JPS61262660A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は分析素子、特に流体中の特定成分を分析する分
析素子に関し、更に詳しくは、生物学的流体試料中の特
定成分を還元型補酵素を介して分析する乾式の分析素子
に関する。

［発明の背景］ 従来、流体試料中の特定成分を分析する方法は多数開発
がなされてきたが、これらは大別して、溶液内で反応が
行なわれる反応系と、固相担体内で行なわれる反応系と
の２種類に分けることができる。溶液系に６ける分析反
応（以下、ウェット・ケミストリーという。）は、用手
法と呼ばれる全く機械を用いない方法から、自動分析機
器まで幅広く知られている。特に臨床化学の分野ではそ
の進歩が著しく、近年榎々の臨床検査用自動定量分析機
器が病院の臨床検査室などに導入されている。

しかしながら、上述の方法は基本的には水溶液の形で反
応を行なわしむるために、種々の欠点を有している。即
ち、その分析過程で大量の水、特に精製された純水ある
いはｉＶＢ水を必要とすることからエネルギー消費の増
大を招く。また、種々の自動分析機器はそれ自体著しく
高価であり、かつその操作に多大の熟練を必要とし、実
大な時間と労力を必要とするばかりでなく、その廃液は
必然的に環境汚染を引き起こすという欠点を有している
。

これに対して固相系における分析反応（以下、ドライ・
ケミストリーという。）を用いる分析方法も広範に用い
られているが、これらは濾紙等に試薬を含浸させた形で
行なわれる。

上記の濾紙は、例えば米国特許第３，０５０，３７３号
あるいは同３，０６１，５２３号各明細書等に記載され
ているように濾紙の如き吸水性繊維質担体に試薬溶液を
含浸させ、乾燥させて作られるものである。

これらは一般に分析試験紙または単に試験片と呼ばれる
もので、試験片に流体試料を滴下するか、または流体試
料中へ試験片を浸漬させ、試験片の色変化または濃度変
化を肉眼判定か、または反射濃度計により測定し、流体
試料中の特定成分の濃度レベルを決定するものである。

これらの試験片は、その取り扱いが簡便であり、かつ直
ちに結果が得られるので有用ではあるが、その構成上か
ら半定量または定性分析の領域にとどまっている。

一方、上述の如き従来の分析方法に対して操作性の簡便
なドライ・ケミストリーを用い、その上高い定量性を有
する多層分析素子が知られている。

例えば、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１６
４３５６号、同５７−１２５８４７号、特願昭５６−６
５４４６号ならびに同５６−１８９７８４号等に多層分
析素子が記載されている。

これらに記載の素子によれば、分析反応に用いられる一
切の試薬類を一枚の分析素子中に含有しており、血清ま
たは全血液を一定容量上記素子上に滴下し、一定温度で
一定時間保温した後、支持体側から反射濃度の測定を行
ない、この反射濃度から物質濃度を決定することが可能
である。

上記方法は、従来の試験紙型のものに対して飛躍的な分
析精度を有し、かつ予め試薬を調製することなくウェッ
ト・ケミストリーと同等以上の性能を有するものである
。

特に、還元型補酵素、即ち還元型ニコチンアミド７デニ
ンジヌクレオチドあるいは還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸の増加または減少によって流体
試料中の成分を測定する方法は、その適用範囲が広く有
用な方法であることが知られている。

これら還元型補酵素はウェット・ケミストリーにおいて
は応用されており、試料中の特定成分を一定の所望の反
応経路を介在せしめた後、上記の還元型補酵素の減少反
応に導き還元型補酵素の紫外部領域を初速変法により測
定することで検出する方法、あるいは還元型補酵素の変
化を電子伝達剤を介して色素形成性前駆物質に伝えるこ
とで、色素を形成せしめ、この色素の濃度を比色法によ
り定量する方法が知られている。

前者の方法は、ウェット・ケミストリーにおいては一般
的に用いられている方法であるが、前述のドライ・ケミ
ストリーの分析素子に導入するためにはいくつかの致命
的な問題点がある。即ち測定対象物とされる還元型補酵
素の変化は、３４０ｎｉの紫外部の吸収を測定する必要
があり、かつその分子吸光係数は著しく小さいものであ
ることが知られている。それ故、紫外部の微小な吸光度
の変化を測定する必要があり、また分析素子の構造上、
反射測光を行なわねばならないために、より高度な測定
機器を必要とし、著しく高価な測定機器を用いなければ
ならない。更に紫外部を測定するために、全ての素材に
ついて３４Ｏｎｍ付近に吸収を有しないものを用いなけ
ればならないという困難さを伴う。

