CN114107424A - 预测针对嵌合抗原受体疗法的治疗应答性的生物标志及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及评估或监测受试者中嵌合抗原受体疗法的治疗应答性的方法、以及预测针对嵌合抗原受体疗法的治疗应答性的生物标志。本发明还涉及所述生物标志的用途，用于预测受试者是否有利地应答嵌合抗原受体疗法。

Description

预测针对嵌合抗原受体疗法的治疗应答性的生物标志及其 用途
本申请是中国专利申请201580065528.X的分案申请，原申请的申请日 是2015年10月7日，发明名称是“预测针对嵌合抗原受体疗法的治疗应 答性的生物标志及其用途”。
本申请要求2014年10月8日提交的美国序列号62/061,553和2015 年4月8日提交的美国序列号62/144,682的优先权，其全部内容通过引用 并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其 整体并入本文。所述的ASCII拷贝于2015年10月7日创建，命名为 N2067-7057WO_SL.txt，大小为219,221字节。
技术领域
本发明涉及癌症生物标志及其用途。
背景技术
许多患有B细胞恶性肿瘤的患者通过标准治疗无法治愈。此外，传统 治疗方案往往具有严重的副作用。在癌症免疫治疗方面已经做了尝试，但 是几个障碍使得临床有效性的目标难以实现。虽然已经鉴定了数百种所谓 的肿瘤抗原，但它们通常来源于自身，因此其免疫原性差。此外，肿瘤使 用几种机制来使自己对免疫攻击的起始和传播具有敌意。
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法的最新发展 在利用免疫系统的力量治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症中显示出有希望的 结果，所述疗法依赖于将T细胞重定向到癌细胞如B细胞恶性肿瘤上的合 适的细胞表面分子(参见，例如，Sadelain etal.,CANCER DISCOVERY 3:388-398(2013))。例如，结合CD19(即“CTL019”)的CART的临床结果已经在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者和儿童急性淋巴细胞白血病(ALL) 患者中建立完全缓解方面显示出希望(参见例如Kalos et al.,SCI TRANSL MED 3:95ra73(2011),Porter etal.,NEJM 365:725-733(2011),Grupp et al.,NEJM 368:1509-1518(2013))。
除了遗传修饰的T细胞上的嵌合抗原受体识别和破坏靶细胞的能力之 外，成功的治疗性T细胞疗法需要具有增殖，随着时间的推移而持续存在， 并进一步监测白血病细胞逃逸的能力。T细胞的变异表型状态，无论是处 于无能，抑制或衰竭状态，都会对CAR转化的T细胞的功效产生影响。 为了有效，CAR转化的患者T细胞需要保持并保持响应于CAR抗原而增 殖的能力。
因此，需要一种使用生物标志用于与CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)疗法差别诊断和治疗癌症有关的方法。特别地，在具有血液癌症 (例如CLL和ALL)的受试者中对于CAR表达细胞疗法(例如用CTL019 或其他CD19 CAR表达细胞的CAR表达细胞疗法)的治疗应答的有效预测 子存在未满足的需求。
发明概述
本公开内容涉及与癌症(例如，血液癌症如慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL))临床相关的分析物，分析物谱或标志 (例如，基因表达，流式细胞术和/或蛋白质表达谱)的鉴定和用途。在一些 实施方案中，本公开提供了基因的身份，其在转录和蛋白质水平上的表达 与CLL和ALL进展相关，例如作为预测对嵌合抗原受体(CAR)表达细胞 疗法(例如，包含表达与CD19结合的CAR的细胞(例如，免疫效应细胞或 细胞群)(本文中也称为“CAR19”或“CD19 CAR”表达细胞)的疗法)的应答 的方式。在某些实施方案中，评估了CD19 CAR表达细胞基因集特征中的 一种或多种，表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中列 出的生物标志，CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3 生物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生 物标志，CD8生物标志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细 胞基因集特征，记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)， 例如，记忆干细胞(TSCM)，例如，中央记忆T细胞(TCM)，例如，效应记忆 T细胞(TEM))基因集特征及其组合。这些基因表达谱可以应用于癌症的诊 断和/或预后，例如血液癌症如CLL和ALL，并且特别可用于预测在诊断 患有癌症(例如诸如CLL或ALL的血液癌症)的受试者中，受试者是否有 利地应答CAR疗法(例如，如本文所述的CD19 CAR疗法，例如CTL019 疗法)。与现有预后方法中使用的临床参数或生物化学标志相比，本文公开 的基因的表达谱构成了血液癌症进展(例如，CLL和ALL进展)的更稳健 的特征，并提供了选择适当的治疗方案的更可靠的非主观基础。
除此之外，本公开提供了新的基因特征(例如在转录和蛋白质水平)及 其使用方法，其预测例如在癌症，例如血液癌症如CLL和ALL中受试者 对表达CAR,例如CD19 CAR的细胞(例如，CD19 CAR-表达细胞，例如 本文所述的T细胞，NK细胞，例如CTL019)疗法的应答。
本公开至少部分地表明，例如在转录和蛋白质水平上的表达谱和基因 特征可用于区分在癌症(例如，诸如CLL和ALL的血液癌症)中对包含 CAR表达细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细 胞)(也在本文中称为“CAR表达细胞疗法”)的疗法的应答者，部分应答者， 非应答者，复发者或非复发者。在一个实施方案中，CAR表达细胞是CD19CAR表达细胞。在一个实施方案中，该疗法是CTL019疗法。在实施方案 中，本文公开的表达谱和基因特征在癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL) 中区分表达CAR(或CD19 CAR)的细胞应答者，表达CAR(或CD19 CAR) 的细胞部分应答者或表达CAR(或CD19 CAR)的细胞非应答者(例如， CTL019应答者，CTL019部分应答者和CTL019非应答者)；或表达CAR(或 CD19 CAR)的细胞复发者或表达CAR(或CD19 CAR)的细胞非复发者(例 如，CTL019-复发者或CTL019-复发者)。本公开包括鉴定预测受试者对 CAR表达细胞疗法，例如CD19 CAR表达细胞疗法如CTL019的应答的 新基因特征。
因此，本文公开了用于鉴定，评估和/或治疗患有癌症的受试者的方法， 系统，组合物和试剂盒。示例性的癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞 白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血 病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞 前髓细胞性白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥 漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡 淋巴瘤，恶性淋巴增生性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边 缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍 奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞 肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症是ALL。在 另一个实施方案中，癌症是CLL。在一个实施方案中，癌症与CD19表达 相关。
因此，一方面，本发明的特征在于评估患有癌症例如血液癌症的受试 者的方法。该方法包括获得受试着对包含CAR表达细胞(例如，多个(例如， 群体)CAR(例如CAR19-)表达细胞)的疗法的应答者或复发者状态的值(例 如，如本文所述的应答者或复发者状态的值)，其中所述值指示受试者对 CAR表达细胞疗法的应答性或复发状态。
在相关方面，本发明的特征在于评估或监测患有癌症例如血液癌症的 受试者中CAR表达细胞疗法的有效性的方法。该方法包括获得受试者对 包含CAR表达细胞(例如，多个(例如，群体)CAR(例如CAR19-)表达细胞) 的疗法的应答者或复发者状态的值(例如，如本文所述的应答者或复发者状 态的值)，其中所述值表示CAR表达细胞疗法的有效性，从而评估受试者 中CAR表达细胞疗法的有效性。
另一方面，本发明的特征在于治疗患有癌症例如血液癌症的受试者的 方法。该方法包括如果受试者被鉴定为对包含CAR表达细胞(例如，多个(例如，群体)CAR(例如CAR19-)表达细胞)的疗法应答(例如，被鉴定为完 全应答者，部分应答者或非复发者)，那么向受试者施用治疗有效剂量的 CAR表达细胞疗法，其中所述鉴定包括应答者或复发者状态的值(例如， 如本文所述的应答者或复发者状态的值)。
在相关方面，本发明的特征在于在受试者中治疗癌症例如血液癌症的 方法。该方法包括获得受试者对包含CAR表达细胞(例如，多个(例如，群 体)CAR(例如CAR19-)表达细胞)的疗法的应答者或复发者状态的值(例如， 如本文所述的应答者或复发者状态的值)；和响应所述值，治疗所述癌症。
在本文所述的用途的任何方法和组合物的实施方式中，应答者或复发 者状态的值包括以下的一，二，三，四，五，六，七或更多(全部)个的度 量:
(i)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或CAR 表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或 CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或CAR 表达细胞产物样品)中一种，两种，三种或更多(例如，全部)静息TEFF细胞， 静息TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT 细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的水平或活性；
(iii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或生 产的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较 老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一 种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或制 造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志物例如一种，两种或更 多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B中列出的生物标 志，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1 或CD19 CAR表达细胞基因集特征的一种，两种，三种，四种，五种，十 种，二十种或更多种的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品(例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)， 其中细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种 或更多种(或全部)；
(vii)CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或表 达CAR的细胞产品样品，例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))的CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量。
一方面，本发明提供了用于治疗受试者的CAR表达细胞疗法(例如， CD19CART细胞，例如CTL019细胞)，其中例如在用CAR核酸转导或 转染之前或之后，根据本文的方法已经测定了CAR表达细胞。在相关方 面，本发明提供CAR表达细胞疗法(例如，CD19 CART细胞，例如CTL019 细胞)，用于治疗已被鉴定为对包含CAR表达细胞群体(例如，表达CAR19 的细胞群体)的疗法有应答的受试者(例如，鉴定为完全应答者，部分应答 者或非复发者)。使用的组合物可以包含本文所述的(i)-(viii)的一，二，三， 四，五，六，七或更多(全部)个的度量。
备选地，或与本文公开的用途的方法和组合物组合，响应于所述值， 执行以下的一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个(例如全 部):
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者，或复发者或非 复发者；
对例如应答者或非复发者施用CAR表达细胞疗法；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
将另外的活性剂，例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂 与CAR表达细胞疗法组合施用于例如非应答者或部分应答者；
在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增 加受试者中较年轻T细胞数量的疗法；
例如，对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，修改CAR表 达细胞疗法的方法，例如制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富 集较年轻的T细胞，或增加转导效率；
例如对于非应答者或部分应答者或复发者施用替代疗法，例如特定癌 症类型的护理标准；或者
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，则减少TREG细胞群体和 /或TREG基因特征，例如通过CD25消耗或施用环磷酰胺，抗GITR抗体， mTOR抑制剂或其组合中的一种或多种。
在某些实施方案中，用抗GITR抗体预治疗受试者。在某些实施方案 中，在输注或重新输注之前，用抗GITR抗体治疗受试者。在一些实施方 案中，受试者是患有CLL的患者。
在另一方面，本发明的特征在于鉴定患有癌症的受试者应答包含CAR 表达细胞(例如，多个(例如，群体)CAR(例如CAR19-)表达细胞)的治疗的 增加或减少的可能性的方法或测定法。该方法包括:
(1)提供，例如获取来自所述受试者的样品；
(2)确定样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表 14(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1，LAG-3， TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1中列出的一种或多种生 物标志的水平或活性；
其中所确定的水平与参考水平之间的差异，例如统计学显著差异是预 测受试者对CAR表达细胞疗法的应答性；和
(3)(任选地)将所述受试者鉴定为对CAR表达细胞疗法的完全应答者， 部分应答者，非应答者，复发者或非复发者。
在另一方面，本发明的特征在于用于治疗患有癌症的受试者的方法， 包括:
通过确定例如，相对于参考水平，来自受试者的样品中表1A，表1B， 表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6), 图2B，表17，表18，表20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122， CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中一种或多种生物标 志的水平或活性,来确定受试者是否对CAR表达细胞疗法(例如，表达 CAR19的疗法，例如CTL019)具有增加的应答可能性或降低的复发可能 性；和
向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法。
在另一方面，本发明的特征在于治疗患有癌症的受试者的方法，包括:
(1)通过获取来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或制备的表 达CAR的产品样品)中的本文表(例如表17)中一种或多种标志的水平或活 性的值，确定受试者对CAR表达细胞疗法是否具有增加的复发可能性， 其中一种或多种生物标志基因的水平或活性相对于参考水平的差异，例如 统计学显著性差异表明对CAR表达细胞疗法增加的复发可能性；和
(2)对于具有增加的复发可能性的受试者，减少TREG细胞群体和/或减 少TREG基因特征；和
(3)向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法。
本发明的附加特征和实施方案包括以下一个或多个:
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，免疫细胞 具有耗尽的表型，例如共表达至少两种耗尽标志，例如共表达PD-1和 TIM-3。在其他实施方案中，免疫细胞具有耗尽的表型，例如共表达至少 两种耗尽标志，例如共表达PD-1和LAG-3。
在本文公开的任何方法，系统，使用组合物和试剂盒的某些实施方案 中，CAR表达细胞疗法包含多个(例如，一群)CAR表达免疫效应细胞，例 如多个(例如，一群)T细胞或NK细胞，或其组合。在一个实施方案中， CAR表达细胞疗法是CAR19疗法(例如，CTL019疗法)。在一个实施方 案中，CAR表达细胞疗法包括CTL019或由CTL019组成。在一个实施方 案中，CAR表达细胞是CTL019产物。在一个实施方案中，CAR表达细 胞是T细胞。在一个实施方案中，CAR表达细胞是NK细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，(i)-(viii) 中的一种或多种的度量是从受试者获得的单采血液成分术样品。可以在输 注或再输注之前评估单采血液成分术样品。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，(i)-(viii) 中的一种或多种的度量从制备的CAR表达细胞产物样品，例如表达 CAR19的细胞产品样品(例如CTL019)获得。可以在输注或再输注之前评 估所制备的CAR表达细胞产物。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，在接受 CAR表达细胞疗法之前，期间或之后评估受试者。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，血液癌症 是ALL或CLL。受试者可以是人类患者。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，细胞，例 如免疫效应细胞群体(例如，表达本文所述的CAR分子的细胞)与免疫检查 点分子的抑制剂组合施用，所述免疫检查点分子选自PD1,PD-L1,PD-L2, CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或 CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80, CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270), KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷，TGFR(例如TGFRβ)， 或其组合的一种或多种。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，受试者接 受用活性剂例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂的同时治疗。在一些实 施方案中，受试者在CAR表达细胞疗法后接受用活性剂例如，mTOR抑 制剂和/或检查点抑制剂的治疗。在一些实施方案中，在启动CAR表达细 胞疗法之前，受试者接受用活性剂例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂 的预治疗。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，TREG细胞 群体和/或TREG基因特征在收集用于制造的细胞之前被减少。在一些实施 方案中，在CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法之前，TREG细胞 群体和/或TREG基因特征被减少。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺， 抗GITR抗体，mTOR抑制剂或其组合来减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，应答者或 复发者状态的值包括基因特征和生物标志的组合的度量。在一些实施方案 中，应答者或复发者状态的值包括CD19 CAR表达细胞基因集特征，以及 以下的一种或多种的组合的度量:表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表 9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20 中列出的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,或 KLRG1。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，该方法还 包括基于(i)-(viii)中的一个或多个的度量，将受试者鉴定为应答者(例如， 完全或部分应答者)，非应答者，复发者或非复发者。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，(i)-(viii) 中的一个或多个的度量评估基因表达，流式细胞术或蛋白质表达中的一种 或多种的谱。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，表达谱包 括基于从单采血液成分术样品或制备的CD19 CAR表达细胞产物(例如， CTL019)获得的所选基因的mRNA表达水平的一种或多种基因特征。在 一个实施方案中，表达谱包括表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9， 表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表 20，图2B中所列的生物标志，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27， CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征的一种，二 种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，CD8+T 细胞的水平或活性使用指示样品中CD8+T细胞百分比的分布或特征进行 评价。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，CD27+ CD45RO-免疫效应细胞的水平或活性使用指示样品中CD27+CD45RO-免 疫效应细胞百分比的谱图或特征进行评价。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，使用根据 表1A，1B，3,4,5,6或图2B中所列的一，二，三，四，五，十，二十，五 十，六十，七十，一百或更多种生物标志或基因集评估例如(i)，(ii)或(v) 中的水平或活性。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，例如，使 用流式细胞术评估一种或两种或以上的免疫检查点抑制剂的水平或活性， 作为CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中PD-1+/LAG-3+细胞 百分比的指标。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，例如使用 流式细胞术评估了一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂的水平或活性， 作为CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中的PD-1+/TIM-3+细 胞百分比的指标。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，列于表 7A，表7B，表8和图2B中一，二，三，四，五，十，二十，五十，六十， 七十，一百或更多种生物标志或基因集的水平或活性预测受试者对 CAR19+细胞产物(例如CTL019)的应答。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，应答者或 复发者状态的值包括本文所列，例如本文的表中所列的具有给定FDR p值 的生物标志的一种，二种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种(例 如，所有)的水平或活性的度量。在一些实施方案中，FDR p值低于0.2,0.1, 0.05,0.02,0.01,0.005,0.002,或0.001。在一些实施方案中，FDR p值低于 0.1或0.01。在一些实施方案中，生物标志是表1A，表1B，表16，表17， 表18或表20中列出的生物标志，或其组合。在一些实施方案中，该度量 包括表1A中具有低于0.2,0.1,0.05,0.02,0.01,0.005,0.002,或0.001的阈值 的p值的所有生物标志的度量。在一些实施方案中，该度量包括表1B中 具有低于阈值0.2,0.1,0.05,0.02,0.1,0.005,0.002或0.001的p值的所有生物标 志的度量。在一些实施方案中，该度量包括表16中具有低于0.2,0.1,0.05, 0.02,0.01,0.005,0.002,或0.001的阈值的p值的所有生物标志的度量。在 一些实施方案中，该度量包括表17中具有低于0.2,0.1,0.05,0.02,0.01, 0.005,0.002,或0.001的阈值的p值的所有生物标志的度量。在一些实施方 案中，该度量包括表18中具有低于0.2,0.1,0.05,0.02,0.01,0.005,0.002,或 0.001的阈值的p值的所有生物标志的度量。在一些实施方案中，该度量 包括表20中具有低于0.2,0.1,0.05,0.02,0.01,0.005,0.002,或0.001的阈值 的p值的所有生物标志的度量。在一些实施方案中，该度量包括具有所述阈值的p值的所有生物标志的度量。在一些实施方案中，该度量包括具有 低于阈值的p值的1，2，3，4，5，10，20，50或100种生物标志的度量。 在一些实施方案中，该度量包括具有低于阈值的p值的至少1，2，3，4， 5，10，20，50或100种生物标志的度量。在一些实施方案中，该度量包 括具有低于阈值的p值的1-5,5-10,10-20,20-50,或50-100种生物标志的度 量。
在一些实施方案中，与非应答者相比，在表中被指定为“CR”的表7B 的生物标志在完全应答者中上调。在一些实施方案中，与完全应答者相比， 在表中被指定为“NR”的表7B的生物标志在非应答者中被上调。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，生物标志 是表8中列出的分泌的或细胞表面生物标志。例如，可以通过流式细胞术 测量生物标志。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，与非应答 者相比，应答者(例如，完全应答者)具有或被鉴定为具有GZMK，PPF1BP2 或初始T细胞的一种或两种或以上(全部)的更高的水平或活性。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，与应答者 相比，非应答者具有或被鉴定为具有IL22,IL-2RA,IL-21,IRF8,IL8, CCL17,CCL22,效应T细胞或调节性T细胞的一种，二种，三种，四种， 五种，六种，七种或更多(例如，全部)的更高的水平或活性。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的实施方案中，复发者与非复 发者相比是具有或被鉴定为具有一种或多种(例如，2,3,4或全部)以下基因 的增加的表达水平:MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C,和 HLA-DQB1和/或与非复发者相比具有一种或多种(例如， 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或全部)以下基因的降低的表达水平的患者:PPIAL4D,TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2, RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1,和EIF1AY。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，与参考值, 例如，非应答者CD8+T细胞的百分比相比，完全应答者具有或被鉴定为 具有更大，例如，统计学上更大的CD8+T细胞百分比。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，完全应答 者与参考值，例如，非应答者CD27+CD45RO-免疫效应细胞数目相比具 有或被鉴定为具有更大的百分比(例如5％,6％,7％,10％,15％,20％, 25％,27％,30％,35％,或40％或更多数量)CD27+CD45RO-免疫效应细胞 (例如在CD8+群体中)。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，完全应答 者或部分应答者与参考值(例如非应答者CD4+T细胞的百分比)相比具有或 被鉴定为具有更大，例如，统计学上显著的更大百分比的CD4+T细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，完全应答 者与参考值(例如非应答者的静息TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的 T细胞(例如，较年轻的CD4或CD8细胞)或早期记忆T细胞)相比具有或 被鉴定为具有更大百分比的一种，两种，三种或更多(例如全部)静息TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如，较年轻的CD4或CD8 细胞或γ/δT细胞))或早期记忆T细胞或其组合。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 具有或鉴定为具有与参考值(例如，应答者活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞的 数目)相比更大百分比的一种，两种，三种或更多(例如全部)活化的TEFF细 胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 具有或被鉴定为具有更大百分比的免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或 更多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1，TIM-3和/或LAG-3)。在一个实施 方案中，非应答者与来自应答者的表达PD-1或LAG-3的免疫效应细胞的 百分比相比较，具有或被鉴定为具有更大百分比的PD-1或LAG-3表达免 疫效应细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)(例如，CAR表达CD4+细胞和/或CD8+T细胞)。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 具有或被鉴定为具有更大百分比的具有耗尽表型的免疫细胞，例如共表达 至少两种耗尽标志，例如共表达PD-1和TIM-3的免疫细胞。在其他实施 方案中，非应答者具有或被鉴定为具有更大百分比的具有耗尽表型的免疫 细胞，例如共表达至少两种耗尽标志，例如共表达PD-1和LAG-3的免疫 细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 与应答者(例如，完全应答者)相比具有或被鉴定为对于CAR表达细胞疗 法，在CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中具有更大百分比的 PD-1+/LAG-3+细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，部分应答 者具有或被鉴定为在CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中具有 比应答者更高百分比的PD-1+/LAG-3+细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 具有或被鉴定为在CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中具有 PD1+CAR+的耗尽表型和共表达LAG3。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非应答者 具有或被鉴定为与应答者(例如，完全应答者)相比在CAR表达细胞群体(例 如，CAR19+细胞群体)中具有更大百分比的PD-1+/TIM-3+细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，部分应答 者具有或被鉴定为在CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中具有 比应答者更高百分比的PD-1+/TIM-3+细胞。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，单采血液 样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是对CAR表达细胞疗法(例如 CAR19疗法(例如CTL019疗法))的受试者应答的阳性预测指标。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，单采血液 样品中高百分比的PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞是对CAR表达 细胞疗法(例如CAR19疗法(例如CTL019疗法))的受试者应答的不良预后 预测指标。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，CAR19 疗法的应答者(例如，完全应答者)具有或被鉴定为具有表9的生物标志谱。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，CAR19 疗法的非应答者具有或被鉴定为具有包含一种或多种PD-1+免疫效应细 胞,TIM-3+免疫效应细胞，LAG-3+免疫效应细胞，KLRG1+免疫效应细胞， CD27-免疫效应细胞，活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，活化的TH1， 活化的TH2细胞，刺激的记忆细胞或晚期T细胞，或其组合的生物标志。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，CAR19 疗法的非应答者具有或被鉴定为具有表10的生物标志谱。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，KLRG1， CD57，CD27，CD122或CD62L的一种，两种，三种，四种或更多(全部) 的表达预示着患者对CTL019疗法的应答。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，非复发者 是具有B-ALL的患者，并且具有或被鉴定为具有静息TEFF细胞或静息 TREG细胞特征的一个或多个表达谱(例如，蛋白质或基因表达谱)或基因特 征。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，复发者是 具有B-ALL的患者，并且具有或被鉴定为具有活化的TEFF细胞或活化的 TREG细胞特征的一个或多个表达谱(例如蛋白质或基因表达谱)或基因特 征。
在任何上述使用的方法和组合物的一些实施方案中，TREG细胞(例 如，活化的TREG细胞)具有一种或多种(例如，至少10,20,30,40,50,60,70， 或全部)以下生物标志的上调的表达:AIM2,ALAS1,BATF,C5orf32, CCL17,CD40LG,CHAC2,CSF1,CTSL1,EBNA1BP2,EDARADD, EMP1,EPAS1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GCLM,GK,GPR56, HMOX1,HSPD1,HSPE1,IKBIP,IL10,IL13,IL15RA,IL1RN,IL2RA, IL3,IL4,IL5,IL9,KCNK5,LTA,MANF,MIR1182,MIR155, MIR155HG,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,PANX2, PDIA6,PGAM4,PPIL1,PPPDE2,PRDX4,PRKAR1B,PSMD1,PSMD11, PUS7,RBBP8,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SRXN1,STIP1,STT3A, TBX21,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,TNFRSF9,TXN,UCK2, VDR,VTRNA1-3,WDR12,YWHAG,ZDHHC16或ZNF282。上调的表达 可以例如在刺激16小时后测量。可以例如通过测量所指定的基因的RNA 水平来确定上调的表达。
在任何上述使用的方法和组合物的一些实施方案中，TEFF细胞(例如， 活化的TEFF细胞)具有一种或多种(例如，至少10,20,30,40,50,60,70,或全 部)以下生物标志的上调的表达:AIM2,ALAS1,B4GALT5,BATF, C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7,CD40LG,CHAC2,CSF2, CTNNA1,EBNA1BP2,EDARADD,EEF1E1,EIF2B3,EIF2S1,FABP5, FAM40B,FKBP4,FOSL1,GFOD1,GLRX2,HSPD1,HSPE1,IFNG, IL15RA,IL21,IL2RA,IL3,KCNK5,KIAA0020,LARP4,LRP8,LTA, MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MTCH2,MYOF,NDUFAF1, NLN,NME1,NME1-NME2,OTUD7B,PAM,PDIA6,PEA15,PFKM, PGAM1,PGAM4,PPIL1,PRDX4,PRSS23,PSMD1,PSMD11,PSMD14, PTRH2,PUS7,RBBP8,RPF2,RPP25,SFXN1,SLC27A2,SLC39A14, SLC43A3,SORD,SPR,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TMCC2, TMEM165,TNFRSF9,TXN,TXNDC5,UCK2,VDR,WDR12,YWHAG, 或ZDHHC16。上调的表达可以例如在刺激16小时后测量。可以例如通过 测量所指定的基因的RNA水平来确定上调的表达。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，复发者是 具有B-ALL的患者，并且具有或被鉴定为具有一种或多种蛋白质或基因 表达谱，其包含根据表7A，表7B或图2B或一种，两种，三种，四种， 五种，十种或更多种基因，或其组合。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，复发者具 有或被鉴定为具有一种或多种TREG细胞生物标志或其组合的升高的水平。 在一些实施方案中，所述复发者具有或被鉴定为具有以下基因中的一种或 多种(例如，至少10,20,30,40,50,60,70,或全部)的上调的表达:AIM2, ALAS1,BATF,C5orf32,CCL17,CD40LG,CHAC2,CSF1,CTSL1, EBNA1BP2,EDARADD,EMP1,EPAS1,FABP5,FAM40B,FKBP4, FOSL1,GCLM,GK,GPR56,HMOX1,HSPD1,HSPE1,IKBIP,IL10, IL13,IL15RA,IL1RN,IL2RA,IL3,IL4,IL5,IL9,KCNK5,LTA,MANF, MIR1182,MIR155,MIR155HG,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1, NME1-NME2,PANX2,PDIA6,PGAM4,PPIL1,PPPDE2,PRDX4, PRKAR1B,PSMD1,PSMD11,PUS7,RBBP8,SLC27A2,SLC39A14, SLC43A3,SRXN1,STIP1,STT3A,TBX21,TNFRSF11A,TNFRSF1B, TNFRSF8,TNFRSF9,TXN,UCK2,VDR,VTRNA1-3,WDR12,YWHAG, ZDHHC16,或ZNF282。在某些实施方案中，所述复发者具有或被鉴定为 具有以下基因中的一种或多种(例如，至少10,20,25种或全部)的上调表 达:C5orf32,CCL17,CSF1,CTSL1,EMP1,EPAS1,GCLM,GK,GPR56, HMOX1,IKBIP,IL10,IL13,IL1RN,IL4,IL5,IL9,MIR155,PANX2, PGAM4,PRKAR1B,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,VTRNA1-3, 或ZNF282。上调的表达可以例如在刺激16小时后测量。可以例如通过测 量所指定的基因的RNA水平来确定上调的表达。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，复发者具 有或被鉴定为具有一种或多种TEFF细胞生物标志或其组合的升高的水平。 在一些实施方案中，所述复发者具有或被鉴定为具有以下基因中的一种或 多种(例如，至少10,20,30,40,50,60,70,或全部)的上调表达:AIM2, ALAS1,B4GALT5,BATF,C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7, CD40LG,CHAC2,CSF2,CTNNA1,EBNA1BP2,EDARADD,EEF1E1, EIF2B3,EIF2S1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GFOD1,GLRX2, HSPD1,HSPE1,IFNG,IL15RA,IL21,IL2RA,IL3,KCNK5,KIAA0020, LARP4,LRP8,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MTCH2, MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,OTUD7B,PAM,PDIA6, PEA15,PFKM,PGAM1,PGAM4,PPIL1,PRDX4,PRSS23,PSMD1, PSMD11,PSMD14,PTRH2,PUS7,RBBP8,RPF2,RPP25,SFXN1, SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SORD,SPR,SRXN1,STIP1,STT3A, TBX21,TMCC2,TMEM165,TNFRSF9,TXN,TXNDC5,UCK2,VDR, WDR12,YWHAG,或ZDHHC16。在某些实施方案中，所述受试者具有 或被鉴定为具有以下基因中的一种或多种(例如，至少10,20,25种或全部) 的上调表达:B4GALT5,C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7, CSF2,CTNNA1,EEF1E1,EIF2B3,EIF2S1,GFOD1,GLRX2,IL21, IL2RA,IL3,KIAA0020,LARP4,LRP8,OTUD7B,PAM,PEA15,PFKM, PGAM1,PGAM4,PRSS23,PSMD1,PSMD11,PSMD14,PTRH2,RPF2, SORD,SPR,TMCC2,TMEM165,或TXNDC5。上调的表达可以例如在 刺激16小时后测量。可以例如通过测量所指定的基因的RNA水平来确定上调的表达。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，应答者(例 如，完全或部分应答者)具有以下谱中的一个，两个，三个或更多个(或全 部):
(i)与参考值，例如非应答者CD27+免疫效应细胞的数目相比具有更多 数目的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值，例如非应答者CD8+T细胞的数目相比具有更多数目的 CD8+T细胞；
(iii)与参考值例如，表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1， LAG-3，TIM-3或KLRG-1或组合的检查点抑制剂)的细胞的非应答者数 目的相比，具有表达一种或多种检查点抑制剂的免疫细胞数目较少；或
(iv)与参考值，例如，静息TEFF细胞，静息TREG细胞，初始CD4细 胞，未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞的非应答者数目相比，具有更多 数目的一种，两种，三种，四种或更多(全部)静息TEFF细胞，静息TREG细胞，初始CD4细胞，未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞或其组合。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，例如(vi) 的细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a,IL17A,IL6, GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα,或其组合的 一种，二种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，或更多种(或全部)。 细胞因子可以选自IL-17a,CCL20,IL2,IL6,或TNFa的一种，两种，三 种，四种或更多种(全部)。在一个实施方案中，细胞因子的增加的水平或 活性选自IL-17a和CCL20之一或两者，指示增加的应答性或减少的复发。 在一些实施方案中，在T细胞活化后测量细胞因子水平。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，例如(vii) 中15％或以上的转导效率表示增加的应答性或减少的复发。
在本文公开的用途的任何方法和组合物的一些实施方案中，例如(vii) 中小于15％的转导效率表示减少的应答性或增加的复发。
在另一方面，本发明的特征在于一种鉴定对包括CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)的疗法(例如，CD19 CAR表达细胞疗法，例如本文所述， 例如CTL019疗法)的可能的应答者(例如，完全应答者或部分应答者，非 复发者)的方法。在一个实施方案中，应答者状态(例如，对包含CAR表达 细胞(例如，T细胞，NK细胞)的疗法的完全应答者，部分应答者，非应答 者，复发者或非复发者)通过测量如下的一种或多种来确定:CD19 CAR表 达细胞基因集特征，表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10， 表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表 20中列出的生物标志，CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物 标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物 标志，CD4生物标志，CD8生物标志，TH1+辅助T细胞基因集特征， TH2+辅助T细胞基因集特征，记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例 如初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞(TSCM)例如中央记忆T细胞(TCM)， 例如效应记忆T细胞(TEM))基因集特征及其组合。在一个实施方案中，完 全应答者(CR)具有例如如表9所描述的CD27+,CD45RO-,PD-1-,LAG-3-, 和TIM-3-的两种，三种，四种或更多种(例如全部)。在一个实施方案中， 非应答者(NR)具有例如如表10所述的CD27-CD45RO+,PD-1+,LAG-3+, 和TIM-3+的两种，三种或更多种(例如全部)。
在一个实施方案中，应答者或复发者状态(例如，对CAR表达细胞疗 法的完全应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复发者)通过评估， 例如测量二，三，四，五，六，七，八，九，十，十五或更多种以下的来 确定:CD19 CAR表达细胞基因集特征，表1A，表1B，表7A，表7B，表 8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)， 表17，表18，表20中列出的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27, CD122,CD62L,和KLRG1。
在一个实施方案中，本文公开的用途的任何方法和组合物可以在施用 CAR表达细胞疗法之前使用。在一些实施方案中，所提供的方法可以在 CAR表达细胞疗法之前，同时或期间使用。
在一个实施方案中，本文公开的用途的任何方法和组合物可用于将具 有癌症例如血液癌症，例如CLL或ALL的受试者鉴定为对包含CAR表 达细胞(例如，T细胞，NK细胞)的疗法，例如CD19 CAR表达细胞疗法 的治疗具有增加或降低的应答可能性。该方法包括:(1)从受试者获取样品 (例如，从受试者的血液获得的单采血液成分术样品；和/或例如制造的产品 样品，例如遗传工程化T细胞)；(2)确定样品中表1A，表1B，表7A，表 7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或 IL-6)，表17，表18，表20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122， CD62L和KLRG1中列出的一种或多种生物标志(例如2,3,4,5,10,15或更 多)的水平(例如，量或活性)；和(3)(任选地)将确定的一个或多个标志的水平 与参考水平进行比较；以及(4)将该受试者鉴定为CAR表达细胞疗法的完全 应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复发者。在实施方案中，所 确定的水平与参考水平相比之间的差异，例如统计学显著性差异预测受试 者对CAR表达细胞疗法的应答性。
在一方面，所提供的方法包括(1)获取样品(例如，从受试者的血液获得 的单采血液成分术样品；和/或例如制造的产品样品，例如遗传工程化T细 胞，例如制造的CD19 CAR表达细胞产物)；(2)获取，例如确定样品的基因 特征；和(3)(任选地)将基因特征与参考基因特征进行比较；其中所确定的基 因特征中的一种或多种生物标志的表达水平的差异，例如统计学显著差异 预测受试者对CAR表达细胞疗法的应答性。在一个实施方案中，基因特征包括选自表1A，表1B，表2，表3，表4，表5，表6，表7A，表7B， 表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18， 表20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1 和其组合的一种或多种标志。在一个实施方案中，样品是选自血液，血浆 或血清样品的生物样品。在一个具体实施方案中，生物样品是血液样品。 在一个实施方案中，样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获 得的免疫效应细胞(例如，T细胞)。在一个实施方案中，样品是制成的产 品样品，例如，遗传工程化的T细胞，例如制造的CD19CAR表达细胞 产物。
在一方面，提供了用于确定具有癌症，例如血液癌症诸如例如，CLL 或ALL的受试者对包含CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法， 例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法的治疗的应答性的方法。该方法 包括:确定在治疗前获得的样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表 9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17， 表18，表20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L 和KLRG1中列出的一种或多种生物标志(例如2,3,4,5,10,15或更多种)的水 平或活性；其中样品中一种或多种标志的水平(例如，量或活性)相对于预 定值的差异(例如，统计学显著差异)指示对表达CAR的细胞的增加的应答性。在一个实施方案中，样品是选自血液，血浆或血清样品的生物样品。 在一个具体实施方案中，生物样品是血液样品。在一个实施方案中，样品 是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。在一个实施 方案中，样品是制造的产品样品，例如,基因工程T细胞，例如从受试者 的血液获得，例如制造的CAR表达细胞产物，例如制造的CD19 CAR表 达细胞产物。
在一个实施方案中，提供了用于评估患有癌症例如血液癌症，例如 CLL或ALL的受试者的方法，包括获取受试者的应答者或者复发者状态 的值，包括测量以下的一种或多种(例如，2,3,4,5,10,15或更多种):表1A， 表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物标志，CD27生物 标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生 物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4+生物标志，CD8+生物标 志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征，记忆T 细胞(例如CD8+记忆T细胞，例如，初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞 (TSCM)，例如中央记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集特 征，以及CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)基因集特征，从 而评估受试者。在一个实施方案中，方法包括测量下列一种或多种:表1A， 表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列的生物标志，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1和CD19 CAR表达细胞基因 集特征。在一个实施方案中，方法包括测量以下一种或多种:表1A，表1B， 表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1,和CD19 CAR表达细胞基因集特 征，用于评估具有CLL的受试者。在另一个实施方案中，方法包括测量 以下一种或多种:表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所 列的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, KLRG1,和CD19 CAR表达细胞基因集特征，用于评估具有ALL的受试 者。在一个实施方案中，该方法包括测量选自血液，血浆或血清样品的生物样品中以下一种或多种(例如2,3,4,5,10,15或更多种):表1A，表1B，表 7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1，或CD19 CAR表达细胞基因集特征。在一个具体实施方案中，生物样品是血液样品。在一个实施方案中， 样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。在一个 实施方案中，样品是制造的产品样品，例如。基因工程T细胞，例如从受 试者的血液获得，例如制造的CAR表达细胞产物，例如制造的CD19 CAR 表达细胞产物。
在一个实施方案中，提供了用于在患有癌症的受试者中评估或监测 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，CD19 CAR表达细胞 疗法)的有效性的方法，包括获取受试者的应答者或者复发者状态的值，包 括测量以下的一种或多种(例如，2,3,4,5,10,15或更多种):表1A，表1B，表 7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物标志，CD27生物标志， CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标志， IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物标志，CD8生物标志，TH1+ 辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征，记忆T细胞(例如 CD8+记忆T细胞，例如，初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞(TSCM)，例如 中央记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集特征，以及CD19 CAR表达细胞基因集特征，从而评估或监测受试者中CAR表达细胞疗法 的有效性。在一个实施方案中，所述方法包括测量下列一种或多种(例如， 2,3,4,5,10,15或更多种):表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10， 表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, KLRG1,或CD19 CAR表达细胞基因集特征。在一个实施方案中，方法包 括测量以下一种或多种(例如，2,3,4,5,10,15或更多种):表1A，表1B，表 7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1,或CD19 CAR表达细胞基因集特 征，用于评估或监测具有CLL的受试者中CAR表达细胞疗法的有效性。 在另一个实施方案中，方法包括测量以下一种或多种(例如，2,3,4,5,10,15 或更多种):表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表 15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列 的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1 或CD19CAR表达细胞基因集特征，用于评估或监测具有ALL的受试者 中CAR表达细胞疗法的有效性。在一个实施方案中，该方法包括测量选 自血液，血浆或血清样品的生物样品中以下一种或多种(例如，2,3,4,5,10,15 或更多种):表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表 15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中所列 的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1 或CD19 CAR表达细胞基因集特征。在一个实施方案中，生物样品是血液 样品。在一个实施方案中，样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的 血液获得的T细胞。在一个实施方案中，样品是制造的产品样品，例如， 基因工程T细胞，例如从受试者的血液获得。
在一个实施方案中，提供了用于提供对CAR表达细胞疗法(例如本文 所述的CD19CAR表达细胞疗法)在患有癌症的受试者中的成功率的预测 方法，所述方法包括以下步骤:提供来自受试者的生物样品；确定表1A，表 1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如，CCL20， IL-17a和/或IL-6)和表17中列出的一种或多种(例如2,3,4,5,10,15或更多种)基因的表达水平，以获得样品的基因表达模式；并基于获得的基因表达 模式，为受试者提供预后。在一个实施方案中，生物样品包括但不限于血 液，血浆或血清样品。在一个具体实施方案中，生物样品是血液样品。在 一个实施方案中，样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得 的T细胞。在一个实施方案中，受试者具有CLL。在一个实施例中，受试者具有ALL。
另一方面，提供了治疗患有癌症例如血液癌症的受试者的方法。在一 个实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，确定受试者在 表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例 如CCL20，IL-17a和/或IL-6)和表17中所列一种或多种(例如2,3,4,5,10,15 或更多种)标志的表达水平相对于参考水平是否具有差异，例如统计学显著 性差异，并且如果在测定的水平和参考水平之间存在差异，例如统计学显 著性差异，则向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)，从而治疗受试者。在一个实施方案中，其中在测定的水平和参 考水平之间存在差异，例如统计学显著性差异，所述方法包括在输注到受 试者之前修饰CAR表达细胞产物。在一个实施方案中，其中在所测定的 水平和参考水平之间存在差异，例如统计学显著性差异，所述方法包括在 输注到受试者之前修饰CAR表达细胞产物的制造。在一个实施方案中， 如果在所测定的水平和参考水平之间存在差异，例如统计学显著性差异， 则该方法包括调整CAR表达细胞输注剂量以实现抗癌作用。
在一个实施方案中，本文所述的治疗方法包括确定受试者是否具有对 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法例如本文所述的CD19 CAR 表达细胞疗法的应答的增加的可能性，通过相对于参考水平比较来自受试 者的样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表 15和表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)中的一种或多种(例如 2,3,4,5,10,15或更多种)标志的水平，其中在一个或多个标志基因表达水平 相对于参考水平的差异，例如统计学显著性差异表明增加的应答可能性； 并向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞，从而治疗受试者。在一 个实施方案中，样品选自血液，血浆或血清样品。在一个实施方案中，样 品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。
在一个实施方案中，本文所述的治疗方法还包括从受试者获得样品； 确定样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表 15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1中的一种或多种(例如 2,3,4,5,10,15或更多种)标志的水平；比较表1A，表1B，表7A，表7B， 表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)， 表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, 和KLRG1中的一种或多种标志的测定的水平与参考水平；并且如果受试 者在样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表 15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1中的一种或多种标志的测 定的水平与参考水平的比较中被鉴定为具有差异(例如，统计学显著性差 异)，则施用治疗有效剂量的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)。
在一个实施方案中，本文所述的治疗方法包括或进一步包括获取受试 者的应答者或复发者状态的值，其包括测量以下的一种或多种(例如 2,3,4,5,10,15或更多种):表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10， 表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表 20中列出的生物标志，CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物 标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物 标志，CD4生物标志，CD8生物标志,TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+ 辅助T细胞基因集特征，记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始 T细胞(TN)，例如记忆干细胞(TSCM)，例如中枢记忆T细胞(TCM)，例如效 应记忆T细胞(TEM))基因集特征，以及CD19 CAR表达细胞基因集特征， 并响应于应答者或复发者状态的确定，执行一，二，三,四个或更多个:将 受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者；施用CAR表达细胞疗 法；选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；选择或改变CAR表达细胞疗法 的时间表或时间过程；例如对非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞 疗法组合的另外的活性剂，例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑 制剂或激酶抑制剂，例如本文描述的激酶抑制剂；在用CAR表达细胞疗法 治疗之前向非应答者或部分应答者施用增加受试者中初始T细胞数量的疗 法；修改CAR表达细胞疗法的制备方法，例如对于被鉴定为非应答者或部 分应答者的受试者,例如在引入编码CAR的核酸之前富集初始T细胞；或选择备选疗法，例如对于非应答者，部分应答者或复发者，例如针对特定癌 症(例如，如本文所述)的护理标准；从而治疗受试者的癌症。
系统
在另一方面，本公开提供了用于预测受试者对CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)疗法，例如CD19 CAR表达细胞疗法，例如本文描述的 CD19 CAR表达细胞疗法的应答的试剂盒。该试剂盒包含至少一种特异性 检测一组基因(例如，2,3,4,5,10,15或更多的基因)的水平或活性的试剂，所 述基因选自表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和/或KLRG1；以及使用试剂盒的说 明书，例如用于预测受试者对CAR表达细胞疗法的应答。在一些实施方 案中，所述使用说明书规定，如果所检测的表达水平中的一种或多种不同 于，例如大于参考水平，则受试者更可能对CAR表达细胞疗法产生积极应答。在一些实施方案中，所述使用说明书规定，如果所检测的表达水平 中的一种或多种小于参考水平，则受试者更可能对CAR表达细胞疗法产 生积极应答。在一些实施方案中，如果PD-1，LAG-3或TIM-3或其任何 组合的水平或活性小于参考值，则受试者更可能对该疗法有积极应答。
在某些实施方案中，特异性检测所述组基因的表达水平的至少一种试 剂包含与从基因(例如cDNA或寡核苷酸)表达的mRNA互补的核酸探针。 核酸探针可以固定在基质表面上或可以在溶液中。该组试剂可以检测由所 述组基因编码的多肽，例如表面多肽的表达。在一个实施方案中，核酸探 针包含与表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15， 表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18列出的生物标志，PD-1, LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和/或KLRG1的核酸序列互 补的约10,15,20,25,30,35,40,45,50或100个核酸残基的核酸。试剂盒还 可以包含以下一种或多种:提取缓冲液/试剂和方案，扩增缓冲液/试剂和方 案，杂交缓冲液/试剂和方案，以及标记缓冲液/试剂和方案。
在某些实施方案中，试剂盒还包含至少一种CD19 CAR表达细胞(例 如，T细胞，NK细胞)基因集特征。在一个实施方案中，试剂盒还包含参 考标准。
在一个实施方案中，受试者具有CLL。
在一个实施例中，受试者具有ALL。
在一个实施方案中，受试者具有B细胞ALL。
在一方面，本公开的特征在于包含至少一种试剂的反应混合物，所述 试剂特异性检测选自表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10， 表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表 20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L和/或KLRG1 的一组基因(例如，2,3,4,5,10,15或更多的基因)的表达水平，和生物样品。 在一个实施方案中，样品选自血液，血浆或血清样品。在一个实施方案中， 样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。在一个 实施方案中，样品包含CAR表达细胞，例如CART表达细胞，例如CART19 细胞。
在某些实施方案中，特异性检测所述组基因的表达水平的至少一种试 剂包含与从基因(例如cDNA或寡核苷酸)表达的mRNA互补的核酸探针。 核酸探针可以固定在基质表面上或可以在溶液中。该组试剂可以检测由所 述组基因编码的多肽，例如表面多肽的表达。在一个实施方案中，核酸探 针包含与表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15， 表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生 物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和/或KLRG1 的核酸序列互补的约10,15,20,25,30,35,40,45,50或100个核酸残基的核 酸。反应混合物还可以包含以下一种或多种:提取缓冲液/试剂，扩增缓冲 液/试剂，杂交缓冲液/试剂和标记缓冲液/试剂。
在另一方面，本公开描述了用于评价受试者中的癌症的系统。所述系 统包括至少一个有效连接到存储器的处理器，所述至少一个处理器在执行 时被配置为执行本文所述的任何一个或多个步骤。
在另一方面，本公开描述了用于评估受试者中的癌症的系统。该系统 包括有效连接到存储器的至少一个处理器，所述至少一个处理器在执行时 被配置为:
获得应答者或复发者状态的值，其包含测量以下一个，两个，三个， 四个，五个，六个，七个或更多(全部)个:
(i)在样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR-表达细胞产物样 品)中例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+ CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)在样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR-表达细胞产物样 品)中一种，两种，三种或更多(例如，全部)静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，更年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，早 期记忆T细胞或其组合的水平或活性；
(iii)在样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR-表达细胞产物 样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的 CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多 种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)在样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR-表达细胞产物 样品)中的免疫细胞耗尽标志(例如，一种，两种或更多种免疫检查点抑制 剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3))的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1,或CD19CAR表达细胞基因集特征 中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标 志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品(例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所用组成成分的质量)， 其中细胞因子选自表16中所列的一种，两种，三种，四种，五种或更多种 (或全部)的细胞因子；
(vii)在制备的CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率； 或
(viii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或 CAR表达细胞产物样品，例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量。
应答于确定应答者状态的值的测定，执行一个，两个，三个，四个， 五个，六个，七个或更多(例如全部):
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复 发者；
建议施用CAR表达细胞疗法；
建议选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；
建议选择或改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
建议例如向非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞疗法组合的 额外活性剂,例如,检查点抑制剂，例如，本文所述的检查点抑制剂，
建议在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施 用增加受试者中初始T细胞数量的疗法；
建议修改CAR表达细胞疗法的制造方法，例如对于被鉴定为非应答 者或部分应答者的受试者，例如在引入编码CAR的核酸之前富集初始T 细胞；
建议在输注到患者体内前修饰CAR表达细胞产品；
建议调整CAR表达细胞输注剂量以达到临床疗效；
建议例如对于非应答者或部分应答者或复发者，施用备选疗法；
建议选择备选疗法，例如对于非应答者或部分应答者，例如特定癌症 类型的护理标准，或
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，建议降低TREG细胞群体 和/或TREG基因特征，例如通过CD25消耗，施用环磷酰胺，抗GITR抗 体，mTOR抑制剂或其组合。
在一个实施方案中，该值包括测量CD19 CAR表达细胞基因集特征以 及以下一种或多种(例如2,3,4,5,10,15或更多)的组合:表1A，表1B，表7A， 表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/ 或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物标志，CD27生物标志，CD45RO 生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标志，IL2RA 生物标志，IL21生物标志，CD4生物标志，CD8生物标志，TH1+辅助T 细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征和记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞(TSCM)，例如中枢记 忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集特征；并且响应于确定 应答者状态的值，执行以下一个，二个，三个，四个或更多个:将所述受试 者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者；建议CAR表达细胞疗法； 建议选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；建议备选疗法，建议组合疗法， 例如与CAR表达细胞疗法的组合，建议或改变CAR表达细胞疗法的制造 方法。
在一个实施方案中，所述至少一个处理器在执行时被配置为:获取应答 者状态的值，所述应答者状态的值包括测量CD19 CAR表达细胞基因集特 征和一种或多种(例如2,3,4，5,10,15或更多)以下的的组合:表1A，表1B， 表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1；并且响应于应答者状态的值的确 定，执行以下一个，二个，三个，四个或更多个:将所述受试者鉴定为完全 应答者，部分应答者或非应答者；建议CAR表达细胞疗法；建议选择或改变 CAR表达细胞疗法的剂量；建议备选疗法，例如，对特定癌症(例如，如本 文所述)的护理标准；建议组合疗法，例如与CAR表达细胞疗法的组合， 建议或改变例如本文所述的CAR表达细胞疗法的制造方法。
制造方法
在另一方面，本发明的特征在于评估CAR表达细胞产物(例如表达 CAR19的细胞产品样品(例如CTL019))的效力的方法。该方法包括获取以 下一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个或更多(例如全部) 的值:
(i)CAR表达细胞产物，例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或 CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)在CAR表达细胞产物中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较 年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆 T细胞或其组合的一个，两个，三个或更多(例如，全部)的水平或活性；
(iii)在CAR表达细胞产物中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较 老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一 个，两个，三个或更多个(例如，全部)的水平或活性；
(iv)CAR表达细胞产物中的免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更 多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B中列出的生物标 志，PD-1，LAG-3，TIM-3，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122, CD62L,KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征的一种，两种，三种， 四种，五种，十种，二十种或更多种的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品(例如CAR19表达细胞产物样品(例如， CTL019))中的细胞因子水平或活性，其中所述细胞因子选自一种，两种， 三种，四种，五种或更多种(或全部)表16中列出的细胞因子；
(vii)产物中CAR表达细胞的转导效率；
(viii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或表 达CAR的细胞产品样品，例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量； 或
(ix)TREG细胞或细胞群体的水平或活性，
其中(i),(ii),(vi),(vii),(viii)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产 物的效力增加，
其中(iii),(iv),(ix)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的效力 降低。
在相关方面，本发明的特征在于优化CAR表达细胞产物(例如表达 CAR19的细胞产品样品(例如CTL019))的制造方法。该方法包括:
(1)获得包含CAR表达细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞群体)的 样品；
(2)体外激活CAR表达细胞；
(3)通过确定以下的一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，八 个或更多个(例如全部)，评估活化的CAR表达细胞的效力:
(i)CAR表达细胞产物，例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或 CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)在CAR表达细胞产物中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，年 轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T 细胞或其组合的一个，两个，三个或更多(例如，全部)的水平或活性；
(iii)在CAR表达细胞产物中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较 老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一 种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)CAR表达细胞产物中的免疫细胞耗尽标志例如一种，两种或更多 种免疫检查点抑制剂(例如PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B中列出的生物标 志，PD-1，LAG-3，TIM-3，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122, CD62L,KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征的一种，两种，三种， 四种，五种，十种，二十种或更多种的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品(例如CAR19表达细胞产物样品(例如， CTL019))中的细胞因子水平或活性，其中所述细胞因子选自一种，两种， 三种，四种，五种或更多种(或全部)表16中列出的细胞因子；
(vii)产物中CAR表达细胞的转导效率；
(viii)受试者，例如来自受试者的样品(例如，单采血液成分术样品或表 达CAR的细胞产品样品，例如表达CAR19的细胞产品样品(例如， CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量； 或
(ix)TREG细胞或细胞群体的水平或活性，
其中(i),(ii),(vi),(vii),(viii)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产 物的效力增加，
其中(iii),(iv),(ix)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的效力 降低。
在相关方面，本文公开了CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)产品 (例如CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞，例如， CTL019)以确定产品的效力或功效的制造方法。在一个实施方案中，所提 供的方法包括从受试者例如血液，血清或血浆样品提供生物样品的步骤； 确定表1A，1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例 如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中所列的一种或多种(例如 2,3,4,5,10,15或更多)基因的表达水平，以获得样品的基因表达模式；(任选 地)将获得的基因表达模式与预定值进行比较；以及确定所获得的值和所述 预定值之间的差异。在一个实施方案中，确定的差异被记录在质量控制记 录中。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法还包括富集，例如分离具有 (i),(ii),(vi),(vii),(viii)，或其任何组合的增加，或(iii)，(iv)，(ix)或其任何 组合的减少的细胞。
在另一方面，本发明的特征在于制造产品样品的方法，所述产品样品 为例如基因工程化的T细胞，例如从受试者的血液获得，例如制造的CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物，例如CD 19CAR表达细胞产物， 例如本文所述的CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019)。在一个实施方 案中，该方法包括:
提供制造的产品样品，例如基因工程化的T细胞，例如从受试者的血 液获得的，例如制造的CAR表达细胞产物，例如CD19 CAR表达细胞产 物，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019)；
(i)获得从CAR表达细胞产物分泌的细胞因子表达谱(例如表14，表15 或表16(例如CCL20，IL-6和/或IL-17a))；和/或
(ii)获得产品中CAR表达细胞的转导效率的度量；
基于确定的细胞因子水平或转导效率(或两者)鉴定适合于施用的CAR 表达细胞产物；和
任选地，选择用于施用于受试者的CAR表达细胞产物，
从而制造CAR表达细胞产物。
在前述制造方法的某些实施方案中，细胞因子选自CCL20/MIP3a, IL17A,IL6,GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα 或其组合的一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种，或更多种(或全 部)。在一个实施方案中，细胞因子选自IL-17a,CCL20,IL2,IL6,或TNFa 的一种，两种，三种，四种或更多种(全部)。例如，细胞因子可以选自:IL-17a 和CCL20中的一种或两种；CCL20/MIP3a和IL17A的一种或两种；或 CCL20/MIP3a，IL17A和IL6的一种或两种或全部。在一个实施方案中， 细胞因子是CCL20/MIP3a。在另一个实施方案中，细胞因子是IL17A。 在另一个实施方案中，细胞因子是IL6。
在前述制造方法的某些实施方案中，15％或以上的转导效率表示增加 的效力。在其它实施方案中，小于15％的转导效率表明降低的效力。
在某些实施方案中，任何上述制备方法还包括例如通过CD25消耗， GITR消耗或mTOR抑制减少TREG细胞的数目(例如，消耗)。备选或组合 地，制造方法还包括使样品例如单采血液成分术样品样品与抗GITR抗体 接触。
在某些实施方案中，在体外激活后评估(i)，(ii)或(iii),(iv),(v),(vi),(vii),(viii),(ix)任一个的任何上述制备方法或其任何组合(例如，全部)。
在一个实施方案中，细胞因子谱包括CCL20(也称为MIP3a)，IL-17a, IL-6,GM-CSF,IFNγ,IL-10,IL-13,IL-2,IL-21,IL-4,IL-5,IL-9和TNFα 的一种或多种(例如一种，二种，三种，四种，五种，六种或更多种)。在 一个实施方案中，细胞因子谱包括CCL20。在一个实施方案中，细胞因子 谱包括IL-17a。在一个实施方案中，细胞因子谱包括IL-6。在一个实施方 案中，细胞因子谱包括CCL20，IL-17a和IL-6的两种或更多种(例如全部 三种)。
在一个实施方案中，所述方法还包括确定由CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞)产物分泌的表14，表15或表16(例如，CCL20，IL-17a 和/或IL-6)的一种或多种细胞因子的表达水平。在一个实施方案中，表14， 表15或表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)的一种或多种细胞因子的分 泌是应答于一种或多种靶肿瘤抗原对CAR表达细胞产物刺激。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征或水平指示CAR表达 细胞产物的效力。在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征是对血液 癌症(例如CLL和ALL)中的CAR表达细胞产物的应答的标志。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征或水平预测受试者对 CAR表达细胞产物的应答。
