップでは、アルブミンに優先的に結合する親和性マトリックスが用いられる。例えば、好適なマトリックスは、Cibacron blue色素、Reactive Blue 2、Procion Blue HB、Capto Blue、Capto Blue(high sub)、Toyopearl、AF−Blue HC−650M、Blue Sepharose、Blue Trisacryl、Mimetic Blue 1、Mimetic Blue SA、Mimetic Blue SA HLおよび他のアントラキノン型化合物、ニトロセルロースマトリックス、Life Technologies製Capture Selectなどの抗体に基づくマトリックス、脂肪酸に基づくマトリックスを含む。一実施形態では、Cibacron blue色素クロマトグラフィーは、アルブミン融合タンパク質を細胞培地からアルブミンに対するその親和性により精製するための理想的な選択である。多数のCibracon blue色素クロマトグラフィー樹脂が市販されているが、それらの多くがアルブミン融合タンパク質の大規模精製にとって理想的とは言えない。大規模精製の場合、樹脂は、宿主関連不純物との非特異的相互作用を最小化する材料からなり、良好な圧力−フロー特性を有し、また衛生化を目的としてpH極値で安定である(腐食性条件下で好ましくは安定である)必要がある。これらの特性に留意して、幾つかの市販のCibacron blue色素クロマトグラフィー樹脂(GE Healthcare製のCapto BlueおよびCapto Blue(high sub)、およびTosoh Biosciences製のToyopearl AF−Blue HC−650M)が臨床および工業規模での精製における有望な樹脂として注目されている。一部の実施形態では、2つのCapto Blueオプションのうちのhigh subバージョンが、そのより高いリガンド密度と、したがってより高い結合能力とのために好ましい。
本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質を含有する画分または試料は、存在し得るウイルスを不活化するように処理してもよい。このように、その画分/試料は、ウイルス不活化剤、例えば、トリトンX−100、ツイーン80、ツイーン20、リン酸トリ−n−ブチル、または尿素で処理してもよい。一実施形態では、ウイルス不活化ステップは、親和性クロマトグラフィーとアニオン交換クロマトグラフィーとのステップの間に実施される。このように、ウイルス不活化剤、例えばトリトンX−100は、約1秒〜約10時間、約30秒〜約5時間、約30分〜約3時間、または約2時間の期間中、約0.05%〜約3%、約0.01%〜約1%、または約0.1%〜約0.5%の量で添加してもよい。一実施形態では、ウイルス不活化剤は、約30分〜約240分、例えば130分にわたり保持される0.5%トリトンX−100(w/w)である。
本発明の別の態様では、アルブミン融合タンパク質を含有する画分または試料にアニオン交換クロマトグラフィーが施される。アニオン交換は、結合および溶出システムまたはフロースルーシステムまたは両方を介して実施してもよい。任意の好適なアニオン交換マトリックスを用いてもよい。一実施形態では、アニオン交換マトリックスは、樹脂、例えばアガロースもしくはセファローズなど、または合成微孔膜もしくはマクロ細孔膜であってもよい。好適なアニオン交換結合および溶出マトリックスとして、例えば、Q−resin、第4級アミン、DEAEが挙げられる。市販のマトリックスとして、例えば、Capto Q、Toyopearl SuperQ、ANX、DEAE、Q−Sepharose、Q−Sepharose FF、Q−Sepharose HP、およびQ−Sepharose XL、Q−Hyper D、DEAE−cellulose、QAE−cellulose、TMAE、DMAE、またはDEAE Fractogel、Mustang Q、Sartobind Q、またはSartobind STIC PAが挙げられる。かかるマトリックスは、高度に架橋されたアガロースを含み得るか、または例えば、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、メタクリレート、もしくはポリプロピレート(polypropylate)基材を有する重合体であり得る。カラム負荷(load challenge)は、約0.1〜約50g/L、約0.5〜約40g/L、約1〜約30g/L、または約5〜約25g/Lの範囲内である。膜負荷は、約0.1〜約10g/mL、約0.2〜約5.0g/mL、約0.5〜約2.5g/mL、または約1.0〜約2.0g/mLの範囲内である。
追加的な精製ステップは、アルブミン融合タンパク質を含む溶出液/画分に疎水性相互作用またはマルチモーダルマトリックスに供することを含んでもよい。疎水性相互作用マトリックスは任意の好適なマトリックスであってもよい。場合により、疎水性相互作用マトリックスは、フェニル、オクチルまたはブチル疎水基を含む。疎水性相互作用マトリックスは、市販されており、当業者に公知であり、例えば、Capto Butyl、Capto Phenyl、Capto Butyl、Butyl−S Fast Flow(GE Healthcase Life Sciences,Piscataway,NJ)、Toyopearl Hexyl、Toyopearl Butyl、Toyopearl Phenyl、Toyopearl PPG、Toyopearl Ether、Toyopearl PPG−600M、およびToyopearl Phenyl−650M、Toyopearl PPG−600M、TSKgel Phenyl、TSKgel Ether(TOSOH Corporations,Tokyo,Japan)、Macro−Prep Methyl(Bio−Rad Labboratories,Hercules,CA)が挙げられる。マルチモーダルマトリックスは任意の好適なマトリックスであってもよい。場合により、マルチモーダルマトリックスは、カチオンまたはアニオン交換基とともに、フェニル、オクチルまたはブチル疎水基を含む。マルチモーダルマトリックスは、市販されており、当業者に公知であり、例えば、Capto MMC、Eshmuno HCX、Nuvia cPrime、またはToyopearl MX−Trp−650Mが挙げられる。アルブミン融合タンパク質が、任意選択的に、塩、例えば、カチオンとして、アンモニウム塩、リチウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、もしくはグアニジウム塩、および/またはアニオンとして、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、もしくは塩素酸塩を含有する緩衝液で平衡化されることは見出されている。例えば、一部の実施形態では、塩は、適量の塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムであり、例えば、約100mM〜約2M、約200mM〜約1.5M、約300mM〜約1M、約400mM〜約800mMの塩、例えばクエン酸塩である。平衡化後、アルブミン融合タンパク質を含有する試料/画分はカラム上に負荷される。一実施形態では、カラムは再平衡化され、次に低下した塩濃度を有する緩衝液に対する段階または勾配を用いて溶出される。
精製されたアルブミン融合タンパク質を含む組成物は、本発明の範囲内に含まれる。これらの組成物は、低レベルの宿主細胞タンパク質、DNA、およびウイルス活性という特質がある。加えて、精製されたアルブミン融合タンパク質を含むこれらの組成物は、低レベルの酸化および保持された生物活性を有する。
アルブミン、例えばヒト血清アルブミン(HSA)、またはその断片もしくは変異体は、血流中のタンパク質の半減期および/またはその組織透過性を増加または延長させるため、治療用タンパク質に融合または複合させてもよい。一部の実施形態では、HSA変異体との複合によって改善される特性は血漿半減期である。アルブミン融合タンパク質の血漿半減期における改善は、血漿半減期の増加または減少などのその特性における改変、または他の薬物動態パラメータにおける変化であり得る。
(a)407位のロイシン(L)とアスパラギン(N)またはチロシン(Y)との置換;
(b)415位のバリン(V)とトレオニン(T)との置換;
(c)463位のロイシン(L)とアスパラギン(N)との置換;
(d)500位のリジン(K)とアルギニン(R)との置換;
(e)506位のトレオニン(T)とチロシン(Y)との置換;
(f)508位のトレオニン(T)とアルギニン(R)との置換;
(g)509位のフェニルアラニン(F)とメチオニン(M)またはトリプトファン(W)との置換;
(h)511位のアラニン(A)とフェニルアラニン(F)との置換;
(i)512位のアスパラギン酸(D)とチロシン(Y)との置換;
(j)515位のトレオニン(T)とグルタミン(Q)との置換;
(k)516位のロイシン(L)とトレオニン(T)またはトリプトファン(W)との置換;
(l)521位のアルギニン(R)とトリプトファン(W)との置換;
(m)523位のイソロイシン(I)とアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)との置換;
(n)524位のリジン(K)とロイシン(L)との置換;
(o)526位のグルタミン(Q)とメチオニン(M)との置換;
(p)535位のヒスチジン(H)とプロリン(P)との置換;
(q)550位のアスパラギン酸(D)とグルタミン酸(E)との置換;
(r)557位のリジン(K)とグリシン(G)との置換;
(s)573位のリジン(K)とフェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)との置換;
(t)574位のリジン(K)とアスパラギン(N)との置換;
(u)580位のグルタミン(Q)とリジン(K)との置換;および
(v)前記置換の2つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、完全長成熟HSA中の位置に対して付番された、少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、完全長成熟HSAの配列(配列番号133または138)を含むHSA変異体またはその断片を含み、ここで、治療用タンパク質は、前記HSA変異体に複合されない同じ治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
(a)463位のロイシン(L)とアスパラギン(N)との置換;
(b)508位のトレオニン(T)とアルギニン(R)との置換;
(c)523位のイソロイシン(I)とアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)との置換;
(d)524位のリジン(K)とロイシン(L)との置換;および
