JPH0673472B2 - 分析素子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、目的とする検体を測定するために必要な反応
を触媒する酵素を保護することに関し、詳しくは分析素
子製造及び保存において測定系において必要な反応を触
媒する酵素を、該酵素に対して不活性な物質と共存させ
ることによつて活性を維持させた分析素子に関する。

〔従来の技術〕

従来、流体試料中の特性成分を分析する方法は、多数開
発がなされてきたが、これらは大別して溶液内で反応が
行われる反応系と、固相担体内で行われる反応系との２
種類に別けることができる。溶液系におけ分析反応（以
下、ウエツト・ケミストリーという。）は、用手法と呼
ばれる全く機械を用いない方法から、自動分析機器まで
幅広く知られている。特に臨床化学の分野ではその進歩
が著しく、近年種々の臨床検査用自動定量分析機器が病
院の臨床検査室などに導入されている。

しかしながら、上述の方法は、基本的には水溶液の形で
反応を行わせるために、種々の欠点を有している。すな
わち、その分析過程で大量の水、特に精製された純水あ
るいは蒸留水を必要とすることからエネルギー消費の増
大を招く。また、種々の自動分析機器はそれ自体著しく
高価であり、かつその操作に多大の熱練を必要とし、莫
大な時間と労力を必要とするばかりでなく、その廃液は
必然的に環境汚染を引起こすという欠点を有している。

これに対して固相系における分析反応（以下、ドライ・
ケミストリーという。）を用いる分析方法も広範に用い
られているが、これらは紙等に試薬を含浸させた形で
行われる。

上記の紙は、例えば米国特許第3,050,373号あるいは
同3,06,523号各明細書等に記載されているように紙の
ごとき吸水性繊維質担体に試薬溶液を含浸させ、乾燥さ
せて作られるものである。これらは一般に分析試験紙又
は単に試験片と呼ばれるもので、試験片に流体試料を滴
下するか、又は流体試料中へ試験片を浸漬させ試験片の
色変化又は濃度変化を肉眼判定か、又は反射濃度計によ
り測定し、流体試料中の特性成分の濃度レベルを決定す
るものである。

これらの試験片は、その取扱いが簡便であり、かつ直ち
に結果が得られるので有用ではあるが、その構成上から
半定量又は定性分析の領域にとどまつている。

他方、上述のごとき従来の分析方法に対して操作性の簡
便なドライ・ケミストリーを用い、その上高い定量性を
有する多層分析素子が知られている。例えば、特公昭53
−21677号、特開昭55−164356号、同57−125847号、特
願昭56−654446号、並びに同56−189784号各明細書に多
層分析素子が記載されている。

これらに記載の素子によれば、分析反応に用いられる一
切の試薬類を一枚の分析素子中に含有しており、血清又
は全血液を一定容量上記素子上に滴下し、一定温度で一
定時間保温した後、支持体側か反射濃度の測定を行い、
この反射濃度から物質濃度を決定することが可能であ
る。

上記方法は、従来の試験紙型のものに対して飛躍的な分
析精度を有し、かつ予め試薬を調製することなくウエッ
ト・ケミストリーと同等以上の性能を有するものであ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、かかるドライ・ケミストリーを用いた分
析素子において、目的とする検体を測定するために必要
な反応系を触媒する酵素を、活性を維持したまま組込む
ことは、極めて困難なことである。

本発明の目的は、前記のような酵素の活性を維持させた
分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あつて、支持体上に、少なくとも１つの試薬層、及びそ
の上方に有機溶媒を用いて設けた多孔性層を有する、流
体中のあらかじめ定められた特性成分を分析するための
分析素子であつて、該特性成分を検知可能な物質に誘導
させる反応のために必要な酵素を、該分析及び該反応を
実質的に妨害する物質を含有しないタンパク質及び／又
はポリペプチド化合物との混合物として前記有機溶媒中
に分散させ、前記多孔性層中に分散含有させたことを特
徴とする。

まず、本発明において、酵素を含有させる層について説
明する。

主として疏水性の高い被験物質の分析を分析素子に適用
する場合、触媒である酵素は展開層又はそれに類似の層
に含有させることが望ましい。

上記層で反応させることにより、被験物質を、新水性バ
インダーから成る試薬層へ拡散可能な物質まで変換する
ことが望ましい。

例えば、コレステロール分析の場合、血液中にはコレス
テロールエステルとコレステロールとの混合物として存
在することが知られているが、これらの反応は、下記の
ように （３）Ｈ_２Ｏ_２検出反応 という過程で行われる。そして、前記のように、この１
及び２の反応に用いられる酵素、すなわちコレステロー
ルエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを、展
開層又はそれに類似の層に含有させることが望ましい。

