JPS6352897A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は分析素子、特Ｋｉ体試料中の特定成分を分析す
る分析素子に関し、更に詳しくは、生物学的流体試料中
の特定成分を還元型補酵素を介して分析するための乾式
の分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中の特定成分を分析するための乾式の
分析素子は種々の構成のものが知られている。それらの
中で脱水素酵素と酸化型補酵素の関与の下に生成する還
元型補酵素を電子伝達剤含分して色素形成前駆物質に伝
えて色素を形成させる反応系を利用する分析素子は、例
えば特開昭５９−８８０９７号、同５９−９１８９６号
各公報及び特願昭６０−１０４７７６号明細書に詳述さ
れている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、とれら各明細書に記載の分析素子は、乳
酸脱水素酵素の分析及び酸化型補酵素として酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ”
）の利用による特定成分の分析を除いて、生物学的流体
試料中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及び乳酸に由来する
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｐ）の非特異還元による誤差を受け、分析の正確度が損
なわれる欠点を有している。

本発明の目的は、脱水素酵素と酸化型補酵素の関与の下
に生成する還元型補酵素を電子伝達剤を介して色素形成
前駆物質に伝えて色素を形成させる反応系を利用する分
析素子において、生物学的流体試料中のＬＤＨ及び乳酸
に由来する誤差を除き、分析の正確度が改良された分析
素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あって、光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に、第１
の試薬層、第２の試薬層及びその上方に多孔性展開層を
有し、電子伝達剤、色素形成前駆物質、酸化型補酵素、
緩衝剤及び流体試料中の特定成分を介して前記酸化型補
酵素を還元型補酵素に変換し得る試薬を含有する、前記
流体試料中の特定成分を分析するだめの分析素子におい
て、前記酸化型補酵素を前記多孔性展開層に含有し、か
つＬＤＨ阻害剤分＃記第２の試薬層及び／又は前記多孔
性展開層に含有していることを特徴とする。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明に係る電子伝達剤は、生物学的流体試料中の特定
成分が介在して、本発明に係る試薬の少なくとも１種と
酸化型補酵素が反応して生成する還元型補酵素の存在下
で還元され、更に還元された該電子伝達剤は、色素形成
前駆物質を還元し、可視部に吸収を有する色素を形成さ
せるものである。

本発明において測定し得る流体試料中の特定成分として
は、例えばグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー
、ゼ（ＧＯＴ　）　、グルタミン酸ビルビ／酸トランス
アミナーゼ（ＧＰＴ　）　、アミラーゼ（ＡＭＹ　）　
、クレアチンホスホキナーゼ（ＯＰＫ　）及びトリグリ
セリド（ＴＧ）等が挙げられる。

本発明に係る試薬には、酵素、必要に応じて基質が包含
される。

これらの試薬は、測定すべき生物学的流体試料中の特定
成分によって適宜選ばれ、例えばＧＯＴを測定する場合
はアスパラギン酸、α−ケトグルタル酸及びグルタミン
酸脱水素酵素（ＧＩＤＨλＧＰＴの場合はアラニン、α
−ケトグルタル酸及びグルタミン酸脱水素酵素（Ｇ／Ｄ
Ｈ）　、ＡＭＹの場合はマルトペントース、オルトリン
酸、β−ホスホグルコムターゼ（β−ＰＧＭ　）　、グ
ルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ　）及びマルトースホス
ホリラーセ（Ｍｌ）　）　、ＯＰＫの場合はクレアチン
、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ　）　、ヘキソキナーゼ
（ＨＫ）及びグルコ−・スー６−リン酸脱水素酵素（Ｇ
−６−ＰＤＥ［）　、ＴＧの場合は、リボプロティンリ
パーゼ（ＬＰＬ　）、グリセロキナーゼ（ＧＫ）、グリ
セロリン酸脱水素酵素（Ｇｐｎａ）及びアデノシン三リ
ン酸（ＡＴＰ　）あるいはＩ＋ＰＬ及びグリセロール脱
水素酵素（ＧＤＨ）である。

