CN110054701A - 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用 - Google Patents

一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110054701A
CN110054701A CN201910307184.9A CN201910307184A CN110054701A CN 110054701 A CN110054701 A CN 110054701A CN 201910307184 A CN201910307184 A CN 201910307184A CN 110054701 A CN110054701 A CN 110054701A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
hac
label
stem cell
mescenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910307184.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110054701B (zh
Inventor
熊冬生
杨圆圆
张砚君
范冬梅
林芳珍
熊梦裳
宋月雯
张益枝
叶舟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karamay Central Hospital
Hematology Hospital Of Chinese Academy Of Medical Sciences Institute Of Hematology
Original Assignee
Karamay Central Hospital
Hematology Hospital Of Chinese Academy Of Medical Sciences Institute Of Hematology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Karamay Central Hospital, Hematology Hospital Of Chinese Academy Of Medical Sciences Institute Of Hematology filed Critical Karamay Central Hospital
Priority to CN201910307184.9A priority Critical patent/CN110054701B/zh
Publication of CN110054701A publication Critical patent/CN110054701A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110054701B publication Critical patent/CN110054701B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用，该给药系统包括肿瘤特异的启动子、权利要求1所述的带有His标签或不带His标签的融合蛋白CD3‑HAC以及间充质干细胞。本发明实现了抗肿瘤药物，尤其是免疫治疗药物的局部释放，避免了系统给药的风险和副作用，同时利用间充质干细胞可靶向原发病灶及转移灶的特点，重点实现对微小转移灶的追踪给药。并在动物体内加以证实，经基因修饰的间充质干细胞可以有效地趋化至肿瘤转移部位，且靶向给药组和联合治疗组均能够明显延长小鼠的生存期。该间充质干细胞运载的靶向治疗体系为转移性肿瘤的治疗提供新的思路。

Description

一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种间充质干细胞的新用途，具体涉及一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用。
背景技术
乳腺癌是影响全世界女性健康的头号杀手，发病率位居恶性肿瘤之首。据全国肿瘤登记中心统计，2015年全国乳腺癌发病病例分别占女性发病和死亡病例的15％和7％。其中三阴性乳腺癌患者占所有乳腺癌病例类型的10.0-20.8％，30％的TNBC可发展为转移性乳腺癌。与其他类型相比，三阴性乳腺癌增殖迅速、恶性程度高、病理组织学分级差；切缘易受侵、预后极差，5年生存率不足15％；临床表现为侵袭性病程，极易发生脑组织和内脏转移，发生转移复发后的中位生存期仅为9个月。临床上针对三阴性乳腺癌的治疗手段仍以手术和化疗方法为主，缺乏系统有效的治疗方法。调动免疫系统对抗癌症的概念至少可追溯到19世纪，自2011年anti-CTLA4抗体批准上市，免疫治疗进入了新的纪元，同时靶向肿瘤及其免疫微环境的观点得到广泛认可。其中又以PD-1/PD-L1通路抑制剂在实体瘤中的治疗效果最为引人注目，为转移性晚期肿瘤治疗带来了新的希望。
但PD-1/PD-L1通路阻断药物常伴有一定的副作用且临床响应率偏低，“瘤内局部给药”是许多研究者给出的理想解决方案之一。这一给药途径相比于传统的系统给药方式，可以避免免疫治疗药物的全身暴露，减少自身免疫毒性和脱靶效应，从而降低不良反应的发生风险。在导入方式方面包括，导管插入，纳米材料，脂质体，生物可降解的水性支架材料等。
间充质干细胞是广泛分布于间叶组织的一种多能干细胞，它不但易扩增，同时还具有以下优点：(1)具有低免疫原性和免疫抑制作用；(2)具有肿瘤及炎症组织趋向性；(3)安全性：大量体外研究和体内临床试验证明，间充质干细胞人体使用安全，无致瘤性和其它毒副作用。经过基因修饰后的MSCs仍然保留其特性，固而被认为是优良的肿瘤基因靶向治疗运载体。
腺病毒是目前肿瘤临床试验中应用最多的病毒载体，是一种无包膜的线性双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂，腺病毒载体是目前在肿瘤治疗的临床试验中应用最多的载体，因其具有以下优势：(1)宿主范围广，可有效感染多种靶细胞；(2)已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性；(3)病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩；(4)载体容量大。E1基因是病毒复制早期基因，进一步分为E1A和E1B，其中E1A是在病毒感染细胞后最早被表达出来的基因，调节细胞代谢使得病毒DNA更易于在细胞中复制，E1A基因是腺病毒复制所必需的。在补偿了E1基因产物的293细胞里，这种E1基因缺失的腺病毒载体可以得到大量的扩增。
腺病毒感染细胞的过程，首先是腺病毒纤毛的头节区粘附到目的细胞表面的特异性柯萨奇腺病毒受体(CAR),接下来病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，通过内呑作用将腺病毒内化到细胞中，从而实现基因传递的功能。Bhattacharyya等研究者发现5-FU可以改变宿主细胞表面腺病毒内化所需关键受体的表达水平，主要表现为CAR、αvβ3和αvβ5整合素表达的升高，从而增强宿主细胞对腺病毒的摄取能力。
发明内容：
鉴于以上问题，本发明的目的在于提供一种“瘤内”靶向给药系统，来实现抗肿瘤药物的局部释放，使用慢病毒和腺病毒共同感染间充质干细胞，将治疗基因克隆至人5型复制缺陷腺病毒载体中，利用间充质干细胞运载系统，使其在肿瘤部位分泌。
本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤靶向给药系统的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤靶向给药系统的应用。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种双特异性的分泌型融合蛋白CD3-HAC，该融合蛋白CD3-HAC的氨基酸序列为：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSADIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDARFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLRAELRVTER。(SEQ ID NO:1)
所述的融合蛋白CD3-HAC为抗CD3单链抗体序列与HAC(PD-1胞外区突变序列)通过linker串联形成CD3-HAC。
其中抗CD3单链抗体的氨基酸序列为：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSADIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLELKR。(SEQ ID NO:2)