(e)前記置換の2つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、完全長成熟HSA中の位置に対して付番された、少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、完全長成熟HSAの配列(配列番号133または138)を含むHSA変異体またはその断片を含み、ここで、前記治療用タンパク質は、前記HSA変異体に複合されない同じ治療用タンパク質の血漿半減期より長い血漿半減期を有する。
本発明の一実施形態では、アルブミン融合タンパク質はスキャフォールドを含む。例えば、スキャフォールドは、少なくとも1つの天然に存在しない分子内ジスルフィド結合が改変されている、ヒトテネイシンC(Tn3)の3番目のFnIIIドメインに由来するCD40Lに特異的な単量体サブユニットを含んでもよい。本発明のTn3スキャフォールドを形成する単量体サブユニットは、互いに独立して正確にフォールディングし、それらの結合特異性および親和性を保持し、単量体スキャフォールドの各々はその機能的特性を保持する。単量体サブユニットが高い結合価の多量体Tn3スキャフォールドにおいて構築される場合、単量体サブユニットは、互いに独立して正確にフォールディングし、それらの結合特異性および親和性を保持し、単量体の各々はその機能的特性を保持する。
本発明の好適なスキャフォールドは、生物およびウイルスの3つすべてのドメインを通じて、また多数のタンパク質クラス内に広範に見出されるドメインであるIII型フィブロネクチンモジュール(FnIII)の構造に基づくものを含む。特定の実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ヒトテネイシンCの3番目のFnIIIドメインに由来する(国際公開第2009/058379号パンフレットとして公開された国際出願第PCT/米国特許出願公開第2008/012398号明細書;国際公開第2011/130324号パンフレットとして公開されたPCT/米国特許出願公開第2011/032184号明細書;および国際公開第2011130328号パンフレットとして公開された国際出願第PCT/米国特許出願公開第2011/032188号明細書を参照)。
本発明は、複数のループ領域に連結された複数のβストランドドメインを含む、CD40Lに特異的な天然に存在しない組換えTn3スキャフォールドを提供し、ここで、前記ループ領域の1つ以上は、野生型Tn3(配列番号3)内の同族ループからの少なくとも1つのアミノ酸の欠失、置換または付加によって変化する(表1を参照)。
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGがそれぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1がアミノ酸残基のアラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;かつ
(c)ループの長さnが2〜26の整数である。
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGがそれぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1がアミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;かつ
(c)ループの長さnが2〜26の整数である。
(a)X1がアミノ酸残基のセリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のアラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のフェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のイソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のグリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のトリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のトリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;かつ
(l)X12がアミノ酸残基のアルギニン(R)またはセリン(S)を表す。
(a)X1がアミノ酸残基のセリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のアラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のフェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のイソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のグリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のトリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のトリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;かつ
(l)X12がアミノ酸残基のアルギニン(R)またはセリン(S)を表す。
(a)X1がアミノ酸残基のリジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のトレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のアスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のセリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のチロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のチロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のアスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のグリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のアラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12がアミノ酸残基のセリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14がアミノ酸残基のプロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)もしくはアラニン(A)、またはアミノ酸なしを表し;
(o)X15がアミノ酸残基のイソロイシン(I)またはアミノ酸なしを表し;
(p)X16がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;かつ
(q)X17がアミノ酸残基のセリン(S)またはアスパラギン(N)を表す。
(a)X1がアミノ酸残基のリジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のトレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のアスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のセリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のチロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のチロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のアスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のグリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のアラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12がアミノ酸残基のセリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14がアミノ酸残基のプロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)もしくはアラニン(A)、またはアミノ酸なしを表し;
(o)X15がアミノ酸残基のイソロイシン(I)またはアミノ酸なしを表し;
(p)X16がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;かつ
(q)X17がアミノ酸残基のセリン(S)またはアスパラギン(N)を表す。
本発明の一態様は、タンデムに連結された本発明の少なくとも2つのTn3単量体サブユニットを含む多量体Tn3スキャフォールドを提供し、ここで、単量体の少なくとも1つはCD40Lに特異的な単量体サブユニットである。かかる多量体Tn3スキャフォールドは、複数の形式で構築され得る。具体的な態様では、本発明は、多量体Tn3スキャフォールドを提供し、ここで、少なくとも2つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットは、ペプチドリンカーを介してタンデムに連結される。一部の実施形態では、多量体Tn3スキャフォールドは、標的結合の結合価および/または結合活性、または標的の他の作用における増加を呈する。一部の実施形態では、標的結合の結合価および/または結合活性における増加は、複数の単量体サブユニットが同じ標的に結合するときに達成される。一部の実施形態では、結合価における増加は、標的に対する特異的作用を改善し、例えば標的タンパク質の二量体化を増強する。
一部の実施形態では、単量体または多量体Tn3スキャフォールドは、異なるエピトープに対してCD40Lに特異的な単量体サブユニットを含み得、それは単一のCD40L分子上または異なるCD40L標的分子上の異なるエピトープであり得る。一部の実施形態では、多量体Tn3スキャフォールドは、CD40Lに特異的な単量体サブユニットを含み得、ここで、各サブユニットは、1つ以上のCD40L分子上の1つ以上の異なるエピトープを標的にする。
一部の実施形態では、本発明のTn3スキャフォールドは、限定はされないがFcドメインを含む、抗体(例えばIgG)のドメインまたは断片に融合されたCD40Lに特異的な単量体サブユニットを含む。
本発明のTn3スキャフォールドは、任意の好適な空間的配置で、Fcドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のC末端に融合され得る。検討されたスキャフォールドの形態の詳細な説明については、例えば国際公開第PCT/米国特許出願公開第2011/032184号明細書を参照されたい。