この際、酵素を該層に含有させるためには、該層は、水
又はそれに準ずる系で塗設することが望ましい。しかし
ながら、該方法を用いると、試薬層から、水溶性の試薬
の移動を誘起し、十分な分析性能を達成することができ
ない。これを解決するには、前記層を非水溶媒で塗設す
るとよいが、その際、酵素を直接該層中に分散含有させ
ると、酵素の有機溶媒による変性失活を招き、著しい感
度の低下を引起す。

上記問題点を解決するために本発明においては、妨害物
質を含有しないタンパク質及び／又はポリペプチド化合
物を使用する。

本発明において使用する「該分析及び該反応を実質的に
妨害する物質を含有しないタンパク質及び／又はポリペ
プチド化合物」とは、分析目的たる特定成分及び酵素活
性を実質的に含有せず、且つ該特定成分を検知可能な物
質に誘導させる反応を実質的に妨害する物質を含有しな
いタンパク質及び／又はポリペプチド化合物を意味す
る。

前記定義したタンパク質及び／又はポリペプチド化合物
の例としてはアルブミン（牛血清アルブミン、卵白アル
ブミン等）、グロブリン、ゼラチン及びゼラチン分解物
等が好ましい。特定成分を検知可能な物質に誘導させる
ために必要とされる酵素としてはコレステロールエステ
ラーゼ、リポプロテインリパーゼ等の加水分解酵素、コ
レステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ等の酸化酵素、ウリカーゼ、ジアホラ
ーゼ、グルタミン酸脱水素酵素等が挙げられる。被験物
質を親水性バインダーから成る試薬層へ拡散可能な物質
まで変換するために多孔性層に含有させるのに好ましい
酵素としてはコレステロールエステラーゼ、リポプロテ
インリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ等が挙げら
れる。該酵素と妨害物質を含有しないタンパク質及び／
又はポリペプチド化合物の比率は広範に選択された割合
を用いることが可能であるが、各々のタンパク量として
重量で10対１〜１対5000が好ましく、特に１対１〜１対
200の比率の範囲で用いることが、特に好適である。

本発明において、酵素とタンパク質及び／又はポリペプ
チド化合物との混合物を分散含有する多孔性層を形成す
るための有機溶媒としては、例えばキシレン、ベンゼ
ン、トルエン、メタノール、エタノール、ブタノール、
アセトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン等の非水
溶媒が挙げられるが、これらの中で好適なものは、キシ
レン、ベンゼン、トルエン、ブタノール、クロロホルム
等の水不混和性有機溶媒である。

ペルオキシダーゼを用いる場合には、常法に従つて水素
供与体及びカプラーを併用する。

水素供与体の例としては、特開昭48−52158号公報に開
示されている４−置換アンチピリン、同55−20471号公
報に開示されている２−ヒドラゾノベンゾチアゾリン、
同55−148100号公報に開示されているｐ−ハロゲノフエ
ノール（以上、特開昭57−174099号公報参照）、更に特
開昭和50−137192号、同57−94653号、及び同57−17409
9号各公報に開示されているｏ−又はｐ−フエニレンジ
アミン系化合物が挙げられる。

これらの中で好ましいものは、４−置換アンチピリン及
びｐ−フエニレンジアミン系化合物であり、特に、４−
アミノアンチピリン、特開昭57−94653号公報に具体例
として挙げられているｐ−フエニレンジアミン系化合物
が好ましい。

水素供与体は広範に選択された量を用いることが可能で
あるが、0.01〜100ミルモル/m^２、好ましくは0.05〜50
ミリモル/m^２の範囲で用いることができる。

カプラーの例としては、特開昭57−94654号公報に開示
されているアシルアセトアミド化合物、同57−94656号
及び同57−174099号各公報に開示されているピラゾロン
系化合物、同57−94653号及び同57−174099号各公報に
開示されているフエノール系化合物、同57−94655号及
び同57−17099号各公報に開示されているナフトール系
化合物、及び同57−174099号公報に開示されているN,N
−ジ置換アニリン化合物が挙げられる。これらの中で好
ましいものは、ピラゾロン系化合物、フエノール系化合
物及びナフトール系化合物であり、特に特開昭57−9465
6号、同57−94653号、同57−94655号及び同57−174099
号各公報に具体例として挙げられている化合物、及び２
−テトラフルオロエチルカルボニルアミノ−５−〔α−
（2,4−ジ−ｔ−アミルフエノキシ）ペンチルカルボニ
ルアミノ〕フエノールが好ましい。

