BR112016024972B1 - Anticorpo monoclonal humanizado, polinucleotídeo isolado,plasmídeo, composições farmacêutica e de disgnóstico, usos do dito anticorpo monoclonal humanizado e método in vitro para determinar a expressão de ceacam1 - Google Patents
Anticorpo monoclonal humanizado, polinucleotídeo isolado,plasmídeo, composições farmacêutica e de disgnóstico, usos do dito anticorpo monoclonal humanizado e método in vitro para determinar a expressão de ceacam1 Download PDFInfo
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Abstract
anticorpos humanizados contra a ceacam1 a presente invenção se refere a anticorpos humanizados, aptos a formar uma ligação específica com as moléculas da ceacam1 humana contendo mutações reversas humano-murino em regiões variáveis não cdr, e às suas sequências codifica-doras de polinucleotídeo. também são fornecidas composições farmacêuticas contendo tais anticorpos, bem como métodos para seu uso no tratamento e no diagnóstico do câncer e demais condições.
Description
[001]A presente invenção se refere primordialmente a anticorpos humanizados aptos a formar uma ligação específica com as moléculas CEACAM humanas. Mais especificamente, a presente invenção se refere a anticorpos dirigidos contra a CEACAM1, que compreendem CDRs derivadas de murino e regiões leves e pesadas humanizadas contendo mutações reversas específicas.
[002]A molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrioná- rio 1 (CEACAM1), também conhecida como grupamento de diferenciação 66a (CD66a), é um membro da família gênica do antígeno carcinoembrionário (CEA) e pertence à superfamília da imunoglobulina (Ig). A CEACAM1 nas células T e NK é regulada positivamente mediante ativação e suas interações homofílicas ocasionam a inibição do efeito citotóxico dos linfócitos. Estudos conduzidos com diversos tipos de tumores humanos sugerem que a exploração da via da CEACAM1 possivelmente permitiria a evasão imune por tumores. Modelos pré-clínicos de tumores em animais têm demonstrado que o bloqueio das interações CEACAM1 por anticorpos monoclo- nais (mAbs) pode melhorar a resposta imune aos tumores. Foram observados 1.660.290 novos casos de câncer e 580.350 mortes relacionadas à doença nos Estados Unidos no ano de 2013.
[003]O bloqueio por Imunoterapia do Ponto de Checagem tem surgido como um caminho pioneiro e alentador no tratamento do câncer. As vias dos pontos de checagem imunológicos consistem numa gama de moléculas coestimuladoras e inibido- ras que funcionam harmonicamente a fim de manter a autotolerância e de proteger os tecidos contra os danos provocados pelo sistema imunológico sob condições fisiológicas. Os tumores se beneficiam de certas vias dos pontos de checagem para escaparem do sistema imunológico. Portanto, a inibição dessas vias emergiu como estratégia promissora para o tratamento do câncer (Pardoll, D. M., 2012, Nat Rev Cancer, 12, 252-264). A imunoterapia antitumoral através do bloqueio da CEACAM1 não se restringe, em princípio, a um tipo único de tumor, podendo exibir atividade no aumento da resposta imunológica terapêutica a diversos tumores histologicamente distintos.
[004]O anticorpo linfócito T anticitotóxico 4 (CTLA-4) ipilimumab (aprovado em 2011) foi o primeiro agente imunoterapêutico que se mostrou benéfico no tratamento de pacientes portadores de câncer (Robert et al., 2011, N. Engl. J. Med., Vol. 364, páginas 2517-2526). O anticorpo interfere nos sinais inibidores durante a apresentação do antígeno às células T. O anticorpo anti-morte celular programada 1 (PD-1) pembrolizumab (aprovado em 2014) bloqueia a sinalização reguladora imune negativa do receptor da PD-1 expresso pelas células T (Hamid, 2013, N. Engl. J. Med., Vol. 2, páginas 134-144). Os anticorpos de bloqueio do eixo PD-1/PL-L1 têm mostrado resultados promissores em diversos testes clínicos em pacientes portadores de tipos variados de tumor (Dolan e Gupta 2014, Cancer Control, Vol. 21, páginas 231-237). Um agente anti-PD-1 adicional foi registrado em 2014 em busca de aprovação regulatória para o tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). No momento a pesquisa se empenha na exploração de vários outros pontos de checagem imunológica, dentre os quais: o gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), CD137, OX40 (também denominado CD134), e receptores similares às imunoglobulinas de células killer (KIR) (Gelao et al., 2014, Toxinas, Vol. 6, páginas 914-933).
[005]Anticorpos humanizados sãos anticorpos provenientes de espécies não humanas (por exemplo, anticorpos murinos) cujas sequências de proteína foram modificadas para aumentar sua similaridade às variantes de anticorpo produzidas naturalmente nos seres humanos. O processo de "humanização" normalmente é aplicado a anticorpos monoclonais que foram desenvolvidos para administração em humanos, e é realizado quando o processo de desenvolvimento de um anticorpo específico envolve a geração em um sistema imune não humano (como nos camundongos). As sequências de proteína dos anticorpos assim produzidos são distintas dos anticorpos que ocorrem naturalmente em humanos, portanto, são imunogênicos quando admi-nistrados em pacientes humanos. Os anticorpos humanizados são considerados distintos dos anticorpos quiméricos, esses últimos exibindo sequências de proteínas similares às dos anticorpos humanos, carregando, no entanto, segmentos longos de proteína não humana.
[006]É possível produzir um anticorpo humanizado sem criar um intermediário quimérico. A criação direta de um anticorpo humanizado pode ser realizada inserindo os segmentos de codificação de CDR apropriados (responsáveis pelas propriedades de ligação desejadas) num esqueleto (scaffold) do anticorpo humano, um processo conhecido como “enxertia de CDR”. De maneira geral, depois que um anticorpo é desenvolvido para portar as propriedades desejadas em um camundongo (ou em outro animal não humano), a codificação do DNA para as CDRs daquele anticorpo pode ser sequenciada. Uma vez conhecidas as sequências precisas das CDRs desejadas, tais sequências são inseridas num construto que contém o DNA para a framework de um anticorpo humano.i.O documento WO 2010/125571 dos presentes inventores revela um anticorpo monoclonal murino (MRG-1) produzido por uma célula de hibridoma específica. O mAb é altamente seletivo para a CEACAM1 e não reage de maneira cruzada com outros membros da família CEACAM. O documento WO 2013/054331 dos presentes inventores revela um anticorpo quimérico (CM-10), também altamente seletivo para a CEACAM1.
[007]Muito embora com avanços no campo da imunoterapia, subsiste a ne-cessidade de novos tratamentos, mais efetivos e duradouros, que envolvam alvos inéditos e passiveis de funcionar tanto na qualidade de agentes de sinal quanto em combinação com terapias já conhecidas, para finalmente gerar respostas longas e duradouras em pacientes com câncer. Existe uma lacuna no fornecimento de anticorpos humanizados que reconheçam proteínas específicas da CEACAM mais seguras e po-tentes que possam ser utilizadas para fins diagnósticos e terapêuticos em doenças envolvendo a expressão ou ativação das proteínas da CEACAM.
[008]A presente invenção fornece anticorpos humanizados que reconheceram a CEACAM1. Os anticorpos humanizados selecionados de acordo com a presente invenção contêm inúmeras “mutações reversas” específicas em suas sequências da região variável, a saber, mutações da sequência humanizada revertida para a sequência de camundongo. Essas mutações reversas são produzidas em resíduos essenciais à manutenção da conformação do anticorpo original e da afinidade de ligação, embora com a mais baixa incidência de potenciais epítopos de célula T, minimizando com isso o risco da resposta imunológica adversa aos anticorpos.
[009]Para produzir um mAb humanizado que reconheça a CEACAM1 que contém sequências de CDR específicas na orientação e conformação desejadas e framework humana, os inventores da presente invenção identificaram resíduos-chave na framework humana (fora das sequências de CDR) que afetam a apresentação da CDR e esquematizaram uma matriz de mutações é estes (sic) resíduos-chave para restaurar a apresentação correta das CDRs, minimizando a imunogenicidade dos an-ticorpos. A presente invenção fornece pela primeira vez, portanto, um anticorpo humanizado de alta afinidade, não imunogênico e altamente específico contra a CEACAM1.
[0010]A presente invenção fornece, de acordo com um aspecto, um anticorpo monoclonal humanizado (mAb) que reconhece especificamente a CEACAM1 humana, ou um fragmento daquele que compreende pelo menos o domínio de ligação antigê- nico, compreendendo pelo menos uma região variável selecionada dentre o grupo formado por: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácido descritas na SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3, respectivamente; e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de ami- noácido descritas na SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6, respectivamente; em que pelo menos uma entre (i) e (ii) contém 1-25 mutações reversas de resíduos de aminoácido de uma sequência humana para uma sequência murina.
[0011]De acordo com algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humanizado (mAb) ou um fragmento deste, que reconhece especificamente a CEACAM1 humana, compreendendo pelo menos uma região variável selecionada dentre o grupo formado por (i) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de CDR descritas na SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3, em que a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada difere da SEQ ID N°: 57 em 1-25 resíduos de aminoácidos nas sequências de framework; e (ii) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de CDR descritas na SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6, em que a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve difere da SEQ ID N°: 58 em 1-10 resíduos de aminoácido nas sequências de framework.
[0012]Em certas modalidades, a invenção fornece um anticorpo monoclonal humanizado (mAb) ou um fragmento deste, que reconhece especificamente a CEACAM1 humana, compreendendo: (i) as sequências de CDR descritas na SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6; (ii) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada que difere em 3-13 resíduos da framework de aminoácido da SEQ ID N°: 57; e (iii) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve que difere em 3-5 resíduos de ami- noácido da framework da SEQ ID N°: 58.
[0013]De acordo com certas modalidades, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada difere da SEQ ID N°: 57 em 3-13 resíduos de ami- noácido nas sequências de framework. De acordo com outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve difere da SEQ ID N°: 58 em 3-5 resíduos de aminoácido nas sequências de framework.
[0014]De acordo com outras modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal não completamente humanizado, que contém (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácido descritas na SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3, respectivamente, e uma sequência de aminoácidos da framework que difere em 2 a 9 aminoácidos da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°: 9; e/ou (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácido descritas na SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6, respectivamente, e uma sequência de aminoácidos da framework que difere em 2 a 4 aminoácidos da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°: 13; e seus análogos, derivados e fragmentos de ligação a antígenos que reconheçam especificamente a CEACAM1 humana.
[0015]De acordo com algumas modalidades, a sequência do mAb compreende 1-50 mutações reversas para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades, a sequência do mAb compreende 2-30 mutações reversas para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades ainda, a sequência do mAb compreende 3-20 mutações reversas para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades, a sequência do mAb compreende 4-15 mutações reversas para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades, a cadeia pesada da sequência do mAb compreende 1-15 mutações reversas para uma sequência murina.De acordo com outras modalidades, a cadeia leve da sequência do mAb compreende 1-15 mutações reversas para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades, a cadeia pesada da sequência do mAb compreende 2-9 mutações reversas para uma sequência murina e a cadeia leve da sequência do mAb compreende 2-4 mutações reversas para uma sequência murina.
[0016]De acordo com algumas modalidades específicas, o mAb humanizado compreende 1-25 mutações na sequência de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 57 da sequência humana para a sequência murina. De acordo com algumas modalidades, a cadeia pesada do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: V11, R38, M48, V68, M70, R72, T74, S77, R85, R87, T91, Y95 e T115 da SEQ ID N°: 57. De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 57 é selecionada dentre o grupo formado por: V11L, R38K, M48I, V68A, M70L, R72A, T74K, S77N, R85S, R87T, T91S, Y95F e T115S.
[0017]De acordo com algumas outras modalidades específicas, o mAb humanizado compreende 1-25 mutações na sequência de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 58 da sequência humana para a sequência murina. De acordo com algumas modalidades, a cadeia leve do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: P44, F71, F73, P80 e Y87 da SEQ ID N°: 58. De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 58 é selecionada dentre o grupo formado por: P44V, F71Y, F73L, P80Q, e Y87F.
[0018]De acordo com algumas modalidades, a cadeia pesada do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: V11, R38, M48, V68, M70, R72, T74, S77, R85, R87, T91, Y95 e T115 da SEQ ID N°: 57, e a cadeia leve do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: P44, F71, F73, P80 e Y87 da SEQ ID N°: 58. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0019]De acordo com algumas modalidades, a cadeia pesada do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: V68, M70, R72, T74, S77, R85, R87, T91, e Y95 da SEQ ID N°: 57, e a cadeia leve do mAb humanizado compreende pelo menos uma mutação num resíduo selecionado dentre o grupo formado por: F71, F73, P80 e Y87 da SEQ ID N°: 58. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0020]De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 57 é selecionada dentre o grupo formado por: V11L, R38K, M48I, V68A, M70L, R72A, T74K, S77N, R85S, R87T, T91S, Y95F e T115S, e a pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 58 é selecionada dentre o grupo formado por: P44V, F71Y, F73L, P80Q, e Y87F. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0021]De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 57 é selecionada dentre o grupo formado por: V68A, M70L, R72A, T74K, S77N, R85S, R87T, T91S, e Y95F, e a pelo menos uma mutação reversa na SEQ ID N°: 58 é selecionada dentre o grupo formado por: F71Y, F73L, P80Q, e Y87F. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0022]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende pelo menos uma sequência de framework de cadeia pesada descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 12, e SEQ ID N°: 23. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende uma sequência de framework de cadeia pesada descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 e SEQ ID N°: 22. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0023]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende as sequências de framework de cadeia pesada descritas na SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 16 ou SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 22; e SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 23. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0024]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 31 e SEQ ID N°: 32. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 32.
[0025]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende uma sequência de framework de cadeia leve descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e SEQ ID N°: 27.
[0026]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende uma sequência de framework de cadeia leve descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e SEQ ID N°: 27. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0027]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende as sequências de framework de cadeia leve descritas na sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 24; SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 e SEQ ID N°: 27; e SEQ ID N°: 14. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0028]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia leve descrita numa sequência selecionada dentre o grupo formado por: SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 35. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34.
[0029]Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende: (i) as sequências de framework de cadeia pesada descritas na: SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 16 ou SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 22; e SEQ ID N°: 10 ou SEQ ID N°: 23, e (ii) as sequências de framework de cadeia leve descritas na: SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 24; SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 ou SEQ ID N°: 27; e SEQ ID N°: 14. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0030]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 31 ou SEQ ID N°: 32; e uma sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 34 ou SEQ ID N°: 35. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 32, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34.
[0031]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 28, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 29, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 30, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 31, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 32, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 33.
[0032]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 28, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 29, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 30, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 31, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 34.
[0033]Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 28, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 35. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 29, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 35. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 30, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 35. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 31, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 35. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal compreende a sequência da região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 32, e a sequência da região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 35.
[0034]De acordo com algumas modalidades, a cadeia pesada do mAb humanizado é selecionada entre o isótipo IgG4 e IgG1. De acordo com algumas modalidades, a cadeia pesada do mAb humanizado é o isótipo IgG4. De acordo com algumas modalidades, a cadeia leve do mAb humanizado é o isótipo kappa. De acordo com algumas modalidades específicas, o mAb humanizado compreende um isótipo kappa de cadeia leve e um isótipo IgG4 de cadeia pesada. De acordo com outras modalidades específicas, o mAb humanizado compreende um isótipo kappa de cadeia leve e um isótipo IgG1 de cadeia pesada.
[0035]De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 52. De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 53 ou SEQ ID N°: 59. De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 52 e uma cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 53. De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 52 e uma cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 59.
[0036]De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 58 e uma cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 53. De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 58 e uma cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 59. De acordo com algumas modalidades, o mAb compreende uma cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 52 e uma região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 57.
[0037]A presente invenção também fornece um mAb que compreende uma região variável de cadeia leve descrita na SEQ ID N°: 58 e uma região variável de cadeia pesada descrita na SEQ ID N°: 57.
[0038]Em algumas modalidades, o mAb humanizado ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar com uma afinidade de pelo menos cerca de 108M a uma proteína da CEACAM1 humana. Em algumas modalidades, o mAb humanizado ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar com uma afinidade de pelo menos cerca de 5x10-7M a pelo menos uma proteína da CEACAM3 humana ou da CEACAM5 humana.
[0039]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, análogos e/ou derivados do anticorpo monoclonal descrito acima, que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o fragmento de ligação ao antígeno do dito anticorpo monoclonal.
[0040]Os fragmentos dos mAbs que reconhecem a CEACAM1, compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, também estão incluídos no escopo da presente invenção, desde que contenham as sequências de CDR definidas acima e pelo menos uma mutação reversa de uma sequência humana para uma sequência murina.
[0041]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, polinu- cleotídeos isolados que codificam um anticorpo monoclonal descrito acima ou um fragmento deste, que reconhece especificamente a CEACAM1 humana.
[0042]Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo isolado compreende as sequências de DNA descritas em qualquer uma das SEQ ID NOs:44 a 51 que codificam uma região variável do mAb humanizado, ou seus análogos que tenham pelo menos 90% de identidade de sequência com as ditas sequências. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo isolado compreende as sequências de DNA descritas na SEQ ID N°: 54 ou SEQ ID N°: 55 que codificam uma cadeia pesada do mAb humanizado, ou seus análogos que tenham pelo menos 90% de identidade de sequência com as ditas sequências. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de DNA descrita na SEQ ID N°: 56 que codificam uma cadeia leve do mAb humanizado, ou seus análogos que tenham pelo menos 90% de identidade de sequência com as ditas sequências.
[0043]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um plasmídeo que compreende o polinucleotídeo isolado descrito acima.
[0044]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma composição farmacêutica que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal descrito acima, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceutica- mente aceitável.
[0045]De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende 1-50 mg/ml do mAb humanizado contra a CEACAM1. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um aminoácido básico. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um açúcar. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um tensoativo. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um aminoácido básico, um açúcar e um tensoativo. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (i) 1-10 mg/ml de ami- noácido básico; (ii) 10/100 mg/ml de açúcar; (iii) 0,01-1 mg/ml de um tensoativo; (iv) 1-50 mg/ml do mAb humanizado contra a CEACAM1, 4-6 mg/ml de aminoácido básico, 70-100 mg/ml de um açúcar e 0,1-1 mg/ml de um tensoativo não aniônico; ou (v) 10 mg/ml de mAb humanizado contra a CEACAM1, 4,65 mg/ml de L-Histidina, 82 mg/ml de sacarose e 0,20 mg/ml de polissorbato 20
[0046]De acordo com algumas modalidades, o aminoácido básico é selecionado dentre o grupo formado por: Histidina, Arginina, Lisina e Ornitina. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição compreende 1-10, 2-9, 3-7 ou 4-6 mg/ml de ami- noácido básico. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0047]De acordo com algumas modalidades, o açúcar é selecionado dentre o grupo formado por: sacarose, trealose, glucose, dextrose e maltose. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição compreende 10-200, 10-100, 50-150 ou 70-100 mg/ml de açúcar. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0048]De acordo com outras modalidades ainda, a composição compreende poliol, incluindo, entre outros, manitol e sorbitol. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0049]De acordo com algumas modalidades, o tensoativo é não aniônico. De acordo com algumas modalidades, o tensoativo é selecionado dentre o grupo formado por: polissorbatos, ésteres de sorbitano e poloxâmeros. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, o tensoativo é selecionado dentre o grupo formado por: polissorbato 20, polissor- bato 80. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição compreende 0,01-10, 0,011, 0,05-5 ou 0,1-1 mg/ml de tensoativo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende 4-6 mg/ml de aminoácido básico, 70-100 mg/ml de açúcar e 0,1-1 mg/ml de tensoativo.
[0050]De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica está sob a forma líquida e compreende 1-50 mg/ml de mAb humanizado contra a CEACAM1 compreendendo pelo menos uma mutação reversa para uma sequência murina. De acordo com outras modalidades, a composição farmacêutica é liofilizada. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende: 10 mg/ml de mAb humanizado contra a CEACAM1, 4,65 mg/ml de L-Histidina, 82 mg/ml de sacarose e 0,20 mg/ml de polissorbato 20.
[0051]De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos um mAb humanizado ou o fragmento definido acima e um imu- nomodulador adicional ou um inibidor da quinase. De acordo com algumas modalidades, uma composição farmacêutica que contém pelo menos um mAb humanizado ou fragmento definido acima, e uma composição farmacêutica que contém um imunomo- dulador adicional ou um inibidor da quinase, são utilizados no tratamento do câncer em administração separada.
[0052]De acordo com algumas modalidades específicas, o imunomodulador adicional é selecionado dentre o grupo formado por: anticorpo PD-L1 e PD-L2 anti- proteína de morte celular programada 1 (PD-1), uma célula de linfócito citotóxico ativada, um agente ativador de linfócito, e um inibidor da via RAF/MEK. Cada possibili-dade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades específicas, o imunomodulador adicional é selecionado dentre o grupo formado por: mAb para PD-1, mAb para PD-L1, mAb para PD-L2, Interleucina 2 (IL-2), célula killer ativada por linfocina (LAK).
[0053]De acordo com algumas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica que contém um mAb humanizado contendo mutações reversas, conforme definido acima, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uma composição farmacêutica que contém um mAb para pelo menos uma proteína da morte celular programada humana 1 (PD-1), PD-L1 e PD-L2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso no tratamento do câncer em administração separada.
[0054]De acordo com outras modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica contendo um mAb humanizado para a CEACAM definida acima ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uma célula de linfócito T citotóxico. Em certas modalidades, a célula de linfócito T citotóxico é selecionada dentre o grupo formado por uma célula LAK, uma célula CIK, e qualquer combinação dessas células. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. Em certas modalidades, a célula de linfócito T citotóxico é uma célula killer ativada por linfocina (LAK).
[0055]Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende um mAb humanizado contra a CEACAM1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um agente ativador de linfócito ou um fragmento, análogo ou proteína de fusão do mesmo. Em certas modalidades, o agente ativador de linfócito é selecionado dentre o grupo formado por IL-2, IFNY, um anticorpo anti-CD3 e seus fragmentos, análogos ou proteínas de fusão. Em certas modalidades, o agente ativador de linfócito é a IL-2 ou um fragmento, análogo ou proteína de fusão da mesma. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.
[0056]Em outras modalidades ainda, a composição farmacêutica compreende um inibidor de uma quinase selecionada dentre o grupo formado por um mutante da quinase B-Raf, uma quinase MEK1 e uma quinase MEK2, e um mAb humanizado contra a CEACAM1 humana definida acima ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0057]De acordo com algumas modalidades específicas, o inibidor da quinase B-Raf atenua ou impede a fosforilação de MEK1 ou MEK2 pelo mutante da quinase B-Raf. Em certas modalidades, o inibidor da quinase B-Raf atenua ou impede a dime- rização do mutante da quinase B-Raf. Em certas modalidades, o inibidor da quinase MEK1 atenua ou impede a fosforilação da MAPK pela quinase MEK1. Em certas modalidades, o inibidor da quinase MEK2 atenua ou impede a fosforilação da MAPK pela quinase MEK2.i.A presente invenção fornece adicionalmente, de acordo com outras modalidades, um inibidor de uma quinase selecionada dentre o grupo formado por um mu- tante da quinase B-Raf, uma quinase MEK1 e uma quinase MEK2, e um mAb humanizado contra a CEACAM1 humana ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso no tratamento do câncer. Os dois princípios ativos podem ser parte de uma composição farmacêutica ou de composições farmacêutica separadas passi- veis de administração simultânea ou em separado.
[0058]O mAb humanizado contra a CEACAM1 de acordo com a presente invenção e o imunomodulador adicional podem estar contidos em uma composição farmacêutica ou em composições separadas para administração simultânea ou em separado.
[0059]Em algumas modalidades, a composição farmacêutica se destina ao tratamento de uma doença ou desordem associada à expressão, ativação ou função de um membro da família da proteína da CEACAM, incluindo, entre outras, a CEACAM1. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0060]Em algumas modalidades, a composição farmacêutica se destina ao tratamento de uma doença ou desordem associada à expressão, ativação ou função da CEACAM1. Em algumas modalidades, a doença ou desordem é uma doença ou desordem de proliferação celular. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, a doença ou desordem de proliferação celular é o câncer.
[0061]De acordo com algumas modalidades o câncer é selecionado dentre o grupo formado por: melanoma, câncer de cólon e reto, bexiga, pulmão, carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLA), gastrointestinal, pâncreas, mama, próstata, tireoide, estômago, ovário, mieloma e útero. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0062]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma composição de diagnóstico que compreende pelo menos um mAb humanizado ou um fragmento deste, que reconhece especificamente a CEACAM1 humana, conforme descrito acima.
[0063]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método de prevenção, atenuação ou tratamento de uma doença ou desordem associada à expressão, ativação ou função de uma proteína da CEACAM1, que compreende administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica descrita acima.
[0064]Em algumas modalidades, a doença ou desordem é o câncer. Em algumas modalidades, a doença ou desordem é uma infecção, por exemplo, uma infecção viral.
[0065]Em algumas modalidades, o anticorpo isolado contido na composição farmacêutica está anexado a uma fração citotóxica.
[0066]Em certas modalidades, o método descrito acima compreende administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de um mAb humanizado contra a CEACAM1 na faixa de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal. Em certas modalidades, o método descrito acima compreende administrar (i) doses múltiplas, idênticas ou diferentes do mAb humanizado; (ii) múltiplas doses progressivas; ou (iii) a composição farmacêutica uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, ou uma vez a cada 5 semanas. Em certas modalidades, o método descrito acima compreende 1-10 ciclos de administração, cada ciclo compreendendo 2-5 infusões a cada 1-4 semanas, com um mAb humanizado, seguindo-se 2-8 semanas entre cada ciclo.
[0067]Em certas modalidades, o método descrito acima compreende ainda administrar uma célula de linfócito ou uma pluralidade de células de linfócito. Em algumas modalidades, o método descrito acima compreende ainda administrar ao indivíduo linfócitos que expressam a CEACAM1. Em algumas modalidades, os linfócitos compreendem células T, células NK ou Linfócitos Infiltrantes de Tumores (TILs). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, a célula de linfócito expressa a CEACAM1, PD-1, ou ambas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em certas modalidades desse tipo, a célula de linfócito expressa a CEACAM1 e a PD-1. Em algumas modalidades, a célula de linfócito é selecionada dentre o grupo formado por uma célula de linfócito infiltrante de tumor (TIL), uma célula killer ativada por linfocina (LAK), uma célula killer induzida por citocina (CIK), uma célula T, uma célula B, uma célula NK, e qualquer combinação de tais células. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em certas modalidades desse tipo, a célula de linfócito é selecionada dentre o grupo formado por uma célula de linfócito infil- trante de tumor (TIL) e uma célula killer ativada por linfocina (LAK). Em certas modalidades desse tipo, a célula de linfócito é uma célula de linfócito infiltrante de tumor (TIL) ou uma pluralidade de células TIL. Em certas modalidades desse tipo, a célula de linfócito é uma célula killer ativada por linfocina (LAK) ou uma pluralidade de células LAK. Em certas modalidades, a célula de linfócito é ativada. Em algumas modalidades, a célula de linfócito é citotóxica à célula do câncer. Em algumas modalidades, a célula do câncer expressa a CEACAM1, a PD-L1, PD-L2, ou qualquer combinação desses elementos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, a célula do câncer expressa a CEACAM1, a PD-L1, ou ambas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, a célula do câncer expressa a CEACAM1, a PD-L2, ou ambas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em certas modalidades desse tipo, a célula do câncer expressa a CEACAM1 e a PD-L1 e a PD-L2.
[0068]Em certas modalidades, os métodos descritos acima compreendem ainda administrar ao indivíduo um agente ativador de linfócito. De acordo com algumas modalidades, o agente ativador de linfócito é selecionado dentre o grupo formado por IL-2, IFNY, e um anticorpo anti-CD3. Em certas modalidades, os métodos descritos acima compreendem ainda administrar ao indivíduo uma composição anticancerígena adicional.
[0069]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método de imunomodulação, o método compreendendo contatar o linfócito que expressa a CEACAM1 com os anticorpos ou fragmentos do mesmo descritos acima.
[0070]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para inibir a migração de uma célula tumoral que expressa a CEACAM1, o método compreendendo contatar a dita célula tumoral que expressa a CEACAM1 com os anticorpos ou fragmentos do mesmo descritos acima, inibindo assim a migração da dita célula tumoral que expressa a CEACAM.
[0071]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para inibir a interação proteína-proteína homotípica ou heterotípica da CEACAM1, o método compreendendo contatar um linfócito que expressa a CEACAM1 com os anticorpos ou fragmentos do mesmo descritos acima, inibindo assim a interação proteína-proteína homotípica ou heterotípica da CEACAM1.
[0072]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para aumentar a duração ou progresso da resposta ou ainda a sobrevida de um indivíduo afetado pelo câncer, que compreende administrar ao indivíduo quantidades eficazes de uma composição contendo um anticorpo monoclonal conforme descrito acima, e uma composição antineoplásica, em que a dita composição antineoplásica compreende pelo menos um agente quimioterápico, e com isso a coadministração do anticorpo e da composição antineoplásica aumenta efetivamente a duração ou a progressão da sobrevida.
[0073]O método da presente invenção pode compreender administrar uma composição farmacêutica definida acima junto com a composição anticancerígena adicional. De acordo com uma modalidade específica a composição anticancerígena compreende pelo menos um agente quimioterápico. De acordo com outras modalidades específicas, a composição anticancerígena compreende um agente imunomodu- lador. O agente anticancerígeno, que poderia ser administrado junto com o anticorpo de acordo com a presente invenção, ou em separado, pode compreender qualquer um dos agentes conhecidos na técnica por sua atividade anticancerígena.
[0074]De acordo com algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento do câncer que compreende administrar a um indivíduo necessitado uma composição farmacêutica contendo um anticorpo humanizado capaz de reconhecer a CEACAM1 e que inclui mutações reversas para uma sequência murina, e uma composição farmacêutica que contém um imunomodulador adicional ou um inibidor da quinase.
[0075]De acordo com algumas modalidades, o imunomodulador é selecionado dentre o grupo formado por: mAb para PD-1, mAb para PD-L1, mAb para PD- L2, Interleucina 2 (IL-2), célula killer ativada por linfocina (LAK), sendo o inibidor da quinase um inibidor de B-Raf/MEK.
[0076]Em algumas modalidades o método compreende administrar duas ou mais composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, a administração de duas ou mais composições farmacêuticas é realizada simultaneamente. Em algumas modalidades do método, a administração de duas ou mais composições farmacêuticas é realizada sequencialmente. Em algumas modalidades do método, o imunomodulador adicional é administrado antes do mAb humanizado contra a CEACAM1 humana ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades do método, o imunomodulador é administrado simultaneamente ao mAb contra a CEACAM1 humana ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades do método, o imunomodulador é administrado depois do mAb humanizado contra a CEACAM1 humana ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0077]Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao dito paciente uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal para a CEACAM1 humana ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal para a PD-1 humana ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0078]De acordo com outras modalidades ainda, os métodos descritos acima para o tratamento de um paciente afetado pelo câncer, compreendem a etapa de administrar ao paciente uma composição farmacêutica contendo um inibidor de uma qui- nase selecionada dentre o grupo formado pelo mutante da quinase B-Raf, uma qui- nase MEK1 e uma quinase MEK2, e uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal para a CEACAM1 humana ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, em que as células cancerosas expressam um mutante da quinase B-Raf, e com isso o câncer é tratado.
[0079]Em algumas modalidades, os métodos destinados ao tratamento do câncer descritos acima compreendem ainda a etapa de administrar ao dito paciente uma composição farmacêutica contendo uma célula de linfócito. Em algumas modalidades, a administração da composição farmacêutica contendo uma célula de linfócito é realizada simultaneamente com pelo menos uma das composições farmacêuticas contendo anticorpos. Em algumas modalidades do método, a administração de duas ou mais composições farmacêuticas é realizada sequencialmente.
[0080]Em algumas modalidades, a célula de linfócito é pré-incubada junto com um mAb humanizado contra a CEACAM1 humana, junto com um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou junto com o imunomodulador adicional. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0081]A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada em qualquer uma das vias exemplificadas adiante: intranasal, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intra-articular, intralesional, oral ou tópica. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via parenteral. De acordo com algumas modalidades específicas, utiliza-se a administração intravenosa (i.v.).
[0082]Um método de acordo com a presente invenção destinado ao tratamento do câncer ou de outra doença ou desordem associada à CEACAM1 compreende, de acordo com algumas modalidades, administrar a um indivíduo necessitado do tratamento pelo menos uma dose de um mAb humanizado contra a CEACAM1 na faixa de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de seu peso corporal.
[0083]De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma dose é selecionada dentre o grupo formado por: 0,01-0,1 mg/kg; 0,1-1 mg/kg; 1-10 mg/kg; e 1050 mg/kg.
[0084]De acordo com algumas modalidades, o método compreende administrar múltiplas doses, idênticas ou não, do mAb humanizado. De acordo com algumas modalidades, o método compreende administrar múltiplas doses progressivas. De acordo com algumas modalidades, o método compreende pelo menos um ciclo de administração por pelo menos 12 semanas.
[0085]De acordo com outras modalidades, a duração do tratamento é de 1250 semanas. De acordo com algumas modalidades específicas a duração do tratamento é selecionada dentre o grupo formado por: 12-20 semanas, 20-30 semanas e 30-50 semanas. De acordo com outras modalidades ainda, o regime de tratamento compreende vários ciclos de administração, cada um deles por pelo menos 12 semanas.
[0086]De acordo com algumas modalidades, o regime de tratamento compreende 1-8 ciclos, cada ciclo compreende 4 infusões do mAb humanizado anti-CEACAM com duração de pelo menos 4 semanas. De acordo com algumas modalidades, o regime de tratamento compreende 2-6 ciclos.
[0087]De acordo com algumas modalidades, a administração ocorre uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, ou uma vez a cada 5 semanas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.
[0088]De acordo com algumas modalidades, um regime de tratamento compreende 1-10 ciclos, cada ciclo compreendendo 2-5 infusões a cada 1-4 semanas, com um mAb humanizado de acordo com a invenção, seguindo-se 2-8 semanas entre cada ciclo.
[0089] De acordo com algumas modalidades, é fornecido um regime de progressão da dose que compreende iniciar a administração com 0,01 mg/kg, e continuar até 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, e 10 mg/kg. De acordo com outras modalidades ainda, o regime de tratamento compreende 6 ciclos de 4 infusões cada administrado a cada 2 semanas.
[0090] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para o diagnóstico do câncer em um indivíduo necessitado, o método compreendendo contatar uma amostra biológica derivada ou obtida do dito indivíduo com a composição de diagnóstico descrita acima, em que uma formação complexa além de um limite mínimo previamente determinado é um sinal indicativo de câncer no dito indivíduo.
[0091]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para determinar a expressão da CEACAM1, o método compreendendo contatar uma amostra biológica com os anticorpos ou fragmentos da mesma descritos acima, e medir o nível de formação do complexo imunológico. De acordo com algumas modalidades, o método compreende comparar o dito nível do complexo imunológico a uma curva-padrão obtida a partir de quantidades conhecidas da CEACAM1.
[0092]A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método para o diagnóstico de uma doença ou desordem associada à expressão de uma proteína da CEACAM, que compreende as etapas de incubar uma amostra biológica junto com um anticorpo monoclonal conforme descrito acima; detectar a proteína da CEACAM ligada usando uma sonda detectável; comparar a quantidade de proteína da CEACAM ligada a uma curva-padrão obtida a partir de amostras de referência que contêm quantidades conhecidas de proteína da CEACAM; calcular a quantidade de proteína da CEACAM na amostra biológica a partir da curva-padrão; e comparar a quantidade de proteína da CEACAM com a quantidade normal de proteína da CEACAM.