本明細書に記載のTn3スキャフォールドは、新規のまたは改善された標的結合タンパク質を進化させるための任意の技術で用いてもよい。一特定例では、標的は固体支持体、例えばカラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェルの上で固定化され、かつ標的は候補スキャフォールドに基づく結合タンパク質のライブラリーと接触される。かかるライブラリーは、Tn3スキャフォールドからCDR様ループの配列および/または長さの無作為化を通じて構築されるクローンからなってもよい。
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGがそれぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列内に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1がアミノ酸残基のAまたはTを表し;かつ
(c)ループの長さnが2〜26の整数である。
(a)X1がアミノ酸残基のセリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のアラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のフェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のイソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のグリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のトリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のトリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;かつ
(l)X12がアミノ酸残基のアルギニン(R)またはセリン(S)を表す。
(a)X1がアミノ酸残基のリジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のトレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のアスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のセリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のチロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のチロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のアスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のグリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のアラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12がアミノ酸残基のセリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14がアミノ酸残基のプロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)もしくはアラニン(A)、またはアミノ酸なしを表し;
(o)X15がアミノ酸残基のイソロイシン(I)またはアミノ酸なしを表し;
(p)X16がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;かつ
(q)X17がアミノ酸残基のセリン(S)またはアスパラギン(N)を表す。
標的リガンドをスキャフォールド:標的リガンド複合体の形成に適した条件下で本発明のライブラリーと接触させるステップと;
複合体から、標的リガンドに結合するスキャフォールドを得るステップと;
ステップ(b)で得られたスキャフォールドの安定性が野生型Tn3スキャフォールドの安定性より高いか否かを判定するステップと
を含む。
本発明のTn3スキャフォールドの発生は、1つ以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟ステップを含んでもよい。一部の実施形態では、Tn3単量体サブユニットは、単一の親和性成熟ステップを経ることができる。他の実施形態では、Tn3単量体サブユニットは、2つ以上の親和性成熟ステップを経ることができる。一般には親Tn3スキャフォールドにおけるアミノ酸変化、または詳細には親和性成熟Tn3スキャフォールドの所望される抗原への結合を改善する親Tn3スキャフォールドのループにおけるアミノ酸変化をもたらすような任意の親和性成熟手法を用いることができる。
タンデム構築物の連結物、すなわち2つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットを連結することによって形成される二量体は、限定はされないがII型およびIIS型制限酵素を含む、当該技術分野で公知の制限酵素を用いてのオリゴヌクレオチドの制限部位でのライゲーションにより作製してもよい。
(i)VL、CL、VHおよびCH1ドメインを有するFab断片;
(ii)1つ以上のシステイン残基をCH1ドメインのC末端に有するFab断片であるFab’断片;
(iii)VHおよびCH1ドメインを有するFd断片;
(iv)VHおよびCH1ドメインならびに1つ以上のシステイン残基をCH1ドメインのC末端に有するFd’断片;
(v)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインを有するFv断片;
(vi)VHドメインからなるdAb断片;
(vii)単離されたCDR領域;
(viii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab’断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片;
(ix)一本鎖抗体分子(例えば、一本鎖Fv;scFv);
(x)同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する「二重特異性抗体」;
(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の対を形成する、タンデムFdセグメントの対(VH−CH1−VH−CH1)を含む「線状抗体」;
(xii)全長抗体;および
(xiii)ヒンジ領域および/またはCH1領域の全部もしくは一部をさらに含んでもよい、CH2−CH3を含むFc領域
から選択される抗体部分を含む二量体化ドメインに融合または複合されてもよい。
本発明のTn3スキャフォールドの組換え発現は、Tn3スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターの構築を必要とする。Tn3スキャフォールドをコードするポリヌクレオチドが得られていると、Tn3スキャフォールドの生成用のベクターは、組換えDNA技術により当該技術分野で周知の技術を用いて生成してもよい。したがって、Tn3スキャフォールドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。スキャフォールドポリペプチドをコードする配列を有する発現ベクターと適切な転写および翻訳制御シグナルを構築するため、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法として、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明のTn3スキャフォールドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
本発明のTn3スキャフォールドは、細胞内にまたは分泌形態として生成され得る。一部の実施形態では、分泌されるスキャフォールドは、適切にフォールディングされ、完全に機能的である。本発明のTn3スキャフォールドは、スケーラブルなプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、スキャフォールドは、分析用スケールバイオリアクター(例えば限定はされないが、5L、10L、15L、30L、もしくは50Lのバイオリアクター)において本発明のスキャフォールドを生成するためにスケールアップ可能である、研究室における本発明のスケーラブルなプロセスにより生成され得る。他の実施形態では、Tn3スキャフォールドは、生成用スケールバイオリアクター(例えば限定はされないが、75L、100L、150L、300L、もしくは500L)において本発明のTn3スキャフォールドを生成するためにスケールアップ可能である、研究室における本発明のスケーラブルなプロセスにより生成され得る。一部の実施形態では、本発明のスケーラブルなプロセスは、研究室において実施される生成プロセスと比べて、生成効率における低下をほとんどもたらさない。
多量体Tn3スキャフォールドにおける単量体サブユニットは、タンパク質および/または非タンパク質リンカーによって連結され得、ここで、各リンカーは少なくとも2つの単量体サブユニットに融合される。好適なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組み合わせからなり得る。リンカーの組み合わせは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。一部の実施形態では、本発明の多量体Tn3スキャフォールドは複数の単量体サブユニットを含み、ここで、すべてのリンカーは同一である。他の実施形態では、多量体Tn3スキャフォールドは複数の単量体サブユニットを含み、リンカーの少なくとも1つは、残りのリンカーとは機能的または構造的に異なる。一部の実施形態では、リンカーは、標的への結合に直接的または間接的に関与することにより、多量体Tn3スキャフォールドの活性に自ら寄与し得る。
本発明は、CD40Lに特異的に結合するTn3スキャフォールドを提供する。具体的な実施形態では、本発明のスキャフォールドは、ヒトCD40Lに特異的に結合する。他の具体的な実施形態では、本発明のTn3スキャフォールドは、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギに由来するCD40L相同体に結合する。一部の実施形態では、本発明のTn3スキャフォールドは、CD40Lの曝露されたエピトープに結合する。かかる実施形態は、細胞上で内因性に発現されるCD40Lおよび/または受容体を異所性に発現するように遺伝子導入された細胞を含む。