本発明に係る酸化型補酵素とは、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰ
＋等をいう。還元型補酵素とは、前記酸化型補酵素の還
元型をいう。ＮＡＤＰの還元型はＮＡＤＨで、ＮＡＤＰ
＋の還元型は１ＪＡＤＰＨである。本発明では特にＮＡ
ＤＰが好しく用いられ、したがってＮＡＤＨに変換され
る。ＮＡＤＰは本発明に係る多孔性展開層に含有させる
ことによシ、前記特定成分の分析感度が向上できる。

以下に本発明に係る生物学的流体試料中の特定成分が介
在して、本発明に係る試薬の少なくとも１種とＮＡＤ＋
との反応によって、ＭＡＤＥが生成される反応式を示す
。

アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸−→ル酸十ＮＡＤ
Ｈ＋Ｎ馬＋■＋ ＰＴ 酸十ＮＡＤＨ十ＮＨ，＋Ｈ” ＭＹ マルトース ＋β−Ｄ−グルコースー１−ホスフェートグルコース−
６−ホスフェート ６−ホスホグルコン酸十ＮＡＤＨ ＰＫ ＤＰ ６−リン酸 ホスホグルコン酸十ＮＡＤＨ Ｇ ン酸＋ＡＤＰ ＤＨ グリセリン＋ＮＡＤ＋−−→ジヒドロキシアセトン十Ｈ
ＡＤＨ 本発明に用いられる電子伝達剤としては、Ｎ−メチルフ
ェナジン・メトサルフェート類（例、ｔばＮ−メチルフ
ェナジン・メトサルフェート、１−メトキシ−Ｎ−メチ
ルフェナジンメトサルフェート等）、メルトラブル−、
メチレンブルー及びジアホラーゼなどを使用することが
でき、好ましい電子伝達剤としては、Ｎ−メチルフェナ
ジンメトサルフェート類及びジアホラーゼを挙げること
ができる。

一方、本発明に係る色素形成前駆物質としては、テトラ
ゾリウム塩類が通常用いられる。本発明において用いら
れる上記テトラゾリウム塩類は、色素形成後はほとんど
が水に対して難溶ないしは不溶性になり、通常ウェット
・ケミストリー法では使用が難しいものの、形成される
色素が耐拡散性であシ、不所望のリンギングを防止し、
測定の定量性を向上させる点で、好ましく使用すること
ができる。

本発明において有用とされる上記テトラゾリウム塩とし
ては、例えば５．５’　−（５，５’−ジメトキシ−４
，４′−ビフェニレン）−ビス（２−（ｐ−二トロフェ
ニル）−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕、５．
５’−（５，５’−ジメトヤシー４．４′−ビフェニレ
ン）−ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリ
ド）、５−（４／ダージ）ｆｋ−２−チアゾリル）　−
２１’−ジフェニルテトラゾリウムプロミド、５−（ｐ
−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５
−フェニル−テトラゾリウムクロリド、２ｆ”１５、ダ
ーテトラー（ｐ−ニトロフェニル）−３，５’−（３，
３’−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ジテト
ラゾリウムクロリド、２，３，５−　トリフェニルテト
ラゾリウムクロリド、Ｓ、Ｓ’−（３，５’−ジメトキ
シ−４，４′−ビフェニレン）−ビス−（２，５−ビス
（ｐ−二トロフェニル）テトラゾリウムクロリド〕及び
５．５’　−（ａ、ａ’−ビフェニレン）−ビスＣ２，
５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド〕等を誉げるこ
とかできる。

上記テトラゾリウム塩の中で好ましく用いられるものと
しては、５．！ｌ’−（５，５’−ジメトキシ−４μ′
−ビフェニレン）−ビス（２−’（ｐ−二トロフェニル
）−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕及び５．５
１−　（４，４１−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジ
フェニルテトラゾリウムクロリド〕を挙げることができ
、本発明に係る第１の試薬層に含有させることが好まし
い。

本発明に用いられる緩衝剤としては、前記反応における
至適ｐＴｌによって適宜選択される。例えば、トリス緩
衝剤（トリスヒドロキシメチルアミノメタン及び塩酸ト
リスヒドロキシメチルアミノメタンの組蚕合へせとして
知られるもの）、グツドの緩衝剤として知られるもの、
炭酸塩緩衝剤等が好ましく用いられることができる。