カプラーは広範に選択された量を用いることが可能であ
るが、0.1〜100ミリモル/m^２、好ましくは0.5〜50ミリ
モル/m^２の範囲で用いることができる。

本発明の分析素子は支持体上に、流体試料中の成分と反
応する少なくとも一種の試薬を含み且つ親水性コロイド
からなる少なくとも一層の試薬層と、その上方に前記流
体試料中の成分を前記試薬層へ透過させる展開層を順次
積層してつくられる。

本発明に係る支持体は、従来公知のものでよく、好適な
ものには、液体不浸透性で、且つ光透過性のものがあ
り、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネート、又はポリスチレンのような種々
の重合体材料が、この使用目的に適する。更には、上記
重合体材料のみならず、ガラスのごとき無機材料も同様
に用いることが可能である。本発明に係る支持体の厚さ
は任意であるが、好ましくは約50〜約250μｍである。
また、本発明に係る支持体の観測側の一側面は、その目
的に応じて任意に加工することが可能である。更に試薬
層を積層する側の支持体面に、場合によつては光透過性
の下塗り層を使用して試薬層と支持体との接着性を改良
することができる。

本発明に係る展開層は、（１）一定容量の流体試料を単
位面積当り一定容量を試薬層に均一に配布する機能を有
するものである。その上、更に、特公昭53−21677号明
細書に記載された性能、すなわち（２）流体試料中の分
析反応を阻害する物質又は要因を除去する機能、及び／
又は（３）分光光度分析を行うときに支持体を経て透過
する測定光を反射するバツクグランド作用を行う機能を
有するものであれば好ましい。したがつて、本発明に係
る展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、（１）
に加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有する
層のいずれかとすることができ、あるいは、（１）を包
含する複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層を
使用することも可能である。更に（１）、（２）及び
（３）の機能のうち、２つの機能を有する層と、残りの
１つの機能を有する層を組合せて使用することもでき
る。例えば、前述の特公昭53−21677号公報に記載され
た二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るブラツシ
ユポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開層、特
開昭55−164356号明細書に記載された親水化処理した織
物の展開層、特開昭57−94658号、同57−125847号、同5
7−197466号及び同58−70161号等の各明細書に記載され
た繊維構造展開層、特開昭58−90167号明細書に記載さ
れた粒子結合体構造展開層が挙げられる。特に、上記繊
維構造展開層及び粒子結合体構造展開層は、血球部分も
速やかに移送することが可能な素材として特に有用であ
る。本発明の分析素子における展開層の膜厚は、その空
隙率によつて決定されるべきであるが、好ましくは約10
0〜約500μｍ、更に好ましくは約150〜350μｍである。
また、空隙率は好ましくは約20〜約85％である。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、緩衝
剤、界面活性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加す
ることができる。

特に界面活性剤は流体試料を本発明の素子に適用した際
の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば2,5−ジ−ｔ
−ブチルフエノキシポリエチレングリコール、ｐ−オク
チルフエノキシポリエチレングリコール、ｐ−イソノニ
ルフエノキシポリエチレングリコール等のアルキル置換
フエノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級脂
肪酸のポリアルキレングリコールエステル等が挙げられ
る。これらの界面活性剤は流体試料の受容層への浸透速
度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラフイ
現象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重量に対して10重量％〜0.005重
量％、好ましくは６重量％〜0.05重量％用いることがで
きる。

本発明に係る試薬層は親水性バインダーから構成される
ものであり、二層以上の試薬層に分離することも可能で
ある。

バインダーとしては、ゼラチン、フタル化ゼラチン等の
ゼラチン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム塩等の水溶性セルロー
ス誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミ
ド、ポリメタクリルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル
置換）アクリルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置
換）メタクリルアミド、及びこれらの水溶性共重合体等
が挙げられる。

本発明の分析素子は、必要に応じて、例えば米国特許第
3,992,158号明細書記載の反射層、下塗り層、米国特許
第4,042,335号明細書記載の放射線ブロツキング層、米
国特許第4,066,403号明細書記載のバリヤー層、米国特
許第4,166,093号明細書記載のマイグレーシヨン阻止
層、特開昭55−90859号公報記載のスカベンジヤー層及
び米国特許第4,110,079号明細書記載の破壊性ポツド状
部材等を任意に組合せて本発明の目的に合わせた任意の
構成とすることができる。