[0093]De acordo com algumas modalidades, um mAb humanizado de acordo com a invenção é usado como biomarcador preditivo em associação ao tratamento anti-CEACAM1, com base nos níveis de expressão da CEACAM1 em espécimes tu- morais antes do tratamento. A expressão dos níveis de CEACAM1 é determinada com o uso de métodos conhecidos na técnica que utilizam um mAb humanizado de acordo com a invenção.
[0094]A presente invenção fornece adicionalmente, em um aspecto, o uso de um anticorpo monoclonal conforme descrito acima, para o diagnóstico, prevenção ou tratamento de uma doença ou desordem relacionada à proliferação celular ou angio- gênese ou uma infecção.
[0095]A presente invenção fornece adicionalmente, em um aspecto, o uso de um anticorpo monoclonal conforme descrito acima, para o preparo de um medicamento destinado ao tratamento de uma desordem ou doença associada à expressão ou ativação de uma proteína da CEACAM.
[0096]A presente invenção fornece adicionalmente, em um aspecto, o uso de um anticorpo monoclonal conforme descrito acima, para o preparo de uma composição de diagnóstico destinada ao diagnóstico de uma doença ou desordem relacionada à proliferação celular ou angiogênese ou uma infecção.
[0097]A presente invenção fornece adicionalmente, em um aspecto, um anticorpo monoclonal parcialmente humanizado, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da framework descrita na SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 22, ou uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de amino- ácidos da framework descrita na SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 ou SEQ ID N°: 27.
[0098]Modalidades adicionais e o escopo completo de aplicabilidade da presente invenção emergirão da descrição detalhada que fazemos a seguir. No entanto, caber notar que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora sinalizem modalidades preferenciais da invenção, são oferecidos a título de mera ilustração, posto que diversas alterações e modificações à essência e ao escopo da invenção serão evidenciadas pelos indivíduos versados na técnica em face da presente descrição detalhada.
[0099]BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00100]A Figura 1 é um modelo estrutural das regiões V do anticorpo quimérico anti-CEACAM-1 (CM-10) em vista de topo (A) e vistas laterais em estéreo (B), produzidas pelo programa de modelagem por homologia da estrutura das proteínas Swiss PDB.
[00101]A Figura 2 é um gel SDS-PAGE colorido por azul de Coomassie de anticorpos purificados da Proteína A. Cerca de 2μg de cada amostra foram carregados em gel NuPage Bis-Tris 4-12% (N° de cat. Invitrogen NP0322BOX) e processados a 200 V por 40 min. (A) variantes enxertadas por CDR de IgG1; (B) variantes enxertadas por CDR de IgG4 (S241P). Fermentas Pageruler Plus (SM1811) foi usado como padrão de peso molecular (contendo bandas de referência em 10, 25, e 70 kDa). As amostras foram numeradas da seguinte maneira:
[00102]A Figura 3 é uma ilustração gráfica dos resultados dos testes de ELISA para a ligação por competição da CEACAM-1 humana recombinante. Várias concentrações de variantes do anticorpo da IgG humanizado purificado foram levadas a competir contra uma concentração constante de IgG anti-CEACAM-1 biotinilada (IgG CM10 quimérica): (A) Variantes de IgG1; e (B) Variantes de IgG4 (S241P). CM-10 quimérico biotinilado, ligado foi detectado usando substrato TMB e HRP-estrepdavidina.
[00103]A Figura 4 representa os efeitos sinérgicos dos anticorpos anti- CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a citotoxicidade de células TIL humanas contra células do melanoma humano. As células TIL foram incubadas com concentrações variadas de um mAb humanizado contra a CEACAM1 humana (linha preta tracejada, marcador esférico), um mAb para a PD-1 humana (linha cinza contínua, marcador retangular) ou uma combinação de ambos anticorpos (linha preta contínua, marcador triângulo). Células de melanoma tratadas com IFN-Y foram adicionadas para incubação de um dia para o outro. Os resultados representam a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado ao anticorpo monoclonal para a CEACAM1 humana apenas.
[00104]A Figura 5A-B Efeitos sinérgicos de anticorpos anti-CEACAM1 e anti- PD-1 sobre os níveis da Granzima B e a citotoxicidade de células TIL humanas contra células do melanoma humano quando anticorpos anti-PD-1 são acrescentados antes da adição de anticorpos anti-CEACAM1. Células do melanoma humano foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. Células TIL humanas foram incubadas com meio apenas (preto), anticorpo IgG não específico (branco), várias concentrações de um anticorpo monoclonal para a CEACAM1 humana (linhas verticais), um anticorpo monoclonal para a PD-1 humana (linhas horizontais) ou uma combinação de ambos os anticorpos (pontos). (A) Os resultados representam a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado à a-PD-1 apenas. (B) Os resultados representam os níveis da Granzima B ±DP conforme determinado pelo kit comercial de ELISA para Granzima B de três poços repetidos por tratamento.
[00105]Figura 6. Efeitos sinérgicos de anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a citotoxicidade de células LAK humanas contra células do melanoma humano quando anticorpos anti-PD-1 são acrescentados antes da adição de anticorpos anti- CEACAM1. Células do melanoma humano foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. Células LAK humanas geradas pela ativação de PBMCs de um doador humano saudável com IL-2 foram incubadas com meio apenas (branco), anticorpo IgG não específico (preto), várias concentrações de um anticorpo monoclonal para a CEACAM1 humana (linhas verticais), um anticorpo monoclonal para a PD-L1 humana (linhas horizontais) ou uma combinação de ambos os anticorpos (pontos). Os resultados a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado à a-PD-L1 apenas. O índice de combinação foi calculado conforme descrição acima.
[00106]Figura 7. Tratamento com anticorpos anti-CEACAM1 aumenta a expressão de PD-L1 nas células de câncer de interesse. Células NK (NK92MI) foram incubadas com ou sem CM-24 (10μg/ml), seguindo-se a adição de células do melanoma humano (SKMEL28). A células foram incubadas por 24, 48 e 72 horas e os níveis de PD-L1 foram medidos em cada ponto no tempo por análise de FACS. Média da razão de anti-PD-L1 comparada a um isótipo de controle adequado para os tratamentos indicados nos diferentes pontos no tempo.
[00107]Figura 8. Efeitos sinérgicos de anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a progressão do tumor em camundongos imunocompetentes. Células de lin- foma murino foram implantadas por via subcutânea no abdômen de camundongos BALB/C (Dia 1). Nos dias 10, 15 e 20, os camundongos receberam administrações intravenosas de PBS (linha preta tracejada, círculos vazios), um anticorpo anti- CEACAM1 murino (linha cinza contínua, retângulos cinzas), um anticorpo anti-PD-1 murino (linha cinza contínua, triângulos cinzas) ou uma combinação de ambos os anticorpos (linha preta contínua, esferas pretas).
[00108]Figura 9. Anticorpos anti-CEACAM1 aumentam a citotoxicidade de células LAK humanas contra células do melanoma humano. Células LAK humanas foram incubadas com o CM-24 em diferentes concentrações por 30 minutos a 37°C. Células de câncer do melanoma humano (SKMEL28) foram adicionadas para incubação por 24 horas. Os resultados representam a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado a efetores + células de interesse com meio apenas.
[00109]Figura 10. Anticorpos anti-CEACAM1 aumentam a citotoxicidade das células LAK humanas contra as células do câncer de pâncreas humano T3M4. Células LAK humanas foram incubadas com CM-24 em diferentes concentrações por 30 minutos a 37°C. Células do câncer de pâncreas humano T3M4 foram adicionadas para incubação por 24 horas. Os resultados representam a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado a efetores + células de interesse com meio apenas.
[00110]Figura 11. Anticorpos anti-CEACAM1 intensificam a secreção de IFN- Y de células LAK humanas na presença de células de câncer humanas. Células LAK humanas foram incubadas com o CM-24 em diferentes concentrações por 30 minutos a 37°C. Células do câncer de pulmão humano H358 (11A) ou H460 (11B) foram adicionadas para incubação por 24 horas. A secreção de IFN-Y foi medida por ELISA. Os resultados representam a média + DP dos valores de liberação da Granzima B de 3 repetições por tratamento. *teste T pareado com P<0,05, comparado a efetores + células de interesse com meio apenas.
[00111]As Figuras 12A e 12B apresenta a correlação entre a expressão dos tipos de CEACAM1 CEACAM1-longa (A) e CEACAM1-curta (B), e a resistência a inibidores de mutantes B-Raf em células cancerosas.
[00112]A Figura 13A apresenta pictogramas de pulmões removidos de camundongos enxertados com células de melanoma e tratados de acordo com os grupos de tratamento indicados na figura; a Figura 13B apresenta o peso médio dos tumores de cada grupo de tratamento; e a Figura 13C apresenta o número de lesões por camundongo de cada grupo de tratamento.
[00113]A Figura 14 é um histograma de barras apresentando o percentual de ocupação do receptor da CEACAM1 em células TIL isoladas do modelo de lesões pulmonares.
[00114]As Figuras 15A e 15B representam as sequências de aminoácido de cadeia leve e pesada do mAB anti-CEACAM1 humanizado que sofreu mutação reversa, indicado como CM-24, atualmente em ensaio clínico. A Figura 15A contém a sequência de cadeia leve (ID SEQ N°: 52) em que os resíduos de aminoácido 1-107 são a região variável que inclui as CDRs e os resíduos de aminoácido 108-214 (em negrito) são a região constante de cadeia leve kappa. A Figura 15B representa a sequência de cadeia pesada (ID SEQ N°: 53), os resíduos de aminoácido 1-120 são a região variável, os resíduos de aminoácido 121-447 (em negrito) são a região constante de cadeia pesada IgG4, e o sítio de N-glicosilação previsto (Asparagina 297) está sublinhado. A Figura 15C representa a sequência de cadeia pesada (ID SEQ N°: 59), os resíduos de aminoácido 1-121 são a região variável, os resíduos de aminoá- cido 122-450 (em negrito) são a região constante de cadeia pesada IgG1, e o sítio de N-glicosilação previsto (Asparagina 300) está sublinhado.
[00115]Descrição Detalhada da invenção
[00116]A presente invenção revela anticorpos monoclonais não completamente humanizados que reconhecem a CEACAM1. Como aspecto favorável, os anticorpos da invenção são quase completamente humanizados, evitando assim o risco de resposta imunológica adversa aos anticorpos, portanto, são seguros para uso in vivo em humanos. Os anticorpos da invenção são caracterizados por apresentarem uma sequência de CDR única e desenho e sequências de framework não completamente humanizadas inéditas. As propriedades únicas dos anticorpos monoclonais da presente invenção amplificam sua utilidade terapêutica no tratamento e diagnóstico de outros tipos de malignidades e de várias infecções. Mais especificamente, os anti-corpos monoclonais fornecidos pela presente invenção têm combinações específicas de CDRs e de sequências de framework não completamente humanizadas, possuindo propriedades únicas e maior potência e segurança em relação aos anticorpos anti- CEACAM1 não humanos.
[00117]As propriedades únicas dos anticorpos fornecidos pela presente invenção conferem diversas vantagens ao uso de tais anticorpos em humanos, especificamente em aplicações que requeiram administração de longo prazo ou repetida, quando outros anticorpos não humanos não podem ser administrados pelo temor de suscitar uma resposta imunogênica em relação aos próprios anticorpos não humanos.Evitar a resposta imunológica é ainda mais crucial quando a pessoa tratada é um paciente afetado por uma doença, onde o agravamento do estado de saúde do paciente deve ser evitado. A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um anticorpo monoclonal não completamente humanizado, compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácido descritas na SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3, respectivamente, e um sequência de aminoácidos distinta da CDR (framework) que difere em 2 a 9 aminoácidos da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°: 9; e/ou (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 que compreende as sequências de aminoácido descritas na SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 6, respectivamente, e um sequência de aminoácidos distinta da CDR que difere em 2 a 4 aminoácidos da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°: 13; e seus análogos, derivados e fragmentos de ligação a antíge- nos que reconheçam especificamente a CEACAM1 humana.
[00118]A título de esclarecimento, cabe enfatizar que as regiões variáveis dos anticorpos fornecidos pela presente invenção compreendem (a) as sequências de CDR já descritas pelos inventores da presente invenção, e (b) sequências de framework, também indicadas aqui como sequências não CDR, sendo que pelo menos uma delas é diferente em pelo menos um resíduo de uma sequência de framework completamente humana correspondente.
[00119]Em certas modalidades, a expressão “uma sequência que difere de outra sequência” conforme aqui utilizado significa uma sequência que contém uma substituição de pelo menos um aminoácido, uma inserção de pelo menos um amino- ácido, uma deleção de pelo menos um aminoácido, ou qualquer combinação desses eventos, em comparação a uma sequência respectiva. Em certas modalidades, a ex-pressão “uma sequência que difere de outra sequência” conforme aqui utilizado significa uma sequência que contém uma substituição de pelo menos um aminoácido em comparação a uma sequência respectiva. O termo “sequência não CDR” na forma aqui utilizada se refere a uma sequência de framework, a saber, qualquer sequência de aminoácidos compreendida numa região variável de um anticorpo, que não seja uma sequência CDR identificada pela presente invenção. Exemplos de sequências não CDR incluem sequências precedentes ou adjacentes à CDR1, sequências entre CDR1 e CDR2, sequências entre CDR2 e CDR3, e sequências subsequentes ou adjacentes à CDR3.
[00120]Como as regiões variáveis dos anticorpos fornecidos pela presente invenção diferem em pelo menos um aminoácido de anticorpos completamente humanos de regiões variáveis, estes também são denominados anticorpos “não completamente humanizados” e “não completamente humanos”.
[00121]O termo “CEACAM1” é usado indicar o produto da proteína do gene da CEACAM1, por exemplo, NP_001020083.1, NP_001703.2. Em humanos, 11 variantes de splice diferentes da CEACAM1 foram detectadas até o momento. Isoformas de CEACAM1 individuais diferem em relação ao número de domínios similares à imu- noglobulina extracelular (por exemplo, a CEACAM1 com quatro domínios similares à imunoglobulina extracelular é conhecida como CEACAM1-4), ancoragem de membrana e/ou o comprimento de sua cauda citoplasmática (por exemplo, a CEACAM1-4 com uma cauda citoplasmática longa é conhecida como CEACAM1-4L e a CEACAM1- 4 com uma cauda citoplasmática curta é conhecida como CEACAM1-4S). O domínio do terminal N da CEACAM1 começa imediatamente depois do peptídeo-sinal e sua estrutura é tida como sendo do tipo IgV. Por exemplo, na notação P13688 da CEACAM1, o domínio do tipo IgV do terminal N é formado por 108 aminoácidos, do aminoácido 35 ao 142. Este domínio foi identificado como responsável pela atividade de ligação homofílica (Watt et al., 2001, Blood. 98, 1469-79). Todas as variantes, inclusive estas variantes de splice, estão inseridas no termo “CEACAM1”.
[00122]Os termos “anticorpo anti-CEACAM1”, “um anticorpo que reconhece a CEACAM1”, “um anticorpo contra a CEACAM1” e “um anticorpo para a CEACAM1” são intercambiáveis, sendo aqui utilizados para fazer menção a um anticorpo que se liga à proteína da CEACAM1 com afinidade e especificidade suficientes.
[00123] O termo "antígeno" na forma aqui utilizada se refere a uma molécula ou a uma porção de uma molécula capaz de evitar a formação de anticorpo e que fica ligada a um anticorpo. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos. A reação específica mencionada acima indica que o antígeno vai reagir, de maneira altamente seletiva, com seu anticorpo correspondente e não com os inúmeros outros anticorpos que possam ser evocados por outros antígenos. Um antígeno de acordo com a presente invenção é uma proteína da CEACAM1 ou um fragmento desta.
[00124]O termo “determinante antigênico” ou “epítopo” na forma aqui utilizada se refere à região de uma molécula do antígeno que reage especificamente com um anticorpo particular. As sequências de peptídeo derivadas de um epítopo podem ser utilizadas, isoladamente ou em conjunto com uma fração do veículo, aplicando os métodos conhecidos na técnica, a fim de imunizar animais e produzir anticorpos policlo- nais ou monoclonais adicionais. Os peptídeos isolados derivados de um epítopo podem ser utilizados em métodos de diagnóstico a fim de detectar anticorpos e como agentes terapêuticos quando a inibição dos ditos anticorpos se fizer necessária.
[00125]Anticorpos, ou imunoglobulinas, compreendem duas cadeias pesadas unidas por ligações dissulfídicas e duas cadeias leves, onde cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada respectiva por ligações dissulfídicas numa configuração em forma de “Y”. A digestão proteolítica de um anticorpo produz os domínios Fv (Frag-mento variável) e Fc (Fragmento cristalino). Os domínios de ligação ao antígeno, Fab, incluem regiões em que a sequência de polipeptídeo é variável. O termo F(ab')2 representa dois braços Fab' unidos por ligações dissulfídicas. O eixo geométrico central do anticorpo é denominado de fragmento Fc. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) acompanhado por diversos domínios constantes (CH).Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) numa extremidade e um domínio constante (CL) na outra, o domínio variável de cadeia leve ficando alinhado ao domínio variável de cadeia pesada e o domínio constante de cadeia leve ficando alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Os domínios variáveis de cada par de cadeias leve e pesada formam o sítio de ligação ao antígeno. Os domínios nas cadeias leve e pesada exibem a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de framework, cujas sequências são relativamente conservadas, unidas por três domínios hipervariáveis conhecidos como regiões determinadoras de complementaridade (CDRs 1-3). Esses domínios contribuem para a especificidade e afinidade do sítio de ligação ao antígeno. O isótipo de cadeia pesada (gama, alfa, delta, épsilon ou mu) determina a classe da imunoglobulina (IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM, respectivamente). A cadeia leve é qualquer uma dentre dois isótipos (kappa, K ou lambda, À) encontrados em todas as classes de anticorpo.
[00126]O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais abrangente e inclui anticorpos monoclonais (inclusive anticorpos monoclonais de comprimento total ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo longos o suficiente para exibir a atividade biológica desejada.
[00127]O anticorpo de acordo com a presente invenção é uma molécula que compreende pelo menos a porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. O anticorpo ou anticorpos de acordo com a invenção incluem anticorpos intactos, como anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais (mAbs), assim como seus fragmentos proteolíticos, como os fragmentos Fab ou F(ab')2. Anticorpos de cadeia simples também estão inseridos no escopo da presente invenção.
[00128]Os "fragmentos de anticorpo" incluem apenas uma porção de um anticorpo intacto, que de maneira geral inclui um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo intacto, logo, retém a capacidade de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo englobados pela presente definição incluem: (i) o fragmento Fab, que tem os domínios VL, CL, VH e CH1; (ii) o fragmento Fab’, que é um fragmento Fab contendo um ou mais resíduos da cisteína no terminal C do domínio CH1; (iii) o fragmento Fd contendo os domínios VH e CH1; (iv) o fragmento Fd’ contendo os domínios VH e CHI e um ou mais resíduos da cisteína no terminal C do domínio CH1; (v) o fragmento Fv contendo os domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo; (vi) o fragmento dAb (Ward et al., Nature 1989, 341, 544-546) que consiste de um domínio VH; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que inclui dois fragmentos Fab’ ligados por uma ponte dissulfídica na região da dobradiça; (ix) moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, Fv de cadeia simples; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; e Huston et al., PNAS (EUA) 1988, 85,58795883); (x) "diacorpos" com dois sítios de ligação ao antígeno que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (vide, por exemplo, o documento EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 64446448); (xi) "anticorpos lineares" compreendendo um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; e a Patente dos Estados Unidos N° 5.641.870).
[00129]Anticorpos de cadeia simples podem ser polipeptídeos compósitos de cadeia simples com capacidade de ligação ao antígeno e que compreendem sequências de aminoácido homólogas ou análogas às regiões variáveis de uma cadeia leve e pesada da imunoglobulina, isto é, VH-VL ligados ou Fv de cadeia simples (scFv).
[00130]O termo “anticorpo neutralizante” na forma aqui utilizada se refere a uma molécula que tem um sítio de ligação ao antígeno para um alvo do ligand ou receptor específico capaz de reduzir ou inibir (bloquear) a atividade ou sinalização através de um receptor, conforme determinado por ensaios in vivo ou in vitro, de acordo com o relatório descritivo.
[00131]O termo "anticorpo monoclonal" na forma aqui utilizada se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, anticorpos individuais que constituam a população são idênticos, exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural potencialmente presentes em quantidades secundárias. Anticorpos monoclonais são altamente específicos e dirigidos contra um único antígeno. Ademais, em contraste aos preparos de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epí- topos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante simples no antí- geno. O modificador "monoclonal" não deve ser entendido como significando que o anticorpo deva ser produzido através de qualquer método particular. Abs monoclonais podem ser obtidos com métodos familiares aos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para uso de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma que foi descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos apresentados em fago empregando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628 ou Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597, por exemplo.
[00132]Os mAbs da presente invenção podem ser de qualquer classe de imu- noglobulina, inclusive IgG, IgM, IgE ou IgA. Um hibridoma que produza um mAb pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Titulagens elevadas de mAbs podem ser obtidas pela produção in vivo onde células de hibridomas individuais são injetadas via intraperitoneal em camundongos Balb/c com priming de pristina para produzir fluido ascítico com concentrações elevadas dos mAbs desejados. Os Abs monoclonais do isótipo IgM ou IgG podem ser purificados de tais fluidos ascíticos, ou dos sobrenadantes da cultura, usando métodos de cromatografia de coluna bastante familiares aos indivíduos versados na técnica.
[00133]O termo "anticorpo humano" na forma aqui utilizada se refere a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponda à sequência de aminoácidos de um anticorpo produzido por um humano e/ou que tenha sido produzido por qualquer técnica de produção de anticorpos humanos como aqui revelado. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente o anticorpo humanizado que compreenda resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos por várias técnicas conhecidas na técnica.
[00134]Os termos "molécula contendo a porção de ligação ao antígeno de um anticorpo" e “fragmentos de ligação ao antígeno” na forma aqui utilizada incluem não apenas moléculas de imunoglobulina intactas de qualquer isótipo e geradas por qualquer microrganismo ou linhagem de célula animal, mas também a fração reativa de ligação ao antígeno dessas moléculas, incluindo, entre outros, o fragmento Fab, o fragmento Fab’, o fragmento F(ab’)2, a porção variável de suas cadeias pesada e/ou leve, minianticorpos Fab (vide o documento WO 93/15210, Pedido de Patente dos Estados Unidos 08/256.790, WO 96/13583, Pedido de Patente dos Estados Unidos 08/817.788, WO 96/37621, Pedido de Patente dos Estados Unidos 08/999.554, cujos conteúdos são aqui incorporados em sua totalidade por meio desta citação), biespe- cíficos diméricos (vide Muller et al., 1998) e anticorpos de cadeia simples que incorporem essa fração reativa, assim como qualquer outro tipo de molécula em que essa fração reativa do anticorpo tenha sido inserida fisicamente. Essas moléculas podem ser fornecidas através de qualquer técnica conhecida, incluindo, entre outras, clivagem enzimática, síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes.
[00135]A invenção também fornece variantes de aminoácido conservadoras das moléculas de anticorpo de acordo com a invenção. Também é possível produzir variantes de acordo com a invenção que conservem a estrutura molecular geral das proteínas codificadas. Dadas as propriedades de aminoácidos individuais que compreendem os produtos de proteína revelados, algumas substituições lógicas serão reconhecidas pelo profissional experiente. Substituições de aminoácido, isto é, "substituições conservadoras," podem ser realizadas, por exemplo, com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. O termo “análogo do anticorpo” na forma aqui utilizada se refere a um anticorpo derivado de outro anticorpo por uma ou mais substituições de aminoácido conservadoras.
[00136]O termo “variante do anticorpo” na forma aqui utilizada se refere a qualquer molécula que compreenda o anticorpo da presente invenção. Por exemplo, proteínas de fusão em que o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é ligado a outra entidade química é considerado uma variante do anticorpo.
[00137]O termo “anticorpo monoclonal não completamente humanizado” na forma aqui utilizada se refere a um anticorpo monoclonal, que tem domínios variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve nos quais as sequências de aminoácido que flanqueiam e/ou imediatamente adjacentes às CDRs não são completamente humanas, isto é, não são idênticas a qualquer sequência homóloga ou correspondente obtida de anticorpos humanos naturais.
[00138]Em formulações farmacêuticas ou medicamentosas, o agente ativo é utilizado, de preferência, junto com um ou mais veículo(s) farmaceuticamente aceitá- vel(s) e opcionalmente junto com quaisquer outros ingredientes terapêuticos. Os veí- culo(s) devem ser farmaceuticamente aceitáveis, no sentido de que devem ser compatíveis com os demais ingredientes da formulação e não indevidamente nocivos ao recebedor. O agente ativo é fornecido em quantidade eficaz para alcançar o efeito farmacológico desejado, conforme descrito acima, e em quantidade adequada para obter a dose diária desejada.
[00139]Tipicamente, as moléculas da presente invenção que compreendem a porção de ligação ao antígeno de um anticorpo ou outro polipeptídeo que inclui um mimético do peptídeo ficarão em suspensão numa solução salina estéril para usos terapêuticos. Em alternativa, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para controlar a liberação do princípio ativo (molécula contendo a porção de ligação ao antígeno de um anticorpo) ou para prolongar sua presença no sistema do paciente. Inúmeros sistemas de entrega de fármacos adequados são conhecidos e incluem, por exemplo, sistemas de liberação de fármaco implantáveis, hidrogéis, hidroximetilcelu- lose, microcápsulas, lipossomas, microemulsões, microesferas, e sistemas do tipo. Os preparos de liberação controlada podem ser elaborados com o uso de polímeros para complexar ou adsorver a molécula de acordo com a presente invenção. Por exemplo, polímeros biocompatíveis incluem matrizes de poli(etileno-covinil acetato) e matrizes de um copolímero polianidrido de um dímero do ácido esteárico e ácido sebácico. A taxa de liberação da molécula de acordo com a presente invenção, isto é, de um anticorpo ou fragmento do anticorpo, dessa matriz depende do peso molecular da molé-cula, da quantidade da molécula na matriz, e do tamanho das partículas dispersas.
[00140]A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma via adequada qualquer, por exemplo, oral, tópica, intranasal, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intra-articular, intralesional ou parenteral. É comum o uso da administração intravenosa (i.v.).
[00141]Os indivíduos versados na técnica básica perceberão claramente que a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de acordo com a presente invenção vai depender, entre outras coisas, da escala de administração, da dose unitária de molécula administrada, se a molécula é administrada em combinação com outros agentes terapêuticos, da condição imunológica e de saúde do paciente, da atividade terapêutica da molécula administrada e do julgamento do médico encarregado do tratamento. Na forma aqui utilizada, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade de molécula necessária para aliviar um ou mais sintomas associados a uma desordem que é tratada ao longo de um período de tempo.
[00142]O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou desordem em um mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco consegue reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, reduzir até certo ponto e, de preferência, fazer cessar) a infiltração da célula cancerosa nos órgãos periféricos; inibir (isto é, reduzir até certo ponto e, de preferência, fazer cessar) a metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados à desordem. Na medida em que consiga impedir o crescimento e/ou exterminar as células cancerosas existentes, o fármaco pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia do câncer, a eficácia in vivo pode ser medida, por exemplo, avaliando a duração da sobrevida, o tempo até a progressão da doença (TTP), as taxas de resposta (RR), duração da resposta, e/ou qualidade de vida.
[00143]O termo "açúcar" se refere a monossacarídeos, dissacarídeos, e po- lissacarídeos, Exemplos de açúcares incluem, entre outros, sacarose, trealose, dextrose, e outros sacarídeos.
[00144]As moléculas da presente invenção na forma de princípios ativos são dissolvidas, dispersas ou misturadas em um excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o princípio ativo como é perfeitamente sabido. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, tampão fosfato salino (PBS), dextrose, glicerol, etanol, ou outras substâncias do gênero e suas combinações. Outros veículos adequados são bastante familiares aos indivíduos versados na técnica. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes de molhamento ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH.
[00145]A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada junto com uma composição antineoplásica. De acordo com uma modalidade específica, a composição antineoplásica compreende pelo menos um agente quimioterápico. O agente quimoterápico, o qual poderia ser administrado junto com o anticorpo de acordo com a presente invenção, ou em separado, pode compreender qualquer agente de mesma natureza conhecido na técnica que demonstre atividade anticancerígena, incluindo, entre outros: mitoxantrona, inibidores da topoisomerase, vincas do veneno do fuso: vinblastina, vincristina, vinorelbina (taxol), paclitaxel, docetaxel; agentes alquilantes: mecloretamina, clorambucil, ciclofosfamida, melfalan, ifos- famida; metotrexato; 6-mercaptopurina; 5-fluorouracila, citarabina, gencitabina; podo- filotoxinas: etopósido, irinotecano, topotecano, dacarbazina; antibióticos: doxorrubi- cina (adriamicina), bleomicina, mitomicina; nitrosoureias: carmustina (BCNU), lomus- tina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina; íons inorgânicos: cisplatina, carboplatina; interferon, asparaginase; hormônios: tamoxifeno, leuprolida, flutamida, e acetato de megestrol.
[00146]De acordo com uma modalidade específica, o agente quimioterápico é selecionado dentre o grupo formado por agentes de alquilação, antimetabólitos, análogos do ácido fólico, análogos da pirimidina, análogos da purina e inibidores correlacionados, alcaloides da vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-asparaginase, inibidor da topoisomerase, interferons, complexos de coordenação de platina, ureia substituída pela antracenediona, derivados da metil hidrazina, supressor adrenocortical, adrenocorticosteróides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos, andrógenos, antian- drógenos, e análogo do hormônio de liberação da gonodotropina. De acordo com outra modalidade, o agente quimioterápico é selecionado dentre o grupo formado por 5- fluorouracila (5-FU), leucovorina (LV), irenotecano, oxaliplatina, capecitabina, paclitaxel e doxetaxel. Dois ou mais agentes quimioterápicos podem ser usados em um coquetel a ser administrado em combinação com a administração do anticorpo anti- CEACAM1.
[00147]O termo "tratamento" na forma aqui utilizada se refere tanto ao tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas e preventivas. Os indivíduos necessitados de tratamento incluem os já portadores da desordem bem como aqueles nos quais a desordem deve ser evitada.
[00148]Os termos "câncer" e "canceroso" se referem a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos cuja característica típica consiste no crescimento irregular das células. Exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a carcinoma, lin- foma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem o câncer do tipo melanoma, de pulmão, tireoide, mama, cólon, próstata, fígado, bexiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, linfoma, mieloide, ovário, útero, sarcoma, biliar ou endométrio.
[00149]O termo "composição antineoplásica" se refere a uma composição útil no tratamento do câncer que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo apto a inibir ou prevenir o crescimento ou a função tumoral e/ou de causar a destruição de células tumorais. Os agentes terapêuticos adequados em uma composição antine- oplásica para o tratamento do câncer incluem, mas não se limitam a agentes quimio- terápicos, isótopos radioativos, toxinas, citocinas como interferons, e citocinas dirigidas a agentes antagonistas, receptores da citocina ou antígenos associados a células tumorais. De preferência, o agente terapêutico é um agente quimioterápico.
[00150]O termo “diagnosticar” na forma aqui utilizada significa determinar a presença ou ausência de uma patologia, classificar uma patologia ou um sintoma, determinar a gravidade da patologia, monitorar a progressão da patologia, prever o desfecho de uma patologia e/ou as perspectivas de recuperação.
[00151]O termo “mutação do resíduo do aminoácido” na forma aqui utilizada se refere a uma substituição, inserção, ou deleção de um único resíduo de aminoá- cido. O termo “mutação reversa do resíduo de aminoácido” como aqui utilizado se refere a uma substituição de um único resíduo de aminoácido encontrado na framework de um anticorpo humano por um resíduo de aminoácido correspondente encontrado na framework de um anticorpo murino.
[00152]Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar algumas modalidades da invenção de maneira mais completa. No entanto, jamais devem ser interpretados como uma limitação ao escopo abrangente da invenção.EXEMPLOS Quadro 1. Sequências de CDR. Um mAb humanizado de acordo com a pre-sente invenção compreende as seis CDRs indicadas abaixo: Quadro 2. Sequências não CDR de regiões variáveis completamente murinas e completamente humanas.
Quadro 3. Sequências não CDR de regiões variáveis de cadeia pesada sub-metidas à mutação reversa humanizadas.
•Aminoácidos sublinhados e em negrito com mutações reversas em relação à sequência murina. Quadro 4. Sequências não CDR de regiões variáveis de cadeia leve humani- zadas submetidas à mutação reversa. •Aminoácidos em negrito e sublinhados com mutações reversas em relação à sequência murina. Quadro 5. Sequências não CDR de regiões variáveis humanizadas submeti- d as à mutação reversa.
[00153]A sequência de cadeia pesada completamente humanizada de referência (ID SEQ N°: 57), nas quais as mutações reversas são introduzidas é constituída por:
[00154]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (ID SEQ N°: 7)- GYAFTNNLIE (ID SEQ N°: 1)- WVRQAPGQGLEWMG (ID SEQ N°: 8)- VINPGSGDTNYNEKFKG (ID SEQ N°: 2)- RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (ID SEQ N°: 9)- GDYYGGFAVDY (ID SEQ N°: 3)- WGQGTTVTVSS (ID SEQ N°: 10).
[00155]A sequência de cadeia leve completamente humanizada de referência (ID SEQ N°: 58), nas quais as mutações reversas são introduzidas é constituída por:
[00156]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (ID SEQ N°: 11)- RTSQDIGNYLN (ID SEQ N°: 4)- WYQQKPGKAPKLLIY (ID SEQ N°: 12)- YTSRLHS (ID SEQ N°: 5)- GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (ID SEQ N°: 13)- QQGKSLPRT (ID SEQ N°: 6)- FGGGTKVEIK (ID SEQ N°: 14)
[00157]Exemplo 1. Desenho das Sequências da região variável do anticorpo enxertadas com a CDR
[00158]Modelos estruturais das regiões V do anticorpo anti-CEACAM-1 quimérico foram produzidas com o uso de Swiss PDB e analisados a fim de identificar aminoácidos nas frameworks da região V que possam ser importantes para as propriedades de ligação do anticorpo (Figura 1). Esses aminoácidos foram anotados para incorporação em um ou mais anticorpos enxertados com CDR variantes. Ambas as sequências VH e VK de CM-10 contêm resíduos de framework típicos e os motivos 1, 2 e 3 da CDR são comparáveis a muitos anticorpos murinos. As CDRs foram obtidas diretamente da sequência murina. Os modelos Swiss PDB foram então analisados, junto com as homologias de camundongo/humanas em posições críticas, para destacar resíduos individuais e regiões de framework suscetíveis de impactar potencialmente a apresentação das CDRs.
[00159]A sequência de aminoácidos da região V de cadeia leve e pesada foram (sic) comparadas contra um banco de dados de sequências humanas da região V da linhagem germinativa a fim de identificar as sequências humanas de cadeia leve e pesada com o maior grau de homologia para uso como frameworks da região V. Uma série de regiões V de cadeia leve e pesada foram então projetadas através do enxerto de CDRs nas frameworks e, se necessário, por mutação reversa na sequência murina de resíduos identificada acima já que potencialmente crucial para a restauração da eficiência de ligação do anticorpo quimérico. Considerou-se que um pequeno número de resíduos de camundongo deveria permanecer retido em cada variante. As sequências de variantes com o menor índice de potenciais epítopos de célula T foram então selecionadas conforme determinado pela aplicação de tecnologias in silico de propriedade exclusiva da Antitope, iTope™ e TCED™ (banco de dados T Cell Epitope) (Perry et al 2008, Bryson et al 2010). O número de mutações reversas foi determinado pela sequência murina inicial. Com base na análise estrutural, foram identificadas no máximo 13 posições em VH e 5 posições em Vk como resíduos que poderiam ser estruturalmente relevantes. Esses foram priorizados e variantes que incorporassem números variáveis daqueles foram projetadas. Muito embora não haja um limite teórico para o número de mutações reversas, quanto mais mutações reversas são incorporadas, menos humana a sequência pode ser. Cinco cadeias VH e três cadeias VK foram projetadas com as sequências descritas nas IDs SEQ N°: 28 a 35.