一部の実施形態では、本発明のTn3スキャフォールドは、CD40Lに結合する少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのループ配列を含む、CD40Lに特異的な単量体サブユニットを含む。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体と一緒に調合された本発明のアルブミン融合タンパク質の1つもしくは組み合わせを含有する組成物、例えば限定はされないが医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、スキャフォールド、例えばTn3スキャフォールドを有するアルブミン融合タンパク質を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号134、135、201、202、203、204、205、206、207もしくは208のアルブミン融合タンパク質を含み、ここで、その組成物は20ng/mg未満の宿主細胞タンパク質を有し、また46位、151位もしくは両方でのトリプトファンは酸化されない。他の実施形態は、本発明に従って精製されたアルブミン融合タンパク質を含む薬学的に許容できる製剤に関する。その製剤は、好適には緩衝液、糖、および乳化剤を含んでもよい。一実施形態では、緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液であり、糖はスクロースであり、かつ乳化剤はポリソルベート80である。請求項100または101に記載の医薬製剤は凍結乾燥される。
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を理解するか、または単にルーチン実験を用いるのみで確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
化学物質
プロピレングリコールはAlfa Aesar(Ward Hill,MA,USA)から入手した。スクロースはPfanstiehl(Waukegan,Il,USA)から入手した。トリトンX−100および硫酸ナトリウムはEMD Millipore(Billerica,MA,USA)から入手した。ビストリス、ビストリスHCl、およびニコチンアミドはSigma−Aldrich(St.Louis、MO,USA)から入手した。氷酢酸、アルギニン、グリシン、酢酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス、および尿素は、JT Baker(Center Valley,PA,USA)から入手した。
本研究で用いられるタンパク質のアルブミン融合タンパク質#1(AFP−1)(配列番号145)は、ヒト血清アルブミンに融合された、ヒトフィブロネクチンIII型タンパク質ドメインに由来する2つの同一のテネイシンC(TnC)ドメインからなるCD40L拮抗剤である。(ヒトTnCの3番目のフィブロネクチンIII型タンパク質ドメイン由来の)各Tn3ドメインは、ヒトCD40Lに結合し、ヒトCD40とのその相互作用を阻害する。ヒト血清アルブミン融合体は、その分子の好適な薬物動態特性を保証する。そのタンパク質は、当業者が精通した技術を用いて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において発現される。組換えヒトアルブミン(rHSA;米において発現される)は、Sigma−Aldrichから凍結乾燥粉末として購入した(カタログ番号A9731)。表3は、rHSAおよびAFP−1の特性の概要である。
すべてのプロセス中間体(清澄化培地および場合によりCibacron blue色素クロマトグラフィープールを除く)におけるタンパク質濃度を、業界で共通の標準的な分光光度的手順を用いて280nmでの吸光度により測定した。吸光係数として、AFP−1に対して0.98(mg/mL)-1cm-1、rHSAに対して0.531(mg/mL)-1cm-1を用いた。
分析用高性能HSA親和性クロマトグラフィー(HSA−HPLC)をAgilent 1200 HPLCシステム(Palo Alto,CA,USA)とともに、Life Technologies(Grand Island、NY,USA)から入手したPoros CaptureSelect HSAカラムを用いて実施した。平衡化緩衝液相は10〜50mMのリン酸ナトリウム、3.5mL/分でpH7.2であり、生成物は100mMのグリシン、pH2.0緩衝液で溶出させた。10〜100ugの試料を適切に注射し、溶出特性を280nmでの分光光度計を用いて監視した。データを収集し、Agilent製のChemStationソフトウェアを用いて分析し、生成物に特異的な濃度を、精製タンパク質を用いて作成した検量線から判定した。
Cibacron blue色素親和性クロマトグラフィーは、20cmのベッド高を有する小規模クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、GE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)製のAKTA Explorer液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは300cm/時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは、50mMのビストリス(またはリン酸塩)、50mMのNaCl、pH6.0で平衡化し、次に(清澄化細胞培養液中のHSA−HPLC力価に基づいて)樹脂1Lあたり最大25gのタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを再平衡化し、50mMのビストリス(またはリン酸塩)、pH7.0で洗浄し、次に50mMのビストリス(またはリン酸塩)、25mMのオクタン酸ナトリウム、10mMのEDTA、pH7.0で溶出した。生成物ピークを生成物ピークのリーディング側とテーリング側での100mAUの吸光度基準に基づいて収集した。最適化(実施例2参照)中、追加洗浄を再平衡化と50mMリン酸塩、pH7洗浄中にカラムに適用した。Capto Blue(high sub)樹脂はGE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)から入手した。Toyopearl AF−Blue HC−650M樹脂はTosho Biosciences(King of Prussia,PA,USA)から入手した。
アニオン交換クロマトグラフィー(AEX)は、20cmのベッド高に充填された小型クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、GE Healthcare製のAKTA Explorer液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは300cm/時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは、50mMのビストリス、20mMの塩化ナトリウム、pH7.0で平衡化し、タンパク質を負荷し、次に平衡化緩衝液で洗浄した。カラムをpH7.0でのビストリス緩衝液中で20〜400mMの塩化ナトリウムの段階的または10カラム容積(CV)線形勾配を用いて溶出した。生成物ピークは、生成物ピークのリーディング側およびテーリング側に対する100mAUの吸光度基準に基づいて収集した。Capto Q樹脂は、GE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)から入手した。
アニオン交換膜クロマトグラフィー(AEMC)を典型的なフロースルー条件下で実施した。すべての実行は、GE Healthcare製のAKTA Explorer液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは10MV/分で操作した。ベースライン条件下において、膜は50mMのビストリス、50mMの塩化ナトリウム、pH7.0で平衡化し、次に負荷材料は膜を通過させた。フロースルー生成物ピークは、生成物ピークのリーディング側およびテーリング側に対する100mAUの吸光度基準に基づいて収集した。最適化(実施例2を参照)中、10〜220mMのNaClおよびpH6〜8の緩衝液条件を用いた。Mustang Q膜は、Pall Life Sciences(Port Washington,NY,USA)から入手した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、20cmのベッド高を有する小規模クロマトグラフィーカラム内で典型的な結合および溶出条件下で実施した。すべての実行は、GE Healthcare(Piscataway,NJUSA)製のAKTA Explorer液体クロマトグラフィーシステムを用いて実行し、カラムは130〜300cm/時で操作した。ベースライン条件下において、カラムは50mMのビストリス、1Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0で平衡化した。負荷物は1(重量)部のタンパク質溶液を2重量部の50mMのビストリス、2Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0で希釈することにより調製し、次にカラムに樹脂1Lあたり最大25gのタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを平衡化緩衝液で再平衡化し、次に20カラム容積にわたる1Mから0mMのクエン酸ナトリウムでのクエン酸ナトリウムの線形勾配で溶出した。生成物ピークを画分で収集するとともに、早期に溶出する材料を酸化生成物中で濃縮した。Toyopearl PPG 600MおよびToyopearl Phenyl 650M樹脂は、Tosoh Bioscience(King of Prussia,PA,USA)製であり;Capto MMCおよびButyl−S Fast Flow樹脂はGE Healthcare(Piscataway,NJ,USA)製であった。
分析用高性能サイズ排除クロマトグラフィー(SEC−HPLC)を、Agilent 1200 HPLCシステム(Palo Alto,CA,USA)とともに、Tosoh Biosciences(King of Prussia,PA USA)から入手したTSK−GEL G3000SWXLカラム(7.8mm×30cm)を用いて実施した。移動相は、30℃、0.8mL/分で22分間、0.1Mのリン酸ナトリウム、0.1Mの硫酸ナトリウム、10%イソプロパノール、pH6.8であった。250ugの試料を適切に注射し、Bio−Rad(Hercules,CA USA)からの分子量標準を用いてカラムを較正した。280nmでの分光光度計を用いて溶出特性を監視し、データを収集し、Agilent製のChemStationソフトウェアを用いて分析した。結果は、約12分後に認められた緩衝液関連ピークを除き、すべての他のピークと比べた生成物単量体ピークの面積パーセントとして報告する。移動相に10%のイソプロパノールを伴わずにSEC−HPLC法を実行するとき、トリプトファン酸化単量体として同定された単量体ピークに対するフロントショルダー(完全には溶解されない)が認められる。したがって、単量体および凝集体を測定するかまたはトリプトファン酸化を推定するため、SEC−HPLCアッセイの操作方法に応じてそれを用いることができる。