其中HAC氨基酸序列为：
DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDARFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLRAELRVTER。(SEQ ID NO:3)
其中linker氨基酸序列为：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4)
本发明还提供了编码该融合蛋白CD3-HAC的核苷酸序列，其序列为：
caggtgcagctgcagcagtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtaaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctatatggagctcactaggctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattacgatgatcattacagccttgactactggggccaaggcaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggaggcagtggcggtggagggagcggcggaggcggtagtgctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctgaaacggggtggaggcggcagtggaggtggcgggagcggcggaggtgggagcgactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttccacgtcgtctggcaccgcgagagccccagcggacagacggacaccctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggacgcccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacgtctgtggggtcatctccctggcccccaagatccagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagatag。(SEQ ID NO:5)
本发明还提供了一种带有His标签的融合蛋白CD3-HAC，其氨基酸序列为：
HHHHHHGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSADIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLELKRGGGGSGGGGSDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDARFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLRAELRVTER(SEQ ID NO:6)。
本发明还提供了一种携带His标签的编码融合蛋白CD3-HAC基因，其核苷酸序列为：
caccatcatcaccatcatgggggtggaggcagccaggtgcagctgcagcagtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtaaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctatatggagctcactaggctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattacgatgatcattacagccttgactactggggccaaggcaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggaggcagtggcggtggagggagcggcggaggcggtagtgctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctgaaacggggtggaggcggcagtggaggtggcgggagcggcggaggtgggagcgactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttccacgtcgtctggcaccgcgagagccccagcggacagacggacaccctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggacgcccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacgtctgtggggtcatctccctggcccccaagatccagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagatag。(SEQ ID NO:7)
本发明还提供了一种带有His标签的融合蛋白CD3-HAC的制备方法：将携带His标签的编码融合蛋白CD3-HAC基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)并瞬时转染293T细胞，收集转染上清使用HisTrap亲和镍柱对携带His标签的目的蛋白CD3-HAC于AKTA Primer纯化系统中进行纯化。
本发明还提供了一种抗肿瘤靶向给药系统，包括肿瘤特异的启动子、带His标签或不带His标签的融合蛋白CD3-HAC以及间充质干细胞。
在本发明中，所述的间充质干细胞可分离自骨髓、脂肪、脐带、胎盘等。具体地，所述间充质干细胞为人体的脐带、胎盘、骨髓或者脂肪来源的间充质干细胞。
本发明还提供了上述抗肿瘤靶向给药系统的制备方法，包括
(1)肿瘤特异启动子克隆入腺病毒表达载体中；
(2)将携带His标签的融合蛋白基因序列克隆入腺病毒表达载体中；
(3)应用慢病毒和腺病毒先后修饰间充质干细胞。
优选地，所述慢病毒是含有E1A基因的重组慢病毒。
优选地，所述的肿瘤特异启动子，为人端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)启动子、甲胎蛋白启动子或survivin启动子。更优选地，所述的肿瘤特异启动子为hTERT肿瘤特异启动子。
本发明还提供了一种间充质干细胞作为载药工具和靶向工具在制备PD-L1阳性肿瘤靶向治疗的产品中的应用；所述的间充质干细胞为基因修饰的间充质干细胞；所述基因修饰的间充质干细胞为将：肿瘤特异启动子克隆入腺病毒表达载体中；将携带His标签的融合蛋白CD3-HAC基因序列克隆入腺病毒表达载体中；应用慢病毒和腺病毒先后修饰间充质干细胞。
所述的PD-L1阳性肿瘤包括原发病灶及转移灶。
再具体应用中，经基因修饰后的间充质干细胞分泌腺病毒并感染肿瘤细胞；融合蛋白CD3-HAC介导T细胞对PD-L1阳性肿瘤细胞进行杀伤。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，包括上述靶向给药系统和5-FU。
本发明设计的一种双特异性的分泌型融合蛋白CD3-HAC，将抗CD3单链抗体与HAC串联，HAC序列是Roy L.Maute等发现的，在PD-1胞外区序列的基础上突变了10个氨基酸位点得到的高亲和PD-1突变体，能够与T细胞表面的PD-1竞争性结合肿瘤细胞表面的PD-L1，CD3-HAC融合蛋白可通过其HAC端靶向结合至肿瘤细胞表面的PD-L1，同时通过抗CD3单链抗体端募集并激活T细胞，在激活T细胞的同时阻断PD-1/PD-L1通路，逆转免疫耐受。
本发明公开了一种联合用药方式，将靶向给药系统与5-FU联合使用，上调肿瘤细胞表面与腺病毒内化相关蛋白以及PD-L1的表达水平，提高肿瘤细胞腺病毒摄取能力，肿瘤细胞被病毒感染后在肿瘤特异启动子的操控下表达CD3-HAC。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明实现了抗肿瘤药物，尤其是免疫治疗药物的局部释放，避免了系统给药的风险和副作用，同时利用间充质干细胞可靶向原发病灶及转移灶的特点，重点实现对微小转移灶的追踪给药。并在动物体内加以证实，经基因修饰的间充质干细胞可以有效地趋化至肿瘤转移部位，且靶向给药组和联合治疗组均能够明显延长小鼠的生存期。该间充质干细胞运载的靶向治疗体系为转移性肿瘤的治疗提供新的思路。
附图说明：
图1CD3-HAC在肿瘤细胞中的表达。
选取MDA-MB-231和MCF-7细胞，AdCD3-HAC，AdCDscFv，AdHAC分别感染上述两种细胞，感染复数为100MOI，平行设置AdTrack空载对照组。收集各组总蛋白，Western blot检测各融合蛋白在总蛋白中的表达。如图1所示，AdCD3-HAC，AdCDscfv，AdHAC感染组，MDA-MB-231、MCF-7两种细胞中均有相应目的蛋白的表达，AdTrack做为空载对照，在上述三种蛋白对应的位置均无条带。