[00160]O software iTope™ prevê as interações favoráveis entre as cadeias laterais de aminoácidos de um peptídeo e pockets (cavidades) de ligação específica (nas posições de pocket particulares; p1, p4, p6, p7 e p9) no interior dos sulcos de ligação de 34 alelos humanos de MHC classe II. A localização dos resíduos de ligação essenciais é obtida pela geração in silico de peptídeos 9mer que se sobrepõem em um aminoácido que abrange a sequência da proteína de teste. Comparações internas com experimentos de ligação de MHC classe II físicos mostraram que o iTope™ pode ser utilizado para discriminar de maneira bem-sucedida e precisa os peptídeos que se ligam ou não a moléculas de MHC classe II. No entanto, os resultados devem ser avaliados à luz do fato de que todos os métodos preditivos para a ligação ao MHC classe II exageram inerentemente a previsão do número de epítopos da célula T, pois não possibilitam outros processos importantes durante a apresentação ao antígeno, a exemplo do processamento da proteína/peptídeo, do reconhecimento pelo receptor da célula T ou a tolerância da célula T ao peptídeo.
[00161]O TCED™ contém as sequências de todos os peptídeos já submetidos à triagem nos ensaios de mapeamento dos epítopos da célula T EpiScreen™. O TCED™ é utilizado para pesquisar qualquer sequência de teste contra um banco de dados de grande volume (acima de 10.000 peptídeos) de peptídeos através da pesquisa BLAST para selecionar especificamente segmentos que previamente já tenham demonstrado não estimular as respostas da célula T. Além disso, todas as regiões que apresentassem homologia significativa com os epítopos da célula T no banco de dados foram descartadas.
[00162]Todos os genes da região VH e VK enxertada com a CDR da variante para o CM-10 foram sintetizados usando uma série de oligonucleotídeos sobrepostos que foram anelados, ligados e amplificados por PCR para produzir as regiões V de comprimento total sintéticas. As variantes montadas foram então clonadas diretamente em um sistema de vetor de expressão para as cadeias VHe cadeias Vk de IgG1 e IgG4 (S241P). Todos os construtos foram confirmados mediante sequenciamento.
[00163]Os genes do anticorpo quimérico e toda as combinações das cadeias VH e Vk enxertadas com CDR (isto é, um total de 15 pareamentos para cada IgG1 e IgG4 (S241P)) foram transfectados transitoriamente em células HEK293-EBNA (Cat. ATCC N° CRL-10852) usando fosfato de cálcio. As transfecções transitórias foram incubadas por até cindo dias antes da coleta dos sobrenadantes.
[00164]Os anticorpos quiméricos e as variantes enxertadas com a CDR do CM-10 foram purificados a partir dos sobrenadantes da cultura de células transitória em uma coluna de Proteína A em sefarose (Cat. GE Healthcare N° 110034-93), o tampão foi trocado em PBS 1X pH 7,4 e quantificado por OD280nm usando um coeficiente de extinção baseado na sequência de aminoácidos prevista (Ec(0,1%) = ~1,37- 1,40 para o anticorpo quimérico e variantes CM-10). Os anticorpos quiméricos e as variantes lead humanizadas foram analisados por redução com SDS-PAGE. Bandas correspondendo aos tamanhos previstos das cadeias VH e Vk foram observadas sem qualquer evidência de contaminação (Figura 2).
[00165]A ligação do anticorpo quimérico CM-10 purificado junto com os anticorpos quiméricos e cada uma das variantes enxertadas com a CDR da CEACAM-1 humana recombinante foram avaliadas por teste de ELISA competitivo. Uma série de diluição (três vezes) de anticorpos quiméricos ou humanizados de 20 μg/ml a 0,009 μg/ml foi previamente misturada com uma concentração constante do CM-10 quimérico biotinilado (0,005 μg/ml, concentração final) antes de incubada por 1 hora à temperatura ambiente em placa de microtitulação de fundo plano com 96 cavidades Ma- xiSorp da Nunc Immuno (Cat. Fisher N° DIS-971-030J) já revestida com a CEACAM- 1 humana recombinante 0,5 μg/ml (Cat. R&D Systems N° 2244-CM-050) diluída em PBS 1X pH 7,4. A ligação do anticorpo biotinilado foi detectada com estreptavidina- HRP (Cat. Sigma N° S5512) e substrato TMB (Cat. Invitrogen N° 00-2023). A reação foi interrompida com HCl 3M, a absorbância lida a 450nm em leitora de placa MRX TC II da Dynex Technologies e as curvas de ligação representadas.
[00166]Todas as variantes humanizadas renderam perfis de ligação similares ao do CM-10 quimérico com as curvas de ligação mostradas na Figura 3. Esses dados foram utilizados para calcular os valores IC50 de cada anticorpo e normalizados para o IC50 do CM-10 quimérico conforme incluído em cada teste ELISA e conforme mostram os Quadros 6 e 7.
[00167]Quadro 6. Valores IC50 para as variantes da anti-CEACAM-1 humani-zadas.
[00168]Quadro 7. Valores IC50 relativos calculados para as variantes da anti- CEACAM-1 humanizada.
[00169]Os dados da IC50 mostraram uma faixa de 0,84 a 1,56 para todas as variantes testadas, indicando que as eficiências de ligação de todos os anticorpos enxertados com a CDR à CEACAM-1 humana foram comparáveis às do CM-10 quimérico.
[00170]Exemplo 3. Combinação do mAb humanizado à CEACAM1 e a anticorpos anti-PD-1/PD-L
[00171]Os efeitos sinérgicos dos anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a citotoxicidade de células TIL humanas contra células do melanoma humano foram demonstrados. Células de câncer do tipo melanoma humano (MALME 3M) foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. As células TIL humanas (TIL14) foram incubadas com um anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana (CM-24) (0,01μg/ml, 0,05μg/ml, 0,1μg/ml, 0,5μg/ml), um anticorpo monoclonal da PD-1 humana (clone E12.2H7) ou com uma combinação de ambos os anticorpos (0,005, 0,025, 0,05 e 0,25 μg/ml de cada anticorpo) por 30 minutos a 37°C. As células de câncer do tipo melanoma humano tratadas com IFN-ã foram adicionadas para incubação de um dia para o outro, antes da avaliação de citotoxicidade. A Figura 4 demonstra que ambos os anticorpos anti-CEACAM1 e anticorpos anti-PD-1 foram capazes de se ligar aos seus respectivos alvos nos linfócitos humanos, tais como as células TIL, e que essa ligação aumentou significativamente a toxicidade das células TIL humanas contra as células de câncer humanas em cada monoterapia isoladamente. Portanto, concluiu-se que, ao proteger os linfócitos dos sinais imunossupres- sores das células de câncer pretendidas, um nível de citotoxicidade substancial é causado a essas células cancerosas.
[00172]Os efeitos sinérgicos dos anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre os níveis da Granzima B e na citotoxicidade das células TIL humanas contra as células do melanoma humano quando se acrescentam os anticorpos anti-PD-1 antes da adição de anticorpos anti-CEACAM1 também foram mostrados: Células de câncer do melanoma humano (MALME 3M) foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. As células TIL humanas (TIL14) foram incubadas com meio apenas (preto), anticorpo IgG não específico (0,8μg/ml, branco), várias concentrações (0,05μg/ml, 0,1μg/ml, 0,2μg/ml, 0,4μg/ml, 0,8μg/ml) de CM-24, um mAb contra a PD-1 humana (clone E12.2H7) ou uma combinação de ambos os anticorpos (0,05 μg/ml cada, 0,1 μg/ml cada, 0,2 μg/ml cada, 0,4 μg/ml cada, 0,8 μg/ml cada). O anticorpo monoclonal contra a PD-1 humana foi adicionado primeiramente por 30 minutos a 37°C, seguindo-se a adição do mAb contra a CEACAM1 humana. Células do câncer melanoma humano tratadas com IFN-ã foram adicionadas para incubação de um dia para o outro, antes da avaliação de citotoxicidade. O índice de combinação (CI) foi calculado para ser 0,15. No mesmo ensaio, o nível da proteína citotóxica granzima B que é secretada após a ativação da célula citotóxica foi avaliado com o kit comercial de ELISA para Granzima B. A Figura 5 demonstra que os anticorpos anti-CEACAM1 e os anticorpos anti-PD-1 são capazes de se ligar aos seus respectivos alvos nos linfócitos humanos, tais como as células TIL, e que essa ligação aumenta a secreção da granzima B e a toxicidade das células TIL humanas contra as células de câncer humanas. A Figura 5 indica novamente que ao proteger os linfócitos dos sinais imu- nossupressores das células de câncer pretendidas, um nível de citotoxicidade substancial é causado a essas células cancerosas, sugerindo que o tempo pode ser um fator crítico na terapia combinada.
[00173]Efeitos sinérgicos dos anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-L1 sobre os níveis da Granzima B e sobre a citotoxicidade das células TIL humanas contra as células do melanoma humano quando se acrescentam os anticorpos anti-PD-L1 antes da adição de anticorpos anti-CEACAM1 (dados não exibidos). Células do melanoma humano (MALME 3M) foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. Células TIL humanas (TIL14) foram incubadas com meio apenas (preto), anticorpo IgG não específico (0,8μg/ml, branco), várias concentrações (0,05μg/ml, 0,1μg/ml, 0,2μg/ml, 0,4μg/ml, 0,8μg/ml) de um anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana (CM-24), um anticorpo monoclonal contra a PD-L1 humana (clone 29E.2A3) ou uma combinação de ambos os anticorpos (0,05 μg/ml cada, 0,1 μg/ml cada, 0,2 μg/ml cada, 0,4 μg/ml cada, 0,8 μg/ml cada). O anticorpo anti-PD-LI foi adicionado primeiramente por 30 minutos a 37°C, seguindo-se a adição do anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana. Células do câncer melanoma humano tratadas com IFN-ã foram adicionadas para incubação de um dia para o outro antes da avaliação de citotoxicidade. O índice de combinação (CI) foi calculado para ser 0,67. Os resultados representam a média do % de citotoxicidade ±DP conforme determinado pelo ensaio clássico da LDH liberada de três repetições de poços por tratamento. * teste T pareado com P<0,05 comparado à a-PD-L1 apenas. No mesmo ensaio, os níveis da proteína citotóxica granzima B que é secretada pela ativação da célula citotóxica foram avaliados com o kit comercial de ELISA para Granzima B. Os resultados representam o nível médio de granzima B de três poços repetidos por tratamento. Os resultados demonstram que os anticorpos anti-CEACAM1 e os anticorpos anti-PD-L1 são capazes de se ligar aos seus respectivos alvos em linfócitos humanos (tais como as células TIL) e em células cancerosas humanas (tais como as células de melanoma), e que essa ligação aumenta a secreção da granzima B e a toxicidade das células TIL humanas contra as células de câncer humanas. Foi demonstrado ainda que o bloqueio das interações PD-1/PD-L1 e CEACAM1/CEACAM1 pode resultar em efeito sinérgico e que, ao proteger os linfócitos dos sinais imunossupressores PD- 1linfócito/PD-Ligandcélula cancerosa, um nível substancial de citotoxicidade é causado a essas células de câncer, não importando o antígeno pretendido, seja PD-1, PD-L1 ou PD-L2.
[00174]Efeitos sinérgicos dos anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a citotoxicidade de células LAK humanas contra células do melanoma humano quando se acrescentam anticorpos anti-PD-1 antes da adição de anticorpos anti-CEACAM1. Células do melanoma humano (SKMEL28, CEACAM1 positivas, PD-L1 positivas) foram crescidas na presença de IFN-ã visando a induzir a expressão de PD-L1. Células LAK humanas (killer ativada por linfocina) geradas pela ativação de PBMCs de um doador humano saudável com IL-2 (500 unidades/ml) por 7 dias foram incubadas com meio apenas (branco), anticorpo IgG não específico (0,8μg/ml, preto), várias concentrações (0,1μg/ml, 0,2μg/ml, 0,4μg/ml, 0,8μg/ml) de um anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana (CM-24), um anticorpo monoclonal contra a PD-1 humana (clone E12.2H7) ou uma combinação de ambos os anticorpos (0,1 μg/ml cada, 0,2 μg/ml cada, 0,4 μg/ml cada, 0,8 μg/ml cada). O anticorpo monoclonal contra a PD-1 humana foi adicionado primeiramente por 30 minutos a 37°C, seguindo-se a adição do anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana. Células do melanoma humano tratadas com IFN-ã foram adicionadas para incubação de 24 horas, antes da avaliação de citotoxicidade. A Figura 6 demonstra que anticorpos anti-CEACAM1 e anticorpos anti- PD-1 são capazes de se ligar aos seus respectivos alvos nos linfócitos humanos ativados, tais como as células LAK, e que essa ligação aumenta a toxicidade das células LAK humanas contra as células do câncer humano. O índice de combinação (CI) foi calculado para ser < 0,8. A Figura 6 demonstra ainda que a ligação desses anticorpos contra as células LAK está de algum modo inter-relacionada, justificando um estudo posterior acerca de seu mecanismo de ligação, e que este mecanismo está presente em uma variedade de linfócitos ativados.
[00175]O tratamento com anticorpos anti-CEACAM1 aumenta a expressão da PD-L1 nas células cancerosas pretendidas. As células NK humanas (NK92MI) foram incubadas com ou sem um anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana (10μg/ml CM-24), seguindo-se a adição de células de câncer do melanoma humano (SKMEL28). As células foram incubadas por 24, 48 e 72 horas e os níveis da PD-L1 foram medidos em cada ponto no tempo por análise de FACS. A média dos níveis da razão da anti-PD-L1 em relação a um isótipo de controle adequado para os tratamentos indicados em diferentes pontos no tempo é mostrada na Figura 7, demonstrando que a expressão da CEACAM1 e PD-L1 nas células de câncer está de fato inter-relacionada. A adição de anticorpos anti-CEACAM1 resulta na expressão aumentada de PD-L1 nas células cancerosas sobreviventes, servindo para corroborar ainda mais o tratamento combinado com ambos os agentes. O tratamento do câncer pode ser be-neficiado quando os anticorpos anti-CEACAM1 são administrados primeiramente, seguindo-se a administração de anticorpos anti-PD-L1 e/ou anti-PD-L2, já que o número das proteínas PD-L1 nas células de câncer permanece relativamente alto, tornando as células mais sensíveis ao tratamento com anticorpos PD-1/ PD-L1, e sugerindo que a terapia combinada pode melhorar o resultado clínico. A administração de anticorpos diferentes em momentos separados, e não simultaneamente, maximiza o efeito cito- tóxico dos linfócitos contra as células cancerosas. Sem vincular-se a qualquer teoria ou mecanismo, este achado pode estar associado a outra constatação surpreendente da presente invenção, segundo a qual o tratamento com anticorpos anti-CEACAM1 aumenta a expressão da PD-L1 nas células cancerosas de interesse. Hipoteticamente, isso sustentaria a necessidade de uma pluralidade de anticorpos para obter maior eficácia em relação aos linfócitos citotóxicos. É possível antecipar que a administração dos anticorpos anti-PD-1 bloqueia primeiramente as moléculas PD-1 nos linfócitos, a administração subsequente de anticorpos anti-CEACAM1 bloqueia as mo-léculas CEACAM1 nos linfócitos e/ou células cancerosas de interesse e aumenta a expressão dos ligands PD-1 nas células cancerosas pretendidas. No entanto, como as moléculas PD-1 nos linfócitos já estão bloqueadas, os níveis de expressão elevados dos ligands da PD-1 nas células cancerosas de interesse não impedem que os linfócitos exerçam com eficiência seu potencial citotóxico pleno.
[00176]Efeitos sinérgicos dos anticorpos anti-CEACAM1 e anti-PD-1 sobre a progressão do tumor em camundongos imunocompetentes. Células de linfoma murino (5*106, A20) foram aloenxertadas no abdômen de camundongos Balb/C através de injeção subcutânea no dia 1. No dia 10, os tumores alcançaram um volume médio de 45 mm3, e os camundongos foram randomizados em 4 grupos separados (11-12 camundongos por grupo), e receberam uma administração intravenosa de PBS, CC-1 (anticorpo anti-CEACAM1 murina, 6mg/kg, PRM-1 (anticorpo anti-PD-1 murina, 6mg/kg) ou uma combinação de CC-1 e PRM-1 (6mg/kg cada). Os tratamentos foram repetidos nos dias 15 e 20. O efeito de um anticorpo monoclonal contra a CEACAM1 humana isoladamente, de um anticorpo monoclonal contra a PD-1 humana isolada-mente, e de uma combinação de ambos os anticorpos sobre inibição do crescimento tumoral foi acompanhado. Camundongos Balb/C imunocompetentes foram selecionados para este experimento de modo a possibilitar a avaliação da atividade biológica de anticorpos anti-CEACAM1 murina e anti-PD-1 murina em camundongos com sistema imune intacto e avaliar a reação do sistema imune completo contra as células cancerosas murinas. Como um todo, este modelo simula terapias em humanos nas quais os pacientes portadores de câncer receberiam combinações de anticorpos anti- CEACAM1 humana e anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 humana. Sem buscar vinculação a qualquer teoria ou mecanismo, formula-se a hipótese de que uma combinação de anti- CEACAM1 e anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 anticorpos impediria as células cancerosas de escaparem da ativação e da citotoxicidade do sistema imunológico do paciente, gerando uma resposta significativa contra o câncer. A Figura 8 demonstra que anticorpos anti-CEACAM1 e anticorpos anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 são capazes de se ligar aos seus respectivos alvos em células tumorais e/ou células imune in vivo, e que essa ligação combinada atenua significativamente a progressão do tumor quando comparada a cada monoterapia. Este resultado é de suma importância, pois atesta a eficácia e o potencial do uso de uma combinação de anti-CEACAM1 e anti-PD-1/PD-L1/PD-L2, mesmo em tumores estabelecidos de volumes consideráveis, o que simula a configuração clínica em que os pacientes com tumores estabelecidos estão sendo tratados.