アルブミン融合タンパク質の精製(500L規模)
組換えヒトアルブミン(rHSA)は、フロースルークロマトグラフィー膜、トリトンウイルス不活化ステップ、および限界濾過/ダイアフィルトレーションステップといった3つの結合および溶出クロマトグラフィーカラムを含むプロセスで精製した。rHSAプロセス用の出発物質を作製するため、モノクローナル抗体(mAb)プロセスからの細胞培養上清において、プロテインAクロマトグラフィーの実行中、非結合材料を回収することにより抗体を枯渇させ、次に凍結乾燥したrHSA粉末を、抗体を含まない上清中に溶解させた。この出発物質は、宿主細胞タンパク質、DNA、および小分子不純物を含み、それらは典型的にはCHO細胞培養下で発現されるアルブミン融合タンパク質の細胞培養上清中に存在することになる。
アルブミン融合タンパク質の精製(500L規模)
組換えヒト血清アルブミン融合タンパク質AFP−1(HSA融合体またはアルブミン融合体)をCHO細胞内で発現させ、フロースルークロマトグラフィー膜、トリトンウイルス不活化ステップ、ナノフィルターといった3つの結合および溶出クロマトグラフィーカラム、および2つの中間的な限界濾過/ダイアフィルトレーションステップを含むプロセスを用いて精製する。
Cibacron blue色素親和性クロマトグラフィー
Capto Blue(high sub)とToyopearl AF−Blue HC−650Mとを結合能力の観点で比較し、不純物を清澄化細胞培養液から除去した。表9は、清澄化細胞培養液中でのAFP−1の動的結合能力の概要である。Capto Blue(high sub)では、動的結合能力はpHと間接的な相関を示し、この場合、pH5は最高の結合能力(樹脂1Lあたり37.4gのAFP−1)を有し、pH8は最低の結合能力(12.3g/L)を有した。高い結合能力が望ましい一方、pH5での操作は、pH6以下での分子において凝集割合が増加することに起因し、それほど望ましくない(データは示さず)。したがって、高い結合能力と生成物安定性を均衡させるため、pH6を最適pHとして選択した。Capto Blue(high sub)およびToyopearl AF−Blue HC−650Mにおける動的結合能力の比較によると、pH6でのCapto Blue(high sub)における動的結合能力がほぼ2倍であることが示された。
トリトンX−100ウイルス不活化
5.4〜5.5の範囲内の等電点を有するアルブミン融合分子であるAFP−1の場合、低pH処理は分子の生成物品質に対して(凝集および沈殿が認められ)有害であると判定した。したがって、ウイルス不活化についてはトリトンX−100処理を選択した。低pH処理と同様、トリトンX−100の添加は、ウイルスの周りのエンベロープを破壊し、ウイルスを不活化することになる。低pH処理と異なり、トリトンX−100は、AFP−1の生成物品質に対して測定可能な影響を有しない。
アニオン交換膜クロマトグラフィー
フロースルーモードで操作されるアニオン交換(AEX)膜は、宿主細胞タンパク質(HCP)、DNA、およびウイルスなどの宿主細胞不純物の優れた除去をもたらし得る。pIが典型的には7.5〜9.5の範囲内である場合のモノクローナル抗体(mAb)では、フロースルーAEX膜がおよそ中性pHで操作され、収率がしばしば(塩濃度または伝導率とは無関係に)>95%であるとき、生成物結合はほとんど重要でない。pHがmAbのpIに接近すると、結合が生じる可能性があり、収率が低下する場合がある。mAbでは、宿主細胞の不純物クリアランスは高pHおよび低塩(または伝導率)の条件下で達成される。したがって、典型的なmAbでは、操作条件は、伝導率が最小化され、pHが可能な限り高い一方でpI未満を維持するように最適化される。
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる酸化変異体の制御
本研究で用いたタンパク質は、組換えヒト血清アルブミンに連結された2つのTn3スキャフォールドを含むアルブミン融合タンパク質である。各Tn3スキャフォールドは、CD40Lリガンドに結合する能力がある活性部位を含む。アルブミン融合タンパク質は、8つのメチオニン残基(分子のアルブミン部分に6つと、各Tn3スキャフォールドに1つ)および7つのトリプトファン残基(分子のアルブミン部分に5つ、および各Tn3スキャフォールドに1つ)を含む。表面領域近傍にあるメチオニン残基およびトリプトファン残基は、細胞培養および/または精製プロセス中に酸化され得る。図10は、ペプチドマッピング質量分析によって決定される酸化の関数としての相対の効力を示す。明らかなように、分子のアルブミン(M498およびM529)またはTn3(M74およびM17)部分に対するメチオニン酸化は、効力低下に寄与しない。他方、分子の(BCループ上の)活性部位近傍のTn3スキャフォールド上で生じるトリプトファン酸化(W46およびW151)は、分子における効力の低下をもたらす。したがって、トリプトファン酸化は、作製プロセス全体を通して十分に制御される必要がある。
上記は、臨床的または商業的製造に適し得るスケーラブルな技術を用いて、組換えヒトアルブミン(rHSA)およびアルブミン融合タンパク質を精製するための様々な手法を概説している。宿主関連不純物、例えばHCP、DNA、およびウイルスを低減するため、プロセス中の初期ステップを最適化した。Cibacron blue色素クロマトグラフィー捕捉ステップは、HCPを低減するための徹底した洗浄を含み、オクタン酸を伴う選択的溶出を用いた。トリトンX−100ウイルス不活化は、生成物品質に影響を与えることのないエンベロープウイルスの不活化にとって強固な方法であることが示された。DNAを極めて低いレベルまで低減するため、AEXカラムおよび膜クロマトグラフィーステップを最適化した。興味深いことに、膜クロマトグラフィーステップは、本研究の前に想定された低pHおよび高塩で最適であることが示された。最終的に、精製プロセスは、それほど強力でないことが示される酸化変異体のレベルを制御するように設計した。制御方法は、Cibacron blueクロマトグラフィーステップ中のプロピレングリコール洗浄と、トリプトファン酸化を制限しやすくするためのEDTAの溶出緩衝液への添加とを含んだ。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを酸化生成物の除去のための有効な選択肢として用いた。精製プロセスは、500Lのバイオリアクターを精製するためにスケールアップし、バッチ間の収率および生成物品質の観点で一貫していることが示された。
Claims (104)
- アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび/またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を以下の精製プロセス:
(a)親和性マトリックス;
(b)アニオン交換マトリックス
に供するステップを含み、前記アルブミン融合タンパク質が、オクタン酸を含む溶出緩衝液を適用することによって前記親和性マトリックスから溶出される、方法。 - 前記溶出緩衝液が約2mM〜約100mMのオクタン酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 親和性マトリックスが、
(1)約2%〜約20%の、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、および2−メチル−2,4−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール;
(2)0.05M〜2.0Mの、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩;
(3)約0.02M〜約0.2Mの硫酸ナトリウム;
(4)約0.01%〜約1%の非イオン性界面活性剤;
(5)約0.05M〜約1.0Mの尿素;または
(6)約0.02M〜約0.5Mのニコチンアミド
を含む洗浄用緩衝液で洗浄される、請求項1または2に記載の方法。 - アルブミン融合タンパク質における精製中のトリプトファンおよび/またはメチオニンの酸化を低減する方法であって、前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を以下の精製プロセス:
(a)親和性マトリックス;
(b)アニオン交換マトリックス
に供するステップを含み、前記親和性マトリックスが、
(1)約2%〜約20%の、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、および2−メチル−2,4−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール;
(2)0.05M〜2.0Mの、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩;
(3)約0.02M〜約0.2Mの硫酸ナトリウム;
(4)約0.01%〜約1%の非イオン性界面活性剤;
(5)約0.05M〜約1.0Mの尿素;または
(6)約0.02M〜約0.5Mのニコチンアミド
を含む洗浄用緩衝液で洗浄される、方法。 - 前記洗浄用緩衝液が、約5%〜約15%のポリオール、約0.2M〜約0.8Mの塩、約0.2M〜約0.8Mの硫酸ナトリウム、約0.02%〜約0.4%の非イオン性界面活性剤、または約0.2M〜約1.0Mの尿素を含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記ポリオールが1,2−プロパンジオールであり、前記塩が塩化ナトリウムであり、かつ前記非イオン性界面活性剤がトリトンX−100である、請求項3、4または5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄用緩衝液が、(1)約0.5Mの塩化ナトリウム;(2)約0.5Mの硫酸ナトリウム;または(3)約10%の1,3−プロパンジオールを含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が、ビストリス、トリス、リン酸、塩、キレート剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1、2、3、5、6または7に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が50mMのビストリスである、請求項8に記載の方法。
- 前記洗浄用緩衝液が5.5〜7.0のpHである、請求項3または4に記載の方法。