上記緩衝剤は、前述の色素形成前駆物質と別異の層に含
有することが好ま゛しい。これらは、製造時及び試料適
用時に混合されない状態で、積層されていることはいう
までもない。このためくい上記緩衝剤がバインダー中に
分散されていることが好ましく、本発明に係る第２の試
薬層に含有させることが好ましい。

本発明に係るＬＤＩｌｉ阻害剤とは、ＴＪＤＴｌの活性
を阻害する物質をいい、このＬＤ’ＦＩ阻害剤としては
、シュウ酸及びその塩、ピルビン酸及びその塩、マロン
酸及びその塩、オキサミン酸及びその塩、タルトロン酸
及びその塩、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、ヨー
ドアセトアミド、２．Ａ−ジニトロフルオロベンゼン、
ｐ＋ジクロロ息香酸第二水銀、沃化物、銀塩及び第二水
銀塩等を使用することができ、好ましい乳酸脱水素酵素
阻害剤としては、シュウ酸及びその塩、ピルビン酸及び
その塩、オキサミン酸及びその塩、タルトロン酸及びそ
の塩及びヨードアセトアミドを挙げることができる。

上記ＩＪＤＨ阻害剤は、本発明に係る第２の試薬層及び
／又は多孔性展開層に含有させることによシ本発明の効
果は特に大きくなる。

本発明に係る第１の試薬層及び第２の試薬層を構成する
バインダーの特性は重要である。第２の試薬層のバイン
ダーは第１の試薬層のバインダーに対して不溶性を示す
溶媒によφ積層されることか望ましい。す力わち、第２
の試薬層のバインダーの溶媒が第１の試薬層のバインダ
ーを溶解させないものでおるバインダーの組合せが好ま
しい。例えば、第１の試薬層のパイン゛ダーは水溶性ポ
リマーであり、第２の試薬層のバインダーは親水性且つ
有機溶媒可溶性のポリマーの組合せが好ましい。

本発明に係る第１の試薬層を形成するためのバインダー
としてはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導
体、ヒドロキシエチルセル゛ロース、カルボキクメチル
セルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース誘導体、
ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタ
クリルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）アクリ
ルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）メタクリル
アミド及びこれらの水溶性共重合体等が挙げられる。好
ましくは、ゼラチン及びその誘導体が用いられる。

本発明の第２の試薬層を形成するためのバインダーとし
ては、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｍ−ビニ
ルイミダゾール）、ポリ（Ｎ−ビニルトリアゾール）及
びこれらの誘導体又はそれらの共重合体、エチルセルロ
ース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、特願昭
６０−１０４７７６号明細書に記載の共重合体等が挙げ
られる。これらの重合体は主としてアルコール類、例え
ばエタノール、プロパツール、ブタノール等に溶解し且
つ親水性の高分子物質である。好ましくは特願昭６０−
’１０４７７６号゛明細書に記載の共重合体が用いられ
る。

本発明に係る電子伝達剤及び他の種々の試薬は、第１の
試薬層、第２の試薬層及び多孔性展開層のいずれに含有
させてもよい。

本発明に用いられる電子伝達剤を本発明の分析素子に含
有させる量は、前記特定成分の量に応シて変わるが、ジ
アホラーゼ以外の電子伝達剤の場合、通常は１Ｔｎ９／
−〜１　ｆ／ｌｎ”　、好ましくは１０〜５　ｏ　ｏ　
ｕｐ／−である。

更に、ジアホラーゼを電子伝達剤として用いる場合、前
記特定成分の量に応じて変るだけでなく、ジアホラーゼ
の由来及び活性値の測定法に応じて変わる。通常は１０
０Ｕ／−〜１０へＯＯＯＩＦ７−１好ましくは５００〜
５Ｑ、０ＯＯ１ｌｒ／−を含有させることができる。

