JPH0431677B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、過酸化水素の分析素子に係り、詳し
くはペルオキシダーゼ作用を有する物質の存在下
で水素供与体及びカプラーを酸化縮合させ生成す
る色素を測定することにより過酸化水素を定量分
析するための保存安定性が改良された分析素子に
関する。 〔従来の技術〕 従来、乾式分析素子における試薬の保存安定性
を改善するために各種の試みがなされており、特
に過酸化水素を分析するための多層分析素子にお
いて、ペルオキシダーゼの保存安定性を改善する
ための試みが提案されている。例えば、特開昭54
−50393号、及び同57−116258号では、ある種の
共重合体を試薬層に添加することにより、また特
開昭57−174099号では、ピロガロール誘導体を試
薬層に添加することにより、それぞれペルオキシ
ダーゼの保存安定性の改善が試みられている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 これらの提案は、ペルオキシダーゼの保存によ
る劣化を抑制するための手段としては効果はある
が、素子の分析性能の保存安定性としては、まだ
充分満足できるものとは言い難く、更なる改善が
望まれている。 本発明の目的は、ペルオキシダーゼ作用を有す
る物質、水素供与体及びカプラーを用いる保存安
定性が改良された過酸化水素検出用分析素子を提
供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は過酸化水素検出
多層分析素子に関する発明であつて、ペルオキシ
ダーゼ作用を有する物質、水素供与体及び耐拡散
性カプラーを含有する過酸化水素の分析素子にお
いて、該ペルオキシダーゼ作用を有する物質と該
水素供試体とを、重層された多重層の別々の層に
含有されて互いに分離しているが流体試料適用に
より相互作用の生起が可能な状態に配備したこと
を特徴とする。 換言すると、本発明によれば、ペルオキシダー
ゼ作用を有する物質と水素供与体を流体試料適用
前までは実質的に分離された状態に配備したこと
により、両物質を共存含有させたものに比べて、
保存安定性が著しく改善される。 ペルオキシダーゼ作用を有する物質としては、
従来より知られている諸種の生物から抽出された
ペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ様作用を示す生物から抽出された他
の化学物質等を挙げることができ、これらのうち
ではペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダ
ーゼ作用を有する物質は広範に選択された量を用
いることが可能であるが、100〜1000000U／m²、
好ましくは1000〜100000U／m²の範囲で用いるこ
とができる。 水素供与体の例としては、特開昭48−52158号
公報に開示されている４−置換アンチピリン、同
55−20471号公報に開示されている２−ヒドラゾ
ノベンゾチアゾリン、同55−148100号公報に開示
されているｐ−ハロゲノフエノール（以上、特開
昭57−174099号公報参照）、更に特開昭50−
137192号、同57−94653号、及び同57−174099号
各公報に開示されているｏ−又はｐ−フエニレン
ジアミン系化合物が挙げられる。 これらの中で好ましいものは、４−置換アンチ
ピリン及びｐ−フエニレンジアミン系化合物であ
り、特に、４−アミノアンチピリン、特開昭57−
94653号公報に具体例として挙げられているｐ−
フエニレンジアミン系化合物が好ましい。 水素供与体は広範に選択された量を用いること
が可能であるが、0.01〜100ミリモル／m²、好ま
しくは0.05〜50ミリモル／m²の範囲で用いること
ができる。 耐拡散性カプラーの例としては、特開昭57−
94654号公報に開示されているアシルアセトアミ
ド化合物、同57−94656号及び同57−174099号公
報に開示されているピラゾロン系化合物、同57−
94653号及び同57−174099号各公報に開示されて
いるフエノール系化合物、同57−94655号及び同
57−174099号各公報に開示されているナフトール
系化合物、及び同57−174099号公報に開示されて
いるＮ，Ｎ−ジ置換アニリン化合物が挙げられ
る。これらの中で好ましいものは、ピラゾロン系
化合物、フエノール系化合物及びナフトール系化
合物であり、特に特開昭57−94656号、同57−
94653号、同57−94655号及び同57−174099号各公
報に具体例として挙げられている化合物、及び２
−テトラフルオロエチルカルボニルアミノ−５−
〔α−（２，４−ジ−ｔ−アミルフエノキシ）ペン
チルカルボニルアミノ〕フエノールが好ましい。 カプラーは広範に選択された量を用いることが