- 前記親和性マトリックスがローディング緩衝液で平衡化される、請求項3または4に記載の方法。
- 前記親和性マトリックスが色素親和性マトリックスである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換マトリックスがデキストラン表面増量剤で高度に架橋されたアガロースを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質がステップ溶出を用いて前記アニオン交換マトリックスから溶出される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質が勾配溶出を用いてアニオン交換から溶出される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換マトリックス溶出緩衝液が、NaCl、KCl、CaCl2、HCl、LiCl、NaBr、KBr、およびLiBrからなる群から選択される塩を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記塩がNaClであり、かつ20〜400mMの量で存在する、請求項14に記載の方法。
- 前記アニオン交換マトリックスが、50mMのビストリスおよび20mMのNaClをpH7.0で含むローディング緩衝液で平衡化される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、アニオン交換膜を通過させるステップをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換膜が第4級アミンで修飾されたポリエーテルスルホンベース膜である、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物が、10mMを超える塩濃度と8未満のpHとを有するフロースルー緩衝液中で前記アニオン交換膜を通過させられる、請求項17に記載の方法。
- 前記フロースルー緩衝液が10mM〜220mMの塩濃度と6〜8のpHとを有する、請求項19に記載の方法。
- 前記フロースルー緩衝液が6〜7.5のpHで50mM〜220mMの塩濃度を有する、請求項20に記載の方法。
- アニオン交換マトリックス溶出液をダイアフィルトレーションに供する、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- ダイアフィルトレーション用の緩衝液がpH7.0で50mMのビストリスと50mMのNaClとを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記膜が予め調整される、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜が平衡化される、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を疎水性相互作用マトリックスに供するステップをさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用マトリックスまたはマルチモーダルマトリックスが、Capto Butyl、Capto Phenyl、Capto Butyl、Butyl−S Fast Flow、Toyopearl Hexyl、Toyopearl Butyl、Toyopearl Phenyl、Toyopearl PPG、Toyopearl Ether、Toyopearl PPG−600M、およびToyopearl Phenyl−650M、Toyopearl PPG−600M、TSKgel Phenyl、TSKgel Ether、Macro−Prep Methyl、Capto MMC、Eshmuno HCX、Nuvia cPrime、またはToyopearl MX−Trp−650Mからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用マトリックスに、クエン酸塩、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む緩衝液が負荷される、請求項26に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用マトリックスが、低レベルのクエン酸塩、[硫酸?]ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液で溶出される、請求項26に記載の方法。
- 前記組成物を限界濾過に供するステップをさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物をダイアフィルトレーションに供するステップをさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物をナノ濾過に供するステップをさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供するステップをさらに含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ウイルス不活化プロセスをさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス不活化プロセスが、アルブミン融合タンパク質を含む前記組成物をトリトンX−100、ツイーン80、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ノノキシノール−9、ポリオキサマー、ステアリルアルコール、またはソルビタンモノステアレートで処理するステップを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記ウイルス不活化プロセスが前記ステップ(a)のプロセス後および前記ステップ(b)のプロセス前に実施される、請求項34に記載の方法。
- トリトンX−100が、約30〜約240分にわたって保持される約0.01%〜約1%のトリトンX−100の最終濃度(w/w)まで添加される、請求項38に記載の方法。
- 酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を含む組成物を得る方法であって、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とを含む組成物を疎水性相互作用マトリックスに供するステップを含み、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に前記疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、前記トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質を前記トリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法。
- トリプトファン/メチオニン残基の酸化を本質的に含まないアルブミン融合タンパク質を単離する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、以下の精製プロセス:
(a)親和性マトリックスクロマトグラフィープロセス;
(b)アニオン交換クロマトグラフィープロセス;および
(c)疎水性相互作用マトリックスクロマトグラフィープロセス
に供するステップを含み、オクタン酸を含む溶出緩衝液が前記親和性マトリックスに適用され、トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質とトリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質とが異なる時間に前記疎水性相互作用マトリックスから溶出され、それにより、前記トリプトファンが酸化されたアルブミン融合タンパク質を前記トリプトファンが酸化されていないアルブミン融合タンパク質から分離する、方法。 - アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、アルブミン融合タンパク質を含む組成物を、疎水性相互作用マトリックスおよび以下の精製プロセス:
(a)オクタン酸を含む溶出緩衝液が適用される親和性マトリックス;および/または
(b)アニオン交換マトリックス
の1つ以上に供するステップを含み、親和性マトリックスが、(1)約2%〜約20%の、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,6ヘキサンジオール、および2−メチル−2,4−ペンタンジオールからなる群から選択されるポリオール;(2)0.05M〜2.0の、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、および臭化リチウムから選択される塩;(3)約0.02M〜約0.2Mの硫酸ナトリウム;(4)約0.01%〜約1%の非イオン性界面活性剤;(5)約0.05M〜約1.0Mの尿素;または(6)約0.02M〜約0.5Mのニコチンアミドを含む洗浄用緩衝液で洗浄され、
得られる精製されたアルブミン融合タンパク質が、酸化されたトリプトファン残基を本質的に含まない、方法。 - アルブミン融合タンパク質を精製する方法であって、
(a)前記アルブミン融合タンパク質を含む組成物を親和性マトリックスに適用するステップと;
(b)前記アルブミン融合タンパク質を前記(a)の親和性マトリックスから溶出させて第1の溶出液を得るステップと;
(c)前記第1の溶出液をアニオン交換マトリックスに適用するステップと;
(d)前記アルブミン融合タンパク質を前記アニオン交換マトリックスから溶出させて第2の溶出液を得るステップと;
(e)前記第2の溶出液をアニオン交換膜に適用するステップと;
(f)前記アルブミン融合タンパク質を、アニオン交換膜を通過させてフロースルーを得るステップと;
(g)前記フロースルーを疎水性相互作用マトリックスに適用するステップと;
(h)前記アルブミン融合タンパク質を前記疎水性相互作用マトリックスから溶出させて第3の溶出液を得るステップと
を含み、前記第3の溶出液が前記精製されたアルブミン融合タンパク質を含む、方法。 - 前記アルブミン融合タンパク質中のアルブミンがヒト血清アルブミン(HSA)である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HSAが変異体HSAである、請求項42に記載の方法。