图2流式细胞术检测PD-L1在乳腺癌细胞中的表达。
结果表明MDA-MB-231为PD-L1高表达的细胞株，而MCF-7为PD-L1低表达的细胞株
图3CD3-HAC与PD-L1阳性细胞的结合能力。
结果表明对于PD-L1高表达的MDA-MB-231细胞株，及PD-L1低表达的MCF-7细胞株，CD3-HAC显示出不同的结合能力。且未感染病毒的MDA-MB-231细胞群同样为CD3-HAC阳性，表明分泌到培养上清的CD3-HAC可以有效结合未感染细胞。
图4PBMC对感染腺病毒的肿瘤的杀伤作用。
对于PD-L1高表达细胞系MDA-MB-231，PBMC对AdCD3-HAC感染组具有明显杀伤活性，并且随着效靶比例增加，杀伤作用也进一步增强，效靶比为20:1时杀伤效率可以达到94.36±3.11％；而对其他病毒感染组或Blank未感染组并无明显影响。
图5透射电镜观察腺病毒颗粒在间充质干细胞中的存在。
在AdTrack及LentiR.E1A共感染MSCs后48小时，收集MSC.Adtrack.E1A细胞，并以MSC.Adtrack.LentiR.做为对照，固定切片后置于投射电镜下。结果表明MSC.Adtrack.LentiR.呈现完整的细胞形态，而经过E1A修饰的MSC.Adtrack.E1A细胞膜破损严重，进一步放大观察可以发现腺病毒颗粒的存在。这也是MSC.Adtrack.E1A可以复制包装腺病毒的直接证据。
图6经修饰的间充质干细胞可感染MDA-MB-231。
为了证明MSC.Adtrack.E1A释放的病毒颗粒具有感染能力，我们将共感染HUMSCs以不同的比例与MDA-MB-231细胞共培养96h后，收集MDA-MB-231细胞，流式检测其感染效率。随着MSCs：MDA-MB-231比例的升高，MDA-MB-231细胞的感染效率逐渐增加；当二者比例达到1:1时，对应的MDA-MB-231细胞的感染效率为(54.13±2.08)％，5-FU预处理可以进一步提高其感染效率至(77.37±0.78)％。
图7 5-FU可上调CAR、αⅴβ3及PD-L1在肿瘤细胞表面的表达。
结果显示：MDA-MB-231细胞经低剂量5-FU处理后，其表面CAR和ανβ3表达水平显著升高。至此，我们证明了低剂量5-FU可以通过提高肿瘤细胞表面CAR的表达增强细胞摄取腺病毒的能力，增加双特异性融合蛋白CD3-HAC分泌，从而促进T细胞介导的抗肿瘤作用。值得关注的是我们发现5-FU对MDA-MB-231表面的PD-L1的表达也有上调作用，这就使得CD3-HAC双特异性融合蛋白有了更多的可结合位点。
图8 5-FU可增强PBMCs对肿瘤细胞的杀伤作用。
结果表明，在所选取的三个腺病毒感染复数下(10,20,50MOI)，单独的腺病毒感染组可不同程度的介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤，而5-FU的预处理可以进一步提高PBMC对MDA-MB-231的杀伤水平，尤其在较低感染复数下杀伤效果提升更加明显。
图9为间充质干细胞高效靶向乳腺癌肺部转移灶的结果图片。
为实时监测基因修饰的MSCs在体内的分布特征，我们将双病毒共同感染的MSC.AdLuc.LentiR.或MSC.AdLuc.E1A经尾静脉注射到荷瘤小鼠或正常小鼠体内，然后用活体成像系统观察生物发光情况。结果显示，三组小鼠在注射MSCs后第1天，生物发光信号集中于肺部，而正常对照组的生物发光强度明显低于荷瘤小鼠，提示MSCs注射入体后可以向肿瘤部位归巢，而有部分细胞被阻滞于尾静脉的毛细血管网；随着时间的推移肿瘤部位的生物发光强度逐渐降低，荷瘤小鼠MSC.AdLuc.LentiR.组可以维持至第4-5天左右，而正常小鼠生物发光强度下降迅速至第3-4基本消失；荷瘤小鼠MSC.AdLuc.E1A组，发光强度在第二天突然降低，至第五天出现小幅度上升。推测是由于MSCs自24小时开始包装腺病毒后逐渐裂解,分泌出的腺病毒Ad-Luc释放至肿瘤周围，感染了肿瘤细胞所致。以上结果说明，经过多基因修饰的MSCs可以有效的向肿瘤部位归巢，发挥相应的生物学功能。
图10为间充质干细胞载药系统在小鼠中抑制肿瘤生长的生存曲线结果。
在三次治疗后，我们继续观察了小鼠的生存期，结果表明单独给药组和5-FU联用组生存期均明显长与对照组。各组的中位生存期为：PBS，60天；5-FU，61天；MSC+PBMC，56天；MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC，69天；MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC+5-FU，89天。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但并不限定本发明的保护范围。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
间充质干细胞的分离
本发明中的间充质干细胞可为脐带间充质干细胞，胎盘间充质干细胞，骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞，现以脐带(人来源)间充质干细胞为例描述间充质干细胞的分离方法，具体如下：
(1)于T75塑料培养瓶中加入1-2mL DF-12培养基，将瓶底湿润后置于37℃培养箱中预热备用。
(2)将脐带用PBS冲洗其外层残留的血液及血凝块，然后将脐带剪成长度为1-2cm的小段，继续冲洗直至液体澄清。
(3)沿脐带静脉剪开脐带，用镊子剥离血管壁，抽离动脉血管，将胶冻状组织剪碎至0.5cm3大小的组织块，用滴管依次将组织块摆放至预先湿润的T75塑料培养瓶中(组织块之间的间隔为1-2cm)。倒置培养4小时后，小心翻转培养瓶正放继续培养。
(4)次日，于培养瓶中添加1mL含10％FBS的DF-12培养基，连续添加三天，并于第四天全量换液。以后每隔三天换液一次。
(5)培养7-10天后，于显微镜下可以观察到组织块周围有长梭形纤维状细胞爬出；10-14天，可观察到组织块周围细胞成漩涡状密集排列。此时去除组织块，用0.125％的胰酶(含1mM EDTA)消化细胞，进行初次传代(P1)。可以保留条件培养基，离心后用于二代细胞的培养。
(6)待细胞长至70％～80％汇合时，消化细胞进行二次传代(2000个细胞/cm2)或冻存。取3-5代的HUMSCs用于实验。
载体构建及融合蛋白CD3-HAC的表达纯化
将抗CD3单链抗体与高亲和PD-1胞外区序列(HAC)通过G4S串联并克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体或Adtrack腺病毒表达载体，为了提高融合蛋白表达的特异性在Adtrack载体中克隆入肿瘤特异的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase,hTERT)启动子操控CD3-HAC的表达。同时为了便于产物的纯化和检测我们在多肽链的氨基端引入了6╳His标签，一经表达即形成双特异性融合蛋白，并在信号肽的引导下分泌到细胞外。将构建好的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CD3-HAC转染至293T细胞中。收集转染48小时后的培养上清，经His-tag亲和层析柱纯化并浓缩得到融合蛋白。WesternBlot检测融合蛋白CD3-HAC在乳腺癌细胞中的表达
(1)取对数生长期的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF-7，用含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，接种至6孔培养板内，2mL/孔，每种细胞接种两孔；于37℃、5％CO2培养箱中常规培养过夜。
(2)次日，更换新鲜培养基2mL/孔，每种细胞各选取一孔，向其中一孔感染AdCD3-HAC(100MOI)；向另一孔加入的空载对照腺病毒AdTrack(100MOI)；置于37℃、5％CO2培养箱中常规培养。
(3)48小时后，收集细胞，冷PBS洗两遍，尽量清除上清；向收集的每种细胞沉淀内加入100μl预冷的RIPA裂解液(强)和1μl PMSF(100mM)，转移至1.5mL EP管内冰浴，水平摇床震摇30分钟；4℃12,000rpm离心15分钟，收集上清转移至新的1.5mL EP管内，-80℃保存，避免反复冻融。
(4)剩余样品定量后进行Western blot检测(图1)。
选取MDA-MB-231和MCF-7细胞，AdCD3-HAC，AdCDscFv，AdHAC分别感染上述两种细胞，感染复数为100MOI，平行设置AdTrack空载对照组。收集各组总蛋白，Western blot检测各融合蛋白在总蛋白中的表达。如图1所示：AdCD3-HAC，AdCDscfv，AdHAC感染组，MDA-MB-231、MCF-7两种细胞中均有相应目的蛋白的表达，AdTrack做为空载对照，在上述三种蛋白对应的位置均无条带。