これら分析阻止の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に伴い、従来写真工業において公知のスライ
ドホツパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を適宜
選択して用い、順次積層することで任意の厚みの層を塗
設することができる。

本発明の分析阻止を用いて、流体試料中の特定成分の量
を、本発明に係る支持体側から反射スペクトロフオトメ
トリーにより初速度法又は反応終結法に従つて測定する
ことができる。このようにして得られた測定値は、予め
作成しておいた検量線に当てはめることで特定成分の量
を決定することができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５μから約50μ
であり、更に好ましくは５μから20μである。通常
約10μの流体試料を適用するのが好ましい。

本発明の分析素子は、全血液、血清及び血漿のいずれの
分析にも不都合なく用いることができる。更には尿、リ
ンパ液、髄液等の他の体液も不都合なく用いられる。全
血液を用いる場合には、必要に応じて検出のための放射
線が血球により妨害を受けるのをさけるために前述の放
射線ブロツキング層又は他の反射層を設けることができ
る。

本発明の分析素子に用いられる分析反応は、その目的に
より任意に定めることができるが、例えば臨床化学の分
野に有用であり、特に生物学的液体試料、すなわち血液
又は尿中の成分の分析に用いられる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

なお、各実施例において、特に断わりのない限り試薬層
はすべて水溶液として調製し、塗布層とした。

実施例１ 膜厚180μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレー
ト支持体上に表−１に示す組成の試薬層を一層又は二層
設け、次いで各試薬層上に表−２に示す組成の各試薬を
キシレン分散又は水系溶解の方法で展開層として塗布
し、表−３に示す本発明の分析素子−１〜２及び比較分
析素子−１〜２を作成した。

これらの試料に対して製造直後及び40℃で10日間保存し
た後の性能について、これらの試料に各々100、200、40
0、500mg/dlのコレステロールエステルが含有された血
清〔リピツドセーラム栄研化学（株）製〕を10μ滴下
し、次いで37℃、10分間保温後サクラデンシトメーター
PDA−65（小西六写真工業社製）を用いて発色スポツト
の540nmにおける反射濃度を測定した。その結果を表−
４に示す。

表−４で明らかなように比較の分析素子は同一濃度の血
清を滴下した場合の反射濃度値に大きな変動及び保存に
おける劣化が認められるのに対して、本発明の分析素子
では僅かな変動しか認められず保存性においても良好な
性能が得られた。

また、本発明の分析素子は比較の分析素子に比べて発色
むらがなく均一であつた。

実施例２ 膜厚約180μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に表−５に示す組成の試薬層を二層設け次
いで各試薬層上に表−６に示す組成の各試薬をキシレン
分散させて展開層として塗布し表−７に示す本発明の分
析素子−１（実施例１と同じ）及び比較の分析素子−３
〜４を作成した。これらの試料に対して製造直後及び40
℃で10日間保存した後の性能についてこれらの試料に各
々100、200、400、500mg/dlのコレステロールエステル
が含有された血清〔リピツドセーラム栄研化学（株）
製〕を10μ滴下し次いで37℃10分間保温後サクラデシ
トメーターPDA−65（小西六写真工業社製）を用いて発
色スポツトの540nmにおける反射濃度を測定した。その
結果実施例１に示したと同様に比較の分析素子は上記各
濃度の血清を滴下した場合の識別能が低く保存における
劣化が認められるのに対して本発明の分析素子において
は識別能及び保存性において良好な性能が得られた。

実施例３ 膜厚約180μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に表−８に示す組成の試薬層を二層設け次
いで各試薬層上に表−９に示す組成の各試薬をキシレン
分散させて展開層として塗布し表−10に示す本発明の分
析素子−３及び比較の分析素子−５を作成した。

これらの試料に対して製造直後及び40℃で10日間保存し
た後の性能についてこれらの試料に各々100、200、300m
g/dlのトリグリセリドを含有した血清〔リピツドセーラ
ム栄研化学（株）製〕を10μ滴下し次いで37℃10分間
保温後、サクラデンシトメーターPDA−65（小西六写真
工業社製）を用いて発色スポツトの540nmにおける反射
濃度を測定した。その結果表−11に示したように、比較
の分析素子は上記各濃度の血清を滴下した場合の識別能
が低く保存における劣化が認められるのに対して本発明
の分析素子においては識別能及び保存性において良好な
性能が得られた。