- 前記変異体HSAのアミノ酸配列が配列番号133である、請求項43に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質が、3番目のフィブロネクチンIII型(FnIII)ドメインを含むスキャフォールド部分を含む、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FnIIIドメインがヒトテネイシンC(Tn3スキャフォールド)由来である、請求項45に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質がスキャフォールドを含む、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スキャフォールドがトリプトファン残基を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記トリプトファン残基の酸化が前記アルブミン融合タンパク質の活性を低下させる、請求項48に記載の方法。
- 前記スキャフォールドがCD40Lに特異的に結合する、請求項47〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドが単一のCD40Lに特異的な単量体サブユニットを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがタンデムに連結された2つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記2つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットが直接的に連結される、請求項52に記載の方法。
- 前記2つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットがリンカーによって連結される、請求項52に記載の方法。
- 前記リンカーがペプチドリンカーを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記ペプチドリンカーが(GmX)n配列を含み、ここで、
(a)Xがセリン(S)、アラニン(A)、グリシン(G)、Leu(L)、イソロイシン(I)、またはバリン(V)であり;
(b)mおよびnが整数であり;
(c)mが1、2、3または4であり;かつ
(d)nが1、2、3、4、5、6、または7である、請求項55に記載の方法。 - 前記ペプチドリンカーが配列番号131、配列番号132、配列番号142または配列番号143を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドを含み、少なくとも1つのCD40Lに特異的な単量体サブユニットの前記βストランドが配列番号3のβストランドに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドAを含み、前記βストランドAが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号11を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドBを含み、前記βストランドBが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号12を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドCを含み、前記βストランドCが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号13または14を含み、配列番号13または14中のシステインが置換されない、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドDを含み、前記βストランドDが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号15を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがEβとして含み、βストランドEが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号16を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがFβとして含み、βストランドDが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号17を含み、配列番号17中のシステインが置換されない、請求項45に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドがβストランドGを含み、前記βストランドGが少なくとも1つの突然変異を除いて配列番号18を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記ABループの前記配列が配列番号4または配列番号136を含み、前記CDループの前記配列が配列番号6を含み、かつ前記EFループの前記配列が配列番号8または配列番号137を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記BCループの前記配列が、配列番号83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、および168からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記DEループの前記配列が、配列番号94、95、96、97、98、および169からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記FGループの前記配列が、配列番号9、99、139、および170からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記BCループの前記配列が、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、および174からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記DEループの前記配列が、配列番号118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、および175からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記FGループの前記配列が、配列番号129、130、および177からなる群から選択される配列を含む、請求項67に記載の方法。
- (a)前記BCループの前記配列が配列番号83を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(b)前記BCループの前記配列が配列番号83を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号99を含むか;
(c)前記BCループの前記配列が配列番号84を含み、前記DEループの前記配列が配列番号95を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(d)前記BCループの前記配列が配列番号85を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(e)前記BCループの前記配列が配列番号86を含み、前記DEループの前記配列が配列番号96を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(f)前記BCループの前記配列が配列番号87を含み、前記DEループの前記配列が配列番号97を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(g)前記BCループの前記配列が配列番号88を含み、前記DEループの前記配列が配列番号95を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(h)前記BCループの前記配列が配列番号89を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(i)前記BCループの前記配列が配列番号90を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(j)前記BCループの前記配列が配列番号91を含み、前記DEループの前記配列が配列番号95を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;
(k)前記BCループの前記配列が配列番号92を含み、前記DEループの前記配列が配列番号98を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含むか;または
(l)前記BCループの前記配列が配列番号93を含み、前記DEループの前記配列が配列番号94を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号9または139を含む、請求項67に記載の方法。 - (a)前記BCループの前記配列が配列番号100を含み、前記DEループの前記配列が配列番号118を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(b)前記BCループの前記配列が配列番号101を含み、前記DEループの前記配列が配列番号119を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(c)前記BCループの前記配列が配列番号102を含み、前記DEループの前記配列が配列番号120を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(d)前記BCループの前記配列が配列番号103を含み、前記DEループの前記配列が配列番号121を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(e)前記BCループの前記配列が配列番号104を含み、前記DEループの前記配列が配列番号122を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(f)前記BCループの前記配列が配列番号105を含み、前記DEループの前記配列が配列番号121を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(g)前記BCループの前記配列が配列番号106を含み、前記DEループの前記配列が配列番号123を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(h)前記BCループの前記配列が配列番号107を含み、前記DEループの前記配列が配列番号123を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(i)前記BCループの前記配列が配列番号108を含み、前記DEループの前記配列が配列番号118を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(j)前記BCループの前記配列が配列番号109を含み、前記DEループの前記配列が配列番号123を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(k)前記BCループの前記配列が配列番号110を含み、前記DEループの前記配列が配列番号121を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(l)前記BCループの前記配列が配列番号111を含み、前記DEループの前記配列が配列番号123を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号130を含むか;