後者の方法は、電子伝達剤を介して色素を形成させ、こ
れを可視部において比色法により定量できるため、前者
の方法に比べてはるかに有利であるばかりでなく、初速
変法、反応終点法の両方を用いることが可能であるため
極めて有利である。

この様に有利な面を有しながら、後者の方法はウェット
・ケミストリーにおいては多用されなかった。というの
は、前述の電子伝達剤および色素形成前駆体は、両者が
溶液系内で共存するとこれらの安定性が非常に低下し、
不所望の色素の形成を誘発するという重大な欠点を有す
るだけでなく、両者の混合時における精度の低下や、色
素形成前駆体から誘導される色素が水に不溶性である場
合が多く、色素が水溶液中で沈澱を起こし、この沈澱に
基づく精度の低下、再現性の劣化等が問題となる。

従って、後者の方法を単に多層分析素子に適用した場合
、本来多層分析素子自体が有している有用性を発揮でき
ないばかりか、更に試薬の安定性および測定精度等の点
で充分に満足し得るものではないことは明白である。

このため、多層分析素子の有用性を維持しつつ、かつ上
記後者の方法を適用した分析素子が特開昭５９−４４６
５８号公報に提案されている。

しかしながら、同上公報に開示されている分析素子は保
存安定性及び発色領域内での呈色均一性が十分とはいい
がたい。

［発明の目的］ 従って、本発明の目的は、試薬の安定性および測定精度
に優れ、生物学的流体試料中の特定成分を還元型補酵素
を介して簡便に分析するための分析素子を提供すること
にある。

［発明の構成］ 即ち本発明の上記目的は、光透過性かつ液体不浸透性の
支持体上に第１の試薬層、第２の試薬層及び多孔性展開
層から成り、電子伝達剤、少なくとも一種の色素形成前
駆物質、少なくとも一種の酸化型補酵素、少なくとも一
種の緩衝剤及び前記特定成分を介して、前記酸化型補酵
素を還元型補酵素に変換し得る少なくとも一種の試薬を
含有し、かつ前記緩衝剤と色素形成前駆物質を異なる層
に配置した液体試料中の特定成分を分析するための分析
素子において、上記緩衝剤を含有する層が下記一般式（
Ｉ）および（ＩＩ）から選ばれる少なくとも１つのバイ
ンダーを用いる事によって達成される。

一般式（Ｉ＞ １式中、Ｒ６はメチル基又はエチル基を表わし、Ｘは２
０から９５モルパーセント、ｙは５から８０モルパーセ
ントを示す。コ 一般式（ｎ） ［式中、Ｒユは水素原子又はメチル基を表わし、Ｘはフ
ェニル基、シアノ基又は−Ｇ　ＯＯＲ３基を表わし、Ｒ
３はメチル基、エチル基又はブチル基を表わす。Ｘは５
０から９５モルパーセント、ｙは５０から５モルパーセ
ントを示す。］［発明の具体的構成］ 本発明に係る電子伝達剤は、生物学的流体試料中の特定
成分が介在して、本発明に係る試薬の少なくとも１種と
酸化型補酵素が反応して生成する還元型補酵素の存在下
で還元され、更に還元された該電子伝達剤は、色素形成
性前駆物質を還元し、可視部に吸収を有する色素を形成
せしめるものである。

本発明において測定し得る流体試料中の特定成分として
は、例えば乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン
酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、アミラー
ゼ（ＡＭＹ＞、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）　
、およびトリグリセリド（ＴＧ）等が挙げられる。

本発明に係る試薬には、酵素、色素形成性前駆物質、緩
衝剤、補酵素、必要に応じて基質が包含される。

これらの試薬は、測定すべき生物学的流体試料中の特定
成分によって適宜選ばれ、例えばＬＤＨを測定する場合
は乳酸、ＧＯＴの場合はアスパラギン酸、α−ケトグル
タル酸およびグルタミン酸脱水素酵素（ＧＩＤＨ）、Ｇ
ＰＴの場合はアラニン、α−ケトグルタル酸およびグル
タミン酸脱水素酵素（ＧＩＤＨ）、ＡＭＹの場合はマル
トペントース、オルトリン酸、β−ホスフォグルコムタ
ーゼ（β−ＰＧＭ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ
）およびマルトースホスフォリラーゼ（ＭＰ）、ＣＰＫ
の場合はクレアチン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ＞、
ヘキソキナーゼ（ＨＫ）およびグルコース−６−リンｌ
！！脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）　、ＴＧの場合はリ
ボプロティンリパーゼ（ＬＰＬ）　、グリセロキナーゼ
（ＧＫ）、グリセロリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）およ
びアデノシン三リンＩｔ（ＡＴＰ）である。

本発明に係る酸化型補酵素とは、酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）、および酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ
す）等をいう。還元型補酵素とは、前記酸化型補酵素の
還元型をいう。ＮＡＤ十の還元型はＮＡＤＨで、ＮＡＤ
Ｐすの還元型はＮＡＤＰＨである。

以下に本発明に係る生物学的流体試料中の特定成分が介
在して、本発明に係る試薬の少なくとも１種と酸化型補
酵素との反応によって、還元型補酵素が生成される反応
式を示す。

オキザロ酢酸十グルタミン酸 ル酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ（Ｐ）Ｈ＋　Ｎ　Ｈ３ＰＴ アラニン＋α−ケトグルタル酸２ピルビン酸＋グルタミ
ン酸 ＡＭＹ −Ｄ−グルコースー１−ホスフェート β−Ｄ−グルコース−１−ホスフェート２６−ホスフォ
グルコン画十　ＮＡＤ（Ｐ）ＨＰＫ ＣＰＫ クレアチン＋ＡＴＰ−→クレアチンリン酸＋ＤＰ １−１に グルコース＋Ａ　Ｔ　Ｐ−＞Ａ　Ｄ　Ｐ＋グルコース−
６−リン酸 グルコース−６−リン酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ”上５四４６
−ホスフォグルコン酸＋ＮＡｔ）ＰＨＧ グリセリン＋ＡＴＰ卯≦グリセリン−１−リンジヒドロ
キシアセトンリン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ本発明に用いられ
る電子伝達剤としては、Ｎ−メチルフェナジン・メトサ
ルフェート類（例えばＮ−メチルフェナジン・メトサル
フェート、１−メトキシ−Ｎ−メチルフェナジンメトサ
ルフェート等）、メルトラブル−、メチレンブルーおよ
びジアホラーゼなどを使用することができ、好ましい電
子伝達剤としては、Ｎ−メチフェナジンメトサルフェー
ト類及びジアホラーゼを挙げることができる。

一方、本発明に係る色素形成性前駆物質としては、テト
ラゾリウム塩類が通常用いられる。本発明において用い
られる上記テトラゾリウム塩類は、色素形成後は殆どが
水に対して難溶ないしは不溶性になり、通常ウェット・
ケミストリー法では使用が難しいものの、形成される色
素が耐拡散性であり、不所望のリンギングを防止し、測
定の定量性を向上せしめる点で、好ましく使用すること
ができる。

本発明において有用とされる上記テトラゾリウム塩とし
ては、例えば３．３’　−（３，３’−ジメトキシ−４
，４′−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェ
ニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド］　（Ｎ
ＢＴ）、３．３’　−（３゜３′−ジメトキシ−４，４
′−ビフェニレン）−ビス［２，５−ジフェニルテトラ
ゾリウムクロリド］　　（ＢＴ）、３−　（４’　　５
’　−ジメチル−トリ７ゾリルー２）−２，４−ジフェ
ニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）　、２−　（Ｄ
−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５
−フェニル−テトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ＞、２゜
２’　、５．５’−テトラ−（Ｄ−ニトロフェニル）−
３，３’　−（３−ジメトキシ−４−ジフェニレン）−
ジテトラゾリウムクロリド（ＴＮ８Ｔ）、２．３．５−
トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴ）および３
．３’　−（４，４’　−ビフェニレン）−ビス［２，
５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド］　（ＮＴ）等
を挙げることができる。

上記テトラゾリウム塩の中で好ましく用いられるものと
しては、３．３′−ジメトキシ−４゜４′−ビフェニレ
ン）−ビス［２−（Ｅ）−ニトロフェニル）−５−フェ
ニルテトラゾリウムクロリド］　　（ＮＢＴ）及び３．
３’　−（４，４’　−ビフェニレン）−ビス［２，５
−ジフェニルテトラゾリウムクロリド］　　（ＮＴ）を
挙げることができる。

本発明に用いられる緩衝剤としては、前記反応における
至適ｐＨによって適宜選択される。例えば、トリス緩衝
剤（トリスヒドロキシメチルアミノメタン及び塩酸トリ
スヒドロキシメチルアミンの組み合わせとして知られる
もの）、グツドの緩衝剤として知られるもの、炭酸塩緩
衝剤、等が好ましく用いられることができる。

上記緩衝剤は、前述の色素形成性前駆物質と別異の層に
含有することが好ましい。これらは、製造時及び試料適
用時に混合されない状態で、積層されていることはいう
までもない。この為に、上記Ｍ’ｔｌ剤がバインダー中
に分散されていることが好ましい。

本発明に係るバインダーとしては、下記一般式で示され
る共重合体を用いることができる。

一般式（Ｉ＞ ｒ式中、Ｒ７はメチル基又はエチル基を表わし、Ｘは２
０から９５モルパーセント、Ｖは５から８０モルパーセ
ントを示す。］ 一般式（■）。

［式中、Ｒ２は水素原子又はメチル基を表わし、Ｘは置
換又は未置換のフェニル基、シアノ基又は−〇　〇　Ｏ
Ｒ３基を表わす。Ｒ３はメチル基、エチル基、ブチル基
を表わし、Ｘは５０から９５モルパーセント、ｙは５０
から５モルパーセントを表わす。

以下に本発明（係る共重合体の代表的な具体例を示すが
、これによって本発明が限定されるものではない。

例示重合体 （１）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比９５　：　５） （２）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比８０　：　２０） （３）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比７０：３０） （４）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比６０　：　４０） （５〉Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比５０　：　５０） （６）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比４０　：　６０） （７）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比３０　：　７０） （８）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比２０：８０） （９）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共重合
体（モル比９５　：　５） （１０）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共重
合体（モル比９０：１０） （１１）　Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共
重合体（モル比７５：２５） （１２）Ｎ−ビニルピロリドン−メタアクリル酸メチル
共重合体（モル比９０：１０） （１３）　Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸−〇−ブ
チル共重合体（モル比９０　：　１０）（１４）Ｎ−ビ
ニルピロリドン−アクリロニトリル共重合体（モル比８
５：１５） （１５）Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（モ
ル比９０：１０） ＜１６）　Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（
モル比７５　：　２５） （１７）　Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（
モル比５０　：　５０） 本発明に係る重合体は、公知の重合法を用いて容易に得
ることができる。

上記本発明の共重合体を前記緩衝剤と組み合わせて層に
することにより、例えば保存安定性を向上させるばかり
でなく、発色領域内の呈色の均一度を向上させ、結果と
して同時再現性の著しい向上をもたらすことができる。

本発明の分析素子に含有される本発明に係る試薬および
酸化型補酵素は、それぞれ少なくしも１種の受容層およ
び少なくとも１層のＩＩＲ層の何れに含有されても良い
。また、電子伝達剤および色素形成前駆物質も、それぞ
れ、少なくとも１層の受容層および少なくとも１層の展
開層のうちの何れの層に含有されても良い。しかし、電
子伝達剤がジアホラーゼ以外の場合には、流体試料が適
用されるまではこれらの電子伝達剤および色素形成性前
駆物質は、不所望の色素を形成することがないように互
いに反応しない状態で含有されていることが必要である
。従って、ジアホラーゼ以外の電子伝達剤および色素形
成性前゛層物質が、少なくとも１層の受容層および少な
くとも１１１の展開層のうちの別異の層に含有されてい
ることが好ましい。あるいは少なくとも１層の受容層お
よび少なくとも１ｍｌの展開層のうちの同一の層に含有
される場合においても、これらの電子伝達剤および色素
形成性前駆物質は、それぞれ別々の粒子として含有され
ていることが好ましい。

但し、電子伝達剤としてジアホラーゼを用いる場合には
この限りではなく、例えばジアホラーゼと色素形成性前
駆物質を同一の層内に含有することが可能である。

電子伝達剤および色素形成性前駆物質が別異の層に含有
され、少なくとも１！１の受容ＪｌｃＨよび少なくとも
１層の１１１８層の何れか゛Ｉｌ１以上に電子伝達剤を
含み、電子伝達剤を含まない層の何れか１層以上に色素
形成性前駆物質を含有する分析素子においては、電子伝
達剤が展開層の何れか１Ｆ！！に含有され、色素形成性
前駆物質が受容層に含有されていても良く、その逆の状
態で含有されていても良いが、好ましくは前者の状態で
ある。この場合、電子伝達剤を含むｍ同層と色素形成性
前駆物質を含む受容層の間にこれらの電子伝達剤および
色素形成性前駆物質を含まない層が介在していることが
、より好ましい。

ジアホラーゼ以外の電子伝達剤を展開層に含有する場合
、一般的に分散又は溶解によって含有することができる
が、電子伝達剤の含有量は極微量の為、分散を用いた場
合十分に均一に展開層中に含有することがむずかしい。

又溶解の場合、製造過程で多層へ移行する可能性があり
、その結果電子伝達剤との共存が好ましくない化合物と
接触することにより性能の劣化を引き起こす可能性があ
る。この場合、特開昭５７−１９７４６６号明細書に謁
示された繊維構進展Ｉｌ１層が有利に用いることができ
る。即ち、前記電子伝達剤溶液をキシレン等の塗布溶媒
に添加した後、ばらばらの繊維を加え繊維の中に上記電
子伝達剤を含浸し、濾過乾燥したものを用いることで微
量の電子伝達剤を正確に、かつ多層への移行を防止しつ
つ含有することが可能である。

電子伝達剤および色素形成性前駆物質を別異の層に含有
させる場合、これらの含有層を設ける方法としては、電
子伝達剤または色素形成性前駆物質をバインダー水溶液
に溶解させ、更に具体的には水に溶解させた後、この溶
液を水にＩ！させたバインダー中に加えて溶解させたも
のを塗設する方法が挙げられる。

少なくとも１層の受容層および少なくとも１層の展開層
のうちの同一層に、電子伝達剤および色素形成性前駆物
質が別々の粒子として含有されているとき、これらの電
子伝達剤および色素形成性前駆物質の粒径がそれぞれ０
．１μ以上となっていることが好ましい。

更に電子伝達剤および色素形成性前駆物質が別異の層に
含有されている場合にも、これら電子伝達剤および／ま
たは色素形成性前駆物質は粒子状とすることもできる。

電子伝達剤および色素形成性前駆物質を粒子として含有
する層を設ける方法としては、予め微粉砕した電子伝達
剤および色素形成性前駆物質をそれぞれ有機Ｓ＊中に懸
濁させ、同一の有ｍ溶媒に溶解させたバインダー中に得
られた懸濁物を加えて均一に分散させたものを塗設する
方法、あるいは、電子伝達剤および色素形成性前駆物質
をそれぞれ有機溶媒中に懸濁させて微粉砕し、同一の有
機溶媒に溶解させたバインダー中に加えて均一に分散さ
せたものを塗布する方法、ないしは、電子伝達剤および
色素形成性前駆物質を、バインダーを服務有機溶媒中で
微粉砕した後、均一したものを塗設する方法などが挙げ
られる。

また展開層が濾紙の如きＩＩＩＡＮ質多孔物質で構成さ
れる場合は、バインダーを含む有機溶媒中に電子伝達剤
および色素形成性前駆物質を加えた後、多孔質物質を加
えて均一に分散させて塗布する方法が挙げられる。

本発明に用いられる電子伝達剤を本発明の分析素子に含
有させる量は、前記特定成分の量に応じて変わるが、ジ
アホラーゼ以外の電子伝達剤の場合、通常は１　ｍａ／
■２〜１１）／■２　、好ましくは１０〜５００霞ｇ／
■　である。

更に、ジアホラーゼを電子伝達剤として用いる場合、前
記特定成分の量に応じて変るだけでなく、ジアホラーゼ
の由来及び活性値の測定法に応じて変ワル。通常ハ１０
０Ｖ／１　〜１００，０ＯＯＶ／ｌミ好ましくハ５００
Ｖ／ｌ”　　〜５０，０ＯＯＶ／ｌ”　　金含有させる
ことができる。

また、本発明に係る色素形成性前駆物を本発明の分析素
子に含有させる量は、通常は１０１Ｑ／−２〜１０ｇ／
ｌ、好ましくは５０■ｇ／■　〜３ｇ／Ｉ２え である。更に、本発明に係る酸化型補酵素を本発明の分
析素子に含有させる量は、通常は１０■Ｑ／　１２〜５
０ｇ／−２、好ましクハ５０−ｏ／１２〜１０ｇ／１２
である。

前記電子伝達剤を含有する層および色素形成性前駆物質
を含有する層を形成するために用いられるバインダーは
、特に制限されないが親水性コロイド物質を用いる事が
好ましい。例えばゼラチン、及びその誘導体、ポリアク
リルアミド及びその共重合体、ポリメタアクリルアミド
及びその共重合体、ポリヒドロキシ、エチル、アクリレ
ート及びその共重合体、ポリビニルアルコール、アガロ
ース、カルボキシ、メチル、セルロースナトリウム塩、
ヒドロキシエチル、セルロース等の親水性セルロース誘
導体等が挙げられる。好ましくは、ゼラチン及びその誘
導体が上記目的に対して用いられる。層を形成させる方
法は特に制限されない。

この様にして構成された本発明の分析素子は、分析素子
のカブ９１１度をはじめとして、作製した素子の保存安
定性が飛躍的に向上し、高い識別能を得ることが可能と
なった。

本発明に係る展開層は、（１）一定容量の流体試料を、
単位面積あたり一定容量を受容層に均一に配布する機能
を有するものである。その上、更に、特公昭５３−２１
６７７号公報に記載された性能、即ち、（２）流体試料
中の分析反応を阻害する物質または要因を除去する機能
、および／または（３）分光光度分析を行なうときに支
持体を経て透過する測定光を反射するバックグラウンド
作用を行なう機能を有するものであれば好ましい。従っ
て、本発明に係る展開層は、上記（１）の機能のみを有
する層、（１）に加えて（２）および／または（３）の
機能を併せて有する層の何れかとすることができ、ある
いは（１）を包含する複数の機能を適宜分離し、各機能
毎に別の層を使用することも可能である。更に（１）、
（２）および（３）の機能のうち、２つの機能を有する
層と、残りの１つの機能を有する層を組み合わせて使用
することもできる。例えば、前述の特公昭５３−２１６
７７号公報に記載された二酸化チタンおよび二酢酸セル
０−スから成るプラッシュポリマーと呼称される非線雑
多孔質媒体の展開層、特開昭５６−２４５７６号、同５
７−１２５８４７号および同５７−１９７４６６号明細
書などに記載されたｍＮ構造展開層が挙げられる。特に
上記繊維構造展開層は、血球部分も速やかに移送するこ
とが可能な素材として特に有用であり、更に本発明の目
的の一つである酵素の如き巨大分子のｍｓ移送に有用な
ものである。本発明の分析素子における展一層の膜厚は
、その空隙率によって決定されるべきであるが、好まし
くは約１００〜約５００ミクロン、更に好ましくは約１
５０〜３５０ミクロンである。また、空隙率は好ましく
は約２０〜約８５％である。

本発明に係る受容層は、流体試料中の特定物質が、選択
された反応により最終的に電子伝達剤を介し、色素形成
性前駆物質が色素に変化する際、該色素形成性前駆物質
が該受容層内で色素に変化するか、あるいは少な（とも
色素形成性前駆物質から変化した色素を受容し、分光学
的観測量の変化として検知するための場とする目的で設
けられるものであり、この目的に反しない限りにおいて
種々の試薬類および各種の付加的な添加剤を含有するこ
とが可能である。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することが出
来る。

特に界面活性剤は、流体試料を本発明の素子に適用した
際の浸透速度のｉｌＩ！１等有効に用いることができる
。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
またはカチオン性）、′非イオン性を同ゎず使用するこ
とが可能であるが、非イオン性詐面活性剤が有効である
。非イオン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−
ジ−ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ
−オクチルフτノキシポリエチレングリコール、ｐ−イ
ソノニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキ
ル置換フＸノールのポリアルキレングリコール誘導体、
高級脂肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが
挙げられる。これらの界面活性剤は流体試料の受容層へ
の浸透速度を調節し、同時に好ましからざる「りＯマド
グラフィ環象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重量に対して２５重量パーセント
乃至ｏ、ｏｏｓｆＩ量パーセント、好ましくは１５重量
パーセント乃至０．０５重量パーセント用いることがで
きる。

本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の光透過性
支持体（以下、本発明に係る支持体と略す。）は、液体
不浸透性で、かつ光透過性であればその種類を問わない
が、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネートまたはポリスチレンのような種々
の重合体材料が、この使用目的に適する。更には上記重
合体材料のみならず、ガラスの如き無機材料も同様に用
いることが可能である。本発明に係る支持体の厚さは任
意であるが、好ましくは約５０〜約２５０ミクロンであ
る。また、本発明に係る支持体の観測側の−側面は、そ
の目的に応じて任意に加工することが可能である。更に
受容層を積層する側の支持体面に、場合によっては光透
過性の下塗り晒を使用して受容層と支持体との接着性を
改良することができる。

本発明の分析素子は必要に応じて、例えば米国特許第３
，９９２，１５８号記載の反射層、下塗り層、米国特許
第４，０４２，３３５＠記載の放射線ブロッキング層、
米国特許第４，０６６．４０３号記載のバリヤ一層、米
国特許第４，１６６．０９３号記載のマイグレーション
阻止層、特開昭５５−９０８５９＠記載のスカベンジャ
ー屑、および米国特許第４，１１０，０７９＠記載の破
壊性ボンド状部材等を任意に組み合せて本発明の目的に
合わせた任意の構成とすることができる。。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸Ｉｔ塗布法等を適
宜選択して用い、順次積層することで任意の厚みの府を
塗設することができる。

本発明の分析素子を用いて、流体試料中の特定成分の量
を、本発明に係る支持体側から反射スペクトロフォトメ
トリーにより初速変法または反応終点法に従って測定す
ることができる。このようにして得られた測定値は、予
め作成しておいた検量線に当てはめることで特定成分の
量を決定することができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料の借は任意に定
めることができるが、好ましくは約５μｐから約５０μ
ｐであり、更に好ましくは５μノから２０μでである。

通常１０μρの流体試料を適用するのが好ましい。

本発明の分析素子は全血液、血清および血漿のいずれの
分析にも不都合なく用いることができる。

更には尿、リンパ液、髄液等の他の体液も不都合な（用
いられる。全血液を用いる場合には、必要に応じて検出
のための放射線が血球により妨害を受けるのをさけるた
めに、前述の放射線ブロッキング層または他の反射層を
設けることができる。

本発明の分析素子に用いられる分析反応は、その目的に
より任意に定めることができるが、例えば臨床化学の分
野に有用であり、特に生物学的液体試料、すなわち血液
または尿中の成分の分析に用いられる。

以上詳述したように、本発明の分析素子によれば、流体
試料を適用するまでは、電子伝達剤と色素形成性前駆物
質とが互いに反応し得ない状態で構成層中に含有せしめ
ることができたので試薬の保存、安定性が改良され、カ
プリ濃度が低減し・、発色性に優れているだけでなく、
不均一濃度の発生や、クロマトグラフィ現象もＧ、ｆと
んと見られず、可視光を使用して通常の分光光度計によ
り、簡便かつ迅速に流体試料、特に生物学的流体試料中
の成分の高精度乾式定量分析に用いることが可能となり
、極めて実用的に有利である。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、これによって本発明の実施１様が限定されるものでは
ない。

実施例−１ １８０μｍの下引き済の透明なポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に、下記組成の層を順次塗布して、分析素
子とした。

第１の試薬層 ゼラチン　　　　　　　　　　１８．９１１／−”グル
タミン酸脱水素酵素　　１９．０００Ｖ／ｌ′Ｌジアホ
ラーゼ　　　　　　　１，９００Ｖ／ＩＩ’３．３’　
−＜３．３’　−ジメト キシ−４，４′−ビフェニレン） 一ビス［２，５−ジフェニルテ トラゾリウムクロリド３　　　　０．９４ｇ／ｍ１．２
−ビス（ビニルスルノオ ニル）エタン　　　　　　　　　０．ｉ　ｏ／ｍ”トラ
イトンＸ−１００ （ＲＯｈｌ　＆Ｈａｓｓ社）　　　　　０．１　ａ／ｒ
ｅ”から成る乾燥膜厚約２３μ膳の第１の試薬層筒２の
試薬層 トリスヒドロキシメチルアミノメタン ３．８７ｇ／ａ’ 塩酸トリスヒドロキシアミノメタン ０．８３ｏ／　ｌＬ トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ−１０００，１ｇ／
ｌ”バインダー（表−１参照）　　　　　１．３５０／
Ｉ２から成る乾燥膜厚的１５μ−の第２の試薬層展開層 粉末濾紙Ｃ［東洋濾紙（製） ３００メツシュ以上］　　　　　　　　８．９２Ω／畿
２アラニン　　　　　　　　　　　２．９＋ＩＩ　／１
２酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド ５．３ａ　／ｍ” α−ケトゲルタール スチレン−グリシジルメタアクリ レート共重合体（重量化９　：　１　）　　１５　ａ／
ｍ”トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　−　　１００
　　５　ａ／ｒｅ：Ｌから成る乾燥膜厚的２５０μ■の
展開層Ｍ２の試ＩＩ層のバインダーとして、下記の表−
１に示すものを用いた。

以下余白 上記比較分析素子及び、本発明の分析素子工〜■に各種
ＧＰＴ活性のヒト血清を１０μｍ滴下した後、３７℃に
インキュベーションし、滴下後、２分後及び４分後の反
射濃度を反射分光光度計で５４６０騰のフィルターを通
して測定し、この反射濃度の差と、標準法で検定したヒ
ト血清のＧＰＴ活性値からあらかじめ検量線を作成した
。

更に、ヒト血清の中から正常値（２５力ルメン単位）及
び異常値（９８力ルメン単位）のものを各々１５回滴下
し、同様の操作を行ない反射濃度の差を出し、あらかじ
め作成した検量線にあてはめ、活性値をだした後、標準
偏差及びＣｖを出した。結果を表−２に示す。

以下余白 表−２ ［ｌ 正常 異常 （ｘ　、ＳＯ共に単位はカルメン単位）以上表−２から
も明らかな如く、本発明の分析素子は、良好な同時再現
性を示すのみならず、呈色領域内の発色は均一であった
。一方比較の分析素子は、本発明の分析素子に比較して
同時再現性は劣り、かつ呈色領域内の均一性も劣るもの
であった。

実施例−２ 前記本発明の分析素子（Ｉ）〜（ＩＶ）及び比較分析素
子を、４０℃、５５％相対湿度で７日間保存した後に、
正常値（２５力ルメン単位）および異常値（９８力ルメ
ン単位）のヒト血清を滴下し、同様の操作を行ない、反
射濃度の差を算出した後、即日の検量線にあてはめ、活
性値に変換し、変動率を出した。結果は表−３に示す。

以下余白 表−３ 以上表−３から明らかな如く、本発明の分析素子は、比
較分析素子に比べ良好な保存安定性を有している事が明
らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に第１の試薬層、
   第２の試薬層及び多孔性展開層から成り、電子伝達剤、
   少なくとも一種の色素形成前駆物質、少なくとも一種の
   酸化型補酵素、少なくとも一種の緩衝剤及び前記特定成
   分を介して、前記酸化型補酵素を還元型補酵素に変換し
   得る少なくとも一種の試薬を含有し、かつ前記緩衝剤と
   色素形成前駆物質を異なる層に配置した液体試料中の特
   定成分を分析するための分析素子において、上記緩衝剤
   を含有する層が下記一般式（ I ）および（II）から選
   ばれる少なくとも１つのバインダーを用いる事を特徴と
   する流体試料中の特定成分を分析するための分析素子。 一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１はメチル基又はエチル基を表わし、ｘは
   ２０から９５モルパーセント、ｙは５から８０モルパー
   セントを示す。］ 一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿２は水素原子又はメチル基を表わし、Ｘは
   フェニル基、シアノ基又は−ＣＯＯＲ＿３基を表わし、
   Ｒ＿３はメチル基、エチル基又はブチル基を表わす。ｘ
   は５０から９５モルパーセント、ｙは５０から５モルパ
   ーセントを示す。］