また、本発明に係る色素形成前駆物質を本発明の分析素
子に含有させる量は、通常は１０１−〜１０１７ｍ”、
好ましくは５０η／−〜３η−である。更に、本発明に
係る酸化型補酵素を本発明の分析素子に含有させる量は
、通常は１０■／−〜５０１７ｍ”　、好ましくは５０
　ｍｇ／−〜１０１７ｍ”　　である。

また、本発明に係るＬＤＨ阻害剤を本発明の分析素子に
含有させる量は、通常はｓ　ｒＲ９／−〜５０ｆ／−１
好ましくは５０　ｍ９７ｍ”　〜１０　ｆ／−である。

本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の光透過性
支持体（以下、本発明に係る支持体と略す）は、液体不
浸透性で、かつ光透過性であればその種類を問わないが
、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート
、ポリカーボネート又はポリスチレンのような種々の重
合体材料がこの使用目的に適する。更には上記重合体材
料のみならず、ガラスの如き無機材料も同様に用いるこ
とが可能である。本発明に係る支持体の厚さは任意であ
るが、好ましくは５０〜２５０μ惟である。また、本発
明に係る支持体の観測側の一側面は、その目的に応じて
任意に加工することが可能である。更に試薬層を積層す
る側の支持体面に、場合によっては光透過性の下塗シ層
を使用して試薬と支持体との接着性を改良することがで
きる。

本発明に係る多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試
料を単位面積ｓｂ試薬層に均一に配布する機能を有する
ものである。その上、更に、特公昭５５−２１６７７号
公報に記載された性能、すなわち（２）流体試料中の分
析反応を阻害する物質又は要因と除去する機能及び／又
は（３）分光光度分析を行うときに支持体を経て透過す
る測定光を反射するバックグランド作用を行う機能を有
するものであれば好ましい。したがって、本発明に係る
多孔性展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、（
１）に加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有
する層のいずれかとすることができ、あるいは（１）を
包含する複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層
を使用することも可能である。更に（１）、（２）及び
（３）の機能のうち、２つの機能分有する層と、残りの
１つの機能を有する層を組合せて使用することもできる
。例えば、前述の特公昭５５−２１６７７号公報に記載
された二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るプラ
ッシュポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開層
、特開昭５５−１６４５５６号公報に記載された親水化
処理した織物の展開層、特開昭５７−９４６５８号、同
５７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号及び同
５８−７０１６１号等の各公報に記載された繊維構造展
開層、特開昭５８−９０１６７号明細書に記載された粒
子結合体構造展開層が挙げられる。特に、上記繊維構造
展開層及び粒子結合体構造展開層は、血球部分も速やか
に移送することが可能な素材として特に有用である。本
発明の分析素子における展開層の膜厚は、その空隙率に
よって決定されるべきであるが、好ましくは約１００〜
５００μ情、更に好ましくは約１５０〜３５０μ常であ
る。また、空隙率は好ましくは約２０〜８５チである。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することがで
きる。

特に界面活性剤は、流体試料を本発明の素子に適用した
際の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−ジ−
ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−イソノ
ニルフエノキシポリエチレングリコール等のアルキル置
換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級
脂肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが挙げ
られる。これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸
透速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラ
フィー現象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重量に対して２５重量％〜（１０
０５重量％、好ましくは１５〜１０５重量％用いること
ができる。

本発明の分析素子は必要に応じて、例えば米国特許第４
９９２，１５８号明細書記載の反射層、下塗）層、米国
特許第４．　ＯＡ　２．３３５号明細書記載の放射線ブ
ロッキング層、米国特許第４０６４４０５号明細書記載
のバリヤー層、米国特許第４，１６６．０９５号明細書
記載のマイグレーション阻止層、特開昭５５−９０８５
９号公報記載のスカベンジャー層、及び米国特許第４１
１Ｑ、０７９号明細書記載の破壊性ボッド状部材等を任
意に組合せて本発明の目的に合せた任意の構成とするこ
とができる。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を適宜
選択して用い、順次積層することで任意の厚みの層を塗
設することができる。

本発明の分析素子を用いて、流体試料中の特定成分の量
を、本発明に係る支持体側から反射スペクトロホトメト
リーによυ初速変法または反応終点法に従って測定する
ことができる。このようにして得られた測定値は、予め
作成しておいた検量線に当てはめることで特定成分の量
を決定することができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５μｌから約５０μ
ｌであシ、更に好ましくは５μｌから２０μｌである。