(m)前記BCループの前記配列が配列番号108を含み、前記DEループの前記配列が配列番号121を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(n)前記BCループの前記配列が配列番号112を含み、前記DEループの前記配列が配列番号124を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(o)前記BCループの前記配列が配列番号113を含み、前記DEループの前記配列が配列番号125を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(p)前記BCループの前記配列が配列番号114を含み、前記DEループの前記配列が配列番号118を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(q)前記BCループの前記配列が配列番号115を含み、前記DEループの前記配列が配列番号126を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;
(r)前記BCループの前記配列が配列番号116を含み、前記DEループの前記配列が配列番号127を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含むか;または
(s)前記BCループの前記配列が配列番号117を含み、前記DEループの前記配列が配列番号128を含み、かつ前記FGループの前記配列が配列番号129を含む、請求項67に記載の方法。 - 前記ABループが配列番号136を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記CD40Lに特異的な単量体サブユニットが、配列番号20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42および146からなる群から選択される配列を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記CD40Lに特異的な単量体サブユニットがアミノ酸配列:
(a)X1がアミノ酸残基のセリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のアスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のアラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のフェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のイソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のグリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のトリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11がアミノ酸残基のトリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;かつ
(l)X12がアミノ酸残基のアルギニン(R)またはセリン(S)を表す、請求項50〜54のいずれか一項に記載の方法。 - 前記CD40Lに特異的な単量体サブユニットが、配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、および82からなる群から選択される配列を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記CD40Lに特異的な単量体サブユニットがアミノ酸配列:
(a)X1がアミノ酸残基のリジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2がアミノ酸残基のトレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3がアミノ酸残基のアスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4がアミノ酸残基のセリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5がアミノ酸残基のチロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6がアミノ酸残基のチロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7がアミノ酸残基のアスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8がアミノ酸残基のロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9がアミノ酸残基のヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10がアミノ酸残基のグリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)
(l)X11がアミノ酸残基のアラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(m)X12がアミノ酸残基のセリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(n)X13がアミノ酸残基のセリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(o)X14がアミノ酸残基のプロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)もしくはアラニン(A)、またはアミノ酸なしを表し;
(p)X15がアミノ酸残基のイソロイシン(I)またはアミノ酸なしを表し;
(q)X16がアミノ酸残基のグルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;かつ
(r)X17がアミノ酸残基のセリン(S)またはアスパラギン(N)を表す、請求項78に記載の方法。 - 前記Tn3スキャフォールドが、配列番号134、135、205、206、207および208からなる群から選択される配列を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記Tn3スキャフォールドが、配列番号201、202、203、および204からなる群から選択される配列を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記CD40LがヒトCD40Lである、請求項50に記載の方法。
- 前記CD40Lが、膜結合CD40L(配列番号1)、可溶性CD40L(配列番号2)、またはその断片である、請求項83に記載の方法。
- 前記スキャフォールドがCD40Lに結合し、かつCD40LのCD40への結合を阻止する、請求項50〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スキャフォールドがCD40Lに結合し、かつCD40媒介性シグナル伝達を破壊する、請求項50〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スキャフォールドが、約1μM以下、または約500nM以下、または約100nM以下、または約50nM以下、または約25nM以下、または約10nM以下、または約5nM以下、または約2nM以下の親和性(Kd)でCD40Lに結合する、請求項50〜86のいずれか一項に記載の方法。
- CD40Lに特異的な単量体サブユニットが、配列番号2の142〜155位、200〜230位、または247〜251位に位置するアミノ酸を含むCD40Lエピトープに特異的に結合する、請求項50〜87のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜88のいずれか一項に記載の方法によって得られるアルブミン融合タンパク質組成物。
- 前記精製されたアルブミン融合タンパク質の相対効力が>90%である、請求項89に記載の組成物。
- アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、20ng/mg未満の宿主細胞タンパク質を有し、トリプトファン残基の15%未満が酸化されている、組成物。
- 前記トリプトファン残基の5%未満が酸化されている、請求項91に記載の組成物。
- 総タンパク質に対する5%未満のアミノ酸残基が酸化されている、請求項94に記載の組成物。
- アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、5×10-3ng/mg未満のDNAを有し、トリプトファン残基の15%未満が酸化されている、組成物。
- 前記トリプトファン残基の5%未満が酸化されている、請求項94に記載の組成物。
- 総タンパク質に対する20%未満の前記アミノ酸残基が酸化されている、請求項95に記載の組成物。
- アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、20ng/mg未満の宿主細胞タンパク質を有し、前記アルブミン融合タンパク質が>90%の相対活性を有する、組成物。
- アルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、5×10-3ng/mg未満のDNAを有し、前記アルブミン融合タンパク質が>90%の相対活性を有する、組成物。
- 配列番号134、135、201、202、203、204、205、206、207または208のアルブミン融合タンパク質を含む組成物であって、20ng/mg未満の宿主細胞タンパク質を有し、46位、151位または両方のトリプトファンが酸化されない、組成物。
- (a)請求項90〜99のいずれか一項に記載の組成物;
(b)緩衝液;
(c)糖;および
(d)乳化剤
を含む薬学的に許容できる製剤。 - 前記緩衝液がリン酸ナトリウム緩衝液であり、前記糖がスクロースであり、かつ前記乳化剤がポリソルベート80である、請求項100に記載の製剤。
- 凍結乾燥される、請求項100または101に記載の製剤。
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