可能であるが、0.1〜100ミリモル／m²、好ましく
は0.5〜50ミリモル／m²の範囲で用いることがで
きる。 本発明の分析素子は支持体上に、流体試料中の
成分と反応する少なくとも一種の試薬を含み且つ
親水性コロイドからなる少なくとも一層の試薬層
と、その上方に前記流体試料中の成分を前記試薬
層へ透過させる展開層を順次積層してつくられ
る。 本発明に係る支持体は、従来公知のものでよ
く、好適なものには、液体不浸透性で、且つ光透
過性のものがあり、例えば酢酸セルロース、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又
はポリスチレンのような種種の重合体材料が、こ
の使用目的に適する。更には、上記重合体材料の
みならず、ガラスのごとき無機材料も同様に用い
ることが可能である。本発明に係る支持体の厚さ
は任意であるが、好ましくは約50〜約250μmであ
る。また、本発明に係る支持体の観測側の一側面
は、その目的に応じて任意に加工することが可能
である。更に試薬層を積層する側の支持体面に、
場合によつては光透過性の下塗り層を使用して試
薬層と支持体との接着性を改善することができ
る。 本発明に係る展開層は、(1)一定容量の流体試料
を単位面積当り一定容量を試薬層に均一に配布す
る機能を有するものである。その上、更に、特公
昭53−21677号明細書に記載された性能、すなわ
ち(2)流体試料中の分析反応を阻害する物質又は要
因を除去する機能、及び／又は(3)分光光度分析を
行うときに支持体を経て透過する測定光を反射す
るバツクグランド作用を行う機能を有するもので
あれば好ましい。したがつて、本発明に係る展開
層は、上記(1)の機能のみを有する層、(1)に加えて
(2)及び／又は(3)の機能を併せて有する層のいずれ
かとすることができ、あるいは、(1)を包含する複
数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層を使
用することも可能である。更に(1)、(2)及び(3)の機
能のうち、２つの機能を有する層と、残りの１つ
の機能を有する層を組合せて使用することもでき
る。例えば、前述の特公昭53−21677号公報に記
載された二酸化チタン及び二酢酸セルロースから
成るブラツシユポリマーと呼称される非繊維多孔
質媒体の展開層、特開昭55−164356号明細書に記
載された親水処理した織物の展開層、特開昭57−
94658号、同57−125847号、同57−197466号及び
同58−70161号等の各明細書に記載された繊維構
造展開層、特開昭58−90167号明細書に記載され
た粒子結合体構造展開層が挙げられる。特に、上
記繊維構造展開層及び粒子結合体構造展開層は、
血球部分も速やかに移送することが可能な素材と
して特に有用である。本発明の分析素子における
展開層の膜層は、その空〓率によつて決定される
べきであるが、好ましくは約100〜約500μm、更
に好ましくは約150〜350μmである。また、空〓
率は好ましくは約20〜約85％である。 本発明に係る試薬層は、親水性バインダーから
構成されるものであり、本発明に係る試薬、すな
わちペルオキシダーゼ作用を有する物質、水素供
与体及びカプラーを含有することができる。 本発明の目的に従えば、水性流体試料を適用す
る前にペルオキシダーゼ作用を有する物質と水素
供与体が実質的に分離された態様をとることを必
要とする。 上記二種の試薬を該試薬層内に含有させるため
には、該試薬が該水性流体試料適用前に不望の混
合を避けるために隣接して又は他に層を介して二
層以上の試薬層に分離することにより達成可能で
ある。 この際重要な点は、上記各試薬層を構成するバ
インダーの特性である。上記試薬層の上層のバイ
ンダーは、下層のバインダーに対して不溶性を示
す溶媒により積層されることが望ましい。すなわ
ち、該上層のバインダーの溶媒が該下層のバイン
ダーを溶解させないものであるバインダーの組合
せが好ましい。例えば、下層のバインダーは水溶
性ポリマーであり、上層は親水性且つ有機溶媒可
溶性ポリマーの組合せが好ましい。 更に詳しくは、下層のバインダーとしては、ゼ
ラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、
ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース誘
導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミ
ド、ポリメタクリルアミド、ポリ（モノ又はジア
ルキル置換）アクリルアミド、ポリ（モノ又はジ
アルキル置換）メタクリルアミド、及びこれらの
水溶性共重合体等が挙げられる。上層のバインダ
ーとしては、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポ
リ（Ｎ−ビニルイミダゾール）、ポリ（Ｎ−ビニ
ルトリアゾール）、及びこれらの誘導体又はそれ
らの共重合体、エチルセルロース、メチルセルロ
ース等が挙げられる。これらの重合体は主として
アルコール類、例えばエタノール、プロパノー
ル、ブタノール等に溶解し且つ親水性の高分子物
質である。 本発明のペルオキシダーゼ作用を有する物質及
び水素供与体は各々が分離され、別々の層に、溶
解又は分散等の方法により含有させることができ
る。この時の本発明のカプラーはいずれか一方の
層又は両方の層、更には別の層に含有することが
可能であり、その位置は特定されない。 更に別の態様として、該ペルオキシダーゼ作用
を有する物質及び水素供与体のいずれか一方を展
開層に、他方を試薬層に含有させることができ
る。この際展開層には、溶解、分散、含浸等の
種々の方法によつて含有させることが可能であ
る。特に、特開昭57−197466号公報に記載の繊維
構造展開層は、該展開層を構成する繊維中に所望
の量の試薬を容易に含浸することが可能である。 当然のことながら、カプラーは本発明の分析素
子を構成するいずれの層に含有されても本発明の
効果を減ずるものではない。 本発明の分析素子に用いられる分析反応はその
目的により任意に定めることができ、適用される
水性流体試料は生物学的、非生物学的水性流体試
料であれ、過酸化水素あるいは過酸化水素を生成
する化合物を含むものであれば良い。例えば、血
球（血糖、血清を含む）リンパ液、尿等が挙げら
れる。 本発明の分析素子は、前記のペルオキシダーゼ
作用を有する物質、水素供与体及びカプラー以外
に、分析すべき成分の種類に応じて、過酸化水素
を生成する酸化酵素及び他の酵素、基質、緩衝
剤、保恒剤、界面活性剤、硬膜剤等の種々の試薬
を含有することができる。 過酸化水素を生成する酸化酵素としては、例え
ば以下に示す種々のものが挙げられる。グルコー
スオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセ
リン−３−リン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキ
シダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−アスパ
ラギン酸オキシダーゼ、Ｄ（又はＬ）−アミノ酸オ
キシダーゼ、Ｌ−グロノ−γ−ラクトンオキシダ
ーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、Ｌ−２−ヒ
ドロキシ酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシ−Ｄ−
ニコチンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ−Ｌ−ニ
コチンオキシダーゼ、ピリドキサミンリン酸オキ
シダーゼ、ピリドキシンオキシダーゼ、ヘキソー
スオキシダーゼ、ｏ−アミノフエノールオキシダ
ーゼ、アミンオキシダーゼ（ピリドキサール含
有、又はフラビン含有）、キサンチンオキシダー
ゼ、アルコールオキシダーゼ、エタノールアミン
オキシダーゼ、N⁶−メチル−Ｌ−リジンオキシ
ダーゼ、α−グリセロホスフエートオキシダー
ゼ、コリンオキシダーゼ、アシルCoAオキシダ
ーゼ、亜硫酸オキシダーゼ等。 本発明の分析素子は、必要に応じて、例えば米
国特許第3992158号明細書記載の反射層、下塗り
層、米国特許第4042335号明細書記載の放射線ブ
ロツキング層、米国特許第4066403号明細書記載
のバリヤー層、及び特開昭55−90859号明細書記
載のスカベンジヤー層等を任意に組合せて本発明
の目的に合わせた任意の構成とすることができ
る。 これら分析素子の種種の層は、本発明に係る支
持体上に所望の構成に従い、従来写真工業におい
て公知のスライドホツパー塗布法、押出し塗布
法、浸漬塗布法等を適宜選択して用い、順次積層
することで任意の厚みの層を塗設することができ
る。 以上のように構成された本発明の分析素子は、
展開層側から流体試料を供給した後、試薬層の分
析反応を透明支持体側又はその反対側から観察
し、反射濃度を測定し、得られた測定値を予め作
製しておいた検量線にあてはめることで未知の量
を決定することができる。 〔実施例〕 以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。 実施例 １（グルコース用分析素子） 膜厚180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に表−１に示す組成の試薬層を
一層又は二層設け、次いで各試薬層上に表−２に
示す組成の展開層を設け、表−３に示す本発明の
分析素子−１〜３及び比較分析素子−１を作成し
た。