通常１０μｌの流体試料を適用するのが好ましい。

本発明の分析素子は全血液、血清及び血漿のいずれの分
析にも不都合なく用いることができる。更には尿、リン
パ液、髄液等の他の体液も不都合なく用いられる。全血
液を用いる場合には、必要に応じて検出のための放射線
が血球により妨害を受けるのを避けるために、前述の放
射線ブロッキング層又は他の反射層を設けることができ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例−１（ＧＯＴ用分析素子） 膜厚１８０μ慣の透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層（Ｒ−１−１） ゼラチン　　　　　　　　　　　２１．Ｏｔ／Ｗ？グル
タミン酸脱水酸酢水素酵素ａ　２０００σ／−ジアホラ
ーゼ　　　　　　　　　２．１ｏｏＴ７／ｍ”５　、３
１−　（４、４１−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジ
フェニルテトラソリ ウムクロリド）　　　　　　　　　　１．０　ｆ／Ｉ？
ト　リ　ト　ン！　　−１００Ｃローム　アンドノース
（Ｒｏｈｍ　ｓａ　Ｈａｇｓ）社）　　　　　　２．１
　ｆ／Ｊ１．２−ビス（ビニルスルホニル） エタン　　　　　　　　　　　　ａ、１ｓ　ｔ／Ｊ上記
第１の試薬層上ｋ、更に下表の第２の試薬層及び展開層
を順次設け、表−１に示す本発明の分析素子１〜５及び
比較分析素子−１を作成した。

第２の試薬層（Ｒ−２） 簀１）　ＢＡＳＩＦ社の商品名 Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モル比２
０　：　８０） 黄　上記第２の試薬層は、溶媒としてｎ−ブタノールを
用いて、サンドグラインダー直接分散により塗設。

展開層（Ｓ） 薫キシレン溶媒にて塗設 簀アスパラギン酸−ナトリウム、ＭＡＤ十　及びオキサ
ミン酸カリウムは別途に溶媒としてキシレンを用い、サ
ンドグラインダーによシ直接分散して添加。

簀α−ケトグルタル酸及びシュウ酸・２馬０はメタノー
ルに溶解後、添加。

表−１ 上記本発明の分析素子１〜５及び比較分析素子−１に対
して、透析処理したプール血清（ＧＯＴ：２５に−Ｕ　
、　Ｔ、＋ＤＨ：　２５０Ｗ−Ｕ　）、ＧＯＴ　（：シ
グマ社、ボーシン　／’　　）　（Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｈ
ｅａｒｔ　）　］を添加したプール血清（ＧＯＴ　：　
９０に一■、　ＬＤＨ：　２５０Ｗ−ＩＴ）及び上記各
々のプール血清にＩ、ＤＨ（シグマ社、ラビット　マス
ク／ｌ／　（Ｒａ’ｂ’ｂｉｔ　Ｍｕｓｃｌｅ）　）を
添加したプール血清（ＧＯＴ　：　２５に−Ｅｌｆ　、
ＬＤＨ：　７５０Ｗ−１ｌｒ及びＧＯＴ　：　９０に−
Ｕ　、　ｂＤＴｌ：　７３０Ｗ−Ｕ　）に更にそれぞれ
乳酸リチウムを０．１０．２０．５０η／（１／添加し
た各プール血清を１０ｐｌ展開層上に滴下した後、５７
℃でインキュベーションし、滴下後、７分後及び１１分
後の反射鑓度を反射分光光度計で５４６ｎｍのフィルタ
ーを通して測定し、この反射濃度の差を求め、表−２の
結果を得た。

表−２の結果から明らかなように、乳酸脱水素酵素阻害
剤を含有しない比較分析素子−１では、ＬＤＨ及び乳酸
の影響が大きいのに対して、Ｉ＋Ｄ１１１阻害剤（シュ
ウ酸又はその塩、オキサミン酸塩）を含有させた本発明
の分析素子−１〜５では、その影響をほとんど受けず、
分析の正確度が向上しているととが判る。

実施例−２（ＧＰＴ用分析素子） 膜厚１８０μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層（Ｒ−１−２） ゼラチン　　　　　　　　　　　２１．Ｏｙ／ｌｐ？グ
ルタミン酸脱水素酸素水素酵素　１，０００　α７ｓ”
ジアホラーゼ　　　　　　　　　２，１００　Ｕ／ｌ１
５　、５１−　（４、４１−ビフェニレン）−ビス（２
，５−ジフェニルテトラゾリ ウムクロリド）　　　　　　　　　１．０　ｔ／ｌｐ？
ト　リ　ト　ン　！−１００２−１ｔ／γ同一１．２−
ビス（ヒニルスルホニル）工Ｉ’７　　α１ｓ　ｙ／ｌ
ｙ？上記第１の試薬層上に、更に下表の第２の試薬層及
び展開層を順次設け、表−３に示す本発明の分析素子４
〜６及び比較分析素子−２を作成した。

第２の試薬層（Ｒ−２） そ上記第２の試薬層は、溶媒としてｎ−ブタノールを用
いて、サンドグラインダー直接分散により塗設。

展開層（Ｓ） 簀キシレン溶媒にて塗設 簀アラニン、ＮＡＤ＋　及びオキサミン酸カリウムは別
途に溶媒としてキシレンを用い、サンドグラインダーに
よシ直接分散して添加。

畳α−ケトグルタル酸及びシュウ酸・２Ｈ！０はメタノ
ールに溶解後、添加。

表−３ 上記本発明の分析素子４〜６及び比較分析素子−２に対
して、透析処理したプール血清（ＧＰＴ：２０に一１１
Ｔ　、　ＬＤＨ：　２５０Ｗ−Ｕ　）、ＧＰＴ　（シグ
マ社、ボーシン　ハート）を添加したプール血清（ＧＰ
Ｔ：８０　Ｋ−Ｕ　、　ＬＩ）Ｈ：　２５０Ｗ−Ｕ　）
及び上記各々のプール血清ＫＬＤＨ（シグマ社、ラビッ
ト　マスクル）を添加したプール血清（ＧＰＴ　：　２
０に−Ｕ　、　ＬＤＨニア３０Ｗ−σ及びＧＰＴ　：　
８０に−Ｕ　、　ＩＩＤＨ：　７５０Ｗ−Ｉ？　）に更
にそれぞれ乳酸リチウムを０．１０．２０．３ａｍｇ／
ｄ＆　　添加した各プール血清を１０μ！展開層上に滴
下した後５７℃でインキュベーションし、滴下後、７分
後及び１１分後の反射濃度を反射分光光度計で５４６ｎ
ｍのフィルターを通して測定し、この反射濃度の差を求
め、表−４の結果を得た。

表−４の結果から明らかなように、乳酸脱水素酵素阻害
剤を含有しない比較分析素子−２では、ＩＪＤ′Ｈ及び
乳酸の影響が大きいのに対して、乳酸脱水素酵素阻害剤
（シュウ酸又はその塩、オキサミン酸塩）を含有させた
本発明の分析素子−４〜６では、その影響をほとんど受
けず、分析の正確度が向上していることが判る。

実施例−５（ＴＧ用分析素子） 膜厚１８０μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層（Ｒ−１−５） ゼラチン　　　　　　　　　　　　２１．０　ｔ／ｌｒ
？グリセロール脱水素酵素　　　　へ０００Ｕ／ｇ”ジ
アホラーゼ　　　　　　　　　２，０００８７ｍ”５　
、５１−　（４、４１−ビフェニレン）−ビス（２，５
−ジフェニルテトラゾリウ ムク　ロ　リ　トつ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．８　　も４ｚト　リ　ト　ン　Ｘ　　−１
００２−１ｔ／ｌｙ？１．２−ビス（ビニルスルホニル
）エタン　　α１５？／−上記第１の試薬層上に、更に
下表の第２の試薬層及び展開層を順次設け、表−５に示
す本発明の分析素子−７〜９及び比較分析素子−３を作
成した。

第２の試薬層（Ｒ−２） 釜上記第２の試薬層は、溶媒としてｎ−ブタノールを用
いて、サンドグラインダー直接分散によシ塗設。

展開層（Ｓ） 肴キシレン溶媒にて塗設 ！）　ＮＡＤ＋及びピルビン酸リチウムは別途に溶媒と
してキシレンを用い、サンドグラインダーによシ直接分
散して添加。

そシュウ酸・２Ｅ［２０はメタノールに溶解後、添加。

餐リポプロティンリパーゼは、牛血清アルブミンと共に
溶解し均一にかくはん後凍結乾燥を行い、リボプロティ
ンリパーゼ／牛血清アルブミンの凍結乾燥粉末を調製し
、２００メツシユふるいでふるったものを使用。

表−５ 上記本発明の分析素子−７〜９及び比較分析素子−５に
対して、透析処理したプール血清（ＴＧ　：　１２５　
ｍ９／ｄｔ　、　ＬＤＨ：　２５０Ｗ−Ｕ　）及びＬＤ
ＩＩ！（７グマ社、ラビット　マスクル）を添加したプ
ール血清（ＴＧ　：　１２５　ｍ９／６１．　ＬＤＨ：
　７５０Ｗ−Ｕ　）に更にそれぞれ乳酸リチウムをＯｌ
ｌ　０．２０．５０１Ｆ＋９／ｄ／添加した各プール血
清を１０μｌ展開層上に滴下し、３７℃で７分間インキ
ュベーションした後の反射濃度を反射分光光度計で５ａ
６ｎｍのフィルターを通して測定し、表−６の結果を得
た。

表−６の結果から明らかなように１乳酸脱水素酵素阻害
剤を含有しない比較分析素子−３では、ｌ１ＤＨ及び乳
酸の影響が大きいのに対して、ＩＪＤＨ阻害剤（ピルビ
ン酸リチウム、シュウ酸）を含有させた本発明の分析素
子−７〜？では、その影響をほとんど受けず、分析の正
確度が向上していることが判る。

なお、リビツドセーラム−Ｉと−■〔栄研化学■製〕よ
シ調製した１００．２００．５００　ｍｑ／ｄｔのトリ
グリセリド標準血清を、本発明の分析素子−７〜９及び
比較分析素子−３に対して前記と同様に１０μｌ展開層
上に滴下し、３７℃で７分間インキュベーションした後
の反射濃度を反射分光光度計で５４６ｎｍのフィルター
を通して測定した結果、これら分析素子間に識別能の差
は認められなかった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の分析素子は、ＬＤ
Ｅ及び乳酸の影響のない正確な分析を可能にした点で顕
著な効果を奏するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に、第１の試
   薬層、第２の試薬層及びその上方に多孔性展開層を有し
   、電子伝達剤、色素形成前駆物質、酸化型補酵素、緩衝
   剤及び流体試料中の特定成分を介して前記酸化型補酵素
   を還元型補酵素に変換し得る試薬を含有する、前記流体
   試料中の特定成分を分析するための分析素子において、
   前記酸化型補酵素を前記多孔性展開層に含有し、かつ乳
   酸脱水素酵素阻害剤を前記第２の試薬層及び／又は前記
   多孔性展開層に含有していることを特徴とする分析素子
   。 ２、前記の色素形成前駆物質を第１の試薬層に、前記の
   緩衝剤を第２の試薬層に含有している特許請求の範囲第
   １項記載の分析素子。 ３、前記酸化型補酵素が酸化型ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドである特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の分析素子。 ４、前記乳酸脱水素酵素阻害剤がシユウ酸及びその塩、
   ピルビン酸及びその塩、マロン酸及びその塩、オキサミ
   ン酸及びその塩、タルトロン酸及びその塩、エチレンジ
   アミン四酢酸及びその塩、ヨードアセトアミド、２，４
   −ジニトロフルオロベンゼン、ｐ−クロロ安息香酸第二
   水銀、沃化物、銀塩及び第二水銀塩から成る群から選ば
   れる少なくとも１種である特許請求の範囲第１項〜第３
   項のいずれか１項に記載の分析素子。