ES2903280T3

ES2903280T3 - Anticuerpos específicos del receptor de poliovirus humano (RPH)

Info

Publication number: ES2903280T3
Application number: ES17713469T
Authority: ES
Inventors: Noa S Kaynan; Pinchas Tsukerman; Stipan Jonjic
Original assignee: Of Rijeka Faculty Of Medicine, University of; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Of Rijeka Faculty Of Medicine, University of; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2016-03-01
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2022-03-31
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: RU2018134065A; CN109071666B; EP3423495B1; AU2024201912A1; MX2018010445A; KR20180133399A; US20200040092A1; IL261200A; EP4043492A1; US20240018257A1; EP3423495A1; IL261200B2; US20210115150A1; CA3015619A1; AU2017228055B2; AU2017228055A1; MX2022014867A; RU2756275C2; BR112018067522A2; JP6966176B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al receptor de poliovirus humano (PVR), o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende al menos la porción de unión al antígeno, que comprende un conjunto de CDR de seis CDR en donde: CP CDR1 se selecciona de GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36) y SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CP CDR2 es EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CP CDR3 es TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CL CDR1 se selecciona de KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44) y KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CL CDR2 se selecciona del grupo que consta de: WASSRHN (SEQ ID NO: 46), WASSRHA (SEQ ID NO: 56), WASSRHR (SEQ ID NO: 57), WASSRHD (SEQ ID NO: 58), WASSRHE (SEQ ID NO: 57) NO: 59), WASSRHP (SEQ ID NO: 60) y WASSRHT (SEQ ID NO: 61); y CL CDR3 es QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48); en donde el anticuerpo monoclonal aislado es capaz de inhibir la unión de PVR al inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos específicos del receptor de poliovirus humano (RPH)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención pertenece al campo de la inmunoterapia y se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen al receptor de poliovirus de proteína, a secuencias de polinucleótidos que codifican estos anticuerpos y a células de hibridoma que producen estos anticuerpos. La invención se refiere además a composiciones terapéuticas y de diagnóstico que comprenden estos anticuerpos y a métodos para tratar y diagnosticar enfermedades, particularmente cáncer, usando estos anticuerpos monoclonales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La inmunoterapia contra el cáncer se utiliza para generar y aumentar una respuesta inmunitaria antitumoral, p. ej., mediante el tratamiento con anticuerpos específicos de antígenos en células tumorales, con fusiones de células presentadoras de antígeno con células tumorales, o mediante activación específica de células T antitumorales. La capacidad de reclutar células inmunitarias (p. ej., células T) contra las células tumorales en un paciente proporciona una modalidad terapéutica para combatir los tipos de cáncer y la metástasis que hasta ahora se consideraban incurables.

[0003] La respuesta inmunitaria mediada por células T incluye múltiples pasos secuenciales regulados por un equilibrio entre señales coestimuladoras y co-inhibidoras que controlan la magnitud de la respuesta inmunitaria. Las señales inhibitorias, denominadas puntos de control inmunitarios, son cruciales para el mantenimiento de la auto-tolerancia y también para la limitación del daño tisular colateral mediado por el sistema inmunitario. Estas señales cambian a medida que se elimina, empeora o persiste una infección o respuesta inmunitaria, y estos cambios afectan la respuesta de las células T y reconfiguran la respuesta inmunitaria.

[0004] La expresión de proteínas de puntos de control inmunológico puede ser regulada por los tumores. Por ejemplo, la regulación al alza del ligando de muerte programada-1 (PD-L1) en la superficie de las células cancerosas les permite evadir el sistema inmunológico del huésped inhibiendo las células T mediante la unión a PD-1 que de otro modo podrían atacar estas células tumorales. Por tanto, los puntos de control inmunológico representan barreras importantes para la activación de la inmunidad celular funcional contra el cáncer. En consecuencia, los anticuerpos antagonistas específicos de los ligandos inhibidores de las células inmunitarias se consideran agentes anticáncer viables y se están evaluando en las clínicas (p. ej., Nivolumab y Pembrolizumab). Otro ejemplo de molécula de punto de control inmunológico es el inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT). TIGIT es una molécula co-inhibidora expresada en varias células inmunitarias, incluidas las células T y las células asesinas naturales (células NK). TIGIT se une con alta afinidad al receptor del virus de la polio (PVR).

[0005] El receptor de poliovirus (PVR), también denominado CD155, es una glicoproteína transmembrana que participa en la mediación de la adhesión celular a moléculas de la matriz extracelular. Se describió previamente como un antígeno tumoral y como un objetivo potencial para la intervención terapéutica, ya que su expresión está regulada positivamente en los cánceres neuroectodérmicos, incluidos el glioblastoma multiforme, el meduloblastoma y el carcinoma colorrectal (Solecki et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 25697-700) así como en cáncer de páncreas (Nishiwada et al., Anticancer Res.

2015, 35 (4): 2287-97). También se sabe que la PVR mejora la activación inducida por el suero de la señalización Ras-Raf-MEK-ERK, regula al alza las ciclinas D2 y E, y al p27Kip1 regulado a la baja, lo que eventualmente acorta el período de la fase G0/G1 del ciclo celular (Kakunaga 2004, J. Biological Chemistry, 279, 36419-36425), por esa razón se anticipa que el bloqueo de PVR en células tumorales reducirá la viabilidad de las células tumorales. PVR también tiene un papel crítico en la angiogénesis y se sugiere que regule la angiogénesis inducida por VEGF controlando la interacción de VEGFR2 con la integrina a(v)p(3), y la vía de señalización Rap1 -Akt mediada por VEGFR2 (Kinugasa et al., 2012, Circ Res, 2012, 110 (5), 716-26). Además, PVR forma un complejo con IGF1R y participa en la señalización de Met y bloquea la formación del complejo y reduce la viabilidad celular y la angiogénesis (Lee et al., Scientific Reports 2014, 20, 4, 7139).

[0006] La implicación de PVR en la metástasis se demostró inyectando células cancerosas en la cola de los ratones y midiendo la metástasis en los pulmones. Se ha demostrado que el PVR regulado al alza en las células cancerosas transinteractúa con su contrareceptor en las plaquetas, y que esta trans-interacción aumenta la metástasis de las células cancerosas a los pulmones (Morimoto et al., Oncogene (2008) 27,264-273).

[0007] La Patente de EE. UU. N°. 20070041985 describe moléculas que se unen específicamente a al menos un dominio intra o extracelular del PVR o cualquier derivado del mismo, en donde la molécula tiene la capacidad de modular un comportamiento de adhesión, tráfico y/o invasión mediado por un receptor de una célula que expresa el PVR o cualquier derivado del mismo.

[0008] La Patente de EE. UU. N°. 20090215175 proporciona moléculas (p. ej., pequeños compuestos, oligonucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos químicos) que modulan las funciones PVR necesarias para la adhesión, el tráfico, la invasión y/o el potencial metastásico de las células. Las moléculas se pueden usar para el tratamiento de células con potencial metastásico, metástasis y cáncer.

[0009] La Publicación de Solicitud PCT N°. WO 2006/124667 describe la modulación de la proteína zB7R1 (TIGIT) por anticuerpos monoclonales que bloquean la unión de TIGIT a su ligando PVR.

[0010] Hay una necesidad no satisfecha de proporcionar agentes adicionales y más eficaces, específicos, seguros y/o estables, que solos o en combinación con otros agentes, potencian células del sistema inmunitario que atacan las células tumorales o infectadas por el virus mediante la inhibición de la unión de PVR a TIGIT.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0011] La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de los mismos que reconocen el receptor de poliovirus (PVR), evitan su unión al inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT) e inhiben la actividad supresora de linfocitos como las células asesinas naturales (NK) y las células T. Los anticuerpos anti-PVR descritos en este documento son capaces de unirse al PVR presente en las células cancerosas. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos se caracterizan por tener conjuntos únicos de secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR), alta afinidad y alta especificidad para PVR y son útiles en inmunoterapia del cáncer para combatir la evasión inmunitaria tumoral, como terapia independiente y en combinación con otros agentes anticancerígenos. Los anticuerpos también son útiles en el tratamiento de infecciones virales.

[0012] Se describe ahora que los anticuerpos anti-PVR de alta afinidad descritos en este documento bloquean la interacción TIGIT-PVR y restauran la actividad de células T y NK. Los anticuerpos mostraron una alta especificidad para la PVR humana. Estas propiedades hacen que los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente invención sean candidatos valiosos para su uso en la inmunoterapia del cáncer, lo que permite la administración de dosis más bajas con menos efectos secundarios.

[0013] Ventajosamente, los mAbs anti-PVR de acuerdo con la invención pueden inducir la proliferación a las células T mejor que mAbs anti PD-1 y CTLA-4 en un modelo in vitro PD-L1 (A549). El efecto de inducción se demostró para las células sanguíneas mononucleares periféricas (PMBC) y las células T CD4 y CD8 purificadas. Además, los mAb de PVR pudieron inducir la activación de las células NK en la mayoría de las células diana probadas. Además, algunos de los anticuerpos anti-PVR descritos en el presente documento tienen una actividad anticancerosa comparable in vitro a la de un agente conocido, Erbitux®, utilizado actualmente en terapia. Además, algunos de los anticuerpos anti-PVR descritos en el presente documento mostraron un efecto sinérgico cuando se combinaron con agentes anticáncer adicionales, tales como anticuerpos anti-PD-1 y CTLA-1 y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Además, se encontró que algunos de los anticuerpos anti-PVR inducen citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Se describe además que algunos anticuerpos anti-PVR de acuerdo con la invención no tenían ningún efecto de bloqueo sobre la señalización coestimuladora de DNAM1, por lo tanto, no tienen ningún efecto deletéreo sobre otras señales de inducción inmunitaria.

[0014] Es interesante que, a pesar de una alta similitud de secuencia entre secuencias de PVR de humanos y roedores, los anticuerpos de la presente invención son altamente específicos para PVR humano.

[0015] Se describe además que inesperadamente algunos anticuerpos monoclonales quiméricos, que comprenden la cadena constante humana, mostraron un efecto mejorado sobre la activación de las células inmunitarias en comparación con sus anticuerpos monoclonales murinos equivalentes.

[0016] Algunos de los mAbs anti PVR descritos en este documento fueron capaces de reducir la viabilidad de las células tumorales de una manera independiente de la inmunidad mediante el bloqueo de PVR en las células tumorales. Sin desear estar ligado a ningún mecanismo de acción, se sugiere que esta actividad resulta de la capacidad de PVR para acortar el período de la fase G0/G1 del ciclo celular.

[0017] Según un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une al receptor de poliovirus (PVR), o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende al menos la porción de unión a antígeno, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

i. tres CDR de una región variable de cadena pesada (CP) que comprende SEQ ID NO: 77 y tres CDR de una variable de cadena ligera (CL) que comprende SEQ ID NO: 79, o un análogo o derivado de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con dicho anticuerpo o secuencia de fragmentos;

ii. tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 69 y tres CDR de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 71, o un análogo o derivado de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con dicho anticuerpo o secuencia de fragmentos; y

iii. tres CDR de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 73 y tres CDR de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 75, o un análogo o derivado de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con dicha secuencia de anticuerpo o fragmento.

[0018] Los anticuerpos que comprenden secuencias de CDR contenidas en cadenas pesadas y ligeras homólogas a SEQ ID Nos: 2, 10, 18, 26, 34 o 42 también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 2 es intercambiable con SEQ ID NO: 69. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 10 es intercambiable con SEQ ID NO: 71. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 18 es intercambiable con SEQ ID NO: 73. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 26 es intercambiable con SEQ ID NO: 75. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 34 es intercambiable con SEQ ID NO: 77. Según algunas formas de realización, SEQ ID NO: 42 es intercambiable con SEQ ID NO: 79.

[0019] Hay varios métodos conocidos en la técnica para la determinación de las secuencias de CDR de una molécula de anticuerpo dada, pero no existe un método inequívoco estándar. La determinación de las secuencias de CDR a partir de las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo se puede realizar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, incluidos, entre otros, los métodos conocidos como KABAT, Chothia e IMGT. Un conjunto seleccionado de CDR puede incluir secuencias identificadas por más de un método, es decir, algunas secuencias de CDR pueden determinarse usando KABAT y algunas usando IMGT, por ejemplo.

[0020] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento monoclonal aislado comprende las secuencias de CDR de un anticuerpo monoclonal denominado Anti-PVR 4E5 (o hPVR.07), a saber, las tres secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 69 y las tres secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 71.

[0021] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8).

[0022] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de anticuerpo comprende cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de RYW. Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia RYWMT (SEQ ID NO: 80). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82).