[00177]Exemplo 4. Tratamento de combinação com mAb humanizado contra células LAK e CEACAM1.
[00178]Anticorpos anti-CEACAM1 aumentam a citotoxicidade de células LAK humanas contra as células do melanoma humano: células PBMC foram isoladas de um doador saudável seguindo-se a ativação com IL-2 (500 ou 1000 unidades/ml) por 3 dias para gerar uma população de células LAK humanas. Em seguida, as células LAK humanas foram incubadas com 0,1μg/ml, 0,5μg/ml, 2,5μg/ml, 5μg/ml ou 10μg/ml de um anticorpo anti-CEACAMI (CM-24) por 30 minutos a 37°C. Células do melanoma humano (SKMEL28) foram adicionadas para incubação por 24 horas, e depois disso a citotoxicidade foi determinada. A Figura 9 demonstra que, enquanto as células LAK humanas são citotóxicas às células de câncer do melanoma humano por sua ação intrínseca (compare, por exemplo, as duas barras à esquerda), a adição de anticorpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente a citotoxicidade contra essas células de câncer do melanoma humano de forma dose-dependente.
[00179]Anticorpos anti-CEACAM1 aumentam a citotoxicidade de células LAK humanas contra uma variedade de células do câncer de pulmão e pâncreas humano. Células PBMC foram isoladas de um doador saudável seguindo-se a ativação com IL- 2 (500 unidades/ml) por 7 dias para gerar uma população de células LAK humanas. Em seguida, as células LAK humanas foram incubadas com 0,1μg/ml a 10μg/ml de um anticorpo anti-CEACAMI (CM-24) conforme indicado, por 30 minutos a 37°C. Três células diferentes do câncer de pâncreas humano, T3M4, SU8686 e PANC2, e duas células diferentes do câncer de pulmão humano, H358 e H460, foram adicionadas para incubação por 24 horas. A Figura 10 demonstra que, enquanto as células LAK humanas são citotóxicas às células do câncer de pâncreas humano T3M4 por sua ação intrínseca, a adição de anticorpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente a citotoxicidade contra essas células cancerosas humanas de forma dose-dependente.Resultados similares foram obtidos para a outra célula do câncer de pulmão e pâncreas.
[00180]Anticorpos anti-CEACAM1 intensificam a secreção da granzima B de células LAK humanas na presença de células do câncer de pulmão e pâncreas humano. Células LAK humanas foram incubadas com um anticorpo anti-CEACAM-1 (CM-24) em diferentes concentrações por 30 minutos a 37°C. Células do câncer de pâncreas humano T3M4 (A) ou células do câncer de pulmão humano H358 (B) foram então adicionadas para incubação por 24 horas. A secreção da granzima B foi medida por ELISA. Os resultados demonstram que, enquanto as células LAK humanas produzem níveis elevados de Granzima B por si mesmas, a adição de anticorpos anti- CEACAM1 aumenta significativamente os níveis da Granzima B de forma dose-de- pendente.
[00181]Anticorpos anti-CEACAM1 intensificam a secreção de IFN-Y de células LAK humanas na presença de células do câncer humano. Células LAK humanas foram incubadas com um anticorpo anti-CEACAM-1 (CM-24) em diferentes concentrações por 30 minutos a 37°C. As células do câncer de pulmão humano H358 ou H460 foram então adicionadas para incubação por 24 horas. A secreção de IFN-Y foi medida por ELISA. A Figura 11 demonstra que, enquanto as células LAK humanas produzem intrinsecamente níveis elevados de IFN-y, a adição de anticorpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente os níveis de IFN-y de forma dose-dependente.
[00182]Exemplo 5. Expressão da CEACAM1 está correlacionada à presença de mutações B-Raf em células cancerosas.
[00183]A avaliação de amostras de biópsia de 24 pacientes portadores de câncer do tipo melanoma para os níveis de expressão da CEACAM1 e para o genótipo BRAF revelou uma correlação estatisticamente significativa entre a mutação B-Raf V600E e a expressão da CEACAM1. Mais especificamente, enquanto apenas 50% (3/6) das células de melanoma com uma B-Raf do tipo selvagem, isto é, uma valina na posição 600, expressaram níveis detectáveis da CEACAM1 (Ct igual ou inferior a 36 e menos), 100% (18/18) das células de melanoma com uma B-Raf mutada, isto é, um ácido glutâmico na posição 600, expressaram níveis detectáveis da CEACAM1 (Ct igual ou inferior a 36).
[00184]Coloração extracelular da CEACAM1 de células de câncer tratadas com inibidores de B-Raf ou MEK. 1.0*106 células de uma amostra de célula B-Raf W.T. (076mel) e duas amostras de célula B-Raf V600E (526mel, 624mel) foram incubadas com diferentes concentrações de vemurafenib ou selumetinib (0,1 μM ou 1 μM) por 2 a 48 horas. Em cada ponto no tempo, determinou-se a expressão da CEACAM1 nas células por FACS. Equivalentes em volume de DMSO (veículo) foram utilizados como controle. Os resultados demonstraram que, ao passo que o vemurafenib 0,1 μM e 1 μM não mostrou qualquer efeito nos níveis de expressão da CEACAM1 em células que exibiam W.T. B-Raf (076mel), o vemurafenib 0,1 μM e 1 μM mostrou um efeito dose-dependente nos níveis de expressão da CEACAM1 nas células contendo a B- Raf mutada (526mel, 624mel). Os resultados demonstram ainda que o selumetinib apresentou efeito similar ao vemurafenib nas células que portavam a B-Raf mutada (526mel, 624mel), e que, enquanto o selumetinib 1 μM reduziu significativamente os níveis de expressão da CEACAM1 nas células que continham a W.T. B-Raf, mas a N- Ras mutada (sk-mel-2), o vemurafenib 1 μM não provocou qualquer efeito sobre os níveis de expressão da CEACAM1. Esses resultados corroboram ainda mais a regulação da CEACAM1 através da via MAPK constitutivamente ativada, que nesse caso é dirigida pela N-Ras mutada, e não pela B-Raf mutada.
[00185]Células de câncer resistentes ao inibidor mostram aumento na expressão da CEACAM1 e atividade restaurada da via MAPK. Duas amostras de célula B- Raf V600E sensíveis ao vemurafenib (526mel, 624mel) e linhagens celulares resistentes ao vemurafenib derivadas daquelas foram incubadas por 2 dias com vemura- fenib 1μM. As células foram então analisadas para expressão da proteína CEACAM1 por FACS conforme descrito acima. Linhagens celulares resistentes ao vemurafenib foram geradas pelo incremento gradual da concentração do inibidor na cultura, até 0,32μM. Foi demonstrado que as linhagens celulares resistentes ao vemurafenib expressaram níveis mais altos da CEACAM1 do que linhagens celulares sensíveis ao vemurafenib. A atividade da MAPK foi medida em amostras de célula sensíveis ao vemurafenib e B-Raf V600E resistentes ao vemurafenib (624mel) por immunoblotting para a ERK1/2 fosforilada (pERK, Thr202/Tyr204), ERK1/2 total e actina 24 horas depois da exposição ao vemurafenib 160 nM. Nas células B-Raf V600E sensíveis ao vemurafenib, o vemurafenib elimina quase completamente a fosforilação da ERK1/2, sendo que a atividade da MAPK praticamente não foi interrompida pelo vemurafenib nas células B-Raf V600E resistentes ao vemurafenib.
[00186]Células de câncer resistentes ao inibidor regulam positivamente a expressão da CEACAM1. Células de melanoma B-Raf V600E 526mel foram cultivadas na presença de vemurafenib 1 μM. O cultivo foi realizado em RPMI 1640 suplementado com piruvato de sódio 1 mM, Pen-Estrep. 1 mM, L-glutamina 1 mM, aminoácidos não essenciais 1 mM, e soro fetal bovino 10% termicamente inativado. A concentração inicial do vemurafenib foi de 0,01 do IC50 determinado (0,64 nM). A cada semana a concentração era duplicada até 5 vezes o IC50 (320 nM), para gerar células de melanoma resistentes ao vemurafenib. As células foram então testadas para a expressão da CEACAM1 usando MRG1 (anticorpo murino contra a CEACAM1 humana) em cito- metria de fluxo conforme descrito acima. O RNA total foi extraído com TRIZOL e o cDNA foi gerado com uma transcriptase reversa, seguindo os protocolos de rotina. Embora o vemurafenib regule negativamente a expressão da CEACAM1 em células de melanoma B-Raf V600E, essas células regulam positivamente os níveis de expressão da CEACAM1 depois de adquirir resistência ao vemurafenib. É importante notar que os níveis da CEACAM1 em células de melanoma B-Raf V600E depois da resistência adquirida ao vemurafenib são mais elevados que os níveis da CEACAM1 em células de melanoma B-Raf V600E não tratadas (ingênuas ao vemurafenib).
[00187]Células de câncer resistentes ao inibidor regulam positivamente a expressão de ambos os tipos da CEACAM1. As células de melanoma B-Raf V600E 526mel resistentes ao vemurafenib e sensíveis ao vemurafenib mencionadas acima foram testadas para o tipo da CEACAM1 super-expressado depois da resistência adquirida ao vemurafenib por qPCR. Os dados apresentados nas Figuras 12A e 12B demonstram que a expressão dos dois tipos de CEACAM1, CEACAM1-longa (12A) e CEACAM1-curta (12B) é regulada positivamente cerca de três vezes nas células re-sistentes ao vemurafenib do que nas células sensíveis ao vemurafenib.
[00188]Inibidores de B-Raf/MEK aumentam a citotoxicidade induzida pela célula T. Duas amostras de célula B-Raf V600E sensíveis ao vemurafenib (526mel, 624mel) foram testadas em termos de viabilidade na presença de células T citotóxicas, com ou sem o vemurafenib 1 μM. As células de melanoma foram previamente incubadas com o vemurafenib 1μM e em seguida incubadas em conjunto de um dia para o outro com o antígeno pareado ao HLA-A2-células T pareadas na razão efetor-alvo de 5:1. A morte celular foi determinada pela liberação de LDH. Foi demonstrado que o vemurafenib sensibiliza significativamente as células de melanoma contra as células T citotóxicas. Inibidores de B-Raf/MEK e anticorpos contra a CEACAM1 aumentam a citotoxicidade induzida pela célula T contra células cancerosas in vitro.Exemplo 6. O efeito anticancerígeno do CM-24 em diferentes doses in vivo
[00189]Camundongos SCID-NOD foram enxertados via IV com 5x106 células de melanoma (linhagem celular MEL526) e tratados durante 44 dias de acordo com os grupos de tratamento indicados na Figura 13. Os anticorpos foram oferecidos duas vezes por semana em injeção IV e 10x106 TIL foram administradas via IV a cada 10 dias. No dia 49, os camundongos foram sacrificados e os pulmões removidos, fotografados (Figura 13A), pesados (Figura 13B) e as lesões contadas (Figura 13C). A Figura 13A - Fotos digitais dos pulmões dos camundongos imediatamente após a coleta. A Figura 13B - Peso do tumor foi calculado subtraindo o peso do pulmão dos camundongos ingênuos do peso pulmonar médio dos diferentes grupos de tratamento. Os resultados representam o peso médio do tumor ±DP de 7-8 camundongos por grupo de tratamento. A Figura 13C - Número de lesões pulmonares em camundongos individuais nos vários grupos; as linhas pretas representam as medianas do grupo; pulmões com lesões incontáveis receberam a pontuação 100. Teste t pareado foi usado para calcular a significância estatística entre os grupos * P<0,05, ** P<0,025.
[00190]O tratamento com CM-24 na presença de TIL resultou em forte inibição do crescimento tumoral, como é possível observar pela morfologia pulmonar (Figura 13A), pelo peso dos tumores (Figura 13B) e pelo número de lesões pulmonares (Figura 13C), enquanto camundongos tratados com uma IgG de controle mostraram grande carga tumoral e numerosas lesões pulmonares causadas pelo melanoma. A inibição apenas moderada do crescimento tumoral (TGI 47%) foi observada no grupo que recebeu células T reativas humanas contra o melanoma com um anticorpo de controle (TIL + IgG), porém, quando o CM-24 foi adicionado, uma atividade antican- cerígena substancial e dose-dependente foi demonstrada em todas as doses examinadas (TGI de 84%, 87%, 90% e 93% em doses de 1,3, 6 e 10 mg/kg respectivamente) com significância estatística nas doses de 6 e 10 mg/kg (Figura 13B). Registros efetuados por meio de fotos digitais dos pulmões no dia de encerramento do ensaio (Figura 13A) mostraram uma morfologia pulmonar praticamente normal nos camundongos tratados com CM-24 na presença de TIL, indicando que o CM-24 na presença de TIL elimina quase completamente as células malignas.
[00191]No grupo que recebeu o TIL e a IgG de controle, algum efeito antitu- morígeno também foi observado, como era de se esperar. No entanto, quando se compara o efeito sobre camundongos tratados com CM-24 em termos de TGI, número de lesões pulmonares e morfologia pulmonar, diferenças consideráveis foram observadas.
[00192]A avaliação do número de lesões pulmonares revelou números baixíssimos de lesões pulmonares em todos os camundongos tratados com TIL e nas várias doses de CM-24, com nenhum dos pulmões apresentando mais de 10 lesões. Por outro lado, nos grupos IgG ou TIL + IgG, diversos animais mostraram um número elevado de lesões (>100) e as medianas dos grupos foram consideravelmente mais altas que de camundongos tratados com CM-24 (Figura 13C) (100 e 45 nos grupos IgG e TIL + IgG em comparação a 5, 6, 3 e 2, nos grupos tratados com CM-24; P< 0,025).
[00193]Esses efeitos foram observados em baixas concentrações de até 1mg/ml, mas foram estatisticamente significativas em termos de peso pulmonar em concentrações de CM-24 equivalentes a 6 e 10 mg/kg.
[00194]Observações especiais: 1 camundongo do grupo IgG mostrou morbi- dade severa, inclusive paralisia do membro, e foi sacrificado no dia 33 (uma grande carga tumoral foi detectada no pulmão); 1 camundongo do grupo TIL+ IgG mostrou sinais de morbidade e morreu no dia 49, dia de encerramento do ensaio (diversas lesões foram detectadas); 1 camundongo do grupo TIL+ CM-24 mostrou morbidade severa e peso corporal reduzido, tendo sido sacrificado no dia 39 (nenhuma evidência de lesão foi detectada); 3 camundongos do grupo PBS mostraram morbidade severa durante o experimento e foram sacrificados no dia 42 e os outros dois camundongos no dia 48 (uma grande carga tumoral, inclusive um número elevado de lesões no pulmão, foi detectado em todos os camundongos).
[00195]No dia do encerramento, um ensaio baseado em citometria de fluxo em combinação com um kit QuantiBrite foi utilizado para determinar a ocupação do receptor da CEACAM1 pelo CM-24 em TIL humano isolado dos pulmões de camundongos tratados. Os valores de ocupação do receptor (RO) em camundongos tratados com as várias doses de CM-24 demonstraram (Figura 14) que a RO de 50% poderia ser atribuída a concentrações de 1 mg/kg (nível sorológico de CM-24 no sangue) e RO >90% foi demonstrada em doses de 3, 6 e 10 mg/kg (níveis sorológicos de CM24 de 0,3, 48,5 e 111μg/ml, respectivamente). O exame dos valores de RO do CEACAM1 foi realizado com o uso de um ensaio baseado em citometria de fluxo que utiliza o anticorpo CM-24 conjugado a PE e um Kit QuantiBrite Kit (BD). Os resultados representam média ± DP dos valores RO no TIL isolado do pulmão de 8-9 camundongos por grupo de tratamento. Os dados foram analisados pelo software Kaluza.
[00196]A partir dos dados acima, fica claro que uma inibição substancial do crescimento tumoral foi observada em camundongos tratados com CM-24 na presença do TIL, acarretando a eliminação quase completa de células malignas. Embora todas as doses de CM-24 tenham demonstrado respostas anticancerígenas efetivas, doses crescentes mostraram correlação com valores mais altos da inibição do crescimento tumoral (TGI de 84, 87, 90 e 93 correspondendo a doses de 1,3,6 e 10mg/kg respectivamente), que também foram estatisticamente significativas. Os resultados de RO ex vivo demonstram RO >90% nas doses de 3, 6 e 10 mg/kg (níveis sorológicos de CM-24 de 0,3, 48,5 e 111μg/ml respectivamente), ao passo que RO de 50% foi detectada na dose de 1mg/kg. Quando se avaliam os dados de RO de camundongos tratados com CM-24 na dose de 1mg/kg, muito embora as concentrações sorológicas de CM-24 sejam bastante baixas, os dados de RO demonstram que o CM-24 ainda está ligado ao TIL nos pulmões, sugerindo que o CM-24 pode mediar um efeito dura-douro in vivo no microambiente tumoral.
[00197]Esses resultados sustentam o modo de ação do CM-24 como enhancer da atividade citotóxica das células efetoras contra células malignas e mostram que o CM-24 é um potente agente anticancerígeno.
[00198]O CM-24 é um anticorpo monoclonal anti-CEACAM1 humana da IgG humanizada que se liga ao domínio do N terminal da CEACAM1 e que bloqueia a interação da CEACAM1 intercelular entre linfócitos ativados e células tumorais; o bloqueio das interações CEACAM1 pelo CM-24, portanto, é sugerido para intensificar a atividade de extermínio dos linfócitos e se apresenta como caminho promissor na busca da imunoterapia contra o câncer.
[00199]O CM-24 mostra alta afinidade e ligação seletiva à CEACAM1 humana, o que é expressado por células tumorais ou linfócitos ativados. Dados em modelos imunomoduladores in vitro demonstraram que o CM-24 é um potente bloquea- dor das interações intercelulares CEACAM1-CEACAM1 e que podem intensificar a morte citotóxica de várias células tumorais positivas para as células killers ativadas pela linfocina (LAK) e NK positivas para a CEACAM-1 e linfócitos infiltrantes de tumores (TIL). O aumento da atividade de extermínio induzida pelo CM-24 pode ser mediado pela granzima B e pela secreção de IFNY conforme demonstrado em vários modelos.
[00200]O CM-24 intensifica a atividade citotóxica de células efetoras na presença de células tumorais positivas à CEACAM1 e no contexto de uma reação de célula T limitada pelo antígeno leucocitário humano (HLA) específico. O CM-24 não intensifica a atividade citotóxica dos linfócitos efetores contra as células positivas à CEACAM1 não de interesse (células normais humanas). Além disso, os dados mostram que o CM-24 não produz efeitos agonistas semelhantes ao ligand, funções efe- toras relacionadas ao FC ou efeitos diretos. A ligação do CM-24 à CEACAM1 não induz atividade agonista, e nenhum efeito do CM-24 sobre as células efetoras pôde ser observado na ausência de células de interesse conforme demonstrado nos ensaios funcionais in vitro. Também não é esperado que o CM-24 induza a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), pois é uma IgG4 é (sic) incapaz de se ligar ao componente do complemento - C1q e o mediador da ADCC -FcY-RIIIa e não produz qualquer efeito direto sobre a taxa de proliferação ou sobre a viabilidade de células primárias positivas à CEACAM-1 (linfócitos, células epiteliais e endoteliais).
[00201]Vários modelos de xenoenxerto de tumor in vivo demonstram que o CM-24 tem uma clara atividade anticancerígena, que é acompanhada por um aumento na atividade imunológica das células T no interior do tumor.
[00202]O bloqueio da CEACAM1 aliviaria a inibição mediada pela CEACAM1 dos linfócitos infiltrantes de tumor positivos à CEACAM1 que encontram células de câncer positivas à CEACAM1 no microambiente do tumor. O efeito imunológico supostamente é a acentuação da resposta imunológica local contra as células tumorais, o que presumidamente resulta na sua eliminação e na subsequente regressão clínica.
[00203]A avaliação pré-clínica de segurança com relação ao CM-24 incluiu a avaliação do efeito do CM-24 na proliferação da célula T e na secreção da citocina pró-inflamatória. Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e o sangue total de 10 doadores saudáveis foram avaliados e o anticorpo apresentado tanto pela forma solúvel quanto pela forma imobilizada. Não houve qualquer proliferação aparente induzida pelo CM-24 nem qualquer secreção significativa da citocina pró-inflamatória nos formatos de estimulação imobilizada revestida a seco ou solúvel.
[00204]Realizou-se um estudo de doses repetidas por 6 semanas em macacos rhesus a fim de avaliar a toxicidade e a toxicocinética do CM-24. O CM-24 foi administrado em infusão intravenosa (IV) (a via de administração clínica pretendida) uma vez a cada duas semanas para o total de 4 doses (simulando o ciclo de tratamento pretendido em pacientes oncológicos) em doses representando 2,5X (25 mg/kg) e 10X (100 mg/kg) da dose máxima projetada em humanos (10 mg/kg). Não foram observadas reações adversas claras associadas ao tratamento, achados patológicos grosseiros ou microscópicos ou eventos de mortalidade. Oftalmoscopia e ele- trocardiografia indicaram ausência de achados relacionados ao tratamento. Além disso, todos os exames de sangue e urina observados ficaram dentro das faixas normais para macacos Rhesus. Tomados em conjunto, o estudo essencial de toxicologia de doses repetidas GLP em macacos Rhesus não exibiu toxicidades relacionadas ao tratamento em qualquer nível de dose, e o Nível Sem Efeitos Adversos Observados (NOEL) foi determinado como sendo de 100 mg/kg. A avaliação toxicocinética mostrou um aumento proporcional à dose na exposição ao CM-24 (Cmax, AUC) quando administrado por infusão IV. Um ligeiro aumento em Cmax e AUC no dia 42 em comparação ao dia 0 poderia sugerir o potencial para algum acúmulo do CM-24 quando o mAb é administrado por este ROA e regime de dosagem nesses níveis de dose. Apenas um único animal no Grupo 2 (25 mg/kg) mostrou uma resposta positiva ao anticorpo anti-CM-24, sugerindo que a resposta ADA muito provavelmente não teve efeito sobre o estudo farmacocinético ou de toxicidade. Este resultado não representa uma forte resposta imunogenicidade à dosagem repetida com os resultados da CM-24.
[00205]A dose inicial clinicamente segura para o CM-24 com base em MABEL determinado a partir de experimentos in vivo nos resultados de modelos de xenoen- xerto de tumor de camundongo está na faixa de 0,2-1 mg/kg, incluindo um fator de segurança de 10 vezes. O estudo essencial de toxicologia de doses repetidas de GLP em macacos Rhesus não apresentou toxicidades ligadas ao tratamento em qualquer nível de dose, e o Nível Sem Efeitos Adversos Observados (NOEL) foi determinado como sendo de 100 mg/kg (dose equivalente para humanos (HED) de 100 mg/kg em base peso a peso), o que claramente corrobora a faixa determinada pela avaliação MABEL. Os resultados do ensaio de produção de citocina pró-inflamatória e de proliferação de PBMC in vitro/ex vivo não demonstraram qualquer indução substancial da proliferação da célula T e da produção da citocina pró-inflamatória.
[00206]Exemplo 8. Um Estudo de Fase 1, Aberto, Multicêntrico, com Múltiplas Doses do CM-24 em Indivíduos com Malignidades Recorrentes ou Avançadas Selecionadas
[00207]Seis tipos de tumores - melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas adenocarcinoma, câncer gástrico, colorretal, bexiga e ovariano - foram selecionados para o corrente estudo, por serem representativos dos tumores para os quais há uma grande necessidade de novas terapias; aqueles para os quais existe um precedente para respostas clínicas a outras imunoterapias; e aqueles para os quais dados patológicos correlacionados relativos sugerem que a via da CEACAM1 é importante para a progressão do tumor.
[00208]O estudo inclui 2 fases: A Porção de Progressão da Dose e a Porção da Coorte de Expansão. A Porção de Progressão da Dose tem duração mínima de 12 semanas começando com 4 infusões (Ciclo 1) para cada indivíduo. Os indivíduos que não apresentam Toxicidade Limitante da Dose (DLT) e exibindo benefício clínico (Resposta Completa - CR, Resposta Parcial - PR, Doença Estável - SD), assim como os indivíduos portadores de Doença Progressiva - PRD em avaliação de imagem e que de resto estejam clinicamente estáveis, são tratados por até 5 ciclos adicionais no total (Período de Tratamento Continuado), e esse tratamento adicional tem duração máxima de 38 semanas e duração mínima de 25 semanas de acompanhamento (total de 75 semanas / aproximadamente 15 meses). O tratamento na Porção de Expansão tem duração máxima de 46 semanas e duração mínima de 25 semanas de acompanhamento (total de 71 semanas / aproximadamente 14 meses) em indivíduos portadores de melanoma cutâneo.
[00209]Avaliar a segurança e a tolerabilidade de múltiplas doses progressivas do CM-24 (administrado por via intravenosa) e
[00210]Determinar a dose de Fase 2 recomendada do CM-24, em indivíduos portadores de malignidades avançadas ou recorrentes que incluam cânceres como melanoma, adenocarcinoma pulmonar de célula não pequena, e gástrico, colorretal, bexiga e ovário.
[00211]Caracterizar o perfil farmacocinético de múltiplas doses do CM-24.
[00212]Caracterizar a imunogenicidade do CM-24.
[00213]Avaliar a eficácia primária com base na resposta objetiva do tumor e a duração da resposta em indivíduos tratados com o CM-24.
[00214]Explorar um biomarcador preditivo em potencial associado à atividade clínica do CM-24 com base nos níveis de expressão da CEACAM1 em espécimes de tumor antes do tratamento.
[00215]Investigar a atividade imunomoduladora do CM-24 em populações de células imunológicas selecionadas e fatores solúveis em tumores e no sangue periférico.
[00216]Avaliar a sobrevida geral em indivíduos tratados com o CM-24.
[00217] A Porção de Progressão da Dose: A dosagem do fármaco do estudo é programada para ser administrada de forma escalonada iniciando com 0,01 mg/kg, e continuando até 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, e 10 mg/kg. É atribuído aos indivíduos um nível de dose segundo sua ordem de entrada no estudo. Para os dois primeiros níveis de dose (0,01mg/kg e 0,03mg/kg) 1 paciente em cada coorte é recrutado em um desenho rápido no qual uma única toxicidade relacionada ao fármaco de grau 2 resulta na expansão para um desenho 3 + 3 na dose e em todas as doses subsequentes. Para os indivíduos nas duas coortes inferiores (0,01mg/kg e 0,03mg/kg) (sic) Progressão da dose da primeira coorte de baixa dose de um único paciente (0,01mg/kg) até a coorte seguinte (0,03mg/kg), e da segunda coorte de dose única (0,03mg/kg) até a coorte seguinte (0,1mg/kg) começa depois de uma janela DTL de 6 semanas, se não tiver ocorrido toxicidade equivalente ou acima do Grau 2. Para níveis de dose iguais e acima de 0,1 mg/kg, pelo menos 3 pacientes por coorte são recrutados em um desenho 3 + 3 tradicional, a menos que ocorra DLT, e nesse caso a coorte é expandida para 6 pacientes. A progressão até a coorte seguinte começa somente depois de uma janela DTL de 8 semanas, começando pela primeira administração do fármaco do estudo do primeiro indivíduo de cada coorte.
[00218] O Período de Dosagem inclui três períodos: Triagem, Dosagem e Acompanhamento: 1) 4 doses repetidas que compreendem o primeiro ciclo, seguindo- se um período de observação de 6 semanas), 2) um Período de Tratamento Continuado (ciclos 2-6) e 3), um Período de Acompanhamento que inclui a avaliação da so- brevida geral. Cada ciclo de tratamento compreende 4 doses de administração do fármaco no estudo a cada 2 semanas. Pelo menos 3 indivíduos por coorte são recrutados em um desenho 3 + 3 tradicional. O número mínimo planejado de indivíduos recrutados nesta porção é de 17, podendo aumentar em caso de Toxicidades Limitan- tes da Dose (DLTs). Na ocorrência de DLT em um dado nível de dose, este nível de dose é expandido para 6 indivíduos, logo, o número máximo de indivíduos na Porção de Progressão da Dose é de 42.
[00219] Os indivíduos recrutados recebem 4 tratamentos, uma vez a cada 2 semanas (Ciclo 1) seguindo-se uma Janela de Observação de 6 semanas; quando os indivíduos apropriados ingressam no período de Tratamento Continuado durante o qual recebem os outros Ciclos (2-6). Durante este Período de Tratamento Continuado, os indivíduos são submetidos a avaliações clínicas e laboratoriais incluindo exame físico (peso corporal, sinais vitais e saturação de oxigênio), farmacocinética e farma- codinâmica, coleta de citocina, bem como testes laboratoriais de segurança e ensaios de segurança imunológica e registro do ECG. Todos os indivíduos são submetidos a uma avaliação de resposta uma semana e cinco semanas depois do ciclo 1, com base nas avaliações clínicas e de imagem. Uma vez elegíveis para prosseguir no estudo, outras avaliações de resposta são realizadas imediatamente antes do início do ciclo seguinte. Depois do último ciclo de tratamento continuado, os indivíduos são acompanhados em termos de segurança, eficácia e sobrevida.
[00220]A Porção de Expansão: Até 20 indivíduos portadores de melanoma cutâneo metastático foram recrutados e tratados na dose de Fase 2 recomendada (RP2D), que inclui 3 períodos: Triagem, Dosagem e Acompanhamento. O Período de Dosagem consiste em 6 ciclos de 4 tratamentos cada, administrado a cada 2 semanas. O Período de Acompanhamento inclui a avaliação da sobrevida geral.
[00221]Os indivíduos recrutados recebem a dose da Fase 2 recomendada a cada 2 semanas em cada ciclo. Quatro tratamentos são administrados e os indivíduos continuam o tratamento até os 6 ciclos. Durante o Período de Dosagem, os indivíduos são submetidos a avaliações clínicas e laboratoriais conforme detalhado acima.
[00222]Os indivíduos devem passar por um período de “eliminação” de pelo menos 4 semanas antes da primeira administração do fármaco do estudo de todos os agentes quimioterápicos e experimentais anteriores, exceto imunomoduladores (por exemplo, mas não se limitando a: anticorpos anti-CTLA4, anti-PD-L1, anti-PD-1, IL-2) que demandam um período mínimo de “eliminação” de 6 semanas antes da primeira administração do fármaco do estudo, e todos os eventos adversos retornaram à linha de base ou estabilizaram no Grau 1 ou abaixo dele.
[00223]Os indivíduos portadores de melanoma com melanoma positivo à mutação B-Raf V600E ou V600K devem ter progredido, ou foram intolerantes à terapia anterior do inibidor de B-Raf e/ou MEK.
[00224]Porção de Progressão da Dose
[00225]O Ciclo 1 consistirá de um Período de Dosagem Repetida de 6 semanas (4 doses, cada uma com 2 semanas de diferença); e um período de observação de 6 semanas.
[00226]É necessário um intervalo mínimo de 1 semana entre o primeiro tratamento de qualquer indivíduo em uma coorte da dose e o primeiro tratamento para o indivíduo subsequente naquela coorte da dose.
[00227]Os indivíduos são acompanhados de perto durante o Período Inicial do Estudo de 12 semanas. Todos os indivíduos são submetidos à avaliação de resposta uma semana e cinco semanas depois de terminado o ciclo 1 para comprovação e confirmação do benefício clínico, definido como doença estável (SD), resposta parcial (PR) ou resposta completa (CR) na Semana 12. Os indivíduos comprovadamente portadores de Doença Progressiva (PRD) nas imagens da Semana 7 ou da Semana 11 depois de aprovados no Formulário de Consentimento Informado (ICF), podem continuar participando do estudo e do tratamento continuado com o CM-24, se o investigador considerar clinicamente seguro nos termos das Normas de Interrupção da Seção de Deterioração Clínica e posteriormente avaliados na semana 15. Se as imagens de acompanhamento na Semana 15 confirmarem PRD, o indivíduo não dá continuidade ao tratamento em virtude da progressão confirmada da doença.
[00228]Todos os indivíduos com DLTs, inclusive DLTs tardias, descontinuarão outras dosagens do CM-24, mas não são retirados do estudo.
[00229]Os indivíduos retirados do estudo antes da conclusão das 3 primeiras administrações do fármaco no estudo no Período Inicial do Estudo (Ciclo 1) são substituídos. Os indivíduos retirados por qualquer outra razão, exceto a revogação do consentimento informado, são acompanhados ao longo de 4 visitas de acompanhamento pelo período de seis meses.
[00230]Os Ciclos 2-6 são mencionados como o Período de Tratamento Continuado. Depois do Período Inicial do Estudo, os indivíduos com comprovado benefício clínico, definido como SD, PR ou CR segundo os critérios de RECIST 1.1 modificados e sem Toxicidade Limitante da Dose (DLT) comprovada na Semana 12, podem prosseguir com o tratamento com o CM-24 no mesmo nível de dose recebido durante o Período Inicial do Estudo por mais 5 ciclos de tratamento. Os indivíduos com PRD que tenham sido confirmados, mas sem agravamento de seu quadro e de resto em melhor condição clínica ou em condição clínica estável, devem prosseguir em tratamento com o fármaco do estudo até futura progressão ou deterioração clínica.
[00231]Cada ciclo de tratamento completo do Período de Tratamento Continuado compreende 4 doses do fármaco do estudo administradas com intervalo de 2 semanas, nos dias 1, 15, 29, e 43. A resposta é avaliada entre os dias 52 e 56 de cada ciclo de tratamento. A avaliação da resposta deve ser finalizada antes da administração da primeira dose do ciclo seguinte.
[00232]Durante o Período de Tratamento Continuado, indivíduos com PRD confirmada, mas sem agravamento de seu quadro e de resto em melhor condição clínica ou em condição clínica estável, devem prosseguir o tratamento com o fármaco do estudo até futura progressão ou deterioração clínica.
[00233]Após a última administração do CM-24 no Período de Tratamento Continuado, cada indivíduo é acompanhado durante 4 visitas de acompanhamento por um período de seis meses.
[00234]Todos os indivíduos com DLTs, inclusive DLTs tardias, descontinuam outras dosagens com o CM-24, mas não são retirados do estudo.
[00235]A sobrevida de todos os indivíduos é acompanhada indefinidamente.
[00236]Expansão da Coorte
[00237]Para os dois primeiros níveis de dose (0,01mg/kg e 0,03mg/kg) 1 paciente em cada coorte é recrutado em um desenho rápido no qual uma única toxicidade relacionada ao fármaco de grau 2 resulta na expansão para um desenho 3 + 3 na dose e em todas as doses subsequentes. Para os indivíduos nas duas coortes inferiores (0,01mg/kg e 0,03mg/kg) (sic) Progressão da dose da primeira coorte de baixa dose de um único paciente (0,01mg/kg) até a coorte seguinte (0,03mg/kg), e da segunda coorte de dose única (0,03mg/kg) até a coorte seguinte (0,1mg/kg) começa depois de uma janela DTL de 6 semanas, se não tiver ocorrido toxicidade equivalente ou acima do Grau 2. Com relação aos níveis de dose iguais ou acima de 0,1 mg/kg, pelo menos 3 pacientes por coorte serão recrutados no desenho 3 + 3 tradicional, a menos que ocorra DLT, e nesse caso a coorte é expandida para 6 pacientes. A progressão até a coorte seguinte começará somente depois de uma janela DTL de 8 semanas, começando a partir da primeira administração do fármaco no estudo do primeiro indivíduo de cada coorte.
[00238]Se nenhum outro indivíduo na coorte de 6 indivíduos apresentar DLT, então, após a revisão dos dados de segurança para todos os indivíduos pelo Comitê de Segurança, a progressão da dose é permitida.
[00239]Se 2 ou mais indivíduos numa coorte de dose de 3 ou 6 indivíduos desenvolverem DLTs, a progressão da dose é interrompida, e:
[00240]Se a coorte do nível de dose anterior já não tiver sido expandida para 6 indivíduos, será expandida para 6 indivíduos.