在一个实施方案中，表16中所述的细胞因子特征或水平预测受试者对 CAR表达细胞产物的应答。
在一个实施方案中，IL-17a和CCL-20表达水平预测受试者对CAR 表达细胞产物的应答。
在一个实施方案中，该方法还包括以下一个或多个(例如，一个，两个， 三个或全部):获得血液样品，例如从受试者的血液获得的T细胞群体；例 如通过本文所述的方法激活T细胞群体；使用包含编码CAR(例如本文所述 的CAR,例如本文所述的CD19 CAR,例如，CTL019)的核酸的载体例如转 导来自T细胞群体的细胞，遗传工程化来自T细胞群体的细胞；扩增包含 经遗传工程化的T细胞(例如通过本文所述的方法，例如用编码CAR,例如， 本文所述的CAR,例如本文所述的CD19 CAR的核酸转导的细胞)的T细胞 群体。
在一个实施方案中，本文所述的CAR转导效率指示受试者对血液癌 症(例如CLL和ALL)中的CAR表达细胞疗法的应答。
在一个实施方案中，本文所述的CAR转导效率预测了受试者对血液 疾病(例如CLL和ALL)中CAR表达细胞疗法的应答。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征或水平用于在输注于患 者之前改善和/或修饰CAR表达细胞产物(例如，CD19 CAR表达细胞产物， 例如CTL019)。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征或水平用于评估制造的 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)产物。在一个实施方案中，本文所 述的细胞因子特征或水平提供制造方法优化中的终点。
在一个实施方案中，任何上述制备方法包括将比较结果记录在用于 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂(例如，如本文所述的制备的 CD19 CAR表达细胞制剂，例如CTL019)的质量控制记录中的步骤。在一 个实施方案中，所述方法还包括从被鉴定为部分应答者或非应答者的受试 者获得T细胞的制剂，并增加所述制剂中初始T细胞的数量。在一个实施 方案中，所述方法还包括将编码CAR的核酸引入所述T细胞制剂中。
在一个实施方案中，该方法还包括从被鉴定为部分应答者或非应答者 的受试者获得免疫效应细胞(例如T细胞)的制剂，并随后用增加受试者中 初始T细胞数量的活性剂治疗，例如，受试者已经用激酶抑制剂例如 mTOR抑制剂(例如本文所述)和/或检查点抑制剂(例如本文所述)进行治 疗。在一个实施方案中，所述方法还包括将编码CAR的核酸引入所述制 剂的多种免疫效应细胞(例如T细胞)中。
在一个实施方案中，CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物是 CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞，例如CTL019。
在另一方面，本公开提供了一种或多种基因特征或表达谱，其区分癌 症，例如血液癌症(例如ALL和CLL)中CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)治疗的复发者和CAR表达细胞治疗的非复发者。
在一个实施方案中，本文所述的一种或多种基因特征或表达谱可以使 得能够改进制成品，从而降低患者复发的可能性。在一个实施方案中，本 文所述的基因特征用于修饰制成品的治疗应用，从而降低患者复发的可能 性。
在一个实施方案中，本文所述的一种或多种基因特征或表达谱在CAR 表达细胞治疗(例如，CD19 CAR表达细胞治疗，例如CTL019治疗)之前 在受试者中进行鉴定，其预测CAR表达细胞治疗的复发。在一个实施方 案中，本文所述的一种或多种基因特征或表达谱在单采血液成分术样品中 被鉴定。在一个实施方案中，本文所述的一种或多种基因特征或表达谱在 骨髓样品中被鉴定。在一个实施方案中，本文所述的一种或多种基因特征 或表达谱在输注前在制备的CAR表达细胞产物(例如CD19 CAR表达细胞 产物，例如CTL019)中被鉴定。
在一个实施方案中，在单采血液成分术前或在制备CAR表达细胞产 物期间降低受试者中的TREG水平或基因特征显著降低了受试者复发的风 险。
在一个实施方案中，在用于CAR表达细胞产物制造的细胞收集之前, 受试者用一种或多种减少TREG细胞的疗法预治疗，从而降低受试者对 CAR表达细胞治疗(例如，CTL019治疗)复发的风险。在一个实施方案中， 降低TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗 体，CD25-耗尽，mTOR抑制剂或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25耗尽，mTOR抑制剂或其组合中的一种或多种可以 在CAR表达细胞产物的输注之前，期间或之后进行。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前， 将受试者用环磷酰胺预治疗，从而降低受试者对CAR表达细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞产物制造的细胞之前， 用抗GITR抗体预治疗受试者，从而降低受试者对CAR表达细胞治疗(例 如CTL019治疗)复发的风险。
在一个实施方案中，修饰CAR表达细胞制备方法，以在制备CAR表 达细胞产物(例如CTL019产物)之前消耗TREG细胞。在一个实施方案中， 在制备CAR表达细胞产物(例如CTL019产物)之前，使用CD25消耗来消 耗TREG细胞。因此，在一些实施方案中，该方法还包括:
a.提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群体；和
b.从群体中除去T调节细胞，从而提供T调节消耗的细胞群；
其中在将编码CAR的核酸引入群体之前进行步骤a)和b)。
在该方法的实施方案中，T调节细胞包含CD25+T细胞，并使用抗 CD25抗体或其片段从细胞群体中除去。抗CD25抗体或其片段可以与基 质例如珠缀合。
在其它实施方案中，由步骤(b)提供的T调节耗尽细胞群含有少于30％, 25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％的CD25+细胞。
在其他实施方案中，所述方法还包括从表达不包含CD25的肿瘤抗原 的群体中移除细胞，以在将编码CAR的核酸引入群体之前提供T调节性 耗尽的和肿瘤抗原耗尽的细胞群体。肿瘤抗原可以选自CD19,CD30, CD38,CD123,CD20,CD14或CD11b，或其组合。
在其它实施方案中，所述方法还包括从表达检查点抑制剂的群体中移 除细胞，以在将编码CAR的核酸引入群体之前提供T调节耗尽的和抑制 性分子耗尽的细胞群。抑制性分子，例如检查点抑制剂，可以选自PD1, PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(e.g.,CEACAM-1,CEACAM-3 和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4, CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或 CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如， TGFRβ)，例如，如本文所述。
本文公开的其它实施方案包括提供免疫效应细胞群。提供的免疫效应 细胞群可以基于CD3，CD28，CD4，CD8，CD45RA和/或CD45RO中的 一种或多种的表达来选择。在某些实施方案中，提供的免疫效应细胞群是 CD3+和/或CD28+。
在该方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括在已经引入编码 CAR的核酸分子之后扩增细胞群。
在实施方案中，细胞群扩增8天或更短的时间。
在某些实施方案中，细胞群在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在 相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。
在其他实施方案中，细胞群在培养物中扩增5天，并且与在相同培养 条件下培养物中扩增9天的相同细胞相比，在抗原刺激时，显示出细胞倍 增至少增加1倍，2倍，3倍或4倍。
在其他实施方案中，细胞群在培养物中扩增5天，并且与在相同培养 条件下培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎 IFN-γ和/或GM-CSF水平。
在其它实施方案中，通过在刺激CD3/TCR复合物相关信号的活性剂 和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的配体的存在下培养细胞来扩增细胞 群。该活性剂可以是与抗CD3抗体或其片段，和/或抗-CD28抗体或其片 段缀合的珠。
在其他实施方案中，细胞群在包括一种或多种白细胞介素的合适培养 基中扩增，所述白细胞介素导致在14天扩增期中细胞至少增加200倍，250 倍，300倍或350倍，如通过流式细胞术测量。
在其他实施方案中，细胞群在存在IL-15和/或IL-7的情况下扩增。
在某些实施方案中，该方法还包括在适当的扩增期后冷冻保存细胞 群。
在其他实施方案中，本文公开的制备方法还包括使免疫效应细胞群与 编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是 DNA。
在其它实施方案中，本文公开的制备方法还包括在包含2％hAB血清 的血清中培养免疫效应细胞群。
在本文所述的任何方法、系统和试剂盒中，CD19 CAR可以包含表12 所述的抗CD19结合结构域，或CDR,例如表12中描述的抗CD19结合结 构域的一个或多个(例如全部)HCCDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，CAR可以包含以下 之一或多个:前导序列，例如本文例如在表11中所述的前导序列；抗CD19 结合结构域，例如本文,例如表12所述的抗CD19结合结构域；铰链区，例 如本文所述的铰链区，例如表11中所述的铰链区；跨膜结构域，例如本文, 例如表11所述的跨膜结构域；和细胞内信号传导结构域(例如共刺激结构域 和/或一级信号传导结构域，例如本文例如表11中所述的共刺激结构域， 和/或本文例如表11中所述的一级信号传导结构域)。在一个实施方案中， CD19CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)是表13中所述的CTL019 或CD19 CAR。
尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或 测试中，但是合适的方法和材料在下面描述。本文提及的所有出版物，专 利申请，专利和其他参考文献(例如，序列数据库参考号)通过引用整体并 入本文。例如，本文中提及的所有GenBank，Unigene和Entrez序列，例 如在本文的任何表中，例如表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表14，表17，表18和表20中的任何一个通过引用并入本文。除非另有说明，本 文规定的序列登录号，包括本文中任何表格，例如表1A，表1B，表7A， 表7B，表8，表14，表17，表18和表20中的任何一个，参考截至2014 年10月8日的数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时， 包含所有序列变体。
此外，材料，方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。标题，子 标题或编号或字母元素，例如(a)，(b)，(i)等仅仅是为了便于阅读而呈现。 在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求以字母顺序执行步骤或元 素，或者步骤或元素必须彼此离散。本发明的其他特征，目的和优点将从 说明书和附图以及权利要求书中变得显而易见。
附图说明
图1描绘了示例性模型，其说明了在单采血液成分术中对T细胞进行 的全基因组CTL019 RNAseq分析以及针对21个CLL和7个ALL样品的 CTL019制造之后的发现。该模型证明完全应答者(CR)的表达模式具有比 非应答者(NR)更年轻的T细胞表型。记忆T细胞亚组在CR与NR之间差 异富集，CR显示与T记忆干细胞的相似性。
图2A描绘了在本文所述的全基因组CTL019 RNAseq分析中分析的 样品数目的示例性直方图。p＝产品；a＝单采血液成分术。图2B是示出分 析的概述的示例性示意图。简言之，对于每个基因集，应用3组统计模型 来确定CLL产物CR,PR和NR之间的元基因是否在统计学上是不同的。 CR更像静息TEFF细胞，而NR更像是活化的TEFF细胞。CTL019 NR样 品比CR样品处于更激活的状态。
图3描绘了记忆T细胞前体和子集的示例性示意图。不希望受特定理 论的约束，CTL019样品中记忆T细胞的状态可能是应答的主要成分。
图4描述了说明TSCM对TCM上调的基因集的元基因得分的示例性结 果。x轴是应答组的样品，其中a＝单采血液成分术和p＝产物。y轴是归 一化的元基因表达得分。富含CLL CR(例如CTL019 CR)的基因集也富含 急性淋巴细胞白血病(ALLs)。ALL和CLL CRs富集T干细胞(TSCM)子集 特异性基因，而CLL PR和NRs富集在T中心记忆(TCM)子集基因中。在 单采血液成分术中也可以看到与产品样品相同的模式。所有表达模式与 CLL CR最相似，并且在静息/未刺激/早期记忆T细胞的方向上更加极端。
图5A描绘了CTL019样品的主要成分分析(PCA)的示例性结果。该示 例性PCA结果示出了CRs，ALL和正常样品与PR和NR分开聚类。图 5B描绘了来自CTL019的PCA和单采血液成分术样品的示例性结果。该 示例性PCA结果说明，CRs，ALL和正常样品与PRs和NRs以及从单采 血液成分术聚类分开聚类。
图6描绘了描述单采血液成分术和产品样品的免疫表型分型的示例性 示意图。
图7A和7B描绘了鉴定产品样品中的应答的相关性的示例性多色流 式细胞术分析结果。分析了来自CLL患者的36个制备的CTL019样品。 样品包括5个CR,8个PR,19个NR和3个待决的样品。图7A描述了说 明CD4+细胞百分比和患者应答的示例性结果。图7B描述了说明CD8+细 胞百分比和患者应答的示例性结果。
图8A，图8B，图8C和图8D描述了在T细胞上PD1和CAR19 表达的示例性流式细胞术分析。图8A和8B是代表性的流式细胞术谱图， 其证实在来自对CAR表达细胞治疗的完全应答者(CR)或非应答者(NR)的 受试者的CD4+T细胞上PD-1和CAR19表达的分布。图8C是显示来自对 CAR表达细胞治疗具有不同应答的受试者组的CD4+T细胞群体中PD1细 胞百分比的图。图8D是显示来自具有对CAR表达细胞治疗的不同应答的 受试者组的CD8+T细胞群体中PD1细胞的百分比的图。
图9A和图9B描绘了对作为CAR表达细胞治疗的完全应答者(CR) 或非应答者(NR)的受试者的T细胞上的PD1，CAR19和LAG-3表达的示 例性流式细胞术分析。图9C描述了显示来自对CAR表达细胞治疗具有不 同应答的受试者组的PD1和LAG-3表达的分布的示例性结果。非应答者 (NR)产物比CR具有更高百分比的PD1+CAR19+LAG3+T细胞。这些数 据表明NR产物显示出PD1+CAR+的耗尽表型和LAG3的共表达。
图10A和图10B描绘了来自作为CAR表达细胞治疗的完全应答者 (CR)或非应答者(NR)的受试者的T细胞上的PD1，CAR19和TIM-3表达 的示例性流式细胞术分析。图10C描述了显示来自具有对CAR表达细胞 治疗具有不同应答的受试者组的PD1和TIM-3表达的分布的示例性结果。 非应答者(NR)产物比CR具有更高百分比的CAR19+PD1+TIM3+细胞。 这些数据表明NR产物表现出PD1+CAR+的耗尽表型和TIM3的共表达。
图11描述了说明CAR产物中的CD27水平与患者应答相关的示例性 结果。与PR和NR相比，CRs CD8+细胞显示较高百分比的CD27+细胞。
图12描绘了确定单采血液成分术样品中的应答相关性的示例性多色 流式细胞术分析结果。分析了26例来自CLL患者的单采血液成分术样品。 样品包括4例CR,6例PR,14例NR和1例患者未入院。
图13描绘了示例性多色流式细胞术分析结果，其示出了较年轻的T 细胞表型与对CTL019治疗的应答之间的相关性。这些数据表明，CD8+ CD45RO-在CD8+T细胞中的百分比预测了哪些CLL患者将经历对 CTL019的完全应答。
图14描绘了在CTL019治疗之前人类患者中单采血液成像术的示例 性分析。示例性结果说明，虽然患者1000-00045呈现非常少的T细胞，但 是27％的T细胞是CD8+CD27+CD45RO-。
图15描绘了CTL019治疗的患者应答(患者1000-00045)的示例性结 果。CD8+CD27+CD45RO-T细胞是CTL019治疗的患者应答的阳性预测 子。这些示例性结果说明，单采血液成分术中良好的预后表型是高百分比 的CD8+CD27+CD45RO-T细胞(初始或TSCM表型)。CTL019产物的不良 预后表型是高百分比的PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞(耗尽的表 型)。
图16描绘了计算机系统的示例性框图，可以在其上实施各个方面和实 施方案。
图17描绘了显示刺激的CTL019产物和CLL患者中细胞因子表达的 双重聚类的示例性热图。两个聚类(聚类1和聚类3)几乎完全由CR和PR 组成，而其他两个聚类(聚类2和聚类4)主要包含NR。平均来说，CRs/PRs 与NRs的细胞因子表达水平较高。顶部小图显示热图图像的红色通道，中 间小图显示蓝色通道，底部小图显示绿色通道。
图18描绘了统计学显著的细胞因子(例如CCL20/MIP3a，IL2，TNFα， IL17a和IL6)的对数归一化表达的示例性结果，以区分CLL患者中的 CR,PR和NR。
图19A示出了示例性散点图，其显示了IL17A(y轴)和CCL20(x轴) 表达的对数归一化相关性。虚线表示将NR与CR/PR分离的分类边界。每 个点代表CLL患者，交叉阴影(NR)，黑色(PR)和白色(CR)代表临床反应。 相关系数由“r”(例如0.928的相关系数)和使用“p值”(例如，对应的p值为 1.36e-09)的相关p值表示。图19B示出了CCL20与CAR+细胞百分比的相关性的示例性散点图，相关系数为0.395，相应的p值为0.0761。每个 点代表CLL患者，交叉阴影(NR)，黑色(PR)和白色(CR)代表临床反应。 相关系数用“r”表示，相关性的相应的p值用“p值”表示。图19C示出了 显示IL17a与CAR+细胞百分比的相关性的示例性散点图，相关系数为 0.278，相应的p值为0.222。每个点代表CLL患者，交叉阴影(NR)，黑色 (PR)和白色(CR)代表临床反应。相关系数用“r”表示，相关性的相应的p 值用“p值”表示。
图20描绘了与非复发者，完全应答者(CR)相比，TREG基因在复发者 (R)中具有高表达水平的示例性结果(p＝0.000215)。x轴是应答组的样品， 其中CR＝完全应答者，R＝复发者。y轴是归一化的元基因表达得分。
图21描绘了示例性散点图，显示了完全应答者(CR)(白色)，部分应答 者(PR)(黑色)和非应答者(NR)(阴影)在收获前的CAR+细胞百分比(即转导 率)。在收获前测量转导效率并与受试者应答(例如CR,PR或NR)相关。实 线表示将大多数非应答者与应答者分开的15％转导效率。不希望受到特定 理论的约束，这些数据表明预收获的CAR转导率是对CLL中CAR表达 细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗的应答的标志。
图22是描绘输注的CD27+PD1-CART细胞数与治疗应答之间关系的 柱状图。
图23是描绘输注的CD27+PD1-CART细胞数与治疗应答之间的关系 的散点图。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“一个”是指物体的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。 作为示例，“元素”是指一个元素或多于一个元素。
当涉及诸如量，持续时间等的可测量值时，术语“约”意在包括±20％ 的变化或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下为 ±1％，或在某些情况下为指定值的±0.1％，因为这些变化适用于实施公开 的方法。
本文使用的术语“获取”是指通过“直接获取”或“间接获得”物理实体或 值，获得物理实体(例如，样品，多肽，核酸或序列)或值，例如数值的占 有。“直接获取”是指执行方法(例如，执行合成或分析方法)以获得物理实 体或值。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的 第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括执行包括物理物 质(例如起始材料)的物理变化的方法。示例性变化包括从两种或更多种起 始材料制造物理实体，剪切或分裂物质，分离或纯化物质，将两个或更多 个分离的实体组合成混合物，进行包括断裂或形成共价或非共价键的化学 反应。直接获取值包括执行包括样品或其他物质的物理变化的方法，例如， 执行包括物质，例如样品，分析物或试剂的物理变化的分析过程(有时在本 文中称为“物理分析”)，执行分析方法，例如包括以下一个或多个的方法: 从另一物质中分离或纯化物质，例如分析物或其片段或其其他衍生物；将分 析物或其片段或其他衍生物与另一物质例如缓冲液，溶剂或反应物组合； 或通过在分析物的第一和第二个原子之间破坏或形成共价键或非共价键 来改变分析物或其片段或其它衍生物的结构；或者通过改变试剂或其片段 或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间破坏或形成 共价或非共价键。
正如本文中使用的那样，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免 疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多 链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。 抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
本文所述的生物标志的术语“改变的表达水平”(例如，表1A，表1B， 表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16，表18，表20中 列出的生物标志，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, KLRG1,和CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)基因特征)指测 试样品,例如来自患有癌症(例如，诸如ALL和CLL的血液癌症)的患者的 样品中标志的表达水平的增加(或减少)大于或小于用于评估表达的测定法 的标准误。在实施方案中，所述改变可以是对照样品(例如，来自不患有相 关疾病的健康受试者的样品)中生物标志的表达水平或几个对照样品中的 平均表达水平的至少两倍，至少三倍，至少四倍，至少五倍，或至少十倍 或以上更大或更小。可以在蛋白质或核酸(例如mRNA)水平上确定“改变的 表达水平”。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过 结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部 分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv 抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片 段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片 段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原 结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内 抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger 和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也 可以接枝到基于多肽的支架，比如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利 号:6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。术语“scFv”是指包含至 少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体 片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是经由短的柔性多肽接头邻 接的，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完 整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变 区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在的抗体分子中两种类型 的多肽链中较大的一个，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中两种类型 的多肽链中中较小的一个。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗 体轻链同种型。
本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗 原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。例如，通常，每个重链可变区中有 三个CDR(例如，HCDR1，HCDR2和HCDR3)，以及每个轻链可变区中 有三个CDR(LCDR1，LCDR2和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列 边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，包括由Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed. PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (“Kabat”编号方案),Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948 (“Chothia”编号方案)描述的方案或其组合。
在Kabat编号方案下，在一些实施方案中，重链可变结构域(VH)中的 CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和 95-102(HCDR3)；轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为 24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia编号方案下，在一些实施方案中，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)， 52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的CDR氨基酸残基编号为 26-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和 Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为KabatCDR,Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案 中，CDR对应VH，例如哺乳动物VH，例如人VH中的氨基酸残基26-35 (HCDR1),50-65(HCDR2),和95-102(HCDR3)；和VL，例如哺乳动物 VL，例如人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和 89-97(LCDR3)。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限 于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、 癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状 的改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌症首次 出现的能力。术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段表现的生物学效应， 包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少 或肿瘤细胞存活率降低。
术语“同种异体的”是指来源于与将导入物质的个体相同物种的不同动 物的任何物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体 被认为是彼此同种异体的。在某些方面，来自相同物种的个体的同种异体 物质可以在遗传上是足够不同的而以在抗原性上相互作用。.
本文所用的术语“单采血液成分术”是指体外方法，供体或患者的血液 通过该方法从供体或患者中移出并通过分离出选择的特定成分的装置并 将其余部分，例如通过再输血返回供体或患者的循环。因此，在“单采血液 成分术样品”的上下文中，是指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“自体”是指从同一个体获得的任何材料，该材料后来被重新引入 该个体。
“生物标志”或“标志”是经历表达改变的基因，mRNA或蛋白质，所述 改变与癌症(例如血液癌症，例如ALL和CLL)的进展或对治疗的反应性 相关。与从受试者的基线或先前值、不同时间间隔的受试者、癌症患者群 体的平均值或中值、健康对照或健康受试群体(例如对照)获得的样品的量 和/或活性相比，从患有癌症的受试者获得的生物样品(例如，血液，血浆 或血清样品)中的改变可以是量和/或活性的改变；表达和/或活性的这种改 变与具有癌症疾病状态的受试者(例如，血液癌症如ALL和CLL)对CAR 表达细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞(例如，表达CAR的T细胞， NK细胞)治疗，例如CD19 CAR表达细胞治疗的应答性相关联。例如，与 从对照受试者获得的生物样品相比，从患有或怀疑患有癌症的受试者获得 的生物样品中，预测对治疗剂应答性的本发明的标志可以具有改变的表达 水平，蛋白质水平，或蛋白质活性。
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以 局部扩散或穿过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本 文描述的，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、 胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。癌 症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细 胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)， 慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，母细胞性浆细胞 样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤， 毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT 淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发 育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细 胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一 个实施方案中，癌症与CD19表达相关。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可 互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体肿瘤。如本文所用，术语“癌 症”或“肿瘤”包括恶化前，以及恶性癌症和肿瘤。
术语“与癌症相关的抗原”或“肿瘤抗原”可互换地是指与正常细胞相 比全部地或以片段形式(例如MHC/肽)优选在癌细胞表面上被表达的分 子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学活性剂优先 靶向癌细胞。在某些实施方式中，肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞表达的 标志，例如谱系标志例如在B细胞上的CD19。在某些实施方式中，与癌 症相关的抗原为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如 与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达。在某些实施 方式中，与癌症相关的抗原为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子， 例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在 某些实施方式中，肿瘤抗原应当全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专 一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。在某些实施方式中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递肽的抗 原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白质 的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子的口袋，并且被CD8+T 淋巴细胞上的T细胞受体(TCRs)识别。I类MHC复合体由全部有核细胞 组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表 免疫疗法的独特类型的细胞表面靶点。已经描述了在人类白细胞抗原 (HLA)-A1或HLA-A2的情形中来源于病毒或肿瘤抗原的TCR-样抗体靶 向肽(参见，例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等 人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao 等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR-样抗体可以从筛选库比如人scFv噬 菌体展示文库鉴别。
如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，其是可在白血病前体 细胞上检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中 找到，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸 序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，编码人CD19的核 苷酸序列可以在登录号NM_001178098中找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变，片段，插入，缺 失和剪接变体。CD19在大多数B系癌症上表达，包括例如急性成淋巴细 胞白血病，慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。表达CD19的其他细 胞在“与CD19的表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的 早期标志。参见例如Nicholson et al.,MOL.IMMUN.34(16-17):1157-1165(1997)。一方面，CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)的抗原结合部分 识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD19蛋白在 癌细胞上表达。在一个实施方案中，CD19具有野生型序列，例如野生型 人类序列。在另一个实施方案中，CD19具有突变序列，例如突变人序列
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中 通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞) 的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细 胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为 “细胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共 刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同 的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼 此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开 关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构 域偶联至胞内信号传导结构域。一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受 体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含一级信号 传导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质 信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分 子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)， CD27，ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞 外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导 结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包 含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内 信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生 自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白， 其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细 胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传 导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包括 嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号 传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺 激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结 构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的 前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N 末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构 域(例如scFv)切除，并将CAR定位于细胞膜。在一个实施方案中，CAR 是CTL019。
包含抗体或其抗体片段的CAR组合物的部分可以多种形式存在，其 中抗原结合结构域被表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体 片段(sdAb)，单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,COLDSPRING HARBOR LABORATORY PRESS,NY；Harlow et al.,1989,In:ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al., 1988,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体 片段。另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫 球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合 结构域”或“抗体分子”包括抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子 是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其 中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具 有对第一表位的结合特异性和多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一个实施方案 中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种 抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异 性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第 二免疫球蛋白可变结构域序列。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以以多种形式存在， 其中抗原结合结构域被表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗 体片段(sdAb)，单链抗体(scFv)，人源化抗体或双特异性抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体 片段。另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19(例如，野生型 或突变型CD19)表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达CD19的细胞 相关的病症，包括，例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症例如骨 髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相 关的非癌症相关适应证。为了避免疑问，与CD19表达相关的疾病可以包 括与目前不表达CD19的细胞相关的病症，例如因为CD19表达已被下调， 例如由于用靶向CD19的分子例如，CD19 CAR治疗，但从前表达CD19。 一方面，与CD19的表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症是白 血病或淋巴瘤。一方面，与CD19的表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤， 包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如急性骨髓性 白血病(AML)，B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞急性淋巴 细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血 病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)。与CD19表达相关的额外癌症或血液病包括但不限于例如B细胞 早幼粒细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥 漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡 淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边 缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍 奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤， 瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，骨髓增生性肿瘤；组织细胞病变(例如，肥大 细胞病症或母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤)；肥大细胞疾病，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；B细胞淋巴细胞性白血病，浆细胞骨髓 瘤和“白血病前期”，它们是通过骨髓血液细胞的无效生产(或发育不良)联 合在一起的血液病症的多样化集合，等。与CD19表达相关的其它疾病包 括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤， 癌前病症或增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应证包括但不 限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎症性病症(变态反应和哮喘)和移 植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时候表达编码 肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗 原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低 的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一点产生可检测 水平的肿瘤抗原蛋白质，随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其它实施方案中，该疾病是CD19阴性癌症，例如CD19阴性复发性癌症。 在一些实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞表达或在任何时候表 达了编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如 CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白 可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例 如CD19)的细胞在一点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白质，随后基本上不 产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合从而介导T细胞的共 刺激应答，例如但不限于增殖的T细胞上的同源结合配偶体。共刺激分子 是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激 分子包括但不限于I类MHC分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白， 细胞因子受体，整联蛋白，信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK 细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30, CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS, ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR), KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19, CD4,CD8alpha,CD8beta,IL2R beta,IL2R gamma,IL7R alpha,ITGA4, VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD, CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b, ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D, NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244, 2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160 (BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162), LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,CD19a,和与CD83特异性结合的 配体。
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。胞内信号 传导结构域可以包括衍生其的分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信 号传导结构域、或其功能片段。
如本文所使用的，“应答者或复发者状态的值”包括预测受试者对治疗 (例如，包含或由如本文所述CAR表达细胞疗法组成的治疗)的应答性或复 发的测量(例如，水平)。在一些实施方案中，该测量是定性的或定量的。 在一些实施方案中，应答者或复发者状态的值是完全应答者，部分应答者， 非应答者，复发者或非复发者。在一些实施方案中，应答者或复发者状态 的值是作为完全应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复发者的概率。在一些实施方案中，可以基于如本文所述的(i)-(viii)中任何一项的测量 来确定应答者或复发者状态的值。
关于应答性，如果受试者中癌症(例如，血液癌症，例如癌细胞生长， 增殖和/或存活)参数被延迟或减少可检测的量，例如约5％,10％,20％, 30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多(如通过任何适当的测量，例 如质量，细胞计数或体积测定)，那么受试者应答治疗。在一个实例中，如 果与不施用治疗的预期寿命相比，受试者经历预期寿命延长约5％,10％, 20％,30％,40％,50％或更高，则受试者应答治疗。在另一个实例中，如果 受试者具有增加的无病生存期，总生存期或增加的进展时间，则受试者应 答治疗。
可以使用几种方法来确定患者是否应答治疗，包括例如NCCN肿瘤学 临床实践指南(NCCN
Figure BDA0003147962450000561
)提供的标准。例如，在B-ALL的上下文 中，完全应答或完全应答者可以涉及以下一种或多种:<5％BM胚细胞，> 1000个嗜中性粒细胞/ANC(/L),>10万血小板(/L)，无循环胚细胞或 髓外疾病(无淋巴结病，脾肿大，皮肤/牙龈浸润/睾丸质量/CNS受累)，三 线造血，无复发持续4周。部分应答者可能涉及以下一种或多种:BM胚细 胞>50％减少，>1000个嗜中性粒细胞/ANC(/L)，>100,000血小板(/L)。非应答者可以显示疾病进展，例如BM胚细胞中>25％。
本文所用的“完全应答者”是指具有疾病例如癌症的患者，其对治疗表 现出完全应答，例如完全缓解。例如使用NCCN
Figure BDA0003147962450000571
或Cheson et al,J Clin Oncol 17:1244(1999)和Cheson et al.,“Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”,J Clin Oncol 25:579-586(2007)(两者 均通过引用完整并入本文)，可以确定完全应答，如本文所述。
本文所用的“部分反应者”是指具有疾病例如癌症的受试者，其对治疗 表现出部分应答，例如部分缓解。可以例如使用NCCN
Figure BDA0003147962450000572
或本文 所述的Cheson标准来鉴定部分应答。
本文所用的“非应答者”是指具有疾病例如癌症的受试者，其不显示对 治疗的应答，例如患者具有稳定的疾病或进行性疾病。可以例如使用 NCCN
Figure BDA0003147962450000573
或本文所述的Cheson标准来鉴定非应答者。
本文所用的术语“复发”是指在初始应答期(例如，完全应答或部分应 答)之后，例如在用疗法例如癌症疗法进行的先前治疗之后再次出现疾病 (例如癌症)。初始应答期可能涉及癌细胞水平低于某一阈值，例如低于 20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,或1％。再次出现可能涉及癌细胞升高 到一定阈值以上的水平，例如高于20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,或 1％。例如，在B-ALL的上下文中，再次出现可能涉及例如在完全应答之 后血液，骨髓(>5％)或任何髓外部位中的胚细胞的再次出现。在这种情况 下，完全应答可能涉及<5％的BM胚细胞。更一般地，在一个实施方案中， 应答(例如，完全应答或部分应答)可以涉及不存在可检测的MRD(最小残 留疾病)。在一个实施方案中，初始应答期持续至少1,2,3,4,5或6天；至少1， 2，3或4周；至少1，2，3，4，6，8，10或12个月；或至少1，2，3，4 或5年。
在一些实施方案中，包括CD19抑制剂(例如CD19 CAR疗法)的疗法 可能复发或对治疗顽固。复发或抗性可以由CD19损失(例如，抗原损失突 变)或降低CD19水平的其它CD19改变引起(例如由CD19阴性克隆的克隆 选择引起)。携带这种CD19损失或改变的癌症在本文被称为“CD19阴性癌 症”或“CD19阴性复发癌症”)。应当理解，CD19阴性癌症不需要100％的 CD19损失，而是足够减少CD19疗法的有效性，使得癌症复发或变得难 治。在一些实施方案中，CD19阴性癌症来自CD19 CAR疗法。在一些实 施方案中，CD19阴性多发性骨髓瘤可以用CD19 CAR表达疗法来治疗， 例如，如2015年4月7日提交的PCT/US2015/024671中所述(例如，第9 和90段及其中的实施例6)，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施 方案中，CD19阴性癌症可以用表达CAR的疗法例如CD123 CAR表达疗 法来治疗，例如如2015年8月19日提交的PCT/US2015/045898中所述(例 如，第26页，第30页和其中的实施例7)，其通过引用整体并入。
术语“内源性”是指来自或产生于生物，细胞，组织或系统内的任何物 质。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指有效实 现特定生物学结果的本文所述的化合物，制剂，材料或组合物的量。
术语“外源性”是指从生物，细胞，组织或系统外面引入或产生的任何 物质。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如在scFv的上下文中使用的那样，术语“柔性的多肽接头”或“接头” 是指由比如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽 接头，其将可变的重链和可变的轻链区域连接在一起。在一种实施方式中， 柔性的多肽接头为Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n， 其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5、n＝6、 n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:28)。在一种实施方式中，柔性的多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一种实施方式中，接头包括多个重复的(Gly2Ser)、(GlySer) 或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:31)。在本发明的范围内也包括被描述在 WO2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
本文中可互换使用的术语“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列 之间或两个多肽序列之间的序列相似性，同一性是更严格的比较。短语“百 分比同一性或同源性”和“％同一性或同源性”是指在两个或多个多核苷酸 序列或两个或多个多肽序列的比较中发现的序列相似性的百分比。“序列相 似性”是指在两个或更多个多核苷酸序列之间的碱基对序列(通过任何合适 的方法测定)的百分比相似性。两个或更多个序列可以是从0-100％任一点 相似的，或其间的任何整数值。同一性或相似性可以通过比较每个序列中 的位置来确定，可以为了比较目的而比对所述序列。当比较的序列中的位 置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则该位置处的分子是相同的。多 核苷酸序列之间的相似性或同一性程度是多核苷酸序列共有位置上相同 或匹配核苷酸数量的函数。多肽序列的同一性程度是多肽序列共有位置上 相同氨基酸数量的函数。多肽序列的同源性或相似性程度是多肽序列共有 位置上的氨基酸数量的函数。本文所用的术语“基本同源性”是指至少 50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％， 至少90％，至少95％或以上的同源性。
非人(例如，鼠抗体)的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白 链或其片段(如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含 有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗 体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决 定区(CDR)的残基被来自非人物种例如小鼠，大鼠或兔(供体抗体)的具有所 希望的特异性，亲和力和容量的CDR的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化 抗体/抗体片段可以包含在受体抗体中以及输入的CDR或构建序列中均不 存在的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常， 人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个，通常为两个可变 结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR 区域，FR区的全部或重要部分是人免疫球蛋白序列的部分。人源化抗体 或抗体片段还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球 蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,NATURE,321:522-525,1986； Reichmann et al.,NATURE,332:323-329,1988；Presta,CURR.OP.STRUCT. BIOL.,2:593-596,1992。
本文使用的术语“免疫效应细胞”是指涉及免疫应答，例如涉及促进免 疫效应应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和 γ/δT细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NK-T)细胞，肥大细 胞和骨髓来源的吞噬细胞。
如本文所用的术语“免疫效应功能或免疫效应应答”是指例如增强或促 进靶细胞免疫攻击的免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或 应答是指促进靶细胞杀死或生长或增殖的抑制的T或NK细胞的特性。在 T细胞的情况下，主要刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的实例。
术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以 是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“4-1BB”是指具有作为GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨 基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人物种例如小鼠，啮齿动物， 猴，猿等的等同残基；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank Acc No. AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴， 猿等的等同残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是以SEQ ID NO:14提供的序列或来自非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。 细胞内信号传导结构域可产生促进含有CAR的细胞例如表达CAR的细 胞，例如T细胞或NK细胞的免疫效应功能的信号。例如在CAR表达细 胞中，免疫效应功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括细胞因子的 分泌。在实施方案中，细胞内信号结构域转导效应子功能信号并引导细胞 执行专门的功能。尽管可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情 况下，不需要使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程 度上，可以使用这种截短部分代替完整链，只要其转导效应子功能信号。 因此术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细 胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含一级细胞内信号 传导结构域。示例性一级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初次刺激 或抗原依赖性刺激的分子的那些细胞内信号传导结构域。在一个实施方案 中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激 细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原独立刺激的分 子的那些。例如，在CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)的情况下， 一级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺 激的细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质 序列。
一级细胞内信号传导结构域可以包含已知为基于免疫受体酪氨酸的 活化基序或ITAM的信号传导基序。含有一级细胞质信号传导序列的 ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ， CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(“ICOS”),FcεRI,CD66d, CD32,DAP10和DAP12的那些。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，优选 mRNA。通常，体外转录的RNA是从体外转录载体产生的。体外转录载 体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
术语“分离的”是指从自然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动 物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全 分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化 的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特 的，因为能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞 的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV，SIV和 FIV都是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，特 别包括Milone et al.,MOL.THER.17(8):1453–1464(2009)提供的自身灭活 的慢病毒载体。可以在临床中使用的慢病毒载体的其它实例包括但不限于 例如来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0003147962450000611
基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可 获得的，并且是本领域技术人员已知的。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉 素或催化性mTOR抑制剂)一起使用时，术语“低的免疫增强剂量”是指部 分但不是完全抑制mTOR活性(例如，通过抑制P70 S6激酶活性测量)的 mTOR抑制剂的剂量。本文讨论了例如通过抑制P70 S6激酶评估mTOR 活性的方法。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但足以增强免疫应答。 在一个实施方案中，mTOR抑制剂的低的免疫增强剂量导致PD-1阳性免 疫效应细胞例如T细胞或NK细胞数量的减少，和/或PD-1阴性免疫效应 细胞，例如T细胞或NK细胞数量的增加，或PD-1阴性免疫效应细胞， 例如T细胞或NK细胞/PD-1阳性免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞 的比例增加。
通常，术语“初始T细胞”是指包含没经历抗原的细胞的免疫细胞，例 如作为记忆细胞前体的免疫细胞。在一些实施方案中，初始T细胞可以被 分化，但尚未遇到其同源抗原，因此是活化的T细胞或记忆T细胞。在一 些实施方案中，初始T细胞可以通过CD62L,CD27,CCR7,CD45RA, CD28和CD127的表达以及不存在CD95或CD45RO同种型来表征。在某 些实施方案中，初始T细胞是如本文所述的一种更年轻的T细胞。
术语“较少耗尽的”或“较少耗尽的表型”是指具有免疫细胞耗尽标志， 例如，PD1，TIM3和LAG3的减少(例如，缺乏)的表达的免疫效应细胞。 在一些实施方案中，较少耗尽的细胞可以是如本文所述的更年轻的T细胞。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA) 或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物。术语“核酸”包括 基因，cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如化学 合成的)或重组的。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的类似 物或衍生物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然 存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地 包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代可以通过 产生序列来实现，所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置 被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al.,NUCLEIC ACID RES. 19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.BIOL.CHEM.260:2605-2608(1985)；和 Rossolini et al.,MOL.CELL.Probes 8:91-98(1994))。在本发明的上下文中，使用通常存在的核酸碱基的以下缩写。“A”表示腺苷，“C”表示胞嘧啶，“G” 表示鸟苷，“T”表示胸苷，“U”表示尿苷。
“核酸”“标志”或“生物标志”是由如本文所述的标志编码或与所述标志 对应的核酸(例如，DNA，mRNA，cDNA)。例如，这样的标志核酸分子包 括DNA(例如，基因组DNA和cDNA)，其包含任何所述核酸序列的全部 或部分序列，或该序列的互补或杂交片段。标志核酸分子还包括包含本文 所述的任何核酸序列的全部或部分序列或这种序列的互补序列的RNA，其中所有胸苷残基被尿苷残基替代。“标志蛋白”是由本发明的标志编码或对 应的蛋白质。标志蛋白包含由本文所述的任何序列编码的蛋白质的全部或 部分序列，或其片段。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
基因产物的“过表达”或“显著更高水平的表达”是指测试样品中的表达 水平或拷贝数大于用于评估表达水平的测定法的标准误。在实施方案中， 过表达可以是对照样品中基因的表达水平或几个对照样品中基因产物的 平均表达水平的至少两倍，至少三倍，至少四倍，至少五倍，至少十倍或 更多倍。
术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由肽键共价连接的氨 基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且可以 包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽 键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术 语是指两个短链，其也在本领域中通常被称为肽，寡肽和寡聚体，例如长 链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中存在很多类型。“多肽”包括例如 生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的 变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽，重 组肽或其组合。
如本文所用，“多聚(A)”是通过聚腺苷酸化连接到mRNA的一系列腺 苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施方案中，多聚A在50和5000之 间(SEQ ID NO:34)(例如，2000；SEQ ID NO:32)，例如64(SEQ ID NO:37)， 例如大于100(例如，150，SEQ ID NO:33)，例如大于400(SEQ ID NO:38)。 多聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位，稳 定性或翻译效率。
术语“探针”是指能够选择性结合特定目标分子，例如本发明的标志的 任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。 为了检测靶分子，可以将探针专门设计成如本文所述进行标记。可用作探 针的分子的实例包括但不限于RNA，DNA，蛋白质，抗体和有机单体。
术语“启动子”是指由细胞的合成机器识别，或引入合成机器，启动多 核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指与启动子/调节序列有效连接的基因产物 的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列， 并且在其他情况下，该序列也可以包括基因产物表达所需的增强子序列和 其他调控元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产 物的序列。
本文所用的术语“预防”是指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
范围:在本公开内容中，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当 理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发 明的范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被考虑为具体公开了所有可 能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，从1到6的范围的描述应被 认为具体公开了诸如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以 及该范围内的个别数字，例如1,2,2.7,3,4,5,5.3,和6。作为另一实例，诸 如95-99％同一性的范围包括具有95％，96％，97％，98％或99％的同一 性的某物，并且包括诸如96-99％,96-98％,96-97％,97-99％,97-98％和 98-99％同一性。无论范围的广度如何，这都适用。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体 或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体的DNA 分子产生的抗体并且所述DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序 列，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得和熟知的重组DNA或 氨基酸序列技术获得。
本文所用的“难治的”是指对治疗不应答的疾病，例如癌症。在实施方 案中，难治性癌症可以在治疗开始之前或开始时耐受治疗。在其它实施方 案中，难治性癌症在治疗期间可变得抗性。难治性癌症也被称为耐药性癌 症。
在实施方案中，参考或对照水平或活性是受试者中的水平和/或活性， 例如从以下中的一个或多个获得的样品:对于受试者的基线或先前值(例 如，在用CAR-表达细胞治疗前)；在不同的时间间隔的受试者；癌症患者人 群的平均值或中值；健康的对照；或健康受试者群体(例如，对照)。
“样品”，“组织样品”，“患者样品”，“患者细胞或组织样品”或“样本” 均指从受试者或患者的组织或体液获得的生物样品。组织样品的来源可以 是来自新鲜的，冷冻和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物的 固体组织；血液或任何血液成分(如血清，血浆)；体液如尿液，脑脊液，全血， 血浆和血清。样品可以包括非细胞级分(例如尿，血浆，血清或其它非细胞 体液)。在一个实施方案中，样品是尿样。在其他实施方案中，从个体获得 样品的体液包含血液(例如全血)。在一个实施方案中，样品是从受试者获 得的全血样品。在某些实施方案中，可以进一步处理血液以获得血浆或血 清。在一个实施方案中，样品是从受试者的血液中获得的单采血液成分术 样品。在一个实施方案中，样品是制造的产品样品，例如从受试者的血液 获得的经遗传工程化的T细胞，例如制备的CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)产物，例如制造的CD19 CAR表达细胞产物。在另一个实施方案 中，样品含有组织，细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))。例如，样品可 以是细针活检样品，归档样品(例如，具有已知诊断和/或治疗史的归档样 品)，组织学切片(例如，冷冻或福尔马林固定的切片，例如，长期存储后) 等。术语样品包括从生物样品获得和/或衍生的任何材料，包括从样品纯化 或加工的多肽和核酸(例如，基因组DNA，cDNA，RNA)。样品的纯化和/ 或加工可以包括提取，浓缩，抗体分离，分选，浓缩，固定，加入试剂等 中的一种或多种。样品可以含有天然不与天然组织混合的化合物，如防腐 剂，抗凝剂，缓冲剂，固定剂，营养物，抗生素等。
本文所用的术语“产品”或“制造的产品”是指包含遗传工程化细胞(例 如，免疫效应细胞)的制造的组合物，所述细胞为例如细胞群，其中多个细 胞被工程化以表达CAR,例如本文描述的CAR。制造的产品可以是任何基 因工程化的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如从受试者的血液 获得的遗传工程化的免疫效应细胞，例如制造的CAR表达细胞产物，例 如制造的CD19 CAR表达细胞产物。在一个实施方案中，可以从活化的冷 冻保存的扩增的细胞群(例如扩增的免疫效应细胞群)获得工程化以表达 CAR的细胞(例如，免疫效应细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递 信息来调节细胞活性起作用，经由确定的信号途径通过产生第二信使或通 过应答这样的信使而作为效应子发挥功能实现所述调节细胞活性。
如果生物标志的量比正常水平的量分别大于或小于用于评估该量的 测定法的标准误的量，或所述量的至少两，三，四，五，十倍或更多倍， 则受试者中的生物标志，例如基因产物(例如，本文所述的一种或多种生物 标志)的表达量“显著”高于或低于该标志的正常量。或者，如果该量比标志 正常量分别高或低至少约1.5，2，至少约3，至少约4，或至少约5倍或更 高或更低，则受试者中的标志的量可被认为“显著”高于或低于正常量。
术语“特异性结合”是指识别并结合存在于样品中的同源结合配偶体蛋 白的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分 子。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结 合诱导的主要应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3 复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β 的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其提供一级细胞质信号传 导序列，所述序列以刺激方式为T细胞信号通路的至少一些方面调节TCR 复合物的主要活化。在一个方面，主要信号是通过例如TCR/CD3复合物 与装载肽的MHC分子的结合引发的，并导致T细胞应答的介导，包括但 不限于增殖，激活，分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序 列(也称为“一级信号传导结构域”)可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的 激活基序或ITAM的信号基序。在本发明中特别使用的包含细胞质信号传 导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ，共同FcRγ(FCER1G)， FcγRIIa，FcRβ(FcεR1bb)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD79a，CD79b，DAP10 和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ 的一级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的一级信号传导 序列是作为SEQ ID NO:18(突变体CD3ζ)提供的序列或来自非人物种，例 如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ 的一级信号传导序列是作为SEQ ID NO:20(野生型人CD3ζ)中提供的序 列，或来自非人物种，例如小鼠，啮齿动物，猴子，猿猴等的等同残基。
术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物， 人)。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者 是人。在一个实施方案中，受试者是患者。
本文所用的术语“治疗”是指治疗。通过减轻，抑制，缓解或消除疾病 状态获得治疗效果。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主 细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染，转 化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因表达数小时，数天或数周，其 中表达时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定的质 粒复制子中时基因表达的时间段。
术语“跨膜结构域”是指跨越质膜的多肽。在一个实施方案中，其将细 胞外序列(例如开关结构域，细胞外识别元件，例如抗原结合结构域，抑制 性反配体结合结构域或共刺激ECD结构域)连接到细胞内序列，例如开关 结构域或细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一 个或多个另外的氨基酸，例如与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一 个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个，多达15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另 外的氨基酸(例如，细胞内区域的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个，多达15个氨 基酸)。本文公开了跨膜结构域的实例。
正如本文中使用的那样，术语“治疗(treat、treatment、treating)”是指 由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的CAR)减慢 或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的 一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方式中， 术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生 长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”是指通过例如 稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两 者抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳 定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
产品(例如，本文所述的标志)的“低表达”或“显著较低的表达水平”是 指测试样品中的表达水平大于用于评估表达的测定的标准误，例如，比 对照样品中基因的表达水平，或几种对照样品中基因产物的平均表达水平 少至少1.5倍，2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，或至少10倍或更 多倍。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“年轻T细胞”或“较年轻T细胞”是指包含较少分化 表型的免疫效应细胞，例如较年轻的细胞，例如年轻T细胞。在一些实施 方案中，较年轻的T细胞可以是初始T细胞(TN)。在一些实施方案中，年 轻T细胞的特征可以是CD62L的表达，以及不存在CD25，CD44或CD45RO同种型。在一些实施方案中，较年轻的T细胞可以是记忆干细胞 (TSCM)。在一些实施方案中，较年轻的T细胞可以是中央记忆T细胞(TCM)。 与TN,TSCM和TCM相关的表型标志在例如Maus,M.et al.(2014)Annu. Rev.Immunol.32:189-225中公开(参见例如图3)，将其通过引用并入本文。 TN的示例性表型包括以下一种或多种(或全部):CD45RA+,CD45RO-, CD62L高,CCR7高,CD95-,CD122-,CD27高,CD28+,CD57-,KLRG-1-或长 端粒长度(或两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或全部前 述TN标志的任一组合)。TSCM的示例性表型包括以下一种或多种(或全 部):CD45RA+,CD45RO-,CD62L高,CCR7高,CD95+,CD122+,CD27高, CD28高,CD57-,KLRG-1-或长端粒长度(或两种，三种，四种，五种，六种， 七种，八种，九种或全部前述TSCM标志的任一组合)。TCM的示例性表型 包括以下一种或多种(或全部):CD45RA-,CD45RO高,CD62L高,CCR7+, CD95+,CD122高,CD27+,CD28高,CD57-,KLRG-1-/+或长/中间端粒长度 (或两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或所有前述TCM标记的任何组合)。
如本文所用，术语“较老的T细胞”是指包含更耗尽表型的免疫效应细 胞。在一些实施方案中，较老的T细胞可以是效应记忆T细胞(TEM)。在 其它实施方案中，较老的T细胞可以是效应T细胞(TEFF)。在其它实施方 案中，较老的T细胞具有耗尽的表型。与TEM,TEFF和耗尽的T细胞相关 的表型标志在例如Maus,M.et al.(2014)Annu.Rev.Immunol.32:189-225 中公开(参见例如图3)，将其通过引用并入本文。TEM的示例性表型包括以 下一种或多种(或全部):CD45RA-/+,CD45RO高,CD62L-,CCR7-,CD95-, CD122高,CD27-/+,CD28-/+,CD57低,KLRG-1+或中间端粒长度(或两个， 三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或所有前述TEM标志的任何 组合)。TEFF的示例性表型包括以下一种或多种(或全部):CD45RA-/+, CD45RO+,CD62L-,CCR7-,CD95高,CD122-/+,CD27-,CD28-,CD57+, KLRG-1高，或短/中等端粒长度(或两个，三个，四个，五个，六个，七个， 八个，九个或全部上述TEFF标志的任何组合)。耗尽的T细胞表型的示例 性表型包括以下的一种或多种(或全部):CD45RA-/+,CD45RO+,CD62L-,CCR7-,CD95高,CD122低,CD27-,CD28-,CD57高,KLRG-1高，或短端粒长 度(或两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种，或全部上述标 志的任何组合)。
术语“ζ”或备选地“ζ链”，“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBankAcc.No.BAG36664.1提供的蛋白质，或来自非人物种例如小鼠，啮齿动物， 猴，猿等的等同残基，以及“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域” 或“TCR-ζ刺激结构域”定义为足以在功能上传递T细胞活化所需的初始 信号的ζ链的胞质结构域的氨基酸残基。在一个方面，ζ的胞质结构域包 含GenBank Acc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能直向同源物的来自非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基。在一个方 面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:18提供的 序列。一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:20 所提供的序列。
以下进一步详细描述本发明的各个方面。在整个说明书中列出了其他 定义。
某些实施方式详述
本文提供了预测患有癌症的受试者(例如，血液癌症如慢性淋巴细胞白 血病(CLL)和急性成淋巴细胞白血病(ALL))对治疗的应答的生物标志。
一方面，本文提供了预测具有CLL和ALL的受试者中对表达CAR 的细胞，例如CD19CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如本文所 述的CD19 CAR表达细胞例如CTL019)的应答的生物标志。
提供了用于诊断和监测癌症治疗(例如，血液癌症如ALL和CLL)的 方法，其基于检测来自患有或怀疑患有癌症的患者的样品中的某些生物标 志。此外，可以使用一种或多种这样的生物标志的表达来区分有利地应答 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法的受试者(例如，“完全应答 者”或“CR”)与不应答CAR表达细胞疗法的受试者(例如，“非应答者”或“NR”)和对CAR表达细胞疗法具有部分应答的受试者(例如“部分应答者” 或“PR”)。
使用生物标志评估疾病进展和预测受试者对CAR表达细胞疗法的应 答