実施例４ 膜厚約180μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に表−５に示す組成の試薬層のうちＲ−
１、次いでＲ−２の二層を設けた。次いで下記調製法に
て作成した展開層を軽く圧力を加えて接着し、更にこの
上に2,5−ジ−ｔ−ブチルフエノキシポリエチレングリ
コール水溶液を噴霧したものを乾燥してコレステロール
分析用フイルムを作成した。

〔展開層調製法〕

60番手の綿糸で織られたブロード（日清紡製）を１％の
ゼラチン水溶液中で処理し、ゼラチンの含有率がおよそ
2.5％である親水化処理された液体試料展開層用織物を
調製した。

ビーカーの口を該展開層用織物によつてフタをしてそこ
へ表−12の組成の分散溶液を注ぎその後少量のキシレン
中に分散溶液が浸されている展開層用織物を注意深く移
し変え、冷却下に10分間超音波分散を行つた後、室温中
空気乾燥を行い分散物が付着した展開層用織物を作成し
た。

その結果本発明の分析素子においては識別能及び保存性
において良好な性能が得られた。

実施例５ 実施例４で作成したものと同様な方法で試薬層を設け更
に下記調製法にて作成した展開層を軽く圧力を加えて接
着し積層したものに2,5−ジ−ｔ−ブチルフエノキシポ
リエチレングリコール水溶液を噴霧したものを乾燥して
コレステロール分析用フイルムを作成した。

〔展開層調製法〕

表−13の組成の均一な分散溶液中に紙（東洋紙社製
No.7）を浸漬させ冷却下超音波分散を15分間行いその
後、室温中空気乾燥を行い分散物が付着した展開層用
紙を作成した。

その結果本発明の分析素子においては識別能及び保存性
において良好な性能が得られた。

実施例６ 膜厚約180μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に表−８に示す組成の試薬層のＲ−５、次
いでＲ−６の二層を設けた。次いで下記調製法にて作成
したセルロース紙を軽く圧力を加えて接着し、更にこ
の上に2,5−ジ−ｔ−ブチルフエノキシポリエチレング
リコール水溶液を噴霧したものを乾燥してトリグリセリ
ド分析用フイルムとして用いた。

〔展開層用セルロース紙の調製法〕 冷却下リポプロテインリパーゼ800mg（10U/mg）及び牛
血清アルブミン3.8gを蒸留水100mlに溶解し均一にかく
はんしたものを−40℃で凍結させ、減圧真空により凍結
乾燥を行い、凍結乾燥粉末を調製した。次いでこれをキ
シレン中に均一に分散させてキシレン分散液を得た。純
水でよく洗浄したセルロース紙（例えば東洋紙製N
o.3A）を、前記キシレン分散液中に懸濁分散させ、これ
をち密なナイロンメツシユ上に展開し乾燥した後、ナイ
ロンメツシユをはく離し展開層用のセルロース紙とし
て用いた。

結果として本発明の分析素子においては識別能及び保存
性において良好な性能が得られた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように本発明の分析素子によれば、酵素の
保存安定性が飛躍的に向上し、また発色むらもなく可視
光を使用して通常の分光光度計により、簡便且つ迅速に
流体試料、特に生物学的流体試料中の成分の高精度乾式
定量分析に用いることが可能となり、極めて実用的に有
利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 守夫 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真 工業株式会社内 (72)発明者 岡庭 憲一郎 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真 工業株式会社内 (72)発明者 百瀬 隆 東京都北区浮間５丁目５番１号 中外製薬 株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 古川 邦宏 東京都北区浮間５丁目５番１号 中外製薬 株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 残熊 壮一 東京都北区浮間５丁目５番１号 中外製薬 株式会社生産技術研究所内 (56)参考文献 特開 昭59−54962（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−209995（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】支持体上に、少なくとも１つの試薬層、及
   びその上方に有機溶媒を用いて設けた多孔性層を有す
   る、流体中のあらかじめ定められた特定成分を分析する
   ための分析素子であつて、該特定成分を検知可能な物質
   に誘導させる反応のために必要な酵素を、該分析及び該
   反応を実質的に妨害する物質を含有しないタンパク質及
   び／又はポリペプチド化合物との混合物として前記有機
   溶媒中に分散させ、前記多孔性層中に分散含有させたこ
   とを特徴とする分析素子。