[00241]Se a coorte do nível de dose anterior já tiver sido expandida para 6 indivíduos, o Comitê de Segurança, depois de revisar todos os dados de segurança até o momento, poderá:
[00242]Considerar o nível de dose (anterior) como a dose de Fase 2 recomendada (RP2D), ou
[00243]Recomendar a avaliação de uma nova coorte numa dose intermediária.
[00244]A dose da Fase 2 recomendada (RP2D) é definida como o maior nível de dose em que no máximo 1 de cada 6 indivíduos revela DLT.
[00245]Progressão da Dose
[00246]Se não detectadas DLTs na janela DTL de 6 semanas para duas coortes inferiores, e para as coortes restantes, uma janela DTL de 8 semanas, então a coorte seguinte é iniciada e o mesmo padrão repetido. Há um período de espera de uma semana entre o recrutamento dos indivíduos em cada nível de dose da coorte. Antes da progressão da dose, os dados de segurança disponíveis para todos os indivíduos tratados no estudo até o momento, inclusive a coorte corrente, são avaliados pelo Comitê de Segurança.
[00247]A dosagem (ciclo 1) da coorte da dose seguinte é iniciada somente depois de concluída a repetição de dosagem (ciclo 1) para todos os indivíduos na coorte da dose precedente. O cronograma da revisão do Comitê de Segurança se baseia em dados sugerindo que o desenvolvimento de irAEs nos pacientes tratados com outros imunomoduladores ocorrem de 5-10 semanas de administração. No caso de ocorrência de DLT, e havendo necessidade de expansão da coorte da dose de tratamento para seis indivíduos, a janela de DLT é expandida para abarcar toda a repetição de dosagem (Ciclo 1) de todos os seis indivíduos.
[00248]Se, depois da intensificação da dose, 2 ou mais DLTs tardias forem constadas em dose inferior, e que esse AE possa ser uma possível DLT tardia relacionada ao CM-24, a dose acumulada é suspensa temporariamente e o Comitê de Segurança é notificado em 24 horas. O Comitê de Segurança avaliará prontamente o evento e as informações relevantes, inclusive os dados PK, e fará todo o ajuste necessário na dose e/ou no esquema de progressão da dose. As mesmas etapas devem ser cumpridas (sic) 2 ou mais DLTs tardias ocorrerem em uma coorte expandida para 6 indivíduos já testada.
[00249]As DLTs tardias serão revisadas pelo Comitê de Segurança em observância às diretrizes e as decisões são tomadas caso a caso. Essas ações poderiam incluir a aplicação das normas de progressão de DLT, recuando para uma dose menor ou intermediária, ou não adotando qualquer medida caso o evento relacionado à dose examinado não seja suficientemente grave para sustar a progressão da dose e a atual dosagem não seja considerada arriscada para os indivíduos.
[00250]Porção de Expansão
[00251]A Porção de Expansão deste estudo permite o recrutamento de até 20 indivíduos portador de melanoma cutâneo avançado. Outros ramos de expansão de até 20 indivíduos podem ser abertos, condicionados à alteração do protocolo, nas indicações previamente estudadas durante a Porção de Progressão da Dose do ensaio, se indícios de eficácia precoces assim corroborarem. Os indivíduos recrutados são tratados na RP2D por até seis ciclos, sendo o tratamento administrado nos dias 1, 15, 29, e 43. A resposta é avaliada entre os dias 52 e 56. A avaliação da resposta deve ser concluída antes da administração da primeira dose no ciclo seguinte.
[00252]O recrutamento pode ser mantido na Porção de Expansão se a taxa de DLTs for >33%. Indivíduos tolerantes ao fármaco do estudo não são excluídos automaticamente da dosagem continuada até a revisão do Comitê de Segurança, e podem continuar com a dosagem enquanto tolerada, a menos que instruídos de outra forma em consequência da revisão de segurança. Feita a análise de segurança, toma- se a decisão de retomar o recrutamento e de prosseguir com a dosagem na dose atual ou de continuar o recrutamento de outros indivíduos em dose mais baixa. No tocante às DLTs, o recrutamento é realizado e/ou reiniciado após a revisão do Comitê de Segurança.
[00253]Diretrizes Relativas às Decisões de Tratamento
[00254]A resposta do tumor é avaliada segundo os Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST 1.1). O término das avaliações de resposta do tumor do ciclo para todos os indivíduos ocorre no prazo de dias 52 a 56 de cada ciclo de tratamento (os resultados das avaliações devem ser revisados e documentados antes da primeira dose do ciclo seguinte). Depois de cada ciclo de tratamento (continuidade ou expansão), a decisão de tratar um indivíduo com um ciclo adicional de CM-24 se baseia na avaliação do tumor, a menos que o indivíduo desenvolva um evento adverso > Grau 3 (CTCAE) ou outro evento adverso relacionado ao CM-24 que impeça o tratamento adicional. Os indivíduos são tratados até se confirmar uma resposta completa (CR) ou uma doença progressiva (PRD) que tanto seja confirmada quanto apresente evolução adicional conforme descrito abaixo. Indivíduos com PRD confirmada mas não agravada, e que de resto exibam melhor condição clínica ou condição clínica estável (isto é, situação de desempenho no ECOG não reduzida) devem prosseguir o tratamento com o fármaco do estudo até que haja uma futura progressão ou deterioração clínica, conforme explicado mais detalhadamente a seguir.
[00255]Indivíduos com Melhor Resposta Geral (BOR) de CR, PR ou SD continuam a receber o tratamento com CM-24 até a primeira ocorrência entre qualquer uma das elencadas abaixo:
[00256]CR confirmada;
[00257]Deterioração clínica sugerindo a improbabilidade de benefícios adicionais com o tratamento;
[00258]Satisfazer os critérios para a descontinuação da terapia do estudo (DLT) ou outra intolerância à terapia; ou
[00259]Recebimento do número máximo de ciclos.
[00260]Período de Acompanhamento
[00261]Os indivíduos são acompanhados por no mínimo seis meses a contar da última infusão do tratamento. A 1a visita de acompanhamento ocorrerá no prazo de 7 dias da última avaliação de imagem. As visitas de acompanhamento 2-4 ocorrerão com intervalos de 56 dias. Além disso, a condição de sobrevida é avaliada aproximadamente a cada 3 meses, indefinidamente, através de telefonema ou contato pessoal, após a conclusão ou descontinuação do tratamento, e acompanhamento do estudo. As datas de morte são informadas para todos os indivíduos falecidos. As avaliações da sobrevida geral são realizadas até a conclusão ou término do estudo pelo Patrocinador. Nenhum outro dado (por exemplo, terapias subsequentes, situação de desempenho, etc.) além da sobrevida é coletado durante os telefonemas ou visitas.
[00262]Quando um indivíduo descontinua o tratamento com o fármaco do estudo, a data e o motivo para a descontinuação do fármaco do estudo devem constar dos documentos originais, e o indivíduo deve ingressar no Período de Acompanhamento. Quando um indivíduo é retirado do estudo (durante o Período de Tratamento ou Acompanhamento), é necessário envidar todos os esforços possíveis para garantir que todas as avaliações associadas àquela visita do estudo sejam realizadas e a data e o motivo para a descontinuação do estudo constem nos documentos originais.
[00263]Após a conclusão dos períodos de tratamento e acompanhamento, todos os indivíduos sobreviventes são acompanhados com relação à condição de so- brevida a cada 3 meses, indefinidamente.
[00264]Descrição Física do Fármaco do Estudo
[00265]O CM-24 é fornecido num frasco de 10mL de uso único. Cada frasco contém uma solução concentrada com o equivalente a 100mg de CM-24 (10mg/mL).
[00266]O CM-24 é administrado na forma de infusão intravenosa, com um filtro em linha de 0,2 mícron nas doses específicas do protocolo.
[00267]Instruções para o preparo das diferentes doses:
[00268]Para indivíduos recebendo doses de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg e 1,0 mg/kg, uma bolsa de 50 mL para IV contendo cloreto de sódio a 0,9% é utilizada para o preparo. A infusão deve prosseguir à taxa de 1,0 mL/minuto. O arredondamento durante o preparo da dose somente deve ser efetuado quando absolutamente necessário e somente de modo a permitir que a concentração mínima de 0,25 mg/mL seja mantida.
[00269]Para indivíduos recebendo uma dose de 3 mg/kg, uma bolsa de 100 mL para IV contendo cloreto de sódio a 0,9% é utilizada para o preparo. A infusão deve prosseguir à taxa de 2,0 mL/minuto. O arredondamento durante o preparo da dose somente deve ser efetuado quando absolutamente necessário.
[00270]Para indivíduos recebendo uma dose de 10 mg/kg, uma bolsa de 250 mL para IV contendo cloreto de sódio a 0,9% é utilizada para o preparo. A infusão deve prosseguir à taxa de 3,0 mL/minuto. O arredondamento durante o preparo da dose somente deve ser efetuado quando absolutamente necessário.
[00271]Marcadores Farmacodinâmicos (PD)
[00272]Amostras de sangue são coletadas e testadas para ensaios imunoló- gicos e outras avaliações nos seguintes pontos no tempo: pré-dose da 1a administração do fármaco no estudo, 48 horas depois da 1a e 4a dose da administração do fár- maco do estudo do ciclo 1, e pré-dose da 4a (última) dose de cada ciclo completo (ciclos 2-6 de progressão da dose, e todos os ciclos da coorte de expansão), Visitas de Acompanhamento 2-4, e incluem:
[00273]subtipos de linfócito (CD4, CD8 e CD56) em combinação com marcadores de ativação (CD69, CD107a e HLA-DR), Células T Reguladoras por separação de células ativada por fluorescência (FACS)
[00274]expressão da CEACAM1 em subtipos de linfócito
[00275]CEACAM1 solúvel e Granzima B sorológicos
[00276]percentual de ocupação do receptor da CEACAM1 pelo CM-24
[00277]células supressoras derivadas da linhagem mieloide (MDSCs) (CD14+, baixo HLADR, CD11b+)
[00278]proteínas do ponto de checagem imunológico, por exemplo, PD-1, TIM-3, LAG, Vista
[00279]Farmacocinética (PK)
[00280]A farmacocinética é inicialmente estudada durante a Porção de Progressão da Dose durante a primeira infusão (primeira dose do ciclo 1) e durante as quartas infusões (última dose do ciclo 1). Os níveis prévios à dose também são obtidos antes de cada tratamento no 1° ciclo. Indivíduos da Dose de Expansão Adicional (até 6) podem ser testados para a avaliação PK na RP2D preliminar, se for considerada justificada uma caracterização PK mais robusta do CM-24.
[00281]O perfil PK plasmático CM-24 é avaliado até 15 dias pós-dose para a primeira dose e 36 dias pós-infusão para a quarta dose. Os parâmetros PK adiante são derivados da concentração plasmática versus perfis de tempo: Cmax, t1/2, Tmax, AUCo-t, e AUCo-~.
[00282]As amostras são obtidas na primeira e quarta infusões nos seguintes pontos no tempo: pré-infusão (linha de base); ao término da infusão e 1, 4, 8, 24 horas pós-infusão. Para a 1a e 4a doses apenas: nos dias 3, 5, 8, 15 (ou pré-dose do tratamento seguinte) e para a 4a dose também 22 e 36 dias pós-infusão. Os níveis prévios à dose serão obtidos antes de cada tratamento no 1° ciclo. Consulte à Tabela de Eventos e o Manual do Laboratório para informações adicionais sobre coleta de amostra e remessa de amostras.
[00283]Biópsias de Tumor Fresco
[00284]Amostras de tumor são avaliadas em relação a: CD4, CD8, CD56, FOXp3, CEACAM1, Granzima B, CM-24, % de ocupação do receptor da CEACAM1 pelo CM-24.
[00285]Porção de Progressão da Dose: Os indivíduos são solicitados a fornecer uma amostra fresca de tecido para biópsia (ou arquivada se obtida nos últimos seis meses) na linha de base e uma semana após o segundo tratamento do 1° ciclo.
[00286]Porção de Expansão: Duas amostras frescas de tumor são obtidas, na Triagem e uma semana após a 2a administração da dosagem do 1° ciclo. Além disso, os indivíduos são encorajados, mas não obrigados, a fornecer uma biopsia adicional uma semana depois dos quartos tratamentos do 1° ciclo.
[00287]Pontos de Extremidade Relativos à Eficácia
[00288]Os pontos de extremidade a seguir são utilizados para avaliar a eficácia preliminar, e são derivados dos critérios RECIST 1.1 modificados:
[00289]Taxa de Resposta Objetiva (ORR)
[00290]Duração da Resposta (DOR)
[00291]Condição da Resposta do Tumor
[00292]Taxa de Controle da Doença (DCR)
[00293]Resposta Durável (DR)
[00294]Melhor Resposta Geral (BOR) - Resposta Completa (CR), Resposta Parcial (PR), Doença Estável (SD) e Doença Progressiva (PRD).
[00295]Sobrevida Livre de Progressão (PFS)
[00296]Tempo de Resposta (TTR)
[00297]Sobrevida Geral (OS)
[00298]Mudança Percentual na Carga Tumoral (PCTB), avaliada por CT ou MRI.
[00299]O ponto de extremidade da eficácia será avaliado em:
[00300]Coortes da Progressão da Dose:
[00301]Semana 7, uma semana depois que a quarta dose do primeiro ciclo foi administrada.
[00302]Semana 11, cinco semanas depois que a quarta dose do primeiro ciclo foi administrada
[00303]Semana 18-19, Semana 26-27, Semana 34-35, Semana 42-43, Semana 48-49 e Semana 50-51, depois dos cinco ciclos adicionais, mais as visitas de acompanhamento 2-4.
[00304]Coorte de Expansão da Dose:
[00305]Semana 7-8, Semana 14-15, Semana 22-23, Semana 30-31, Semana 38-39, Semana 46-47, mais as visitas de acompanhamento 2-4.
[00306]Pontos de Extremidade da Eficácia Imunorrelacionados
[00307]As avaliações exploratórias adicionais da eficácia podem incluir a aplicação de critérios de resposta imunorrelacionados (irRC) baseados nas modificações do RECIST 1.1 (denominado irRECIST) e incluem os seguintes pontos de extremidade.
[00308]Melhor Resposta Geral Imunorrelacionada (irBOR) com categorias de resposta irCR, irPR, irSD, irPD;
[00309]Taxa de resposta objetiva imunorrelacionada (irORR) durante todo o período do estudo;
[00310]Duração das respostas ir (DOirR) para os indivíduos com respostas ir;
[00311]A irORR baseada nos resultados de irBOR em qualquer número de ciclos também pode ser revisada.
[00312]Pontos de Extremidade Farmacocinéticos (PK)
[00313]A farmacocinética é estudada durante a Porção de Progressão da Dose durante os seguintes pontos no tempo PK: As amostras serão coletadas na primeira, e quarta infusões nos pontos no tempo indicados: pré-infusão (linha de base); ao término da infusão e 1, 4, 8, 24 horas pós-infusão. Para a 1a e 4a doses: nos dias 3, 5, 8, 15 (pré-dose do tratamento seguinte) e para a 4a dose também 22 e 36 dias pós-infusão. Níveis prévios à dose são obtidos antes de cada tratamento no 1° ciclo.
[00314]Os indivíduos de Expansão da Dose Adicional (até 6) podem ser testados para avaliação PK na RP2D preliminar, se for considerada justificada uma caracterização PK mais robusta do CM-24.
[00315]Exemplo 7. Formulação
[00316]Um exemplo de formulação de um mAb humanizado de acordo com a presente invenção compreende o seguinte:
Claims (18)
1. Anticorpo monoclonal (mAb) humanizado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhece especificamente CEACAM1 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i. uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e ii. uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35.
2. Anticorpo monoclonal (mAb) humanizado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 32, e a região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 34.
3. Anticorpo monoclonal (mAb) humanizado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um isótipo kappa de cadeia leve e uma cadeia pesada selecionada dentre o grupo que consiste em isótipo IgG4 e isótipo IgG1.
4. Anticorpo monoclonal (mAb) humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia leve conforme definida na SEQ ID NO: 52.
5. Anticorpo monoclonal (mAb) humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada conforme definida na SEQ ID NO: 53.
6. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência conforme definida em qualquer uma dentre SEQ ID NO: 44 a 51 ou SEQ ID NO: 54 a 56, em que codifica um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
7. Plasmídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um polinucle- otídeo isolado conforme definido na reivindicação 6.
8. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e 1 a 10 mg/ml de aminoácido básico; (ii) um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e 10 a 100 mg/ml de um açúcar; (iii) um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e 0,01 a 1 mg/ml de um tensoativo; (iv) 1 a 50 mg/ml de mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 4 a 6 mg/ml de aminoácido básico, 70 a 100 mg/ml de um açúcar e 0,1 a 1 mg/ml de um tensoativo não aniônico; ou (v) 10 mg/ml de mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 4,65 mg/ml de L-Histidina, 82 mg/ml de sacarose e 0,20 mg/ml de polissorbato 20.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda pelo menos um imunomodu- lador adicional.
11. Uso de mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenir, atenuar ou tratar uma doença ou desordem associada a expressão, ativação ou função de uma proteína da CEACAM em um indivíduo.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou desordem é uma doença ou desordem de proliferação celular.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou desordem de proliferação celular é um câncer selecionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, colorretal, de bexiga, de pulmão, carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLA), gastrointestinal, pancreático, de mama, de próstata, de tireoide, de estômago, de ovário, mieloma e câncer de útero.
14. Uso de um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser administrado com um imunomodulador adicional selecionado dentre o grupo que consiste em: uma anti-proteína de morte celular programada 1 humana (PD-1), anticorpo anti-PD-L1 e anti-PD-L2, uma célula de lin- fócito citotóxico ativada, um agente ativador de linfócito e um inibidor da via RAF/MEK.
16. Composição de diagnóstico CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos um mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
17. Composição de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso em um método para diagnosticar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o método compreende contatar uma amostra biológica derivada ou obtida do dito indivíduo com a composição de diagnóstico, em que uma formação complexa além de um limite pré-determinado é indicativo de câncer no dito indivíduo.
18. Método in vitro para determinar a expressão de CEACAM1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende contatar uma amostra biológica com o mAb humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou com um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e medir o nível de formação do complexo imunológico.
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