JPH0355118B2

JPH0355118B2 -

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Publication number: JPH0355118B2
Application number: JP57201169A
Authority: JP
Priority date: 1982-11-18
Filing date: 1982-11-18
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPS5991896A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、分析化学、特に流体中のあらかじめ
定められた特定成分を分析する分析素子に関し、
更に詳しくは、生物学的流体試料中の特定成分を
還元型補酵素を介して分析するための乾式分析素
子に関する。従来、流体試料中の検体成分を分析する方法に
関しては多数開発がなされてきたがそれらは大別
して、溶液内で反応が行われる反応系と固相担体
内で行われる反応系の二種類に分けることができ
る。溶液系における分析反応（以下ウエツト・ケ
ミストリーと略す）は用手法と呼ばれる全く機械
を用いない分析方法から自動分析機器まで幅広く
知られている。特に臨床化学の分野においてはそ
の進歩が著しく、近年種種の臨床検査用自動定量
分析機器が病院の臨床検査室に導入されている。しかしながら上述の方法は基本的に水溶液の形
で反応を行わせるために種種の欠点を有してい
る。すなわちその分析過程で大量の水、特に精製
された純水あるいは蒸留水を必要とすることから
エネルギー消費の増大を招くことは必然であり、
また種種の自動分析機器はそれ自体著しく高価で
あり且つその操作に多大の熟練を必要とし、ばく
大な時間と労力を必要とするばかりでなく、その
廃液は必然的に環境汚染を引起すという欠点を内
包している。これに対して固相の分析反応（以下、ドライ・
ケミストリーと略す）を用いる分析法も広範に用
いられているが、これらは紙等に試薬を含浸さ
せた形で提供される。上記の紙は、例えば米国特許第3050373号あ
るいは同第3061523号各明細書等に記載されてい
るように紙のごとき吸水性繊維室担体に試薬溶
液を含浸させ、乾燥させて作られるものである。
これらは一般に分析試験紙又は単に試験片と呼称
されるもので、上記の試験片上に流体試料を滴下
するか、又は流体試料中へ試験片を浸漬させ試験
片の色変化または濃度変化を肉眼判定か、又は反
射濃度計により測定し、流体試料中の特定成分の
濃度レベルを決定するものである。これらの試験片は、その取扱いが簡便であり、
且つ直ちに結果が得られるので有用ではあるが、
その構成上から半定量又は定性分析の領域にとど
まつている。一方、上述のごとき従来の分析方法に対して操
作性の簡便なドライ・ケミストリーを用い、その
上高い定量性を有する多層分析素子が知られてい
る。例えば特公昭53−21677号、特開昭55−
164356号、同57−197466号、同57−125847号及び
同58−90167号各公報などに上記多層分析素子が
記載されている。上記各明細書によれば分析反応に用いられる一
切の試薬類を一枚の分析素子中に含有すると共に
血清又は全血液を一定容量上記素子上に滴下し、
一定時間一定温度に保温した後支持体側から反射
濃度測定を行い反射濃度から物質濃度を決定する
ことが可能である。上記方法は従来の試験紙型のものに対して飛躍
的な分析精度を有し、且つ試薬をあらかじめ調整
することなく用いられるウエツト・ケミストリー
と同等以上の性能を有するものである。しかしながら、上記分析素子はいわゆる低分子
量の化合物の分析を主なる目的とし、且つ反応終
点測定法（エンドポイントアツセイ）で行われる
ものが主体であり、いまだ初速度法（レート・ア
ツセイ）を用いる高分子量物質、特に酵素の活性
度を測定するものの開発はなされていない。特に還元型補酵素、すなわち還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド及び還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸の増加又は
減少によつて流体試料中の成分を測定する方法は
その適用範囲が広く有用な方法であることが知ら
れている。前述のウエツトケミストリーにおいては該試料
中の特定成分を一定の所望の反応経路を介在させ
た後に上記の還元型補酵素の減少反応に導き、該
還元型補酵素の紫外部領域を初速度法により測定
することで検出する方法や更に該還元型補酵素の
変化を電子伝達物質を介して色素形成性前駆物質
に伝えることで色素を形成させ、この色素の濃度
を比色法により定量する方法が知られている。前者の方法はウエツト・ケミストリーにおいて
は一般的に用いられている方法ではあるが、前述
のドライケミストリーである分析素子に導入する
ためにはいくつかの致命的な問題点がある。すな
わち測定対象物である該還元型補酵素の変化は
340nｍの紫外部の吸収を測定する必要があり且
つその分子吸光係数は著しく小さいものであるこ
とが知られている。それ故、紫外部の微少な吸光
度の変化を測定する必要があり、また分析素子の
構造上反射測光を行わなければならないためによ
り高度な測定機器を必要としこのため著しく高価
な測定機器を用いなければならないという欠点を
有している。更に紫外部を測定するためにすべて
の素材に対して340nｍ付近に吸収を有しないも
のを用いなければならないという欠点を有してい
る。後者の電子伝達物質を介して色素を形成させる
可視部における比色法は前述の方法に比べてはる
かに有利であるばかりでなく、初速度法、反応終
点法の両方を用いることが可能であるという有用
なものである。このように有用な面を有しながらウエツト・ケ
ミストリーにおいて多用されなかつたのは以下に
述べる欠点があるためである。すなわち前述の電子伝達物質及び色素形成性前
駆物質は両者が溶液系内で共存すると両者の試薬
の安定性が非常に悪化し、不所望の色素形成を誘
発したり、また、電子伝達物質としてフエナゾニ
ウム塩類を使用した場合、水溶液状態はもちろん
固体状態でも大気中の湿気等により、普通の散光
下で酸化等を受けて変質し易いなどという重大な
欠点を有するだけでなく、試薬の混合時における
精度の低下や、ここで用いられる色素形成性前駆
物質から誘導される色素が水に不溶性である場合
が多く、色素が水溶液中で沈殿を起し、この水溶
液中での沈殿が原因となつて起る精度の低下並び
に再現性の劣化等の問題点を有している。上述の欠点は単に前述の多層分析素子に適用し
た場合、本来この多層分析素子自体が有している
有用性を発揮できないばかりか、更に試薬の安定
性及び測定精度等の点で充分に満足し得るもので
はないことは明白である。このため多層分析素子の有用性を維持しつつ、
且つ上記反応を適用した該素子の開発が強く望ま
れている。本発明の目的は、したがつて試薬の安定性及び
測定精度に優れ、且つ操作も簡単な還元型補酵素
測定用分析素子を提供することにある。本発明者等は鋭意検討を重ねた結果、下記構成
を有する分析素子を用いることにより、上記欠点
を克服することができた。すなわち本発明を概説すれば、本発明は、光透
過性で液体不浸透性の支持体上に、流体試料中の
成分と反応する試薬を含む少なくとも一層の試薬
層を設け、更にその上に該流体試料中の成分を該
試薬層へ透過させる少なくとも一層の展開層を設
けた還元型補酵素検出用多層分析素子において、
該試薬層及び／又は展開層に電子伝達物質及び色
素形成性前駆物質を含有させ、且つ該分析素子に
紫外線吸収性物質を含有させたことを特徴とする
還元型補酵素検出用多層分析素子に関する。以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明に係る電子伝達物質は前記の還元型補酵
素の存在下に還元され、更に還元された該電子伝
達物質は前記色素形成性前駆物質を還元し可視部
に吸収を有する色素を形成させるものである。本発明における還元型補酵素とは還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）及
び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（NADPH）等をいう。本発明において用いられる電子伝達物質として
は、Ｎ−メチルフエナジン・メトサルフエート類
（例えばＮ−メチルフエナジン・メトサルフエー
ト又は１−メトキシ−Ｎ−メチルフエナジンメト
サルフエート等）、メルドラブルー、メチレンブ
ルー及びジアホラーゼを使用することができ、好
ましい電子伝達物質としては、Ｎ−メチルフエナ
ジンメトサルフエート類を挙げることができる。一方、上記の本発明に係わる色素形成性前駆物
質としては、テトラゾリウム塩類が好ましく用い
られ、本発明において用いられる上記テトラゾリ
ウム塩類は、前述により色素形成後は水に対して
離溶ないしは不溶性になり、通常ウエツト・ケミ
ストリー法では使用が難しいものの、本発明の分
析素子においては上記色素が耐拡散性であり、不
所望のリンキングを防止し、測定の定量性を向上
させる点で好ましく使用することができる。本発明において有用とされる上記テトラゾリウ
ム塩としては、例えば３，3′−（３，3′−ジメト
キシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス〔２−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウム
クロライド〕（NBT）、３，3′−（３，3′−ジメト
キシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス〔２，５−
ジフエニル−テトラゾリウムクロライド〕
（BT）、３−（4′，5′−ジメチル−トリアゾリル−
２）−２，４−ジフエニルテトラゾリウムブロマ
イド（MTT）、２−（ｐ−ヨードフエニル）−３
−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−テトラ
ゾリウムクロライド（INT）、２，2′，５，5′−
テトラ−（ｐ−ニトロフエニル）−３，3′−（３−
ジメトキシ−４−ジフエニレン）−ジテトラゾリ
ウムクロライド（TNBT）、２，３，５−トリフ
エニルテトラゾリウムクロライド（TT）及び
３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス〔２，５
−ジフエニルテトラゾリウムクロライド〕（MT）
等を挙げることができる。本発明に係る紫外線吸収性物質は吸収極大波長
が450nｍ以下、好ましくは400nｍ以下であれば
特に制限はなく、紫外線吸収剤として公知の物質
はすべて使用することができる。例えば米国特許
第2592310号、同第2592311号、同第2432517号、
同第2432521号、同第2617748号、同第2787620号、
同第2583527号、同第3100717号、同第2544891号、
同第2568760号、同第2708637号、同第2770631号、
同第2811460号、同第2811461号、同第2327899号、
同第2395665号、同第2561467号、同第2747996号、
同第2415624号各明細書、英国特許第645392号、
同第700059号各明細書、独国特許第959052号及び
同第962546号各明細書等に記載されているような
安息香酸誘導体、特公昭43−10160号公報等に記
載されているようなケイ皮酸エステル類、米国特
許第2443157号明細書等に記載されているような
ピルビン酸誘導体類、米国特許第2364027号、同
第2514220号、同第3207620号、同第3287127号、
同第3310525号各明細書、英国特許第928162号、
同第1060426号各明細書及び仏国特許第1487348号
明細書等に記載されているようなフエノール性水
酸基を有する化合物類、米国特許第2615860号、
同第2665265各明細書、英国特許第695810号、同
第811113号及び同第1087567号各明細書等に記載
されているような金属キレート類、米国特許第
2276204号明細書等に記載されているようなα，
β不飽和ケトン類、米国特許第2747996号明細書
等に記載されているようなアセトフエノン類、米
国特許第2568894号、同第2773778号、同第
3359236号、同第3352777号、同第2888315号、同
第2719086号、同第2756253号、同第2763657号、
同第2875053号、同第2890193号、同第2917402号、
同第3100716号、同第3113880号、同第3134752号、
同第3146217号、同第3215530号、同第3192179号、
同第3208865号、同第3214463号、同第3328491号、
同第3330656号、同第3340231号各明細書、英国特
許第786762号、同第810570号、同第1001705号各
明細書、独国特許第1187369号、同第1140812号各
明細書、仏国特許第1385959号明細書、特公昭34
−7239号、同40−16140号、第40−15839号各公報
等に記載されているようなベンゾフエノン類、米
国特許第2632701号明細書、英国特許第573236号、
同第574425号各明細書、独国特許第960517号及び
同第1140812号各明細書等に記載されているよう
なスチルベン誘導体類、米国特許第2440070号、
同第2534654号、同第2748021号、同第2763566号、
同第2875053号各明細書、英国特許第591295号、
同第1071348号各明細書及び独国特許第1182066号
明細書等に記載されているようなフエニルヒドラ
ゾン類、米国特許第2846306号、同第3361707号各
明細書、英国特許第761728号、同第795250号、同
第783325号各明細書及び独国特許第1004046号明
細書等に記載されているようなアゾ化合物類、米
国特許第3074909号、同第3134748号、同第
3253921号、同第3272891号、同第3004896号、同
第3267113号、同第3282886号各明細書、英国特許
第960141号、同第980886号各明細書、独国特許第
1227907号明細書、仏国特許第1497195号、同第
1475329号各明細書、特公昭36−10466号、同41−
1686号、同41−19177号、同48−4596号、同49−
26139号、同50−125337号及び特開昭53−85425号
各公報等に記載されているようなベンゾトリアゾ
ール類、米国特許第2747996号、同第2719162号、
同第2739888号、同第2739971号、同第3350204号、
同第2784087号、同第2798067号、同第2808330号、
同第2875053号、同第2882150号、同第3365295号、
同第3350204号及び同第3352681号各明細書等に記
載されているようなチアゾリドン類、米国特許第
2334348号、同第2508295号、同第2537877号、同
第2432517号、同第3271156号、同第3205083号各
明細書、英国特許第816750号、同第1043145号、
同第1034181号、同第746046号各明細書、独国特
許第1140812号、同第1241101号各明細書及び特公
昭40−27525号公報等に記載されているようなア
ゾール類、米国特許第2160907号、同第2691579号
及び同第2747996号各明細書等に記載されていう
ようなシアニン色素類、米国特許第3052636号、
同第3079366号、同第3111417号、同第3215550号、
同第3134750号、同第3275462号、同第3278448号、
同第3337357号各明細書、英国特許第948627号、
同第1078569号、同第1023384号、同第1027507号
各明細書、独国特許第1238469号、同第1238915
号、同第1242780号各明細書、特開昭46−35721
号、同49−11155及び同52−49029号公報等に記載
されているようなアクリロニトリル類、米国特許
第3268474号、同第3317328号各明細書、英国特許
第975966号、同第1018987号、同第1049463号各明
細書、独国特許第1216874号、同第1216875号、同
第1240083号各明細書、仏国特許第1494413号明細
書、特公昭41−14736号及び同41−14647号各公報
等に記載されているようなｓ−トリアジン類、米
国特許第2334348号、同第2740761号、同第
2747996号各明細書及び英国特許第743759号明細
書等に記載されているようなクマリン類、その他
特開昭51−56620号、同54−111826号各公報等に
記載されているような化合物等を使用することが
できる。好ましくは、ベンゾフエノン類、ベンゾ
トリアゾール類、チアゾリドン類及びアクリロニ
トリル類が挙げられる。本発明に係る前記の液体不浸透性の光透過性支
持体（以下、本発明に係る支持体と略す）は、液
体不浸透性で、且つ光透過性であれば、その種類
を問わないが、例えば酢酸セルロース、ポリエチ
レンテレフタレート、ポリカーボネート、又はポ
リスチレンのような種種の重合体材料が、この使
用目的に適する。この場合の上記支持体の厚さは
任意であるが、好ましくは約50μｍから250μｍで
ある。また、本発明に係る支持体の観察側の一側
面は、その目的に応じて任意に加工することは可
能である。更に試薬層を積層する側の支持体面
に、場合によつては光透過性の下塗り層を使用し
て試薬層と支持体との接着性を改良することがで
きる。本発明に係る展開層は、(1)一定容量の流体試料
を単位面積当り一定容量を試薬層に均一に配布し
得る特性を有することが必要であるが好ましくは
更に(2)流体試料中の分析反応を阻害する物質又は
要因を除去し、(3)分光光度分析を行う際に支持体
を経て透過する測定光を反射するバツクグラウン
ド作用を行う機能を有するものであれば、任意に
選択することができる。したがつて、本発明に係
る展開層は、上記３つの機能をすべて行う得る
が、また３つの機能を適宜分離し、各機能毎に別
の層を使用することも可能である。更に、３つの
機能のうち、２つの機能を有する層と、残りの他
の機能を有する層を組合わせて使用することもで
きる。例えば、特公昭53−21677号公報記載の二
酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るブラツ
シユポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展
開層、特開昭56−24576号、同57−125847号及び
同57−197466号各明細書などに記載の繊維構造展
開層が挙げられる。特に上記繊維構造展開層は、
血球部分も速かに移送することが可能な素材とし
て特に有用であり、更に本発明の目的の一つであ
る酵素のごとき巨大分子の展開移送に有用なもの
である。本発明の分析素子は、種種な構成を有すること
が可能である。本発明に係る電子伝達物質及び色
素形成性前駆物質を、展開層若しくは試薬層に別
別に含有する構成も可能であり、同一試薬層若し
くは別個の試薬層中に含有する構成も可能であ
る。本発明に係る上記試薬層は、該層に分析すべき
検体成分と定量反応を行わせる試薬類を含有せし
め、該層内で定量反応を行わしめるために使用さ
れる。そして上記試薬層は親水性コロイド若しくは、
有機溶媒に可溶性の高分子物質を媒体とし、支持
体上に塗布することによつて層として設けるた
め、紙のごとき担体に試薬を含浸させる従来の
ものとは異なり、均一に試薬類を含有することが
可能であり、且つ、試薬の含有量を自由にコント
ロールできるという利点を有している。このよう
な本発明に係る試薬層を用いられる親水性コロイ
ド物質としては、天然又は合成の高分子物質が好
ましいが、更に好ましくはゼラチン、変性ゼラチ
ン等のゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。この中
で特に好ましい親水性コロイド物質としては、ゼ
ラチン等のゼラチン誘導体を挙げることができる
が還元作用を有する物質の除去処理がなされたゼ
ラチンが最も好ましい。これらの親水性コロイド物質は約150〜約500％
の膨潤度を有することが好ましく、また、その膜
厚は所望に応じて選択することが可能であり、少
なくとも約5μｍ以上であることが必要である。有機溶媒に可溶性の高分子物質としては、例え
ばポリスチレン類、ポリアクリル酸エステル類、
ポリメタクリル酸エステル類、メチルセルロー
ス、エチルセルロース等のアルキルセルロース
類、ポリビニルブチラール、ポリビニルカーボネ
ート等を挙げることができる。上記のようにして形成される試薬層に含有され
る試薬は、試料中の分析すべき検体成分及びこの
成分を分析するために選択した分析反応によつて
決まることは言うまでもない。また、選ばれた分
析反応が二種以上の試薬から構成されている場合
この試薬を同一試薬層内に一緒に混合して含有さ
せても、また、二種以上の試薬を別層として含有
させてもよい。これらは分析反応自体の作用機構
によつて決定されることもあり、好ましくない影
響を及ぼさない限りにおいて、その構成は任意で
ある。一方、試料中の二種以上の検体成分を、同一の
試薬層内で分析反応を行うことは可能である。こ
の際、二種以上の分析反応は相互に他を妨害しな
いように、また、生成した反応生成物を測定する
際、同様に互いに他に影響を及ぼさないよう分析
反応を選択する必要がある。以上により構成された試薬層は、一般的には本
発明に係る支持体上に塗布方法によつて被覆する
ことができるが、前述のとおり試薬層と支持体と
の間に本発明の目的に適用しないものは別として
各種の層を設けることができる。本発明に係る電子伝達物質及び色素形成性前駆
物質は、本発明の分析素子の試薬層及び展開層の
少なくともいずれか一層の単独若しくは、同一層
に混合して加えることも可能であり、例えば、上
記バインダーである高分子物質を含有する有機溶
媒若しくは、水溶液中に添加し、分散又は溶解せ
しめこれを所望の層として塗布することも可能で
ある。一方蛋白質のごとき巨大分子を収納する機能を
有している物質を特開昭58−70163号及び同58−
123458号各公報に記載の試薬層に適用することも
可能であり、流体試料中の酵素のごとき、巨大分
子を収納し、所望の呈色を行わしめるにはより好
ましいものである。上記試薬層には、用いられる試薬の特性によ
り、写真業界で公知であるオイルプロテクト分散
法、直接分散法等の分散法及び溶解等により、試
薬を含有させることができる。また、他の付加的な添加剤として例えば保恒
剤、緩衝剤、界面活性剤等、種種の添加剤も所望
に応じて添加することができる。特に界面活性剤は流体試料を本発明の素子に適
用した際の浸透速度の調節等有効に用いることが
できる。使用可能な界面活性剤としては、イオン性（ア
ニオン性又はカチオン性）、非イオン性を問わず
界面活性剤を使用することが可能であるが、好ま
しくは非イオン性界面活性剤が有効である。非イ
オン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−
ジ−ｔ−ブチルフエノキシポリエチレングリコー
ル、ｐ−オクチルフエノキシポリエチレングリコ
ール、ｐ−イソノニルフエノキシポリエチレング
リコール等のアルキル置換フエノールのポリアル
キレングリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアル
キレングリコールエステルなどが挙げられる。こ
れらの界面活性剤は流体試料中の試薬層への浸透
速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマト
グラフイ現象」発生を抑制する効果を有する。上記界面活性剤は広範に選択された量を用いる
ことが可能であるが、塗布液の重量に対して10重
量％から0.005重量％、好ましくは６重量％から
0.05重量％用いることができる。本発明の分析素子は種種の異なる配置のうち、
任意の一つをとることが可能である。更に本発明
の試薬層と各種の機能層、試薬含有層、及び部
材、例えば米国特許第3992158号明細書記載の試
薬層、反射層、下塗り層、米国特許第4042335号
明細書記載の放射線ブロツキング層、米国特許第
4066403号明細書記載のバリヤー層、米国特許第
4144306号明細書記載のレジストレーシヨン層、
米国特許第4166093号明細書記載のマイグレーシ
ヨン阻止層、米国特許第4127499号明細書記載の
シンチレーシヨン層、特開昭55−90859号公報記
載の清掃層及び米国特許第4110079号明細書記載
の破壊性ポツド状部材等を任意に組合わせて、本
発明の目的に合わせた分析素子を構成することが
可能である。上記の種種の層は、従来写真工業において公知
のスライドホツパー塗布法、押出し塗布法、浸漬
塗布法等を随時用いることで任意の膜厚の層を塗
布することが可能である。本発明に係る紫外線吸収性物質は本発明の分析
素子のいずれの場所に含有させてもよい。例えば上記の各種の層の少なくとも一層にオイ
ルプロテクト分散法、直接分散法等の分散法及び
溶解等により含有させることができる。好ましい
態様においては、電子伝達物質及び／又は色素形
成性前駆物質を含有する層中に含有させることで
ある。更にまた、例えば支持体中及び本発明の分析素
子の最上層の両方に紫外線吸収性物質を含有させ
て、電子伝達物質及び／又は色素形成性前駆物質
を含有する層をサンドイツチしてもよい。本発明に係る紫外線吸収性物質の１層中の含有
量は0.001ｇ／m²以上であり、好ましくは0.05
ｇ／m²以上である。本発明の分析素子を用いて検出可能な変化とし
て分析結果を得たのち、反射スペクトロフオトメ
トリー測定により測定される。このようにして得
られた測定値は、あらかじめ作製しておいた検量
線に当てはめることで、未知被検物質の量を決定
することができる。以上のように構成された本発明の分析素子は、
展開層から流体試料を供給した後、試薬層での分
析反応を透明支持体側から観察することにより目
的を達成できる。本発明の分析素子に適用される流体試料の量は
任意に定めることができるが、好ましくは約50μ
から約5μであり、更に好ましくは約20μか
ら約5μである。通常約10μの流体試料を適用
するのが好ましい。本発明の分析素子の場合、全
血液、血清及び血漿のいずれの分析にも不都合な
く用いることができる。更には尿、リンパ液、髄
液等の他の体液も不都合なく用いることができ
る。全血液を用いる場合には、必要に応じて、検
出のための輻射線が血球により妨害をうけるのを
避けるために前述の輻射線ブロツキング層又は他
の反射層を設けることができる。本発明の分析素子に用いられる分析反応は、そ
の目的により任意に定めることができるが、例え
ば臨床化学の分野に有用に用いられ、特に生物学
的流体試料、すなわち血液又は尿中の成分の分析
に用いられる。これらは分析試薬を適宜選択することで、例え
ば、アミラーゼ（AMY）、トリグリセリド
（TG）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミ
ナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（GPT）、乳酸脱水素酵素
（LDH）、クレアチンホスホキナーゼ（CPK）等
の多くの成分の分析に使用し得るように容易に構
成することが可能である。以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらによつて限定される
ものではない。実施例１膜厚約180μｍの透明な下引き済みポリエチレ
ンテレフタレート支持体上に、表−に示す組成
の試薬層を一層又は二層設け、次いで各試薬層上
に表−に示す組成の展開層を一層又は二層設
け、表−に示す本発明の分析素子１〜９及び比
較分析素子１〜４を作成した。

【表】

【表】されている方法に準じて塗設。

【表】上記本発明の分析素子−１〜９及び比較分析素
子−１〜４に対して、各素子作成直後及び普通の
螢光灯下室温（約25℃）７日間保存後の反射濃度
（カブリ）並びに各素子作成直後及び普通の螢光
灯下室温（約25℃）７日間保存後、ユニキツトレ
ートLDH（中外製薬KK）を用いて確認したLDH
活性126ロブレスキー単位、253ロブレスキー単位
及び506ロブレスキー単位の各標準血清を10μ
展開層上に滴下し、37℃10分間保温した後の反射
濃度をλ_nax＝580nｍのフイルターを用いて支持体
側から測定し、表−の結果を得た。

【表】上記表−の結果から明らかなように、比較分
析素子−１、−３及び−４はカブリ濃度が高く、
しかも血清滴下による発色濃度が非常に低く、螢
光灯下７日保存後では更に著しいカブリ濃度の増
大を示し、もはや血清滴下による発色濃度の識別
は全く認められなかつた。また、比較分析素子−
２については、即日性能は本発明の分析素子と大
差ないが保存後では、著しいカブリ濃度の増大を
示し、やはり血清滴下による発色濃度の識別は困
難となつた。他方、本発明の分析素子は、即日及
び保存後もカブリ濃度が低く、LDH活性に対し
て、良好な発色濃度を示すことが判る。なお、比較分析素子−３の試薬層を前記（注
１）の紫外線吸収性物質を含有する分散液のみで
設けた層でサンドイツチした層構成にして比較分
析素子−３に対応した本発明の分析素子を作成
し、上記と同様の条件で測定を行つた結果、即日
及び保存後もカブリ濃度が低く、LDH活性に対
して良好な発色濃度を示し、比較分析素子−３に
比し、大幅に試薬の安定性が改良されることが判
つた。実施例２実施例１の試薬層Ｒ−１〜Ｒ−５及びＲ−７〜
Ｒ−11における乳酸リチウムの代りに、α−ケト
グルタル酸467mg／m²、Ｌ−アスパラギン酸21.3
ｇ／m²及びグルタミン酸脱水素酵素1200ユニツ
ト／m²を加え、トリスバツフアーの代りに0.2M
リン酸バツフアーでPH7.4に調整した以外は実施
例１と同様にして、本発明に係るGOT分析素子
−10〜18及び比較分析素子−５〜８を作成した。上記本発明の分析素子−10〜18及び比較分析素
子−５〜８に対し、実施例１と同様の操作を行
い、カブリ濃度及び血清滴下による発色濃度を測
定した。その結果、比較分析素子−５、−７及び−８は
カブリ濃度が高く、しかも血清滴下による発色濃
度が非常に低く、螢光灯下７日保存後では更に著
しいカブリ濃度の増大を示し、もはや血清滴下に
よる発色濃度の識別は全く認められなかつた。ま
た、比較分析素子−６については、即日性能は本
発明の分析素子と大差ないが、保存後では著しい
カブリ濃度の増大を示し、やはり血清滴下による
発色濃度の識別は困難となつた。一方、本発明の
分析素子−10〜18は即日及び保存後もカブリ濃度
が低く、GOT活性に対して良好な発色濃度を示
した。実施例３実施例１の試薬層R1〜R5及びR7〜Ｒ−11にお
ける乳酸リチウムの代りに、α−ケトグルタル酸
467mg／m²、Ｌ−アラニン28.5ｇ／m²及びグルタ
ミン酸脱水素酵素1200ユニツト／m²を加え、トリ
スバツフアーの代りに0.2Mリン酸バツフアーで
PH7.4に調整した以外は実施例１と同様にして、
本発明に係るGPT分析素子−19〜27及び比較分
析素子−９〜12を作成した。上記本発明の分析素子−19〜27及び比較分析素
子−９〜12に対し、実施例１と同様の操作を行
い、カブリ濃度及び血清滴下による発色濃度を測
定した。その結果、比較分析素子−９、−11及び−12は
カブリ濃度が高く、しかも血清滴下による発色濃
度が非常に低く、螢光灯下７日保存後では更に著
しいカブリ濃度の増大を示し、もはや血清滴下に
よる発色濃度の識別は全く認められなかつた。ま
た、比較分析素子−10については、即日性能は本
発明の分析素子と大差ないが、保存後では著しい
カブリ濃度の増大を示し、やはり血清滴下による
発色濃度の識別は困難となつた。一方、本発明の
分析素子−19〜27は即日及び保存後もカブリ濃度
が低く、GPT活性に対して良好な発色濃度を示
した。実施例４実施例１の試薬層Ｒ−１〜Ｒ−５及びＲ−７〜
Ｒ−11における乳酸リチウムの代りに、クレアチ
ンリン酸二ナトリウム塩15.0ｇ／m²、アデノシン
−5′−二リン酸ナトリウム塩2.3ｇ／m²、グルコ
ース4.1ｇ／m²、硫酸マグネシウム水和物20ｇ／
m²、NADP⁺1.5ｇ／m²、ヘキソキナーゼ100mg／
m²、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ20
mg／m²を加え、0.2MトリスバツフアーでPH7.2に
調整した以外は実施例１と同様にして本発明に係
るCPK分析素子−28〜36及び比較分析素子−13
〜16を作成した。上記本発明の分析素子−28〜36及び比較分析素
子−13〜16に対し、実施例１と同様の操作を行
い、カブリ濃度及び血清滴下による発色濃度を測
定した。その結果、比較分析素子−13、−15及び−16は
カブリ濃度が高く、しかも血清滴下による発色濃
度が非常に低く、螢光灯下７日保存後では更に著
しいカブリ濃度の増大を示し、もはや血清滴下に
よる発色濃度の識別は全く認められなかつた。ま
た、比較分析素子−14については、即日性能は本
発明の分析素子と大差ないが、保存後では著しい
カブリ濃度の増大を示し、やはり血清滴下による
発色濃度の識別は困難となつた。一方、本発明の
分析素子−28〜36は即日及び保存後もカブリ濃度
が低く、CPK活性に対して良好な発色濃度を示
した。本発明の分析素子は以上詳細に説明したような
構成となしたので試薬の保存性、安定性が良好で
発色性に優れ、且つ不均一濃度の発生や、クロマ
トグラフ現象もほとんど見られず通常の分光光度
計により簡単且つ迅速に流体試料、特に生物学的
流体試料中の成分の定量分析に用いることができ
るという極めて実用上の利点を有する。

Claims

【特許請求の範囲】

１光透過性で液体不浸透性の支持体上に、流体
試料中の成分と反応する試薬を含む少なくとも一
層の試薬層を設け、更にその上に該流体試料中の
成分を該試薬層へ透過させる少なくとも一層の展
開層を設けた還元型補酵素検出用多層分析素子に
おいて、該試薬層及び／又は展開層に電子伝達物
質及び色素形成性前駆物質を含有させ、且つ該分
析素子に紫外線吸収性物質を含有させたことを特
徴とする還元型補酵素検出用多層分析素子。