在一个实施方案中，表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表 10，表14，表15，表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表 18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1和 /或CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)基因特征中的1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,15,20或更多种基因可以与本公开的方法一起使用以获得疾 病进展值。疾病进展值可以用于例如评估治疗癌症(例如，血液癌症例如 ALL和CLL)的疗法的有效性。在一个实施方案中，表1A，表1B，表7A， 表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122, CD62L,和/或KLRG1和/或CD19 CAR表达细胞基因特征中的1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,15,20或更多种基因用于将受试者分类为CAR表达细胞疗法 的完全应答者，部分应答者或非应答者(例如CD19 CAR表达细胞疗法， 例如CTL019)。在一个实施方案中，表1A，表1B，表7A，表7B，表8， 表9，表10，表14，表15，表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表 17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和/ 或KLRG1，和/或CD19 CAR表达细胞基因特征中的1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,15,20或更多基因用于预测受试者对CAR表达细胞疗法(例如，本文所 述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的应答性。
受试者
对于本文公开的任何方法和试剂盒，被治疗的受试者或获得该值的受 试者是在任何治疗阶段的具有癌症或具有癌症风险的受试者。示例性的癌 症包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)，T-细胞急性淋巴性白 血病(T-ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B 细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤， 弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤 泡淋巴瘤，恶性淋巴增生性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)， 边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非 霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿 瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症是血液癌症。 在一个实施方案中，癌症是ALL。在另一个实施方案中，癌症是CLL。 在一个实施方案中，癌症与CD19表达相关。
在一个实施方案中，受试者已接受额外治疗的预治疗，例如已被鉴定 为部分应答者或非应答者，并且随后已经用额外的治疗进行了预治疗的受 试者。在一个实施方案中，受试者接受用mTOR抑制剂的预治疗。在一个 实施方案中，mTOR抑制剂以本文所述的剂量或给药方案施用。在一个实 施方案中，在用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗之前，向受 试者施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂。在一个实施方案中，在施用 本文所述的CAR表达细胞，例如T细胞之前开始施用低的免疫增强剂量 的mTOR抑制剂，例如变构抑制剂，例如RAD001或催化抑制剂。在一 个实施方案中，CAR细胞在足够的时间或足量剂量的mTOR抑制剂后施 用，使得PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应 细胞(例如T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如T细胞)的比例至少暂时 增加了。在一个实施方案中，待工程化以表达CAR的细胞，例如T细胞 在足够的时间之后，或在足量施用mTOR抑制剂的低的免疫增强剂量之后 被收获，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T 细胞)的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应 细胞(例如T细胞)的比例已至少瞬时增加了。
在一个实施方案中，受试者已经接受使用检查点抑制剂例如本文所述 的检查点抑制剂的预治疗。抑制性分子例如检查点分子的实例包括PD1, PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3 和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4, CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或 CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如， TGFRβ)。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA， 例如siRNA或shRNA；或例如抑制性蛋白质或系统，例如，聚类的规则间 隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)或锌指 内切核酸酶(ZFN)，如本文所述，可以用于抑制调控或调节，例如抑制CAR 表达细胞中的T细胞功能的分子的表达。在一个实施方案中，所述活性剂 是本文所述的shRNA，例如shRNA。在一个实施方案中，检查点分子的 抑制剂可以是例如结合检查点分子的抗体或抗体片段。例如，该活性剂可 以是结合PD1，PD-L1，PD-L2(例如，如本文所述)或CTLA4的抗体或抗 体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并以
Figure BDA0003147962450000731
上市；Bristol-Myers Squibb；Tremelimumab(可得自Pfizer的IgG2单克隆 抗体，以前称为ticilimumab，CP-675,206))。在一个实施方案中，该活性 剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段，例如，如本文所述。在一个实施方 案中，该活性剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段，例如，如本文所述。 在一个实施方案中，该活性剂是结合CEACAM的抗体或抗体片段，例如 如本文所述。
在一个实施方案中，受试者接受CAR表达细胞(例如T细胞，NK细 胞)疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)与另外 的疗法的组合。在一个实施方案中，受试者接受mTOR抑制剂，例如本文 所述的mTOR抑制剂与CAR表达细胞疗法的组合。在一个实施方案中， mTOR抑制剂以本文所述的剂量和/或给药方案施用。在一个实施方案中， 受试者接受检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂与CAR表达细 胞疗法的组合。在一个实施方案中，检查点抑制剂以本文所述的剂量和/ 或给药方案施用。在一个实施方案中，受试者接受激酶抑制剂，例如本文 所述的激酶抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂以本文所述的剂量和 /或给药方案施用。
在一个实施方案中，受试者已被鉴定为非应答者，并且受试者接受除 了CAR表达细胞疗法之外的疗法，例如特定癌症类型的护理治疗标准。 在一个实施方案中，受试者接受一种或多种抗CD20抗体或其功能性片段 (例如，奥那霉素，利妥昔单抗，奥比妥珠单抗)，抗-CD52抗体或其功能 片段(例如，阿仑珠单抗)，烷化剂(例如，氮芥烷化剂，例如盐酸苯达莫司 汀，氯氮芥，环磷酰胺)，激酶抑制剂(例如本文所述的激酶抑制剂，例如 本文所述的BTK抑制剂或本文所述的膦酰肌醇-3(phosphonositide-3)激酶 抑制剂)。在一个实施方案中，受试者接受干细胞移植。
生物标志评估
CTL019生物标志的分析
与受试者对CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，本文 所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的应答相关的基因产物的 表达和/或活性水平和癌症疾病进展(例如，血液癌症如CLL和ALL)的分 析导致鉴定新的CD19 CAR表达细胞基因特征。例如，本发明提供了评估 来自表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，TIM-3,CD57, CD27,CD122,CD62L,和包含CD19CAR表达细胞基因特征的KLRG1 的一，二，三，四，五，六，七，八，九，十，十五，二十，二十五，三 十，三十五，四十，四十五，五十，一百或更多种基因的表达水平的方法。
表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和/或KLRG1列出了与部分应答者和 非应答者相比，由完全应答者差异表达的基因(例如，蛋白质生物标志)。
在一些实施方案中，本公开的方法可用于确定受试者对用CAR表达 细胞疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细 胞)疗法，例如CTL019)治疗的应答性，其中相对于参考(例如，癌症患者 群体的中值)(例如，血液癌症如CLL和ALL)，健康的无癌症受试者群体 的中值，受试者样品中非应答者或部分应答者群体的中值，本文公开的标志的量，例如表达和/或活性具有统计学显著差异，则疾病越有可能应答 CAR表达细胞疗法。
在一个实施方案中，本公开提供了鉴定患有癌症的受试者(例如，血液 癌症如CLL和ALL)为具有对包含CAR表达细胞疗法(例如，本文所述的 CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)具有增加或降低的应答可能性的 方法或测定方法，所述方法包括:
(1)从受试者获取样品；
(2)确定样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表 14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20， PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1中所列的 一种或多种(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15或更多)标志的水平；和
(3)将确定的一种或多种标志的水平与参考水平进行比较；其中所确定 的水平与参考水平之间的差异，例如统计学上显著的差异预测受试者对 CAR表达细胞疗法的应答性；和
(4)将该受试者鉴定为对CAR表达细胞疗法的完全应答者，部分应答 者或非应答者。
在一个实施方案中，样品是血液，血浆或血清样品。在一个实施方案 中，样品是单采血液成分术样品，例如从受试者的血液获得的T细胞。在 一个实施方案中，样品是制造的产品样品，例如从受试者的血液获得的经 遗传工程化的T细胞，例如制造的CAR表达细胞产物，例如制造的CD19 CAR表达细胞产物。
在一个实施方案中，本公开提供了鉴定患有癌症的受试者的方法或测 定法，所述癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细 胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性 白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞前髓细胞性白血病， 母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤， 滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴增生 性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨 髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋 巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋 白血症。在一个实施方案中，癌症是血液癌症。在一个实施方案中，癌症 是ALL。在另一个实施方案中，癌症是CLL。在一个实施方案中，癌症 与CD19表达相关。
在一个实施方案中，CAR表达细胞疗法包括本文所述的CAR表达细 胞疗法，例如CTL019。
在一个实施方案中，CAR表达细胞疗法由本文所述的CAR表达细胞 疗法，例如CTL019组成。
在一个实施方案中，本公开提供了鉴定具有癌症(例如，血液癌症如 CLL和ALL)的受试者对包含CAR表达细胞疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的治疗具有增加或降低的应答可能性 的方法或测定方法，所述方法包括:
(1)从受试者获取样品；
(2)确定样品的基因特征；和
(3)将确定的基因特征与参考基因特征进行比较；其中例如与预定值相 比，在确定的基因特征中的一种或多种标志的表达水平的差异，例如，统 计学显著差异预测受试者对CAR表达细胞疗法的应答性。
在一个实施方案中，本公开提供了确定具有癌症(例如，血液癌症如 CLL和ALL)的受试者对包含表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的 细胞，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)， 例如CTL019)的治疗的应答性的方法或测定法，所述方法包括:
确定治疗前获得的样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9， 表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表 18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1 中列出的一种或多种标志的水平；
其中所述样品中一种或多种标志的表达水平相对于预定值的统计学 显著差异指示对所述CAR表达细胞的增加的应答性。
本文提供的方法特别可用于鉴定在开始CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)疗法(例如，疗法前)或治疗方案早期，可能应答CAR表达细胞(例 如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法， 例如CTL019)的患者。在一些实施方案中，在开始疗法前至少2周，至少 1个月，至少3个月，至少6个月或至少1年测量受试者中生物标志的表 达或活性。在一些实施方案中，生物标志的表达或活性在疗法开始前6个 月内测量。因此，在一些实施方案中，在疗法开始前6个月，5个月，4 个月，3个月，2个月，1个月，2周，1周，6天，5天，4天，3天，2 天，或1天测量生物标志的表达或活性。在其他实施方案中，在开始疗法 后(例如1个月，2个月，3个月，3.5个月，4个月，4.5个月，5个月，5.5 个月，6个月)确定生物标志的表达或活性。
在一个实施方案中，本发明提供了评估患有癌症的受试者(例如，血液 癌症如CLL和ALL)的方法，其包括:
获取受试者的应答者状态的值，其包括以下的一个或多个的度量:
表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，CD27生物 标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生 物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物标志，CD8生物标 志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征，记忆 T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞 (TSCM)，例如中央记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集 特征，以及CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种或多种(例如2,3, 4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50或更多)生物标志，
从而评估受试者。
在一个实施方案中，本公开提供了评估患有癌症(例如，血液癌症，例 如CLL和ALL)的受试者的方法，包括获取受试者的应答者状态的值，其 包括以下一个或多个(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40, 45,50或更多)的度量:表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10， 表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表 20，PD-1，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,KLRG1中 列出的生物标志,和CD19 CAR表达细胞基因集特征，从而评估受试者。
在一个实施方案中，本公开提供了评价或监测患有癌症的受试者中 CAR表达细胞疗法的有效性的方法，包括:
获取受试者的应答者状态的值，其包括以下的一个或多个的度量:
表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，CD27生物 标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生 物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物标志，CD8生物标 志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征，记忆 T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞 (TSCM)，例如中央记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集 特征，以及CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的生物标志，
从而评估或监测CAR疗法在该受试者中的有效性。
在一个实施方案中，本公开提供评估或监测CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞)疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如 CTL019)在患有癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL)的受试者中的有效性 的方法，包括:获取受试者的应答者状态值，其包括测量以下一个或多个(例 如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50或更多):表1A，表1B， 表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如，CCL20， IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27, CD122,CD62L,KLRG1中列出的生物标志,和CD19 CAR表达细胞(例 如，T细胞，NK细胞)基因集特征，从而评估或监测CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法在受试者中的有效性。
在一个实施方案中，应答者状态的值包括基因特征和生物标志的组合 的度量。
在一个实施方案中，应答者状态的值包括CD19 CAR表达细胞基因集 特征，以及以下的一种或多种的组合的度量:表1A，表1B，表7A，表7B， 表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)， 表17，表18，表20中列出的生物标志，CD27生物标志，CD45RO生物 标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物 标志，IL21生物标志，CD4生物标志，CD8生物标志，TH1+辅助T细胞 基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集特征，和记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)，例如记忆干细胞(TSCM)，例如中央记 忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞(TEM))基因集特征。
在一个实施方案中，应答者状态的值包括CD19 CAR表达细胞基因集 特征，以及以下的一种或多种的组合的度量:表1A，表1B，表7A，表7B， 表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)， 表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, 和KLRG1中列出的生物标志。
在一个实施方案中，应答者状态的值包括表1A，表1B，表7A，表 7B中列出的一种或多种生物标志，以及以下的一种或多种的组合的度 量:CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生物标 志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物标志， CD8生物标志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞基因集 特征，和记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)，例 如记忆干细胞(TSCM)，例如中央记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞 (TEM))基因集特征，和CD19 CAR-表达细胞基因集特征。
在一个实施方案中，应答者状态的值包括表1A，表1B，表7A，表 7B中列出的一种或多种生物标志，以及CD57，CD27，CD122，CD62L 和KLRG1中的一种或多种的组合的度量。
在一个实施方案中，CD19 CAR表达细胞基因特征包括至少5,6,7,8,9 或10个包含CD19 CAR表达细胞基因特征的基因的表达值。
在一个实施方案中，基因的表达值包括转录参数的值，例如由该基因 编码的mRNA的水平。
在一个实施方案中，蛋白质的表达值包括翻译参数的值，例如蛋白质 的水平。
在一个实施方案中，所提供的方法还包括从受试者获得样品，其中所 述样品包含细胞或组织级分。在一个实施方案中，细胞级分包含血液。
在一个实施方案中，生物标志和/或基因特征的度量在CAR表达细胞 疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)之前， 同时或期间获得。
在一个实施方案中，生物标志和/或基因特征的度量在开始CAR表达 细胞疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)前 少于6个月，5个月，4个月，3个月，2个月，1个月，2周，1周，6天， 5天，4天，3天，2天获得。
本文所述的方法还可以用于监测受试者对CAR表达细胞(例如，T细 胞，NK细胞)治疗(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞治疗，例如 CTL019)的阳性应答。这种方法可用于早期检测对疗法的耐受性或预测受 试者中的疾病是否进展。在这样的实施方案中，确定生物标志的表达或活 性，例如至少每周，至少每2周，至少每月，至少每2个月，至少每3个 月，至少每4个月，至少每5个月，至少每6个月，至少每7个月，至少 每8个月，至少每9个月，至少每10个月，至少每11个月，至少每年， 至少每18个月，至少每2年，至少每3年，至少每5年或以上。还考虑到 生物标志的表达或活性是不规则间隔的，例如在治疗3个月，治疗6个月 和治疗7个月时可以在受试者中检测生物标志。因此，在一些实施方案中， 在本领域技术人员对受试者的监护治疗认为必要时，测定生物标志的表达 或活性。
本文所述的方法可用于治疗任何患有癌症(例如，血液癌症如CLL和 ALL)的受试者。一方面，本发明涉及在受试者中治疗癌症(例如，血液癌 症如CLL和ALL)的方法。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，包括但不限于B 细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)， 急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白 血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突细胞瘤， 伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小 细胞或大细胞滤泡型淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生性病症，MALT淋巴瘤， 套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨 髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤， 浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一个实施方案 中，本发明提供了治疗ALL的方法。在另一个实施方案中，本发明提供 了治疗CLL的方法。在一个实施方案中，本发明提供了治疗与CD19表达 相关的癌症的方法。
在一个实施方案中，所提供的方法包括如果受试者被鉴定为相对于参 考水平,在例如表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1, LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中列出的一种或 多种标志的表达水平具有差异，例如统计学显著差异，那么向受试者施用 表达CAR的细胞，例如，CAR T细胞，例如CD19 CAR T细胞，例如 CTL019产品，使得治疗受试者中癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)。
如上所述，可通过公开的方法治疗的癌症的实例是与CD19表达相关 的癌症。一方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌 症是白血病或淋巴瘤。一方面，与CD19的表达相关的癌症包括癌症和恶 性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B 细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)， 急性淋巴细胞白血病(ALL)，一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如 慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达 相关的额外癌症或血液学状况包括但不限于例如B细胞早幼粒细胞白血 病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋 巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡型淋巴瘤，恶性 淋巴细胞增生性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴 瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴 瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞肿瘤，瓦尔登斯 特隆巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是通过骨髓血细胞的无效生产(或发 育不良)联合起来的血液学状况的多样化集合，等。此外，与CD19表达相 关的疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症， 恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症(例如，诸如ALL和 CLL的血液癌症)的受试者的方法，包括:
通过相对于参考水平比较来自受试者的样品中表1A，表1B，表7A， 表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/ 或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122, CD62L,和KLRG1中的一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25, 30,35,40,45,50或更多)标志的水平，确定受试者是否具有增加的对CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，本文所述的CD19 CAR表 达细胞疗法例如CTL019)的应答的可能性，其中一种或多种标志基因的表 达水平相对于参考水平的统计学显著差异水平表明增加的应答可能性；和
向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者(例如，诸如 ALL和CLL的血液癌症)的方法，其包括:
从受试者获取样品；
确定样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20， PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中的一种或 多种标志的水平；
比较表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15， 表16(例如，CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中的一种或多种标志的测 定的水平与参考水平；和
如果样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1, LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中的一种或多种 标志的确定水平和参考水平比较中受试者被鉴定为具有统计学显著差异， 则施用治疗有效剂量的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如 本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗受试者中癌症(例如，血液癌症 如ALL和CLL)的方法，其包括:
获取该受试者的应答者状态的值，其包括以下中的一个或多个的度量:
表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物 标志，CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生 物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物 标志，CD8生物标志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞 基因集特征，记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)， 例如记忆干细胞(TSCM)例如中心记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细胞 (TEM))基因集特征，以及CD19 CAR表达细胞基因集特征，以及
响应于应答者状态的确定，执行以下一个，两个，三个，四个或更多 个:
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者；
施用CAR表达细胞疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法， 例如CTL019)；
选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；
选择或改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
将另外的试剂与CAR表达细胞疗法，例如检查点抑制剂，例如本文 所述的检查点抑制剂组合施用于例如非应答者或部分应答者；
在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增 加受试者中初始T细胞数量的疗法；
例如对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，修饰CAR表达 细胞疗法的制备过程，例如在引入编码CAR的核酸之前富集初始T细胞； 或例如对于非应答者或部分应答者选择替代疗法；或者
选择替代疗法，例如本文所述的替代治疗，例如癌症的护理治疗标准； 从而治疗受试者的癌症。
在一个实施方案中，本公开提供了在受试者中治疗癌症(例如，血液癌 症，例如ALL和CLL)的方法，其包括:获得受试者的应答者状态的值， 其包括以下中的一个或多个的度量:表1A，表1B，表7A，表7B，表8， 表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表 17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L, KLRG1和CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的生物标志，并且响应 于应答者状态的确定，执行以下一，二，三，四个或更多个:将受试者鉴定 为完全应答者，部分应答者或非应答者；施用CAR表达细胞疗法(例如本文 所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)；选择或改变CAR表达细 胞疗法的剂量；选择或改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；对例 如非应答者或部分应答者施用另外的活性剂与CAR表达细胞疗法，例如 检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂的组合；在用CAR表达细 胞疗法治疗之前向非应答者或部分应答者施用增加受试者中初始T细胞数 量的疗法；例如对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，修饰CAR表达细胞疗法的制备过程，例如在向T细胞引入编码CAR的核酸之前富 集初始T细胞；或例如对于非应答者或部分应答者选择替代疗法，例如癌 症的护理治疗标准；或选择替代的CAR表达细胞疗法；从而治疗受试者 的癌症。
在一些实施方案中，将来自受试者的样品中确定的生物标志的量定量 为绝对测量(例如，ng/mL)。绝对测量可以很容易地与参考值或截断值进行 比较。例如，可以确定代表疾病进展状态的截断值；高于截断值(即对于随 着癌症例如血液癌症如ALL和CLL进展增加表达的生物标志)或低于截断 值(即对于随着癌症例如血液癌症如ALL和CLL进展减少表达的生物标 志)的任何绝对值可能是疾病进展。
或者，确定生物标志的相对量。在一个实施方案中，通过将患有癌症 的受试者中的一种或多种生物标志的表达和/或活性与参考参数中的生物 标志的表达进行比较来确定相对量。在一些实施方案中，从以下中的一个 或多个获得参考参数:受试者的基线或先前值，不同时间间隔的受试者，癌 症受试者(例如，患者)群体的平均值或中值，健康对照或健康的受试者群 体。
本公开还涉及预测医学领域，其中诊断测定法，药物基因组学和监测 临床试验用于预测目的，从而预防性地治疗个体。因此，本公开的一个方 面涉及用于确定对应于本文所述的一种或多种标志的多肽或核酸的量，结 构和/或活性的测定法，以便确定患有癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL) 的个体或患有癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL)的风险的个体是否将 更可能应答CAR表达细胞疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗 法，例如，CTL019)。
因此，一方面，本公开提供了一种用于确定患有癌症的受试者(例如， 血液癌症如CLL和ALL)是否可能应答表达CAR的细胞(例如所描述的 CD19 CAR表达细胞，例如CTL019)的方法。在另一方面，本公开涉及一 种预测疾病时间过程的方法。在另一方面，该方法涉及用于预测疾病时间 过程中重要事件(例如，再次发生或缓解)的概率的方法。在某些实施方案 中，该方法包括检测与本文所述的治疗的应答性相关的生物标志的组合， 并确定受试者是否可能应答治疗。
在一方面，本公开提供了一种用于在具有癌症(例如，血液癌症如 ALL和CLL)的受试者中提供CAR表达细胞疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的成功率的预后的方法，所述方法包 括以下步骤:
提供来自受试者的生物样品；
确定表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15， 表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L和KLRG1中列出的一种或多种(例如 2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多)基因的表达水平，以获得样品的基因 表达模式；和
基于获得的基因表达模式，为受试者提供预后。
在一个实施方案中，确定该组基因的表达水平的步骤还包括检测从所 述基因表达的mRNA的表达。在一个实施方案中，所提供的方法还包括步 骤，其中确定mRNA的表达包括将所述mRNA暴露于与所述mRNA互补 的核酸探针。
在一个实施方案中，确定该组基因的表达水平的步骤还包括检测由所 述基因编码的多肽的表达。
在一个实施方案中，提供的方法包括基于提供的预后来为受试者选择 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，本文所述的CD19 CAR 表达细胞疗法，例如CTL019)。
在一些实施方案中，所述方法包括评估生物样品，例如来自受试者， 例如已被诊断患有或被怀疑患有癌症(例如，血液癌症如CLL或ALL，例 如，呈现CLL或ALL的症状)的患者的样品，以检测表1A，表1B，表 7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122, CD62L,和KLRG1和CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)基因 特征中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15或更多种基因的表达和/或活性的变化。
筛选方法的结果及其解释预测患者的疾病进展(例如癌症，例如血液癌 症，例如ALL或CLL的进展)。根据本发明，表1A，表1B，表7A，表 7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/ 或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1以及CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)基 因特征中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15或更多种基因的表达或活性相对于癌 症患者群体的平均值或中值或健康的无癌症受试者群体的平均值或中值 的改变指示癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)进展。
在另一个实施方案中，一个或多个改变，例如生物标志表达的改变以 预定的间隔(例如，第一时间点和至少在随后的时间点)进行评估。在一个 实施方案中，通过确定受试者疾病过程中的重大事件之间的时间来测量时 间过程，其中测量预测受试者是否具有长的时间过程。在另一个实施方案 中，重大事件是从诊断到死亡的进展。在另一个实施方案中，重大事件是 从诊断到恶化疾病的进展。
基因表达检测方法
还可以测定生物标志表达水平。本文描述的标志的表达可以通过用于 检测转录的分子或蛋白质的表达的多种已知方法中的任何一种进行评估。 这些方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白，细胞表面蛋白，细胞质 蛋白或核蛋白的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定法， 核酸杂交方法，核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在某些实施方案中，特定基因的活性的特征在于基因转录物(例如 mRNA)的度量，翻译的蛋白质量的度量或基因产物活性的度量。可以通过 多种方式监测标志表达，包括检测mRNA水平，蛋白质水平或蛋白质活性， 其中任何一种都可以使用标准技术进行测量。检测可以涉及基因表达水平 的定量(例如，基因组DNA，cDNA，mRNA，蛋白质或酶活性)，或者可以是基因表达水平的定性评估，特别是与对照水平相比较。正在检测的水 平的类型从上下文中将是清楚的。
使用核酸杂交技术检测和/或定量基因转录物(由其制备的mRNA或 cDNA)的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等人，同上)。 例如，用于评估cDNA的存在，不存在或数量的一种方法涉及如上所述的 Southern转移。简言之，分离mRNA(例如，使用酸性胍盐-苯酚-氯仿提取 方法，Sambrook等人，同上)，并逆转录以产生cDNA。然后任选地将cDNA 消化并在缓冲液中的凝胶上运行并转移到膜中。然后使用对靶cDNA特异 性的核酸探针进行杂交。
这种诊断和预后测定法的一般原理包括制备含有标志和探针的样品 或反应混合物,在适当条件下和足够使得所述标志和探针相互作用并结合 的时间内进行所述制备，从而形成复合物，其可以在反应混合物中除去和 /或检测。这些测定法可以以各种方式进行。
例如，进行这种测定的一种方法将涉及将标志或探针锚定在固相支持 体(也称为基质)上，以及在反应结束时检测锚定在固相上的靶标志/探针复 合物。在这种方法的一个实施方案中，待测定标志的存在和/或浓度的来自 受试者的样品可以锚定在载体或固相支持体上。在另一个实施方案中，相 反的情况是可能的，其中探针可以锚定到固相，并且来自受试者的样品可 以作为测定的未锚定组分反应。
为了用上述方法进行测定，将非固定化组分加入其上锚定第二组分的 固相中。反应完成后，可以在形成的任何复合物将固定在固相上的条件下 除去(例如通过洗涤)未复合的组分。锚定到固相的标志/探针复合物的检测 可以用本文概述的许多方法完成。
在另一个实施方案中，当探针是未锚定的测定组分时，其可以被标记 以便直接或间接地用本文讨论的并且本领域技术人员熟知的可检测标记 检测和读出测定。
也可以直接检测标志/探针复合物形成，而无需进一步操作或标记任一 组分(标志或探针)，例如通过利用荧光能量转移技术(参见例如Lakowicz 等，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等人，美国专利号4,868,103)。 选择第一个“供体”分子上的荧光标记，使得当用适当波长的入射光激发时， 其发射的荧光能量将被第二个“受体”分子上的荧光标记吸收，“受体”分子 由于吸收的能量能够发出荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以简单地利用 色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，使得“受体” 分子标记可以与“供体”的不同。由于标签之间能量转移的效率与分离分子 的距离有关，因此可以评估分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的 情况下，测定中“受体”分子标记的荧光发射应该是最大的。可以通过本领 域公知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)方便地测量FET结合事件。
在另一个实施方案中，可以通过利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术完成测定探针识别标志的能力而无需标记测定组分(探针或标 志)(参见例如Sjolander,S.and Urbaniczky,C.,1991,ANAL.CHEM. 63:2338-2345 and Szabo et al.,1995,CURR.OPIN.STRUCT.BIOL. 5:699-705)。如本文所用，“BIA”或“表面等离振子共振”是用于实时研究生 物特异性相互作用的技术，而不标记任何相互作用体(例如BIAcore)。结合表面上的质量变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率的改变(表 面等离振子共振(SPR)的光学现象))，导致可检测的信号，其可以用作生物 分子之间的实时反应的指示。
或者，在另一个实施方案中，类似的诊断和预后测定可以用标志和探 针作为溶质在液相中进行。在这种测定中，通过许多标准技术中的任何一 种将复合的标志和探针与未复合的组分分离，所述技术包括但不限于:差速 离心，层析，电泳和免疫沉淀。在差速离心中，可以通过一系列离心步骤 将标志/探针复合物与未复合的测定组分分离，这是由于基于不同大小和密 度对复合物的不同沉降平衡(参见例如Rivas,G.,and Minton,A.P.,1993, Trends Biochem Sci.18(8):284-7)。也可以使用标准层析技术将复合分子 与未复合的分子分离。例如，凝胶过滤层析基于大小分离分子，并且通过 利用柱形式的合适的凝胶过滤树脂，例如，相对较大的复合物可以与相对 较小的未复合的组分分离。类似地，与未复合的组分相比，标志/探针复合 物的相对不同的电荷性质可以被利用以区分复合物与未复合组分，例如通 过利用离子交换层析树脂。这样的树脂和层析技术是本领域技术人员公知 的(参见例如Heegaard,N.H.,1998,J.MOL.RECOGNIT.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.,and Tweed,S.A.J CHROMATOGR B BIOMED SCI APPL 1997 Oct 10；699(1-2):499-525)。还可以使用凝胶电泳来将复合的 测定组分与未结合的组分分离(参见例如Ausubelet al.,ed.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。在这种技术中，蛋白质或核酸复合物例如根据大小或电荷分 离。为了维持电泳过程中的结合相互作用，非变性凝胶基质材料和不存在 还原剂的条件是典型的。对于特定测定及其组分的适当条件对于本领域技 术人员来说是众所周知的。
在一个具体实施方案中，可以使用本领域已知的方法，通过原位和体 外形式来确定生物样品中对应于标志的mRNA的水平。术语“生物样品” 旨在包括从受试者分离的组织，细胞，生物流体及其分离物，以及存在于 受试者内的组织，细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于 体外方法，不针对mRNA的分离而选择的任何RNA分离技术可以用于从细胞中纯化RNA(参见例如Ausubel et al.,ed.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,John Wiley&Sons,New York 1987-1999)。此外， 使用本领域技术人员熟知的技术，例如Chomczynski(1989，美国专利号 4,843,155)的单步RNA分离方法可以容易地处理大量的组织样品。
分离的核酸可用于杂交或扩增测定，包括但不限于Southern或 Northern分析，聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的 一种诊断方法包括使分离的mRNA与可与被检测的基因编码的mRNA杂 交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，例 如长度至少为7,15,30,50,100,250或500个核苷酸，并且足以在严格条件下与编码本发明标志的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文 描述了用于诊断测定的其它合适的探针。mRNA与探针的杂交表明正在表 达所讨论的标志。
在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过 在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜(例如硝酸 纤维素)上。在备选形式中，将探针固定在固体表面上，并且将mRNA与 探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地调整 已知的mRNA检测方法，以用于检测由本文所述的标志编码的mRNA的 水平。
探针可以是编码蛋白质的核酸序列的全长或小于全长。经验测试较短 探针的特异性。示例性的核酸探针的长度为20个碱基或更长(对于选择用 于核酸杂交的核酸探针序列的方法参见例如Sambrook等人)。杂交部分的 显现允许定性测定cDNA的存在或不存在。
用于确定样品中相应于本发明的标志的转录物水平的备选方法涉及 核酸扩增方法，例如通过rtPCR(Mullis，1987，美国专利号4,683,202中 所述的实验实施方案)，连接酶链反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,88:189-193)，自持续序列复制(Guatelli et al.,1990,PROC.NATL. ACAD.SCI.USA 87:1874-1878)，转录扩增系统(Kwohet al.,1989,PROC. NATL.ACAD.SCI.USA 86:1173-1177)，Q-Beta复制酶(Lizardi etal.,1988, BIO/TECHNOLOGY 6:1197)，滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033) 或任何其它核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增 的分子。荧光rtPCR也可用于本发明的方法。在荧光rtPCR中，定量是 基于荧光信号的量，例如TaqMan和sybr green。如果这样的分子以非常 低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子是特别有用的。如本文 所用，扩增引物被定义为可以退火到基因的5'或3'区域的一对核酸分子(分 别为正负链，反之亦然)，并且其间包含短区域。通常，扩增引物长度为约 10至30个核苷酸，并且侧翼是长度为约50至200个核苷酸的区域。在合 适的条件下并且使用合适的试剂，这样的引物允许扩增包含侧翼为引物的 核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法，mRNA在检测前不需要从细胞中分离出来。在这种方 法中，使用已知的组织学方法制备/加工细胞或组织样品。然后将样品固定 在支持体(通常为载玻片)上，然后与可以与编码标志的mRNA杂交的探针 接触。
作为基于标志的绝对表达水平进行测定的备选方案，可以基于标志的 归一化表达水平进行测定。通过将其表达与不是标志的基因(例如组成型表 达的持家基因)的表达进行比较来校正标志的绝对表达水平，使表达水平归 一化。合适的归一化基因包括持家基因，例如肌动蛋白基因或上皮细胞特 异性基因。该归一化允许将一个样品(例如，受试者样品)中的表达水平与 另一个样品(例如健康受试者)或来自不同来源的样品之间进行比较。
或者，表达水平可以作为相对表达水平提供。为了确定标志的相对表 达水平，在测定所讨论的样品的表达水平之前，可以测定10个或更多个正 常对癌症分离物或甚至50个或更多个样品的标志的表达水平。可以确定在 较大数量的样品中测定的每种基因的平均表达水平，并且这可以用作标志 的基线表达水平。然后将为测试样品(绝对表达水平)确定的标志的表达水 平除以为该标志获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。
在某些实施方案中，在基线测定中使用的样品将来自具有癌症(例如， 血液癌症如ALL和CLL)的受试者的样品与来自相同组织类型的健康受试 者的样品。细胞来源的选择取决于相对表达水平的使用。使用在正常组织 中发现的表达作为平均表达得分有助于验证所测定的标志是否对组织特 异，所述细胞来源于所述组织(相对于正常细胞)。另外，随着更多的数据 被累积，可以修改平均表达值，提供基于累积数据的改进的相对表达值。 来自正常细胞的表达数据提供了分级癌症疾病状态的严重性的手段。
在另一个实施方案中，通过从受试样品中的细胞制备基因组DNA或 mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)并通过将基因组DNA或mRNA/cDNA 与参照多核苷酸杂交来评估标志的表达，所述参照多核苷酸是包含标志的 多核苷酸的互补序列，及其片段。任选地，在与参考多核苷酸杂交之前， 可以使用多种聚合酶链式反应方法中的任何一种来扩增cDNA。同样可以使用定量PCR(QPCR)检测一种或多种标志的表达，以评估标志的表达水 平。或者，可以使用检测本发明标志的突变或变体(例如单核苷酸多态性， 缺失等)的许多已知方法中的任何一种来检测受试者中突变标志的发生。
在相关实施方案中，将从样品获得的转录的多核苷酸的混合物与基质 接触，所述基质固定有与至少部分(例如，至少7，至少10，至少15，至 少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少100，至少500 个或更多个核苷酸残基)本文所述的标志互补或同源的多核苷酸。如果与本 文所述的标志互补或与同源的多核苷酸在底物上是可差别检测的(例如，使 用不同的发色团或荧光团可检测或固定到不同的选定位置)，则可以使用单 个基质(例如，固定在选定位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估 多种标志的表达水平。当使用涉及一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志 表达的方法时，杂交可以在严格的杂交条件下进行。
在另一个实施方案中，利用评估标志表达的方法的组合。
因为组合物，试剂盒和方法依赖于检测本文所述的一种或多种标志的 表达水平的差异，在某些实施方案中，标志的表达水平显著大于用于评估 在来自患有癌症(例如，诸如ALL和CLL的血液癌症)的受试者的生物样 品的至少一种或参考物(例如，来自健康受试者，例如，无癌症的受试者的 生物样品)中表达的方法的最小检测限。
核酸分子和探针
本公开的一个方面涉及对应于本文所述的一种或多种标志的分离的 核酸分子，包括编码对应于本文所述的一种或多种标志的多肽或这种多肽 的一部分的核酸。核酸分子包括存在于本文鉴定的基因组区域中的那些核 酸分子。分离的核酸分子还包括足以用作杂交探针以鉴定对应于本文所述 标志的核酸分子的核酸分子，包括编码对应于本文所述标志的多肽的核酸 分子和此类核酸分子的片段，例如适合用作PCR引物用于扩增或突变核 酸分子的那些。核酸分子可以是使用核苷酸类似物产生的DNA分子(例如 cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和DNA或RNA的类似物。 核酸分子可以是单链或双链的；在某些实施方案中，核酸分子是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子 分离的。在某些实施方案中，“分离的”核酸分子不含天然侧翼于衍生所述 核酸的生物的基因组DNA中核酸的序列(即位于核酸的5'和3'端的序 列)(例如蛋白质编码序列)。
术语“基本上不含其它细胞材料或培养基”包括核酸分子的制剂，其中 所述分子与从所述细胞分离的细胞组分分离或重组产生。因此，基本上不 含细胞材料的核酸分子包括核酸分子的制剂，其具有小于约30％，小于约 20％，小于约10％或小于约5％(以干重计)的其他细胞材料或培养基。
如果需要，可以使用标准分子生物学技术和本文所述的数据库记录中 的序列信息分离核酸分子，例如本文鉴定的标志基因产物。使用这些核酸 序列的全部或部分，可以使用标准杂交和克隆技术分离核酸分子(例如，如Sambrook et al.,ed.,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989中所述)。
可以使用cDNA，mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸 引物根据标准PCR扩增技术扩增核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克 隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，对应于本发 明的核酸分子的全部或一部分的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例 如使用自动化DNA合成仪。
基于本发明的核酸分子的序列的探针可用于检测对应于本文所述的 一种或多种标志的转录物(例如mRNA)或基因组序列。探针包含与其连接 的标记基团，例如放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅因子。这样的探 针可以用作用于鉴定错误表达蛋白质的细胞或组织的诊断测试试剂盒的 一部分，例如通过测量来自受试者的细胞样品中编码所述蛋白质的核酸分 子的水平，例如检测mRNA水平或确定编码所述蛋白质的基因是否已突 变或缺失。
多肽检测
测量本文描述的生物标志的方法包括但不限于:蛋白质印迹，免疫印 迹，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，表面等 离振子共振，化学发光，荧光偏振，磷光，免疫组织化学分析，液相色 谱质谱(LC-MS)，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱， 微细胞计数，微阵列，显微术，荧光激活细胞分选(FACS)，磁激活细胞分选(MACS)，流式细胞术，激光扫描细胞计数，血液学分析仪和基于蛋 白质性质的测定，包括但不限于DNA结合，配体结合或与其它蛋白质配 偶体的相互作用。
也可以通过检测或定量表达的多肽来检测和/或定量标志蛋白的活性 或水平。可以通过本领域技术人员公知的多种方法中的任何一种来检测和 定量多肽。这些可以包括分析生物化学方法，如电泳，毛细管电泳，高效 液相层析(HPLC)，薄层层析(TLC)，超扩散层析等，或各种免疫学方法， 如液体或凝胶沉淀素反应，免疫扩散(单或双倍)，免疫电泳，放射免疫测 定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫荧光测定，Western印迹，免 疫组织化学等。技术人员可以容易地调整用于确定血清样品中一种或多种 生物标志的表达水平的已知蛋白质/抗体检测方法。
用于检测多肽的另一种试剂是能够结合对应于本文所述标志的多肽 的抗体，例如具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。 可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab')2)。关于探针或抗体，术语 “标记的”旨在包括通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)来 直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性间接标 记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体，并用生物素终止标记DNA探针，以便其可用荧光标记的链霉亲和素 检测。
在另一个实施方案中，抗体是被标记的，例如放射性标记的，生色团 标记的，荧光团标记的或酶标记的抗体。在另一个实施方案中，使用抗体 衍生物(例如，与底物缀合或与蛋白质-配体对(例如生物素-链霉亲和素)的 蛋白质或配体缀合的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体，分离的抗体高变 区等)，其与对应于标志的蛋白质(例如由对应于标志的可读框编码的蛋白 质或经历其正常翻译后修饰的全部或部分的蛋白质)特异性结合。
可以使用本领域技术人员熟知的技术来分离来自细胞的蛋白质。所使 用的蛋白质分离方法可以是例如在Harlow和Lane(Harlow and Lane, 1988,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork)中描述的那些。
在一种形式中，抗体或抗体片段可用于诸如Western印迹或免疫荧光 技术的方法中以检测所表达的蛋白质。在这种用途中，可以将抗体或蛋白 质固定在固相支持体上。合适的固相支持体或载体包括能够结合抗原或抗 体的任何支持体。众所周知的支持体或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯， 聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然和改性纤维素，聚丙烯酰胺，辉长 岩和磁石。
在另一个实施方案中，使用免疫测定法检测多肽。如本文所用，免疫 测定法是利用抗体特异性结合分析物的测定法。因此，免疫测定法通过检 测多肽与抗体的特异性结合来表征，而不是使用其他物理或化学性质来分 离，靶向和定量分析物。
使用许多公知的免疫结合测定法中的任一种来检测和/或定量多肽(参 见例如美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。关于一般 免疫测定法的综述，另见Asai(1993)Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology,Academic Press,Inc.New York；Stites&Terr (1991)Basic and Clinical Immunology7th Edition。
在另一个实施方案中，使用
Figure BDA0003147962450000961
测定技术检测和/或定量多肽。
Figure BDA0003147962450000962
测定将微小的颜色编码的珠粒分离成例如不同的组，每组都用 用于特定生物测定的试剂包被，从而以多路方式捕获和检测来自样品的特 定分析物。可以使用基于珠的荧光细胞计数法将
Figure BDA0003147962450000963
测定技术与多 路ELISA测定进行比较，以检测分析物，如生物标志。
本公开还包括用于检测生物样品，例如含有组织，全血，血清，血浆， 颊刮，唾液，脑脊液，尿液，粪便和骨髓的样品中对应于本文所述标志 的多肽或核酸的存在的试剂盒。这样的试剂盒可用于确定受试者是否患有 或具有增加的患癌(例如，血液癌症如CLL和ALL)风险。例如，试剂盒 可以包含能够检测生物样品中对应于本文所述标志的多肽的多肽或编码 所述多肽的mRNA的标记化合物或试剂，以及用于测定样品中多肽或 mRNA的量的工具(例如，结合多肽的抗体或与编码多肽的DNA或mRNA 结合的寡核苷酸探针)。试剂盒还可以包括解释使用试剂盒获得的结果的说 明书。
因此，本公开内容包括用于评估患有癌症(例如，血液癌症如CLL和 ALL)的受试者的疾病进展的试剂盒。
在一个实施方案中，试剂盒可用于评估癌症的疾病进展，所述癌症包 括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白 血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢 性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，母细胞性浆细胞样 树突细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细 胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋 巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨 髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤， 浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一个实施方案 中，本公开提供了用于评估具有血液癌症的受试者的疾病进展的试剂盒。 在一个实施方案中，本公开提供了用于评估具有ALL的受试者的疾病进 展的试剂盒。在另一个实施方案中，本公开提供了用于评估具有CLL的 受试者的疾病进展的试剂盒。在一个实施方案中，本公开提供了用于评估 具有与CD19表达相关的癌症的受试者的疾病进展的试剂盒。
在一个实施方案中，本公开提供了用于评估和表征具有血液癌症的受 试者对表达CAR的细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，如本文所述 的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的应答者状态(例如，完全应 答者，部分应答者或非应答者)的试剂盒。在一个实施方案中，本公开提供 了用于评估和表征具有ALL的受试者对CAR表达细胞疗法(例如，如本 文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的应答者状态(例如， 完全应答者，部分应答者或非应答者)的试剂盒。在一个实施方案中，本公 开提供了用于评估和表征具有CLL的受试者对CAR表达细胞疗法(例如， 如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的应答者状态(例 如，完全应答者，部分应答者或非应答者)的试剂盒。
用于与对应于本文所述标志的多肽结合的合适试剂包括抗体，抗体衍 生物，抗体片段等。用于与核酸(例如基因组DNA，mRNA，剪接的mRNA， cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定于 基质的寡核苷酸(标记或未标记的)，未与基质结合的标记寡核苷酸，PCR 引物对，分子信标探针等。
试剂盒可以任选地包含用于执行本文所述方法的其它组分。作为示 例，试剂盒可以包含适于退火互补核酸或将抗体与其特异性结合的蛋白质 结合的液体(例如，SSC缓冲液)，一个或多个样品室，描述本发明的方法 的性能的指导材料，用于比较本文所述的生物标志的表达水平的参考样品 等。
本发明的试剂盒可以包含可用于测定标志的蛋白质水平或蛋白质活 性的试剂。
在一个实施方案中，提供了用于提供患有癌症(例如，血液癌症如CLL 和ALL)的受试者中CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如本 文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的成功率的预后的试剂 盒，所述试剂盒包含:
特异性检测表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中 列出的基因，PD-1,LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和 KLRG1以及CD19 CAR表达细胞基因集特征的一种或多种(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,50或更多种)的表达水平的一组试剂；和
使用所述试剂盒的说明书；
其中所述使用说明书规定，如果所检测的表达水平中的一种或多种大 于参考水平，则所述受试者更可能积极应答CAR表达细胞疗法。
在一个实施方案中，该组试剂检测由所述组的基因表达的mRNA的表 达。
在一个实施方案中，该组试剂包含与所述组基因表达的mRNA互补的 核酸探针。
在一个实施方案中，与mRNA互补的核酸探针是cDNA或寡核苷酸。
在一个实施方案中，与mRNA互补的核酸探针固定在基质表面上。
在一个实施方案中，该组试剂检测由所述组基因编码的多肽的表达。
治疗剂，组合物和施用
本文描述的方法可用于评估表达CAR的细胞的应答者状态。在一个 实施方案中，细胞表达CAR分子，所述CAR分子包含抗原结合结构域(例 如，特异性结合肿瘤抗原的抗体或抗体片段)，跨膜结构域和细胞内信号传 导结构域(例如，细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域和/或一级 信号传导结构域)。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本领域已知的 靶向或特异性结合本文所述的任何肿瘤抗原的任何抗体或其片段，例如scFv。例如，肿瘤抗原是BCMA(也称为TNFRSF17，肿瘤坏死因子受体 超家族，成员17或B细胞成熟抗原)，CD33，CLL-1(也称为C型凝集素 样结构域家族1或CLECL1)或密蛋白-6(CLDN6)。抗体或其片段可以是鼠， 人源化或完全人的抗体或其片段，例如scFv。
在一个实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，其包含本文所述的抗 -CD19结合结构域(例如，本文所述特异性结合CD19的鼠或人源化抗体或 抗体片段)，本文所述的跨膜结构域，以及本文所述的细胞内信号传导结构 域(例如，包含本文所述的共刺激结构域和/或一级信号传导结构域的细胞 内信号传导结构域)。
抗原结合结构域
在一个方面，本发明的CAR包含靶特异性的结合元件，另外称为抗 原结合结构域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。 例如，可以选择抗原结合结构域以识别在特定疾病状态有关的靶细胞上起 细胞表面标志作用的配体。因此，可以作为本发明的CAR中抗原结合结 构域的配体的细胞表面标志的实例包括那些与病毒，细菌和寄生虫感染， 自身免疫性疾病和癌症细胞相关的细胞表面标志。
在一个方面中，可通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结构域工程 化为CAR的方式，将CAR介导的T细胞应答导向目的抗原。
在一个方面中，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向肿瘤抗 原，例如，本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是结合如下抗原的任何结构域:包括但不限于单 克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段， 包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域 (VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)，且结合本领域已知的 备选的支架以抗原结合结构域形式(比如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体 (TCR)或其片段，例如单链TCR等)起作用。在某些情况下，抗原结合结 构域来源于与CAR的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人 类，CAR的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗 原结合结构域的残基可能是有利的。
本领域的任何已知的CD19 CAR,例如任何已知CD19 CAR的CD19 抗原结合结构域均可根据本发明使用。例如，LG-740；美国专利号 8,399,645中描述的CD19 CAR；美国专利号7,446,190；Xu et al.,Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz et al.,Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens et al.,Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer et al.,Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer et al.,Blood 122(25):4129-39(2013)；and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10。
可以使用CAR表达细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19， CD123，EGFRvIII，间皮素等，如例如WO 2014/130635，WO 2014/130657， 和WO 2015/090230中所述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名 称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019通过T细胞的基因修饰来制备， 其经由用自失活的复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导通过稳定插入介导，所 述载体含有EF-1α启动子控制下的CTL019转基因。CTL019可以是转基 因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞的百分比递送给 受试者。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合人CD19，例如， 可以包括根据WO2014/153270(并入本文作为参考)的表3的CAR分子或 抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合CD123，例如， 可以包括根据WO2014/130635(并入本文作为参考)的表1-2的CAR分子 (例如CAR1-CAR8任一个)或抗原结合结构域。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如 可以包括根据WO 2014/130657(其通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合间皮素，例如可以 包括根据WO2015/090230(其通过引用并入本文)的表2-3的CAR分子或 抗原结合结构域。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自上文所列抗体的一个， 两个或三个(例如全部三个)重链CDR:HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3， 和/或一个，二个，三个(例如，全部三个)轻链CDR:LC CDR1，LC CDR2 和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述 的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是在2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，其全部内容通过引用并入本文。在一 些实施方案中，肿瘤抗原选自以下一种或多种:CD19；CD123；CD22； CD30；CD171；CS-1(也被称为CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319， 和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子 受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体 家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前 列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样 酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚 抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白 介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体 α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或 PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关 的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子 (NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)； 肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I 受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型， 9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌 基因同源物1(AB1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A 型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节 苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶 5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷 脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内 皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)； G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框 61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘 特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化 抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)； 肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体 20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体 51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/ 睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原 1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋 白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受 体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白质p53(p53)；p53突变体； prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)， 由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体； 人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂 (ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰 葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期 蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物 (MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞 色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位 点的调节物的兄弟)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋 白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点 2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾uibiguitous 1(RU1)；肾 uibiguitous 2(RU2)；legumain；人类乳头瘤病毒E6(HPVE6)；人类乳头瘤病 毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hosp 70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体 的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员 2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族 12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋 白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；与免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
CD19 CAR构建体
鼠CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2012/079000中，其通过 引用并入本文，鼠CD19 CAR和scFv构建体的氨基酸序列示于下表2中。
表2:小鼠CD19 CAR构建体
Figure BDA0003147962450001031
Figure BDA0003147962450001041
Figure BDA0003147962450001051
Figure BDA0003147962450001061
Figure BDA0003147962450001071
包含人源化抗CD19 scFv结构域的CD19 CAR构建体描述于PCT公 开WO 2014/153270中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例 如scFv。例如，抗原结合结构域包含表12中列出的可变重链和可变轻链。 连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是例如本文所述的任何接头序 列，或者备选地，可以为GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:45)。
表12:抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0003147962450001072
Figure BDA0003147962450001081
Figure BDA0003147962450001091
Figure BDA0003147962450001101
任何已知的CD19 CAR,例如本领域中任何已知CD19 CAR的CD19 抗原结合结构域可以根据本公开使用。例如，LG-740；在美国专利号 8,399,645中描述的CD19 CAR；Xu etal.,LEUK LYMPHOMA.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz et al.,BLOOD 122(17):2965-2973(2013)； Brentjens et al.,BLOOD,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer etal., BLOOD 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer et al.,BLOOD 122 (25):4129-39(2013)；and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT) (May 15-18,Salt LakeCity)2013,Abst 10。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自上述抗体的一个，两个 或三个(例如全部三个)重链CDR:HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和 /或一个，二个，三个(例如，全部三个)轻链CDR:LC CDR1，LC CDR2 和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述 的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施方案中，针对CD22的抗原结合结构域是抗原结合部分， 例如，例如,Haso et al.,Blood,121(7):1165-1174(2013)；Wayne et al.,Clin Cancer Res 16(6):1894-1903(2010)；Kato et al.,Leuk Res 37(1):83-88 (2013)；Creative BioMart(creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)中描述 的抗体的CDR。
在一个实施方案中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗，Ofatumumab，奥瑞珠单抗，Veltuzumab或GA101的抗原结合部分，例 如CDR。
在一个实施方案中，针对ROR1的抗原结合结构域是在例如,Hudecek et al.,ClinCancer Res 19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和 US20130101607中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子为双特异性抗体分子。双特异 性抗体具有对不超过两个抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于对 第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列，和对第二表 位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案 中，第一和第二表位在同一个抗原，例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白质 的亚基)上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中， 第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位是在不同的 抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施 方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结 构域序列和轻链可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的重链可 变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体 分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特 异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含具有对第一表 位的结合特异性的半抗体，或其片段，和具有对第二表位的结合特异性的 半抗体，或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含具有对第 一表位的结合特异性的scFv或其片段和具有对第二表位的结合特异性的 scFv或其片段。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性) 抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子以及双特异性抗体分子 的各种构型的方案描述于例如2015年3月13日提交的WO2015/142675 的第455-458段中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个方面，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变结构 域序列，例如scFv，其对CD19具有结合特异性，例如包含本文所述的scFv， 或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR以及对不同抗原 上的第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
嵌合TCR
一方面，本发明的抗体和抗体片段(例如，CD19抗体和片段)可以被移 植到T细胞受体(“TCR”)链(例如TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结 构域，以产生嵌合TCR。不受理论束缚，相信嵌合TCR将在抗原结合后 通过TCR复合物发出信号。例如，本文公开的scFv可以移植到恒定结构 域，例如TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的细胞外恒定结构域，跨 膜结构域和胞质结构域的至少一部分。作为另一个实例，抗体片段，例如 本文所述的VL结构域可以移植到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段， 例如本文所述的VH结构域可以移植到恒定TCRβ链的恒定结构域(或者， VL结构域可以被移植到TCRβ链的恒定结构域，并且VH结构域可以被 移植到TCRα链上)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR可以移植 到TCRα和/或β链中以产生嵌合TCR。例如，本文公开的LCDR可以移 植到TCRα链的可变结构域中，并且本文公开的HCDR可以移植到TCRβ 链的可变结构域，反之亦然。这样的嵌合TCR可以例如通过本领域已知 的方法产生(例如，Willemsen RA et al,Gene Therapy 2000；7:1369–1377； Zhang T et al,Cancer Gene Ther 2004；11:487–496；Aggen et al,GeneTher.2012Apr；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如纤连蛋白，锚 蛋白，结构域抗体，脂质运载蛋白，小模块免疫药物，maxybody，蛋白A 或affilin。非抗体支架具有结合细胞上的靶抗原的能力。在实施方案中， 抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在 一些实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体 支架，只要所得到的多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结 合区即可。