[0023] De acuerdo con ciertas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpos comprende: (i) CP CDR1 que comprende la secuencia de GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4); (ii) CP CDR2 que comprende la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); y (iii) CP CDR3 que comprende la secuencia: PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8).

[0024] De acuerdo con ciertas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpos comprende: (i) CP CDR1 que comprende la secuencia de RYW; (ii) CP CDR2 que comprende la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); y (iii) CP CDR3 que comprende la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82).

[0025] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende la cadena ligera de CDR1 que comprende la secuencia de KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WASTRHT (SEQ ID NO: 14). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16). Según determinadas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende: (i) CL CDR1 comprende la secuencia kAs QDVGTAVT (SEQ ID NO: 12); (ii) CL CDR2 comprende la secuencia: w As TRHT (SEQ ID NO: 14); y (iii) CP CDR3 comprende la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16).

[0026] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo o fragmento monoclonal aislado comprende la secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4), CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia: PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8), CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia: Wa STr Ht (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16), o análogos de la misma que comprenden no más del 5% de sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos en la secuencia de la región hipervariable (HVR).

[0027] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que consisten en:

i. CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 80,

ii. CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 81,

iii. CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 82,

iv. CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 12,

v. CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 14, y

vi. CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 16.

[0028] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que consiste en: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.

[0029] De acuerdo con otras formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que consta de: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.

[0030] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende la región variable de la cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 69), o un análogo o derivado del mismo que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de la región variable de la cadena pesada.

[0031] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo de la SEQ ID NO: 2 es la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 69.

[0032] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende la región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 71), o un análogo de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de región variable de cadena ligera.

[0033] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo de la SEQ ID NO: 10 es la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 71.

[0034] De acuerdo con una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 69, y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 71, o un análogo de las mismas que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y/o pesada.

[0035] La invención también abarca el anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse con alta afinidad a un epítopo dentro de la proteína de PVR humana a la que se une el anticuerpo monoclonal (mAb) 4E5.

[0036] Según otras formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado comprende las secuencias de CDR de un anticuerpo monoclonal denominado 7D4 (o hPVR.01), a saber, las tres secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 73 y las tres secuencias de CDR contenidas en la cadena ligera de la región variable expuesta en la SEQ ID NO: 75.

[0037] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia VIPLEY (SEQ ID NO: 24). Según determinadas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende: (i) CP CDR1 comprende la secuencia Gy TFTEYt Mh (SEQ ID NO: 20); (ii) CP CDR2 comprende la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); y (iii) CP CDR3 comprende la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24).

[0038] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de EYTMH (SEQ ID NO: 83).

[0039] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia SASYRYR (SEQ ID NO: 30). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32). Según determinadas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende: (i) CL CDR1 comprende la secuencia kAs QNVYTn Va (SEQ ID NO: 28); (ii) CL CDR2 comprende la secuencia: s As YRYR (SEQ ID NO: 30); y (iii) CP CDR3 comprende la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).

[0040] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20), CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia: s As YRy R (SEQ ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32), o análogos de las mismas que comprenden no más del 5% de sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos en la secuencia de HVR.

[0041] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que consisten en: CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83, CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22, CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24, CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28, CDR2 de cadena ligera que tiene un conjunto de secuencias expuesto en SEQ ID NO: 30, y CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 32.

[0042] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que consiste en: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32.

[0043] De acuerdo con otras formas de realización específicas el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR que constan de: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32.

[0044] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 73, o un análogo o derivado del mismo que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de la región variable de la cadena pesada.

[0045] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo de la SEQ ID NO: 18 es la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 73.

[0046] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende la región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 75, o un análogo de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de región variable de cadena ligera.

[0047] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo de la SEQ ID NO: 26 es la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 75.

[0048] De acuerdo con una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 73, y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 75, o un análogo de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y/o pesada.

[0049] La invención también abarca el anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse con alta afinidad a un epítopo dentro de la proteína de PVR humana a la que se une mAb 7D4.

[0050] Según otras formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado comprende las secuencias de CDR de un anticuerpo monoclonal denominado 5B9 (o hPVR.09), a saber, las tres secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 77 y las tres secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 79.

[0051] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado comprende las secuencias de región de determinación de complementariedad (CDR) contenidas en la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 34 y las tres secuencias de CDR contenidas en la secuencia de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0052] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84).

[0053] De acuerdo con ciertas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpos comprende: (i) CP CDR1 comprende la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84); (ii) CP CDR2 comprende la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); y (iii) CP CDR3 comprende la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40).

[0054] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia WASSRHN (SEQ ID NO: 46). Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

[0055] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85).

[0056] De acuerdo con ciertas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpos comprende: (i) CL CDR1 comprende la secuencia de KASQDv Gt AV (SEQ ID NO: 85); (ii) CL CDR2 comprende la secuencia: w As SRHN (SEQ iD NO: 46); y (iii) CP CDR3 comprende la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

[0057] De acuerdo con formas de realización adicionales, CL CDR2 comprende la secuencia indicada en SEQ ID NOs: 46, 56, 57, 58, 59, 60, o 61. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0058] De acuerdo con algunas formas de realización específicas el anticuerpo o fragmento monoclonal aislado comprende la secuencia de CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia: GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36), CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia: KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44), CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48), o análogos de la misma que comprenden no más del 5% de sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos en la secuencia HVR.

[0059] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento que consiste en: CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 84, CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 38, CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia establecida en SEQ ID NO: 40, CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 85, CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID NO: 46, y CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID NO: 48.

[0060] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento que consiste en: CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 84, CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 38, CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 40, CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ iD NO: 44 o SEQ ID NO: 85, CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61; y CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 48. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0061] Según algunas formas de realización, el anticuerpo aislado monoclonal o fragmento del mismo comprende la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 77, o un análogo o derivado del mismo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de región variable de cadena pesada

[0062] Según algunas formas de realización, el análogo de SEQ ID NO: 34 es una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 77.

[0063] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 79, o un análogo de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de la región variable de la cadena ligera.

[0064] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo de la SEQ ID NO: 42 es la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 79.

[0065] De acuerdo con una forma de realización específica, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 77, y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 79, o un análogo de la misma que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y/o pesada.

[0066] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34, y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54; o un análogo del mismo que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera y/o pesada. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención. La invención también abarca un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse con alta afinidad a un epítopo dentro de la proteína PVR humana a la que se une mAb 5B9.

[0068] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo reconoce PVR humano con una afinidad de al menos 10-8 M. Según otras formas de realización, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con una afinidad de 10-8 M, 5X10-9 M, 10-9 M, 5X10-10 M, 10-10 M, 5X10-11 M o incluso superior a PVR humano. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0069] Los análogos y derivados de los anticuerpos mAb aislados y los fragmentos de anticuerpos descritos anteriormente también están dentro del alcance de la invención. En algunas formas de realización, análogos particulares o mAb aislados o fragmentos de los mismos que comprenden al menos una región variable establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34 y 42 también están dentro del alcance de la presente invención. Los mAb aislados o fragmentos de los mismos que comprenden al menos una región variable establecida en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 69, 71,73, 75, 77 y 79 también están dentro del alcance de la presente invención.

[0070] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo análogo tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la región hipervariable de la secuencia de anticuerpo de referencia.

[0071] De acuerdo con ciertas formas de realización, el análogo o derivado del anticuerpo aislado o fragmento de la misma tiene al menos 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con una región variable de la secuencia de anticuerpo de referencia. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0072] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un conjunto de región variable de cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 69, o un análogo que tiene al menos 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia. Según otras formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la invención comprende una región variable de cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 73, o un análogo que tiene al menos un 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia. Según otras formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la invención comprende una región variable de cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 77, o un análogo que tiene al menos un 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia.

[0073] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 71, o un análogo que tiene al menos 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia. Según otras formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 75, o un análogo que tiene al menos un 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia. Según otras formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 79, o un análogo que tiene al menos un 95% de similitud de secuencia con dicha secuencia.

[0074] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde: (i) la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 10; (ii) la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 18 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 26; o (iii) la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 34 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 42. También se incluyen análogos de los anticuerpos o fragmentos, que tienen al menos un 95% de similitud de secuencia con dichas cadenas pesadas o ligeras.

[0075] Según otras formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde: (i) la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 69 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 71; (ii) la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 73 y la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 75; o (iii) la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 77 y la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 79. También se incluyen análogos de los anticuerpos o fragmentos, que tienen al menos un 95% de similitud de secuencia con dichas cadenas pesadas o ligeras.

[0076] De acuerdo con algunas formas de realización, el análogo tiene al menos 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con regiones variables del anticuerpo de cadena ligera o de cadena pesada descritas anteriormente. Según algunas formas de realización, el análogo comprende no más de una sustitución, deleción o adición de aminoácidos a una o más secuencias de CDR de la región hipervariable, es decir, cualquiera de las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 4, 6, 8., 12, 14, 16, 20, 22, 24, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 44, 46, 48, 80, 81,82, 83, 84 y 85. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención. Según algunas formas de realización, la sustitución de aminoácidos es una sustitución conservadora.

[0077] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región hipervariable (HVR) que tiene regiones de cadena ligera y pesada definidas anteriormente, en donde 1,2, 3, 4, o 5 amino ácidos se sustituyeron, eliminaron y/o adicionaron. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0078] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una HVR que tiene regiones de cadena ligera y pesada definidas anteriormente, en donde fue sustituido un aminoácido. Según formas de realización específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDR como se definió anteriormente, en donde se sustituyó un aminoácido. Según algunas formas de realización específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDR2 de cadena ligera como se definió anteriormente, en donde se sustituyó un aminoácido.

[0079] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera CDR2 que tiene una secuencia indicada en SEQ ID NO: 55 (WASSRHX), en donde X se selecciona del grupo que consiste en A, R, D, E, P y T. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0080] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-61.

[0081] Según algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de anticuerpo comprende un conjunto de CDR seleccionado de entre el grupo que consiste en:

i. un conjunto de CDR de seis CDR en donde: CP CDR1 se selecciona de GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36) y SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CP CDR2 es EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CP CDR3 es TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CL CDR1 se selecciona de KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44) y KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CL CDR2 se selecciona del grupo que consta de: WASSRHN (SEQ ID nO: 46), WASSRHA (SEQ ID NO: 56), WASSRHR (SEQ ID NO: 57), WASSRHD (SEQ ID NO: 58), WASSRHE (SEQ ID NO: 57) NO: 59), WASSRHP (SEQ ID NO: 60) y WASSRHT (SEQ ID NO: 61); y CL CDR3 es QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48). ii. un conjunto de CDR de seis CDR en donde: la secuencia de CP CDR1 se selecciona de GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) y RYWMT (SEQ ID NO: 80); CP CDR2 se selecciona de EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6) y EIHPDSSKINYTPSQKD (SEQ ID NO: 81); CP CDR3 se selecciona de PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8) y PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82); CL CDR1 es KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12); CL CDR2 es WASTRHT (SEQ ID NO: 14); y CL CDR3 es QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16).

iii. un conjunto de CDR de seis CDR en donde: la secuencia de CP CDR1 se selecciona de GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20) y EYTMH (SEQ ID NO: 83); CP CDR2 es GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); CP CDR3 es VIPLEY (SEQ ID NO: 24); CL CDR1 es KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28); CL CDR2 es SASYRYR (SEQ ID NO: 30); y CL CDR3 es QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).

[0082] La presente invención proporciona de este modo un anticuerpo monoclonal que se une específicamente la proteína PVR humano, o un fragmento de unión de la misma, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento comprende un conjunto de seis secuencias de CDR en donde el conjunto se selecciona del grupo que consiste en:

i. SEQ ID NO. 4, 6, 8, 12, 14 y 16;

ii. SEQ ID NO. 20, 22, 24, 28, 30 y 32;

iii. SEQ ID NO. 36, 38, 40, 44, 46 y 48;

iv. SEQ ID NO. 36, 38, 40, 44, 55 y 48;

v. SEQ ID NO. 80, 81,82, 12, 14 y 16;

vi. SEQ ID NO. 83, 22, 24, 28, 30 y 32;

vii. SEQ ID NO. 84, 38, 40, 85, 46 y 48; y

viii. SEQ ID NO. 84, 38, 40, 85, 55 y 48.

[0083] La presente invención también proporciona anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión de los mismos, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dichas cadenas comprenden un conjunto de secuencia de región variable de cadena pesada y secuencia de región variable de cadena ligera, seleccionándose dicho conjunto del grupo que consiste en:

i. SEQ ID NO: 2 y 10;

ii. SEQ ID NO: 69 y 71;

iii. SEQ ID NO: 18 y 26;

iv. SEQ ID NO: 73 y 75;

v. SEQ ID NO: 34 y 42; y

vi. SEQ ID NOs: 77 y 79.