【表】

【表】

【表】

【表】 上記本発明の分析素子１〜３及び比較分析素子
−１に対して、製造直後及び40℃で３日間保存し
た後、反射濃度（カブリ）、並びに100、300、500
mg／dlのグリコース標準液を10μ展開層上に滴
下し、37℃10分間保温した後の反射濃度を540nm
にて各々支持体側から測定し、表−４の結果を得
た。

【表】 表−４の結果から明らかなように、水素供与体
である４−アミノアンチピリン・塩酸塩とペルオ
キシダーゼを共存含有させて作成した比較分析素
子−１では、保存によりカブリ及び呈色濃度の増
加が著しく大きいのに対して、本発明の分析素子
では、保存後もカブリ及び呈色濃度の変動が極め
て小さく、素子の安定性が向上していることが判
る。 実施例 ２（コレステロール用分析素子） 膜厚180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に表−５に示す組成の試薬層を
一層又は二層設け、次いで各試薬層上に表−６に
示す組成の展開層を設け、表−７に示す本発明の
分析素子−４及び比較分析素子−２を作成した。

【表】

【表】

【表】

【表】 上記本発明の分析素子−４及び比較分析素子−
２に対して、製造直後及び40℃で３日間保存した
後、反射濃度（カブリ）、並びにリピツドセラム
−と（栄研化学社製）より調製した150、
300、450mg／dlのコレステロール標準液を10μ
展開層上に滴下し、37℃10分間保温した後の反射
濃度を540nmにて各々支持体側から測定し、表−
８の結果を得た。

【表】 表−８の結果から明らかなように、水素供与体
である４−アミノアンチピリンとペルオキシダー
ゼを共存含有させて作成した比較分析素子−２で
は、保存によりカブリ及び呈色濃度の増加が著し
く大きいにのに対して、本発明の分析素子では、
保存後もカブリ及び呈色濃度の変動が極めて小さ
く、素子の安定性が向上していることが判る。 実施例 ３（尿酸分析素子） 膜厚180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に表−９に示す組成の試薬層を
設け、次いで各試薬層上に表−10に示す組成の展
開層を設け、表−11に示す本発明の分析素子−５
及び比較分析素子−３を作成した。

【表】

【表】

【表】

【表】 上記本発明の分析素子−５及び比較分析素子−
３に対して、製造直後及び40℃で３日間保存した
後、反射濃度（カブリ）、並びに５、10、15mg／
dlの尿酸標準液を10μ展開層上に滴下し、37℃
10分間保温した後の反射濃度を540nmにて各々支
持体側から測定し、表−12の結果を得た。