非抗体支架包括:纤连蛋白(Novartis，MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)，结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA 和Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)，脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG， Freising，Germany)，小型模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle,WA)，maxybodies(Avidia，Inc.，Mountain View，CA)，蛋白 A(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，Germany)。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的反配对 的分子的胞外结构域或其反配体结合片段。
跨膜结构域
在实施方案中，本文所述的CAR包含与细胞外序列(例如细胞外识别 元件)融合的跨膜结构域，其可以包含抗原结合结构域。在一个实施方案中， 跨膜结构域是与CAR中的一个结构域天然结合的跨膜结构域。在一个实 施方案中，跨膜结构域是不与CAR中的一个结构域天然结合的跨膜结构 域。
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如 与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外 区的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个至多达15个氨基酸)和/或一个或多个与衍 生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的另外的氨基酸(例如，细胞内区域 的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个至多达15个氨基酸)。
在实施方案中，跨膜结构域是使与其它元件例如其他跨膜结构域的相 互作用最小化的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域使得这些结构域 与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合最小化，例如以最小化与受 体复合物的其它成员的相互作用。可以通过选择或修饰已知跨膜结构域的 氨基酸取代来获得合适的实例。在一个实施方案中，跨膜结构域能够促进 与细胞表面上的另一种CAR的同二聚化。
跨膜结构域可以包含天然存在的或非天然存在的合成序列。当天然存 在时，跨膜结构域可以衍生自任何膜结合的或跨膜蛋白。
适用于本文所述分子的跨膜区域可衍生自以下的任何一种或多种:例 如T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9, CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154。在 一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包括例如KIRDS2,OX40,CD2, CD27,LFA-1(CD11a,CD18),ICOS(CD278),4-1BB(CD137),GITR, CD40,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44, NKp30,NKp46,CD160,CD19,IL2R beta,IL2Rgamma,IL7Rα,ITGA1, VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD, CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b, ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2, DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile), CEACAM(例如,CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),CRTAM, Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),SLAMF6 (NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,PAG/Cbp,NKG2D,NKG2C,或CD19的跨膜 区。在一个实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8。在一个实施方案中，跨 膜结构域衍生自CD28。一方面，跨膜结构域是来自作为SEQ ID NO:12 或SEQ ID NO:42提供的序列的跨膜结构域。
在一个实施方案中，序列，例如铰链或间隔区序列可以设置在跨膜结 构域和与其融合的另一个序列或结构域之间。在实施方案中，也可以使用 多种人铰链(也称为“间隔区”)，例如包括但不限于人Ig(免疫球蛋白)铰链。 任选地，长度为2至10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可以形成CAR的 跨膜结构域与另一结构域(例如细胞内信号传导结构域或共刺激结构域)之 间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。在一个方面，铰链或间隔区是作为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8提供的 氨基酸序列。在一个方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
在一个实施方案中，跨膜结构域可以是非天然存在的序列，在这种情 况下可以主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中， 将在跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸，色氨酸和缬氨酸三联体。
任选地，长度为2至10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可以形成CAR 的跨膜结构域和细胞质区域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别 合适的接头。例如，一方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10) 的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核 苷酸序列编码。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导 结构域通常负责其中已经引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少 一个的活化。
用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域的实例包括共同作用以在 抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质 序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重 组序列。
众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且 也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同 种类的细胞质信号传导序列介导的:通过TCR引发抗原依赖性一级活化的 那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或 共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
一级信号传导结构域
一级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的一 级活化。以刺激方式起作用的一级胞内信号传导结构域可以含有信号传导 基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
在本发明中特别使用的含有一级细胞内信号传导结构域的ITAM的实 例包括TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a， CD79b，CD278(也称为“ICOS”)，FcεRI，DAP10，DAP12和CD66d。 在一个实施方案中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的一级信号传导结构域，例如本文所述的CD3-ζ序列。
在一种实施方式中，一级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域， 例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强或降低的)活性的突 变ITAM结构域。在一种实施方式中，一级信号传导结构域包含含有修饰 的ITAM的一级胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM 的一级胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，一级信号传导结构域包 含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。在本发明中特别使用 的含有一级细胞内信号传导结构域的分子的其它实例包括DAP10，DAP12 和CD32的那些。
一级细胞内信号传导结构域包含主要刺激分子(例如CD3 zeta-GenBankAcc.No.BAG36664.1)的功能片段或类似物。一级细胞内信 号传导结构域可以包含整个细胞内区域或细胞内区域的片段，当与其融合 的抗原结合结合域结合同源抗原时，其足以产生细胞内信号。在实施方案 中，一级细胞内信号传导结构域与天然存在的主要刺激分子，例如人 (GenBank Acc No.BAG36664.1)或其他哺乳动物，例如非人类物种，例如 啮齿动物，猴，猿或鼠细胞内主要刺激分子的整个细胞内区域或细胞内区 域的片段具有至少70,75,80,85,90,95,98或99％的序列同一性，所述片段足 以产生细胞内信号。在实施方案中，一级细胞内信号传导结构域与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少70,75,80,85,90,95,98,或99％的序列 同一性。
在实施方案中，一级细胞内信号传导结构域与天然存在的人类主要刺 激分子(例如本文公开的天然存在的人类主要刺激分子)的整个细胞内区域 或细胞内区域的足以产生细胞内信号的片段的相应残基具有至少70,75, 80,85,90,95,96,97,98,或99％同一性，或者相差不超过30,25,20,15,10, 5,4,3,2,或1个氨基酸残基。
共刺激信号传导结构域
CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身， 或者其可以与用于本发明的CAR的上下文中的任何其它期望的胞内信号 传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ链部 分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包括共刺激性分 子的胞内结构域的CAR的部分。在一个实施方案中，细胞内结构域被设 计为包含CD3-zeta的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个 方面，细胞内结构域被设计成包含CD3-zeta的信号传导结构域和ICOS 的信号传导结构域。
共刺激性分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其 配体以外的细胞表面分子。这些分子的实例包括I类MHC分子，TNF受 体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导淋巴细 胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体， OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1 (CD11a/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278), GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80 (KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8alpha,CD8beta,IL2Rbeta,IL2R gamma,IL7R alpha,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4, CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL, CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2, CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile), CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100 (SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150, IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS, SLP-76,PAG/Cbp,CD19a,和与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27 共刺激已经被证明在体外增强人类CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细 胞)的扩增，效应子功能和存活，并在体内增强人T细胞的持久性和抗肿瘤 活性(Song et al.BLOOD.2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其它实 例包括CDS,ICAM-1,GITR,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7, NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD160,CD19,CD4,CD8alpha, CD8beta,IL2R beta,IL2R gamma,IL7R alpha,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE, CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1, CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile), CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100 (SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150, IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS, SLP-76,PAG/Cbp,NKG2D和NKG2C。
可以使本发明的CAR的细胞质部分之内的胞内信号传导序列以随机 或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、 4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内 信号传导序列之间形成连接。在一种实施方式中，甘氨酸-丝氨酸二联体可 用作合适的接头。在一种实施方式中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可 用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含两个或多个，例如2、 3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方式中，两个或多 个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所 述的接头)分子分开。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含两个共 刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，接头分子为甘氨酸残基。在某 些实施方式中，接头为丙氨酸残基。
共刺激结构域包括共刺激分子(例如，ICOS，CD28或4-1BB)的功能 片段或类似物。其可以包含整个细胞内区域或细胞内区域的足以产生细胞 内信号的片段，例如当其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时。在实施 方案中，共刺激结构域与如本文所述的天然存在的共刺激分子，例如人或 其它哺乳动物，例如非人类物种，例如啮齿动物，猴，猿或鼠的细胞内共 刺激分子的整个细胞内区域或细胞内区域的足够产生细胞内信号的片段 具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一 性。在实施方案中，共刺激结构域与SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:40,或SEQ ID NO:44具有至少70％,75％,80％,85％,90％, 95％,98％,或99％的序列同一性。
在实施方案中，共刺激信号传导结构域与天然存在的人共刺激分子， 例如本文公开的天然存在的人共刺激分子的整个细胞内区域的相应残基 或细胞内区域的足以产生细胞内信号的片段具有至少70,75,80,85,90,95, 96,97,98,或99％的同一性，或者相差不超过30,25,20,15,10,5,4,3,2,或 1个氨基酸残基。
本文描述的任何CAR可以包括表11中列出的一种或多种组分。
表11.CAR的多种成分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
Figure BDA0003147962450001191
Figure BDA0003147962450001201
Figure BDA0003147962450001211
Figure BDA0003147962450001221
Figure BDA0003147962450001231
Figure BDA0003147962450001241
Figure BDA0003147962450001251
CAR的组合
在一个方面，本文所述表达CAR的细胞可以进一步包括第二CAR, 例如,第二CAR,其包括例如对相同靶标或不同靶标不同的抗原结合结构 域(例如，除本文所述的癌症相关抗原的靶标或不同的本文所述的癌症相关 抗原，例如CD19，CD33，CLL-1，CD34，FLT3或叶酸受体β)。在一个 实施方案中，第二CAR包括针对与所述癌症相关抗原相同的癌症细胞类 型表达的靶标的抗原结合结构域。在一种实施方式中，表达CAR的细胞 包括靶向第一抗原且包括具有共刺激信号传导结构域而不是一级信号传 导结构域的胞内信号传导结构域的第一CAR,和靶向第二、不同的抗原且 包括具有一级信号传导结构域而不是共刺激信号传导结构域的胞内信号 传导结构域的第二CAR。尽管不希望被理论束缚，将共刺激信号传导结构 域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并且 将一级信号传导结构域例如CD3ζ置于第二CAR上可以将CAR活性限制 为表达两个靶的细胞。在一种实施方式中，表达CAR的细胞包含第一癌 症相关抗原CAR,其包括结合本文所述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜 结构域和共刺激结构域，和第二CAR,其靶向不同的靶抗原(例如，相同癌 细胞类型上表达的抗原作为第一靶抗原)，并且包括抗原结合结构域，跨膜 结构域和一级信号传导结构域。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含 第一CAR和第二CAR,第一CAR包括结合本文中所描述的靶抗原的抗原 结合结构域，跨膜结构域和一级信号传导结构域，第二CAR靶向第一靶 抗原(例如，相同癌细胞类型上表达的抗原作为第一靶抗原)以外的抗原并 且包括抗原的抗原结合结构域，跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一种实施方式中，表达CAR的细胞包含本文所述CAR(例如，CD19 CAR)和抑制性CAR。在一种实施方式中，抑制性CAR包含结合正常细 胞(例如也表达CLL的正常细胞)而不是癌细胞上发现的抗原的抗原结合结 构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构 域，跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如,CEACAM-1, CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1, CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM (TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺 苷和TGFR(例如TGFRβ)的胞内结构域。
在一种实施方式中，当表达CAR的细胞包括两个或多个不同的CAR 时，不同的CAR的抗原结合结构域可以是这样的，使得所述抗原结合结 构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一 CAR的抗原结合结构域，例如呈片段形式，例如scFv，其不与第二CAR 的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在某些实施方式中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR的抗原 结合结构域与其同源抗原的结合不会受所述第二CAR的存在而实质性降 低。在某些实施方式中，在所述第二CAR的存在下，所述第一CAR的抗 原结合结构域与其同源抗原的结合是在不存在所述第二种CAR下所述第 一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％。
在某些实施方式中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR和第二 CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域 时。在某些实施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR的抗原结合结构 域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时的85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％。
CAR表达细胞
本文描述的CAR在细胞，例如免疫效应细胞，例如T细胞上表达。 例如，将本文所述的CAR的核酸构建体转导至T细胞。在实施方案中， 表达本文所述的CAR的细胞是体外转录的RNA CAR T细胞。
细胞，例如T细胞的来源
在扩增和遗传修饰或其它修饰之前，可以从受试者获得细胞来源，例 如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。受试者的实例包括人，猴，黑 猩猩，狗，猫，小鼠，大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得， 包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染 部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，将如本部分所述获得的细胞进行本文所述的测定，例如测定一种或多种生物标 志。
在本发明的某些方面，免疫效应细胞例如T细胞或NK细胞可以使用 本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如FicollTM分离)从受试者收 集的血液单位获得。在一个方面，通过单采血液成分术成分术，从个体的 正在循环的血液获得细胞。单采血液成分术成分术的产物通常含有淋巴细 胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞 和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术成分术收集的细胞 以除去血浆级分，并任选地将细胞置于适合的缓冲液或培养基中用于后续 加工步骤。在一个实施方案中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备 选的实施方案中，洗涤溶液不含钙，且可以不含镁或可以不含许多(即使不 是全部)二价阳离子。
在不存在钙下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技 术人员应当容易地理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法 完成，比如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流通”离心机(例如， Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。 在洗涤之后，可以将细胞再悬浮在多种生物相容性缓冲液中，比如例如不 含Ca、不含Mg PBS、PlasmaLyte A、或含或不含缓冲剂的其它盐溶液。 备选地，可以除去单采血液成分术成分术样品的不期望组分，并将细胞直 接再悬浮在培养基中。
认识到本申请的方法可以利用包含5％或更少，例如2％的人AB血清 的培养基条件，并采用公知的培养基条件和组合物，例如在Smith et al., “Ex vivo expansion ofhuman T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS ImmuneCell Serum Replacement”Clinical&
Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所述。
在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过离心穿过PERCOLLTM梯度 或逆流离心机淘析耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。
本文描述的方法可以包括，例如，使用例如本文所述的负选择技术， 选择免疫效应细胞，例如，T细胞的特定亚群，其是T调节细胞耗尽的群 体，CD25+耗尽的细胞。在一个实施方案中，调节性T耗尽细胞群包含少 于30％,25％,20％,15％,10％,5％,4％,3％,2％,1％CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体 IL-2从所述群体去除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方 案中，所述抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体缀合到基质，例如， 珠子，或以其它方式涂布在基质，例如，珠子上。在一个实施方案中，所 述抗CD25抗体或其片段缀合到如本文所述基质上。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗尽试剂从所述群 体去除所述调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，细 胞对CD25耗尽试剂的比率为1e7细胞对20uL,或1e7细胞对15uL,或 1e7细胞对10uL,或1e7细胞对5uL,或1e7细胞对2.5uL,或1e7细胞 对1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于调节性T细胞，例如，CD25+ 耗尽，使用大于500万个细胞/ml。在进一步的方面，使用600，700，800， 或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待被耗尽的免疫效应细胞群体包含大约6x109个CD25+T细胞。在其它方面中，待被耗尽的免疫效应细胞群体包括约1 x109到1x1010CD25+T细胞，和两者之间的任何整数值。在一个实施方 案中，所得的群体T调节耗尽的细胞具有2x109T调节细胞，例如，CD25+ 细胞，或更少(例如，1x109,5x108,1x108,5x107,1x107,或更少的 CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用CliniMAC系统，利用耗尽管路设置，例如, 管路162-01，从所述群体去除所述调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在 一个实施方案中，CliniMAC系统在耗尽设置上，例如，DEPLETION2.1 上运行。
不希望被特定理论束缚，在单采血液成分术前或在制备CAR表达细 胞的过程中，降低受试者中免疫细胞的负调节因子的水平(例如，减少不需 要的免疫细胞，例如TREG细胞的数量)可以降低受试者复发的风险。在一 个实施方案中，患者在用于CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产品 制造的细胞收集之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法进行预治疗，从 而降低患者对CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗(例如，CTL019 治疗)复发的风险。耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞 的方法包括但不限于环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25耗尽及其组合。
在一些实施方案中，制造方法包括在制造CAR表达细胞之前减少 TREG细胞的数目(例如，耗尽)。例如，制造方法包括用抗GITR抗体和/ 或抗CD25抗体(或其片段，或CD25-结合配体)接触样品，例如，单采血 液成分术分离样品，例如，以在制造CAR表达细胞(例如，T细胞，NK 细胞)产品前耗尽TREG细胞。
在一个实施方案中，在收集用于CAR表达细胞(例如T细胞，NK 细胞)产物制造的细胞之前，将患者用环磷酰胺预治疗，从而降低患者对 CAR表达细胞治疗(例如，CTL019治疗)复发的风险。在一个实施方 案中，在收集用于CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产品制造的 细胞之前，用抗GITR抗体预治疗患者，从而降低患者对CAR表达细胞 治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。
在一个实施方案中，修饰CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制 造方法以在制备CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物(例如CTL019 产物)之前消耗TREG细胞。在一个实施方案中，在制备CAR表达细胞(例 如T细胞，NK细胞)产物(例如CTL019产品)之前，使用CD25消耗来消 耗TREG细胞。
本文描述的方法可以包括一个以上的选择步骤，例如，一个以上的耗 尽步骤。例如，使用针对负选择的细胞特有的表面标志的抗体的组合，通 过负选择对T细胞群体的富集可以实现。一种方法是通过负磁免疫粘附或 流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用 针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志的单克隆抗体的混合物。例 如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可包括针对CD14，CD20，CD11b，CD16，HLA-DR,和CD8的抗体。
本文描述的方法可以进一步包括从群体中除去表达肿瘤抗原，例如不 包含CD25的肿瘤抗原，例如，CD19，CD30，CD38，CD123，CD20， CD14或CD11b的细胞，从而提供T调节性耗尽的，例如，CD25+耗尽的 和肿瘤抗原耗尽的细胞群体，其适用于表达CAR,例如，本文所述的CAR。 在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同 时除去。例如，抗CD25抗体或其片段，以及抗肿瘤抗原抗体，或其片段， 可以连接到相同的基质，例如，珠子，其可被用来除去细胞或抗CD25抗 体或其片段，或抗肿瘤抗原抗体，或其片段可以附着到单独的小珠，其混 合物可以用来除去细胞。在其他实施方案中，去除T调节细胞，例如，CD25+ 细胞，和去除肿瘤抗原表达细胞是顺序的，并且可以例如以任一顺序发生。
还提供了一些方法，其包括从群体中除去细胞，所述细胞表达检查点 抑制剂，例如，本文所述的检查点抑制剂，例如，一种或多种PD1+细胞， LAG3+细胞，和TIM3+细胞，以由此提供T调节耗尽的，例如，CD25+ 耗尽的细胞，和检查点抑制耗尽的细胞，例如，PD1+，LAG3+和/或TIM3+ 耗尽的细胞。示例性检查点抑制剂包括B7-H1,B7-1,CD160,P1H,2B4, PD1,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或 CEACAM-5)，LAG3，TIGIT，CTLA-4，BTLA和LAIR1。在一个实施 方案中，检查点抑制剂表达细胞与T调节，例如，CD25+细胞同时被去除。例如，抗CD25抗体或其片段，以及抗检查点抑制剂抗体，或其片段，可 以附着到相同的珠子，所述珠子可以被用来除去细胞，或抗CD25抗体， 或其片段，以及抗检查点抑制剂抗体，或其片段可以附着到单独的珠子， 所述珠子的混合物可以用来除去细胞。在其他实施方案中，去除T调节细 胞，例如，CD25+细胞，和除去检查点抑制剂表达细胞是顺序的，并且可 以例如以任一顺序发生。
本文中所描述的方法可以包括正选择步骤。例如，通过用抗-CD3/抗 -CD28(例如3×28)-缀合的珠(比如
Figure BDA0003147962450001311
M-450CD3/CD28T)培 养足以正选择期望的T细胞的时期可以分离T细胞。在一个实施方案中， 所述时期为约30分钟。在一个进一步的实施方案中，所述时期范围为30 分钟至36小时或更长及其中所有整数值。在一个进一步的实施方案中，所 述时期为至少1、2、3、4、5或6小时。在仍然另一个实施方案中，所述 时期为10至24小时，例如，24小时。在与其它细胞类型相比存在很少T 细胞的任何情形中，比如从肿瘤组织或免疫功能受损的个体分离浸润肿瘤 的淋巴细胞(TIL)，可以使用较长的培养时间以分离T细胞。进一步，使 用较长的培养时间可以提高俘获CD8+T细胞的效率。因此，通过仅缩短 或延长时间使T细胞结合CD3/CD28珠和/或通过增加或降低珠与T细胞 的比率(如本文进一步描述的)，在培养开始或在该过程的其它时间点可以 优选地选择T细胞的亚群。另外，通过增加或降低珠或其它表面上抗-CD3 和/或抗-CD28抗体的比率，可以在培养开始或在其它期望时间点优选地选 择T细胞的亚群。
在一种实施方式中，可以选择表达下述的一种或多种的T细胞 群:IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5,IL-6,IL-9,IL-21, CCL20,GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白或其它适合的分子例 如其它细胞因子。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法确定。在一个实施方案中，T细胞群体表达细胞 因子CCL20，IL-17a，IL-6及其组合。
对于通过正选择或负选择分离期望的细胞群，细胞的浓度和表面(例 如，粒子，比如珠)可以变化。在某些方面，可能期望显著地降低其中珠和 细胞混合在一起的体积(例如，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大 接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、 70亿/ml、60亿/ml,或50亿/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml 的浓度。在仍然一个方面，使用来自7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细 胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml 的浓度。
使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步， 使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如 CD28-阴性T细胞，或者从其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血 液、肿瘤组织等)更有效地捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并 且将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有 较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关的方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释 T细胞和表面(例如，粒子比如珠)的混合物，使粒子和细胞之间的相互作 用最小化。这选择表达大量的期望结合粒子的抗原的细胞。例如，CD4+T 细胞表达较高水平的CD28，并且在稀浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕 获。在一个方面，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它方面，使用的浓度 可以为约1×105/ml至1×106/ml及其中任何整数值。
在其它方面，可以在2-10℃或在室温下在旋转器中以可变速率培养细 胞可变的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束 缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除 去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后， 将细胞悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的且将适用 于该情形，但是一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的 PBS，或含有10％葡聚糖和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、 或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖 40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例 如Hespan和PlasmaLyte的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/ 分钟的速率冷冻至-80℃并贮存在液氮贮槽的汽相中。可以使用控制冷冻的 其它方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷藏保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并且允许在 室温下静置1小时，之后使用本发明的方法活化。
本发明的上下文中还涉及在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的 时间从受试者收集血样或单采血液成分术成分术产物。因而，要扩增的细 胞来源可以在任何必须的时间点收集，并且分离和冷冻期望的细胞比如T 细胞用于随后用于许多将受益于免疫效应细胞疗法的疾病或病症(如本文 所述那些)的免疫效应细胞疗法中。在一个方面，血样或单采血液成分术成 分术是从一般健康受试者采集的。在某些方面，血样或单采血液成分术成分术是从处于发展为疾病的风险中但还没有发展为疾病的一般健康受试 者采集的，并且分离和冷冻目的细胞用于随后使用。在某些方面，T细胞 可以扩增、冷冻和在随后时间使用。在某些方面，可以在诊断如本文所述 的特定疾病之后不久但在任何治疗之前，从患者采集样品。在一个进一步 的方面，在许多相关的治疗模式之前，从受试者的血样或单采血液成分术 成分术分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下活性剂治疗:比如那他 珠单抗(natalizumab)、艾法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、放射、 免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗 体、或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agents)比如CAMPATH、抗CD3 抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、 类固醇、FR901228和照射。
在本发明的一个进一步的方面，在给受试者留下功能性T细胞的治疗 之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在一些癌症治疗之后， 特别地用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常从治疗恢复期间的治 疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的或对其在离体扩增的能力有 所改善。同样地，在使用本文所述方法离体处理之后，这些细胞可以对于 增强移植和体内扩增处于优选的状态。因此，在本发明的上下文之内预期在该恢复期收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。 进一步，在某些方面，可以使用转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案 产生受试者中的条件，其中特别地在治疗之后的定义时间窗期间，特定细 胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的。示例性的细胞类型包 括T细胞、B细胞、树突细胞及免疫系统的其它细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子，例如，本文所述的CAR分子的 免疫效应细胞，是从已接受了低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者 获得的。在一个实施方案中，免疫效应细胞，例如，T细胞的群体被工程 化以表达CAR,在足够的时间之后被收获，或低的免疫增强剂量的mTOR 抑制剂的足够给药后被收获，以使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T 细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率至少暂时增加了。
在其他实施方案中，已经或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞， 例如，T细胞群，可以通过用一定量的mTOR抑制剂接触离体处理，所述 mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的数目，或增加 PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T 细胞)的比率。
在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK 缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低的或抑制的DGK 活性的细胞。可通过遗传方法来生成DGK缺陷的细胞，例如，施用RNA 干扰剂，例如，siRNA，shRNA，miRNA，以减少或防止DGK表达。备 选地，可通过用本文所述DGK抑制剂处理来产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷型细胞 包括不表达Ikaros RNA或蛋白质的细胞，或具有降低的或抑制的Ikaros 活性的细胞，可通过遗传方法来生成Ikaros缺陷的细胞，例如，施用RNA 干扰剂，例如，siRNA,shRNA,miRNA，以减少或防止Ikaros表达。备选 地，可以通过用Ikaros抑制剂，例如，来那度胺处理来产生Ikaros缺陷的细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷和Ikaros缺陷的，例如，不 表达DGK和Ikaros，或具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。此类DGK 和Ikaros缺陷的细胞可通过任何本文所述的方法产生。
同种异体的CAR
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应 细胞，例如T细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如功能性T 细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类 HLA)表达不足的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如工程化以使得其在其表面上不表 达任何功能性TCR,工程化以使其不表达包括功能性TCR的一个或更多个 亚基(例如，被工程化使得它不表达(或表现出降低的表达)TCRα，TCRβ， TCRγ，TCRδ，TCRε和/或TCRζ)，或工程化以使得其在其表面产生非常 少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达基本上受损的TCR,例如通过表达突变或截短的形式的一个或更多个TCR的亚基。术语“基本上受损的 TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如工程化以使得其在表面上不表达功能性 HLA。例如，本文所述的T细胞可以工程化以使得细胞表面表达HLA(例 如1类HLA和/或II类HLA)下调。在一些实施方案中，HLA的下调可以 通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现。
在某些实施方式中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA(例如 I类HLA和/或II类HLA)。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何合适 的方法获得，包括一个或更多个TCR或HLA的亚基的基因敲除(knock out)或基因敲减(knock down)。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、 簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸 酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)的TCR和/或HLA的基因敲减。
在某些实施方式中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制 性分子的细胞，例如通过本文所述任何方法。例如，细胞可以是不表达或 以低水平表达抑制性分子的细胞，例如可以降低表达CAR的细胞建立免 疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、 TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、 LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80，CD86， B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)， KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如TGFRβ)。 抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制，可以优 化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用如本文所述的抑制性 核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA例如siRNA或shRNA，簇状的规则 间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN) 或锌指核酸内切酶(ZFN)。
siRNA和shRNA抑制TCR或HLA
在一些实施方案中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA和/或本文所 述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例 如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA, TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类 MHC，GAL9，腺苷和TGFRβ)的核酸的siRNA或shRNA来抑制细胞例 如T细胞中TCR表达和/或HLA表达。
用于siRNA和shRNA以及示例性shRNA的表达系统描述于例如2015 年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段，其全部 内容通过引用并入本文。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文中使用的“CRISPR”或“TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制 TCR和/或HLA的CRISPR”是指簇状的规则间隔的短回文重复序列组或 包括该重复序列组的系统。正如本文中使用的那样，“Cas”是指CRISPR- 相关的蛋白。“CRISPR/Cas”系统指来源于CRISPR和Cas的系统，其可 用于沉默或突变在细胞，例如T细胞中TCR和/或HLA基因,和/或本文所 述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例 如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA, TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14 or CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类 MHC，GAL9，腺苷和TGFRβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际 申请WO2015/142675的第651-658段中，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的 TALEN”是指转录激活子样效应子核酸酶，其是一种在细胞中，例如T细 胞中可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶，和/或本文所述的抑 制性分子(例如PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA, TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4 (VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷，和TGFRβ)。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675的第659-665段，其全部内容通过引用并入本文。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/ 或TCR的ZFN”是指细胞，例如T细胞中中的锌指核酸酶，一种可用于 编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1,PD-L1, PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80, CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270), KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷，和TGFRβ)的人工核 酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675的第666-671段，其全部内容通过引用并入本文。
端粒酶表达
虽然不希望受任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，由于在T细 胞端粒缩短，治疗性T细胞具有在患者中短期持久性；相应地，用端粒酶 基因转染能延长T细胞的端粒和改善患者中T细胞的持久性。见Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应 细胞，例如，T细胞，异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT。在一些方面，本公开内容提供了生产CAR 表达细胞的方法，其包括将细胞与编码端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚 基，例如，TERT，例如，hTERT的核酸接触。该细胞可以在与编码CAR 的构建体接触之前，同时或之后与所述核酸接触。
在一个方面，本公开内容描述了制备免疫效应细胞(例如，T细胞，NK 细胞)群的方法。在一个实施方案中，该方法包括:提供免疫效应细胞(例如， T细胞或NK细胞)群，将免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；和将免 疫效应细胞群与编码端粒酶亚基例如,hTERT的核酸在允许CAR和端粒 酶表达的条件下接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案 中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基的表达的启动子。
在实施方案中，hTERT具有GenBank蛋白质ID AAC51724.1的氨基 酸序列((Meyerson et al.,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic SubunitGene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785–795) 如在本文的SEQ ID NO:82中给出。
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:82的序列有至少 80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性的序列。在一个实 施例中，hTERT具有SEQ ID NO:82的序列。在一个实施方案中，hTERT 包含N末端、C-末端、或两端的缺失(例如，不超过5，10，15，20，或 30个氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，hTERT包含N末端、C-末端、 或两端的转基因氨基酸序列(例如，不超过5，10，15，20，或30个氨基 酸)。
在一个实施方案中，hTERT由如在本文SEQ ID NO:83中给出的 GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson et al.,“hEST2,the Putative Human TelomeraseCatalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and duringImmortalization”Cell Volume 90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785–795)。
在一个实施方案中，hTERT由具有与SEQ ID NO:83的序列有至少 80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列的核 酸编码。在一个实施方案中，hTERT是由SEQ ID NO:83的核酸编码。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的活化和扩增
通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869； 7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美 国专利公开号20060121005中所述的方法进行免疫效应细胞如T细胞的 活化和扩增。在一些实施方案中，在活化之前，期间或之后，或在扩增之 前，期间或之后，免疫效应细胞进行如本文所述的测定(例如，测定一种或 多种生物标志)。
通常，免疫效应细胞的群体可以通过与连接有刺激CD3/TCR复合体 相关的信号的活性剂和刺激T细胞表面上的共刺激性分子的配体的表面接 触进行扩增。特别地，可以如本文所述的刺激T细胞群，比如通过与抗-CD3 抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与 钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T 细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺 激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗-CD3抗体和抗CD28抗体接触。 为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗-CD3抗体和抗 -CD28抗体。可以如本领域已知的其它常用方法那样使用抗-CD28抗体的 实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,
Figure BDA0003147962450001401
France)(Berg等 人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med. 190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999)。
在某些方面，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次刺激信号和 共刺激信号。例如，提供每种信号的活性剂可以在溶液中或被偶联至表面。 当与表面偶联时，可以把所述活性剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式) 或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以把一种活性剂偶联到表面， 且另一种活性剂可以在溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的活性剂与 细胞表面结合，且提供一级活化信号的活性剂在溶液中或被偶联至表面。在某些方面，两种活性剂都可以在溶液中。在一个方面，活性剂可以呈可 溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该活性剂结合的Fc受体 或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)， 参见例如美国专利申请公开号:20040101519和20060034810，考虑其在本 发明中用于活化和扩增T细胞。
在一个方面，把两种活性剂都固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”， 或在不同的珠上，即“反式”。例如，提供一级活化信号的活性剂是抗CD3 抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的活性剂是抗-CD28抗体或 其抗原结合片段；并且两种活性剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠 上。在一个方面，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与所述珠结合的抗 CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到 T细胞扩增的增加。在一个特别的方面，与使用1:1的比率观察的扩增相 比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，与所述珠结合的CD3:CD28 抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在一个方面，与粒 子结合的抗-CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率小于1。在 某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一 个特别的方面，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个 方面，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的 方面，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用1:10 的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用的与珠结合的抗 体的1:3CD3:CD28比率。在还有一个方面中，使用3:1的与珠结合的抗 体CD3:CD28比率。
可以使用1:500至500:1及其间任何整数值的粒子与细胞的比率来刺 激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样， 粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子尺寸。例如，小尺寸珠 可能仅结合少数细胞，而较大珠可结合许多细胞。在某些方面，细胞与粒 子的比率范围为1:100至100:1及其中任何整数值，并且在进一步的方面， 也可以使用包括1:9至9:1的及其中任何整数值的比率来刺激T细胞。导 致T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28偶联的粒子与T细胞的比率可以如上 所述变化，然而某些合适值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、 1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、 7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个合适的比率为至少1:1的粒子/T细胞。 在一个方面，使用1:1或更小的粒子与细胞的比率。在一个特别的方面， 合适的粒子:细胞比率为1:5。在进一步的方面，粒子与细胞的比率可以根 据刺激的天数变化。例如，在一个方面，在第一天，粒子与细胞的比率为 1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中加入另外的粒子，直到10 天，最终比率为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特别的方 面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为1:1，并在刺激的第三天和第 五天调节为1:5。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激 的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:5。在一个特别的 方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为2:1，并在刺激的第三天和 第五天调节为1:10。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺 激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技 术人员应当理解多种其它比率都可以适用于本发明。特别地，比率将根据 粒径及细胞尺寸和类型而变化。在一个方面，在第一天，最典型的使用比 率为约1:1、2:1和3:1左右。
在进一步的方面，将细胞比如T细胞与活性剂包被的珠混合，接着分 离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的方面，在培养之前，活性剂-包被的 珠和细胞没有分离，而是一起培养。在一个进一步的方面，首先通过施加 力(比如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志的连接增加，从而诱导细 胞刺激。
例如，可以通过允许附着了抗-CD3和抗-CD28的顺磁性的珠(3x28珠) 与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，比率1:1的
Figure BDA0003147962450001421
M-CD3/CD28 T顺磁性 的珠)在缓冲液中混合，缓冲液例如为PBS(不含二价阳离子，比如钙和镁)。 此外，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如， 样品中靶细胞可能非常少，且仅占样品的0.01％，或全部样品(即，100％) 可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文之内。在 某些方面，可能期望显著减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加 细胞浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。例如，在一个方面，使用约 100亿个细胞/ml、90亿/ml、8 0亿n/ml、70亿/ml、60亿/ml、5 0亿/ml、 或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。 在一个方面，使用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细 胞/ml的浓度。在仍然一个方面，使用从7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个 细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞 /ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。 进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细 胞，比如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某 些方面将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常 具有弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，通过例如本文所述的方法扩增用编码CAR,例如， 本文所述的CAR的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，将细胞在培养 中扩增几个小时(例如，约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，18，21小 时)到约14天(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)。在一个实施方案中，细胞被扩增4至9天。在一个实施方案中，细胞 被扩增8天或更短，例如，7,6或5天。在一个实施方案中，所述细胞，例 如，本文所述的CD19 CAR细胞在培养中扩增5天，所得细胞比相同的培 养条件下培养扩增9天的相同的细胞更有效。效力可以通过例如，由不同 的T细胞的功能，例如增殖，靶细胞杀伤，细胞因子的产生，活化，迁移， 或它们的组合来定义。在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下扩增 9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本文所述的CD19 CAR细胞 显示细胞倍增的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，所述细胞， 例如，表达本文所述的CD19 CAR的细胞培养扩增了5天，并且相比于在 相同培养条件下扩增9天的相同细胞，所得的细胞显示出更高的促炎细胞 因子产生，例如，IFN-γ和/或GM-CSF的水平。在一个实施方案中，相比 于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本 文所述的CD19 CAR细胞显示出促炎细胞因子产生，例如，IFN-γ和/或 GM-CSF的水平以pg/ml计至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加。
也可能需要几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或以 上。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如,极限必需培养基或 RPMI培养基1640或X-vivo 15,(Lonza))，其可以含有增殖和生存所必需 的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-1(IL-2)、胰岛素、 IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α 或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的 其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂比如N-乙酰 基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、 MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、OptimizeR,具有加入的 氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适合量的血清(或血浆)或定 义的激素组、和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例 如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不在输注到受试者中的细 胞培养物中。靶细胞保持在载体生长必需的条件下，例如适合的温度(例如 37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在合适的培养基(如，本文中所描述的培养 基)中扩增，所述培养基包括导致细胞在14天的扩增期间增加至少200倍 (例如，200倍，250倍，300倍，350倍)的一种或多种白介素，例如，如 通过本文所述的方法如流式细胞术测定。在一个实施方案中，将细胞在 IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施方案中，本文描述的方法，例如，CAR表达细胞的制造方法， 包括例如，用抗CD25抗体或其片段，或CD25-结合配体IL-2从细胞群体 除去调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。从细胞群体除去调节性T细胞， 例如，CD25+T细胞的方法在本文中描述。在实施方案中，这些方法，例 如，制造方法，进一步包括将细胞群(例如，其中调节性T细胞，例如 CD25+T细胞已耗尽的细胞群；或已预先接触抗CD25抗体，或其片段，或CD25-结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，细胞群(例如， 已经预先接触抗CD25抗体，其片段，或CD25-结合配体的细胞群)在IL-15 和/或IL-7的存在下扩增。
在一些实施方案中，在制造CAR表达细胞期间，本文所述的CAR表 达细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽，白介素15受体α(IL-15Ra)多肽，或 IL-15多肽和IL-15Ra多肽例如,hetIL-15的组合的组合物离体接触。在实 施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽的组合物在制造 CAR表达细胞期间例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合的组合物在制造CAR表 达细胞期间，例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细 胞与包含hetIL-15的组合物在制造CAR表达细胞期间，例如，离体接触。
在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含hetIL-15的组 合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细 胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中， 本文描述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合物在 离体扩增期间接触。在一个实施方案中，接触导致淋巴细胞亚群例如， CD8+T细胞的存活和增殖。
在一个实施方案中，在包含血清的培养基中培养细胞(例如扩增，刺激 和/或转导)。血清可以是例如人AB血清(hAB)。在一些实施方案中，hAB 血清以约2％，约5％，约2-3％，约3-4％，约4-5％或约2-5％存在。如 本文实施例15所示，2％和5％血清各自是允许T细胞多倍扩增的合适水 平。此外，如Smith et al.,“Ex vivo expansion of human Tcells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune CellSerum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31； doi:10.1038/cti.2014.31所示，含有2％人AB血清的培养基适用于T细胞 的离体扩增。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，典 型的血液或单采血液成分术成分术外周血单核细胞产物具有大于细胞毒 性或抑制T细胞群(TC,CD8+)的辅助T细胞群(TH,CD4+)。通过刺激CD3 和CD28受体的离体T细胞扩增产生T细胞群，该细胞群在约第8-9天前 主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包括越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，向受试者输注主要包括TH细胞的T细 胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组， 则使该亚组在更大程度上扩增可能是有益的。
进一步，除了CD4和CD8标志之外，其它表型标志显著变化，但大 部分在细胞扩增过程中可再重现。因此，这样的可重现性使能够针对特定 目的裁剪活化的T细胞产物。
在一些实施方案中，可以基于例如CCL20,GM-CSF,IFNγ,IL-10, IL-13,IL-17a,IL-2,IL-21,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,TNFα和/或其组合中的一 种或多种的蛋白质表达水平来选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的 核酸转导的细胞用于施用。在一些实施方案中，可以基于例如CCL20， IL-17a，IL-6及其组合的蛋白质表达水平来选择用编码CAR(例如本文所 述的CAR)的核酸转导的细胞用于施用。
一旦构建本文所述的CAR,则可以使用多种试验来评价分子的活性， 比如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激下维持T 细胞扩增和在适合的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价CAR的效 应的试验在下文进一步详细描述。
可以使用原代T细胞中CAR表达的Western印迹分析来检测单体和 二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675 的第695段所述，其通过引用整体并入本文。
可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。 例如，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，接着 在要被分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体转导。示例性的启 动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。 在第6天，通过流式细胞测量术测量CD4+和/或CD8+T细胞亚组中培养 物的GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009)。备选地，在第0天，用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激 CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天使用表达CAR的双顺反子慢 病毒载体用CAR转导以及使用2A核醣体跳跃序列用eGFP转导。在抗 -CD3和抗-CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，用本文所述的癌症相关 抗原+K562细胞(如本文所述的K562癌症相关抗原),野生型K562细胞 (K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激培养物，之 后洗涤。每隔一天，向培养物中加入100IU/ml的外源性IL-2。通过流式细胞术，使用基于珠的计数对GFP+T细胞计数。参见，例如Milone等人, Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR+T细胞扩增。参见，例如 Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第 0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的CAR转导， 在培养的第8天，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)活性， 例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第698段 所述，其通过引用全部并入本文。
可以评估剂量依赖性CAR治疗应答，例如，如2015年3月13日提 交的国际申请WO2015/142675的第699段所述，其全部内容通过引用并 入本文。
之前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如如2015年3 月13日提交的国际申请WO2015/142675的第700段所述，其全部内容通 过引用并入本文。
在另一个实施方案中，细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体(例如CAR 表达细胞)产物，例如CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞))细胞 产物，例如，CTL019细胞)的效力使用
Figure BDA0003147962450001471
组的细胞因子来评估以 确定细胞因子表达水平。细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体(例如，制造 的CAR表达细胞)细胞产物，例如CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019 细胞)在体外通过表达CD19的K562(K562-19)细胞活化，所述K562细胞 在CLL中模拟表达CD19的B细胞。在细胞(例如，T细胞，NK细胞)活 化后，在共培养的细胞培养基中测量细胞因子表达谱，并且活化细胞(例如， CAR表达细胞产物，例如CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019细胞) 的效力与不同细胞因子的表达相关，所述细胞因子包括但不限于 CCL-20/MIP-3a,GM-CSF,IFNγ,IL-10,IL-13,IL-17a,IL-2,IL-21,IL-4, IL-5,IL-6,IL-9,TNFα和/或其组合。
在一个实施方案中，关于细胞(例如，T细胞，NK细胞)群体的效力(例 如，杀死肿瘤细胞)，细胞因子表达水平是有信息的。在一个实施方案中， 本文所述的细胞因子表达水平用于在患者中输注前改善细胞(例如，T细 胞，NK细胞)群体(例如，表达CAR的细胞产物，例如CD19 CAR表达细 胞产物，例如CTL019细胞)。在一个实施方案中，本文所述的细胞因子表达水平在制备过程的优化期间提供终点。
细胞毒性可以通过标准的51Cr释放测定来评估，例如，如2015年3 月13日提交的国际申请WO2015/142675的第701段所述，其全部内容通 过引用并入本文。
成像技术可用于评估荷瘤动物模型中CAR的特异性运输和增殖，例 如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落702所 述，其全部内容通过引用并入本文。
其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那 些也可用于评估本文所述的CAR。
备选地或与本文公开的方法组合，公开了用于以下一种或多种的方法 和组合物:检测和/或定量CAR表达细胞(例如体外或体内(例如临床监测))； 免疫细胞扩增和/或活化；和/或CAR特异性选择，其涉及使用CAR配体。 在一个示例性实施方案中，CAR配体是结合CAR分子，例如结合CAR 的细胞外抗原结合结构域的抗体(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如 抗独特型抗体；或结合细胞外结合结构域的恒定区的抗体)。在其它实施方 案中，CAR配体是CAR抗原分子(例如本文所述的CAR抗原分子)。
一方面，公开了一种用于检测和/或定量CAR表达细胞的方法。例如， CAR配体可用于在体外或体内检测和/或定量CAR表达细胞(例如，临床 监测患者中CAR表达细胞或对患者给药)。该方法包括:
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包括标签，珠，放 射性或荧光标记的CAR配体)；
获取CAR表达细胞(例如，获取含有CAR表达细胞的样品，例如制 造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使CAR表达细胞与CAR配体接触，从而检测存 在的CAR表达细胞的水平(例如，量)。CAR表达细胞与CAR配体的结合 可以使用标准技术如FACS，ELISA等检测。
另一方面，公开了扩增和/或激活细胞(例如免疫效应细胞)的方法。该 方法包括:
提供CAR表达细胞(例如，第一CAR表达细胞或瞬时表达CAR细 胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下使所述CAR表达细胞与CAR 配体例如本文所述的CAR配体接触，从而产生活化和/或扩增的细胞群体。
在某些实施方案中，CAR配体存在于基质(例如，固定化或附着到基 质，例如非天然存在的基质)上。在一些实施方案中，基质是非细胞基质。 非细胞基质可以是选自例如板(例如，微量滴定板)，膜(例如硝酸纤维素膜)， 基质，芯片或珠粒的固相支持体。在实施方案中，CAR配体存在于基质中 (例如，在基质表面上)。CAR配体可以固定，连接或共价或非共价结合(例 如交联)至基质。在一个实施方案中，将CAR配体连接(例如共价连接)到 珠粒上。在上述实施方案中，免疫细胞群可以在体外或离体扩增。该方法 还可以包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞群体，例如使用本文 所述的任何方法。
在其它实施方案中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分 子例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可固定在基质例如一个或 多个珠粒上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
另一方面，提供了一种用于选择或富集CAR表达细胞的方法。该方 法包括使CAR表达细胞与本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体 的结合选择细胞。
在其它实施方案中，提供了用于消耗，减少和/或杀死CAR表达细胞 的方法。该方法包括使CAR表达细胞与本文所述的CAR配体接触；并基 于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少CAR表达细胞的数量和/或杀死 CAR表达细胞。在一个实施方案中，CAR配体与毒性剂(例如毒素或细胞 消融性药物)偶联。在另一个实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞 活性，例如ADCC或ADC活性。
可以在本文公开的方法中使用的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena et al.,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody toDetect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3e57838,，其内容通过引用并入。
在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对T细胞的特定子 集进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号 PCT/US2015/043219中所述，其内容通过引用全部并入本文。在一些实施 方案中，与对照T细胞(例如表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如， CD8+或CD4+))相比，T细胞的优化子集显示增强的持续性。
在一些实施方案中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR,所述CAR包 含适于CD4+T细胞(例如，优化，例如导致增强的持久性)的细胞内信号传 导结构域，例如ICOS结构域。在一些实施方案中，CD8+T细胞包含本文 所述的CAR,所述CAR包含适于CD8+T细胞(例如，优化，例如导致增强 的持久性)的细胞内信号传导结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或 ICOS结构域以外的另一共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的 CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一方面，本文描述了治疗受试者，例如患有癌症的受试者的方法。 该方法包括向所述受试者施用有效量的:
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+T细胞
其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域和
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS结构域； 和
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB结构域， CD28结构域或除ICOS结构域之外的另一共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，所述方法还包括施用:
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含不存在于CARCD8+上 的细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，并且任选地不包 含ICOS信号传导结构域。
RNA转染
本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。RNA CAR及其 使用方法描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675 的第553-570段，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式 引入细胞。RNA可以具有3'UTR,5'UTR,或两者。5'UTR可以包含Kozak 序列。RNA可以包含IRES。RNA可以包含5'帽。RNA可以包含多聚A 序列。可以使用包含启动子，例如T7，T7或SP6启动子的DNA模板来 产生RNA。可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，所 述方法为例如可商购的方法，包括但不限于电穿孔，Gene Pulser II， MultiporatoR,使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染，聚合物包封，肽 介导的转染，或诸如“基因枪”的生物射弹颗粒递送系统。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可用于将编码本文描述的CAR的核酸递送 至细胞或组织或受试者。合适的非病毒递送方法包括转座子(例如，Sleeping Beauty，piggyBac和基于pT2的转座子)。例如在2015年3月13日提交 的国际申请WO2015/142675(其全部内容通过引用并入本文)的第571-579 段中描述了示例性的非病毒递送方法和使用该方法的方法。