[0084] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de inhibir la unión de PVR humano a TIGIT expresado en células T o células NK.

[0085] De acuerdo con una forma de realización específica, el mAb se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpo quimérico, y un fragmento de anticuerpo que comprende al menos la porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Según formas de realización específicas, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Según aún otras formas de realización, el anticuerpo quimérico comprendía la región constante humana. Según aún otras formas de realización, el anticuerpo monoclonal quimérico comprende la región constante de IgG1 humana. Según una forma de realización específica, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: Fab, Fab’, F(ab')2, Fd, Fd’, Fv, dAb, región CDR aislada, anticuerpo monocatenario (scab), "diacuerpos” y “anticuerpos lineales”. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0086] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de marco seleccionada del grupo que consiste en: IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, y IgG4 humana. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0087] De acuerdo con algunas formas de realización, se proporciona un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo como se describe anteriormente.

[0088] De acuerdo con algunas formas de realización, el conjugado comprende una proteína portadora.

[0089] Las secuencias de polinucleótidos que codifican anticuerpos monoclonales, que tienen alta afinidad y especificidad por PVR, así como vectores y células huésped que portan estas secuencias de polinucleótidos, se proporcionan de acuerdo con otro aspecto de la presente invención.

[0090] De acuerdo con algunas formas de realización, se proporcionan las secuencias de polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de región variable de CP y de región variable de CL descritas anteriormente.

[0091] Según algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o una cadena capaz de unirse a un epítopo dentro de la proteína PVR humana a la que se une: (i) un anticuerpo monoclonal (en adelante identificado como 4E5) que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10; (ii) un anticuerpo monoclonal (identificado aquí como 7D4) que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26; o (iii) un anticuerpo monoclonal (en adelante identificado como 5B9) que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.

[0092] Según algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 69. Según algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótidos codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 71.

[0093] Según otras formas de realización, la secuencia de polinucleótido codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o la cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 73. De acuerdo con formas de realización adicionales, la secuencia de polinucleótido codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o la cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 75.

[0094] Según otras formas de realización, la secuencia de polinucleótido codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 77. Según formas de realización adicionales, la secuencia de polinucleótidos codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cadena que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 79.

[0095] De acuerdo con todavía algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido de acuerdo con la invención codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o cadena que comprende las seis secuencias de CDR: (i) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia: GFDfSrYW (SEQ ID NO: 4) o RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYNSYPLA (SeQ ID NO: 32); o (iii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPLT (SeQ ID NO: 48).

[0096] De acuerdo con algunas formas de realización, las secuencias de polinucleótidos definidas anteriormente codifican una molécula seleccionada del grupo que consiste en: un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende al menos una porción de unión al antígeno, y un conjugado de anticuerpo que comprende dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0097] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 68, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0098] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 72, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0099] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 76, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0100] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 70, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0101] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 74, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0102] De acuerdo con algunas formas de realización, la secuencia de polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 78, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia.

[0103] La presente invención proporciona, de acuerdo con algunas formas de realización, un polipéptido que comprende al menos una secuencia codificada por al menos una secuencia de polinucleótido descrita anteriormente.

[0104] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una cadena de anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la presente invención. Según algunas formas de realización, la construcción de ácido nucleico es un plásmido.

[0105] De acuerdo con algunas formas de realización, el plásmido comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 33.

[0106] De acuerdo con algunas formas de realización, el plásmido comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, o SEQ ID NO: 76.

[0107] De acuerdo con otras formas de realización, el plásmido comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 41.

[0108] De acuerdo con otras formas de realización, el plásmido comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en la SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, o SEQ ID NO: 78.

[0109] En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una célula de hibridoma capaz de producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende las secuencias de CDR específicas y/o las regiones variables de cadena ligera y pesada específicas definidas anteriormente.

[0110] De acuerdo con algunas formas de realización, se proporciona una célula de hibridoma que comprende al menos una secuencia de polinucleótido descrita anteriormente.

[0111] De acuerdo con algunas formas de realización, el hibridoma es capaz de producir un anticuerpo monoclonal que comprende las seis secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR): (i) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) o RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SeQ ID NO: 6), c Dr 3 de cadena pesada que tiene la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASq Dv GTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: GIDPNNGGt Ny NQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQNVYTn Va (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: SASYRYR (s Eq ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); o (iii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIFPGs Gr INFn Ek FKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAV (Se Q ID NO: 85), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

[0112] Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención pueden estar unidos a un resto citotóxico, un resto radiactivo, o un resto identificable.

[0113] La presente invención proporciona, según otro aspecto, una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugados de los mismos, que reconoce PVR con alta afinidad y especificidad, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéutico aceptable, diluyente, sal o portador.

[0114] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que es capaz de unirse a un epítopo dentro de la proteína PVR humana a la que se une un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: (i) un anticuerpo identificado en el presente documento como 4E5 (también denominado PVR.07), que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10; (ii) un anticuerpo identificado en el presente documento como 7D4 (también denominado PVR.01) que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26; y (ii) un anticuerpo en el presente documento identificado como 5B9 (también denominado PVR.09) que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.

[0115] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende las seis CDR: (i) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) o RYWMT (SEQ ID NO: 80, CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQNVY TNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: SASYRYR (s Eq ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); o (iii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia SNYWIE (SeQ ID NO: 84), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

[0116] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 77. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0117] Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 79. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0118] De acuerdo con una forma de realización específica, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 69 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 71.

[0119] De acuerdo con una forma de realización específica, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 73 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 75.

[0120] De acuerdo con una forma de realización específica, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 77 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 79.

[0121] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende una combinación de al menos dos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, que reconocen la PVR humana.

[0122] De acuerdo con todavía otras formas de realización, la composición farmacéutica comprende un mAb o fragmento que se une específicamente PVR según la invención, y un mAb o fragmento que se une específicamente a un antígeno diferente, tal como, receptor de células, antígeno tumoral o proteína inmunomoduladora.

[0123] También se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de acuerdo con la invención, para su uso en la restauración de la citotoxicidad de NK mediante la inhibición de la unión de PVR a TIGIT expresado en las células NK.

[0124] Según algunas formas de realización, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo es capaz de inhibir la unión de PVR humano a TIGIT expresado en células T.

[0125] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es para su uso en la inmunoterapia del cáncer o en la mejora de la respuesta inmunitaria.

[0126] El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer que expresa PVR. Según algunas formas de realización, el cáncer sobreexpresa PVR.

[0127] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, el cáncer es un cáncer metastásico. Según algunas formas de realización, la composición farmacéutica según la presente invención se utiliza para inhibir la formación o distribución de metástasis o reducir el número total de metástasis en un sujeto.

[0128] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer cervical, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un cáncer de tiroides, un cáncer de próstata, un cáncer de cerebro, un cáncer de riñón, un cáncer de garganta, un carcinoma de laringe, un cáncer de vejiga, un cáncer de hígado, un fibrosarcoma, un cáncer de células endometriales, un glioblastoma, un sarcoma, un mieloide, una leucemia y un linfoma. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0129] De acuerdo con algunas formas de realización, el cáncer es un cáncer sólido. Según algunas formas de realización específicas, el cáncer sólido se selecciona del grupo que consiste en melanoma (piel), cáncer de pulmón, colon, mama, útero y renal. Según formas de realización específicas, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón y liposarcoma.

[0130] Según otras formas de realización, el cáncer es cáncer hematológico. Según algunas formas de realización, el cáncer hematológico es leucemia mieloide, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple o síndrome mielodisplásico. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención. Según determinadas formas de realización, el cáncer es leucemia. Según formas de realización específicas, el cáncer es leucemia mieloide aguda (LMA).

[0131] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es para uso en el tratamiento de una infección viral.

[0132] Según algunas formas de realización, la infección viral es causada por un virus que se une una célula diana a través de un PVR en una superficie de la célula infectada.

[0133] De acuerdo con algunas formas de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la angiogénesis relacionada. Según determinadas formas de realización, la enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, enfermedades proliferativas de células del ojo (enfermedades oculares), trastornos de la retina y enfermedad inflamatoria. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0134] De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la unión de PVR humano a al menos un ligando mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo definido anteriormente.

[0135] Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para mejorar la respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo definido anteriormente.

[0136] De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado del mismo, que reconoce PVR humano con alta afinidad y especificidad y capaz de inhibir su unión a su ligando.

[0137] De acuerdo con algunas formas de realización, el anticuerpo en la composición farmacéutica administrada se selecciona del grupo que consiste en: (i) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 2 y las secuencias de CDR contenidas en región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 10; (ii) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada indicada en SEQ ID NO: 18 y las secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 26; o (iii) un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena pesada indicada en la SEQ ID NO: 34 y las secuencias de CDR contenidas en la región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 42.

[0138] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal en la composición farmacéutica administrada comprende: CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) y RYWMT (SEQ ID NO: 80); CDR2 de cadena pesada comprende la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82); CDR1 de cadena ligera comprende la secuencia: KASQDVg Ta VT (SEQ ID NO: 12); CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14); y CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16). Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0139] Según otras formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal en la composición farmacéutica administrada comprende: CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia de EYTMH (SEQ ID NO: 83); CDR2 de cadena pesada comprende la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24); CDR1 de cadena ligera comprende la secuencia: KASQNVYTNVA (SeQ ID NO: 28); CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia: SASYRYR (SEQ ID NO: 30); y CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).

[0140] Según otras formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal en la composición farmacéutica administrada comprende: CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia de SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CDR2 de cadena pesada comprende la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CDR1 de cadena ligera comprende la secuencia: KAs QdVGTAV (SeQ ID NO: 85); CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46); y CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

[0141] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz resulta en una disminución en el tamaño del tumor o en el número de metástasis en el sujeto.

[0142] Según algunas formas de realización, el método de tratamiento del cáncer comprende la administración o la realización de al menos una terapia adicional anti-cáncer. Según determinadas formas de realización, la terapia anticancerosa adicional es cirugía, quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia.

[0143] De acuerdo con algunas formas de realización, el método de tratamiento de cáncer comprende la administración de un anticuerpo monoclonal que reconoce PVR humano con alta afinidad y especificidad y un agente anti-cáncer adicional. Según algunas formas de realización, el agente anticanceroso adicional se selecciona del grupo que consiste en: inmunomodulador, linfocito activado, inhibidor de quinasa y agente quimioterapéutico.

[0144] Según otras formas de realización, el inmunomodulador adicional es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo que se une a un antígeno distinto de PVR humano.

[0145] De acuerdo con algunas formas de realización, el inmuno-modulador adicional es un anticuerpo contra una molécula de puesto de control inmunológico. Según algunas formas de realización, el inmunomodulador adicional es un anticuerpo contra una molécula de punto de control inmunitario seleccionada del grupo que consiste en la proteína de muerte celular programada humana 1 (PD-1), PD-L1 y PD-L2, molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario. 1 (CEACAM1), gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), CD137, OX40 (también denominado CD134), receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), TIGIT y cualquier combinación de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0146] De acuerdo con algunas formas de realización, el agente anti-cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en: Erbitux, citarabina, fludarabina, fluorouracilo, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, gemcitabina, vincristina, vinblastina, vinorelbina, carmustina, lomustina, clorambucilo, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, ifosfamida, mecloretamina, melfalán, tiotepa, dacarbazina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etopósido, tenipósido y cualquier combinación de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0147] De acuerdo con algunas formas de realización, el agente anti-cáncer es el inhibidor de receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Según algunas formas de realización, el inhibidor de EGFR se selecciona del grupo que consiste en: Cetuximab (Erbitux®), Panitumumab (Vectibix®) y necitumumab (Portrazza®). Según algunas formas de realización, el inhibidor de EGFR es Cetuximab (Erbitux®).

[0148] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, el sujeto es un sujeto humano.

[0149] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, el uso comprende además el uso de un agente que regula a la baja la actividad o expresión de un receptor co-inhibidor inmunitario.

[0150] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, la célula inmunitaria es una célula T.

[0151] De acuerdo con algunas formas de realización de la invención, el receptor co-inhibidor inmunitario se selecciona del grupo que consiste en PD-1, TIGIT, DNAM-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4, CD96, BY55, LAIR1, SIGLEC10 y 2B4. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0152] Según un aspecto, la presente invención proporciona un método para modular la función del sistema inmunitario y/o que comprende la modulación de la actividad de la unión de PVR a TIGIT usando un anticuerpo de acuerdo con la invención.