流式细胞术检测PD-L1在乳腺癌细胞中的表达
(1)分别取对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7加入鼠源抗PD-L1抗体或同型对照抗体(1:100稀释)，于4℃下共同孵育1h。
(2)1500rpm离心5min后弃去上清，冷PBS洗涤细胞3次。
(3)向细胞中加入PE标记的抗鼠IgG抗体(1:500)，于4℃下共同孵育30min。
(4)1500rpm离心5min后弃去上清，冷PBS洗涤细胞2次。
(5)将细胞沉淀重悬于500L PBS后于流式细胞分析仪中检测(图2)。其中a为同型对照，b为PD-L1抗体。结果表明MDA-MB-231为PD-L1高表达的细胞株，而MCF-7为PD-L1低表达的细胞株。
流式细胞术检测腺病毒的感染效率及CD3-HAC与乳腺癌细胞的结合
(1)将AdTrack或AdCD3-HAC腺病毒以100MOI的感染复数分别感染MDA-MB-231和MCF-7；
(2)病毒感染48小时后，收集各组细胞，PBS洗两遍，细胞计数，每个流式管中加入1×106个细胞，100μl PBS重悬细胞；
(3)向各组流式管中加入一抗工作液(鼠源抗His标签抗体，1:500稀释)，室温避光孵育30分钟；
(4)1000rpm离心10分钟，弃上清，加入4mL PBS洗两遍；
(5)100μl PBS重悬细胞，向各组流式管中加入二抗工作液(APC标记的山羊抗鼠二抗，1:500稀释)，室温避光孵育30分钟，同型对照组只加入二抗孵育；
(6)PBS洗三次，加入500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞GFP阳性率及His标记的CD3-HAC与乳腺癌细胞的结合水平(图3)。注：以上各组平行设置空白细胞、单独病毒感染细胞、病毒感染只标二抗细胞，用于流式检测平行对照。
结果表明对于PD-L1高表达的MDA-MB-231细胞株，及PD-L1低表达的MCF-7细胞株，CD3-HAC显示出不同的结合能力。且未感染病毒的MDA-MB-231细胞群同样为CD3-HAC阳性，表明分泌到培养上清的CD3-HAC可以有效结合未感染细胞。
人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离和培养
取健康成人富含血小板白膜(天津市血液中心提供)经密度梯度离心法分离后得到外周血单个核细胞。具体操作如下：
(1)按1:1的比例往外周血中加入生理盐水进行稀释。
(2)于容积为10mL的刻度玻璃管中预先加入4mL淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)，将步骤(1)中稀释后的外周血悬液小心缓慢地加于淋巴细胞分离液的液面上至总体积为10mL，注意不能打乱界面。室温1800rpm离心20min(注意离心机要缓慢升速和降速)。
(3)离心后由上到下分为四层：最上层是血浆及血小板，第二层为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层(白膜)，第三层为淋巴细胞分离液，第四层为粒细胞层和红细胞层。用细的玻璃滴管小心吸取中间的白膜，加入另一个盛有30mL生理盐水的离心管中，1500rpm离心10min。重复洗一次。
(4)于细胞沉淀中加入红细胞裂解液(细胞沉淀体积的10倍)冰上放置10min后，1200rpm离心10min。弃去上清液后将细胞重悬于30mL生理盐水洗涤一次。
(5)细胞计数后，调整细胞密度为3×106/mL，同时加入重组人IL-2至终浓度为50U/mL培养于含10％FBS的RPMI 1640培养基中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养72小时后用于杀伤实验。
CD3-HAC介导的T细胞对PD-L1+细胞的杀伤作用
本实验采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega)(LDH释放法)检测CD3-HAC介导的T细胞对PD-L1+细胞的杀伤。该方法是一种基于比色法的检测方法，可以定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH在培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测。在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)，该红色产物的生成量与裂解的细胞数成正比。本研究中的杀伤实验均用IL-2刺激72小时后的PBMCs作为效应细胞。具体操作如下：
(1)收集对数生长期的靶细胞(MDA-MB-231和MCF-7，其中MCF-7细胞低表达PD-L1，作为对照细胞)，以1×105个/mL接种至6孔板中。待细胞完全贴壁后，按100MOI的感染复数向两种细胞中分别加入AdCD3-HAC、AdCD3scFv、AdHAC和AdTrack进行感染。
(2)病毒感染48小时后，收集细胞并调整细胞密度为1×105/mL，分别取100L(1×104个细胞)接种至96孔板中培养过夜(约8小时)。
(3)次日，然后按照不同的效靶比(E:T＝20:1,10:1,5:1,2.5:1)加入效应细胞PBMCs使每孔的总体积为100L。同时设置效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正对照孔及培养基背景对照孔，所有实验孔和对照孔至少设置三个复孔。混匀后，250g离心板子4分钟以确保效应细胞和靶细胞充分接触。
(4)将板子置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下孵育10小时。在收集上清前45分钟，向靶细胞最大释放孔及体积校正对照孔分别加入20L Lysis Solution。
(5)孵育10小时后，250g离心板子4分钟。用排枪从每孔转移50L上清至一个新的96孔平底板中。
(6)底物液的配制。融化Assay Buffer(可以用37℃水浴融化，但是一旦融化后不要再于37℃放置)，取出12mL后迅速将未使用的部分储存在-20℃。将取出的12mL AssayBuffer平衡至室温(注意避光)，然后将其加入到一瓶Substrate Mix中。轻轻颠倒摇晃使底物溶解。(注意：一瓶底物足够供两块96孔板使用；底物一旦溶解，要避免强光直射，立即使用。)
(7)向步骤(5)中含有样品上清的96孔板中每孔均加入50L配制好的底物液，室温避光孵育30分钟。(注意：未用完的底物液应盖紧后放在-20℃，可以储存6-8周。)
(8)每孔中加入50L Stop Solution。可用注射器针头戳破大的气泡，加入StopSolution后1小时内于490nm处测量吸光值。
(9)实验结果的计算：将所有实验孔、靶细胞自发释放孔和效应细胞自发释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大释放孔的吸光值减去体积校正对照孔吸光值的均值；将以上获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比或每个浓度所产生的细胞毒性百分比，结果如图4所示。
对于PD-L1高表达细胞系MDA-MB-231，PBMC对AdCD3-HAC感染组具有明显杀伤活性，并且随着效靶比例增加，杀伤作用也进一步增强，效靶比为20:1时杀伤效率可以达到94.36±3.11％；而对其他病毒感染组或Blank未感染组并无明显影响。
抗肿瘤靶向给药系统的制备方法。
(1)取3-5代新鲜分离的HUMSCs，按5×104个/孔的密度接种于六孔板中，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中常规培养。
(2)待细胞全部贴于孔板底部后，将腺病毒AdTrack(500MOI)上清加入细胞培养液。
(3)次日，吸出六孔板中含腺病毒上清的培养液，PBS洗两次，将慢病毒LentiR.E1A(8MOI)上清与新鲜的10％FBS DF-12培养基混合均匀，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，混匀后加入六孔板中(1ml/孔)，37℃、5％CO2培养箱中常规培养过夜。
(4)慢病毒感染8小时后，更换新鲜的10％FBS DF-12培养基以终止感染，于37℃、5％CO2培养箱中培养，用于后续实验。
扫描电镜证明腺病毒在基因修饰间充质干细胞中的复制。
(1)取两种病毒共转染之后的间充质干细胞，以慢病毒开始感染时间为0点，48小时后收集腺病毒及慢病毒共感染HUMSCs细胞，离心收集细胞，PBS漂洗两遍，移液器尽可能吸净上清；
(2)于细胞沉淀内直接加2.5％戊二醛，固定30分钟后送电镜室，常规梯度脱水、浸透、包埋、切片后置透射电镜下观察完整的病毒颗粒(图5)。