制造/生产方法
一方面，本文公开了制备根据本发明的CAR表达细胞的方法(例如， 在“细胞来源”和“细胞的活化和扩增”)中。
在一个实施方案中，提供了制造CAR表达细胞的方法。该方法包括:
提供CAR表达细胞(例如，多种CAR表达免疫效应细胞，例如T细 胞或NK细胞)的制备(例如，本文所述的CD19 CAR表达细胞，例如， CTL019)；
获得表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15， 表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3, TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1中列出的一种或多种基因 的水平(例如，确定表达水平)值以获得样品的基因表达模式；
(任选地)将获得的基因表达模式与基因表达的历史记录进行比较；
确定获得的和历史的基因表达之间的差异；和
在质量控制记录中记录确定的差异。
在一个实施方案中，所提供的方法包括提供如本文所述的CAR表达 细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂(例如，CD19 CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞),例如CTL019)；
确定样品中表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14， 表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1, LAG-3,TIM-3,CD57,CD27,CD122,CD62L,和KLRG1中列出的一种或 多种基因的表达水平，以获得基因表达模式(例如，基因特征)；
将基因特征与患者对CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例 如本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法，例如 CTL019)相关联；
并且在输入患者之前基于基因特征和患者应答的相关性优化CAR表 达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂。
在一个实施方案中，所提供的方法包括获得CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞)应答抗原识别而分泌的细胞因子的水平(例如，确定表达水 平)的值，所述细胞因子为例如表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a 和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的一种或多种细胞因子。在一个 实施方案中，所提供的方法包括测定响应于抗原识别，由CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)分泌的一种或多种细胞因子CCL20/MIP3a，IL-17a， IL-6和/或其组合的表达水平。在一个实施方案中，所提供的方法还包括在 效力测定中整合由CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)分泌的细胞因 子，例如表14，表15和表16所列的一种或多种细胞因子。在一个实施方 案中，所提供的方法进一步包括在效力测定中整合细胞因子 CCL20/MIP3a，IL-17a，IL-6和/或其组合。
在一个实施方案中，所提供的方法包括效力测定中由CAR表达细胞 (例如，T细胞，NK细胞)分泌的细胞因子的整合，例如表14，表15，表 16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)和表17中列出的一种或多种细胞因子， 以及确定如本文所述的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂(例 如，CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CTL019)是否 可能具有临床效果。在一个实施方案中，CCL20/MIP3a，IL-17a，IL-6和 /或其组合用于效力测定以确定如本文所述CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)制剂(例如，CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例 如CTL019)是否可能具有临床效果。在一个实施方案中，所提供的方法还包括调节CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)输注剂量以达到临床疗效。
在一个实施方案中，所提供的方法包括提供来自患有癌症的受试者的 血液样品，例如T细胞样品的步骤。
在一个实施方案中，所提供的方法还包括将获得的基因表达模式差异 与参考样品的差异进行比较的步骤。
在一个实施方案中，参考样品是来自不同批次的产生治疗性CAR表 达细胞制剂的细胞的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂(例如本 文所述的CD19 CAR表达细胞，例如CTL019)。
在一个实施方案中，参考样品是具有制备的CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞)产物(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞，例如CTL019) 的健康供体样品。在一个实施方案中，参考样品是具有制备的CD19 CAR 表达细胞产物(例如CTL019产物)的健康供体样品。
在一个实施方案中，所提供的方法还包括将治疗性CAR表达细胞(例 如T细胞，NK细胞)制剂的比较结果记录在质量控制记录中的步骤。
在一个实施方案中，将确定的差异与参考样品的历史记录进行比较。
在一个实施方案中，CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂是 CD19 CAR表达细胞(例如CTL019)制剂。
在一个实施方案中，CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)制剂包 含CD19 CAR表达细胞(例如CTL019)制剂。
在一个实施方案中，CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)制剂由 CD19 CAR表达细胞(例如CTL019)制剂组成。
一方面，提供了一种方法，包括:
提供来自患有癌症的受试者的血液样品，例如T细胞样品；
确定表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如 CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，PD-1,LAG-3,TIM-3, CD57,CD27,CD122,CD62L,或KLRG1中列出的一种或多种基因的表达 水平，以获得样品的基因表达模式；
将获得的基因表达模式与参考值的基因表达模式，例如基因表达的历 史记录进行比较；
确定获得的值和参考值之间的差异；和
在质量控制记录中记录确定的差异。
该方法可以包括将获得的基因表达模式差异与参考样品的基因表达 模式差异进行比较的步骤。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在用细胞(例如本文所述的 免疫效应细胞)处理后施用T细胞消耗剂，从而减少(例如，消耗)CAR表 达细胞(例如，CD19 CAR表达细胞)。这样的T细胞消耗剂可用于有效地 消耗CAR表达细胞(例如CD19 CAR表达细胞)以减轻毒性。在一些实施 方案中，根据本文的方法制备CAR表达细胞，例如根据本文方法测定(例 如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施方案中，在施用细胞，例如本文所述的免疫效应细胞群后 1，2，3，4或5周施用T细胞消耗剂。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡而消耗CAR表达细胞的 活性剂。例如，本文所述的CAR表达细胞也可以表达由能够诱导细胞死 亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如，靶抗原)。 例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向 的靶蛋白(例如受体)。这些靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM，VEGFR, 整联蛋白(例如整联蛋白ανβ3,α4,αΙ3/4β3,α4β7,α5β1,ανβ3,αν)，TNF受 体超家族的成员(例如TRAIL-R1，TRAIL-R2)，PDGF受体，干扰素受体， 叶酸受体，GPNMB,ICAM-1,HLA-DR,CEA,CA-125,MUC1,TAG-72, IL-6receptor,5T4,GD2,GD3,CD2,CD3,CD4,CD5,CD11, CD11a/LFA-1,CD15,CD18/ITGB2,CD19,CD20,CD22,CD23/lgE受体， CD25,CD28,CD30,CD33,CD38,CD40,CD41,CD44,CD51,CD52, CD62L,CD74,CD80,CD125,CD147/basigin,CD152/CTLA-4, CD154/CD40L,CD195/CCR5,CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例 如，保留一个或多个胞外表位但是缺乏细胞质结构域内的一个或多个区域 的形式)。
在一些实施方案中，CAR表达细胞共表达CAR和靶蛋白，例如天然 表达靶蛋白或被工程化以表达靶蛋白。例如，细胞，例如免疫效应细胞群 体可以包括包含CAR核酸(例如本文所述的CAR核酸)和编码靶蛋白的核 酸的核酸(例如载体)。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗 体分子，例如阿仑珠单抗。
在其他实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞群，表达如本文所述的 CAR分子(例如CD19CAR)和由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施 方案中，靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施方案中，T细胞消耗 剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步实施方案中，所述方法还包括将细胞例如造 血干细胞或骨髓移植到哺乳动物中。
另一方面，本发明的特征在于在细胞移植之前对哺乳动物进行调理的 方法。该方法包括向哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽例如 CD19 CAR核酸或多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移 植，例如造血干细胞移植或骨髓移植。在其它实施方案中，在细胞移植之 前对受试者进行调理包括减少受试者中靶表达细胞，例如表达CD19的正 常细胞或表达CD19的癌细胞的数量。
编码CAR的核酸构建体
编码一种或多种CAR构建体的核酸分子可以引入如本文所述免疫效 应细胞(例如，T细胞)中。一方面，提供核酸分子作为信使RNA转录物。 一方面，提供核酸分子作为DNA构建体。
在一些实施方案中，将本文所述的核酸引入已经通过本文所述的方法 测定的细胞中，例如已经测定了一种或多种生物标志。在一些实施方案中， 通过本文所述的方法测定了包含本文所述的核酸的细胞，例如已经测定了 一种或多种生物标志。
本文所述的核酸分子可以是DNA分子，RNA分子或其组合。在一个 实施方案中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其它 实施方案中，核酸分子是包含任何上述核酸分子的载体。
核酸分子可以编码例如本文所述的CAR分子，并且可以包含例如本 文所述，例如表11，表12或表13中的核酸序列。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如 通过从表达该基因的细胞筛选文库，通过从已知包含该基因的载体衍生基 因，或使用标准技术通过从含有该基因的细胞和组织直接分离。或者，可 以合成产生，而不是克隆目的基因。
还描述了其中插入本公开的核酸的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒 的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定 整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于衍生自癌逆转录病毒例如 鼠白血病病毒的载体具有增加的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，例 如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体也可以是 例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子，包装信 号(ψ)，引物结合位点(PBS)，一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR) 和目的转基因，例如编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可能缺乏病毒结 构基因，如gag，pol和env。示例性的γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病 毒(MLV)，脾脏病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)以及 从其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如TobiasMaetzig et al., “Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011 Jun；3(6):677–713。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺 病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码CAR的核酸的表达可以使 用转座子如睡美人，CRISPR,CAS9和锌指核酸酶来实现。参见下面的June et al.2009 NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY 9.10:704-716,，通过引用将其 并入本文。
总之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽 或其部分的核酸有效连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现。 载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终 止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
表达构建体也可以使用标准的基因递送方案用于核酸免疫和基因治 疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346, 5,580,859,5,589,466,，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案 中，本发明提供了一种基因治疗载体。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中， 包括但不限于质粒，噬菌粒，噬菌体衍生物，动物病毒和粘粒。特别感兴 趣的载体包括表达载体，复制载体，探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在 本领域中是众所周知的，并且描述于例如Sambrook et al.,2012, MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press,NY)和其他病毒学和分子生物学手册。可用作载 体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒和慢 病毒。通常，合适的载体包含在至少一个生物体中起作用的复制起点，启 动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个可选择标志(例如 WO 01/96584；WO 01/29058和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。 例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已 知的技术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以 将重组病毒分离并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒体 系是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载 体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子调节转录起始的频率。通常，它们位 于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已经显示了许多启动子在起始位点 的下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件 相对于彼此倒置或移动时，启动子功能被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中， 在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到50bp。取决于启 动子，似乎单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因，EF-1α，泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a 启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基的表达，其负 责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动 物表达质粒，已被证明能有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR 表达。参见，例如，Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。一 方面，EF1a启动子包含SEQ ID NO:11提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启 动子序列是能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的 强组成型启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但 不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人免 疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病 病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基 因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，延伸因子-1α 启动子，血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用 组成型启动子。也可以考虑诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启 动子的使用提供了分子开关，其能够启动当期望这种表达时有效连接的多 核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例 包括但不限于金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子和四环 素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施方案中， 当与野生型PGK启动子序列比较时，截短的PGK启动子(例如，具有一 个或多个，例如1,25,10,100,200,300或400个核苷酸缺失的PGK启动子)可 能是需要的。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终 止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因))，允许附加型复制和在原核生物 中复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允 许选择的元件(例如，氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标志)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以 含有选择性标记基因或报道基因或两者，以便于从细胞群体中鉴定和选择 试图通过病毒载体转染或感染的表达细胞。在其他方面，选择标记可以携 带在单独的DNA片段上并用于共转染过程。选择性标记和报告基因都可 以侧翼为适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标 记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评估调节序列的功能。报告 基因描述于例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的 第599段中，其全部内容通过引用并入本文。
在实施方案中，载体可以包含编码CAR,例如本文所述的CAR,例如 CD19 CAR和第二种CAR,例如抑制性CAR或特异性结合除了CD19外的 抗原的CAR的两种或更多种核酸序列。在这样的实施方案中，编码CAR 的两种或更多种核酸序列由相同框架中的单个核酸分子和作为单个多肽 链编码。在这方面，两种或更多种CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开。(例如，自切割位点或细胞内蛋白酶的底物)。肽切割位点的实例 包括T2A，P2A，E2A或F2A位点。
将基因引入细胞并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文 中，可以通过本领域任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物， 细菌，酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理，化学或生物手段 转移到宿主细胞中，例如在2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675的段落601-603中描述的那些手段，其通过引用全部并入 本文。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。预期使 用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外，离体或体内)，并描述于例如2015 年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第604-605段，其全部内 容通过引用并入本文。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本发 明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进 行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测 定，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”测定， 例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在，或通过本文所述的测定来鉴定属于本发明范围内的活性剂。
治疗方法
一方面，本公开提供了治疗与本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病的 方法。在一些实施方案中，通过本文所述的方法测定免疫效应细胞，例如 测定一种或多种生物标志，并将细胞作为本文所述治疗的一部分施用于受 试者。例如，免疫效应细胞可以作为本文所述的组合疗法的一部分施用。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表 达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如，血液 癌症，例如ALL和CLL)的方法。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B 细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL(急性淋巴细胞 白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)或MM(多发性骨髓瘤)。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表 达CD19CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如， 血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，其中癌细胞表达CD19。在一个实 施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗 的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)，霍奇金淋巴瘤或 MM(多发性骨髓瘤)。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表 达CD22CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如， 血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，其中癌细胞表达CD22。在一个实 施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗 的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)，霍奇金淋巴瘤或 MM(多发性骨髓瘤)。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表 达CD20CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如， 血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，其中癌细胞表达CD20。在一个实 施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗 的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)，霍奇金淋巴瘤或 MM(多发性骨髓瘤)。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表 达ROR1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如， 血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，其中癌细胞表达ROR1。在一个实 施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗 的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)，霍奇金淋巴瘤或 MM(多发性骨髓瘤)。
本公开内容包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK 细胞)被遗传修饰(例如，通过慢病毒载体的转导)以表达CAR,并且将CAR 表达细胞输注到需要其的受体中。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细 胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞) 能够在体内复制，导致长期持续性，其可导致持续的肿瘤控制。使用慢病 毒载体产生的CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)将具有稳定的CAR 表达。在各个方面，施用于患者或其后代的免疫效应细胞(例如，T细胞， NK细胞)在T细胞施用于患者后在患者中持续至少四个月，五个月，六个 月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月， 十四个月，十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十 个月，二十一个月，二十二个月，二十三个月，二年，三年，四年，或五 年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK 细胞)被修饰，例如通过体外转录的RNA修饰，以瞬时表达CAR,并且将 表达CAR的细胞输注到需要其的受体中。通过CAR RNA转导产生的表 达CAR的细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如通过转染或电穿孔)在转导 后瞬时表达RNA CAR 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天。输注的细胞 能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，施用于患者的免疫效应 细胞(例如，T细胞，NK细胞)在T细胞施用于患者后持续至少一个月，例 如三周，两周，一周。
在一个方面，本公开通过向需要其的受试者提供经工程化以表达 CAR,例如本文描述的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，提 供了治疗癌症(例如，血液癌症，例如ALL和CLL)的方法。
在一个实施方案中，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程 化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如， 血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，所述CAR特异性靶向或结合本文 所述的肿瘤抗原(或癌症相关抗原)，其中所述受试者已被鉴定为应答者或 部分应答者。在其它实施方案中，所述方法通过向受试者提供除CAR疗 法之外的癌症疗法，例如向受试者提供作为该特定类型癌症的护理标准的 治疗，提供治疗作为部分应答者或非应答者的受试者的癌症(例如，血液癌 症如ALL和CLL)的方法。在再一个实施方案中，治疗方法包括对被鉴定 为部分应答者或非应答者的受试者，在施用CAR表达细胞，例如本文所 述的CAR表达细胞之前，改变CAR表达细胞的制造以富集初始T细胞。
在一个实施方案中，将免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)工程化 以表达CD19CAR,用于治疗患有癌症(例如血液癌症，例如ALL和CLL) 的受试者，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是 ALL或CLL。要在免疫效应细胞中表达的CD19 CAR分子可以包含本领 域任何抗CD19抗原结合结构域(例如表12中提供的那些)与本文所述的任何CAR结构域组合以产生完整的CAR构建体。例如，完整的CAR构建 体是表13中列出的CAR。表13提供了使用表12中列出的多种CAR结 构域(例如，跨膜和细胞内信号传导结构域)和表12中列出的抗CD19抗原 结合结构域产生的示例性完整CD19 CAR构建体。命名氨基酸序列(aa)， 并命名核酸序列(nt)。
表13.CD19 CAR构建体
Figure BDA0003147962450001641
Figure BDA0003147962450001651
Figure BDA0003147962450001661
Figure BDA0003147962450001671
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Figure BDA0003147962450001691
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Figure BDA0003147962450001711
Figure BDA0003147962450001721
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Figure BDA0003147962450001771
Figure BDA0003147962450001781
Figure BDA0003147962450001791
CD19相关疾病和/或病症
一方面，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗 法来治疗癌症例如与CD19表达相关的癌症的方法。示例性的癌症包括但 不限于例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴 细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋 巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓 性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的额 外癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞早幼粒细胞白血病，母细胞性 浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋 巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症， MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨 髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆 母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤，瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症和 “白血病前期”，其是通过骨髓血细胞的无效生产(或发育不良)联合起来的 血液病症的多样化集合等。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于 例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或 增殖性疾病。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗CLL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗ALL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗B细胞ALL的方法。
一方面，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例 如，如本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)，例如 CTL019)治疗具有癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的应答者(例如， 完全应答者和部分应答者)的方法。在一个实施方案中，本公开提供了用 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)与另一种治疗剂(例如，本文所描 述的另一种治疗剂,例如，另一种CAR,例如本文所述的另一种CAR,例如 抑制性CAR,例如本文所述的抑制性CAR,激酶抑制剂(例如，本文所述的 激酶抑制剂，例如mTOR抑制剂，BTK抑制剂)，检查点抑制剂，例如本 文所述的检查点抑制剂，护理标准疗法等)组合治疗应答者(例如，完全应 答者和部分应答者)的方法。所述组合可以是与例如本文所述的任何活性 剂。在一个实施方案中，在CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗(例 如，初始的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗)后，部分应答者 通过任一种本文描述的方法，例如CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)基因集特征测试，并且如果状态没有改变和/或降级到例如非应答者，那么对受试者施用替代疗法，例如特定癌症的护理标准。
一方面，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例 如如本文所述CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CTL019) 治疗具有癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的非应答者的方法。在一 个实施方案中，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞) 与另一种治疗剂(例如本文所述的另一种治疗剂，例如，另一种CAR,例如，本文所述的另一种CAR,例如抑制性CAR,例如本文所述的抑制性CAR,激 酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂，例如mTOR抑制剂，BTK抑制 剂)，检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂，护理标准疗法等)组 合治疗非应答者的方法。所述组合可以是例如任何本文所述的活性剂。在 一个实施方案中，在CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗(例如， 初始的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗)之后，通过以下任何 一种本文描述的方法，例如CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞) 基因集特征测试非应答者，并且如果状态已经改变和/或被升级到例如部分 应答者，例如，完全应答者，那么对受试者施用本文所述的替代疗法。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症(例如，血液癌症，例如 ALL或CLL)的方法，其包括以下步骤:(1)鉴定部分应答者受试者和/或非 应答者受试者，(2)对部分应答者受试者和/或非应答者受试者例如以本文 所述的剂量和/或给药方案施用本文所述的mTOR抑制剂，例如RAD001 和雷帕霉素；和(3)例如在施用mTOR抑制剂之后，施用CAR(例如，本文 所述的CD19 CAR,例如CTL019)，从而治疗癌症。在一个实施方案中，所 述方法还包括将mTOR抑制剂和/或CAR与本文所述的一种或多种检查点 抑制剂，例如PD1抑制剂组合施用。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症(例如，血液癌症，例如 ALL或CLL)的方法，其包括以下步骤:(1)鉴定部分应答者受试者(例如患 者)和/或非应答者受试者(例如，患者)，(2)通过选择较少消耗和/或更初始 的T细胞群体来富集部分应答者受试者和/或非应答者受试者的T细胞群 体，(3)引入(例如通过转化，转导，感染，电穿孔等)CAR(例如，本文所述 的CD19 CAR,例如CTL019)到所述富集的T细胞群体中，从而转化受试 者的T细胞群体；和(4)将表达CAR的T细胞群体施用于部分应答者和/ 或非应答者受试者，从而治疗癌症。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症(例如，血液癌症，例如 ALL或CLL)的方法，其包括以下步骤:(1)鉴定部分应答者受试者(例如患 者)和/或非应答者受试者(例如，患者)，(2)在较晚的时间段对初始T细胞 和/或较少耗尽的表型重新评估部分应答者受试者和/或非应答者受试者(例 如，患者)，和(3)例如，如果受试者具有初始T细胞的增加和/或较少耗尽 的表型，那么施用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，如 本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CTL019)， 从而治疗癌症。在一个实施方案中，较晚的时间段包括至少1小时，至少 2小时，至少3小时，至少4小时，至少5小时，至少6小时，至少7小 时，至少8小时，至少9小时，至少10小时，至少11小时，至少12小 时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至 少1周，至少2周，至少3周，至少1个月，至少2个月，至少3个月， 至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少 9个月，至少10个月，至少11个月，至少1年，至少2年，至少3年， 至少4年，至少5年，至少6年，至少7年，至少8年，至少9年，至少 10年，或11年或以上。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症(例如，血液癌症例如ALL 或CLL)的方法，其包括以下步骤:(1)鉴定部分应答者和/或非应答者；和(2) 用替代疗法，例如针对特定癌症的护理标准(例如，ALL或CLL的护理标 准)治疗。在一个实施方案中，在没有用CAR治疗的情况下，部分应答者 仅被护理标准(例如，血液癌症如ALL或CLL的护理标准)治疗。在一个 实施方案中，在不用CAR治疗的情况下，非应答者仅用护理标准(例如， 血液癌症例如ALL或CLL的护理标准)治疗。
在一个实施方案中，CLL的护理标准包括但不限于本文所述的示例性 疗法，例如表A中所述，以及其组合。
表A:CLL的示例性疗法
Figure BDA0003147962450001831
Figure BDA0003147962450001841
在一个实施方案中，CLL的护理标准包括(1)放射疗法，(2)化学疗法， (3)手术(例如，去除脾脏)，(4)靶向疗法，(5)干细胞移植及其组合。在一个 实施方案中，护理标准包括外部放射疗法。在一个实施方案中，护理标准 包括内部放射疗法(例如，密封在例如直接放置在癌症中或癌症附近的针 头,导线或导管中的放射性物质)。
在一个实施方案中，ALL的护理标准包括但不限于本文所述的示例性 疗法，例如表B所述，以及其组合。
表B:ALL的示例性疗法
Figure BDA0003147962450001842
Figure BDA0003147962450001851
在一个实施方案中，ALL的护理标准包括(1)化疗，(2)放疗，(3)干细 胞移植，(4)生物治疗，(5)靶向治疗及其组合。
在一个实施方案中，护理标准包括但不限于氟达拉滨与环磷酰胺(FC)； 氟达拉滨与利妥昔单抗(FR)；氟达拉滨，环磷酰胺和利妥昔单抗(FCR)；环 磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松(CHOP)；及其组合。考虑使用的一 般化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0003147962450001852
比卡鲁胺 (bicalutamide)
Figure BDA0003147962450001853
硫酸博来霉素盐(bleomycin sulfate)
Figure BDA0003147962450001854
白消安(busulfan)
Figure BDA0003147962450001855
白消安注射剂
Figure BDA0003147962450001856
卡培他滨
Figure BDA0003147962450001857
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂
Figure BDA0003147962450001861
卡莫司汀
Figure BDA0003147962450001862
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003147962450001863
顺铂
Figure BDA0003147962450001864
克拉屈滨
Figure BDA0003147962450001865
环磷酰胺(
Figure BDA0003147962450001866
或
Figure BDA0003147962450001867
)、 阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷
Figure BDA0003147962450001868
阿糖胞苷脂质体注射剂
Figure BDA0003147962450001869
达卡巴嗪
Figure BDA00031479624500018610
更生霉素(Actinomycin D, Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐
Figure BDA00031479624500018611
柔红霉素柠檬酸盐脂质体注 射剂
Figure BDA00031479624500018612
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00031479624500018613
多柔比星盐酸盐
Figure BDA00031479624500018614
依托泊苷
Figure BDA00031479624500018615
氟达拉滨磷酸盐
Figure BDA00031479624500018616
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00031479624500018617
氟他胺
Figure BDA00031479624500018618
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧啶核苷(difluorodeoxycitidine))、羟基 脲
Figure BDA00031479624500018619
伊达比星
Figure BDA00031479624500018620
异环磷酰胺
Figure BDA00031479624500018621
依立替康
Figure BDA00031479624500018622
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00031479624500018623
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00031479624500018624
6-巯基嘌呤
Figure BDA00031479624500018625
甲氨蝶呤
Figure BDA00031479624500018626
米托蒽醌
Figure BDA00031479624500018627
麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00031479624500018628
phoenix (Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀 植入物
Figure BDA00031479624500018629
枸橼酸它莫西芬
Figure BDA00031479624500018630
替尼泊苷
Figure BDA00031479624500018631
6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)
Figure BDA00031479624500018632
用于注射的托泊替康盐酸盐
Figure BDA00031479624500018633
长春碱
Figure BDA00031479624500018634
长春新 碱
Figure BDA00031479624500018635
长春瑞滨
Figure BDA00031479624500018636
和其组合。
在一个实施方案中，化学疗法包括抗代谢物，包括但不限于叶酸拮抗 剂(本文中也称为抗叶酸剂)，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制 剂):甲氨蝶呤
Figure BDA00031479624500018637
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00031479624500018638
Figure BDA00031479624500018639
氟尿苷
Figure BDA00031479624500018640
阿糖胞苷(
Figure BDA00031479624500018641
Tarabine PFS)， 6-巯嘌呤
Figure BDA00031479624500018642
6-硫鸟嘌呤(Thioguanine
Figure BDA00031479624500018643
)，磷酸氟达 拉滨
Figure BDA00031479624500018644
喷司他丁
Figure BDA00031479624500018645
培美曲塞
Figure BDA00031479624500018646
雷替曲塞
Figure BDA00031479624500018647
克拉屈滨
Figure BDA00031479624500018648
氯法拉滨
Figure BDA00031479624500018649
阿 糖胞苷脂质体(也称为Liposomal Ara-C,DepoCytTM)；地西他滨
Figure BDA00031479624500018650
羟基脲(
Figure BDA00031479624500018651
DroxiaTM和MylocelTM)；巯嘌呤
Figure BDA00031479624500018652
普拉曲坦(FolotynTM)，卡培他滨
Figure BDA00031479624500018653
奈拉滨
Figure BDA0003147962450001871
阿扎胞苷
Figure BDA0003147962450001872
和吉西他滨
Figure BDA0003147962450001873
合适的抗代谢物 包括，例如5-氟尿嘧啶
Figure BDA0003147962450001874
氟尿苷
Figure BDA0003147962450001875
卡培他滨
Figure BDA0003147962450001876
培美曲塞
Figure BDA0003147962450001877
雷替曲塞
Figure BDA0003147962450001878
和吉西他滨
Figure BDA0003147962450001879
及其组合。在一个实施方案中，嘌呤类似物是氟达 拉滨。
在一个实施方案中，化疗包括烷化剂，包括但不限于氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)∶尿嘧啶 氮芥(Aminouracil
Figure BDA00031479624500018710
Figure BDA00031479624500018711
Uracil nitrogen
Figure BDA00031479624500018712
)、氮 芥(chlormethine)
Figure BDA00031479624500018713
Figure BDA00031479624500018714
Figure BDA00031479624500018715
Figure BDA00031479624500018716
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00031479624500018717
美法仑
Figure BDA00031479624500018718
苯丁酸氮芥
Figure BDA00031479624500018719
哌泊溴烷(pipobroman)
Figure BDA00031479624500018720
Figure BDA00031479624500018721
三乙撑三聚氰胺(triethylenemelamine)
Figure BDA00031479624500018722
Figure BDA00031479624500018723
三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure BDA00031479624500018724
塞替派
Figure BDA00031479624500018725
白消安
Figure BDA00031479624500018726
卡莫司 汀
Figure BDA00031479624500018727
洛莫司汀
Figure BDA00031479624500018728
链佐星(streptozocin)
Figure BDA00031479624500018729
和达 卡巴嗪
Figure BDA00031479624500018730
和其组合。另外的示例性的烷化剂包括，不限于奥 沙利铂
Figure BDA00031479624500018731
替莫唑胺(
Figure BDA00031479624500018732
和
Figure BDA00031479624500018733
)；更生霉素(也称 为放线菌素-D，
Figure BDA00031479624500018734
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯基 丙氨酸氮芥，
Figure BDA00031479624500018735
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure BDA00031479624500018736
)； 卡莫司汀
Figure BDA00031479624500018737
苯达莫司汀(Bendamustine)
Figure BDA00031479624500018738
白消安 (
Figure BDA00031479624500018739
和
Figure BDA00031479624500018740
)；卡铂
Figure BDA00031479624500018741
洛莫司汀(也称为CCNU,
Figure BDA00031479624500018742
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure BDA00031479624500018743
和
Figure BDA00031479624500018744
-AQ)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00031479624500018745
环磷酰胺(
Figure BDA00031479624500018746
and
Figure BDA00031479624500018747
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、 DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00031479624500018748
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure BDA00031479624500018749
)；异环磷酰胺
Figure BDA00031479624500018750
Prednumustine；丙卡巴肼
Figure BDA00031479624500018751
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和 甲氯乙胺(mechloroethamine)盐酸盐、
Figure BDA0003147962450001881
)；链佐星
Figure BDA0003147962450001882
塞替派(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA,
Figure BDA0003147962450001883
)；环磷酰胺
Figure BDA0003147962450001884
Figure BDA0003147962450001885
和苯达莫司汀HCl
Figure BDA0003147962450001886
和其组合。在一个实施方 案中，烷化剂是苯达莫司汀。在一个实施方案中，烷化剂是环磷酰胺。
在一个实施方案中，化学治疗剂是激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制 剂，包括但不限于盐酸埃罗替尼
Figure BDA0003147962450001887
N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯 基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(也称为ABT 869，可从Genentech得到)；苹果 酸舒尼替尼
Figure BDA0003147962450001888
波舒替尼(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧 基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，也称为SKI-606，并在美国专 利号6,780,996中描述)；达沙替尼
Figure BDA0003147962450001889
帕唑帕尼
Figure BDA00031479624500018810
索拉非 尼
Figure BDA00031479624500018811
zactima(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA00031479624500018812
和
Figure BDA00031479624500018813
)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib(PCI-32765)； GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059； CNX-774；和LFM-A113的BTK抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂 是选自以下的CDK4抑制剂:aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2- 氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-chromenone； crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1- 甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃–4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基 -5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯 基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；吲地磺胺(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure BDA00031479624500018814
唑-2- 基)甲基]硫基]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟 苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂
Figure BDA00031479624500018815
-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)； 5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲 胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰 胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯 基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。在一个实施方案中，激 酶抑制剂是选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶 (CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)- 吡唑并[3,4-d]嘧啶的MNK抑制剂。
在一个实施方案中，靶向疗法包括但不限于抗CD20抗体或其功能性 片段，例如利妥昔单抗(
Figure BDA0003147962450001891
和
Figure BDA0003147962450001892
)；托西莫单抗
Figure BDA0003147962450001893
和ofatumumab
Figure BDA0003147962450001894
及其组合。在一个实施方案中，靶向疗法包括 但不限于抗CD52抗体或其功能性片段，例如阿仑珠单抗
Figure BDA0003147962450001895
在一个实施方案中，生物疗法包括免疫疗法。示例性的蒽环类药物包 括但不限于多柔比星(
Figure BDA0003147962450001896
和
Figure BDA0003147962450001897
)；博来霉素
Figure BDA0003147962450001898
柔红霉素(盐酸多柔比星，道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA0003147962450001899
)；柔红 霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体，
Figure BDA00031479624500018910
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00031479624500018911
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure BDA00031479624500018912
Idamycin
Figure BDA00031479624500018913
)；丝裂霉素C
Figure BDA00031479624500018914
格尔德霉素；除莠霉素；ravidomycin；去 乙酰拉维霉素(desacetylravidomycin)及其组合。
在一个实施方案中，干细胞移植包括自体干细胞移植。在一个实施方 案中，干细胞移植包括同种异体干细胞移植。在一个实施方案中，干细胞 移植包括同种异体骨髓移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括造血干 细胞移植(HSCT)。在一个实施方案中，造血干细胞衍生自各种组织，包括 但不限于骨髓，外周血，脐带血及其组合。
在一个实施方案中，所提供的方法包括确定受试者是否被鉴定为在表 1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15和表16中列 出的一种或多种标志或PD-1生物标志，LAG-3生物标志，TIM-3生物标 志，CD57生物标志，CD27生物标志，CD122生物标志，CD62L生物标 志和KLRG1生物标志的表达水平相对于参考水平具有统计学显著差异， 并对受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞，例如T细胞或NK细胞。 在一个实施方案中，CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)是本文所述 的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CTL019。
一方面，本公开提供了治疗与CD19表达相关的疾病的方法。一方面， 本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对于CD19是阴性的，并且 部分肿瘤对于CD19是阳性的。例如，所提供的方法可用于治疗已经经历 与CD19升高的表达相关的疾病治疗的受试者，其中经历了升高水平的 CD19的治疗的受试者表现出与升高水平的CD19相关的疾病。
在一个方面，提供的方法包括含有有效连接到启动子以在哺乳动物细 胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达的CD19 CAR的载体。一方面，所提 供的方法包括表达CD19 CAR的重组细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于 治疗CD19表达肿瘤的方法，其中表达CD19 CAR的重组T细胞称为CD19 CAR表达细胞。在一个方面，根据提供的方法施用的CD19 CAR表达细 胞(例如，T细胞，NK细胞)能够使肿瘤细胞与其表面上表达的至少一种 CD19 CAR接触，使得CAR表达细胞靶向肿瘤细胞并且肿瘤的生长被抑 制。
一方面，本公开的特征在于抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法， 其包括使肿瘤细胞与本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK 细胞)接触，使得表达CAR细胞响应于抗原而被激活并靶向癌细胞，其中 肿瘤的生长被抑制。
一方面，本公开内容包括一种细胞疗法，其中T细胞被遗传修饰以表 达CAR,并且将CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)输注到需要其的 受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修 饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，导致长期持续性， 其可导致持续的肿瘤控制。在各方面，在将细胞施用于患者后，施用于患者的细胞或其后代在患者中持续至少四个月，五个月，六个月，七个月， 八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月，十四个月， 十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十个月，二十 一个月，二十二个月，二十三个月，两年，三年，四年，或五年。。
本公开还包括一种细胞疗法，其中细胞(例如，T细胞，NK细胞)被修 饰(例如通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)被输注到需要其的受体。输注的细胞 能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在向患者施用细胞(例如， T细胞，NK细胞)之后，施用于患者的细胞存在少于一个月，例如三周，两周，一周。
不希望受任何特定理论的约束，由CAR修饰的细胞(例如，T细胞， NK细胞)引起的抗肿瘤免疫应答可能是主动或被动免疫应答，或者可能是 由于直接对间接免疫应答。一方面，CAR转导的T细胞应答表达CD19 的人类癌细胞而表现出特异性促炎细胞因子分泌和有效的溶细胞活性，抵 抗可溶性CD19抑制，介导旁观者杀死并介导已建立的人肿瘤的消退。例 如，CD19表达肿瘤的异质区域内的少抗原肿瘤细胞可能会对CD19重定 向的T细胞的间接破坏敏感，所述CD19重定向的T细胞先前已经针对相 邻的抗原阳性癌细胞反应。
一方面，本文所述的完全人CAR修饰的细胞(例如，T细胞，NK细 胞)可以是用于哺乳动物中离体免疫和/或体内疗法的一种疫苗。一方面， 哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于受试者之前，以下至少一种在体外发 生:i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是众所周知的，并且在下面更全面地讨论。简而 言之，用表达本文公开的CAR的载体从受试者(例如人)分离细胞并进行遗 传修饰(即，在体外转导或转染)。CAR修饰的细胞可以施用于哺乳动物受 体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以 相对于受体是自体的。或者，相对于受体，细胞可以是同种异体的，同基 因的或异种的。
血液癌症
血液癌症状况是影响血液，骨髓和淋巴系统的癌症类型，如白血病和 恶性淋巴组织增生症。
白血病可分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分为急 性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢 性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括 骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，这是通过骨髓细胞 无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合起来的血液病症的多样 化集合。
淋巴瘤是从淋巴细胞发育的一组血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍 奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
本公开提供了治疗癌症的组合物和方法。一方面，癌症是血液癌症， 包括但不限于白血病或淋巴瘤。一方面，本发明的CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)可用于治疗癌症和恶性肿瘤，例如但不限于例如急性白 血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞 急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种 慢性白血病，包括但不限于慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血 病(CLL)；额外的血液癌症或血液病症，包括但不限于例如B细胞早幼粒细 胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B 细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞-滤泡淋巴瘤， 恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴 瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴 瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤，瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是通过骨髓细胞无效产生(或发育 异常)等联合起来的血液病症的多样化集合。与CD19表达相关的其他疾病 包括但不限于例如表达CD19的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前 病症或增殖性疾病。
本公开还提供了抑制增殖或减少表达CD19的细胞群体的方法，所述 方法包括使包含表达CD19的细胞的细胞群与本文所描述的结合CD19表 达细胞的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)接触。在具体方面， 本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞的群体增殖或减少所述群体的方 法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与结合CD19表达细胞的本 文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)接触。一方面， 本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞群体的增殖或减少该群体的方法， 所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与本文所述的CD19 CAR表达细 胞(例如，T细胞，NK细胞)接触，所述CD19 CAR表达细胞结合CD19 表达细胞。在某些方面，相对于阴性对照，抗CD19 CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)将在有骨髓性白血病或与CD19表达细胞相关的另一种 癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量，数目，量或百分比减 少至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％， 至少85％，至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本公开还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾 病(例如，表达CD19的血液癌症或非典型癌症)的方法，所述方法包括向 需要的受试者施用本文所述的CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)， 其结合CD19表达细胞。在一个方面，受试者是人。与CD19表达细胞相 关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(例如狼疮)，炎症性病症(例 如变态反应和哮喘)和癌症(例如表达CD19的血液癌症或非典型癌症)。
本公开还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾 病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本文所述的CD19 CAR表达 细胞(例如T细胞，NK细胞)，其结合CD19表达细胞。在一个方面，受 试者是人。
本公开提供了用于预防与CD19表达细胞相关的癌症(例如，血液癌症 例如ALL和CLL)复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用本文 所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，其结合CD19表 达细胞。在一个方面，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的与表 达CD19的细胞结合的本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK 细胞)与有效量的另一种疗法的组合。
组合疗法
应当理解，如上文和本文所述的任何癌症疗法可以与一种或多种另外 的疗法组合施用以治疗和/或减轻本文所述的癌症的症状。药物组合物可以 与一种或多种其它疗法或治疗剂同时施用，在其他疗法之前或之后施用。 在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞可以与其它已知的活性剂 和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有病症的过程 中将两种(或更多种)不同的治疗递送给受试者，例如，在受试者被诊断所述病症之后和在病症已经治愈或消除或者由于其他原因治疗已经停止之 前，递送两种或多种治疗。在一些实施方案中，当第二种治疗递送开始时， 一种治疗的递送仍然发生，从而在给药方面存在重叠。这在本文中有时被 称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种 治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用， 治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，用较少的第二种治疗看到 等同效果，或者与没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗所看到的或者 用第一种治疗所看到的类似情况相比，第二种治疗可以更大程度地减轻症 状。在一些实施方案中，递送使得症状或与该病症相关的其他参数的减少 大于在不存在另一种的情况下递送的一种治疗所观察到的减少。两种治疗 的效果可以是部分相加的，全部相加的或大于相加的。递送可以使得当递 送第二种治疗时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
本文所述的CAR表达细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时或在相 同或分开的组合物中或顺序施用。为了顺序施用，可以首先施用本文所述 的CAR表达细胞，并且可以其次施用另外的活性剂，或者可以颠倒施用 顺序。
CAR疗法和/或其它治疗剂，程序或方式可以在活跃病症期间或在缓 解期或不太活跃的疾病期间施用。CAR疗法可以在其他治疗之前，与治疗 同时，治疗后或病症的缓解期间施用。
当组合施用时，可以以比单独使用的每种活性剂(例如，作为单一疗法) 的量或剂量更高，更低或相同的量或剂量来施用CAR疗法和另外的活性 剂(例如第二或第三活性剂)或全部。在某些实施方案中，CAR疗法，额外 的活性剂(例如，第二或第三活性剂)或全部的施用量或剂量低于(例如，至 少20％，至少30％，至少40％或至少50％)单独使用的每种活性剂(例如 作为单一疗法)的量或剂量。在其它实施方案中，导致希望的效果(例如癌 症治疗)的CAR疗法，额外活性剂(例如第二或第三活性剂)或全部的量或 剂量低于(例如，低至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％)实现 相同治疗效果所需的单独使用的每种活性剂(例如作为单一疗法)的量或剂 量。
在另外的方面，本文所述的CAR表达细胞可以与手术，化学疗法， 放射，免疫抑制剂如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506， 抗体或其它免疫烧蚀剂如CAMPATH，抗CD3抗体或其他抗体疗法，细 胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇， FR901228，细胞因子和放射肽疫苗组合用于治疗方案，如Izumoto et al.2008J NEUROSURG 108:963-971所述。
在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞可以与化学治疗剂组 合使用。示例性化学治疗剂包括在2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675(其全部内容通过引用并入本文)的第873-874段所述的那 些以及它们的组合。
示例性的烷化剂包括但不限于2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675(其全部内容通过引用并入本文)的第875段所述的那些以 及它们的组合。
示例性的mTOR抑制剂包括但不限于RAD001，坦罗莫司；雷达罗莫 司(ridaforolimus)(正式称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二 羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36- 二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2- 甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，且描述在 PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(
Figure BDA0003147962450001951
或RAD001)；雷帕 霉素(AY22989,
Figure BDA0003147962450001952
)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus， (5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基) 甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基 -3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2- 基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝 氨酸-(SEQ ID NO:91)，内盐(SF1126,CAS936487-67-1)，XL765及其组合。
示例性免疫调节剂包括但不限于2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675(其通过引用整体并入本文)的第882段所述的那些以及它 们的组合。
示例性的蒽环类药物包括但不限于2015年3月13日提交的国际申请 WO2015/142675(其通过引用整体并入本文)的第883段所述的那些以及它 们的组合。
示例性长春花生物碱类包括但不限于2015年3月13日提交的国际申 请WO2015/142675(其通过引用整体并入本文)的第884段所述的那些以及 它们的组合。
示例性的蛋白酶体抑制剂包括但不限于2015年3月13日提交的国际 申请WO2015/142675(其通过引用整体并入本文)的第884段所述的那些以 及它们的组合。
在一些实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与溶瘤病毒组合施用。 在实施方案中，溶瘤病毒能够选择性地复制并触发癌细胞的死亡或减缓癌 细胞的生长。在某些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有影响或影响最小。 溶瘤病毒包括但不限于溶瘤性腺病毒，溶瘤性单纯疱疹病毒，溶瘤性逆转 录病毒，溶瘤性细小病毒，溶瘤性痘苗病毒，溶瘤性辛比斯病毒，溶瘤性 流感病毒或溶瘤性RNA病毒(例如，溶瘤性呼肠孤病毒，溶瘤性新城疫病 毒(NDV)，溶瘤性麻疹病毒或溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV))。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与减少Treg细胞群 的分子组合施用于受试者。减少Treg细胞的数量(例如，耗尽)的方法在本 领域中是已知的，并且包括，例如，CD25耗尽，环磷酰胺给药，调节GITR 功能。不希望受理论的束缚，但相信在单采血液成分术成分术前或施用所 述的CAR表达细胞前，降低受试者中Treg细胞的数目减少了肿瘤微环境 中不希望的免疫细胞(例如，Treg细胞)的数目并降低了受试者复发的风险。
在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与靶向GITR和/或调 节GITR功能，诸如GITR激动剂和/或耗尽调节性T细胞(Tregs)的GITR 抗体的分子组合施用于受试者。在实施方案中，表达本文所述的CAR细 胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一个实施方案中，GITR结合分子和/ 或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或Treg耗尽GITR抗体) 在施用CAR表达细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂 可以在细胞的单采血液成分术成分术之前施用。在实施方案中，在施用(例 如，输注或重新输注)CAR表达细胞之前或细胞的单采血液成分术成分术 之前，将环磷酰胺施用于受试者。在实施方案中，在施用(例如，输注或重 新输注)CAR表达细胞之前或细胞的单采血液成分术成分术之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用给受试者。在一个实施方案中，受试者患有癌症 (例如，实体癌或血液癌症如ALL或CLL)。在一个实施方案中，受试者 患有CLL。在实施方案中，受试者患有ALL。在实施方案中，受试者患 有实体癌，例如，本文所述的实体癌。示例性的GITR激动剂包括但不限 于GITR融合蛋白和抗-GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，比如例如 美国专利号∶6,111,090、欧洲专利号:090505B1、美国专利号:8,586,023、 PCT公开号∶WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白， 或例如在美国专利号∶7,025,962、欧洲专利号∶1947183B1、美国专利 号:7,812,135、美国专利号:8,388,967、美国专利号:8,591,886、欧洲专利 号:EP 1866339、PCT公开号:WO 2011/028683、PCT公开号:WO 2013/039954、PCT公开号:WO2005/007190、PCT公开号:WO 2007/133822、 PCT公开号:WO2005/055808、PCT公开号:WO 99/40196、PCT公开号:WO 2001/03720、PCT公开号:WO99/20758、PCT公开号:WO2006/083289、 PCT公开号:WO 2005/115451、美国专利号∶7,618,632和PCT公开号:WO 2011/051726中所述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞，例如CD19 CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如CTL019)与GITR激动剂，例如 本文所述的GITR激动剂组合施用于受试者，例如被鉴定为部分应答者或 非应答者的受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用GITR 激动剂。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液 成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液癌症例 如ALL和CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案 中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞，例如CD19 CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如CTL019)与mTOR抑制剂(例如 本文所述的mTOR抑制剂)，例如雷帕霉素信号传导途径的靶标，例如 RAD001组合施用于受试者，例如被鉴定为部分应答者或非应答者的受试 者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用mTOR抑制剂。例如， 在一个实施方案中，mTOR抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施 用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液癌症例如ALL和 CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案中，受试 者患有CLL。
激酶抑制剂
在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞可以与激酶抑制剂例 如CDK4抑制剂，BTK抑制剂，MNK抑制剂，mTOR抑制剂，ITK抑 制剂等组合用于治疗方案中。在一个实施方案，受试者是完全应答者，并 且对受试者施用治疗方案，其包括将本文所述的CAR表达细胞与激酶抑 制剂(例如本文所述的激酶抑制剂)组合施用，例如以本文所述的剂量或给 药方案施用。在一个实施方案中，受试者是部分应答者或非应答者，并且 对受试者施用治疗方案，其包括将本文所述的CAR表达细胞与激酶抑制 剂(例如本文所述的激酶抑制剂)组合施用，例如，以本文所述的剂量或给 药方案施用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的 CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，比如例如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基 -2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为 palbociclib或PD0332991)。在一种实施方式中，激酶抑制剂为BTK抑制 剂，例如本文所述BTK抑制剂，比如例如ibrutinib。在一种实施方式中， 激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如本文所述mTOR抑制剂，比如例如雷 帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以为例如mTORC1 抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述mTORC1抑制剂和/或 mTORC2抑制剂。在一种实施方式中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，例如 本文所述MNK抑制剂，比如例如4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧 啶。MNK抑制剂可以为例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b 抑制剂。.
在一种实施方式中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，选自阿洛新 A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羟 基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基4-哌啶基]-4-色酮(chromenone)；
crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟基甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基 -5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯 基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)； palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure BDA0003147962450001991
唑-2- 基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二 氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂
Figure BDA0003147962450001992
-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)； 5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲 胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰 胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基) 苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如palbociclib (PD0332991)，并且palbociclib以每日约50mg、60mg、70mg、75mg、 80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、 130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量施用一段时间， 例如28天周期的第14-21天每日施用，或21天周期的第7-12天每日施用。 在一种实施方式中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或 更多个周期的palbociclib。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib(PCI-32765)； GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059； CNX-774；和LFM-A13的BTK抑制剂。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如ibrutinib (PCI-32765),ibrutinib以每天约250mg，300mg，350mg，400mg，420mg， 440mg，460mg，480mg，500mg，520mg，540mg，560mg，580mg，600mg(例 如，250mg，420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日 施用，或例如28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期的ibrutinib。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，选自坦罗莫司；雷 达罗莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23, 29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三 十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也 称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)； simapimod(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲 氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6- 甲氧基3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和 N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲 氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸，内盐 (SF1126)；和XL765。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并 且雷帕霉素每日以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg (例如6mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或28天周期 每日施用。在一个实施方案中，施用了1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或 更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂， 例如依维莫司，并且依维莫司以每天约2mg,2.5mg,3mg,4mg,5mg,6 mg,7mg,8mg,9mg,10mg,11mg,12mg,13mg,14mg,15mg(例如 10mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期每日施用。在一个实施方案中， 施用依维莫司,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多个周期。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，选自CGP052088； 4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)； cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d] 嘧啶。
在本文的方法，用途和组合物的一些实施方案中，BTK抑制剂是国际 申请WO/2015/079417中描述的BTK抑制剂，其全部内容通过引用并入本 文。例如，在一些实施方案中，BTK抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可 接受的盐；
Figure BDA0003147962450002011
其中，
R1是氢，任选被羟基取代的C1-C6烷基；
R2是氢或卤素；
R3是氢或卤素；
R4是氢；
R5是氢或卤素；
或R4和R5彼此连接并代表键， -CH2-,-CH2-CH2-,-CH＝CH-,-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或 -CH2-CH2-CH2-；
R6和R7彼此独立地表示H，任选被羟基取代的C1-C6烷基，任选被 卤素或羟基取代的C3-C6环烷基或卤素；
R8,R9,R,R’,R10和R11彼此独立地代表H或任选被C1-C6烷氧基 取代的C1-C6烷基；或R8,R9,R,R’,R10和R11中的任何两个与它们所 结合的碳原子一起可以形成3-6元饱和碳环；
R12是氢或任选被卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；
或R12和R8,R9,R,R’,R10或R11中的任何一个与它们所结合的原 子一起可以形成4,5,6或7元的氮杂环，该环可以任选地被卤素，氰基，羟 基，C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；
n为0或1；和
R13是任选被C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基氨基 取代的C2-C6烯基；任选被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔 基；或任选被C1-C6烷基取代的C2-C6环氧烷基(alkenyl oxide)。
低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂
本文描述的方法可以使用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变 构mTOR抑制剂，包括诸如RAD001的rapalog。施用低的免疫增强剂量 的mTOR抑制剂(例如，不足以完全抑制免疫系统但足以改善免疫功能的 剂量)可以优化受试者中免疫效应细胞(例如T细胞或CAR表达细胞)的性 能。用于测量mTOR抑制，剂量，治疗方案和合适的药物组合物的方法描 述于2014年11月13日提交的美国专利申请号2005/0140036中，其通过 引用并入本文。
在一个实施方案中，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂可导致以 下一种或多种:
i)PD-1阳性免疫效应细胞数量的减少；
ii)PD-1阴性免疫效应细胞数量的增加；
iii)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比例的增加；
iv)初始T细胞数量的增加；
v)例如在记忆T细胞，例如记忆T细胞前体上一种或多种以下标志的 表达的增加:CD62Lhigh,CD127high,CD27+,和BCL2；
vi)例如在记忆T细胞，例如记忆T细胞前体上KLRG1的表达的降低； 或
vii)记忆T细胞前体，例如具有以下特征的任何一种或组合的细胞的 数量的增加:增加的CD62Lhigh，增加的CD127high，增加的CD27+，减少 的KLRG1和增加的BCL2；
并且其中例如与未治疗的受试者相比，前述例如，i)，ii)，iii)，iv)， v)，vi)或vii)任何一种例如至少短暂地发生。
在另一个实施方案中，例如与未处理的CAR表达细胞或未经治疗的 受试者相比，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致例如在培养物或 受试者中CAR表达细胞的增加或延长的增殖。在实施方案中，增加的增 殖与CAR表达细胞数量的增加相关。在另一个实施方案中，例如与未处 理的CAR表达细胞或未经治疗的受试者相比，施用低的免疫增强剂量的 mTOR抑制剂导致例如在培养物或受试者中CAR表达细胞对癌细胞增加 的杀伤。在实施方案中，癌细胞的增加的杀伤与肿瘤体积的减少有关。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细 胞与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如 RAD001或催化mTOR抑制剂)组合施用。例如，施用低的免疫增强剂量 的mTOR抑制剂可以在施用本文所述的CAR表达细胞之前开始，在施用 本文所述的CAR表达细胞之前完成；在施用本文所述的CAR表达细胞的 同时启动；与本文所述的CAR表达细胞的施用重叠；或在施用本文所述 的CAR表达细胞后继续。
或者或另外，施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂可以优化待工程 化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞。在这样的实施方案中， 在从受试者收获被工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞例 如T细胞或NK细胞之前，开始或完成施用低的免疫增强剂量的mTOR 抑制剂，例如变构抑制剂，例如RAD001或催化抑制剂。
在另一个实施方案中，例如，在施用于受试者之前，可以在低的免疫 增强剂量的mTOR抑制剂的存在下培养待工程化以表达本文所述的CAR 分子的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞(例如在从受试者收获之后)， 或表达CAR的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一个实施方案中，向所述受试者施用低的免疫增强剂量的mTOR 抑制剂包括例如每周一次，例如以即时释放剂型施用0.1至20,0.5至10,2.5 至7.5,3至6或约5mg的RAD001或其生物等同剂量。在一个实施方案中， 对受试者施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂包括例如每周一次，例如 以持续释放剂型施用0.3至60,1.5至30,7.5至22.5,9至18或约15mg的 RAD001或其生物等同剂量。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与以下相关或提供以下:至 少5但不超过90％，至少10但不超过90％，至少15但不超过90％，至 少20但不超过90％，至少30但不超过90％，至少40但不超过90％，至 少50但不超过90％，至少60但不超过90％，至少70但不超过90％，至 少5但不超过80％，至少10但不超过80％，至少15但不超过80％，至 少20但不超过80，至少30但不超过80％，至少40但不超过80％，至少 50但不超过80％，至少60但不超过80％，至少5但不超过70％，至少 10但不超过70％，至少15但不超过70％，至少20但不超过70％，至少 30但不超过70％，至少40但不超过70％，至少50但不超过70％，至少 5但不超过60％，至少10但不超过60％，至少15但不至少60％，至少 20％但不超过60％，至少30％但不超过60％，至少40％但不超过60％， 至少5％但不超过50％，至少10％超过50％，至少15但不超过50％，至 少20但不超过50％，至少30但不超过50％，至少40但不超过50％，至 少5不超过40％，至少10但不超过40％，至少15但不超过40％，至少 20但不超过40％，至少30但不超过40％，至少35但不超过40％，至少 5但不超过30％，至少10但不超过30％，至少15但不超过30％，至少 20但不超过30％，至少25但不超过30％的mTOR抑制。
mTOR抑制的程度可以传达或者对应于P70 S6激酶抑制的程度，例 如，mTOR抑制的程度可以通过P70 S6激酶活性的降低水平来确定，通 过例如P70 S6激酶底物的磷酸化的降低。可以通过多种方法评价mTOR 抑制水平，例如通过Boulay测定法测量P70 S6激酶活性，如美国专利申 请号2005/01240036中所述，其通过引用并入本文，或如美国专利7,727,950 中所述，其通过引用并入本文；通过蛋白质印迹法测定磷酸化S6的水平； 或评估PD1阴性免疫效应细胞与PD1阳性免疫效应细胞比例的变化。
正如本文中所使用的那样,术语“mTOR抑制剂”是指在细胞中抑制所 述的mTOR激酶的化合物或配体或其药学上可接受的盐。在一种实施方式 中，mTOR抑制剂是别构抑制剂。别构的mTOR抑制剂包括中性的三环 化合物雷帕霉素(西罗莫司)、与雷帕霉素有关的化合物,即与雷帕霉素具有 结构和功能相似性的化合物，包括例如,雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似 物(也被称为雷帕系物)和抑制mTOR活性的其它大环内酯化合物。在一 种实施方式中，mTOR抑制剂是催化性抑制剂。
已知雷帕霉素是由吸水链霉菌生产的大环内酯抗生素，其具有式A中 所示的结构。
Figure BDA0003147962450002051
参见，例如,McAlpine,J.B.等人,J.Antibiotics(1991)44:688； Schreiber,S.L.等人,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7433；U.S.Patent No. 3,929,992。有许多种为雷帕霉素提出的编号方案。为了避免混乱,当本文 中给具体的雷帕霉素类似物命名时,参考雷帕霉素，利用式A的编号方案 给出名称。
可用于本发明中的雷帕霉素类似物例如是O-取代的类似物，其中雷 帕霉素的环己基环上的羟基被OR1替代，其中R1是羟基烷基、羟基烷氧 基烷基、酰基氨基烷基或氨基烷基；例如RAD001,也被称为依维莫司,如 US 5,665,772和WO94/09010中描述，将其内容并入作为参考。其它合适 的雷帕霉素类似物包括在第26-或28-位取代的那些。所述的雷帕霉素类似 物可以是前面提到的类似物的差向异构体,特别是在第40,28或26位取代 的并且可以任选地进一步被氢化的类似物的差向异构体,例如如US 6,015,815、WO95/14023和WO99/15530中描述的那样，将其内容并入作 为参考,例如ABT578也被称为zotarolimus或在US7,091,213、 WO98/02441和WO01/14387中描述的雷帕霉素类似物，将其内容并入作 为参考,例如AP23573，也被称为ridaforolimus。
适用于本发明中的来自US 5,665,772的雷帕霉素类似物的例子包括但 不限于:40-O-苄基-雷帕霉素,40-O-(4’-羟基甲基)苄基-雷帕霉素, 40-O-[4’-(1,2-二羟基乙基)]苄基-雷帕霉素,40-O-烯丙基-雷帕霉素, 40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕霉素, (2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羟基戊-2’-烯-1’-基)-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙氧 基羰基甲基-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(3-羟基)丙基-雷 帕霉素,40-O-(6-羟基)己基-雷帕霉素,40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕 霉素,40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素,40-O-[(2S)-2,3- 二羟基丙-1-基]-雷帕霉素,40-O-(2-乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰 氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-吗啉代)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素, 40-O-(2-N-咪唑基乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-甲基-N’-哌嗪基)乙 酰氧基]乙基-雷帕霉素,39-O-去甲基-39,40-O,O-亚乙基-雷帕霉素, (26R)-26-二氢-40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-氨基乙基)-雷帕霉素, 40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰胺基乙基)-雷帕霉素, 40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2’-基乙氧甲酰氨基)乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-乙氧 基羰基氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-甲苯磺酰氨基乙基)-雷帕霉素和40-O-[2-(4’,5’-二乙氧羰基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕霉素。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物是其中雷帕霉素的环己基环 上的羟基和/或在第28位的羟基被羟基酯基替代的类似物,例如,在US RE44,768中发现的雷帕霉素类似物,例如坦罗莫司。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物包括其中在第16位的甲氧基 被另一个取代基替代的那些,优选地(任选地羟基取代的)炔基氧基,苄基, 正甲氧基苄基或氯代苄基和/或其中在第39位的甲氧基与所述的第39位的 碳一起被缺失，使得雷帕霉素的环己基环变成缺少所述的第39位的甲氧基 的环戊基环的那些；例如如WO95/16691和WO96/41807中描述的那样，将 其内容并入作为参考。可以进一步修饰所述的类似物，使得雷帕霉素第40位的羟基被烷基化和/或所述的第32位的羰基被还原。
来自WO95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于:16-去甲氧基 -16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕霉素, 16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(4-羟基-丁-2-炔 基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-苄基氧基-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素, 16-去甲氧基-16-苄基氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-正-甲氧基苄基-雷帕 霉素,16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,39- 去甲氧基-40-脱氧-39-甲酰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39- 羟基甲基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-羧基-42-去甲-雷帕 霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基 -40-脱氧-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨基甲酰基-42-去甲-雷帕霉素 和39-去甲氧基-40-脱氧-39-(对-甲苯磺酰基亚肼基甲基)-42-去甲-雷帕霉 素。
来自WO96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于:32-脱氧-雷帕霉 素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-40-O-(2-羟 基-乙基)-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉 素,32(S)-二氢-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(S)-二氢-40-O-(2-羟基 乙基)-雷帕霉素。
另一种合适的雷帕霉素类似物是如US2005/010162 4中描述的 umirolimus，将该文献并入本文作为参考。
RAD001,另外被称为依维莫司
Figure BDA0003147962450002081
具有化学名称 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二 羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环 [30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。
别构的mTOR抑制剂的另外的例子包括西罗莫司(雷帕霉素, AY-22989),40-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也被称为坦 罗莫司或CCI-779)和ridaforolimus(AP-23573/MK-8669)。其它别构的 mTOR抑制剂的例子包括zotarolimus(ABT578)和umirolimus。
备选地或此外,已经发现了催化性的、ATP-竞争性的mTOR抑制剂 直接靶向所述的mTOR激酶结构域并且靶向mTORC1和mTORC2两者。 这些也是比诸如雷帕霉素的别构的mTOR抑制剂更加有效的mTORC1的 抑制剂,因为它们调控雷帕霉素抗性的mTORC1输出，例如4EBP1-T37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
催化性抑制剂包括:BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉 -3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈,或单甲苯磺酸盐形式。 BEZ235的合成被描述在WO2006/122806中；CCG168(另外被称为 AZD-8055,Chresta,C.M.等人,Cancer Res,2010,70(1),288-298)，它具有 化学名称{5-[2,4-双-((S)-3-甲基-吗啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧 基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7- 基]-N-甲基苯甲酰胺(WO09104019)；3-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-1-异丙 基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043和WO2013023184)； N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)喹喔啉-2-基)氨磺酰基)苯基)-3-甲氧基 -4-甲基苯甲酰胺(WO07044729和WO12006552)；PKI-587(Venkatesan, A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，它具有化学名称1-[4-[4-(二甲 基氨基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲； GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，它具有化学名称 2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)； (E)-N-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙烷-2-基)吡啶-3- 基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亚基)氰胺(WO12007926)。
催化性的mTOR抑制剂的进一步例子包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3- 甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮 (WO2006/122806)和Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人,Biochem J., 2009,421(1),29-42。Ku-0063794是哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的特异性 的抑制剂)。WYE-354是催化性的mTOR抑制剂的另一个例子(Yu K等 人(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of NovelATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target ofRapamycin.Cancer Res.69(15):6232-6240)。
根据本发明，有用的mTOR抑制剂还包括前述任何一种的前药、衍生 物、药学上可接受的盐或其类似物。
可以基于本领域中成熟的方法,基于本文中描述的特定剂量,配制 mTOR抑制剂,例如RAD001用于递送。特别地，美国专利6,004,973(并入 本文作为参考)提供了可以与本文中描述的mTOR抑制剂一起使用的制 剂的例子。
抑制分子抑制剂/检查点抑制剂
在一个实施方案中，可以对受试者施用增强CAR表达细胞活性的活 性剂。例如，在一个实施方案中，活性剂可以是抑制检查点分子的活性剂。 在一些实施方案中，检查点分子，例如程序性死亡1(PD1)可以降低CAR 表达细胞装载免疫效应应答的能力。抑制性分子例如检查点分子的实例包 括PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(e.g.,CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1, CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM (TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如，TGFRβ)。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞包 含开关共刺激受体，例如WO 2013/019615中所述，其通过引用整体并入 本文。
本文描述的方法可以包括CAR表达细胞与检查点抑制剂组合施用。 在一个实施方案中，受试者是完全应答者。在另一个实施方案中，受试者 是部分应答者或非应答者，并且例如在一些实施方案中，检查点抑制剂在 CAR表达细胞之前施用，例如在施用CAR表达细胞前两周，12天，10 天，8天，一周，6天，5天，4天，3天，2天或1天前施用。在一些实施 方案中，检查点抑制剂与CAR表达细胞同时施用。
检查点分子的抑制，例如通过在DNA，RNA或蛋白质水平的抑制， 可以优化CAR表达细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如如本文 所述的抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，聚簇的规则间 隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或锌 指内切核酸酶(ZFN)可以用来抑制CAR表达细胞中检查点分子的表达。 在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，检查点分子在 CAR表达细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制检查点分子表达的 dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，抑制信号的抑制剂可以是例如结合检查点分子的 抗体或抗体片段。例如，该活性剂可以是结合PD1，PD-L1，PD-L2或 CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和 MDX-101)，并以
Figure BDA0003147962450002101
上市；Bristol-Myers Squibb)；Tremelimumab(可 得自Pfizer的IgG2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，CP-675,206)。在一个实施方案中，该活性剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实 施方案中，该活性剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中， 该活性剂是与CEACAM结合的抗体或抗体片段。
PD1是CD28受体家族的抑制成员，该家族还包括CD28，CTLA-4， ICOS和BTLA。PD1在活化的B细胞，T细胞和髓系细胞上表达(Agata et al.1996INT.IMMUNOL 8:765-75)。已经显示PD1，PD-L1和PD-L2的两个 配体在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman et a.2000JExp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001NAT IMMUNOL 2:261-8；Carter et al.2002EUR J IMMUNOL 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong et al.2003J MOLMED 81:281-7；Blank et al.2005CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER.54:307-314；Konishi etal.2004CLIN CANCER RES 10:5094)。 通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
PD1，PD-L1和PD-L2的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可 获得的，并且可以与本文所述的CAR,例如本文所述的CD19 CAR组合使 用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是完全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD1。在US 8,008,449 和WO2006/121168中公开了Nivolumab(克隆5C4)和与PD1特异性结合的其它人单克隆抗体。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是结合PD1的人源化 IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD1单克隆抗体公开在 WO2009/101611中。兰布鲁珠单抗(Lambrolizumab)(也称为MK03475； 默克)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。兰布鲁珠单抗和其他人源 化抗PD1抗体公开在US 8,354,509和WO2009/114335中。 MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化的IgG1单克 隆抗体。MDPL3280A和PD-L1的其它人单克隆抗体公开在美国专利号 7,943,743和美国公开号20120039906中。其它抗PD-L1结合剂包括 YW243.55.S70(重链和轻链可变区显示在WO2010/077634中的SEQ ID NO20和21)和MDX-1105(也称为BMS-936559，以及例如WO2007/005874 中公开的抗PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如 WO2010/027827和WO2011/066342中公开的)是阻断PD1和B7-H1之间 的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。其它抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等，例如US8,609,089,US 2010028330,和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof”的US 2015/0210769(其全部内容通 过引用并入本文)中所述的抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，抗PD-1 抗体分子包含来自选自以下任何一种的抗体的重链和轻链可变区的至少 一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有 CDR):BAP049-hum01,BAP049-hum02,BAP049-hum03,BAP049-hum04, BAP049-hum05,BAP049-hum06,BAP049-hum07,BAP049-hum08, BAP049-hum09,BAP049-hum10,BAP049-hum11,BAP049-hum12, BAP049-hum13,BAP049-hum14,BAP049-hum15,BAP049-hum16, BAP049-Clone-A,BAP049-Clone-B,BAP049-Clone-C,BAP049-Clone-D, 或BAP049-Clone-E；或如US2015/0210769的表1所述，或由表1中的核 苷酸序列编码，或与任一前述序列基本相同的序列(例如，至少80％,85％, 90％,92％,95％,97％,98％,99％或以上的同一性)；或密切相关的CDR, 例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例 如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至 少一个，两个，三个或四个可变区，例如选自BAP049-hum01, BAP049-hum02,BAP049-hum03,BAP049-hum04,BAP049-hum05, BAP049-hum06,BAP049-hum07,BAP049-hum08,BAP049-hum09,BAP049-hum10,BAP049-hum11,BAP049-hum12,BAP049-hum13, BAP049-hum14,BAP049-hum15,BAP049-hum16,BAP049-Clone-A, BAP049-Clone-B,BAP049-Clone-C,BAP049-Clone-D,或 BAP049-Clone-E任一个的抗体；或如US 2015/0210769的表1所述，或由 表1中的核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本相同(例如，至少80％, 85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或更高同一性)的序列。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负调节T细胞功能，特别是在分泌IFN-g 的CD4+T辅助1细胞和CD8+T细胞毒性1细胞中，并在T细胞消耗中发 挥关键作用。抑制TIM3与其配体如galectin-9(Gal9)，磷脂酰丝氨酸(PS) 和HMGB1之间的相互作用可增加免疫应答。TIM3及其配体的抗体，抗 体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体，抗体片段，小分子或肽抑制剂 结合TIM3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体 和肽公开在WO2013/006490和US20100247521中。其他抗TIM3抗体包 括RMT3-23的人源化形式(公开于Ngiow et al.,2011,Cancer Res, 71:3540-3551)和克隆8B.2C12(公开于Monney et al.,2002,Nature,415:536-541)。在US20130156774中公开了抑制TIM3和PD-1的双特异性 抗体。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules toTIM3 and Uses Thereof,”的美国专利2015/0218274(其全部内 容通过引用并入本文)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗 TIM3抗体分子包括来自抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三 个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR)，所述抗体选自ABTIM3, ABTIM3-hum01,ABTIM3-hum02,ABTIM3-hum03,ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05,ABTIM3-hum06,ABTIM3-hum07,ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09,ABTIM3-hum10,ABTIM3-hum11,ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13,ABTIM3-hum14,ABTIM3-hum15,ABTIM3-hum16,ABTIM3-hum17,ABTIM3-hum18,ABTIM3-hum19,ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21,ABTIM3-hum22,ABTIM3-hum23的任一个；或如US 2015/0218274的表1-4所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何前述 序列基本相同(例如至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％或 更高同一性)的序列或密切相关的CDR,例如，相同或具有至少一个氨基酸 改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守 取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自本文所述抗体的至 少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体例如选自ABTIM3, ABTIM3-hum01,ABTIM3-hum02,ABTIM3-hum03,ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05,ABTIM3-hum06,ABTIM3-hum07,ABTIM3-hum08,ABTIM3-hum09,ABTIM3-hum10,ABTIM3-hum11,ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13,ABTIM3-hum14,ABTIM3-hum15,ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17,ABTIM3-hum18,ABTIM3-hum19,ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21,ABTIM3-hum22,ABTIM3-hum23的任一个；或如US 2015/0218274的表1-4所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与前述任 何序列基本相同(例如，至少80％,85％,90％,92％,95％,97％,98％,99％ 或更高同一性)的序列。
在其它实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂是CEACAM 抑制剂(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一 个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性的 抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571,WO 2013/082366,WO2014/059251和WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1,26H7和5F4； 或其重组形式，如例如US 2004/0047858，US 7,132,255和WO 99/052552 中所述。在其它实施方案中，抗CEACAM抗体结合CEACAM-5，如例 如Zheng et al.PLoS One.2010Sep 2；5(9).pii:e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)所述，或与例如WO 2013/054331和 US 2014/0271618中所述的CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应。
不希望被理论束缚，认为癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)如 CEACAM-1和CEACAM-5至少部分地介导抗肿瘤免疫应答的抑制(参见 例如，Markel et al.J Immunol.2002Mar15；168(6):2803-10；Markel et al.J Immunol.2006Nov 1；177(9):6062-71；Markel etal.Immunology.2009 Feb；126(2):186-200；Markel et al.Cancer ImmunolImmunother.2010 Feb；59(2):215-30；Ortenberg et al.Mol Cancer Ther.2012 Jun；11(6):1300-10；Stern et al.J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701； Zheng etal.PLoS One.2010Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM-1 已经被描述为TIM-3的异嗜性配体，并且在TIM-3介导的T细胞耐受和 消耗中起作用(参见例如WO 2014/022332；Huang,et al.(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，已经显示了CEACAM-1和TIM-3的共阻断增强异种移植结肠直肠癌模型中的抗肿瘤免疫应答(参见 例如WO 2014/022332；Huang,et al.(2014),supra)。在其它实施方案中， CEACAM-1和PD-1的共同阻断降低了T细胞耐受性，例如在WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其它免疫 调节剂(例如抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)一起使用以增强针对癌症(例如 黑素瘤，肺癌(例如，NSCLC)，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌和本文所述的其 它癌症)的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞激活基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上 表达的细胞表面分子，其已被证明在CD8+T细胞耗尽中起作用。LAG3 及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以 与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗 体，IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗竭性LAG3抗体。其他 LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3的可溶性部分和与II 类MHC分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig的重组融合蛋白。例如 在WO2010/019570中公开了其它抗体。
在一些实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是例如包 含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是检查点分子或 其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细 胞内信号传导结构域的多肽(本文也称为抑制性CAR或iCAR)。在一些实 施方案中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28，CD27，ICOS的共刺 激结构域，例如CD28，CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域和/或 例如，本文所述CD3ζ的一级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合 蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不 表达CAR,例如CD19 CAR的细胞，例如T细胞表达。
在一个实施方案中，检查点分子，例如本文所述的检查点分子的细胞 外结构域(ECD)，例如编程性死亡1(PD1)，可以融合到本文所述的跨膜结 构域和细胞内信号传导结构域，例如，包含共刺激信号传导结构域，例如41BB,OX40，Cd28，CD27和/或例如CD3ζ的一级信号传导结构域的细胞 内信号传导结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR,例如PD1 CAR可以 与另一CAR,例如CD19CAR(例如，CD19RCAR)组合使用。在一个实施方 案中，PD1 RCAR(或PD1 CAR)改善了T细胞的持续性。抑制分子的实例 包括PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1, CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4(VTCN1),HVEM (TNFRSF14或CD270),KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷 和TGFR(例如TGFRβ)。在一个实施方案中，抑制性分子CAR包含第一 多肽(例如抑制性分子如PD1,PD-L1,PD-L2,CTLA4,TIM3,CEACAM(例 如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3,VISTA,BTLA, TIGIT,LAIR1,CD160,2B4,CD80,CD86,B7-H3(CD276),B7-H4 (VTCN1),HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR,A2aR,I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFR(例如，TGFRβ)或这些任何一种的片段(例如， 这些任何一种的至少一部分细胞外结构域)，以及第二多肽(其是本文所述 的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB，CD27 或CD28，例如本文所述)和/或一级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ 信号传导结构域))。
在一个实施方案中，抑制性分子CAR包含融合到跨膜结构域的PD1 的细胞外结构域(ECD)和细胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ(本文也 称为PD1 CAR)。在一个实施方案中，PD1 CAR改善了细胞CAR表达细 胞的持久性。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ IDNO:44所示的 PD1的细胞外结构域。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:40 的氨基酸序列。
在一个实施方案中，PD1 CAR包含作为SEQ ID NO:41提供的氨基酸 序列。
在一个实施方案中，PD1 CAR,例如本文所述的PD1 CAR由以SEQ ID NO:42提供的核酸序列，或至少包含编码PD1细胞外结构域的核酸序列(以SEQ ID NO:101提供)编码。
在实施方案中，抑制性细胞外结构域与天然存在的人抑制分子，例如 本文公开的天然存在的人类主要刺激分子具有至少70,75,80,85,90,95, 96,97,98,或99％的同一性，或与所述天然存在的人抑制分子的相应残基 相差不超过30,25,20,15,10,5,4,3,2,或1个氨基酸残基。
在一个实施方案中，编码抑制调节或调整例如抑制T细胞功能的分子 表达的dsRNA分子的核酸分子有效连接到启动子，例如H1-或U6衍生的 启动子，使得抑制调节或调整例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA 分子被表达，例如在表达CAR的细胞内表达。参见例如Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,”Chapter 3,in Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA(eds.Friedmann and Rossi).Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, NY,USA,2007；Brummelkamp TR,et al.(2002)Science 296:550–553； MiyagishiM,et al.(2002)Nat.Biotechnol.19:497–500。在一个实施方案 中，编码抑制调节或调整，例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分 子的核酸分子存在于相同的载体上，例如包含编码CAR的组件，例如所 有组件的核酸分子的慢病毒载体上。在这样的实施方案中，编码抑制调节 或调整，例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子位于 载体上，例如慢病毒载体上，编码CAR的组件，例如所有组件的核酸的5’- 或3’。编码抑制调节或调整，例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA 分子的核酸分子可以以与编码CAR的组件，例如所有组件的核酸相同或 不同的方向转录。
在一个实施方案中，编码抑制调节或调整，例如抑制T细胞功能的分 子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于除包含编码CAR的组件，例如所 有组件的核酸分子的载体之外的载体上。在一个实施方案中，编码抑制调 节或调整，例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子在 表达CAR的细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制调节或调整， 例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子稳定地整合到CAR表达细胞的基因组中。在一个实施方案中，调节或调整例如抑制T 细胞功能的分子是PD-1。
在实施方案中，增强CAR表达细胞(例如抑制性分子的抑制剂)的活性 的活性剂与同种异体CAR,例如本文所述的同种异体CAR(例如，在本文的 同种异体CAR部分中描述)组合施用。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子包含自然杀伤细胞受体 (NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以 下任何自然杀伤细胞受体的跨膜结构域，铰链结构域或细胞质结构域:杀伤 细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1,KIR2DL2/L3,KIR2DL4, KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS2,KIR2DS3,KIR2DS4,DIR2DS5,KIR3DL1/S1,KIR3DL2,KIR3DL3,KIR2DP1,和KIR3DP1；自 然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30，NKp44，NKp46；免疫细胞受体的 信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48,CD229,2B4,CD84, NTB-A,CRACC,BLAME,和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A，LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可与衔 接子分子或细胞内信号传导结构域，例如DAP12相互作用。包含NKR组 分的CAR分子的示例性构型和序列描述在国际公开号WO2014/145252 中，其内容通过引用并入本文。
分裂CAR
在一些实施方案中，CAR表达细胞使用分裂CAR。分裂CAR方法在 出版物WO2014/055442和WO2014/055657中有更详细的描述，其通过引 用并入本文。简而言之，分裂CAR系统包括表达具有第一抗原结合结构 域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具 有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞遇 到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活，细胞杀伤活性开始。因此， CAR表达细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
调节嵌合抗原受体的策略
有多种方式可以调节CAR活性。在一些实施方案中，其中可以控制 CAR活性的可调节CAR(RCAR)是期望的，以优化CAR疗法的安全性和 功效。有多种方式可以调节CAR活性。例如，使用例如融合到二聚化结 构域的胱天蛋白酶的可诱导性凋亡(见例如，Di Stasa etal.,N Engl.J.Med. 2011Nov.3；365(18):1673-1683)，可以在本发明的CAR疗法中用作安全开 关。在一个实施方案中，表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK 细胞)还包含可诱导的凋亡开关，其中人胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)或 修饰形式融合到人类FKB蛋白的修饰形式，其允许条件二聚化。在小分 子如rapalog(例如AP 1903，AP20187)的存在下，可诱导的胱天蛋白酶(例 如胱天蛋白酶9)被激活并导致表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或 NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的可诱导凋亡开关(或这种开 关的一个或多个方面)的实例已经在例如US2004040047；US20110286980； US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348； WO2014197638；WO2014197638中进行了描述；所有这些文献都通过引 用并入本文。
在另一个实例中，CAR表达细胞还可以表达诱导型胱天蛋白酶 -9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为 AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致胱天蛋白酶 -9的激活和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介导二聚化的二 聚化(CID)结合结构域的化学诱导剂。这导致CAR表达细胞的可诱导和选 择性消耗。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分开的核 酸分子编码，在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的 核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关，以避免CAR表达细胞的 任何毒性。参见例如Song et al.Cancer GeneTher.2008；15(10):667-75； Clinical Trial Id.No.NCT02107963；和Di Stasi etal.N.Engl.J.Med. 2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的备选策略包括利用失活或关闭CAR活 化的小分子或抗体，例如，通过缺失CAR表达细胞，例如通过诱导抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的CAR表达细胞还 可以表达由能够诱导细胞死亡，例如ADCC或补体诱导的细胞死亡的分子 识别的抗原。例如，本文所述的CAR表达细胞也可以表达能够被抗体或 抗体片段靶向的受体。这些受体的实例包括EpCAM，VEGFR,整联蛋白(例 如整联蛋白αvβ3，α4，αΙ3/4β3，α4β7，α5β1，ανβ3，αν)，TNF受体超家 族成员(例如TRAIL-R1，TRAIL-R2)，PDGF受体，干扰素受体，叶酸受 体，GPNMB,ICAM-1,HLA-DR,CEA,CA-125,MUC1,TAG-72,IL-6受 体，5T4,GD2,GD3,CD2,CD3,CD4,CD5,CD1 1,CD1 1a/LFA-1,CD15, CD18/ITGB2,CD19,CD20,CD22,CD23/lgE受体，CD25,CD28,CD30, CD33,CD38,CD40,CD41,CD44,CD51,CD52,CD62L,CD74,CD80, CD125,CD147/basigin,CD152/CTLA-4,CD154/CD40L,CD195/CCR5,CD319/SLAMF7,和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表 位但缺少胞质结构域内一个或多个区域的形式)。
例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达截短的表皮生长因子受 体(EGFR)，其缺少信号传导能力，但保留由能够诱导ADCC的分子(例如 西妥昔单抗
Figure BDA0003147962450002201
)识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC 并随后消耗CAR表达细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda et al.,Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一个策略包括表达高度紧密的标记/ 自杀基因，该基因将结合利妥昔单抗的本文描述的CAR表达细胞中的 CD32和CD20抗原的靶表位组合，导致CAR表达细胞的选择性消耗，例 如通过ADCC(参见例如Philip et al.,Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于 消耗本文所述的CAR表达细胞的其它方法包括施用CAMPATH，其是单 克隆抗CD52抗体，该抗体选择性结合并靶向成熟淋巴细胞例如CAR表 达细胞，例如通过诱导ADCC进行破坏。在其它实施方案中，可以使用 CAR配体例如抗独特型抗体选择性靶向CAR表达细胞。在一些实施方案 中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从 而减少CAR表达细胞的数量。在其它实施方案中，CAR配体，例如抗独 特型抗体可以偶联至诱导细胞杀伤的试剂，例如毒素，从而减少CAR表达细胞的数量。或者，CAR分子本身可以被配置为使得可以调节活性，例 如开启和关闭活性，如下所述。
在其它实施方案中，本文所述的CAR表达细胞还可以表达由T细胞 消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20，T细胞消耗 剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减 少或消除CAR表达细胞，例如减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞消耗 剂。在其它实施方案中，T细胞消耗剂是如本文实施例中所述的抗CD52 抗体，例如阿仑珠单抗。
在其它实施方案中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中通 常为两个，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和胞 内信号传导结构域分配在分开的多肽或成员上。在一些实施方案中，该组 多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如 可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本 发明的CAR利用二聚化开关，如在例如WO2014127261(其通过引用并 入本文)中所描述的二聚化开关。本文和例如2015年3月13日提交的国 际公开号WO 2015/090229(其全部内容通过引用并入本文)的第527-551 段提供了这种可调节CAR的附加描述和示例性结构。在一些实施方案中， RCAR涉及开关结构域，例如FKBP开关结构域，如SEQ ID NO：92所示，或包含具有与FRB结合能力的FKBP的片段，例如如SEQ ID NO： 93所示。在一些实施方案中，RCAR涉及包含FRB序列的开关结构域， 例如如SEQ ID NO：94所示，或突变型FRB序列，例如SEQ ID NO：95-100 的任一个中所示。
CAR与趋化因子受体的共同表达
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞进一步包含趋化因子受体 分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强了 对分泌CCL2-或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock et al.,J Immunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw et al.,Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚， 认为在CAR表达细胞中表达的识别由肿瘤例如实体瘤分泌的趋化因子的 趋化因子受体，可以改善CAR表达细胞归巢到肿瘤中，促进CAR表达细 胞浸润到肿瘤，并增强CAR表达细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子 可以包含天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于 在本文所述的CAR表达细胞中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因 子受体(例如CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4,CXCR5,CXCR6,或 CXCR7)，CC趋化因子受体(例如CCR1,CCR2,CCR3,CCR4,CCR5, CCR6,CCR7,CCR8,CCR9,CCR10,或CCR11)，CX3C趋化因子受体(例 如CX3CR1)，XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在 一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子选择要用本文所述的CAR表 达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞 进一步包含，例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中， 本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载 体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案 中，CAR和趋化因子受体分子各自由两种不同的启动子控制，或者在同一 启动子的控制下。
分裂CAR
在一些实施方案中，CAR表达细胞使用分裂CAR。分裂CAR方法在 出版物WO2014/055442和WO2014/055657中有更详细的描述，其通过引 用并入本文。简而言之，分裂CAR系统包括表达具有第一抗原结合结构 域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具 有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞遇 到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活，细胞杀伤活性开始。因此， CAR表达细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
药物组合物和治疗
药物组合物可以包含与一种或多种药学上可接受的或生理上可接受 的载体、稀释剂或赋形剂组合的表达CAR的细胞,例如,许多表达CAR的 细胞(正如本文中描述的那样)。这样的组合物可以包含缓冲液例如中性的 缓冲盐水、磷酸缓冲盐水以及诸如此类；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、 蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯 合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。例如，可 以把组合物配制成用于静脉内施用。
可以以合适的方式把本公开的药物组合物施用到将要被治疗(或预防) 的疾病。施用的数量和频度将由这样的因素决定，如患者的状况以及患者 的疾病类型和严重程度,然而合适的剂量可以由临床试验来确定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含，例如没有可检测水平的 污染物，例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675(其通 过引用全部并入本文)的第1009段中描述的污染物。
当指示“免疫学上有效量”,“抗肿瘤有效量”,“抑制肿瘤有效量”或 “治疗有效量”时,将要被施用的本发明的组合物的精确数量可以由医师 在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者) 的状况的情况下确定。一般地可以声明:可以以104至109个细胞/kg体重(在 一些实例中105至106个细胞/kg体重,包括这些范围内所有的整数值)的剂 量，施用包含本文中描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物 组合物。也可以以这些剂量多次施用所述的T细胞组合物。可以通过免疫 疗法中通常已知的输注技术来施用所述的细胞(参见，例如,Rosenberg等 人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包含约1 x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1 x108,2x108,或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如， CD19 CAR细胞)的剂量包含至少约1x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x 106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1x108,2x108,或5x108个细胞/kg。 在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)的剂量包含多达约1 x106,1.1x106,2x106,3.6x106,5x106,1x107,1.8x107,2x107,5x107,1 x108,2x108,或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如， CD19 CAR细胞)的剂量包含约1.1x106–1.8x107个细胞/kg。在一些实 施方案中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包含约1x107,2x107, 5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。在一些 实施方案中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包含至少约1x107, 2x107,5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。 在一些实施方案中，CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)的剂量包含多达约 1x107,2x107,5x107,1x108,2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。
在某些方面中,可能希望的是:给受试者施用活化的免疫效应细胞(例 如，T细胞、NK细胞)，然后随后再次抽血(或者进行单采血液成分术成分 术),按照本公开活化从中得到的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),并 且再给所述的患者输注这些活化的并且扩增的免疫效应细胞(例如，T细 胞、NK细胞)。每隔几个星期可以进行这种方法多次。在某些方面中,可 以从10cc至400cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK 细胞)。在某些方面中,从20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或 100cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。
所述主题组合物的施用可以以常规方式进行,包括通过气雾剂吸入、 注射、摄入、输液、植入或移植。可以以下列方式给患者施用本文中描述 的组合物:经动脉方式,皮下方式,皮内方式,肿瘤内方式,节内方式,髓 内,肌肉内方式,通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内方式。在一个方面中，通过 皮内或皮下注射给患者施用本文所述的T细胞组合物。在一个方面中，通 过静脉内注射施用本文所述的T细胞组合物。可以把所述的免疫效应细胞 (例如，T细胞、NK细胞)组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
在一种特定的示例性的方面中,受试者可以经受白细胞去除术,其中 将白细胞收集，富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞,例如,T细胞。 可以通过本领域中已知的方法把这些T细胞分离物扩增和处理，使得可以 引入本文所述的一种或更多种CAR构建体,从而产生本公开的CAR T细 胞。需要其的受试者随后可以经受采用高剂量化疗然后外周血干细胞移植 的标准治疗。在某些方面中,在所述的移植之后或与所述的移植同时，受 试者接受本文所述的扩增的CAR细胞的输注。在另外一个方面中,在外科 手术之前和之后，施用所述的扩增的细胞。
上述将要给患者施用的治疗的剂量将会随被治疗的状况的精确性质 和所述治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践进行用于人施用 的剂量的定标。例如,对于成年患者，CAMPATH剂量一般将会在1至大 约100mg的范围,通常每日施用，持续1至30天的一段时间。合适的每 日剂量是1至10mg/天，然而在一些实例中，可以使用最多40mg/天的更大剂量(在美国专利号6,120,766中描述的)。
在一种实施方式中,把所述的CAR引入到免疫效应细胞(例如，T细 胞、NK细胞)中,例如利用体外转录,并且所述的受试者(例如人)接受本发 明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的初次施用,以及本发 明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或更多次随后的 施用,其中所述的一次或更多次随后的施用是在先前的施用之后15天以内,例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天内被施用的。在一种实施 方式中,每个星期给所述的受试者(例如人)超过一次施用本文所述的 CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),例如每个星期施用2,3或4 次本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一种实施方 式中,每个星期所述的受试者(例如人受试者)接受超过一次CAR免疫效应 细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用(例如每个星期2,3或4次施用)(在 本文中也被称为循环),随后一个星期不施用CAR免疫效应细胞(例如，T 细胞、NK细胞),然后给所述的受试者施用一次或更多次CAR免疫效应细 胞(例如，T细胞、NK细胞)的额外施用(例如每个星期超过一次的CAR免 疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用)。在另一种实施方式中,所述 的受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),并且每个循环之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3 天。在一种实施方式中,每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、 NK细胞)，每个星期持续3次施用。在一种实施方式中,施用本文所述的 CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)持续至少2,3,4,5,6,7,8或 更多个星期。
一方面，使用慢病毒病毒载体如慢病毒产生如本文所述的CAR表达 细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CD19 CAR表达细胞，例如CTL019。 以这种方式产生的CAR表达细胞可以具有稳定的CAR表达。
一方面，CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)在转导后瞬时表达CAR 载体4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天。CAR的瞬时表达可以通过RNA CAR载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导入细胞。
使用瞬时表达CAR细胞例如T细胞(特别是携带鼠scFv的CAR表达 细胞(例如T细胞，NK细胞))治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治 疗后的过敏反应。不受这个理论的限制,相信这样的过敏反应可能是由正 在发展体液抗CAR应答,即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体的患者引起 的。认为当在暴露于抗原中有10到14天的间断时，患者的产生抗体的细 胞发生从IgG同种型(它不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果在短暂的CAR治疗的过程期间，患者处于产生抗CAR抗体应答 (例如通过RNA转导产生的那些)的高风险下,CAR表达细胞(例如，T细胞、 NK细胞)输注间断不应该持续超过10至14天。
在任何上述方法的一些实施方案中，所述方法还包括向哺乳动物(例 如，具有癌症的哺乳动物，例如根据本文的方法为或被鉴定为应答者，完 全应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复发者的哺乳动物)施用一 个或多个剂量的细胞(例如，包含本文所述的含有CAR核酸或CAR多肽 的免疫细胞)。在一些实施方案中，一个或多个剂量的CAR细胞(例如， CD19 CAR细胞)包含至少约1x106,5x106,1x107,2x107,5x107,1x108, 2x108,5x108,1x109,2x109,或5x109个细胞。
在一个实施方案中，施用多达10,9,8,7,6,5,4,3或2个剂量的细胞。在 其它实施方案中，将一个，两个，三个，四个，五个或六个剂量的细胞， 例如以一，二，三，四或更多周的治疗间隔施用于哺乳动物。在一个实施 方案中，在两周内施用多达6个剂量。剂量可以相同或不同。在一个实施 方案中，最初施用较低剂量，随后是一个或多个较高剂量。在一个示例性 实施方案中，较低剂量为约1x105至1x109个细胞/kg,或1x106至1x108细胞/kg；并且较高剂量为约2x105至2x109细胞/kg或2x106至2x108细胞 /kg，接着为3-6次剂量的约4x105至4x109细胞/kg或4x106至4x108细胞 /kg。
在一个实施方案中，在一次或多次淋巴细胞减少疗法(例如淋巴滤除化 疗)后施用一次或多次剂量的细胞。在一个实施方案中，淋巴滤除疗法包括 化疗(例如环磷酰胺)。
在一个实施方案中，一次或多次剂量之后是细胞移植，例如同种异体 造血干细胞移植。例如，同种异体造血干细胞移植发生在约20至约35天， 例如约23至33天之间。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种CAR表达细胞可经由生 物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物 支架可以支持或增强本文所述的CAR表达细胞的递送，扩增和/或分散。 生物聚合物支架包含生物相容性(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/ 或可天然存在或合成的可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例 如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675(其全部内容通过 引用并入本文)的段落1004-1006中。
示例性计算机系统
多种计算机系统可以被特别配置以利用在潜在的癌症应答者状态指 标(例如，如本文所述的ALL和CLL应答者状态指标，例如完全应答者， 部分应答者，非应答者)上返回的信息。在一些实施方案中，计算机系统可 以确定和呈现关于与癌症(例如血液癌症)诸如ALL和CLL的多种生物标 志和/或指标相关的置信水平的信息。例如，计算机系统可以评估对受试者 进行的测试是否指示完全应答者，部分应答者或非应答者的基因特征以及 与受试者应答者分类相关联的置信度。在进一步的实例中，该系统可以提 供关于增加与预测的应答者分类相关联的置信度的指示和/或建议。例如， 该系统可以被配置为评估任何测试和测试的癌症生物标志和/或指标，已为 受试者对已被鉴定为现有数据的独立和/或加性的另一特征进行了所述测 试。在一个实施方案中，该系统可以被配置为评估任何测试和测试的生物 标志和/或癌症指标(例如，血液癌症，例如CLL和ALL)，已经为受试者 针对被鉴定为现有数据的独立和/或加性的另一特征进行了所述测试。该系 统可以确定额外的生物标志和/或指标(例如，基因特征)何时将增加与例如 应答者分类的变化相关联的置信度。该系统可以相应地建议测试任何鉴定 的特征。
在一些实施方案中，可以提供用于鉴定，评估和/或治疗患有癌症(例 如，血液癌症如ALL和CLL)的受试者的交互式系统。在一个实施方案中， 可以提供用于鉴定，评估和/或治疗患有癌症(例如，血液癌症如ALL和 CLL)的受试者的交互式系统。根据一个实施方案，系统可以被配置为接受 关于受试者评估的置信度的用户输入。响应用户输入的置信度，系统可以 将测试特征确定为包括在评估模型中。在一个实例中，系统包括用于受试 者(例如，患者)群体中疾病活动的独立指标的说明。该系统可以被配置为 基于使用什么独立指标来估计确定疾病活动或预测未来疾病活动的置信 度。该系统可以被进一步配置为确定和/或建议所确定的独立指标的各种组 合，以提高评估的置信度。
根据另一方面，计算机系统可以被特别地配置为评估癌症(例如血液癌 症，例如ALL和CLL)的指标。在一个实施方案中，计算机系统可以被特 别地配置为评估ALL和/或CLL的指标。该系统可以被配置为生成多变量 模型，其中多变量模型排除相关的指标。在一些实例中，系统可以被配置 为响应于评估具有一个或多个指标的受试者(例如，患者)群体内的返回的 测试结果来鉴定相关的指标。例如，系统可以执行回归模型分析来控制多 种参数，包括例如受试者年龄，种族，性别以及其他指标的存在。响应消 除相关的指标，系统可以生成一个或多个独立指标的模型。在一些实施方 案中，系统可以被配置为选择一个或多个独立指标的各种组合，并且可以 进一步访问评估(包括例如直接评估组合)以呈现关于与各自选择相关联的 置信水平的信息。系统选择的模型可用于通过确定的置信水平来产生疾病 活动的预期变化。
在一个实施方案中，本公开提供了用于评价受试者中的癌症(例如，血 液癌症如ALL和CLL)的系统，其包括:
有效连接到存储器的至少一个处理器，所述至少一个处理器在执行时 被配置为:
获得应答者状态的值，其包括CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)基因集特征的度量和以下中的一种或多种的组合:
表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表 16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20中列出的生物 标志，CD27生物标志，CD45RO生物标志，PD-1生物标志，LAG-3生 物标志，TIM-3生物标志，IL2RA生物标志，IL21生物标志，CD4生物 标志，CD8生物标志，TH1+辅助T细胞基因集特征，TH2+辅助T细胞 基因集特征和记忆T细胞(例如，CD8+记忆T细胞，例如初始T细胞(TN)， 例如记忆干细胞(TSCM)，例如中枢记忆T细胞(TCM)，例如效应记忆T细 胞(TEM))基因集特征；和
响应于应答者状态的值的确定，执行一个，两个，三个，四个或更多 个:
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者；
建议CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如本文所述的 CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法，例如CTL019)；
建议选择或改变CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法的剂量； 或
替代疗法，例如针对特定癌症的护理标准。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于评估受试者中的癌症(例 如，血液癌症如ALL和CLL)的系统，其包括:至少一个处理器，其有效 连接到存储器，所述至少一个处理器在执行时被配置为:获得应答者状态的 值，其包括CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)基因集特征的度 量和以下的一种或多种的组合:表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14，表15，表16(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表 18，表20，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L和 KLRG1中列出的生物标志；并且响应于应答者状态的值的确定，执行一个， 二个，三个，四个或更多个:将所述受试者鉴定为完全应答者，部分应答者 或非应答者；建议CAR表达细胞疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细 胞疗法，例如CTL019)；建议选择或改变CAR表达细胞疗法的给药；或替代 疗法。
图16是分布式计算机系统200的框图，其中可以实施根据本公开的各 个方面和功能。分布式计算机系统200可以包括一个或多个计算机系统。 例如，如所示，分布式计算机系统200包括三个计算机系统202,204和206。 如所示，计算机系统202,204和206通过通信网络208互连并且可以通过 通信网络208交换数据。网络208可以包括任何通信网络，计算机系统可 以通过其交换数据。为了通过网络208交换数据，计算机系统202,204和 206以及网络208可以使用多种方法，协议和标准，包括令牌环，以太网， 无线以太网，蓝牙，无线电信令，红外线信令，TCP/IP,UDP,HTTP,FTP, SNMP,SMS,MMS,SS2,JSON,XML,REST,SOAP,CORBA IIOP,RMI, DCOM和Web服务。
根据一些实施方案，可以单独和/或组合在计算机系统202,204和206 上执行用于鉴定，治疗或预防癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的所 讨论的功能和操作。例如，计算机系统202,204和206支持例如参与协作 操作，其可以包括分析在患者群体上捕获的治疗数据。在一个备选方案中， 单个计算机系统(例如，202)可以分析在受试者(例如，患者)群体上捕获的 治疗数据，以开发表征模型和/或鉴定疾病活动的独立指标。计算机系统 202,204和206可以包括个人计算设备诸如蜂窝电话，智能电话，平板电脑 等的，并且还可以包括台式计算机，膝上型计算机等。
根据本公开的多个方面和功能可以被实现为在包括图16所示的计算 机系统202的一个或多个计算机系统中执行的专用硬件或软件。在一个实 施方案中，计算机系统202是专门配置为执行上面讨论的过程和/或操作的 计算设备。例如，该系统可以向终端用户呈现用户界面，其呈现与生物标 志和/或遗传指标相关的治疗信息，诊断信息和置信水平以及其他选项。如 所示，计算机系统202包括至少一个处理器210(例如，单核或多核处理器)， 存储器212，总线214，输入/输出接口(例如，216)和存储装置(storage) 218。处理器210可以包括一个或多个微处理器或其他类型的控制器，并且 可以执行操作数据(例如，处理数据，测试数据等)的一系列指令。如所示， 处理器210由互连元件(例如，总线214)连接到包括存储器212的其它系统 组件。
存储器212和/或存储装置218可以用于在计算机系统202的运行期间 存储程序和数据。例如，存储器212可以是相对高性能的易失性随机存取 存储器，例如动态随机存取存储器(DRAM)或静态存储器(SRAM)。此外， 存储器212可以包括用于存储数据的任何设备，诸如磁盘驱动器或其他非 易失性存储设备，诸如闪速存储器，固态或相变存储器(PCM)。在另外的 实施方案中，关于鉴定，治疗或预防受试者中的癌症(例如，ALL和/或CLL) 所讨论的功能和操作可以体现在应用程序中，该应用程序在计算机系统 202上从存储器212和/或存储装置218执行。
计算机系统202还包括一个或多个接口216，例如输入设备，输出设 备和组合输入/输出设备。接口216可以接收输入，提供输出或两者。存储 装置218可以包括计算机可读和可计算机可写的非易失性存储介质，在所 述存储介质中存储定义要由处理器执行的程序的指令。存储系统218还可 以包括记录在介质上或介质中的信息，并且该信息可以由应用程序处理。 可以与多种实施方案一起使用的介质可以包括例如光盘，磁盘或闪存，SSD等。
此外，本发明不限于特定的存储系统或存储器系统。虽然计算机系统 202作为示例被示为一种类型的计算机系统，其上可以实施用于鉴定，治 疗或预防受试者的癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的各种功能，但 是本发明不限于在图16所示的计算机系统上实现。可以在具有不同于图 16所示的结构或组件的一个或多个计算机上实施根据本发明的多个方面 和功能。
在一些实施方案中，计算机系统202可以包括操作系统,其管理包括在 计算机系统202中的硬件组件(例如，输入/输出设备，触摸屏，照相机等) 的至少一部分。一个或多个处理器或控制器诸如处理器210可以执行操作 系统，其可以是可从MicrosoftCorporation获得的基于Windows的操作 系统(例如，Windows NT，ME，XP，Vista，2,8或者RT)，来自Apple Computer的操作系统(例如，MAC OS，包括System X)，许多基于Linux 的操作系统发行版之一(例如，可从Red Hat Inc.获得的Enterprise Linux 操作系统)，可从Sun Microsystems获取的Solaris操作系统或可从多种来 源获取的UNIX操作系统。可以使用许多其他操作系统，包括为个人计算 设备(例如，iOS，Android等)设计的操作系统，并且实施方案不限于任何 特定的操作系统。
根据一个实施方案，处理器和操作系统一起定义可以在其上执行应用 程序的计算平台。此外，可以在非编程环境(例如，以HTML，XML或其 他格式创建的文档，其当在浏览器程序的窗口中查看时，呈现图形用户界 面的方面或执行其他功能)中实现用于鉴定，治疗或预防癌症(例如，血液 癌症如ALL和CLL)的多种功能。此外，根据本公开的方面的多种实施方 案可以被实现为已编程或非编程组件，或其任何组合。因此，本公开不限 于特定的编程语言，并且也可以使用任何合适的编程语言。
实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅 仅是为了举例说明的目的,并不意图是限定性的，除非另有说明。因此,无 论如何不应把本发明解释为限定到下列实施例,而是应该把本发明解释成 包括任何以及所有的变化，这些变化作为本文中所提供的教导的结果而变 成显而易见的。
没有进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前面描述和以下 说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。以 下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，而不应被解释为以任何方式 限制本公开的其余部分。
实施例1:使用全基因组RNAseq和无偏特征选择鉴定慢性淋巴样白血 病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中预测受试者对CD19 CAR表达细 胞疗法的应答的新的转录基因特征
本实施例描述了鉴定慢性淋巴样白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病 (ALL)中预测患者对CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法(例 如CTL019疗法)的应答的新的转录基因特征，用于本发明。
其中，本实施例描述了在重新输注之前，基于单采血液成分术和制备 的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物样品(例如，CTL019) 中所选择的基因的mRNA表达水平的新的基因特征。
特别地，本实施例描述了用于根据本发明用途的发现新基因特征的无 偏特征选择方法，所述新基因特征预测患者对CLL和ALL中CD19 CAR 表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如CTL019)的应答。
已经鉴定了基于重新输注前的单采血液成分术和制备的CD19 CAR 表达细胞产物样品中的mRNA表达水平的新型基因特征，其预测患者对慢 性淋巴样白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中CD19 CAR表达细 胞疗法的应答。在生产的产品样品的全基因组RNAseq研究中发现了鉴定 的特征，所述样品包括7个ALL受试者样品和21个CLL受试者样品。 从具有对CD19 CAR表达细胞疗法的完全应答的受试者(例如患者)取出 ALL受试者样品(总共7个)。CLL受试者样品(共21个)分层如下:从2例 CTL019治疗的完全应答者(CRs)的患者，6例部分应答者(PR)患者，13例 非应答者(NRs)患者中获取生物样品。然后在上述患者的一个子集中研究基 因特征，其中在单采血液成分术时采集样品。发现并且在实施例2中进一 步描述了区分制造的产品和单采血液成分术样品中的应答者和非应答者 的几种基因特征。获得了具有制造产品的健康供体样品(即，参考样品)并 用作参考水平。
然后使用如下多种数据分析方法发现了新型基因特征:1)无偏特征选 择；2)基因集分析；和3)所选择的目的基因的差异表达分析。基因集分析(2) 和差异表达分析(3)在实施例2中进一步详细讨论。
通过确定哪些基因在CR和NR之间以及CR和PR之间差异表达， 发现了从无偏特征选择得到的新基因特征。如果差异表达具有统计学显著 性，FDR p值截断值为0.1，则将基因定义为差异表达。CR与NR比较(N ＝128)和CR与PR比较(N＝34)的基因列表列于表1A-B。
不希望受到特定理论的约束，这些数据表明，单采血液成分术或CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物(例如CTL019)中T细胞的分 化状态与受试者应答(即，CR,PR或NR)相关。来自CR的T细胞的基因 特征处于更加未刺激/未分化的状态。此外，记忆T细胞亚群在CR与NR 之间差异富集，其中CR与初始T细胞(TN)和T记忆干细胞(TSCM)显示相 似性。图3)显示了说明初始T细胞(TN)通过记忆T细胞子集阶段发展成效 应记忆T细胞(TEM)的示例性示意图。
与非应答者相比，CTL019疗法的完全应答者具有显著较高的CD8+T 细胞的百分比，所述细胞表达共刺激分子CD27但缺乏抗原经历的T细胞 标志CD45RO。在一个实施方案中，该区分的阈值是CD8+群体中的7％ CD27+CD45RO-细胞。在一个实施方案中，完全应答者被定义为CD8+群 体中7％或更多的CD27+CD45RO-细胞。不希望受特定理论的束缚， CTL019样品中记忆T细胞的状态可能是应答的主要成分(图3)。
这些数据表明，CR更像是静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，初始 CD4细胞，未刺激的记忆细胞和早期记忆T细胞，而NR更像是活化的 TEFF细胞，活化的TREG细胞，活化的TH1和TH2细胞，刺激的记忆细胞 和晚期T记忆细胞。
表1A:完全应答者(CR)与非应答者(NR)的比较
Figure BDA0003147962450002351
Figure BDA0003147962450002361
Figure BDA0003147962450002371
Figure BDA0003147962450002381
表1B:完全应答者(CR)与部分应答者(PR)的比较
Figure BDA0003147962450002382
Figure BDA0003147962450002391
实施例2:使用基因集分析和差异表达分析来鉴定预测慢性淋巴样白血 病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中受试者对CD19 CAR表达细胞疗 法的应答的新的转录基因特征
本实施例描述了根据本发明使用的预测CLL和ALL中患者对CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法(例如CTL019)的应答的新的转 录基因特征的鉴定。
特别地，本实施例描述了根据本发明使用的发现新基因特征的基因集 分析方法。
除此之外，本实施例描述了基于基因集分析的新基因特征，其预测了 患者对CD19CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法(例如，CTL019) 的应答。对实施例1中描述的基因集和来自三个附加数据集的基因集进行 基因集分析。图2A描绘了比较在全基因组CTL019RNAseq分析中分析 的样品数量的示例性直方图。p＝产品；a＝单采血液成分术。基因集来自(1) 基于Szabo等人(本文所述)的基因集的额外的实验；(2)由Abbas et al.在 GENOMERESEARCH 2005发表的基因集；和(3)Gattinoni等人在NATURE MEDICINE 2011发表的基因集。这些基因集中的每一个在下面进一步详细 描述。
在基因集分析中使用的Szabo等人基因集在表2中提供。从PBMC(来 自5个正常供体，男性，18-28岁，没有已知的变态反应或感染)纯化人 CD4+T细胞。分离CD4+CD25+(T reg)和CD4+CD25-(T效应)T细胞，并 用抗CD3/CD28刺激0或16小时，得到4个条件:(1)T reg 0小时；(2)T reg 16小时；(3)T效应子0小时；和(4)T效应子16小时。每个条件都得出两个 基因集:一组基因，其表达水平在该条件下相对于所有其他基因被上调和另 一组基因，其表达水平在该条件下相对于所有其他基因被下调。通过倍数 变化截断值确定每个基因集中的基因数(参见表2)。
表2:静息和活化时TREG和TEFF中上调或下调的基因组成的基因集 (Szabo数据集)
Figure BDA0003147962450002411
在0小时时与Teff相比较在Treg中下调的根据表2的示例性基因包 括ABCB1,ACSL6,ADAMTS10,ADD2,AIF1,AIF1,AIF1,AIF1,AK5, AKR1E2,ALS2CL,ANK3,ANKRD55,APBA2,AREG,ATHL1,AXIN2, B4GALNT4,BACH2,BCL7A,BEND5,BHLHE40,BPGM,C10orf47,C16orf54,C1orf228,C2orf89,CA6,CACHD1,CACNA1I,CCL5,CELA1, CHD7,CHI3L2,COL18A1,COL6A1,CR2,CYB561,CYSLTR1, D4S234E,DACT1,DENND5A,DHRS3,DLG4,DLL1,DPYSL4,DSC1,EDAR,EMR1,EMR4P,ENC1,EPHA1,FCGBP,FHIT,GADD45G, GIPC3,GIPC3,GPR125,GPR160,H1F0,HDGFRP3,HIPK2,IFITM5, KCNQ1,KLF5,KLHL29,KRT72,KRT73,LASS6,LRRC24,MAN1C1,ME3,MMP28,MTUS1,NBL1,NELL2,NEO1,NKG7,NLRP6,NME4, NOG,NOSIP,NPAS2,NRCAM,OBSCN,OSBPL5,PCSK5,PDZD4, PECAM1,PLLP,PLXDC1,PPFIBP2,PRKAR1B,PTK2,RHOB,RMRP,RNF157,SATB1,SCML4,SDK2,SEC14L2,SEC14L2,SLC15A3, SLC22A17,SLC22A23,SLC40A1,SNTB1,SORBS3,SOX8, ST6GALNAC1,TCF7,TCF7,THEMIS,TMIGD2,VIPR1,WNT10B, WNT7A,ZNF467,ZNF516,和ZNF609。
在16小时时与Teff相比较在Treg中下调的根据表2的示例性基因 包括IL2,TNFSF8,NELL2,G0S2,IRF8,IFNG,IGFBP4,GPR125,CD200, GPR81,ADD2,IL21,SNORD86,TMCC2,C1orf228,SLC15A3,IL22, LRRN3,GPR171,FASLG,GZMH,NHS,MCOLN2,BACH2,TAGAP,MPZL2,PRAGMIN,DACT1,CXCL10,SLAMF6,PHGDH,CSF2, PRSS23,UHRF1,PLAC8,ISM1,BTLA,CDC20,GFOD1,HSD11B1, ME3,ZNF704,DHRS3,CXCL13,CCND1,NBL1,CRTAM,MAP6D1, H1F0,CDT1,CCL4,LIF,CD84,TRAT1,MIR155,SLAMF7,AIF1,AIF1, AIF1,AIF1,PRG4,VWCE,CHEK1,SH2D4A,MCM10,RHOU,NPAS2, NFIX,STAP1,DTL,C16orf59,CSDA,GINS2,FAM117B,ABCB1,CLC, PHEX,GDF10,RAB13,BCL7A,MAMLD1,SHF,LPIN2,AHI1,CCND3, HDGFRP3,MIR155HG,PVR,CDCA5,RRAS2,SIPA1L2,RASL10B, GAL,SNORD88C,SNORD18B,CDC6,SRD5A3,ORC6L,B3GNT5, ANK3,MCM2,MIR25,RHOBTB3,TNF,TERT,CSDAP1,CCDC64, CDC25A,ZNF367,MCM7,CASP10,LTA,MCM4,AFF3,FMNL2, TNFRSF21,AXIN2,CHD7,FABP5,XRCC2,CGREF1,CCL4L1,CCL4L2,B4GALNT4,DSCC1,CD97,PTPRK,RAD54L,EPB41L3, MYO1B,ORC1L,CHML,ZWINT,MAD2L1,NDST1,C11orf82, BEGAIN,CD55,和FABP5L3。
在Teff中16小时对0小时下调的根据表2的示例性基因包括ABCA7, ABCG1,ABTB1,ACCS,ADAMTS10,ADD3,AK5,ALS2CL,AMT, ANKRD55,ANXA1,AQP3,AREG,ARL4C,ARRDC2,ARRDC3,BBC3, BCL9L,BIN2,BNIP3L,BTG1,BTN3A1,C10orf110,C11orf21,C11orf35,C14orf181,C16orf54,C16orf74,C17orf108,C1orf162,C1QTNF6, C20orf111,C20orf112,C5orf39,C5orf41,C5orf41,CACNA1I,CAPS, CBX4,CCNL1,CDC14A,CDC42BPG,CECR1,CFP,CHI3L2,CITED4, CLK1,CRIP2,CSGALNACT1,CTSF,CTSW,CXCR4,CYTH4,DCHS1, DDIT3,DDX60L,DISC1,DISC1,DISC1,DISC1,DPEP2,DPYD,DUSP1, DUSP8,EDAR,EMR4P,EPHA4,EPHX1,EPHX2,ERMN,ERP27, EVI2B,FAM13A,FAM13AOS,FAM46C,FAM65B,FBXO32,FHIT,FLT3LG,FOS,FOSB,FRAT1,FYB,GABARAPL1,GABARAPL3, GADD45B,GOLGA7B,GPA33,GPRASP1,GRASP,GSTM2,GZMA, GZMK,HBP1,HERPUD2,HIST1H1C,HIST1H3A,HPCAL4, HSD17B11,ID1,IDUA,IER2,IFI44,IL10RA,IL11RA,IRF2BP2,IRS2, ITGA6,JMY,JUN,JUNB,JUND,KCNQ1,KIAA1370,KIAA1683,KLF2, KLF3,KLF4,KLF5,KLF6,KLHL24,KLHL3,KLRB1,KRT72,KRT73,LIME1,LOC100128071,LOC100289511,LOC282997,LOC283070, LOC338799,LOC728392,LTBP3,MAL,MAP2K6,MDS2,MEGF6, MEGF6,MFGE8,MIR1909,MMP28,MOAP1,MXD4,MYADM,MYLIP,MYO15B,NFKBIZ,NLRC3,NLRP1,NOG,NR1D2,NR1D2, NR3C2,P2RY8,PBXIP1,PCSK5,PDE4D,PDZD4,PER1,PGAM2, PGCP,PHF1,PHF1,PIK3IP1,PIK3R5,PIM1,PION,PLCD1,PLCH2,PLCL1,PLEKHB1,PLK2,PLXDC1,PNRC1,PPP1R15A,ProSAPiP1, RAB37,RAP1GAP2,RARRES3,RASA3,RASGRP2,REM2,RGS1, RGS2,RNF125,SAMD3,SCML4,SEC31B,SIGIRR,SIK1,SLC2A3,SLC2A4RG,SLC2A4RG,SLC9A9,SLFN5,SMAD7,SMPD1,SNORA11, SORL1,SOX4,SULT1B1,SYNE1,SYTL1,TCEA3,TCF7,TCF7, TCP11L2,THEMIS,TMC8,TMEM63A,TMEM71,TMIGD2,TNFAIP3,TNNT3,TP53INP2,TPM2,TRANK1,TRIB2,TSC22D3,TSPAN18, TSPAN18,TSPAN32,TSSK3,TXK,TXNIP,UNC84B,UTRN,VIPR1, VSIG1,VSIG1,WHAMM,WNT10B,WNT7A,XAF1,XYLT1,XYLT1,YPEL2,YPEL3,YPEL5,ZBP1,ZBTB10,ZFP36,ZFP36L2,ZMAT1, ZNF331,和ZNF815。
在Treg v Teff中在16h FC时上调的根据表2的示例性基因包括 ZBTB32,LRRC32,STAMBPL1,SNX10,LOC389333,ZNF193,GCNT1, FAS,GK3P,NTRK1,FREQ,IL1R1,CRADD,GNA15,RAB33A,IL18R1, CX3CR1,TNFRSF1B,APOBEC3G,FOXP3,SEPT11,CD70,IL1RL1, NIPA1,PANX2,CHST2,NEDD9,ACOT9,PDGFA,MAST4,TNFRSF8, PHLPP1,IL2RB,CTLA4,SYTL3,ZC3H12C,PTPRJ,UBASH3B, METRNL,PRDM1,SEPT3,TNFRSF18,WNT10A,CCR8,C18orf1, CSF1,CD80,GALNT4,GALNT4,IL1RL2,ADPRH,ZNF282, APOBEC3C,HS3ST3B1,EPAS1,RBKS,KAT2B,C9orf167,TYMP, IL1RAP,C2CD4A,CD68,ABHD4,MICAL2,C6orf145,DUSP16,LRIG1, CASK,EPSTI1,TNFRSF12A,IGSF3,SPATS2L,SPATS2L,MAF,CD58, KLHDC7B,ZBTB38,LAYN,IL1R2,HIP1,ITGB8,ITGB8,IKZF2, LGMN,XIRP1,GPR19,SAMD9L,PRF1,JAKMIP1,MGC29506, ADAM8,HLF,COL9A2,NDRG1,SAMHD1,AKAP5,RNF213,RNF213, APAF1,STX1A,SSH1,SSH1,CCRL2,CCR6,CSF2RB,HAVCR2,KLF5, MX1,ACTA2,OAS3,EMP1,CTNNAL1,MGC12916,CCL17,FOSL2,SAT1,TRPV2,PRIC285,SOCS2,ETV7,TIGIT,RASAL1,OPTN, MGST2,GPR68,MYO1G,PTPLA,TNFRSF11A,ANXA2,IRF5, C14orf139,CAPN2,LFNG,IL12RB1,MYO1E,GLRX,DENND3,ANXA2P2,NQO1,C10orf128,ANTXR2,ANTXR2,SLC26A11,FLVCR2, PREX1,SLC2A8,CDKN2A,TMEM149,SYT11,TOX,TOX2,FUT7, ANXA2P1,FAM129B,DFNB31,TMPRSS6,IL1RN,ISG15,CDKN1B, FAM129A,TST,HDAC9,TMEM110,SMPD1,CDKN1A,C17orf67, ANXA2P3,MPST,IRF7,LMCD1,SNX24,HMOX1,ATP2B4,FCER2, HPGD,RASGRP4,FAM164A,IFI6,FAM110C,XKRX,PBX4,NTNG2, CST7,BASP1,C14orf49,GLIPR1,DHRS2,TWIST1,SPSB1,CYTH4, CADM1,ITIH4,LOC541471,CGA,LOC645166,PARP12,NINJ2, MICAL1,OAS1,HLA-DRB4,LGALS3,OASL,CORO2A,HLA-DRB3, KIAA1370,HERC6,STAC,MSC,CCR5,SUOX,RHOC,HLA-DQB2, PDE4A,LOC100302650,XAF1,FCRL3,RTKN2,GLIPR2,HLA-DRB1, IL13,P2RY10,IL10,CXCR6,LSP1,ACP5,SLC1A4,FXYD7,TRIB2, LMNA,HLA-DPA1,MEOX1,LGALS1,HLA-DRB5,IL10RA, HLA-DRA,CARD16,IL5,RGS1,HLA-DQA2,AKR1C3,IL4,HLA-DMA, GPR55,AQP3,MUSTN1,P2RY8,FANK1,IL9,CCNG2,ADAM12, LOC654342,IL17A,PPP2R2B,和FAM46C。
在Treg v Teff中在0h FC时上调的根据表2的示例性基因包括 C12orf75,SELPLG,SWAP70,RGS1,PRR11,SPATS2L,SPATS2L, TSHR,C14orf145,CASP8,SYT11,ACTN4,ANXA5,GLRX,HLA-DMB, PMCH,RAB11FIP1,IL32,FAM160B1,SHMT2,FRMD4B,CCR3,TNFRSF13B,NTNG2,CLDND1,BARD1,FCER1G,TYMS,ATP1B1, GJB6,FGL2,TK1,SLC2A8,CDKN2A,SKAP2,GPR55,CDCA7,S100A4, GDPD5,PMAIP1,ACOT9,CEP55,SGMS1,ADPRH,AKAP2,HDAC9,IKZF4,CARD17,VAV3,OBFC2A,ITGB1,CIITA,SETD7,HLA-DMA, CCR10,KIAA0101,SLC14A1,PTTG3P,DUSP10,FAM164A,PYHIN1, MYO1F,SLC1A4,MYBL2,PTTG1,RRM2,TP53INP1,CCR5,ST8SIA6, TOX,BFSP2,ITPRIPL1,NCAPH,HLA-DPB2,SYT4,NINJ2,FAM46C, CCR4,GBP5,C15orf53,LMCD1,MKI67,NUSAP1,PDE4A,E2F2,CD58, ARHGEF12,LOC100188949,FAS,HLA-DPB1,SELP,WEE1, HLA-DPA1,FCRL1,ICA1,CNTNAP1,OAS1,METTL7A,CCR6, HLA-DRB4,ANXA2P3,STAM,HLA-DQB2,LGALS1,ANXA2,PI16, DUSP4,LAYN,ANXA2P2,PTPLA,ANXA2P1,ZNF365,LAIR2, LOC541471,RASGRP4,BCAS1,UTS2,MIAT,PRDM1,SEMA3G, FAM129A,HPGD,NCF4,LGALS3,CEACAM4,JAKMIP1,TIGIT, HLA-DRA,IKZF2,HLA-DRB1,FANK1,RTKN2,TRIB1,FCRL3,和 FOXP3。
在Teff中在16小时对0小时上调的根据表2的示例性基因包括 AARS,ABCF2,ACOT7,ACTL6A,AHSA1,AIM2,AIMP2,ALAS1, ALDH1B1,ANKRD13B,APOL1,ARMCX3,ASPHD2,B3GNT5, B4GALT2,B4GALT5,BATF,BATF3,BCAT2,BCL2L1,BOP1,BTLA, BYSL,C11orf75,C15orf23,C15orf63,C16orf59,C17orf79,C17orf96, C1orf163,C3orf26,C4orf43,C8orf30A,C9orf64,CAD,CBR1,CCDC56, CCDC86,CCL20,CCL3,CCL3L1,CCL3L3,CCL4,CCL4L1,CCL4L2, CCNB1,CCND2,CCT3,CCT5,CCT6A,CCT7,CD109,CD200,CD274, CD3EAP,CD40LG,CD82,CDC20,CDC45L,CDC6,CDK4,CDT1, CENPM,CETN3,CHAC2,CHEK1,CISD1,CISH,CKS1B,COPB2, CORO1C,CSF2,CTNNA1,CTPS,CTTN,DARS2,DCAF12,DCTPP1, DHCR24,DKC1,DTL,E2F1,EBNA1BP2,ECE2,EDARADD,EEF1E1, EGR2,EIF2B3,EIF2S1,EIF5B,EIF6,ENO1,ESPL1,EXOSC3,EXOSC4, F5,F5,FABP5,FABP5L3,FADS1,FAM40B,FARSA,FASLG,FDPS,FKBP4,FKBP4,FOSL1,FREQ,G0S2,G3BP1,GALE,GAR1,GART, GEM,GEMIN6,GEMIN7,GFOD1,GINS1,GINS2,GLRX2,GNG8, GNPDA1,GPATCH4,GPN3,GPR171,GTF2H2D,HIVEP3,HMGCS1,HN1L,HNRNPAB,HSPD1,HSPE1,HYAL2,IARS,IER3,IFNG,IFRD2, IGFBP4,IL12RB2,IL15RA,IL17F,IL2,IL21,IL22,IL2RA,IL3,IRF4, IRF8,ISOC2,KCNK5,KEAP1,KIAA0020,KIAA0664,LAG3, LAPTM4B,LARP4,LIF,LOC286016,LOC344967,LOC442308, LOC728402,LRP8,LSM2,LTA,LYAR,MANF,MATK,MCM10, MCM2,MCM3,MCM4,METTL13,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MIR621,MPV17L2,MPZL2,MRM1,MRPL12,MRPL15,MRPL17, MRPL35,MRPL51,MRPS17,MRPS23,MRTO4,MTCH2,MTHFD1L, MTHFD2,MYOF,NAB2,NDFIP2,NDUFAF1,NFE2L3,NFKBIL2,NLN,NME1,NME1-NME2,NOLC1,NOP16,NPTX1,NT5DC2,NUDCD1, NUP43,NUP62,OTUD7B,PACSIN3,PAICS,PAK1IP1,PAM,PDCD1, PDCD2L,PDIA4,PDIA6,PEA15,PFAS,PFDN6,PFDN6,PFKM,PFKP,PGAM1,PGAM4,PHB,PHF6,PKM2,PLAGL2,PNPO,POLD2,POLE2, POLR3K,POP1,PPIL1,PPP1R14B,PRDX1,PRDX3,PRDX4,PRMT1, PRMT5,PRSS23,PSAT1,PSMA3,PSMA5,PSMA6,PSMB3,PSMB5, PSMD1,PSMD11,PSMD14,PTGFRN,PTMS,PTRH1,PTRH2,PUS7, PYCR1,PYCRL,RARS,RBBP8,RCC1,RPF2,RPP25,RRP1,RRP9, RUVBL1,RUVBL2,SAMD4A,SCD,SDC4,SECTM1,SEH1L,SEMA7A, SFT2D1,SFXN1,SH2D2A,SHF,SHMT2,SIPA1L2,SLAMF1,SLC1A5, SLC27A2,SLC27A4,SLC29A1,SLC38A5,SLC39A14,SLC43A3, SLC6A9,SLCO4A1,SNORA18,SNORD17,SORD,SPR,SQLE,SRM, SRXN1,STIP1,STT3A,TALDO1,TAP1,TBKBP1,TBL3,TBX21, TIMM8B,TIMM8B,TIPIN,TMCC2,TMEM165,TMEM194A, TMEM208,TMEM97,TNF,TNFAIP8L2,TNFRSF4,TNFRSF9,TNFSF14,TOMM40,TPI1,TRIP10,TRIP13,TTLL12,TUBA1B,TUBB, TUBB,TUBB,TUBG1,TXN,TXNDC5,UBE2T,UCK2,UGDH,UHRF1, UMPS,UTP6,VDAC1,VDR,WARS,WDR12,WDR18,WDR3,WDR4,WDR77,YIF1A,YWHAG,ZBED2,ZDHHC16,ZNF593,ZNF607,和 ZWINT。
在Treg中16h对0h Fc8上调的根据表2的示例性基因包括AARS, ACOT7,AGRN,AHSA1,AIM2,AIMP2,ALAS1,ALDH1B1,APOL1, APOL2,B4GALT2,BATF,BATF3,BCL2A1,BCL2L1,BOP1,BYSL, C17orf96,C2CD4A,C5orf32,C9orf64,CCDC86,CCL17,CCL20,CCT5, CD3EAP,CD40LG,CD68,CD7,CDK2AP2,CDK4,CHAC2,CHPF, CISD1,CISH,COPB2,CRIM1,CSF1,CTLA4,CTSL1,CTTN,DCTPP1, DHCR24,EBI3,EBNA1BP2,ECE2,EDARADD,EGR2,EMP1,ENO1, EPAS1,EXOSC4,FABP5,FAH,FAM40B,FARSA,FKBP4,FKBP4, FLT1,FLT1,FOSL1,FREQ,G6PD,GALE,GART,GCLM,GEM,GK, GNPDA1,GPR56,HIVEP3,HMGCS1,HMOX1,HN1L,HSPA1A, HSPA1B,HSPD1,HSPE1,HYAL2,IER3,IFRD2,IKBIP,IL10,IL12RB2, IL13,IL15RA,IL17A,IL1R1,IL1R2,IL1RL2,IL1RN,IL2RA,IL3,IL4, IL4I1,IL5,IL9,IRF4,KCNK5,LAG3,LAPTM4B,LIF,LOC344967, LOC389333,LOC442308,LRRC32,LRRC61,LTA,LYAR,MANF, MATK,METRNL,METTL13,MGC29506,MICAL2,MIR1182,MIR155, MIR155HG,MLEC,MRPL12,MRTO4,MTHFD1L,MYOF,NAB2, NDFIP2,NDUFAF1,NKG7,NLN,NME1,NME1-NME2,NOP16,NPM3, NUDCD1,PAICS,PANX2,PDCD1,PDGFA,PDIA4,PDIA6,PFAS, PGAM4,PHB,PNPO,POP1,PPIL1,PPPDE2,PRDX1,PRDX3,PRDX4, PRKAR1B,PRMT1,PRMT5,PSAT1,PSMB5,PSMD1,PSMD11, PTGFRN,PTRH1,PUS7,PYCR1,RASAL1,RBBP8,RCC1,SC4MOL, SCD,SDC4,SECTM1,SEH1L,SEMA7A,SETP11,SERPINE2,SERPINH1,SH2D2A,SLC16A13,SLC16A3,SLC1A5,SLC27A2, SLC27A4,SLC29A1,SLC38A5,SLC39A1,SLC39A14,SLC43A3, SLCO4A1,SOCS1,SPHK1,SPINT1,SQLE,SRM,SRXN1,STIP1,STT3A,TBKBP1,TBX21,TMPRSS6,TNF,TNFRSF11A,TNFRSF12A, TNFRSF18,TNFRSF1B,TNFRSF4,TNFRSF8,TNFRSF9,TNFSF14, TOMM40,TRIP10,TTLL12,TUBB,TUBB,TUBB,TXN,TYMP,UCK2, UGDH,VDR,VTRNA1-3,WARS,WDR12,WDR4,WDR77,XIRP1, YWHAG,ZBED2,ZBTB32,ZDHHC16,和ZNF282。
在16h时上调的TREG基因的示例性列表包括AIM2,ALAS1,BATF, C5orf32,CCL17,CD40LG,CHAC2,CSF1,CTSL1,EBNA1BP2, EDARADD,EMP1,EPAS1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GCLM, GK,GPR56,HMOX1,HSPD1,HSPE1,IKBIP,IL10,IL13,IL15RA, IL1RN,IL2RA,IL3,IL4,IL5,IL9,KCNK5,LTA,MANF,MIR1182, MIR155,MIR155HG,MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2, PANX2,PDIA6,PGAM4,PPIL1,PPPDE2,PRDX4,PRKAR1B,PSMD1, PSMD11,PUS7,RBBP8,SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SRXN1,STIP1, STT3A,TBX21,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,TNFRSF9,TXN, UCK2,VDR,VTRNA1-3,WDR12,YWHAG,ZDHHC16,和ZNF282。可 以例如通过测量所指定的基因的RNA水平来确定上调的表达。
在16h时上调的TEFF基因的示例性列表包括AIM2,ALAS1, B4GALT5,BATF,C3orf26,C4orf43,CCL3,CCL4,CCT3,CCT7, CD40LG,CHAC2,CSF2,CTNNA1,EBNA1BP2,EDARADD,EEF1E1, EIF2B3,EIF2S1,FABP5,FAM40B,FKBP4,FOSL1,GFOD1,GLRX2, HSPD1,HSPE1,IFNG,IL15RA,IL21,IL2RA,IL3,KCNK5,KIAA0020, LARP4,LRP8,LTA,MANF,MIR1182,MIR155,MIR155HG,MTCH2, MYOF,NDUFAF1,NLN,NME1,NME1-NME2,OTUD7B,PAM,PDIA6, PEA15,PFKM,PGAM1,PGAM4,PPIL1,PRDX4,PRSS23,PSMD1, PSMD11,PSMD14,PTRH2,PUS7,RBBP8,RPF2,RPP25,SFXN1, SLC27A2,SLC39A14,SLC43A3,SORD,SPR,SRXN1,STIP1,STT3A, TBX21,TMCC2,TMEM165,TNFRSF9,TXN,TXNDC5,UCK2,VDR, WDR12,YWHAG,和ZDHHC16。
Abbas基因集比较了17种免疫细胞类型的表达谱，并鉴定了相对于 其他细胞类型在特定细胞类型中唯一表达的基因。包括在基因集分析中的 选定的Abbas基因集列在表3中，并且包括初始和静息CD4+T细胞，初 始和静息CD8+T细胞，在12小时辅助Th1，在48小时辅助Th1，在12小 时辅助Th2，在48小时辅助Th2，记忆T静息(初始)细胞和记忆T活化细 胞。
表3:由基因上调或下调的静息和活化的T细胞亚型组成的基因集 (Abbas数据集)
Figure BDA0003147962450002491
Figure BDA0003147962450002501
Gattinoni基因集比较了各种CD8+记忆T细胞亚组的表达谱。具体来 说，从健康供体分离免疫细胞，并纯化以下CD8+T记忆子集:TN(初始)， TSCM(记忆干细胞)，TCM(中央记忆)，TEM(效应记忆)。通过比较所有成对的 组(例如TSCM对TN)和通过鉴定从TN→TSCM→TCM→TEM按顺序在四种 条件中逐步增加或减少的那些基因，定义了基因集。基因集分析中考虑的来自Gattinoni等人的选择的基因集在表4中列出。
表4:由基因上调或下调的静息和活化的T细胞亚型组成的基因集 (Gattinoni数据集)
Figure BDA0003147962450002502
评估每个基因集(例如ALL和CLL RNAseq基因集，Szabo基因集， Abbas基因集和Gattinoni基因集)，以下列方式确定其与受试者应答(即CR,PR或NR)的关联:计算每个受试者的元基因(meta-gene)，其中将受试 者j的元基因得分定义为
Figure BDA0003147962450002511
其中xij是对于给定基因集，受试者j中基因i的表达值n＝1,..,G；μ(x，j) 是受试者j中基因1,…,G的平均值；和σ(x，j)是受试者j中基因1,…,G的 标准差。
将3组统计模型应用于每个基因集，以确定元基因在CLL产物CR,PR 和NR之间是否在统计学上是不同的。图2B给出了说明该方法的示意图。 CR更像是静息的TEFF细胞，而NR更像是活化的TEFF细胞。CTL019 NR 样品比CR样品处于更活化的状态。被发现显著改变并预测患者对CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如CTL019)的应答的基因 集列于表5中。
表5:在CLL样品中富集的基因集
Figure BDA0003147962450002512
Figure BDA0003147962450002521
图3描绘了记忆T细胞前体和子集的示例性示意图。不希望受特定理 论的约束，CTL019样品中记忆T细胞的状态可能是应答的主要组成部分。
对于实施例1中所述的制造产品研究中的患者的一个子集，也在通过 单采血液成分术收集的T细胞上进行了全基因组RNAseq。在这14个单采 血液成分术样品(2个CR,3个PR和9个NRs)中评估了上述基因集。被发 现显著改变并预测患者对CTL019疗法的应答的基因集列于表5。
在7个ALL生产的产品CR样品和4个ALL单采血液成分术CR样 品上进行全基因组RNAseq。如上对于CLL样品所述，为ALL样品计算 每个基因集的元基因得分。在表6中列出了具有与产品和单采血液成分术 样品(ALL→CLL CR→CLL PR→CLL NR)中的预期应答模式相关的 元基因分数的基因集。表6中标有*的基因集也与单采血液成分术样品中的 应答相关。
表6:与产品ALL和CLL样品上应答相关的基因集(ALL→CLL CR →CLL PR→CLLNR)
Figure BDA0003147962450002522
Figure BDA0003147962450002531
例如，与TCM相比，发现TSCM中上调的基因组成的基因集的元基因 得分与单采血液成分术和产品样品中的应答相关，图4。来自健康供体样 品与制成品的元基因得分作为参考点被包含在该图中。x轴是应答组的样 品，其中a＝单采血液成分术和p＝产品。y轴是归一化的元基因表达得分。 在CLL CR(例如CTL019 CR)中富集的基因集也富集在急性淋巴细胞白血 病(ALLs)中。ALL和CLL CRs都富含T干细胞(TSCM)子集特异性基因， 而CLL PR和NRs富含T中心记忆(TCM)子集基因。在单采血液成分术中 可以看到与产品样品中相同的模式。ALL表达模式与CLL CR最相似， 并且在静息/未刺激/早期记忆T细胞的方向上甚至更加极端。
图5A描绘了CTL019样品的主要成分分析(PCA)的示例性结果。该示 例性PCA结果示出了CRs，ALL和正常样品与PR和NR分开聚类。图 5B描绘了来自CTL019和单采血液成分术样品的PCA的示例性结果。该 示例性PCA结果说明，CRs，ALL和正常样品与PRs和NRs以及与单采 血液成分术聚类分开聚类。
图6描绘了描述单采血液成分术和产品样品的免疫表型分型的示例性 示意图。
对分类为完全应答者(CR)，部分应答者(PR)，非应答者(NR)或待决的 生产的CTL019产品(例如，从CLL患者获得的基因工程化的表达CAR19 的T细胞)评估免疫检查点抑制剂分子，如PD-1，LAG3和TIM3的表达。
通过流式细胞术分析来自对CAR表达细胞疗法具有不同应答的CLL 患者的CD19CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如，制成品)，以 确定CD4+和CD8+T细胞的百分比。CD19 CAR表达细胞来自:应答CAR 表达细胞疗法(CR)的患者(n＝5)；部分应答CAR表达细胞疗法的患者(n＝ 8)，不应答CAR表达细胞疗法(NR)的患者(n＝19)；和待决，例如尚未分配到组(NA)的患者(n＝3)。根据本领域已知的流式细胞术分析的标准方法， 将细胞用特异性识别CD4，CD8，CAR19分子和免疫检测点分子PD-1， LAG3和TIM3的抗体以及与荧光素缀合的第二抗体进行标记。通过流式 细胞术分析软件确定每种标志例如CD4+，CD8+等的表达，并进一步分析 亚群(例如CD4+T细胞，CD8+T细胞或表达CAR19的T细胞)的免疫检查 点分子PD-1，LAG3和TIM3的表达。
使用上述方法和分析，确定每个应答组中每个患者的CD4表达细胞和 CD8表达细胞的百分比。如上所述，分析了来自CLL患者的36个制备的 CTL019样品，并且包括5个CR,8个PR,19NR和3个待决样品。图7A 描述了说明CD4+细胞百分比和患者应答的示例性结果。部分应答者显示 CD4+细胞的统计学显著性较高百分比。图7B描述了说明CD8+细胞百分 比和患者应答的示例性结果。完全应答者被显示具有统计学上显著大百分 比的CD8+细胞。
用于确定表面标志表达的流式细胞术谱图分析的实例示于图8A和8B。使用流式细胞术测定表达CD4+的细胞，并进一步分析CAR19和PD-1 表达，使得谱图的x轴表示CAR19表达(左上(Q5)和左下(Q8)象限显示 CAR19阴性CD4+细胞，而右上(Q6)和右下(Q7)象限显示表达CAR19的 CD4+细胞)，y轴显示PD-1表达(左下(Q8)和右(Q7)象限显示PD-1阴性 CD4+细胞，左上(Q5)和右(Q6)象限显示表达PD-1的CD4+细胞)。在来自 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)应答者的CD4+群体中，44.7％的 CD4+细胞总体表达PD-1，并且约22.3％的CAR19表达细胞为PD-1阳性， 而27.2％的CAR19表达细胞是PD-1阴性的(图8A)。相比之下，在非应答者的CD4+群体中，CAR19表达细胞总体显著减少(与CR中49.5％相比约 15.3％)，14.7％的CAR19表达细胞是PD-1阳性，而仅0.64％为PD-1阴 性的(图8B)。图8A和图8B中的谱图间的比较表明，与CAR表达细胞应 答者(约44.7％)相比，来自非应答者的高得多的百分比的CD4+细胞表达 PD-1(约92.9％)。
使用上述方法和分析，测定每个应答组中每个患者的CD4+群体和 CD8+群体的PD-1表达(PD-1+)细胞百分比。与应答CAR疗法(CR)的患者 相比，非应答者在CD4+(图8C)和CD8+(图8D)群体中显示具有更大百分 比的PD-1+细胞；CD4+和CD8+群体的平均PD-1百分比的增加是统计学显 著的。部分应答者(PR)在CD4+(图8C)和CD8+(图8D)群体中显示出比应 答者(CR)更高的PD-1+细胞百分比。
进行进一步分析以确定来自具有对CAR疗法的不同应答的患者的表 达PD-1，LAG3和TIM3的细胞的分布。CD4+群体中PD-1，LAG3和TIM3 表达的代表性细胞谱分析显示在图9和图10。首先分析细胞群体CAR19+ 表达。然后分析CAR19+群体的PD-1和LAG3表达(图9)或PD-1和TIM-3 表达(图10)。在来自CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)应答者的LAG3+ 群体中，36.1％的CAR19+细胞总体表达PD-1，约7.3％的LAG3表达细 胞为PD-1阳性，而5.9％的LAG3表达细胞为PD-1阴性(图9)。相比之下， 在来自非应答者的CAR19+群体中，LAG3表达细胞总体显著增加(与CR 中13.2％相比约69.7％)，67.3％的LAG3表达细胞为CAR19+阳性，只有2.41％为PD-1阴性(图9)。图9中CR和NR流式细胞术谱之间的比较显 示，与CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)应答者(约7.3％)相比，高 得多的百分比的来自非应答者的LAG3+细胞表达PD-1(约67.3％)。
使用上述方法和分析，确定每个应答组中每个患者的CAR19+群体的 PD-1和LAG-3表达(PD-1+/LAG-3+)细胞的百分比。与应答CAR疗法(CR) 的患者相比，非应答者在CAR19+群体中显示出更大百分比的 PD-1+/LAG-3+细胞(图9)；CAR19+群体的平均PD-1/LAG-3百分比的增 加是统计学显著的。在CAR19+(图9)群体中部分应答者(PR)表现出比应答 者(CR)更高的PD-1+/LAG-3+细胞百分比。在一个实施方案中，NR产物 表现出PD1+CAR+的耗尽表型和LAG3的共表达。
接下来，分析CAR19+群体的PD-1和TIM-3表达(图10)。在来自CAR 表达细胞(例如T细胞，NK细胞)应答者的TIM+群体中，28.5％的CAR19+ 细胞总体表达PD-1(图10)。相比之下，在来自非应答者的CAR19+群体中， TIM3+/PD1+细胞显著增加，83.3％的CAR19+表达细胞为 TIM3+/PD1+(图10)。
使用上述方法和分析，确定每个应答组中每个患者的CAR19+群体的 PD-1和TIM-3表达(PD-1+/TIM-3+)细胞的百分比。与应答CAR疗法(CR) 的那些相比，非应答者在CAR19+群体中显示出更大百分比的 PD-1+/TIM-3+细胞(图10)；CAR19+群体的平均PD-1/TIM-3百分比增加 是统计学显著的。在CAR19+(图10)群体中部分应答者(PR)表现出比应答 者(CR)更高的PD-1+/TIM-3+细胞百分比。在一个实施方案中，NR产物表 现出PD1+CAR+的耗尽表型和TIM3的共表达
使用流式细胞术测定表达CD4+和CD8+的细胞，进一步分析CD27+ 表达。使用上述方法和分析，为每个应答组中每个患者测定CD4+群体和 CD8+群体的CD27表达(CD27+)细胞百分比。与非应答者(NR)相比，完全 应答者(CR)和部分应答者(PR)在CD4+(图11中的左方小图)和CD8+(图11 中的右方小图)群体中显示出更大百分比的CD27+细胞；CD4+和CD8+群体平均CD27百分比的增加是统计学显著的。在CD4+(图11中的左方小 图)群体中部分应答者(PR)表现出比完全应答者(CR)更高百分比的CD27+ 细胞。在CD8+(图11中的右方小图)群体中，完全应答者(CR)表现出比部 分应答者(PR)更高百分比的CD27+细胞。在一个实施方案中，CAR产品 中的CD27水平与患者应答相关。在一个实施方案中，与PR和NR相比， CRsCD8+细胞显示更高百分比的CD27+细胞。
图12描绘了鉴定单采血液成分术样品中的应答相关性的示例性多色 流式细胞术分析结果。分析了来自CLL患者的26个单采血液成分术样品。 样品包括4例CR,6例PR,14例NR并且1例患者未输注。
图13描绘了示例性多色流式细胞术分析结果，其示出了较年轻的T 细胞表型与对CTL019疗法的应答之间的相关性。这些数据表明，CD27+ CD45RO-在CD8+T细胞中的百分比预测了哪些CLL患者将经历对 CTL019的完全应答。
图14描绘了在CTL019疗法之前人类患者中单采血液成分术的示例 性分析。示例性结果说明，虽然患者1000-00045呈现非常少的T细胞，但 是27％的T细胞是CD8+CD27+CD45RO-。
图15描绘了患者对CTL019疗法的应答(患者1000-00045)的示例性结 果。CD8+CD27+CD45RO-T细胞是患者对CTL019疗法应答的阳性预测 因子。这些示例性结果表明，单采血液成分术中良好的预后表型是高比例 的CD8+CD27+CD45RO-T细胞(年轻表型)。CTL019产物中的不良预后 表型是高百分比的PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞(耗尽的表型)。
将上述分析中的重要基因集细化为基因集内的基因亚组，其在ALL CR/CLL CR和CLL NR之间显著差异表达，并且遵循从ALL→CLL CR →CLL PR→CLL N的增加或减少的预期表达模式。显著差异表达的基 因的示例性列表列于表7A中。表7A是生物标志的示例性列表，所述标志 的表达值预测患者对CTL019疗法的应答。通过选择作为细胞表面标志的 基因，进一步精制表7A以产生流式细胞术生物标志基因小组。预测患者 对CTL019疗法的应答的示例性细胞表面基因如表8所示。
表7A:预测患者对CTL019疗法的应答的示例性基因
Figure BDA0003147962450002581
Figure BDA0003147962450002591
Figure BDA0003147962450002601
Figure BDA0003147962450002611
Figure BDA0003147962450002621
Figure BDA0003147962450002631
Figure BDA0003147962450002641
Figure BDA0003147962450002651
Figure BDA0003147962450002661
Figure BDA0003147962450002671
Figure BDA0003147962450002681
Figure BDA0003147962450002691
Figure BDA0003147962450002701
Figure BDA0003147962450002711
Figure BDA0003147962450002721
Figure BDA0003147962450002731
Figure BDA0003147962450002741
Figure BDA0003147962450002751
Figure BDA0003147962450002761
Figure BDA0003147962450002771
Figure BDA0003147962450002781
Figure BDA0003147962450002791
Figure BDA0003147962450002801
Figure BDA0003147962450002811
Figure BDA0003147962450002821
Figure BDA0003147962450002831
Figure BDA0003147962450002841
表7A中最重要的基因定义为具有1)ALL CR/CLL CR和CLL NR之 间大于2的绝对倍数变化和2)应答和表达相关性的p值小于0.01。在下表 7B中列出的三十四种基因符合这一标准，并在四个额外平台上测量这些基 因的表达，以比较和验证RNAseq的发现。这四个平台是OpenArray， Fluidigm，Nanostring和qPCR。该跨平台比较实验的结果证实了本文所述的结果和结论。表7B还指出相对于非应答者，完全应答者(CR)中每种 基因是否上调，或者相对于完全应答者在非应答者(NR)中是否上调。公开 各基因序列的示例性出版物也在表7B中给出，并且每个出版物通过引用 整体并入，包括其中的所有核酸和蛋白质序列。
表7B.从表7A中选择的基因
Figure BDA0003147962450002842
Figure BDA0003147962450002851
Figure BDA0003147962450002861
Figure BDA0003147962450002871
Figure BDA0003147962450002881
Figure BDA0003147962450002891
也评估了在Maus et al.(ANNU.REV.IMMUNOL.2014)中描述并且并未 纳入Gattinoni基因集的区分记忆T细胞亚群的细胞表面标志。除此之外， KLRG1被鉴定为一种基因，其在单采血液成分术样品中的表达从ALL→ CLL CR→CLL PR→CLL NR增加。KLRG1表达值预测患者对CTL019 疗法的应答。至少CD57，CD27，CD122和CD62L被鉴定为产品样品中的应答的生物标志。CD57，CD27，CD122和CD62L表达值预测患者对 CTL019疗法的应答。
在一个实施方案中，完全应答者(CR)基因特征包括表9中描述的一种 或多种生物标志谱。
表9:完全应答者对CAR19疗法的示例性生物标志谱
Figure BDA0003147962450002892
在一个实施方案中，非应答者(NR)基因特征包括表10中描述的一种 或多种生物标志谱。
表10:非应答者对CAR19疗法的示例性生物标志谱
Figure BDA0003147962450002893
Figure BDA0003147962450002901
基于生物学的理解，来自无偏的特征选择的基因、基因集和选择的目 的基因的组合可以用来进一步区分NR,PR,和CR。
以前描述的工作在35个CLL受试者样品的研究中得到了扩展。这组 35名受试者包括在先前的研究中的21名CLL受试者，总共5个CR,9个 PR和21个NR。在这项研究中收集并与对照珠过夜培养制造的CD19 CAR 表达细胞产物样品。已经鉴定出预测患者应答的基于mRNA表达水平的新 基因特征。CR对NR比较(N＝185)的基因列表于表18列出。
表18.CR与NR比较的基因列表
Figure BDA0003147962450002902
Figure BDA0003147962450002911
Figure BDA0003147962450002921
Figure BDA0003147962450002931
Figure BDA0003147962450002941
Figure BDA0003147962450002951
Figure BDA0003147962450002961
Figure BDA0003147962450002971
Figure BDA0003147962450002981
Figure BDA0003147962450002991
进行基因集分析以预测患者对CD19 CAR表达细胞疗法(例如 CTL019)的应答。对实施例1中描述的基因集，以及实施例2中描述的三 个附加数据集的基因集(Szabo等人，Abbas等人，以及Gattinoni等人)进 行基因集分析。评估每个基因集以确定其与受试者应答(即CR,PR或NR) 的关联，如实施例2所述。发现显著改变并预测患者对CD19 CAR表达细胞疗法(例如，CTL019)的应答的基因集列于表19。
表19.预测患者对CAR疗法的应答的基因集
基因集 来源 CRs NRs
Treg vs Teff 0h Szabo Teff 0h Treg 0h
Treg vs Teff 16h Szabo Teff 16h Treg 16h
Teff 16h vs 0h Szabo Teff 0h Teff 16h
Treg 16h vs 0h Szabo Treg 0h Treg 16h
初始CD4 vs 12h act Th2 Abbas 初始CD4 Th2
初始CD4 vs 48h act Th2 Abbas 初始CD4 Th2
初始CD4 vs 12h act Th1 Abbas 初始CD4 Th1
未刺激的对刺激的记忆 Abbas 未刺激的 刺激的
逐渐向下 Gattinoni 早期 晚期
将上述分析中的重要基因集细化为基因集中在CR和NR之间显著差 异表达的基因亚组。显著差异表达的基因的示例性列表列于表20中。表 20是生物标志的示例性列表，所述生物标志的表达值预测患者对CTL019 疗法的应答。通过设置更严格的FDR,可以将表20进一步细化为高置信度 生物标志的较小的列表。例如，使用0.10的FDR将导致265个基因的列 表，并且0.01的FDR将导致27个基因的列表。
表20.用于预测患者对CAR疗法的应答的示例性生物标志
Figure BDA0003147962450003001
Figure BDA0003147962450003011
Figure BDA0003147962450003021
Figure BDA0003147962450003031
Figure BDA0003147962450003041
Figure BDA0003147962450003051
Figure BDA0003147962450003061
Figure BDA0003147962450003071
Figure BDA0003147962450003081
Figure BDA0003147962450003091
Figure BDA0003147962450003101
Figure BDA0003147962450003111
Figure BDA0003147962450003121
Figure BDA0003147962450003131
Figure BDA0003147962450003141
Figure BDA0003147962450003151
Figure BDA0003147962450003161
Figure BDA0003147962450003171
Figure BDA0003147962450003181
Figure BDA0003147962450003191
Figure BDA0003147962450003201
Figure BDA0003147962450003211
Figure BDA0003147962450003221
Figure BDA0003147962450003231
Figure BDA0003147962450003241
Figure BDA0003147962450003251
Figure BDA0003147962450003261
Figure BDA0003147962450003271
Figure BDA0003147962450003281
Figure BDA0003147962450003291
Figure BDA0003147962450003301
Figure BDA0003147962450003311
Figure BDA0003147962450003321
Figure BDA0003147962450003331
Figure BDA0003147962450003341
Figure BDA0003147962450003351
实施例3:预后性的基于流式细胞术的测定法
开发预后性基于流式细胞术的测定法来筛选患有癌症的受试者(例如， 具有血液癌症，例如ALL和CLL的患者)用于CAR表达细胞(例如，T细 胞，NK细胞)疗法，例如如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如 CTL019疗法。在一些实施方案中，受试者正在参与临床试验。
从患者分离样品(例如，血液样品)，并进行基于荧光流式细胞术的测 定法，筛选实施例1和2中描述的一种或多种细胞表面或分泌的生物标志。 测量的标志的示例性列表包括但不限于表8中所列的基因，例如通过流式 细胞术(如果细胞表面表达)，或通过ELISA(如果是分泌的)测量所述标志， 并且其表达值预测患者对CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法，例 如本文描述的CD19 CAR表达细胞疗法，如CTL019疗法的应答。
表8:预测患者对CAR表达细胞疗法的应答的测量的示例性标志
Figure BDA0003147962450003352
Figure BDA0003147962450003361
Figure BDA0003147962450003371
实施例4:预测类成员资格的分类器
基于生物学理解，来自无偏特征选择的基因、基因集和所选感兴趣的 基因的组合用于进一步区分完全应答者与部分应答者和非应答者。在一个 实施方案中，来自无偏特征选择的基因、基因集和所选感兴趣的基因的组 合用于进一步区分复发者与非复发者。在一个实施方案中，基于所有基因 构建分类器以预测类成员资格。在一个实施方案中，类成员资格的预测进 一步区分了NR,PR和CR。在一个实施方案中，类成员资格的预测进一步 区分复发者与非复发者。备选地或另外，构建使用预定重要特征的子集的 分类器。重要特征包括但不限于富集的元基因，元基因中显著差异表达的 基因的子集，及其组合。
实施例5:预测CAR表达细胞效力的细胞因子表达特征
本实施例描述了预测在慢性淋巴样白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血 病(ALL)中，患者对CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如， CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法，例如CTL019疗法) 的应答的示例性细胞因子表达特征的鉴定，用于本发明。
除此之外，本实施例描述了新的细胞因子表达特征，其基于体外活化 后分泌的细胞因子谱来预测制备的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细 胞)细胞产物的效力。
在一个实施方案中，本文所述的新的细胞因子表达特征预测制备的 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物杀死靶肿瘤细胞的效力。
在一个实施方案中，本文所述的新的细胞因子表达特征与CLL中患 者对CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如CD19 CAR表达 细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法，例如CTL019 CAR表达细胞疗法)的应 答相关，以在输注患者之前改善CAR表达细胞产物。
在一个实施方案中，本文所述的新的细胞因子表达特征用于评估制造 的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物(例如CD19 CAR表达细 胞产物，例如CTL019产物)。在一个实施方案中，本文所述的新的细胞因 子表达特征提供了制造方法优化中的终点。
已经基于在重新输注之前制造的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)产物样品中的细胞因子蛋白表达水平鉴定了新的细胞因子表达特 征，其预测在慢性淋巴样白血病(CLL)中患者对CD19 CAR表达细胞(例 如，T细胞，NK细胞)疗法的应答。在从21个CLL受试者样品制备的制 成品样品的细胞因子蛋白质表达研究中发现了鉴定的特征。CLL受试者样 品(共21例)分层如下:CTL019制成品来源于6名CTL019疗法的完全应答 者(CR)患者，5名部分应答者(PR)患者，10名非应答者(NR)。使用13种 细胞因子的
Figure BDA0003147962450003392
小组发现了生产的产品中区分应答者和非应答者的 几种细胞因子表达特征。
在肿瘤细胞杀伤测定中评估来自21名CLL患者的CTL019制造产品 的效力。简言之，制造的CTL019产物在体外通过表达CD19的 K562(K562-19细胞)“活化”。不希望被特定理论束缚，表达CD19的K562 细胞(例如K562-19细胞)模拟CLL患者中白血病的表达CD19的B细胞。 工程化CTL019细胞以鉴定和杀伤在其细胞表面上表达CD19抗原的细胞， 并且K562-19细胞的CTL019介导的杀伤作为评估肿瘤细胞的CTL019介 导的杀伤效力的代理。
在CTL019产物激活后，使用细胞因子的
Figure BDA0003147962450003393
小组在共培养的 培养基中测量细胞因子蛋白表达谱。测量示例性细胞因子的表达谱，并且 CTL019细胞产物的效力与不同细胞因子的表达相关。在该分析中考虑的 示例性细胞因子在表14中提供。
表14:示例性细胞因子
Figure BDA0003147962450003391
Figure BDA0003147962450003401
然后使用多种数据分析方法发现新的细胞因子表达谱，所述方法包括 1)双聚类分析；和2)单变量分析。
从
Figure BDA0003147962450003402
测定法得到的细胞因子表达数据进行对数归一化，并进 行双重聚类分析(使用完全连锁方法进行分层聚类)。在刺激的CTL019产 物和CLL患者中细胞因子表达的双聚类分析产生四个主要聚类(截止距离 ≤1.0，导致如图17所示的4个聚类)，并鉴定了CR/PR和NR的不同亚组。 在刺激的CTL019产物和CLL患者中细胞因子表达的双重聚类的示例性 热图示于图17。令人惊讶的是，两个聚类(聚类1和聚类3)几乎完全由CR 和PR组成，而其他两个聚类(聚类2和聚类4)主要包含NR。平均来说， CRs/PRs对NRs中细胞因子表达水平较高(图17)。
接下来，进行使用ANOVA(方差分析)的3组单变量分析，其比较CR 与PR与NR。使用0.05的p值截断值确定统计学显著性。不同细胞因子 区别CRs，PRs和NRs的统计学显著性(例如，p值)列于表15中。
表15:使用ANOVA在3组单变量分析中不同细胞因子区分CRs，PR 和NRs的统计学显著性
Figure BDA0003147962450003403
Figure BDA0003147962450003411
单变量分析的3组模型鉴定了5种细胞因子，如IL-17a， CCL-20/MIP3a，IL-6，IL-2和TNFα，作为CLL患者中对CTL019疗法 应答的统计学显著标志(图18和表15)。在CLL患者中区分CRs，PR和 NRs的统计学显著细胞因子的对数归一化表达的示例性结果示于图18。
通过流式细胞术评估制造的CTL019产物以确定CAR+细胞的百分 比。在单变量分析的3组模型中鉴定的5种细胞因子进一步与制备的 CTL019产物每一种中CAR+细胞的百分比相关。表16中提供了细胞因子 表达(来自上文讨论的
Figure BDA0003147962450003413
小组)和CAR+细胞的百分比(通过流式细 胞术测定)的示例性相关系数和相应的p值。
表16:细胞因子表达和CAR+细胞百分比的相关系数和相应的p值
Figure BDA0003147962450003412
Figure BDA0003147962450003421
CTL019产物中CAR+细胞的百分比表示转导效率。在CLL中，收获 前水平下CAR+细胞的百分比区分应答者(例如完全应答者和部分应答者) 与非应答者(NR)。图21描绘了示例性散点图，其显示了在收获前完全应 答者(CR)(红色)，部分应答者(PR)(蓝色)和非应答者(NR)(红色)的CAR+细 胞百分比(即转导率)。在收获前测量转导效率并与受试者应答(例如CR,PR 或NR)相关。实线表示将大多数非应答者与应答者分开的15％转导效率。 不希望受到特定理论的束缚，这些数据表明，收获前CAR转导效率是CLL 中CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法的应答标志。
进行IL17a与CCL20细胞因子表达的相关性分析，并通过散点图分 析评估其与临床应答的关联。图19A示出了示例性散点图，其显示IL17A(y 轴)和CCL20(x轴)表达的对数归一化相关性，相关系数为0.928，相应p 值为1.36e-09。虚线表示将NR与CR/PR分离的分类边界。图19A中的每 个点代表CLL患者，交叉阴影(NR)，黑色(PR)和白色(CR)代表临床应答。图19A中的分类边界显示，IL-17a和CCL20的组合几乎分离了所有的NR 与CR/PR,并且PR又与CR分开聚类。其中，这些数据表明表16中列出 的一种或多种细胞因子的CAR+细胞表达预测临床应答。
令人惊讶的是，IL-17a和CCL-20的表达水平与CTL019产品中CAR+ 细胞的百分比(代表转导效率)不相关。不希望受特定理论的束缚，这些数 据表明IL-17a和CCL-20细胞因子表达水平在以几种方式制造的CAR表 达细胞(例如T细胞，NK细胞)(例如制造的CD19 CAR表达细胞产物)的 效力方面具有信息性(例如，预测应答)。首先，细胞因子特征与CLL中对CTL019 CAR表达细胞疗法的患者应答相关。因此，本文所述的细胞因子 特征可以用于在患者中输注之前改善和/或修饰CAR表达细胞(例如，T细 胞，NK细胞)产物(例如，CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019)，以 具有较高的临床疗效。其次，本文所述的细胞因子特征可用于评估制造的 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物，从而提供制造方法优化中 的终点。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征限定CAR表达细胞(例 如，T细胞，NK细胞)产物的效力。在一个实施方案中，本文所述的细胞 因子特征是对血液癌症(例如CLL或ALL)中的CAR表达细胞(例如T细 胞，NK细胞)产物的应答的标志。
在一个实施方案中，本文所述的细胞因子特征预测对CAR表达细胞 (例如T细胞，NK细胞)产物的受试者应答。
在一个实施方案中，表16中所述的细胞因子特征预测对CAR表达细 胞(例如，T细胞，NK细胞)产物的受试者应答。
在一个实施方案中，IL-17a和CCL-20表达水平预测对CAR表达细 胞(例如T细胞，NK细胞)产物的受试者应答。
实施例6:鉴定预测B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中对CD19 CAR表达细胞疗法的受试者复发的因子
本实施例描述了鉴定在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中预测对 CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法(例如，CTL019疗法) 的患者复发的转录基因特征，根据本发明使用。
其中，本实施例描述了基于CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK 细胞)治疗(例如，CTL019)(单采血液成分术或者骨髓)之前患者中或在重新 输注之前在制备的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物样 品(例如，CTL019)中所选基因的mRNA表达水平的新基因特征。在一个 实施方案中，本实施例描述了将B-ALL中CTL019疗法的复发者与B-ALL 中CTL019疗法的非复发者区别开的新基因特征。
本实施例描述了用于本发明的无偏特征选择以发现预测B-ALL中CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法(例如CTL019)的受试者 复发的新基因特征的方法。
本实施例还描述了根据本发明使用的发现新基因特征的基因集分析 方法。
鉴定了在重新输注之前基于制备的CD19 CAR表达细胞(例如，T细 胞，NK细胞)产物样品中的mRNA表达水平的新基因特征，其预测B细 胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞， NK细胞)疗法的受试者复发。在包括7个B-ALL受试者样品的制造的产 品样品的全基因组RNAseq研究中发现了鉴定的特征。B-ALL受试者样品 (共7个)分层如下：生物样品取自CTL019治疗后4个未复发的受试者(“非 复发者”)，CTL019治疗后3个复发的受试者(“复发者”)。发现了在制造 的产品样品中区分应答者和非应答者以及复发者和非复发者的几种基因 特征，并在下面进一步描述。
然后使用多种数据分析方法:1)无偏特征选择；2)基因集分析；和3)所选 择的感兴趣的基因的差异表达分析发现新的基因特征。
通过确定哪些基因在复发者与非复发者的2组比较之间差异表达，发 现了来自无偏特征选择的新基因特征，所述2组比较比较了3名复发者与 4名非复发者。如果差异表达在2组比较中具有统计学显著性并且FDR p 值截断值为0.25，则将基因定义为差异表达。复发者相对于非复发者比较 的基因列表(N＝17)列于表17中。应用两组统计模型来确定元基因在组间 是否有统计学差异，与图2B中所示的方法相似。图2B描绘了在完全应答 者(CR)，部分应答者(PR)和非应答者(NR)中活化的TEFF相对于静息TEFF细胞中上调的基因的示例性热图。
不希望受特定理论的限制，这些数据表明CD19 CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)产物(例如CTL019)中T细胞的分化状态与受试者应答(即 CR,PR或NR)相关，并预测B-ALL中CD19 CAR表达细胞(例如，T细 胞，NK细胞)治疗(例如CTL019治疗)的受试者复发。如实施例1所述， 完全应答者基因特征更像静息的TREG和TEFF细胞。除此之外，复发者的 基因特征(例如，CTL019治疗复发的完全应答者)含有在静息时在TREG相对于TEFF细胞中上调的基因。不希望受特定理论的约束，这些数据表明， B-ALL中CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗(例如CTL019)的 复发者与CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗(例如CTL019)非复发者相比具有更高水平的TREG。图21描绘了示例性结果，其示出了相对 于非复发者，TREG在复发者(R)中差异富集，例如，与完全应答者(CR)(例 如非复发者)相比，复发者表达高水平的TREG基因。公开各基因序列的示 例性出版物或序列号也在表17中给出，并且每个出版物通过引用整体(包 括其中的所有核酸和蛋白质序列)并入。
表17:预测CTL019治疗的患者复发的示例性基因
Figure BDA0003147962450003451
Figure BDA0003147962450003461
Figure BDA0003147962450003471
Figure BDA0003147962450003481
基因集分析产生了许多基因特征，其预测B-ALL中CTL019治疗的 受试者复发。以下基因在复发者中显示出升高的水平和非复发者中降低的 水平:MIR199A1,MIR1203,uc021ovp,ITM2C,和HLA-DQB1。以下基因 在复发者中显示出降低的水平和非复发者中升高的水平:PPIAL4D, TTTY10,TXLNG2P,MIR4650-1,KDM5D,USP9Y,PRKY,RPS4Y2, RPS4Y1,NCRNA00185,SULT1E1,和EIF1AY。
特别地，本实施例描述了根据本发明使用的发现新基因特征的基因集 分析方法。
除此之外，本实施例描述了基于基因集分析的新基因特征，其可预测 在B-ALL中CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗(例如 CTL019)的患者复发。对表17所示的基因集进行基因集分析，并用实施例 2中所述的基因集进行基因集分析，例如基因集来源于(1)基于Szabo等人 (本文所公开)的基因集的另外的实验；(2)由Abbas et al.in GenomeResearch 2005发表的基因集；和(3)Gattinoni et al.in Nature Medicine 2011公开的基因集。在实施例2中详细描述了Szabo，Abbas和Gattinoni 各自的基因集。由Szabo定义并在本分析中考虑的基因集列于实施例2的 表2中。由Abbas定义并在本分析中考虑的基因集列于实施例2的表3中。 由Gattinoni定义并在本分析中考虑的基因集列于实施例2的表4中。
评估各基因集(例如，B-ALL RNAseq基因集，Szabo基因集，Abbas 基因集和Gattinoni基因集)，以下列方式确定其与受试者应答(即，复发者 或非复发者)的关联:计算每个受试者的元基因，其中受试者j的元基因分 数定义为
Figure BDA0003147962450003491
其中xij是对于给定基因集，受试者j中基因i的表达值，n＝1,..,G；μ(x，j) 是受试者j中基因1,…,G的平均值；和σ(x，j)是受试者j中基因1,…,G的标 准差。
将2组统计模型应用于每个基因集，以确定元基因在复发者和非复发 者的所制备的CTL019产物之间是否是统计学上不同的。阐明该方法的示 意图在图2B给出。在Szabo，Abbas和Gattinoni基因集中，有一个在复 发者和非复发者之间显著差异富集的基因集。该基因集来自Szabo系列， 并且包含TREG相对于TEFF细胞在静息时上调的基因，并与CTL019治疗 的患者复发相关。具体来说，该基因集被发现富集于复发者，表明复发者 与非复发者相比具有较高水平的TREGS。例如，与TEFF细胞相比，由TREG中上调的基因组成的基因集的元基因得分与产品样品中的患者复发相关 (参见图20)。图20描绘了示例性结果(p＝0.000215)，其阐述与非复发者， 完全应答者(CR)相比，TREG基因在复发者(R)中具有高表达水平。x轴是应 答组的样品，其中CR＝完全应答者，R＝复发者。y轴是归一化的元基因 表达得分。
在一个实施方案中，本文所述的基因特征用于使制造的产品改进，从 而降低患者复发的可能性。在一个实施方案中，本文所述的基因特征用于 修饰制成品的治疗应用，从而降低患者复发的可能性。
在一个实施方案中，本文所述的基因特征在CAR表达细胞(例如，T 细胞，NK细胞)治疗(例如，CD19 CAR表达细胞治疗，例如CTL019治 疗)之前在受试者中鉴定，其预测CAR表达细胞(如T细胞，NK细胞)治 疗的复发。在一个实施方案中，本文所述的基因特征在单采血液成分术样 品中鉴定。在一个实施方案中，本文所述的基因特征在骨髓样品中被鉴定。 在一个实施方案中，本文所述的基因特征在制备的CAR表达细胞(例如， T细胞，NK细胞)产物(例如CD19 CAR表达细胞产物，例如CTL019)中 在输注前鉴定。
不希望受特定理论的束缚，这些数据表明，在单采血液成分术前或在 制备CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产品期间降低患者中的TREG特征显著降低了患者复发的风险。
实施例7:注入患者的CD27+PD1-CART细胞数量预测对疗法的应答
为29名CLL患者(8名完全应答者和21名非应答者)确定了CTL019 输注产品中CD27+PD1-细胞数。输注的CD27+PD1-CART细胞数和治疗 应答之间的关系如图22中的条形图和图23中的散点图所示。每个患者的 阈值设置为1x107个CART细胞。在完全应答者和非应答者之间观察到统 计学显著差异(p<0.0001)。该实验表明CLL患者对CART19免疫疗法的完全缓解与较高数目的输注的CD27+PD1-CART细胞相关。
等同方案
通过考虑本文公开的本发明的说明书或实践，本发明的其它实施方案 对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经参考具体方面公开了本发 明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本 领域技术人员可以设计出本发明的其它方面和变型。所附权利要求旨在被 解释为包括所有这些方面和等同变型。
序列表
<110> 诺华股份有限公司
宾夕法尼亚大学托管会
DORFMEIER, CORIN
WILCOX, NICHOLAS
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<160> 103
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 1
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
寡核苷酸"
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ccc 63
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 4
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 5
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 6
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 7
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 7
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<211> 282
<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 8
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
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Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
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Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 9
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 9
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 11
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 12
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 13
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 14
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 15