[0153] Según un aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir o tratar una infección viral de un virus que utiliza CD155 como un receptor de entrada, en un sujeto en necesidad del mismo, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti PVR descrito en el presente documento. Según algunas formas de realización, el virus se selecciona del grupo que consiste en: virus de la poliomielitis, virus coxsackie, adenovirus y virus de la deficiencia humana (VIH).

[0154] De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno de la angiogénesis relacionada. Según determinadas formas de realización, la enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, enfermedades proliferativas de células del ojo (enfermedades oculares), trastornos de la retina y enfermedad inflamatoria. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0155] De acuerdo con algunas formas de realización, el método de tratamiento de cáncer implica la prevención o reducción de la formación, el crecimiento o la propagación de metástasis en un sujeto mediante la inhibición de la angiogénesis.

[0156] Según un aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico o pronóstico de cáncer o enfermedad infecciosa en un sujeto, comprendiendo el método la determinación del nivel de expresión de PVR en una muestra biológica de dicho sujeto usando al menos un anticuerpo como se describe aquí.

[0157] La presente invención comprende además, de acuerdo con otro aspecto, un método para determinar o cuantificar la expresión de PVR, comprendiendo el método poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y midiendo el nivel de formación de complejos, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia: GFDFSRYW (SEQ ID nO: 4) o RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYNSYPLA (SeQ ID NO: 32); o (iii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPLT (SeQ ID NO: 48).

[0158] Los métodos de determinación y cuantificación se pueden realizar in vitro o ex vivo de acuerdo con algunas formas de realización o se pueden usar en el diagnóstico de condiciones asociadas con la expresión de PVR. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también se pueden usar para configurar métodos de cribado. Por ejemplo, se puede construir un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA) para medir niveles de polipéptido secretado o asociado a células usando los anticuerpos y métodos conocidos en la técnica.

[0159] Según algunas formas de realización, el método para detectar o cuantificar la presencia de PVR comprende las etapas de:

i. incubar una muestra con un anticuerpo específico para PVR o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende al menos una porción de unión a antígeno;

ii. detectar el PVR unido usando una sonda detectable.

[0160] Según algunas formas de realización, el método comprende además las etapas de:

iii. comparar la cantidad de (ii) con una curva estándar obtenida de una muestra de referencia que contiene una cantidad conocida de PVR; y

iv. calcular la cantidad de PVR en la muestra a partir de la curva estándar.

[0161] Según algunas formas de realización particulares, la muestra es un fluido corporal.

[0162] De acuerdo con algunas formas de realización, el método se realiza in-vitro o ex-vivo.

[0163] Un kit para medir la expresión de PVR en la muestra biológica también se proporciona que comprende al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRs) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) o RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: GIDPNNGGt Ny NQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQNVYt Nv A (SEQ ID NO: 28), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); o (iii) CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia: KASQdVg TAV (SeQ ID NO: 85), CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) y CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia: QQYSRYPLT (SeQ ID NO: 48).

[0164] Según un aspecto, la presente invención proporciona un kit para la detección de cáncer, el kit de diagnóstico comprende un anticuerpo o fragmento del mismo como se describe aquí.

[0165] De acuerdo con algunas formas de realización, la invención proporciona un método de diagnóstico, evaluación de la gravedad o estadificación de una enfermedad de tipo inmunitario o una enfermedad proliferativa que comprende la determinación de la expresión o actividad de PVR en una muestra de un sujeto usando un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un fragmento o conjugado de la misma, y comparar la expresión o actividad de PVR con una cantidad de referencia de expresión o actividad de PVR. Dicha cantidad de referencia puede obtenerse de una muestra tomada de un sujeto normal, del mismo sujeto mientras se encuentra en un paso diferente de la enfermedad o se determina a partir de datos clínicos de una gran población de sujetos.

[0166] Otras formas de realización y el alcance completo de aplicabilidad de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada dada a continuación. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0167]

Las Figuras 1A-1C son gráficos que representan la correlación de los niveles de expresión de ARNm de PVR (alto o bajo según se indica) con la probabilidad de supervivencia. La correlación se midió para cáncer de pulmón (FIG. 1A), cáncer de mama (FIG. 1B) y liposarcoma (FIG. 1C). Se obtuvieron conjuntos de datos de expresión de ARNm del sitio GEO y se analizaron utilizando la página bioprofiling.de, de la siguiente manera: para el conjunto de datos de cáncer de pulmón de GEO ID: GSE31210, para cáncer de mama, conjunto de datos GEO ID: GSE25055 y para liposarcoma, conjunto de datos GEO ID: GSE30929.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de la expresión del receptor en células inmunitarias y tumorales. TIGIT se refiere a un receptor co-inhibidor en muchas células inmunitarias (p. ej., células T); DNAM-1 (también denominado CD226) se refiere a un receptor de activación en muchas células inmunitarias (p. ej., células T); El receptor Fc se refiere al receptor de activación fuerte que se expresa principalmente en las células NK, pero también en las células mieloides, incluidos los neutrófilos y los macrófagos; PVR se refiere a un ligando inhibidor de TIGIT (unión más débil a DNAM-1), expresado por muchas células tumorales; Nectina-2 se relaciona con un ligando activador para DNAM-1 (reconocimiento marginal por TIGIT), expresado por muchas células tumorales. La unión de anti-PVR según la presente invención muestra un efecto doble: 1) potenciar la destrucción de células tumorales mediante receptores Fc; y 2) aumentar la activación de las células inmunitarias al bloquear la interacción con TIGIT.

Las Figuras 3A-3D. son gráficos que representan el análisis FACS de los cuatro anticuerpos anti-PVR generados. Se muestra la eficacia de los anticuerpos para bloquear la unión directa de TIGIT-Fc a una línea de células tumorales. La Figura 3A ilustra un anticuerpo anti-PVR no bloqueante (anticuerpo anti-PVR mAb 2G3, también denominado hPVR,17). Las Figuras 3B-3D muestran que tres de los anticuerpos generados, a saber, 5B9 (también denominado hPVR.09), 7D4 (también denominado hPVR.01) y 4E5 (también denominado hPVR.07), respectivamente, son mAbs bloqueantes de anti-PVR como se muestra por bloqueo de la unión de TIGIT-Ig. Se añadieron sopas de hibridomas (5 gl de/pocillo) a las células HepG2. Se usó TIGIT-Fc a 2 gg/pocillo hasta una concentración final de 20 gg/ml y los niveles de TIGIT unido a células se midieron mediante FACS después de la agregacion de anti-Fc Ab marcado con fluorescencia. Los histogramas llenos representan la tinción de fondo por el reactivo anti-Fc.

La Figura 4 es un gráfico que muestra cómo el bloqueo de las interacciones PVR-TIGIT con el anticuerpo antiPVR mAb 7D4 (también denominado hPVR.01) mejora la destrucción de las células NK de la línea celular humana MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama). La destrucción específica se calcula basándose en la secreción de [35S]-metionina de las células diana. El control (Ctrl) es IgG de ratón no relacionado. Valor de p = 0,0056.

La Figura 5 es un gráfico que muestra que el bloqueo de las interacciones PVR-TIGIT usando el anti-PVR mAb 4E5 (también denominado hPVR.07) mejora la destrucción de las células NK de la línea celular cancerosa humana HepG2 (carcinoma hepatocelular). No destrucción de HepG2 sin mAb; anti-PVR 4E5 - destrucción de HepG2 con anti-PVR 4E5mIgG1 de ratón (sin activación del receptor Fc humano); anti-PVR 4e5hIgG1 -destrucción de HepG2 con anti-PVR 4E5-hIgG1 (activación del receptor Fc humano), Erbitux (PC)-un mAb Erbitux de control positivo (anti-EGFR). Todos los mAb se usaron a 10 |ug/ml. Valores de P: anti-PVR 4E5 - 0,04, anti-PVR 4e5hIgG1 - 0,000746 y Erbitux (control positivo) - 0,003219.

Las Figuras 6A-6O son gráficos que representan que las líneas de células tumorales humanas expresan PVR y Nectina-2. Las células de melanoma (FIGS. 6A-E), células de cáncer de mama (FIGS. 6F-H), células colorrectales (FIG. 6I), células renales (FIG. 6J), células de cáncer de pulmón (FIG. 6K), células de cáncer de próstata (FIG. 6L), células del tumor cerebral (FIG. 6M) y las células de carcinoma hepatocelular (FIGS. 6N-O) expresan PVR y Nectina-2. Se utilizaron mAb a 0,2 |ug/pocillo: un mAb anti-Nectina-2 comercial y el anti-PVR mAb 4E5 (también denominado hPVR.07).

Las Figuras 7A-7C son gráficos de análisis FACS que muestran que PVR es el ligando TIGIT principal. La Figura 7A ilustra que las células HepG2 (células de carcinoma hepatocelular humano) expresan PVR y Nectina-2. La Figura 7B ilustra que el anti-PVR mAb 4E5 purificado (también denominado hPVR.07) (0,15 mg) bloquea casi completamente (por encima del 97%) la unión de TIGIT-Ig (2 mg/ml), a pesar de que estas células también expresan Nectina-2. La Figura 7C ilustra que las células CHO expresan niveles elevados de hNectina-2. La Figura 7D muestra la falta de tinción de las mismas células CHO que en la Figura 7C por todos los mAbs de PVR, lo que significa que no hay un reconocimiento directo de Nectina-2 por los mAbs anti-PVR y, por lo tanto, el bloqueo de la unión de TIGIT visto en la Figura 7B no puede ser explicado por el bloqueo de Nectina-2, sino que es el resultado de un bloqueo directo de PVR.

Las Figuras 8A-8C representan una eficacia de unión similar de todos los anti-PVR mAb a PVR humano. Los tres clones de bloqueo generan una unión similar (menos del 10% de diferencia) tanto a las células PVR HepG2 endógenas (FIG. 8A) como a las células hPVR B16-hPVR sobreexpresadas (FIG. 8B). La unión también se examinó usando la línea celular Vero de mono verde africano (FIG. 8C) que expresa una proteína PVR con un 93% de similitud con PVR humano. En este caso, los diferentes Abs mostraron intensidades de tinción diferenciales. 0,2 mg de cada mAb utilizado en todos los casos.

La Figura 9 es un gráfico que muestra que los anticuerpos anti-PVR de la invención no reconocen la PVR canina. El TIGIT-Fc humano (10 mg/ml) presenta una fuerte reacción cruzada y se une a la línea celular MDCK canina. Ninguno de los mAb de PVR fue capaz de unirse a estas células, lo que sugiere que no reconocen el PVR canino.

Las Figuras 10A-10D representan que Nectina-2 se une preferentemente a DNAM-1 y no a TIGIT. Las células que sobreexpresan PVR o Nectina2 se tiñeron usando las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 10A ilustra la unión de TIGIT-Fc a células que expresan Nectina2; la Figura 10B ilustra la unión de DNAM-Fc a células que expresan Nectina-2. La Figura 10C ilustra la unión de TIGIT a células que expresan PVR. La Figura 10D ilustra la unión de DNAM-1 a células que expresan PVR.

La Figura 11 muestra el efecto de los anticuerpos anti-PVR sobre la proliferación de células T. Las PBMC humanas se marcaron con CFSE y se incubaron con células diana en presencia de los anticuerpos indicados. Los resultados se presentan como una proliferación multiplicada por aumento en relación con el control. Los resultados son de 7 experimentos combinados en total de 10 donantes sanos. Valores P: para mAb 4E5 -0,000241, para mAb 5B9 - 1,96E-05, para anti PD-1 - 0,016303, para anti CTLA4 - 0,000171 y para 4E5hIgG1 -0,008176.

La Figura 12 muestra el efecto combinado de los anticuerpos anti-PVR y otros anticuerpos sobre la proliferación de células T. Las PBMC humanas se marcaron con CFSE y se incubaron con células diana en presencia de la combinación indicada de anticuerpos. Los resultados se presentan como una proliferación multiplicada por aumento en relación con el control. Los resultados son 7 experimentos independientes con 12 donantes sanos. Valores de P: anti PD1+anti CTLA - 47,54E-03, anti PD-1+4E5 - 7.02E-02, anti PD-1+5B9 - 1,11 E-04, anti CTLA4+4E5 - 1,37E-03, anti CTLA4+5B9 - 5,47E-06.

La Figura 13 representa el efecto específico de los anticuerpos anti-PVR sobre la proliferación de células T CD8. Las PBMC humanas se marcaron con CFSE y se incubaron con células diana (A549) en presencia de los anticuerpos indicados. Las células CD8 positivas se contaron mediante FACS después de 9-12 días en cultivo. Los resultados se presentan como una proliferación multiplicada por aumento en relación con el control. Los resultados son de 2 experimentos independientes utilizando donantes de PBMC sanos.

La Figura 14 representa la proporción de células CD8 a células CD4 después de la inducción con diferentes anticuerpos. Las PBMC humanas se marcaron con CFSE y se incubaron con células diana (A549) en presencia de los anticuerpos indicados. Las células se contaron después de 9-12 días en cultivo. Los resultados son de 2 experimentos agrupados en total de 2 donantes sanos.

La Figura 15 muestra el efecto de los anticuerpos anti-PVR sobre la desgranulación de NK. Se incubaron células NK humanas con células MDAMB-231 (línea celular de cáncer de mama triple negativo) en presencia de los anticuerpos indicados. Los resultados son representativos de 7 experimentos independientes realizados con 5 donantes diferentes de células NK sanas. Valores de P: PVR4E5 - 0,005063, PVR5B9 - 0,00374, PVR7D4 -0,019448, PVR4E5-hIgG1 - 2.03E-05, PVR5B9-hIgG1 - 1,45E-05, PVR7D4- hIgG1 5,8E-05.

Las Figuras 16A-16D muestran el efecto de los anticuerpos anti-PVR sobre la supervivencia de las células tumorales en ausencia de células inmunitarias. La supervivencia de las células A549 (FIG. 16A), las células U373 (FIG. 16B), las células HCT116 (FIG. 16C) y Mel-624 (FIG. 16D) se examinó utilizando el ensayo de supervivencia de células MTT en presencia de 50 microgramos/ml del mAb indicado durante 24 horas. La significancia se calcula mediante una prueba TTEST de Student de una sola cola, *<0,05, **<0,03 y ***<0,02.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0168] La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales específicos para el receptor de poliovirus humano (PVR). La invención también proporciona la producción y el uso de mAb como agentes terapéuticos. En particular, los mAb de la presente invención pueden usarse, solos o en combinación con otros agentes, para restaurar y aumentar la actividad antitumoral de las células inmunitarias y como reactivos de diagnóstico.

[0169] El término "antígeno" tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de inducir la formación de anticuerpos y de ser unida específicamente por un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. La unión específica mencionada anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos. Un antígeno según algunas formas de realización de la presente invención es una proteína PVR.

[0170] El término "PVR" tal como se utiliza aquí, se refiere al receptor de poliovirus, también conocido como CD155 (grupo de diferenciación 155). El PVR es una glicoproteína transmembrana con una secuencia señal N-terminal, tres dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina (Ig), un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. Tiene un tamaño molecular de aproximadamente 80 kDa y una estructura compuesta por tres dominios similares a Ig, específicamente un dominio similar a V más externo seguido de dos dominios similares a C2. Un PVR ejemplar según la invención se expone en los números de acceso de GenBank: NP_001129240,1, NP_001129241,1, NP_001129242,2 y NP_006496,4. Estos receptores de poliovirus comparten la secuencia del dominio extracelular y, por lo tanto, pueden ser dirigidos por el resto de unión por afinidad de la invención.

[0171] El término "determinante antigénico" o "epítopo", como se usa aquí se refiere a la región de una molécula de antígeno que específicamente reacciona con un anticuerpo particular. Pueden usarse secuencias de péptidos derivadas de un epítopo, solas o junto con un resto portador, aplicando métodos conocidos en la técnica, para inmunizar animales y producir anticuerpos policlonales o monoclonales adicionales. Los péptidos aislados derivados de un epítopo pueden usarse en métodos de diagnóstico para detectar anticuerpos.

[0172] Hay que señalar que la afinidad se puede cuantificar utilizando métodos conocidos tales como, resonancia de plasmón superficial (SPR) (descrito en Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. Surface plasmon resonance imaging for affinitybased biosensors. Biosens Bioelectron. Biosens Bioelectron, 2010, 25: 957-66), y se puede calcular usando, p. ej., una constante de disociación, Kd, de modo que un Kd más bajo refleja una afinidad más alta.

[0173] Los anticuerpos o un fragmento de los mismos de acuerdo con la invención se une a un epítopo en HPVR. Específicamente, los anticuerpos se unen a un epítopo dentro de los aminoácidos 1-343 del PVR como se establece en NP_006496,4.

[0174] Los anticuerpos o inmunoglobulinas comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro en una configuración en forma de "Y". La digestión proteolítica de un anticuerpo produce dominios Fv (fragmento variable) y Fc (fragmento cristalino). Los dominios de unión al antígeno, Fab, incluyen regiones en las que varía la secuencia polipeptídica. El término F(ab')2 representa dos brazos Fab' unidos entre sí por enlaces disulfuro. El eje central del anticuerpo se denomina fragmento Fc. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes (C^h). Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V^l) en un extremo y un dominio constante (C^l) en su otro extremo, el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios de las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco, cuyas secuencias están relativamente conservadas, unidas por tres dominios hipervariables conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR 1-3). Estos dominios contribuyen a la especificidad y afinidad del sitio de unión al antígeno.

[0175] La identificación o determinación de CDR a partir de una secuencia variable de cadena ligera o pesada dada se realiza típicamente usando uno de los pocos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, tal determinación se realiza de acuerdo con Kabat (Wu T.T y Kabat E.A., J Exp Med, 1970; 132: 211-50) e Im Gt (Lefranc M-P, et al., Dev Comp Immunol, 2003, 27: 55-77).

[0176] Cuando se utiliza el término "CDR que tiene una secuencia" o un término similar, que incluye opciones en donde la CDR comprende las secuencias especificadas y también las opciones en donde la CDR consiste en la secuencia especificada.

[0177] La especificidad de antígeno de un anticuerpo se basa en la región hiper variable (HVR), es decir, las secuencias de CDR únicas de ambas cadenas ligeras y pesadas que juntos forman el sitio de unión al antígeno.

[0178] El isotipo de la cadena pesada (gamma, alfa, delta, epsilon o mu) determina la clase de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, respectivamente). La cadena ligera es de dos isotipos (kappa, k o lambda, A). Ambos isótopos se encuentran en todas las clases de anticuerpos.

[0179] El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, y fragmentos de anticuerpos lo suficientemente largos como para exhibir la actividad biológica deseada, a saber, la unión a PVR humano.

[0180] El anticuerpo o anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos intactos, tales como anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales (mAb), así como fragmentos proteolíticos de los mismos, tales como los fragmentos Fab o F(ab')2. Los anticuerpos monocatenarios también están dentro del alcance de la presente invención.

Fragmentos de anticuerpos

[0181] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y, por lo tanto, retiene la capacidad de unirse al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab’, que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd’ que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 1989, 341,544-546) que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo monocatenarias (p. ej., Fv monocatenario; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 1988, 85, 5879-5883); (x) "diacuerpos" con dos sitios de unión al antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (ver, p. ej., EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. e E. UU., 1993, 90, 6444-6448); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; y Patente de EE. UU. N2.5.641.870).

[0182] Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el médico experto. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv).

[0183] Los anticuerpos monocatenarios pueden ser polipéptidos compuestos monocatenarios que tienen capacidades de unión a antígenos y que comprenden secuencias de aminoácidos homólogas o análogas a las regiones variables de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, es decir, V^h-V^lenlazado o Fv de cadena sencilla (scFv). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE. UU. N°. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios frente a PVR.

[0184] El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. No se debe interpretar que el modificador "monoclonal" requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método en particular. Los mAb se pueden obtener mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (ver, p. ej., Patente de EE. UU. N°. 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas, p. ej., en Clackson et al., Nature 1991,352, 624-628 o Marks et al., J. Mol. Biol., 1991,222: 581 -597.

[0185] El diseño y desarrollo de moléculas de unión a antígeno monovalentes recombinantes derivadas de anticuerpos monoclonales a través de la rápida identificación y clonación de los genes funcionales variables pesados (VH) y variables ligeros (V^l) y el diseño y la clonación de una secuencia de ADN sintético optimizado para la expresión en bacterias recombinantes se describe en Fields et al. 2013, 8(6): 1125-48.

[0186] Los mAbs de la presente invención pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD. Un hibridoma que produce un mAb puede cultivarse in vitro o in vivo. Pueden obtenerse títulos elevados de mAb mediante producción in vivo en donde se inyectan intraperitonealmente células de los hibridomas individuales en ratones Balb/c con cebado prístino para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones de los mAb deseados. Los mAb se pueden purificar a partir de tales fluidos ascíticos o de sobrenadantes de cultivo, usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0187] También están comprendidos los anticuerpos anti-idiotipo específicamente inmunorreactivos con las regiones hipervariables de un anticuerpo de la invención.

[0188] La invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno (ABD), que comprende tres CDR de una cadena ligera y tres CDR de una cadena pesada, en donde dicho ABD tiene al menos 90% de identidad de secuencia o similitud con un ABD de un anticuerpo monoclonal de ratón que comprende: (i) una cadena variable pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 69 y una cadena variable ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 71 (aquí identificada como 4E5 o hPVR.07); (ii) una cadena variable pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 73 y una cadena variable ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 75 (identificada en el presente documento como 7D4 o hPVR.01); o (iii) una cadena variable pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 77 y una cadena variable ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 79 (identificada en el presente documento como 5B9 o hPVR.09). Dicho anticuerpo puede tener un dominio ABD que tenga al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96, al menos 97, al menos 98, al menos 99% de identidad o similitud de secuencia o 100% de identidad de secuencia con la correspondiente ABD de 4E5, 7D4 o 5B9.

[0189] La identidad de secuencia es la cantidad de aminoácidos o nucleótidos que coinciden exactamente entre dos secuencias diferentes. La similitud de secuencia permite determinar la sustitución conservadora de aminoácidos como aminoácidos idénticos.

[0190] La invención también proporciona variantes de aminoácidos conservadoras de las moléculas de anticuerpo de acuerdo con la invención. También se pueden preparar variantes según la invención que conserven la estructura molecular global de las proteínas codificadas. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales que comprenden los productos proteicos descritos, el experto en la materia reconocerá algunas sustituciones racionales. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, es decir, "sustituciones conservadoras", p. ej., sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. El término "análogo de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo derivado de otro anticuerpo mediante una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

[0191] El término "variante de anticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula que comprende el anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, las proteínas de fusión en las que el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo está unido a otra entidad química se consideran una variante de anticuerpo.

[0192] Los análogos y variantes de las secuencias de anticuerpos también están dentro del alcance de la presente solicitud. Estos incluyen, pero no se limitan a sustitución, inserción y deleción conservadora y no conservadora de aminoácidos dentro de la secuencia. Tal modificación y el análogo o variante de anticuerpo resultante están dentro del alcance de la presente invención siempre que confieran, o incluso mejoren, la unión del anticuerpo al PVR humano.

[0193] Las sustituciones conservadoras de aminoácidos como se conocen por los expertos en la técnica están dentro del alcance de la presente invención. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen el reemplazo de un aminoácido por otro que tiene el mismo tipo de grupo funcional o cadena lateral, p. ej., alifático, aromático, cargado positivamente, cargado negativamente. Estas sustituciones pueden mejorar la biodisponibilidad oral, la penetración y el direccionamiento a poblaciones celulares específicas, inmunogenicidad y similares. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, de acuerdo con una tabla conocida en la técnica, los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

[0194] Debe enfatizarse que las secuencias de la cadena de variante están determinadas por métodos de secuenciación utilizando cebadores específicos. Los diferentes métodos de secuenciación empleados en la misma secuencia pueden dar como resultado secuencias ligeramente diferentes debido a problemas técnicos y cebadores diferentes, particularmente en los terminales de la secuencia. Por lo tanto, a lo largo de la solicitud se especifican diferentes variantes de las secuencias de la cadena variable anti-PVR.

[0195] Los términos "molécula que tiene la parte de unión a antígeno de un anticuerpo" y "fragmentos de unión a antígenos" como se usa en el presente documento están destinados a incluir no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, pero también su fracción reactiva de unión a antígeno, que incluye, entre otros, el fragmento Fab, el fragmento Fab’, el fragmento F(ab')2, la porción variable de sus cadenas pesadas y/o ligeras, mini-anticuerpos Fab (ver, p. ej., WO 93/15210, solicitud de patente de EE. UU. 08/256.790, WO 96/13583, solicitud de patente de EE. UU. 08/817.788, WO 96/37621, solicitud de patente de EE. UU. 08/999.554), y anticuerpos de cadena sencilla que incorporan tal fracción reactiva, así como cualquier otro tipo de molécula en donde se haya insertado físicamente dicha fracción reactiva de anticuerpos. Dichas moléculas pueden proporcionarse mediante cualquier técnica conocida, que incluye, pero no se limita a escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes.

[0196] Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es (son) idéntica(s) u homóloga(s) a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 6851-6855 (1984)). Además, se puede realizar un injerto de región determinante de complementariedad (CDR) para alterar ciertas propiedades de la molécula de anticuerpo, incluida la afinidad o especificidad. Un ejemplo no limitante de injerto de CDR se describe en la patente de EE. UU. 5.225.539.

[0197] Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las cuales diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos que tienen residuos del marco de la región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y CDR sustancialmente de un anticuerpo de ratón (denominado anticuerpo donante) también se denominan anticuerpos humanizados. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para aumentar los rendimientos en la producción, p. ej., cuando los mAb murinos tienen rendimientos más altos de hibridomas pero una mayor inmunogenicidad en humanos, de modo que se usan mAb quiméricos humanos/murinos. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (p. ej., las solicitudes de patente PCT WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 y las patentes estadounidenses 5.693.762. 5.693.761.5.585.089. 5.530.101 y 5.225.539).

[0198] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal quimérico.

[0199] Según algunas formas de realización, el anticuerpo quimérico comprende las regiones constantes derivadas de humanos.

[0200] De acuerdo con algunas formas de realización, las regiones constantes humanas del anticuerpo quimérico se seleccionan del grupo que consiste en: IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, y IgG4 humana.

[0201] Según un modo de realización específico el anticuerpo monoclonal quimérico o fragmento del mismo comprende una subclase de región constante de subtipo de IgG1 humano.

[0202] Según una forma de realización particular, se proporciona un anticuerpo monoclonal quimérico que reconoce PVR que comprende un conjunto de seis CDR seleccionados del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NOs: 4 o 80, 6 o 81, 8 o 82, 12, 14 y 16; (ii) SEQ ID NOs: 20 o 83, 22, 24, 28, 30 y 32; y (iii) SEQ ID NOs: 36 o 84, 38, 40, 44 o 85, 46, y 48.

Farmacología

[0203] En las formulaciones farmacéuticas y de medicamento, el agente activo se utiliza preferiblemente junto con uno o más portador(es) farmacéuticamente aceptable(s) y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El (los) vehículo(s) debe(n) ser farmacéuticamente aceptable(s) en el sentido de ser compatible(s) con los otros ingredientes de la formulación y no indebidamente perjudicial(es) para el receptor de los mismos. El agente activo se proporciona en una cantidad eficaz para lograr el efecto farmacológico deseado, como se describió anteriormente, y en una cantidad apropiada para lograr la exposición deseada.

[0204] Típicamente, los anticuerpos y fragmentos y conjugados de los mismos de la presente invención que comprenden la porción de unión a antígeno de un anticuerpo o que comprenden otro polipéptido que incluye un péptido mimético se suspende en una solución salina estéril para usos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular alternativamente para controlar la liberación del ingrediente activo (molécula que comprende la porción de unión al antígeno de un anticuerpo) o para prolongar su presencia en el sistema de un paciente. Se conocen numerosos sistemas de liberación de fármacos adecuados e incluyen, p. ej., sistemas de liberación de fármacos implantables, hidrogeles, hidroximetilcelulosa, microcápsulas, liposomas, microemulsiones, microesferas y similares. Pueden prepararse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o adsorber la molécula de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(etileno-co-acetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhíd rido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebárico. La velocidad de liberación de la molécula de acuerdo con la presente invención, es decir, de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, a partir de dicha matriz depende del peso molecular de la molécula, la cantidad de molécula dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas.

[0205] La composición farmacéutica de esta invención pueden administrarse por cualquier medio adecuado, tal como por vía oral, tópica, intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraarticular, intralesional, intratumoral o parenteral. Normalmente, la administración intravenosa (iv) se usa para administrar anticuerpos.

[0206] Será evidente para los expertos ordinarios en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de acuerdo con la presente invención dependerá, entre otras cosas, del programa de administración, la dosis unitaria de la molécula administrada, si se administra la molécula en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunológico y la salud del paciente, la actividad terapéutica de la molécula administrada, su persistencia en la circulación sanguínea y el juicio del médico tratante.

[0207] Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, p. ej., evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

[0208] El cáncer susceptible de tratamiento mediante la presente invención incluye, pero no se limita a: carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluido cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón escamoso), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluido el cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluido el linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (LNH); linfocitos pequeños (SL) LNH; LNH de grado intermedio/folicular; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de alto grado; LNH linfoblástico de alto grado; LNH de células pequeñas no escindidas de alto grado; LNH de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs. Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin (LNH), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. Las condiciones cancerosas modificables para el tratamiento de la invención incluyen cánceres metastásicos.

[0209] Según otras formas de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer caracterizado por la sobreexpresión PVR. Los tipos de cáncer relacionados con la sobreexpresión de PVR se pueden identificar utilizando bases de datos conocidas como The Cancer Genome Atlas (TCGA). Según determinadas formas de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical (ACC), carcinoma cromófobo de células renales (KICH), carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC), adenocarcinoma de colon y recto (COAD, READ), adenocarcinoma ductal pancreático (PAAD), feocromocitoma y paraganglioma (PCPG), carcinoma papilar de riñón (KIRP), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma endometrial del cuerpo uterino (UCEC), cáncer de cuello uterino (CESC), melanoma cutáneo (SKCM), mesotelioma (MESO), cáncer de vejiga urotelial (BLCA), carcinoma de riñón de células claras (KIRC), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC), carcinosarcoma uterino (UCS), sarcoma (SARC), cistadenocarcinoma seroso de ovario (VO), carcinoma papilar de tiroides (THCA), glioblastoma multiforme (GBM), cáncer de mama (BRCA), glioma de grado inferior (LGG) y linfoma difuso de células B grandes (DLBC). Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0210] Las moléculas de la presente invención como ingredientes activos se disuelven, dispersan o mezclan en un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo como es bien sabido. Los excipientes adecuados son, p. ej., agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Otros vehículos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH.

[0211] La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar junto con una composición antineoplásica.

[0212] El término "tratamiento" como se usa aquí, se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.

[0213] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen melanoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, cáncer biliar o endometrial.

[0214] Según algunas formas de realización, el método de tratamiento de cáncer comprende administrar la composición farmacéutica como parte de un régimen de tratamiento que comprende la administración de al menos un agente anti cáncer adicional.

[0215] De acuerdo con algunas formas de realización, el agente anti-cáncer se selecciona del grupo que consiste de un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un taxano, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor de la topoisomerasa II, una asparaginasa, un agente alquilante, un antibiótico antitumoral, y combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0216] De acuerdo con algunas formas de realización, el antimetabolito se selecciona de entre el grupo constituido por citarabina, gludarabine, fluorouracilo, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, gemcitabina, e hidroxiurea. Según algunas formas de realización, el inhibidor mitótico se selecciona del grupo que consiste en vincristina, vinblastina y vinorelbina. Según algunas formas de realización, el inhibidor de topoisomerasa se selecciona del grupo que consiste en topotecán e irenotecán. Según algunas formas de realización, el agente alquilante se selecciona del grupo que consiste en busulfán, carmustina, lomustina, clorambucilo, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, ifosamida, mecloretamina, melfalán, tiotepa, dacarbazina y procarbazina. Según algunas formas de realización, el antibiótico antitumoral se selecciona del grupo que consiste en bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitomicina, mitoxantrona y plicamicina. Según algunas formas de realización, la topoisomerasa II se selecciona del grupo que consiste en etopósido y tenipósido. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0217] De acuerdo con algunas formas de realización particulares, el agente anti-cáncer adicional se selecciona del grupo que consiste de bevacizumab, carboplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina, clorhidrato de gemcitabina, hidrocloruro de topotecan, tiotepa, y combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0218] Los anticuerpos monoclonales según la presente invención se pueden usar como parte de la terapia combinada con al menos un agente anti-cáncer. Según algunas formas de realización, el agente anticanceroso adicional es un inmunomodulador, una célula linfocitaria activada, un inhibidor de quinasa o un agente quimioterapéutico.

[0219] De acuerdo con algunas formas de realización, el agente anti-cáncer es un inmuno-modulador, ya sea agonista o antagonista, tal como un anticuerpo contra una molécula de puesto de control inmunológico.

[0220] Se ha demostrado que el bloqueo por inmunoterapia de punto de control es una nueva y emocionante vía para el tratamiento del cáncer. Las vías de los puntos de control inmunológico consisten en una variedad de moléculas coestimuladoras e inhibidoras que trabajan en conjunto para mantener la auto-tolerancia y proteger los tejidos del daño del sistema inmunológico en condiciones fisiológicas. Los tumores se aprovechan de ciertas vías de control para evadir el sistema inmunológico. Por lo tanto, la inhibición de tales vías se ha convertido en una estrategia prometedora de tratamiento contra el cáncer.

[0221] El anticuerpo ipilimumab de linfocito T anti-citotóxico 4 (CTLA-4) (aprobado en 2011) fue el primer agente inmunoterapéutico que mostró un beneficio para el tratamiento de pacientes con cáncer. El anticuerpo interfiere con las señales inhibidoras durante la presentación del antígeno a las células T. El anticuerpo anti-muerte celular programado 1 (PD-1) pembrolizumab (aprobado en 2014) bloquea la señalización reguladora inmunitaria negativa del receptor PD-1 expresado por las células T. Un agente anti-PD-1 adicional fue presentado para aprobación regulatoria en 2014 para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Actualmente, la investigación activa está explorando muchos otros puntos de control inmunológico, entre ellos: CEACAM1, NKG2A, B7-H3, B7-H4, VISTA, CD112R, gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), CD137, OX40 (también conocido como CD134) y receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

[0222] De acuerdo con algunas formas de realización específicas, el inmuno-modulador se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo inhibidor de CTLA-4, una proteína de muerte celular programada anti-humana 1 (PD-1), anticuerpo PD-L1 y PD-L2, un linfocito citotóxico activado, un agente activador de linfocitos, un anticuerpo contra CEACAM, un anticuerpo contra TIGIT y un inhibidor de la vía RAF/MEK. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención. Según algunas formas de realización específicas, el inmunomodulador adicional se selecciona de mAb a PD-1, mAb a PDL1, mAb a PD-L2, mAb a CEACAM1, mAb a CTLA-4, mAB a TIGIT, interleucina 2 (IL-2) o célula asesina activada por linfocinas (LAK).

[0223] Según otras formas de realización, el agente anti-cáncer adicional es un agente quimioterapéutico. El agente de quimioterapia, que podría administrarse junto con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o por separado, puede comprender cualquier agente conocido en la técnica que muestre actividad anticancerosa, incluyendo pero no limitado a: mitoxantrona, inhibidores de topoisomerasa, veneno del huso vincas: vinblastina, vincristina, vinorelbina (taxol), paclitaxel, docetaxel; agentes alquilantes: mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida; metotrexato; 6-mercaptopurina; 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina; podofilotoxinas: etopósido, irinotecán, topotecán, dacarbazina; antibióticos: doxorrubicina (adriamicina), bleomicina, mitomicina; nitrosoureas: carmustina (BCNU), lomustina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina; iones inorgánicos: cisplatino, carboplatino; interferón, asparaginasa; hormonas: tamoxifeno, leuprolida, flutamida y acetato de megestrol.

[0224] De acuerdo con algunas formas de realización, el agente quimioterapéutico se selecciona de agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores relacionados, alcaloides vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-asparaginasa, inhibidor de la topoisomerasa, interferones, complejos de coordinación de platino, urea sustituida con antracenodiona, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, adrenocorticosteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos, andrógenos, antiandrógenos y análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas. Según otra forma de realización, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina (LV), irenotecán, oxaliplatino, capecitabina, paclitaxel y doxetaxel. Pueden usarse uno o más agentes quimioterapéuticos.

[0225] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es para su uso en el tratamiento del cáncer o para el uso en la mejora de la respuesta inmunitaria.

[0226] El término "potenciar la respuesta inmunitaria" se refiere a aumentar la capacidad de respuesta del sistema inmunitario e inducir o prolongar su memoria. La composición farmacéutica según la presente invención puede usarse para estimular el sistema inmunológico tras la vacunación. Por tanto, en una forma de realización, la composición farmacéutica se puede utilizar para mejorar la vacunación.

[0227] En ciertas formas de realización, el cáncer se selecciona a partir de pulmón, tiroides, mama, colon, melanoma, próstata, hepático, de vejiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, linfoma, mieloide, de ovario, útero, sarcoma, cáncer de células biliares, y endometriales. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0228] Según algunas formas de realización, una composición farmacéutica, que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la presente invención, y una composición farmacéutica, que comprende un inmunomodulador adicional o un inhibidor de quinasa, se utilizan en el tratamiento del cáncer por administración separada.

[0229] De acuerdo con todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

[0230] El término "cantidad eficaz" como se usa aquí se refiere a una cantidad suficiente del anticuerpo monoclonal del fragmento de anticuerpo que, cuando se administra a un sujeto tendrá el efecto terapéutico pretendido. La cantidad eficaz requerida para lograr el resultado final terapéutico puede depender de varios factores que incluyen, p. ej., el tipo específico de tumor y la gravedad del estado del paciente, y si la combinación se coadministra además con radiación. La cantidad eficaz (dosis) de los agentes activos, en el contexto de la presente invención, debería ser suficiente para afectar una respuesta terapéutica beneficiosa en el sujeto a lo largo del tiempo, que incluye, entre otros, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de la tasa de crecimiento tumoral, la prevención del crecimiento de tumores y metástasis y aumento de la supervivencia.

[0231] La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones descritas en este documento se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., determinando la CI50 (la concentración que proporciona un 50% de inhibición) y la dosis máxima tolerada para un compuesto sujeto. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular una variedad de dosis para uso en humanos. La dosificación puede variar dependiendo, entre otras cosas, de la forma de dosificación empleada, el régimen de dosificación elegido, la composición de los agentes utilizados para el tratamiento y la vía de administración utilizada, entre otros factores relevantes. El médico individual puede elegir la formulación, la vía de administración y la dosificación exactas en función del estado del paciente. Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación también puede ser una administración única de una composición de liberación lenta, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúe la curación o se logre la disminución de la enfermedad. La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la aflicción, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe y todos los demás factores relevantes.

[0232] El término "administración" o "administración de" una sustancia, un compuesto o un agente a un sujeto puede llevarse a cabo usando uno de una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto o un agente por vía enteral o parenteral. Enteralmente se refiere a la administración a través del tracto gastrointestinal, incluida la vía oral, sublingual o rectal. La administración parenteral incluye la administración intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, ocular, sublingual, intranasal, por inhalación, intraespinal, intracerebral y transdérmica (por absorción, p. ej., a través de un conducto cutáneo). Un compuesto o agente también puede introducirse apropiadamente mediante dispositivos poliméricos recargables o biodegradables u otros dispositivos, p. ej., parches y bombas, o formulaciones, que proporcionen la liberación prolongada, lenta o controlada del compuesto o agente. La administración también se puede realizar, p. ej., una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados. En algunas formas de realización, la administración incluye tanto la administración directa, incluida la autoadministración, como la administración indirecta, incluido el acto de prescribir un fármaco. Por ejemplo, como se usa en este documento, un médico que instruye a un paciente para que se autoadministre un fármaco, o que otro le administre el fármaco y/o que le proporcione a un paciente una receta para un fármaco, le está administrando el fármaco al paciente.

[0233] Los anticuerpos se administran generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso del paciente, comúnmente aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg, y con frecuencia aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg. A este respecto, se prefiere usar anticuerpos que tengan una vida media en circulación de al menos 12 horas, preferiblemente al menos 4 días, más preferiblemente hasta 21 días. Se espera que los anticuerpos quiméricos tengan una vida media circulatoria de hasta 14-21 días. En algunos casos, puede ser ventajoso administrar una gran dosis de carga seguida de dosis de mantenimiento periódicas (p. ej., semanales) durante el período de tratamiento. Los anticuerpos también pueden administrarse mediante sistemas de administración de liberación lenta, bombas y otros sistemas de administración conocidos para infusión continua.

[0234] El término "aproximadamente" significa que un intervalo aceptable de error, p. ej., hasta 5% o 10%, para el valor particular debe ser asumido.

Angiogénesis

[0235] Según un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la angiogénesis relacionada.

[0236] La angiogénesis es un evento celular importante en donde las células endoteliales vasculares proliferan, se reducen y se reorganizan para formar nuevos vasos a partir de redes vasculares preexistentes. Existe evidencia convincente de que el desarrollo de un suministro vascular es esencial para los procesos proliferativos normales y patológicos y la inflamación. El compartimento vascular es necesario no solo para el desarrollo y la diferenciación de los órganos durante la embriogénesis, sino también para la cicatrización de heridas, la reparación de tejidos y las funciones reproductivas en el adulto.

[0237] La angiogénesis también está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos, que incluyen, pero no se limitan a tumores, retinopatías proliferativas, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide y psoriasis. La angiogénesis es esencial para el crecimiento de la mayoría de los tumores primarios y su posterior metástasis. Los tumores pueden absorber suficientes nutrientes y oxígeno por simple difusión hasta un tamaño de 1-2 mm, momento en donde su crecimiento adicional requiere la elaboración de un suministro vascular. Se cree que este proceso implica el reclutamiento de la vasculatura madura del huésped vecino para comenzar a brotar nuevos capilares de vasos sanguíneos, que crecen hacia la masa tumoral y posteriormente se infiltran en ella. Además, la angiogénesis tumoral implica el reclutamiento de células precursoras endoteliales circulantes de la médula ósea para promover la neovascularización.

Diagnóstico

[0238] La presente invención describe además métodos para el diagnóstico y pronóstico de cáncer.

[0239] Según un aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer o enfermedad infecciosa en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de determinar el nivel de expresión de PVR en una muestra biológica de dicho sujeto utilizando al menos un anticuerpo como se describe en este documento.

[0240] El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo que puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. El término engloba muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, como una muestra de biopsia, o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos y su progenie. Además, el término puede abarcar un tumor circulante u otras células. El término engloba específicamente una muestra clínica y además incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, orina, líquido amniótico, líquidos biológicos que incluyen humor acuoso y vítreo para muestras de ojos y muestras de tejido. El término también incluye muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de la obtención, como el tratamiento con reactivos, la solubilización o el enriquecimiento de ciertos componentes.

[0241] La determinación del nivel de expresión de PVR puede realizarse mediante un anticuerpo anti-PVR marcado como se describe en el presente documento. La determinación de la expresión se puede realizar, p. ej., mediante ELISA.

[0242] El método de la invención puede comprender además el paso de comparar dicho nivel de expresión con un nivel de control.

[0243] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más plenamente algunas formas de realización de la invención. No deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Procedimientos experimentales

[0244] Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitativa.

[0245] En general, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas de ADN moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica. A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales que se refieren a procedimientos bien conocidos para la comodidad del lector.

Ejemplo 1. Una alta expresión de PVR se correlaciona con un mal pronóstico

[0246] PVR y Nectina-2 son ligandos para el receptor inhibidor TIGIT (FIG. 2). Los resultados ilustran que los niveles elevados de expresión de PVR se correlacionan con un mal pronóstico de cáncer de pulmón, cáncer de mama y liposarcoma (FIGS. 1A-C, respectivamente). La expresión GEO de PVR se correlacionó con la supervivencia utilizando bioprofiling.de, los conjuntos de datos relevantes son ID: GSE31210, GSE25055, GSE30929. Además, utilizando el mismo análisis, la expresión de Nectina-2 fue principalmente un marcador positivo para la supervivencia.

Ejemplo 2. Generación y purificación de anti-PVR mAb

[0247] Para generar anticuerpos anti-PVR, se produjo y purificó una proteína recombinante, hPVR-Fc, que combina la parte extracelular de PVR humano y la región Fc humana de un portador de inmunoglobulina G como inmunógeno.

[0248] Los ratones BALB/c fueron inyectados con 50 pg del inmunógeno en adyuvante completo de Freund y después de 2 semanas en adyuvante incompleto de Freund. Después de 2 semanas, se examinaron los sueros para determinar el título de anticuerpos. Los mejores respondedores (se controló el suero mediante ensayo ELISA para el título de anticuerpos anti-hPVR-Fc) se reforzaron con el inmunógeno en PBS. Tres días después, se recolectaron células del bazo y, después de la lisis de los glóbulos rojos, se fusionaron con células SP2/0. Las células se sembraron en medio RPMI 1640 al 20% que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina para la selección de hibridomas y se cribaron para mAb usando ELISA. Se generaron líneas de células de hibridoma estables fusionando células de mieloma SP2/0 con células de bazo de un ratón inmunizado.

[0249] Se seleccionaron resultados positivos (líneas celulares que secretan anticuerpos que reconocen hPVR-Fc) adicionalmente para desarrollar un producto que tendrá varias características diferenciadoras: a) alto rendimiento para reducir los costos de producción de anticuerpos; b) la falta de reactividad cruzada entre PVR de ratón y humano y varios otros ligandos de los receptores de células inmunitarias; c) una fuerte capacidad de unión a las moléculas de PVR humanas maduras nativas expresadas en la superficie de las células vivas (los anticuerpos se eligieron de un conjunto completo de anticuerpos monoclonales anti-hPVR con capacidad probada para reconocer el hPVR en diferentes técnicas, p. ej., citometría de flujo, transferencia de Western, ELISA). De hecho, el PVR humano y de ratón tienen un alto nivel de homología y no es fácil generar un anticuerpo monoclonal de ratón que reconozca un homólogo humano. Más importante aún, la PVR humana está extensamente glicosilada en su región extracelular. Por estas razones, no es fácil generar un anticuerpo que reconozca una proteína nativa utilizando antígenos comunes (como los derivados de E. coli).

[0250] Los presentes inventores han utilizado el inmunógeno hPVR-Fc, una molécula producida en el riñón embrionario de mamífero humano 293 (HEK 293T) de las células y purificada en condiciones nativas mediante cromatografía de inmunoafinidad, para estrechamente imitar la proteína nativa, PVR humano. En conclusión, a partir de un conjunto de mAbs anti-hPVR generados, se identificaron representantes que reconocen una forma PVR humana nativa en células vivas, lo cual es un requisito previo para desarrollar un derivado que influiría en la respuesta de las células inmunitarias humanas durante el tratamiento.

[0251] Se generaron cuatro anticuerpos anti-PVR. De estos, tres anticuerpos bloqueaban anti-PVR mAb, a saber, el anticuerpo 5B9 (también denominado hPVR.09), el anticuerpo 7D4 (también denominado hPVR.01) y el anticuerpo 4E5 (también denominado hPVR.07). Todos estos anticuerpos bloquean la unión de TIGIT-Ig (como se ilustra en las Figuras 3B-D, respectivamente). Se generó un cuarto anticuerpo que no bloquea la unión de TIGIT-Ig y se denominó 2G3 (también denominado hPVR,17) (FIG. 3A).

[0252] Se utilizó el biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore™ T100 (GE Healthcare) para determinar Koff, Kon y K^dentre los anticuerpos y hPVR (Tabla 1).

Tabla 1. Medición de la afinidad de anticuerpos por Biacore™

[0253] Los anticuerpos monoclonales quiméricos, que comprenden la región IgG1 constante de cadena pesada humana establecida en la SEQ ID NO: 86 (correspondiente a GenBank: AAA02914,1), fueron producidos a partir de los tres anticuerpos anteriores, usando métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo 3. Bloqueo de interacciones PVR-TIGIT con destrucción de células NK potenciada por anti-PVR mAb de líneas celulares humanas

[0254] Las células diana se marcaron con [35S]-metionina 12 horas antes del ensayo. Los anticuerpos indicados se añadieron a la concentración final de 5 pg/ml y se incubaron con las dianas marcadas (5000 células/pocillo) durante 30 minutos en hielo. Los ensayos se realizaron en medio RPMI en placas con forma de 96U a 37°C durante 5 horas. Los objetivos marcados se incubaron con células efectoras NK en una relación E:T de 10:1. Después de la incubación, se centrifugaron las placas (1600 rpm, 5 min, 4°C) y se recogieron los sobrenadantes (50 pl) y se transfirieron a placas Optiplate opacas (Packard). Se añadieron 150 pl de líquido de centelleo (Perkin Elmer) y se analizaron mediante un contador p micro beta (Perkin Elmer). El marcado máximo se determinó añadiendo 100 pl de 0,1N NaOH a una cantidad igual de objetivos (5000/pocillo). La liberación espontánea se determinó en pocillos que contenían únicamente células diana. La destrucción específica final se calculó como sigue: ((lectura radiactiva - liberación espontánea)/(marcaje máximo -liberación espontánea))*100 = destrucción específica. Como se muestra en la Figura 4, el cultivo de células NK con anti-PVR mAb 7D4 (también denominado hPVR.01) mejoró (en dos pliegues) la destrucción de células NK de la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-231.

Ejemplo 4. Bloqueo de interacciones PVR-TIGIT con destrucción de células NK potenciada por anti-PVR mAb de líneas celulares cancerosas humanas

[0255] Se marcaron células diana con [35S]-metionina 12 horas antes del ensayo. Los anticuerpos indicados se agregaron a la concentración final de 5 pg/ml y se incubaron con las dianas marcadas (5000 células/pocillo durante 30 minutos en hielo. Las células se incubaron con células efectoras NK en una relación E:T de 10:1. Los ensayos se realizaron en Medio RPMI en placas en forma de U de 96 a 37°C durante 5 horas. Después de la incubación, las placas se centrifugaron (1600 rpm, 5 min, 4°C) y los sobrenadantes (50 ml) se recogieron y se transfirieron a placas Opti-plate opacas (Packard). Se añadió 150 pl de líquido de centelleo (Perkin Elmer) y se analizó mediante un contador p micro beta, (Perkin Elmer). El marcaje máximo se determinó añadiendo 100 pl de 0,1 N NaOH a una cantidad igual de dianas (5000/pocillo). La liberación espontánea fue determinada en pocillos que contienen células diana solamente. La destrucción específica final se calculó de la siguiente manera: ((lectura radiactiva - liberación espontánea)/(marcaje máximo - liberación espontánea))*100 = destrucción específica.

[0256] Como se muestra en la Figura 5, el bloqueo de las interacciones de PVR-TIGIT con anti-PVR mAb 4E5 (también denominado hPVR.07) mejora la destrucción de células NK de la línea celular de cáncer humano HepG2 (carcinoma hepatocelular). Por tanto, está claro que el bloqueo de PVR conduce a una mayor destrucción de las células diana. La destrucción se mejora aún más cuando se usó la contraparte IgG humana de 4E5 en una versión quimérica del mAb. La destrucción es equivalente al control positivo (Erbitux©).

Ejemplo 5. Las líneas de células tumorales humanas expresan PVR y Nectina-2

[0257] Para examinar la expresión de PVR y Nectina-2 en células tumorales, se examinaron los niveles de expresión de estas proteínas en diferentes líneas de células tumorales mediante análisis FACS usando el anti PVR-4E5 Ab y el anti-Nectina-2 Ab (clon TX-31), ambos a 2 pg/ml. Como se muestra en las Figuras 6A-O, varias líneas de células tumorales humanas expresan PVR y Nectina-2. Específicamente, se muestra que las células de melanoma (FIGS. 6A-E), células de cáncer de mama (FIGS. 6F-H), células colorrectales (FIG. 6I), células renales (FIG. 6J), células de cáncer de pulmón (FIG.

6K), células de cáncer de próstata (FIG. 6L), células tumorales cerebrales (FIG. 6M) y células de carcinoma hepatocelular (FiGs .6NO) todas expresan PVR y Nectina-2.

Ejemplo 6. PVR es el ligando TIGIT principal

[0258] Las Figuras 7A-7C demuestran que PVR es el ligando TIGIT principal. Específicamente, se demostró que las células HepG2 (células de carcinoma hepatocelular humano) expresan tanto PVR como Nectina-2 (FIG. 7A). El cultivo de células HepG2 con anti-PVR mAb 4E5 purificado, también denominado hPVR.07 (0,15 pg/pocillo), bloqueó casi por completo la unión de TIGIT-Ig (2 pg/ml) (FIG. 7B), a pesar de que estas células también expresan Nectina-2. Como se muestra en la Figura 7C y 7D, está claro que no hubo reconocimiento directo de Nectina-2 por mAbs anti-PVR.

Ejemplo 7. Unión de clones de mAb a PVR humano y primate

[0259] Como se muestra en las Figuras 8A-C, todos los clones de anticuerpos anti-PVR probados se unen a PVR humano (hPVR), utilizando análisis FACS. Brevemente, las células se trataron con tripsina y se transfirieron para tinción a 2 x 105 células por pocillo. Los anticuerpos indicados se agregaron durante 30 min en hielo. Todos los anticuerpos se utilizaron a una concentración final de 2 pg/ml. La detección de Ab anti-PVR unido se realizó usando IgG-647 anti-ratón. Se usó IgG1 kappa de ratón como control negativo.

[0260] La Figura 8A ilustra que se detectó hPVR endógeno mediante tinción FACS en la superficie de células de carcinoma hepatocelular HepG2. En la Figura 8B se usó la línea celular murina B16. La secuencia de PVR murina es diferente de la especie humana y no es reconocida por los anticuerpos anti-PVR humanos como puede verse por la falta de señal (panel izquierdo). Cuando la proteína hPVR de longitud completa (NP_006496,4 aminoácidos 1-418) se sobreexpresó en estas células, los tres clones dieron como resultado una señal idéntica (panel derecho) que respalda aún más la afirmación de que esta tinción es el resultado de una unión específica de estos Abs a la proteína PVR humana.

[0261] La secuencia de aminoácidos de PVR se conserva en algunas especies. La conservación de aminoácidos del PVR humano se comparó con la de los monos verdes africanos in síIíco y se encontró que tenía una similitud del 93% con el PVR humano. La tinción FACS de células Vero de mono verde africano demostró que el PVR del mono es reconocido eficazmente por los tres mAb humanos (FIG. 8C). Además, se encontró que estos anticuerpos humanos anti-PVR no reconocen PVR de caninos y roedores como hámster o ratón. La Figura 9 muestra el análisis FACS para las células MDCK que expresan PVR canino. Como puede verse, ninguno de los Abs antihumanos dio como resultado una señal positiva, mientras que la expresión de PVR en sí misma es sugerida por la fuerte señal de TIGIT-Ig.

Ejemplo 8. La nectina-2 se une preferentemente a DNAM-1

[0262] Se utilizaron TIGIT-Fc y DNAM-1-Fc a las concentraciones indicadas en las Figuras 10 para teñir las células que sobreexpresan la línea celular hNectina-2: RPMI-8866 (FIGS. 10A y 10B), (o línea de células B16-HPVR (FIGS. 10 C y 10D). La detección de la proteína de fusión unida se hizo utilizando IgG APC anti-humano y se analizó por FACS.

[0263] Para la unión de PVR, la señal por TIGIT-Fc fue 2-4 veces más alto que la del DNAM-1-Fc, de manera similar a un informe anterior (Yu. X et al., 2009, Nat Immunol., 10(1): 48-57). La unión de hNectin-2 a DNAM-1-Fc fue de 2 a 10 veces más fuerte que su unión a TIGIT-Fc, lo cual es contradictorio con un informe (Yu. X et al 2009), pero corroborado por otro estudio (Zhu Y et al., 2016, J Exp Med., 8; 213(2): 167-76). En conjunto, los resultados ilustran que DNAM-1 es el receptor preferencial para la unión de Nectina-2. En consecuencia, el bloqueo de PVR evitará la señalización inhibitoria de TIGIT, mientras que permite que la señalización coestimuladora por DNAM-1. DNAM-1 media la adhesión celular a otras células que portan sus ligandos.

Ejemplo 9. Los anticuerpos anti PVR potencian la proliferación de células T

[0264] Para probar el efecto de los mAb anti PVR sobre la proliferación de células T, se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) y se incubaron con células diana en la presencia de anticuerpos a una concentración de 4 gg/ml. La dilución de CFSE se midió en células positivas para CD45 después de 5-9 días en cultivo. Como se muestra en la Figura 11, la actividad Anti PVR 5B9 excede la actividad de los anticuerpos PD-1 y CTLA4 como agente único. Además, el clon quimérico anti PVR 4E5hIgG1, que tiene una región constante de IgG1 humana, fue superior a su homólogo de ratón. A continuación, se examinó el efecto combinado de mAb anti PVR y otros anticuerpos que se encontró que potencian la proliferación de células T. Se tiñeron PBMC humanas con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) y se incubaron con células diana en presencia de anticuerpos a una concentración de 4 gg/ml. La dilución de CFSE se midió en células positivas para CD45 después de 5-9 días en cultivo. Los resultados muestran que la actividad de proliferación de anti-PVR 5B9, cuando se combina con PD-1 o CTLA-4, excede la actividad de una combinación de PD-1 y CTLA4 (FIG. 12). Además, la actividad de una combinación de anti-PVR 4E5 y CTLA-4 es igual a la combinación de PD-1 y CTLA4. A continuación, se examinó la inducción específica de CD8. Como se muestra en la Figura 13, la actividad de proliferación de células T CD8 de anticuerpos anti PVR excede la actividad de PD1. Además, la actividad de inducción del anticuerpo anti PVR 5B9 supera a la de CTLA1. Se evaluó la proporción de proliferación de CD8/CD4 para los diferentes anticuerpos (FIG. 14). Anti PVR 5B9 tuvo la relación CD8/CD4 más alta. La secuencia de ADN de las cadenas pesadas y ligeras variables se utilizó para construir anticuerpos quiméricos, que comprenden los dominios constantes del isotipo IgG1 humana y el dominio Kappa de IgG humano ligero constante (CL). La proliferación de células T inducida por anticuerpos homólogos quiméricos de ratón y humanos se midió mediante el ensayo CFSE. Los números que se muestran en la Tabla 2 representan el nivel relativo de proliferación en comparación con el control.

Tabla 2. Un resumen del efecto de anticuerpos anti PVR en la proliferación de células T

[0265] A continuación, se examinó el efecto de PVR-anticuerpos en desgranulación NK. Durante la desgranulación, se liberan gránulos citolíticos en las células NK y la proteína de membrana asociada al lisosoma-1 (LAMP-1, CD107a) que está presente en la superficie de los gránulos citolíticos se transporta a la superficie celular y se vuelve accesible para la unión de anticuerpos. Este marcador permite la identificación de células NK activadas. Las células NK se incubaron con 5 células diana diferentes, junto con los anticuerpos anti PVR (anticuerpos de ratón y sus homólogos quiméricos humanos). La desgranulación se evaluó utilizando anticuerpos anti-CD107a.

Tabla 3. Efecto de los anticuerpos anti-PVR sobre la actividad de desgranulación de NK.

[0266] Como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 15, todos los anticuerpos mostraron una actividad de desgranulación NK, en donde los anticuerpos quiméricos tenían una actividad significativamente más alta en comparación con su anticuerpo de ratón correspondiente.

Ejemplo 10. Los anticuerpos anti-PVR reducen la supervivencia de las células tumorales en ausencia de células inmunitarias.

[0267] Se examinó la supervivencia de las células A549, U373, HCT116 y Mel-624 usando un ensayo de supervivencia de células MTT en presencia de 50 microgramos/ml de diferentes anti-PVR mAb durante 24 horas. Como se muestra en las Figuras 16A-16D y la Tabla 4, el bloqueo de PVR por mAb 5B9 redujo significativamente la viabilidad del 20 al 40% en comparación con mIgG.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al receptor de poliovirus humano (PVR), o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende al menos la porción de unión al antígeno, que comprende

un conjunto de CDR de seis CDR en donde: CP CDR1 se selecciona de GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36) y SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CP CDR2 es EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CP CDR3 es TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CL CDR1 se selecciona de KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44) y KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CL CDR2 se selecciona del grupo que consta de: WASSRHN (SEQ ID NO: 46), WASSRHA (SEQ ID NO: 56), WASSRHR (SEQ ID NO: 57), WASSRHD (SEQ ID NO: 58), WASSRHE (SEQ ID NO: 57) NO: 59), WASSRHP (SEQ ID NO: 60) y WASSRHT (SEQ ID NO: 61); y CL CDR3 es QQYSRYPLT (SeQ ID NO: 48); en donde el anticuerpo monoclonal aislado es capaz de inhibir la unión de PVR al inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT).

2. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1, en donde la secuencia de CP CDR1 se selecciona del grupo que consiste en GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36) y SNYWIE (SEQ ID NO: 84); La secuencia de CP CDR2 consta de EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CP CDR3 consta de la secuencia: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); la secuencia de CL CDR1 se selecciona del grupo que consiste en KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44) y KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CL CDR2 consta de la secuencia WASSRHE (SEQ ID NO: 59); y Cl CDR3 consta de la secuencia: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).

3. Una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Un plásmido que comprende la secuencia polinucleotídica según la reivindicación 3.

5. Una célula de hibridoma que comprende una secuencia polinucleotídica según cualquiera de reivindicaciones 3 o 4.

6. El anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 unido a un resto citotóxico, un resto radiactivo o un resto identificable.

7. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, y un excipiente, diluyente, sal o vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento del cáncer.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, comprendiendo dicho uso además administrar a dicho sujeto un inmunomodulador adicional, una célula de linfocitos activados, un inhibidor de quinasas, un agente quimioterapéutico o cualquier otro agente anticanceroso.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9, en donde el inmunomodulador adicional es un anticuerpo contra una molécula de punto de control inmunológico seleccionada del grupo que consiste en PD-I, CTLA-4, PDL-1, CEACAMI, NKG2A, B7- H3, B7-H4, VISTA, CD112R, gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), CD137, OX40 (también denominado CD134), receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), TIGIT y cualquier combinación de los mismos.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer sólido.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer hematológico.