在AdTrack及LentiR.E1A共感染MSCs后48小时，收集MSC.Adtrack.E1A细胞，并以MSC.Adtrack.LentiR.做为对照，固定切片后置于投射电镜下。结果表明MSC.Adtrack.LentiR.呈现完整的细胞形态，而经过E1A修饰的MSC.Adtrack.E1A细胞膜破损严重，进一步放大观察可以发现腺病毒颗粒的存在。这也是MSC.Adtrack.E1A可以复制包装腺病毒的直接证据。
经基因修饰的间充质干细胞感染肿瘤细胞的检测，以及5-FU对肿瘤细胞摄取腺病毒的促进作用。
(1)Adtrack腺病毒和LentiR.E1A慢病毒共感染HUMSCs,平行设置Adtrack和LentiR共感染HUMSCs做为阴性对照。
(2)以慢病毒开始感染时间为0点，8小时后收集腺病毒及慢病毒共感染HUMSCs；
(3)取对数生长期的MDA-MB-231细胞或经过5-FU(0.25μg/ml)预处理的MDA-MB-231细胞，计数后将细胞密度调整为5×104个/ml，接种于96孔板中(100μl/孔)；待细胞全部贴于孔底，按照不同比例加入共感染病毒的MSCs。
(4)96小时后，大多数HUMSCs已经死亡，分别消化收集各孔的MDA-MB-231细胞，PBS洗两次，加入400μL PBS重悬后，流式细胞仪检测GFP细胞的阳性率(图6)。
为了证明MSC.Adtrack.E1A释放的病毒颗粒具有感染能力，我们将共感染HUMSCs以不同的比例与MDA-MB-231细胞共培养96h后，收集MDA-MB-231细胞，流式检测其感染效率。随着MSCs：MDA-MB-231比例的升高，MDA-MB-231细胞的感染效率逐渐增加；当二者比例达到1:1时，对应的MDA-MB-231细胞的感染效率为(54.13±2.08)％，5-FU预处理可以进一步提高其感染效率至(77.37±0.78)％。
5-FU促进肿瘤细胞表面CAR、αⅴβ3及PD-L1的表达
(1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞，计数后调整细胞密度为1×105/mL，接种于六孔板(2mL/孔)，37℃、5％CO2培养箱内培养。
(2)待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度的5-FU(终浓度分别为0,0.25,0.5μg/mL)继续培养。
(3)48h后，分别收集各组细胞，冷PBS洗两次，然后加入按1:100比例稀释的抗CAR兔源一抗，抗αⅴβ3鼠源一抗或抗PD-L1鼠源一抗，室温孵育1h。
(4)PBS洗三次，然后加入DyLight 649染料偶联的驴抗兔二抗(1:500稀释)或山羊抗鼠二抗(1:500稀释)，室温避光孵育30min，同型对照组只加入二抗孵育。
(5)PBS洗三次，加入400μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞表面CAR、αⅴβ3及PD-L1的表达水平变化(图7)。
结果显示：MDA-MB-231细胞经低剂量5-FU处理后，其表面CAR和ανβ3表达水平显著升高。至此，我们证明了低剂量5-FU可以通过提高肿瘤细胞表面CAR的表达增强细胞摄取腺病毒的能力，增加双特异性融合蛋白CD3-HAC分泌，从而促进T细胞介导的抗肿瘤作用。值得关注的是我们发现5-FU对MDA-MB-231表面的PD-L1的表达也有上调作用，这就使得CD3-HAC双特异性融合蛋白有了更多的可结合位点。
5-FU预处理MDA-MB-231靶细胞后，检测PBMCs对腺病毒感染的靶细胞杀伤水平
(1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，计数后调整细胞密度至1×105个/ml，接种于两块6孔板(2ml/孔)，共12孔，37℃、5％CO2培养箱中常规培养过夜。
(2)次日，更换新鲜培养基，每块六孔板前三个孔加入5-FU(终浓度为0.25μg/ml)，后三个孔加入等体积PBS，置于37℃、5％CO2培养箱中常规培养。
(3)24小时后，吸弃培养基，PBS洗两遍，5-FU组或PBS组对应的细胞分别以10、20、50MOI的感染复数加入AdCD3-HAC或Adtrack腺病毒,于37℃、5％CO2培养箱中常规培养。
(4)48小时后，消化收集各组细胞，铺至96孔培养板内(1×104个/孔)。
(5)待靶细胞全部贴于孔底，吸弃培养基，以效靶比10:1的比例加入PBMCs细胞悬液(200μl/孔)，250g离心4min以保证效靶细胞充分接触。
(6)将反应板于37℃、5％CO2培养箱中培养10小时。在获取上清前45分钟，加10μl裂解液至靶细胞最大释放孔及培养基体积对照孔中。裂解完成后，250g离心4min。
(7)收集上清，按照CytoToX96非放射性细胞毒检测试剂盒说明测定LDH，并计算杀伤率，方法同上(图8)。
结果表明，在所选取的三个腺病毒感染复数下(10,20,50MOI)，单独的腺病毒感染组可不同程度的介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤，而5-FU的预处理可以进一步提高PBMC对MDA-MB-231的杀伤水平，尤其在较低感染复数下杀伤效果提升更加明显。
荷载腺病毒的MSC.AdLuc.E1A向MDA-MB-231肿瘤转移灶归巢的能力
(1)选用BALB/c裸鼠(雌性，5-6周龄，体重16-18g)建立MDA-MB-231细胞肺部移植瘤模型。接种前一天，以300cGy/只的剂量进行射线照射。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，PBS洗涤2次后，用PBS调整细胞密度为5×106/mL，通过尾静脉注射入小鼠体内(200μl/只)，三周后用于后续实验。
(2)活体成像观察双病毒感染的MSCs向肿瘤部位的归巢为了在体内实时的检测MSCs，我们使用表达萤火虫荧光素酶的腺病毒AdLuc对MSCs进行标记。在MDA-MB-231细胞移植至裸鼠体内21天后，开始活体成像实验，具体方法如下：
(3)取3～5代的MSCs，按实施例7的方法进行感染，分为三组：正常小鼠给予MSC.AdLuc.LentiR；荷瘤小鼠给予MSC.AdLuc.LentiR或MSC.AdLuc.E1A。
(4)慢病毒感染8小时后，胰酶消化上述MSCs，PBS洗2次，调整细胞密度为5×106/mL，经尾静脉注射200μl细胞悬液(1×106/只)。
(5)静脉注射HUMSCs后24小时，按150μg/g的剂量给予小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-luciferin(30mg/mL)，然后再腹腔注射戊巴比妥钠(2％，100μg/g)，待小鼠麻醉后，IVIS Xneogen系统观察小鼠体内生物发光情况，连续观察5天(图9)。
为实时监测基因修饰的MSCs在体内的分布特征，我们将双病毒共同感染的MSC.AdLuc.LentiR.或MSC.AdLuc.E1A经尾静脉注射到荷瘤小鼠或正常小鼠体内，然后用活体成像系统观察生物发光情况。结果显示，三组小鼠在注射MSCs后第1天，生物发光信号集中于肺部，而正常对照组的生物发光强度明显低于荷瘤小鼠，提示MSCs注射入体后可以向肿瘤部位归巢，而有部分细胞被阻滞于尾静脉的毛细血管网；随着时间的推移肿瘤部位的生物发光强度逐渐降低，荷瘤小鼠MSC.AdLuc.LentiR.组可以维持至第4-5天左右，而正常小鼠生物发光强度下降迅速至第3-4基本消失；荷瘤小鼠MSC.AdLuc.E1A组，发光强度在第二天突然降低，至第五天出现小幅度上升。推测是由于MSCs自24小时开始包装腺病毒后逐渐裂解,分泌出的腺病毒Ad-Luc释放至肿瘤周围，感染了肿瘤细胞所致。以上结果说明，经过多基因修饰的MSCs可以有效的向肿瘤部位归巢，发挥相应的生物学功能。
MSC.CD3-HAC.E1A+PBMC联用低剂量5-FU对BALB/c裸鼠MDA-MB-231肺转移瘤生长的抑制作用
231-Luc肺转移模型的建立同实施例11。肿瘤细胞移植一周后通过小动物活体成像检测肺部生物发光强度，根据发光强度随机分为5组：(1)PBS；(2)5-FU；(3)MSC+PBMC；(4)MSC.CD3-HAC.E1A+PBMC；(5)MSC.CD3-HAC.E1A+PBMC+5-FU。其中在治疗第1天尾静脉注射MSCs(1×106/只)，第4天尾静脉注射活化的PBMCs(6×106/只)，每7天重复治疗一次，共治疗3次。从移植MSCs开始每隔天腹腔注射5-FU(20mg/kg)，每周期三次，并记录小鼠生存期(图10)。
在三次治疗后，我们继续观察了小鼠的生存期，结果表明单独给药组和5-FU联用组生存期均明显长与对照组。各组的中位生存期为：PBS，60天；5-FU，61天；MSC+PBMC，56天；MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC，69天；MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC+5-FU，89天。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）