【表】 表−12の結果から明らかなように、水素供与体
であるＮ，Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンア
ミドエチル−４−アミノアニリン・ｐ−トルエン
スルホン酸塩とペルオキシダーゼを共存含有させ
て作成した比較分析素子−３では、保存によりカ
ブリ及び呈色濃度の増加が著しく大きいのに対し
て、本発明の分析素子では、保存後もカブリ及び
呈色濃度の変動が極めて小さく、素子の安定性が
向上していることが判る。 実施例 ４ 本発明の分析素子−５及び比較分析素子−３に
おいて、１−（２，４，６−トリクロロフエニル）
−３−（２−クロロ−５−オクタデシルスクシン
イミドアニリノ）−５−ピラゾロンの代わりに２
−テトラフルオロエチルカルボニルアミノ−５−
〔α−（２，４−ジ−ｔ−アミルフエノキシ）ペン
チルカルボニルアミノ〕フエノールを6.2ｇ／m²、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンアミドエ
チル−４−アミノアニリン・ｐ−トルエンスルホ
ン酸塩の代わりにＮ−エチル−Ｎ−メトキシエチ
ル−３−メチル−４−アミノアニリン・ｐ−トル
エンスルホン酸塩を0.13ｇ／m²用いた以外は実施
例−３と全く同様にして、本発明の分析素子−６
及び比較分析素子−４を作成した。 こうして得られた各分析素子に対して、実施例
−３と全く同様にして640nmでの反射濃度を測定
した。その結果、比較分析素子では、保存により
カブリ及び呈色濃度の増加が著しく大きいのに対
して、本発明の分析素子では、保存後もカブリ及
び呈色濃度の変動が極めて小さく、素子の安定性
が向上していることが判つた。 実施例 ５（トリグリセリド用分析素子） 膜厚180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に表−13に示す組成の試薬層を
二層設け、次いで各試薬層上に表−14に示す組成
の展開層を設け、表−15に示す本発明の分析素子
−７及び比較分析素子−５を作成した。

【表】

【表】

【表】 のふるいで分けたものを添加分散。

【表】 上記本発明の分析素子−７及び比較分析素子−
５に対して、製造直後及び40℃で３日間保存した
後、反射濃度（カブリ）並びにリピツドセラム−
と（栄研化学社製）より調製した100、200、
300mg／dlのトリグリセリド標準液を10μ展開
層上に滴下し、37℃10分間保温した後の反射濃度
を540nmにて各々支持体側から測定し、表−16の
結果を得た。

【表】 表−16の結果から明らかなように、水素供与体
である４−アミノアンチピリンとペルオキシダー
ゼを共存含有させて作成した比較分析素子−５で
は、保存によりカブリ及び呈色濃度の増加が著し
く大きいのに対して、本発明の分析素子では、保
存後もカブリ及び呈色濃度の変動が極めて小さ
く、素子の安定性が向上していることが判る。 実施例 ６（トリグリセリド用分析素子） 膜厚180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に、表−17に示す組成の試薬層
を一層又は二層設け、次いで各試薬層上に表−18
に示す組成の展開層を設け、表−19に示す本発明
の分析素子−８及び比較分析素子−６を作成し
た。

【表】

【表】 を添加分散。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の分析素子
は、定量感度及び測定精度に優れ、且つ保存安定
性に優れた過酸化水素検出用素子である点で顕著
な効果を奏するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペルオキシダーゼ作用を有する物質、水素供
   試体及び耐拡散性カプラーを含有する過酸化水素
   の分析素子において、該ペルオキシダーゼ作用を
   有する物質と該水素供試体とを、重層された多重
   層の別々の層に含有されて互いに分離しているが
   流体試料適用により相互作用の生起が可能な状態
   に配備したことを特徴とする過酸化水素検出用多
   層分析素子。