JPS6371199A - グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ−ゼ検出用分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は分析素子、特に流体試料中の特定成分を分析す
る分析素子（関し、更に詳しくは、生物学的流体試料中
のグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯ
Ｔ）′ｔ−還元型補酵素を介して分析するための乾式の
分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中のＧＯＴを分析するための乾式の分
析素子は糧々の横取のものが知られている。それらの中
でグルタミン酸脱水素酵素（Ｇ／ＤＨ）　　と酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＨＡＤ　）　　
又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ　）　［以下、いずれか一方を意味すると
きＭＡＤ（Ｐ）　　と示す〕の関与の下に生成する還元
型補酵素ＬＮＸＰ）：）を電子伝達剤を介して色素形成
前駆物質に伝えて色素を形成させる下記反応系を利用す
るＧＯτ検出用分析素子は、例えば特開昭５９−８８０
９７号、同５９−９１８９６号各公報及び特願昭６０−
１０４７７６号明細書に詳述されている。

００丁 （！）　　アスパラギン酸中α−ケトグルタル酸−一−
→オキザロ酢酸中グルタミン酸 Ｇ／ＤＩ （２）　　グルタミン酸中ＮＡＤ（Ｐ）　　−一→α−
ケトグＮＡｆｌ（Ｐ）”十色素 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、これら各明細書に記載の分析素子は、生
物学的流体試料中のグルタミン酸ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（ＧＰＴ）とＬ−アラニン及び分析素子に含有
されているａ−ケトグルタル酸が、 ＧＰＴ （４）Ｌ−アラニン＋α−ケトグルタル酸−−ビルピン
酸＋グルタミン酸 の反応によタグルタミン酸を生成し、生成し九グルタミ
ン酸は、反応＋２１、＋３１により色素を生成し、その
結果、ＧＯＴの分析に正誤差を生じるという欠点を有し
ている。

本発明の目的は、Ｇ／ＤＨとＨＡＤ（Ｐ）十の関与の下
に生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子伝達剤を介して色素形
成前駆物質に伝えて色素を形成させる反応系を利用する
００丁検出用分析素子において、生物学的流体試料中の
ＧＰＴ及びＬ−アラニンに由来する誤差を除き、分析の
正確度が改良された分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あって、光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に第１の
試薬層、第２の試薬層及びその上方に多孔性展開層を有
し、電子伝達剤、色素形成前駆物質、酸化型補酵素、緩
衝剤、基質及びＧｌ！ＯＨｔ？金含有る、生物学的流体
試料中のＧＯＴを分析するための分析素子において、前
記酸化型補酵素を前記多孔性展開層に含有し、かつＧＰ
で阻害剤を前記第２の試薬層及び／又は前記多孔性展開
層に含有していることを特徴とする。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明に係る電子伝達剤は、前記流体試料中のＧＯＴが
介在して、本発明に係る試薬の少なくとも１種と酸化型
補酵素が反応して生成する還元型補酵素の存在下で還元
され、更に還元された該電子伝達剤は色素形成前駆物質
を還元し、可視部に吸収を有する色素を形成させるもの
である。

本発明に係る基質としては、アスパラギン酸又はその塩
、及びα−ケトグルタル酸又はその塩を用いるのが好ツ
しい。

これらの基質を本発明の分析素子に含有させる量は、ア
スパラギン酸の場合には、通常０．１１７ｍ２〜２　ａ
　ｉ／ｒｒｒ２、好ましくは０．５〜１ｏＦ／ｒｎ２で
あり、α−ケトグルタル酸の場合には、ｏ、ｏ　１１　
／　ｔｎ２〜１０９／ｌ１１２、好ましくは０．０５〜
５Ｉ／ｌ１１２である。

本発明に係るｔＪ／ＤＨは、高等植物由来のＫＯ１Ｌ４
．１．２、哺乳類由来のｇｃ、１．４．１．３及び酵素
又は大腸菌由来の［ｔ、Ｌ４．ＬＡ　　のいずれも用い
ることができるが、哺乳類由来のＥＣ，１，４，１，３
を用いることが好ましい。本発明の分析素子に含有させ
る量は、Ｇ／ＤＨの由来、及び活性値の測定方法に応じ
て異なる。ＫＯ，１，４゜１．３ｔ−用いる場合、通常
１．ＯＱ　ＯＵ　／　ｒａ２〜５００，０ＯＯＵ／ｍミ
好ましくＪｐｉｓ、ｏｏｏ〜２００，０００　Ｕ／ｍ２
である。

本発明に係る酸化型補酵素とは、！ＪＡＤ　　及びＮＡ
ＤＰ＋等をいう。用いるＧ／ＤＨの由来により、用いる
酸化型補酵素は異なる。Ｇ／ＤＨがＥＣ，１，４，１，
２の場合、ＮＡＤ　　のみ、Ｅ（ｊ、１．４．１ｊの場
合、ＮＡＤ＋又はＮ　ＡＤＰ”、ＥＣ，１，４，１，４
の場合、ＮＡＤＰ＋　のみが用いられる。また、ＮＡＤ
（Ｐ）＋は、本発明の分析素子の多孔性展開層に含有さ
せることにより、ＧＯＴの分析感度を向上することがで
きる。

本発明に用いられる電子伝達剤としては、Ｎ−メチルフ
エナジン・メトサルフェート類（例えばＮ−メチル７エ
ナジン・メトサルフェート、１−メトキシ−Ｎ−メチル
フェナジンメトサルフェート等）、メルトラブル−、メ
チレンブルー及びジアホラーゼなどを使用することがで
き、好ましい電子伝達剤としては、Ｎ−メチルフェナジ
ンメトサルフェート類及びジアホラーゼを挙げることが
できる。

一方、本発明に係る色素形成前駆物質としては、テトラ
ゾリウム塩類が通常用いられる。本発明において用いら
れる上記テトラゾリウム塩類は、色素形成後はほとんど
が水に対して難溶ないしは不活性になり、通常ウェット
・ケミストリー法では使用が難しいものの、形成される
色素が耐拡散性であり、不所望のリンギングを防止し、
測定の定量性を向上させる点で、好ましく使用すること
ができる。

本発明において有用とされる上記テトラゾリウム塩とし
ては、例えば３．３’　−（３，３’−ジメトキシ−４
，４′−ビフェニレン）−ビスＣｚ−（ｐ−ニトロフェ
ニル）−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕、３．
３’　−（３，！！−ジメトキシー４．４′−ビフェニ
レン）−ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロ
リド）、３−（４’ダージメチル−２−チアゾリル）　
−２，４−ジフェニルテトラゾリウムプロミド、３−（
ｐ−ヨードフェニル）−２−（Ｅ）−二トロフェニル）
−５−フェニル−テトラゾリウムクロリド、２．２’。

５、ダーテトラー（ｐ−ニトロフェニル）　−３，３’
−（５，♂−ジメトキシー４．４′−ビフェニレン）−
ジテトラゾリウムクロリド、２．！Ｓ、５−　）ジフェ
ニルテトラゾリウムクロリド、ｓ、ｓ’　−（ｓ、ｓ’
−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス−〔２
，５−ビス（ｐ−ニトロフェニル）テトラソリウムクロ
リド〕及び５．５’　−（４，４’−ビフェニレン）−
ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド〕等
を挙げることができる。

上記テトラゾリウム塩の中で好ましく用いられるものと
しては、５．５’　−（５，３’−ジメトキシ−４，４
’−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−二トロフェニル
）−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕及び３．５
’　−（４，４’−ビフェニレン）−ビス〔２，５−ジ
フェニルテトラゾリウムクロリド〕を挙げることができ
、本発明に係る第１の試薬層に含有させることが好まし
い。

本発明に用いられる緩衝剤としては、前記反応における
至適…によって適宜選択される。例えば、トリス緩衝剤
（トリスヒドロキシメチルアミノメタン及び塩酸トリス
ヒドロキシメチルアミノメタンの組合せとして知られる
もの）、グツドの緩衝剤として知られるもの、炭酸塩緩
衝剤等を用いることが好ましい。

上記緩衝剤は、前述の色素形成前駆物質と別異の層に含
有することが好ましい＠これらは１製造時及び試料適用
時に混合されない状態で、積層されていることはいうま
でもない。この之めに、上記緩衝剤がバインダー中に分
散されていることが好ましく、本発明に係る第２の試薬
層に含有させることが好ましい。

本発明に係るＧＰＴ阻害剤とは、ＧＰＴの酵素活性を阻
害する物質をいい、その効果を有する物質であれば限定
されるものではなく、倒えばカルボニル化合物（ピルビ
ン酸及びその塩、アミノオキシ酢酸及びその塩、ギ酸及
びその塩、アミノアジピン酸及びその塩、アミノオキザ
ロ酢酸及びその塩など）、スルフヒドリル化合物（例え
ばＬ−システィンなど）、Ｌ−シクロセリンなどを使用
することができる。好ましいＧＰＴ阻害剤としては、ピ
ルビン酸及びその塩、アミノオキシ酢酸及びその塩を挙
げることができる。

上記ＧＰＴ阻害剤は、本発明に係る第２の試薬層及び／
又は多孔會展開層に含有させることにより本発明の効果
は特に大きくなる。

本発明に係る第１の試薬層及び第２の試薬層を構成する
バインダーの特性は重要である。第２の試薬層のバイン
ダーは第１の試薬層のバインダーに対して不溶性金示す
溶媒により積層されることが望ましい。すなわち、第２
の試薬層のバインダーの溶媒が第１の試薬層のパインダ
−全溶解させないものであるバインダーの組合せが好ま
しい。例えば、第１の試薬層のバインダーは水溶性ポリ
マーであシ、第２の試薬層のバインダーは親水性且つ有
機溶媒可溶性のポリマーの組合せが好ましい。

本発明に係る第１の試薬層を形成する九めのバインダー
としてはゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘導
体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース誘導体、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタク
リルアミド、ポリ（−１：）又はジアルキル置換）アク
リルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）メタクリ
ルアミド及びこれらの水溶性共重合体等が挙げられる。

好ましくは、ゼラチン及びその誘導体が用いられる。

本発明のＷＪ２の試薬層を形成する友めのバインダーと
しては、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン＼ポリ（Ｎ−ビニ
ルイミダゾール）、ポリ（Ｎ−ビニル）　ＩＪアゾール
）及びこれらの誘導体又はそれらの共重合体、エチルセ
ルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、特
願昭６゜−１０４７７６号明ｌａｖに記載の共重合体等
が挙げられる。これらの重合体は主としてアルコール類
、例えばエタノール、プロパツール、ブタノール等に溶
解し且つ親水性の高分子物質である。好ましくは特願昭
６０−１０４７７６号明細書に記載の共重合体が用いら
れる。

本発明に係る電子伝達剤及び他の種々の試薬は、第１の
試薬層、第２の試薬層及び多孔性展開層のいずれに含有
させてもよい。

本発８ＡＫ用いられる電子伝達剤を本発明の分析素子に
含有させる量は、ジアホラーゼ以外の電子伝達剤の場合
、通常は１〜／　ｍ２〜ｔ　＆／ｍ２、好ましくは１０
〜５００Ｉｎ９／ｍ２である。

更に、ジアホラーゼを電子伝達剤として用いる場合、ジ
アホラーゼの由来及び活性値の測定法に応じて変わる。

通常は１００Ｕ／ｍ２〜１００　ｌＯ００Ｕ　／　ｒｒ
ｒ　ｚ好ましくは５００〜５０．０００　Ｕ／　ｍｉ金
含有せることができる。

ま念、本発明に係る色素形成前駆物質を本発明の分析素
子に含有させる量は、通常は１０〜／　ｌｌＩ２〜１０
　Ｊｉ　／　ｒｒｒ２、好ましくはｓｏｍｇ／ｍ２〜３
　ｌ　／　ｍ２である。更に、本発明に係る酸化型補酵
素を本発明の分析素子に含有させる奇は、通を次、本発
明に係るＧＰτ阻害剤を本発明のる。

本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の光透過性
支持体（以下、本発明に係る支持体と略す）は、液体不
浸透性で、かつ光透過性であればその種類を問わないが
、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレ７タレート
、ポリカーボネート又はポリスチレンのような種々の重
合体材料がこの使用目的に適する。更には上記重合体材
料のみならず、ガラスのごとき無機材料も同様に用いる
ことが可能である。本発明に係る支持体の厚さは任意で
あるが、好ましくは５０〜２５０μｍ　である。ま次、
本発明に係る支持体の観測側の一側面は、その目的に応
じて任意に加工することが可能である。更に試薬層を積
層する側の支持体面に、場合によっては光透過性の下塗
り層を使用して試薬と支持体との接着性を改良′するこ
とができる。

本発明に係る多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試
料を単位面積当シ試薬層に均一に配布する機能を有する
ものである。その上、更に、特公昭５３−２１６７７号
公報に記載された性能、すなわち（２）流体試料中の分
析反応を阻害する物質又は要因を除去する機能及び／又
は（３１分光光度分析を行うときに支持体を経て透過す
る測定光を反射するバンクグランド作用を行う機能を有
するものであれば好ましい。したがって、本発明に係る
多孔性展開層は、上記（ＩＩの機能のみを有する層、（
１；に加えて（２）及び／又はｆ３１の機能を併せて有
する層のいずれかとすることができ、あるいは（１１を
包含する複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層
を使用することも可能である。更に（１１、（２＋及び
（３）の機能のうち、２つの機能を有する層と、残９の
１つの機能を有する層を組合せて使用することもできる
。例えば、前述の特公昭５５−２１６７７号公報に記載
された二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るプラ
ッシュポリマーと呼称される非繊維多孔質ハ 昭５７−９４６５８号、同５７−１２５８４７号、同５
７−１９７４６６号及び同５８−７０１６１号等の各明
細書に記載された繊維構造展開層、特開昭５８−９０１
６７号明細書に記載された粒子結合体構造展開層が挙げ
られる。特に、上記繊維構造展開層及び粒子結合体構造
展開層は、血球部分も速やかに移送することが可能な素
材として特に有用である。本発明の分析素子における展
開層の膜厚は、その空隙率によって決定されるべきであ
るが、好ましくは約１００〜５００μｍ１更に好ましく
は約１５０〜３５０μｍである。ま九、空隙率は好まし
くは約２０〜８５％である。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することがで
きる。

特に界面活性剤は、流体試料を本発明の素子に適用した
際の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
またはカチオン性）、非イオン性を問わず使用すること
が可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。

非イオン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−ジ
−ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、り−
オクチルフエノキシポリエチレングリコール、ｐ−イン
ノニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル
置換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高
級脂肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが挙
げられる。

これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透速度を
調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラフィー現
象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重量に対して２５重量％〜ｏ、ｏ
　ｏ　ｓ重量％、好ましくは１５〜０．０５重量％用い
ることができる。

本発明の分析素子は必要に応じて、例えば米国特許第３
，９９２，１５８号明細書記載の反射層、下塗シ層、米
国特許第４，０４２，３３５号明細書記載の放射線ブロ
ッキング層、米国特許第４．０６６，４０３号明細書記
載のバリヤ一層、米国特許第４，１６６，０９３号明Ｉ
ＩＢＩＦ記載のマイグレーション阻止層、特開昭５５−
９０８５９号明細書記載のスカベンジャ一層、および米
国特許第４，１１０，０７９号明細書記載の破壊性ポン
ド状部材等を任意に組み合せて本発明の目的に合せた任
意の構成とすることができる。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を適宜
選択して用い、順次積層することで任意の厚みの層を塗
設することができる。

本発明の分析素子を用いて、流体試料中のＧｏ〒の活性
を、本発明に係る支持体側から反射スペクトロホトメト
リーにょシ初速度法に従って測定することができる。こ
のようにして得られ比測定値は、予め作成しておい次検
量線に当てはめることでＧＯＴＯ活性を決定することが
できる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５μｌから約５０μ
ｌであシ、更に好ましくは５μｌから２０μｌである。

通常１０μｌ　の流体試料を適用するのが好ましい。

本発明の分析素子は全血液、血清及び血漿のいずれの分
析にも不都合なく用いることができる。更には尿、リン
パ液、髄液等の他の体液も不都合なく用いられる。全血
液を用いる場合には、必要に応じて検出のための放射線
が血球により妨害全受けるのを避けるために、前述の放
射線ブロッキング層又は他の反射層を設けることができ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例−１ 腹厚１８０μｍ　の透明な下引済ポリエチレンテレフタ
レート支持体上に下記組成の第１の試薬層を設けた。

第１の試薬層（ａ−１−ｔ） ゼラチン　　　　　　　　　　　　２　ｔ　０１１／ｒ
ａ　２グルタミン酸脱水素酵素　　　　　　　　４２，
０００　Ｕ／ａ２ジアホラーゼ　　　　　　　　　２．
１０００７ｍ　２３．３’−（４，ａ’−ビフェニレン
）−ビス（２，５−ジフェニルテトラゾリウム クロリド）　　　　　　　　　　　　　　　　　ｔｏシ
４２トリトンＸ−１０ｏ［ローム　アンド ハース（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）社］　　　　　　　
２．１＃／ｍ２１．２−ビス（ビニルスルホニル） エタン　　　　　　　　　　　　　　　　　ｒｌ、１５
みへ２上記第１の試薬層上に、更に下表の第２の試薬層
及び展開層を順次設け１１表−１に示す本発明の分析素
子１〜３及び比較分析素子−１を作成した。　　゛ 養１）　ＢＡＢＦ社の商品名 Ｎ−ビニルピロリドン−酢敢ビニル共重合体　　　　　
　　　（モル比２０：８０）肴　上記第２の試薬層は、
溶媒としてｎ−ブタノールを用いて、サンドグラインダ
ー直接分散によシ塗設。

簀キシレン溶媒にて塗設 脣アスパラギン酸−ナトリウム、ＮＡＤ＋　及びビ、　
ルピン酸ナトリウムは別途に溶媒としてキシレンを用い
、サンドグラインダーによυ直接分散して添加。

肴α−ケトグルタル酸はメタノールに溶解後、添加。

表−１ 上記本発明の分析素子１〜３及び比較分析素子−１に対
して、透析処理したプール血清に、ＧＯＴ（シグマ社、
ボーシン　ハート（ｐｏｒｃｌｎａＨｅａｒｔ）］及び
ＧＰＴ（シグマ社、ボーシン　ハート）を添加したプー
ル血清（ＧＯＴ３０に−Ｕ及びｃＰＴｔＬＩＯＫ−Ｕ、
ＧＯＴｌｏ（！に−Ｕ及びＧＰＴｌｏｏに−ＵＸＧＯＴ
３０に−Ｕ及びＧＰＴ’！１００Ｋ−Ｕ、ＧＯＴ１００
に−Ｕ及びＣＰ？３００に−Ｕ）に、更にそれぞれら−
アラニン全、０．１０，２０■／ｄｔ　　添加し之各プ
ール血清を１０μｌ　展開層上に滴下した後、５７Ｃで
インキュベーションし、滴下後、７分後及び１１分後の
反射濃度を反射分光光度計で５４１．　ｎｍ　　のフィ
ルターを通して測定し、この反射濃度の差を求め、表−
２の結果を得た表−２の結果から明らかなように、ＧＰ
Ｔ阻害剤？含有しない比較分析素子−１では、ＧＰＴ及
びＬ−アラニンの影響が大きいのに対して、ＧＰＴ阻害
剤（ピルビン酸ナトリウム、アミノオキシ酢酸）を含有
させた本発明の分析素子−１〜３ではその影響をほとん
ど受けず、分析の正確度が向上していることが判る。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明し友ように、本発明の分析素子は、ＧＰ
Ｔ及びＬ−アラニンの影響のない、正確度の優れたＧＯ
’ｒ検出用分析素子である点で、顕著な効果を奏するも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に第１の試薬
   層、第２の試薬層及びその上方に多孔性展開層を有し、
   電子伝達剤、色素形成前駆物質、酸化型補酵素、緩衝剤
   、基質及びグルタミン酸脱水素酵素を含有する、生物学
   的流体試料中のグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミ
   ナーゼを分析するための分析素子において、前記酸化型
   補酵素を前記多孔性展開層に含有し、かつグルタミン酸
   ピルビン酸トランスアミナーゼ阻害剤を前記第２の試薬
   層及び／又は前記多孔性展開層に含有していることを特
   徴とする分析素子。 ２、前記色素形成前駆物質を第１の試薬層に、前記緩衝
   剤を第２の試薬層に含有している特許請求の範囲第１項
   記載の分析素子。 ３、前記酸化型補酵素が、酸化型ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチド又は酸水型ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドリン酸である特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の分析素子。