克拉玛依市中心医院
<120> 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr
165 170 175
Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
260 265 270
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
275 280 285
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser Pro
290 295 300
Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
305 310 315 320
Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
325 330 335
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
340 345 350
Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg
370 375
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr
165 170 175
Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser Pro Ser
35 40 45
Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg
115 120
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtaaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctat 240
atggagctca ctaggctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattac 300
gatgatcatt acagccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360
ggcggaggca gtggcggtgg agggagcggc ggaggcggta gtgctgacat cgagctcacc 420
cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc 480
agctcaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga 540
tggatttatg acacatccaa actggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 600
tctgggacct cttactctct cacaatcagc ggcatggagg ctgaagatgc tgccacttat 660
tactgccagc agtggagtag taacccattc acgttcggct cggggaccaa gctggagctg 720
aaacggggtg gaggcggcag tggaggtggc gggagcggcg gaggtgggag cgactcccca 780
gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc tcgtggtgac cgaaggggac 840
aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttccacgt cgtctggcac 900
cgcgagagcc ccagcggaca gacggacacc ctggccgcct tccccgagga ccgcagccag 960
cccggccagg acgcccgctt ccgtgtcaca caactgccca acgggcgtga cttccacatg 1020
agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacg tctgtggggt catctccctg 1080
gcccccaaga tccagatcaa agagagcctg cgggcagagc tcagggtgac agagagatag 1140
<210> 6
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
1 5 10 15
Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser
20 25 30
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val
35 40 45
Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro
50 55 60
Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Thr Arg
85 90 95
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp
100 105 110
Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
145 150 155 160
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
180 185 190
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu
210 215 220
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
225 230 235 240
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro
260 265 270
Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala
275 280 285
Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe His Val Val
290 295 300
Trp His Arg Glu Ser Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr
325 330 335
Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg
340 345 350
Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro
355 360 365
Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu
370 375 380
Arg
385
<210> 7
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccatcatc accatcatgg gggtggaggc agccaggtgc agctgcagca gtctggggct 60
gaactggcaa gacctggggc ctcagtaaag atgtcctgca aggcttctgg ctacaccttt 120
actaggtaca cgatgcactg ggtaaaacag aggcctggac agggtctgga atggattgga 180
tacattaatc ctagccgtgg ttatactaat tacaatcaga agttcaagga caaggccaca 240
ttgactacag acaaatcctc cagcacagcc tatatggagc tcactaggct gacatctgag 300
gactctgcag tctattactg tgcaagatat tacgatgatc attacagcct tgactactgg 360
ggccaaggca ccacggtcac cgtctcctca ggtggcggag gcagtggcgg tggagggagc 420
ggcggaggcg gtagtgctga catcgagctc acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct 480
ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt gccagctcaa gtgtaagtta catgaactgg 540
taccagcaga agtcaggcac ctcccccaaa agatggattt atgacacatc caaactggct 600
tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 660
agcggcatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag tagtaaccca 720
ttcacgttcg gctcggggac caagctggag ctgaaacggg gtggaggcgg cagtggaggt 780
ggcgggagcg gcggaggtgg gagcgactcc ccagacaggc cctggaaccc ccccaccttc 840
tccccagccc tgctcgtggt gaccgaaggg gacaacgcca ccttcacctg cagcttctcc 900
aacacatcgg agagcttcca cgtcgtctgg caccgcgaga gccccagcgg acagacggac 960
accctggccg ccttccccga ggaccgcagc cagcccggcc aggacgcccg cttccgtgtc 1020
acacaactgc ccaacgggcg tgacttccac atgagcgtgg tcagggcccg gcgcaatgac 1080
agcggcacct acgtctgtgg ggtcatctcc ctggccccca agatccagat caaagagagc 1140
ctgcgggcag agctcagggt gacagagaga tag 1173

Claims (10)

1.一种双特异性的分泌型的带有His标签或不带His标签的融合蛋白CD3-HAC，其特征在于：不带His标签的融合蛋白CD3-HAC的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示；带有His标签的融合蛋白CD3-HAC的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。
2.一种编码权利要求1所述的带有His标签或不带His标签的融合蛋白CD3-HAC的核苷酸序列，其特征在于：编码不带His标签的融合蛋白CD3-HAC的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示；编码带有His标签的融合蛋白CD3-HAC的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示。
3.权利要求1所述带有His标签的融合蛋白CD3-HAC的制备方法，其特征在于：将携带His标签的编码融合蛋白CD3-HAC基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)并瞬时转染293T细胞，收集转染上清使用HisTrap亲和镍柱对携带His标签的目的蛋白CD3-HAC于AKTA Primer纯化系统中进行纯化。
4.一种抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：包括肿瘤特异的启动子、权利要求1所述的带有His标签或不带His标签的融合蛋白CD3-HAC以及间充质干细胞。
5.权利要求4所述的一种抗肿瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：包括：
(1)肿瘤特异启动子克隆入腺病毒表达载体中；
(2)将携带His标签的编码融合蛋白CD3-HAC基因序列克隆入腺病毒表达载体中；
(3)应用慢病毒和腺病毒先后修饰间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述慢病毒是含有E1A基因的重组慢病毒。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的肿瘤特异启动子为人端粒酶逆转录酶启动子、甲胎蛋白启动子或survivin启动子；更优选地，所述的肿瘤特异启动子为人端粒酶逆转录酶启动子。
8.一种间充质干细胞作为载药工具和靶向工具在制备PD-L1阳性肿瘤靶向治疗的产品中的应用；其特征在于：所述的间充质干细胞为基因修饰的间充质干细胞；所述基因修饰的间充质干细胞为将：肿瘤特异启动子克隆入腺病毒表达载体中；将权利要求2所述的带有His标签的编码融合蛋白CD3-HAC的基因序列克隆入腺病毒表达载体中；应用慢病毒和腺病毒先后修饰间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的PD-L1阳性肿瘤包括原发病灶及转移灶。
10.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括上述靶向给药系统和5-FU。
CN201910307184.9A 2019-04-17 2019-04-17 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用 Active CN110054701B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910307184.9A CN110054701B (zh) 2019-04-17 2019-04-17 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910307184.9A CN110054701B (zh) 2019-04-17 2019-04-17 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110054701A true CN110054701A (zh) 2019-07-26
CN110054701B CN110054701B (zh) 2022-12-27

Family

ID=67317790

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910307184.9A Active CN110054701B (zh) 2019-04-17 2019-04-17 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110054701B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733139A (zh) * 2020-01-13 2020-10-02 西安电子科技大学 一种基于功能化巨噬细胞/单核细胞的靶向递送系统及其构建与应用
CN112980888A (zh) * 2021-02-22 2021-06-18 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） 分泌il-6抗体/cd20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用
CN115029318A (zh) * 2022-05-12 2022-09-09 广州明征生物科技有限公司 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途
CN116120453A (zh) * 2023-01-03 2023-05-16 华南理工大学 一种基于蛋白多聚体的间充质干细胞工程化改造方法及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1298020A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院 抗cd3单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其应用
CN102796198A (zh) * 2011-05-26 2012-11-28 中国医学科学院血液病医院 抗CD3抗体Fv片段与白介素3的融合蛋白、制备方法及其用途
WO2016204966A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107108707A (zh) * 2014-08-08 2017-08-29 小利兰斯坦福大学理事会 高亲和力pd‑1药剂以及使用方法
CN108264557A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海欣百诺生物科技有限公司 一种结合cd3和t细胞负共刺激分子的双功能分子及其应用