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 15
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 16
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 16
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 17
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 17
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 19
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 23
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30
<210> 24
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 25
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 26
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 27
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 28
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> /注释="This sequence may encompass 1-10 repeating "Gly Gly
Gly Ser" units"
<400> 28
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 31
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 32
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 32
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000
<210> 33
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 33
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150
<210> 34
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> /注释="该序列可以包含50-5000个核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /注释="取代和优选实施方案的详述见提交的说明书"
<400> 34
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 35
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100
<210> 36
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 36
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980
tttttttttt tttttttttt 5000
<210> 37
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 37
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaa 64
<210> 38
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 38
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400
<210> 39
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 39
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
145 150 155 160
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 40
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 40
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro
20 25 30
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
35 40 45
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
85 90 95
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
100 105 110
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
115 120 125
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
130 135 140
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
145 150 155 160
Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala
165 170 175
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
180 185 190
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
195 200 205
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
210 215 220
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
225 230 235 240
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
245 250 255
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
260 265 270
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
275 280 285
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
305 310 315 320
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
325 330 335
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
340 345 350
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
355 360 365
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
370 375 380
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385 390
<210> 41
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 41
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195 200 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210 215 220
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
225 230 235 240
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260 265 270
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275 280 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290 295 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325 330 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
340 345 350
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355 360 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 42
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 42
atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga 60
ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg 120
gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc 180
tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc 240
gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa 300
ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg 360
acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420
gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480
cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540
actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600
gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660
gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720
aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780
accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840
gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900
cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960
cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020
tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080
gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140
gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182
<210> 43
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 43
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
145 150 155 160
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
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Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
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Gln Phe Gln Thr Leu Val
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 45
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
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<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
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Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
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Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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多肽"
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
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Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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多肽"
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
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245
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多肽"
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Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
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Ser Ser
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多肽"
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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多肽"
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多肽"
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多肽"
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<221> 来源
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多核苷酸"
<400> 55
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
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gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
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tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
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caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 56
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
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Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
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His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
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<212> DNA
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<220>
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多核苷酸"
<400> 57
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cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
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gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
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cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
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多肽"
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20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser
165 170 175
Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn
195 200 205
Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn
210 215 220
Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 76
atggctctgc ccgtgaccgc actcctcctg ccactggctc tgctgcttca cgccgctcgc 60
ccacaagtcc agcttcaaga atcagggcct ggtctggtga agccatctga gactctgtcc 120
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cctcccggaa agggactgga gtggatcgga gtgatttggg gtagcgaaac cacttactat 240
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ctcaagctct catcagtcac cgccgctgac accgccgtgt attactgtgc caagcattac 360
tactatggag ggtcctacgc catggactac tggggccagg gaactctggt cactgtgtca 420
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agcgaaatcg tgatgaccca gagccctgca accctgtccc tttctcccgg ggaacgggct 540
accctttctt gtcgggcatc acaagatatc tcaaaatacc tcaattggta tcaacagaag 600
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gcacgcttta gcgggtctgg aagcgggacc gactacactc tgaccatctc atctctccag 720
cccgaggact tcgccgtcta cttctgccag cagggtaaca ccctgccgta caccttcggc 780
cagggcacca agcttgagat caaaaccact actcccgctc caaggccacc cacccctgcc 840
ccgaccatcg cctctcagcc gctttccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 900
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg 960
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 1020
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<210> 77
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 77
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
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Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
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Asn Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys
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Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys
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Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro
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275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
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Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
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Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
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Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
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Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
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Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
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His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 78
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 78
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 79
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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<221> 来源
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多核苷酸"
<400> 80
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多肽"
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690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 83
<211> 4027
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 60
cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 120
tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 180
gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 240
cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 300
cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 360
cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 420
acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 480
gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 540
tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 600
ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 660
cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 720
ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 780
ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 840
cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 900
ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 960
agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1020
ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1080
ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1140
agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1200
tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1260
agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1320
cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1380
acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1440
acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1500
acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1560
agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1620
ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1680
ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1740
atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1800
gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1860
cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1920
gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1980
ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2040
tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2100
gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2160
cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2220
aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2280
gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2340
acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2400
agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2460
gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2520
gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2580
gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2640
tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2700
ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2760
agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2820
tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2880
tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2940
gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3000
gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3060
acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3120
atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3180
tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3240
ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3300
tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3360
agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3420
cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3480
agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3540
ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3600
gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3660
tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3720
agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3780
cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3840
caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3900
gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3960
ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaa 4027
<210> 84
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 84
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys
130 135 140
Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Phe Phe Phe Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg Arg Ser
<210> 85
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 85
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys
130 135 140
Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Phe Phe Phe Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg Arg Ser Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
245 250 255
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
260 265 270
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
275 280 285
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
290 295 300
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
305 310 315 320
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
325 330 335
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
340 345 350
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
355 360 365
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
370 375 380
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
385 390 395 400
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
405 410 415
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
420 425 430
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
435 440 445
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 86
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Glu
245
<210> 87
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
260 265 270
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
275 280 285
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
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Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Glu Glu Glu
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Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
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Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
340 345 350
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
355 360 365
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
385 390 395 400
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
405 410 415
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
420 425 430
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu
435
<210> 88
<211> 819
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
260 265 270
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
275 280 285
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
290 295 300
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Glu Glu Glu
305 310 315 320
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
325 330 335
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
340 345 350
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
355 360 365
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
385 390 395 400
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
405 410 415
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
420 425 430
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser
435 440 445
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu
450 455 460
Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe
465 470 475 480
Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
485 490 495
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
500 505 510
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
515 520 525
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
580 585 590
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
595 600 605
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
610 615 620
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
625 630 635 640
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
645 650 655
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
660 665 670
Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp
675 680 685
Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser
690 695 700
Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys
755 760 765
His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
770 775 780
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly
785 790 795 800
Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly
805 810 815
Leu Phe Met
<210> 89
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 90
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro
245 250 255
Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
260 265 270
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 91
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
肽"
<400> 91
Arg Gly Asp Ser
1
<210> 92
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 92
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr
35 40 45
Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg
50 55 60
Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile
100 105 110
Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu
115 120 125
Glu Thr Ser Tyr
130
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 93
Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys
1 5 10 15
Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly
20 25 30
Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met
35 40 45
Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln
50 55 60
Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu
85 90 95
Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser
100 105
<210> 94
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 94
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 95
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 95
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 96
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 96
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 97
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 97
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 98
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> 任何氨基酸
<400> 98
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 99
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 99
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 100
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列描述: 合成的
多肽"
<400> 100
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 101
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
cccggatggt ttctggactc tccggatcgc ccgtggaatc ccccaacctt ctcaccggca 60
ctcttggttg tgactgaggg cgataatgcg accttcacgt gctcgttctc caacacctcc 120
gaatcattcg tgctgaactg gtaccgcatg agcccgtcaa accagaccga caagctcgcc 180
gcgtttccgg aagatcggtc gcaaccggga caggattgtc ggttccgcgt gactcaactg 240
ccgaatggca gagacttcca catgagcgtg gtccgcgcta ggcgaaacga ctccgggacc 300
tacctgtgcg gagccatctc gctggcgcct aaggcccaaa tcaaagagag cttgagggcc 360
gaactgagag tgaccgagcg cagagctgag gtgccaactg cacatccatc cccatcgcct 420
cggcctgcgg ggcagtttca gaccctggtc 450
<210> 102
<211> 785
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
actataaaga cagtgaaaag atcagtggtt atctttgcag acgccaccat cgctgtgagc 60
cctgtactat cagccatggt caactccgtc gtcttttttg aaatcaccag ggatggcaag 120
cccttgggcc gcatctccat caaactgttt gcagacaaga ttccaaagac agcagaaaac 180
tttcgtgctc tgagcactgg agagaaagga tttcgttata agggttcctg ctttcacaga 240
attattccag ggtttatgtg tcagggtggt gacttcacac gccctaatgg caccggtgac 300
aagtccatct atggggagaa atttgatgat gagaacctca tccgaaagca tacaggttct 360
ggcatcttgt ccatggcaaa tgctggaccc aacacaaatg gttcccagtt tttcatctgc 420
gctgccaaga ctgagtggtt ggatggcaag catgtggcgt ttggcaaggt gaaagaacgt 480
gtgaatattg tggaagccac ggagcacttt gggtacagga atagcaagac cagcaagaag 540
atcaccattg ctgactgtgg acaattctaa tgagtttgac ttgtgtttta ttttcaccac 600
cagacccatt ccttctgtag ctcaggagag cacccctcca ccacatttgc ttgcaatatc 660
ctagaatctt tgtgctcttg ctgcagttcc ctttgggttc catgttttcc ttgttccctt 720
ccatgcctag ctggattgca gagttgagtt aagtttatga ttatgaaata aaaactaagt 780
aacaa 785
<210> 103
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人
<400> 103
tatggccata ccaccctgaa tgcacccaat cttgtctgat cttagaagct aagcagggtt 60
aggcctgtta gtacttggat gggagaaaaa tgatatttgc aggaaaactg gtaaagatca 120
gat 123

Claims (64)

1.评估患有癌症的受试者，例如评估或监测患有癌症的受试者中CAR表达细胞疗法的有效性的方法，其包括:
为所述受试者获得对包含CAR表达细胞群体(例如，CAR19表达细胞群体)的疗法的应答者或者复发者状态的值，其中所述应答者或复发者状态的值包括测量以下一项，两项，三项，四项，五项，六项，七项，或更多(全部)项:
(i)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品,例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)，其中细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)；
(vii)制造的CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量,
其中所述值表示受试者对CAR表达细胞疗法的应答性或复发状态，从而评估所述受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括进行以下的一项，二项，三项，四项，五项，六项，七项或更多项(例如全部):
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者，或复发者或非复发者；
施用CAR表达细胞疗法；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
对例如非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞疗法组合的额外的活性剂，例如检查点抑制剂，例如例如本文所述的检查点抑制剂；
在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增加受试者中较年轻T细胞数量的疗法；
例如，对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，改变CAR表达细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或增加转导效率；
在注入患者体内之前，修饰CAR表达细胞产物；
调整CAR表达细胞输注剂量以实现临床疗效；
例如对于非应答者或部分应答者或复发者，施用替代疗法；
例如对于非应答者或部分应答者，施用替代疗法，例如特定癌症类型的护理标准；或
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，例如通过CD25消耗，施用环磷酰胺，抗GITR抗体，mTOR抑制剂或其组合，减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
3.一种CAR表达细胞疗法，用于治疗已被鉴定为对包含CAR表达细胞群体(例如，表达CAR19的细胞群体)的疗法应答的受试者(例如，被鉴定为完全应答者，部分应答者或非复发者)，其中所述鉴定包括以下的一项，二项，三项，四项，五项，六项，七项或更多项(全部)的度量:
(i)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δ细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品,例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)，其中所述细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)；或
(vii)制造的CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量。
4.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括:
如果受试者被鉴定为应答包含CAR表达细胞群体(例如，表达CAR19的细胞群体)的疗法(例如，被鉴定为完全应答者，部分应答者或非复发者)，则向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法，其中所述鉴定包括以下的一种，二种，三种，四种，五种，六种，七种或更多种(全部)的度量:
(i)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δ细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品,例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)，其中所述细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种或更多(或全部)；或
(vii)制造的CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量,
从而治疗所述受试者。
5.一种治疗受试者中的癌症的方法，包括:
为所述受试者获得对于包含CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)的疗法的应答者或复发者状态的值，其中所述应答者或复发者状态的值包括以下一项，二项，三项，四项，五项，六项，七项，或更多项(全部)的度量:
(i)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δ细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品,例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)，其中所述细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)；或
(vii)制造的CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量,和
响应于所述值，进行以下的一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个(例如全部):
将受试者鉴定为完全应答者，部分应答者或非应答者，或复发者或非复发者；
例如对应答者或非复发者施用CAR表达细胞疗法；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
对例如非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞疗法组合的额外的活性剂，例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂；
在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增加受试者中较年轻T细胞或初始T细胞数量的疗法；
例如，对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，改变CAR表达细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞或初始T细胞，或增加转导效率；
例如对于非应答者或部分应答者或复发者，施用替代疗法，例如特定癌症类型的护理标准；或
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，例如通过消耗CD25或施用环磷酰胺，抗GITR抗体，mTOR抑制剂或其组合，减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述CAR表达细胞疗法包含多个CAR表达免疫效应细胞。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述CAR表达细胞疗法是CAR19疗法(例如，CTL019疗法)。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述(i)-(viii)中一个或多个的度量从获自所述受试者的单采血液成分术样品中获得，其中任选地在输注或再输注前对所述单采血液成分术样品进行评估。
9.权利要求1-7中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述(i)-(viii)中的一个或多个的度量从制造的CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如CTL019)获得，其中任选地在输注或再输注前对所述制造的CAR表达细胞产物进行评估。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中在接受CAR表达细胞疗法之前，期间或之后评估所述受试者。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述癌症是血液癌症。
12.权利要求11的方法或用于所述方法的组合物，其中所述血液癌症是ALL或CLL。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述受试者是人类患者。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其进一步包括基于(i)-(viii)中的一个或多个的度量将所述受试者鉴定为应答者(例如，完全或部分应答者)，非应答者，复发者或非复发者。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中(i)-(viii)中的一个或多个的度量评估基因表达，流式细胞术或蛋白质表达中的一种或多种的谱。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中使用指示样品中CD8+T细胞百分比的谱或特征来评估CD8+T细胞的水平或活性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中使用指示样品中CD27+CD45RO-免疫效应细胞百分比的谱图或特征来评估CD27+CD45RO-免疫效应细胞的水平或活性。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中根据表1A，1B，3，4，5，6，7A，7B或图2B中列出的一种，二种，三种，四种，五种，十种，二十种，五十种，六十种，七十种，一百种或更多种的谱或基因特征评估水平或活性。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述生物标志是表8中列出的分泌的或细胞表面生物标志。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中应答者(例如，完全应答者)具有或被鉴定为与非应答者相比具有GZMK，PPF1BP2或初始T细胞的一种，两种或更多种(全部)的更高水平或活性。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与应答者相比，非应答者具有或被鉴定为具有IL22,IL-2RA,IL-21,IRF8,IL8,CCL17,CCL22,效应T细胞或调节性T细胞的一种，二种，三种，四种，五种，六种，七种或更多种(例如，全部)的更高水平或活性。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与参考值，例如非应答者CD8+T细胞的百分比相比，完全应答者具有或被鉴定为具有更大，例如，统计学显著更大百分比的CD8+T细胞。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与参考值，例如非应答者CD27+CD45RO-免疫效应细胞的数目相比，完全应答者具有或被鉴定为例如，在CD8+群体中具有更大百分比(例如7％或更多数目)的CD27+CD45RO-免疫效应细胞。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与参考值，例如非应答者CD4+T细胞的百分比相比，完全应答者或部分应答者具有或被鉴定为具有更大，例如，统计学上显著更大百分比的CD4+T细胞。
25.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与参考值(例如，非应答者静息TEFF细胞，静息TEFF细胞，静息TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞)，早期记忆T细胞数目相比，完全应答者具有或被鉴定为具有更大百分比的一种，两种，三种或更多(例如全部)静息TEFF细胞，静息TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞，或γ/δ细胞)或早期记忆T细胞或其组合。
26.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中与参考值，例如，应答者活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)，晚期记忆T细胞数目相比，非应答者具有或被鉴定为具有更高百分比的一种，两种，三种或更多种(例如全部)活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)，晚期记忆T细胞或其组合。
27.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中非应答者具有或被鉴定为具有:
与来自应答者的PD-1或LAG-3表达免疫效应细胞的百分比相比，更高百分比的表达PD-1或LAG-3的免疫效应细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)(例如，表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+T细胞)，或与CAR 表达细胞疗法的应答者(例如，完全应答者)相比，在CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中更高百分比的PD-1+/LAG-3+细胞，
CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中PD1+CAR+的耗尽表型和LAG3的共表达，或
与应答者(例如，完全应答者)相比，CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中更高百分比的PD-1+/TIM-3+细胞。
28.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中部分应答者具有或被鉴定为具有比CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中的应答者更高百分比的PD-1+/LAG-3+细胞，或
比CAR表达细胞群体(例如，CAR19+细胞群体)中的应答者更高百分比的PD-1+/TIM-3+细胞。
29.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中单采血液成分术样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是对CAR表达细胞疗法(例如CAR19疗法(例如CTL019疗法))的受试者应答的阳性预测子。
30.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中单采血液成分术样品中高百分比的PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞是对CAR表达细胞疗法(例如CAR19疗法(例如CTL019疗法))的受试者应答的不良预后预测子。
31.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中CAR19疗法的应答者(例如，完全应答者)具有或被鉴定为具有表9的生物标志谱。
32.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中CAR19疗法的非应答者具有或被鉴定为具有包含一种或多种PD-1+免疫效应细胞，TIM-3+免疫效应细胞，LAG-3+免疫效应细胞，KLRG1+免疫效应细胞，CD27-免疫效应细胞，活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，活化的TH1，活化的TH2细胞，刺激的记忆细胞或晚期T记忆细胞，或其组合的生物标志。
33.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中CAR19疗法的非应答者具有或被鉴定为具有表10的生物标志谱。
34.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中KLRG1，CD57，CD27，CD122或CD62L的一种，两种，三种，四种或更多种(全部)的基因表达预示着患者对CTL019疗法的应答。
35.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中复发者具有或被鉴定为具有C5orf32,CCL17,CSF1,CTSL1,EMP1,EPAS1,GCLM,GK,GPR56,HMOX1,IKBIP,IL10,IL13,IL1RN,IL4,IL5,IL9,MIR155,PANX2,PGAM4,PRKAR1B,TNFRSF11A,TNFRSF1B,TNFRSF8,VTRNA1-3,或ZNF282的一种，二种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种，十种或更多种的升高的水平。
36.根据权利要求1-20中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述应答者(例如，完全或部分应答者)具有以下谱中的一个，两个，三个或更多个(或全部):
(i)与参考值，例如CD27+免疫效应细胞的非应答者数目相比，具有更多数目的CD27+免疫效应细胞；
(ii)与参考值，例如CD8+T细胞的非应答者数目相比，具有更多数目的CD8+T细胞；
(iii)与参考值，例如，表达一种或多种检查点抑制剂的细胞的非应答数目相比，具有较少数目的表达一种或多种检查点抑制剂，例如选自PD-1，LAG-3，TIM-3或KLRG-1或组合的检查点抑制剂的细胞；或
(iv)与参考值，例如，静息TEFF细胞，静息TREG细胞，初始CD4细胞，未刺激的记忆细胞或早期记忆T细胞的非应答者数目相比，具有更多数目的一种，两种，三种或更多种(全部)静息TEFF细胞，静息TREG细胞，更年轻的细胞或早期记忆T细胞或其组合。
37.根据权利要求1-13或15中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中(vi)的细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a,IL17A,IL6,GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα或其组合的一种，二种，三种，四种，五种，六种，七种，八种或更多种(或全部)。
38.根据权利要求1-13或15中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中(vii)中15％或更高的转导效率指示增加的应答性或减少的复发。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述应答者或复发者状态的值包括具有表1A，1B，17,18或20中列出的FDR p-值低于0.1或0.01的生物标志的一种，二种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种(例如，所有)的水平或活性的度量。
40.一种评估CAR表达细胞产物，例如CAR19表达细胞产物样品(例如,CTL019)的效力的方法，所述方法包括:
获取以下的一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个或更多个(例如全部)的值:
(i)CAR表达细胞产物中，例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)CAR表达细胞产物中静息TEFF细胞，静息TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)CAR表达细胞产物中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)CAR表达细胞产物中免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分)，其中所述细胞因子选自一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)表16中列出的细胞因子；
(vii)产物中CAR表达细胞的转导效率；
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如，大于或等于1x 107个的量；或
(ix)TREG细胞或细胞群体的水平或活性；
其中(i),(ii),(vi),(vii),(viii)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的增加的效力，
其中(iii),(iv),(ix)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的降低的效力。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞因子选自CCL20/MIP3a,IL17A,IL6,GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα或其组合的一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种或更多种(或全部)。
42.权利要求40的方法，其中15％或更高的转导效率指示增加的效力。
43.一种优化CAR表达细胞产物，例如CAR19表达细胞产物样品(例如CTL019))的制造的方法，包括:
(1)获得包含CAR表达细胞(例如，CAR表达免疫效应细胞群体)的样品；
(2)体外活化CAR表达细胞；
(3)通过确定以下的一项，二项，三项，四项，五项，六项，七项，八项或更多项(例如全部)，评估活化的CAR表达细胞的效力:
(i)CAR表达细胞产物中，例如CD4+或CD8+T细胞群体中CD27和/或CD45RO-(例如CD27+CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)CAR表达细胞产物中静息TEFF细胞，静息TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)CAR表达细胞产物中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老的T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)CAR表达细胞产物中免疫细胞耗尽标志，例如，一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如CTL019)中的细胞因子水平或活性，其中所述细胞因子选自一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)表16中列出的细胞因子；
(vii)产物中CAR表达细胞的转导效率；
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如，大于或等于1x 107个细胞的量；或
(ix)TREG细胞或细胞群体的水平或活性；
其中(i),(ii),(vi),(vii),(viii)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的增加的效力，
其中(iii),(iv),(ix)或其任何组合的增加表明CAR表达细胞产物的降低的效力，
从而优化产物的制备。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括富集，例如分离具有(i),(ii),(vi),(vii),(viii)任一项或其任何组合的增加或(iii),(iv),(ix)任一项或其任何组合的减少的细胞的步骤。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a,IL17A,IL6,GM-CSF,IFNγ,IL10,IL13,IL2,IL21,IL4,IL5,IL9或TNFα的一种或多种或其组合。
46.权利要求45的方法，其包括消耗TREG细胞的另一步骤。
47.根据权利要求46所述的方法，其中通过CD25消耗，GITR消耗，mTOR抑制或其组合消耗TREG细胞。
48.权利要求40-47中任一项的方法，其中在体外激活后评估(i),(ii),(iii),(iv),(v),(vi),(vii),(viii),(ix)或其任何组合(例如，全部)。
49.权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述CAR表达细胞疗法包括CTL019。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述受试者接受活性剂，例如mTOR抑制剂和/或检查点抑制剂的治疗，例如预治疗或同时治疗，例如，在开始CAR表达细胞疗法前的预治疗或CAR表达细胞疗法后的治疗。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述癌症与CD19表达相关。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述癌症是血液癌症。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中所述癌症或血液癌症选自B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞前髓细胞性白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴增生性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法或用于所述方法的组合物，其中CD19 CAR表达细胞基因特征包含至少5,6,7,8,9或10个基因的表达值，所述基因包括CD19 CAR-表达细胞基因特征。
55.一种用于在患有癌症的受试者中为CAR表达细胞疗法的成功率提供预后的试剂盒，所述试剂盒包含:
一组特异性检测表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1和/或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种或多种基因的水平或活性的试剂；和
使用所述试剂盒的说明书；
其中所述使用说明书规定，如果所检测的表达水平中的一种或多种不同于，例如大于参考水平，则受试者更可能积极应答CAR表达细胞疗法。
56.权利要求55的试剂盒，其中所述试剂组检测从所述组的基因表达的mRNA的表达。
57.权利要求56所述的试剂盒，其中所述试剂组检测由所述组的基因编码的多肽的表达。
58.一种用于评估受试者中的癌症的系统，包括:
有效连接到存储器的至少一个处理器，所述至少一个处理器在执行时被配置为:
获得应答者或复发者状态的值，所述值包含以下一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个(全部)的度量:
(i)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中例如CD4+或CD8+T细胞群中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+
CD45RO-)免疫效应细胞的水平或活性；
(ii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中静息的TEFF细胞，静息的TREG细胞，较年轻的T细胞(例如较年轻的CD4或CD8细胞或γ/δT细胞)，或早期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iii)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中活化的TEFF细胞，活化的TREG细胞，较老T细胞(例如较老的CD4或CD8细胞)或晚期记忆T细胞或其组合的一种，两种，三种或更多种(例如，全部)的水平或活性；
(iv)样品(例如，单采血液成分术样品或制造的CAR表达细胞产物样品)中免疫细胞耗尽标志，例如一种，两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1，TIM-3和/或LAG-3)的水平或活性；
(v)表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表16，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L，KLRG1或CD19 CAR表达细胞基因集特征中列出的一种，两种，三种，四种，五种，十种，二十种或更多种生物标志的水平或活性；
(vi)CAR表达细胞产物样品,例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019)中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子所有组成成分的质量)，其中所述细胞因子选自表16中所列细胞因子的一种，两种，三种，四种，五种或更多种(或全部)；
(vii)CAR表达细胞产物样品中CAR表达细胞的转导效率；或
(viii)样品(例如，单采血液成分术样品或CAR表达细胞产物样品，例如CAR19表达细胞产物样品(例如，CTL019))中CD27+PD-1-细胞的量，例如大于或等于1x 107个细胞的量,
响应于确定应答者状态的值，执行以下一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或更多个(例如全部):
将该受试者鉴定为完全应答者，部分应答者，非应答者，复发者或非复发者；
建议施用CAR表达细胞疗法；
建议选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；
建议选择或改变CAR表达细胞疗法的时间表或时间过程；
建议例如对非应答者或部分应答者施用与CAR表达细胞疗法组合的另外的活性剂，例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂；
建议在用CAR表达细胞疗法治疗之前，向非应答者或部分应答者施用增加受试者中初始T细胞数量的疗法；
例如对于被鉴定为非应答者或部分应答者的受试者，建议修改CAR表达细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集初始T细胞；
建议在输注到患者体内前修饰CAR表达细胞产物；
建议调整CAR表达细胞输注剂量以达到临床疗效；
例如对于非应答者或部分应答者或复发者，建议施用替代疗法；
例如对于非应答者或部分应答者，建议选择替代疗法，例如特定癌症类型的护理标准；或者
如果受试者是或被鉴定为非应答者或复发者，则建议减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征，例如通过CD25消耗，施用环磷酰胺，抗GITR抗体，mTOR抑制剂，或其组合。
59.一种方法，包括以下步骤:
提供来自患有癌症的受试者的血液样品，例如T细胞样品；
确定表1A，表1B，表7A，表7B，表8，表9，表10，表14(例如CCL20，IL-17a和/或IL-6)，表17，表18，表20，图2B，PD-1，LAG-3，TIM-3，CD57，CD27，CD122，CD62L或KLRG1中列出的一种或多种基因的表达水平，以获得样品的基因表达模式；
将获得的基因表达模式与参考值的基因表达模式，例如基因表达的历史记录进行比较；
确定获得的值和参考值之间的差异；和
在质量控制记录中记录确定的差异。
60.权利要求59的方法，还包括将所获得的基因表达模式差异与参考样品的差异进行比较的步骤。
61.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括:
(1)通过获取来自受试者的样品中的表17中的一种或多种标志的水平或活性的值，确定受试者是否具有CAR表达细胞疗法的增加的复发可能性，其中在一种或多种生物标志基因的水平或活性相对于参考水平的差异，例如，统计学显著差异表明CAR表达细胞疗法的增加的复发可能性；和
(2)对于具有增加的复发可能性的受试者，减少TREG细胞群体和/或减少TREG基因特征；和
(3)向所述受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法。
62.权利要求61的方法，其中在收集用于制造的细胞之前，减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
63.权利要求61的方法，其中在CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)疗法之前，减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
64.权利要求61-63中任一项所述的方法，其中通过施用环磷酰胺，抗GITR抗体或其组合减少TREG细胞群体和/或TREG基因特征。
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