CN110590955A (zh) * 2018-09-17 2019-12-20 北京盛诺基医药科技股份有限公司 一种双特异性抗体
CN112430271A (zh) * 2020-11-13 2021-03-02 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种双特异性单链抗体及应用
CN113135996A (zh) * 2019-12-09 2021-07-20 启愈生物技术(上海)有限公司 一种双特异抗体及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1298020A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院 抗cd3单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其应用
CN102796198A (zh) * 2011-05-26 2012-11-28 中国医学科学院血液病医院 抗CD3抗体Fv片段与白介素3的融合蛋白、制备方法及其用途
CN107108707A (zh) * 2014-08-08 2017-08-29 小利兰斯坦福大学理事会 高亲和力pd‑1药剂以及使用方法
WO2016204966A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN108264557A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海欣百诺生物科技有限公司 一种结合cd3和t细胞负共刺激分子的双功能分子及其应用
CN110590955A (zh) * 2018-09-17 2019-12-20 北京盛诺基医药科技股份有限公司 一种双特异性抗体
CN113135996A (zh) * 2019-12-09 2021-07-20 启愈生物技术(上海)有限公司 一种双特异抗体及其应用
CN112430271A (zh) * 2020-11-13 2021-03-02 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种双特异性单链抗体及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERRMANN 等: "Bifunctional PD-1 × αCD3 × αCD33 fusion protein reverses adaptive immune escape in acute myeloid leukemia", 《BLOOD》 *
YANG 等: "Bispecific CD3-HAC carried by E1A-engineered mesenchymal stromal cells against metastatic breast cancer by blocking PD-L1 and activating T cells", 《JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY》 *
ZHANG 等: "Surface expression of anti-CD3scfv stimulates locoregional immunotherapy against hepatocellular carcinoma depending on the E1A-engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells", 《INT. J. CANCER》 *
杨圆圆: "E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733139A (zh) * 2020-01-13 2020-10-02 西安电子科技大学 一种基于功能化巨噬细胞/单核细胞的靶向递送系统及其构建与应用
CN112980888A (zh) * 2021-02-22 2021-06-18 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） 分泌il-6抗体/cd20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用
CN115029318A (zh) * 2022-05-12 2022-09-09 广州明征生物科技有限公司 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途
CN116120453A (zh) * 2023-01-03 2023-05-16 华南理工大学 一种基于蛋白多聚体的间充质干细胞工程化改造方法及其应用
CN116120453B (zh) * 2023-01-03 2023-09-26 华南理工大学 一种基于蛋白多聚体的间充质干细胞工程化改造方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110054701B (zh) 2022-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110054701A (zh) 一种基于间充质干细胞的抗肿瘤靶向给药系统及其应用
JP7023929B2 (ja) キメラポックスウイルス組成物及びその使用
CN109485732A (zh) 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
TW201934574A (zh) 一種結合ｂｃｍａ的嵌合抗原受體（ｃａｒ）及其應用
CN108239144A (zh) 改造的铰链及其在构建car骨架中的应用
CN109678965A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd22-cd19双靶向性的t细胞及其应用
CN109503716A (zh) 一种双特异性嵌合抗原受体分子及其在肿瘤治疗上的应用
CN113444169B (zh) 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
WO2019236633A9 (en) Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
CN105647873A (zh) 一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法及其试剂盒
WO2021254333A1 (zh) 一种合成t细胞受体抗原受体复合物及其应用
CN109293781A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
Huang et al. Bispecific T cell engagers and their synergistic tumor immunotherapy with oncolytic viruses
WO2022222846A1 (zh) 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
US20220133823A1 (en) A modified oncolytic virus, composition and use thereof
CN105924526B (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carher1-nkt细胞及其制备方法和应用
US20100062007A1 (en) Multi-modal cancer therapy using viral hitch-hiking
CN113372449B (zh) 一种非红细胞凝集的抗pd-l1/cd47双特异抗体及其在抗肿瘤治疗中的应用
CN111499766B (zh) 针对慢性淋巴细胞白血病的免疫效应细胞、其制备方法和应用
CA3229688A1 (en) Chimeric antigen receptor and use thereof
CN114786696A (zh) 包含免疫调节转基因的溶瘤病毒及其用途
CN107286238B (zh) 抗hcv广谱中和抗体的制备、检测以及应用
EP3366303B1 (en) Enhancing the targeted in vivo delivery of cellular therapies
CN109608548A (zh) 基于人源cd20抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
WO2023025187A1 (zh) 特异性结合cd47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant