JPH05176795A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、試薬の安定性、測定精度に優れ、
生物学的流体試料中の特定成分を簡便に分析することを
目的とする。 【構成】 本発明の分析素子は、光透過性かつ液体不浸
透性の支持体上に、試薬層及び多孔性展開層を有し、ジ
アホラーゼ、色素形成前駆物質、酸化型補酵素、緩衝剤
及び前記酸化型補酵素を還元型補酵素に変換しうる試薬
を含有する。但しジアホラーゼ及び色素形成前駆物質は
同一層内に含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は分析素子、特に流体中の
特定成分を分析する分析素子に関し、更に詳しくは、生
物学的流体試料中の特定成分を還元型補酵素を介して分
析する乾式の分析素子に関する。

【０００２】

【発明の背景】従来、流体試料中の特定成分を分析する
方法は多数開発がなされてきたが、これらは大別して、
溶液内で反応が行なわれる反応系と、固相担体内で行な
われる反応系との２種類に分けることができる。溶液系
における分析反応（以下、ウエット・ケミストリーとい
う。）は、用手法と呼ばれる全く機械を用いない方法か
ら、自動分析機器まで幅広く知られている。特に臨床化
学の分野ではその進歩が著しく、近年種々の臨床検査用
自動定量分析機器が病院の臨床検査室などに導入されて
いる。

【０００３】しかしながら、上述の方法は基本的には水
溶液の形で反応を行なわしむるために、種々の欠点を有
している。即ち、その分析過程で大量の水、特に精製さ
れた純水あるいは蒸留水を必要とすることからエネルギ
ー消費の増大を招く。また、種々の自動分析機器はそれ
自体著しく高価であり、かつその操作に多大の熟練を必
要とし、莫大な時間と労力を必要とするばかりでなく、
その廃液は必然的に環境汚染を引き起こすという欠点を
有している。

【０００４】これに対して固相系における分析反応（以
下、ドライ・ケミストリーという。）を用いる分析方法
も広範に用いられているが、これらは濾紙等に試薬を含
浸させた形で行なわれる。

【０００５】上記の濾紙は、例えば米国特許第 3,050,3
73号あるいは同 3,061,523号各明細書等に記載されてい
るように濾紙の如き吸水性繊維質担体に試薬溶液を含浸
させ、乾燥させて作られるものである。これらは一般に
分析試験紙または単に試験片と呼ばれるもので、試験片
に流体試料を滴下するか、または流体試料中へ試験片を
浸漬させ、試験片の色変化または濃度変化を肉眼判定す
るか、または反射濃度計により測定し、流体試料中の特
定成分の濃度レベルを決定するものである。

【０００６】これらの試験片は、その取り扱いが簡便で
あり、かつ直ちに結果が得られるので有用ではあるが、
その構成上から半定量または定性分析の領域にとどまっ
ている。

【０００７】一方、上述の如き従来の分析方法に対して
操作性の簡便なドライ・ケミストリーを用い、その上高
い定量性を有する多層分析素子が知られている。例え
ば、特公昭53-21677号、特開昭 55-164356号、同 57-12
5847号、特願昭56-65446号ならびに同 56-189784号等に
多層分析素子が記載されている。

【０００８】これらに記載の素子によれば、分析反応に
用いられる一切の試薬類を一枚の分析素子中に含有して
おり、血清または全血液を一定容量上記素子上に滴下
し、一定温度で一定時間保温した後、支持体側から反射
濃度の測定を行ない、この反射濃度から物質濃度を決定
することが可能である。

【０００９】上記方法は、従来の試験紙型のものに対し
て飛躍的な分析精度を有し、かつ予め試薬を調製するこ
となくウエット・ケミストリーと同等以上の性能を有す
るものである。

【００１０】特に、還元型補酵素、即ち還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸の増加または減少
によって流体試料中の成分を測定する方法は、その適用
範囲が広く有用な方法であることが知られている。

【００１１】これら還元型補酵素はウエット・ケミスト
リーにおいては応用されており、試料中の特定成分を一
定の所望の反応経路を介在せしめた後、上記の還元型補
酵素の減少反応に導き還元型補酵素の紫外部領域を初速
度法により測定することで検出する方法、あるいは還元
型補酵素の変化を電子伝達剤を介して色素形成性前駆物
質に伝えることで、色素を形成せしめ、この色素の濃度
を比色法により定量する方法が知られている。

【００１２】前者の方法は、ウエット・ケミストリーに
おいては一般的に用いられている方法であるが、前述の
ドライ・ケミストリーの分析素子に導入するためにはい
くつかの致命的な問題点がある。即ち測定対象物とされ
る還元型補酵素の変化は、340nm の紫外部の吸収を測定
する必要があり、かつその分子吸光係数は著しく小さい
ものであることが知られている。それ故、紫外部の微小
な吸光度の変化を測定する必要があり、また分析素子の
構造上、反射濃度測定を行なわねばならないために、よ
り高度な測定機器を必要とし、著しく高価な測定機器を
用いなければならない。更に紫外部を測定するために、
全ての素材について340nm 付近に吸収を有しないものを
用いなければならないという困難さを伴う。

【００１３】後者の方法は、電子伝達剤を介して色素を
形成させ、これを可視部において比色法により定量でき
るため、前者の方法に比べてはるかに有利であるばかり
でなく、初速度法、反応終点法の両方を用いることが可
能であるため極めて有利である。

【００１４】この様に有利な面を有しながら、後者の方
法はウエット・ケミストリーにおいては多用されなかっ
た。というのは、前述の電子伝達剤および色素形成前駆
体は、両者が溶液系内で共存するとこれらの安定性が非
常に低下し、不所望の色素の形成を誘発するという重大
な欠点を有するだけでなく、両者の混合時における精度
の低下や、色素形成前駆体から誘導される色素が水に不
溶性である場合が多く、色素が水溶液中で沈澱を起こ
し、この沈澱に基づく精度の低下、再現性の劣化等が問
題となる。

【００１５】従って、後者の方法を単に多層分析素子に
適用した場合、本来多層分析素子自体が有している有用
性を発揮できないばかりか、更に試薬の安定性および測
定精度等の点で充分に満足し得るものではないことは明
白である。

【００１６】このため、多層分析素子の有用性を維持し
つつ、かつ上記後者の方法を適用した分析素子が特開昭
59-44658号公報に提案されている。

【００１７】しかしながら、同上公報に開示されている
分析素子は保存安定性及び発色領域内での呈色均一性が
十分とはいいがたい。

【００１８】従って、本発明の目的は、試薬の安定性お
よび測定精度に優れ、生物学的流体試料中の特定成分を
還元型補酵素を介して簡便に分析するための分析素子を
提供することにある。

【００１９】即ち本発明の上記目的は、光透過性かつ液
体不浸透性の支持体上に試薬層及び多孔性展開層を有
し、電子伝達剤であるジアホラーゼ、少なくとも一種の
色素形成前駆物質、少なくとも一種の酸化型補酵素、少
なくとも一種の緩衝剤及び前記酸化型補酵素を還元型補
酵素に変換しうる少なくとも一種の試薬を含有する、液
体試料中の特定成分を分析する分析素子において、前記
色素形成前駆物質と前記ジアホラーゼを同一層内に含有
することを特徴とする分析素子によって達成される。

【００２０】以下本発明を更に詳しく説明する。

【００２１】本発明に係る電子伝達剤は、生物学的流体
試料中の特定成分が介在して、本発明に係る試薬の少な
くとも１種と酸化型補酵素が反応して生成する還元型補
酵素の存在下で還元され、更に還元された該電子伝達剤
は、色素形成性前駆物質を還元し、可視部に吸収を有す
る色素を形成せしめるものである。

【００２２】本発明において測定し得る流体試料中の特
定成分としては、例えば乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グ
ルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯ
Ｔ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）、アミラーゼ（ＡＭＹ）、クレアチンホスホキナ
ーゼ（ＣＰＫ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）等が挙
げられる。

【００２３】本発明に係る試薬には、酵素、色素形成性
前駆物質、緩衝剤、補酵素、必要に応じて基質が包含さ
れる。

【００２４】これらの試薬は、測定すべき生物学的流体
試料中の特定成分によって適宜選ばれ、例えばＬＤＨを
測定する場合は乳酸、ＧＯＴの場合はアスパラギン酸、
α−ケトグルタル酸およびグルタミン酸脱水素酵素（Ｇ
ｌＤＨ）、ＧＰＴの場合はアラニン、α−ケトグルタル
酸およびグルタミン酸脱水素酵素（ＧｌＤＨ）、ＡＭＹ
の場合はマルトペントース、オルトリン酸、β−ホスフ
ォグルコムターゼ（β−ＰＧＭ）、グルコースオキシダ
ーゼ（ＧＯＤ）およびマルトースホスフォリラーゼ（Ｍ
Ｐ）、ＣＰＫの場合はクレアチン、アデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）およびグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）、ＴＧの場
合はリポプロテインリバーゼ（ＬＰＬ）、グリセロキナ
ーゼ（ＧＫ）、グリセロリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）
およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であり、本発明に
係る試薬層および展開層のいずれに含有されても良い。

【００２５】本発明に係る酸化型補酵素とは、酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ⁺ ）、お
よび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰ⁺ ）等をいう。還元型補酵素とは、前記酸
化型補酵素の還元型をいう。ＮＡＤ⁺ の還元型はＮＡＤ
Ｈで、ＮＡＤＰ⁺ の還元型はＮＡＤＰＨであり、本発明
に係る試薬層および展開層のいずれに含有されても良
い。

【００２６】以下に本発明に係る生物学的流体試料中の
特定成分が介在して、本発明に係る試薬の少なくとも１
種と酸化型補酵素との反応によって、還元型補酵素が生
成される反応式を示す。 ＬＤＨ _LDH 乳酸＋ＮＡＤ⁺ 又はＮＡＤＰ⁺ ──> ピルビン酸＋ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ ＧＯＴ _GOT アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸 ──> オキザロ酢酸＋グルタミン酸 _GlPH グルタミン酸＋ＮＡＤＰ⁺ ──> α−ケトグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＮＨ₃ ＧＰＴ _GPT アラニン＋α−ケトグルタル酸 ──> ピルビン酸＋グルタミン酸 _GlDH グルタミン酸＋ＮＡＤＰ⁺ ──> α−ケトグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＮＨ₃ ＡＭＹ _α-AMY マルトペントース ───> マルトトリオース＋マルトース _MP マルトース＋オルトリン酸 ──> グルコース＋β−Ｄ−グルコース−１− ホスフェート _β-PGM β−Ｄ−グルコース−１−ホスフェート ───> グルコース−６−ホスフェ ート _G-6-PDH グルコース−６−ホスフェート＋ＮＡＤＰ⁺ ────> ６−ホスフォグルコン 酸＋ＮＡＤＰＨ ＣＰＫ _CPK クレアチン＋ＡＴＰ ──> クレアチンリン酸＋ＡＤＰ _HK グルコース＋ＡＴＰ ──> ＡＤＰ＋グルコース−６−リン酸 _G-6-PDH グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ⁺ ────> ６−ホスフォグルコン酸 ＋ＮＡＤＰＨ ＴＧ _LPL ＴＧ ──> グリセリン＋脂肪酸 _GK グリセリン＋ＡＴＰ ──> グリセリン−１−リン酸＋ＡＤＰ _GPDH グリセリン−１−リン酸＋ＮＡＤＰ⁺ ──> ジヒドロキシアセトンリン酸 ＋ＮＡＤＰＨ

【００２７】本発明に用いられる電子伝達剤としては、
Ｎ−メチルフェナジン・メトサルフェート類（例えばＮ
−メチルフェナジン・メトサルフェート、１−メトキシ
−５−メチルフェナジンメトサルフェート等）、メルド
ラブルー、メチレンブルーおよびジアホラーゼなどを使
用することができ、好ましい電子伝達剤としては、Ｎ−
メチルフェナジンメトサルフェート類及びジアホラーゼ
を挙げることができる。

【００２８】一方、本発明に係る色素形成性前駆物質と
しては、テトラゾリウム塩類が通常用いられる。本発明
において用いられる上記テトラゾリウム塩類は、色素形
成後は殆どが水に対して難溶ないしは不溶性になり、通
常ウエット・ケミストリー法では使用が難しいものの、
形成される色素が耐拡散性であり、不所望のリンギング
を防止し、測定の定量性を向上せしめる点で、好ましく
使用することができる。

【００２９】本発明において有用とされる上記テトラゾ
リウム塩としては、例えば３，３′−（３，３′−ジメ
トキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−
ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリ
ド］、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−
ビフェニレン）−ビス［２，５−ジフェニルテトラゾリ
ウムクロリド］、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾ
リル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、
３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−テトラゾリウムクロリド、２，
２′，５，５′−テトラ−（ｐ−ニトロフェニル）−
３，３′−（３−ジメトキシ−４−ジフェニレン）−ジ
テトラゾリウムクロリド、２，３，５−トリフェニルテ
トラゾリウムクロリド、３，３′−（３，３′−ジメト
キシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス−［２，５−ビ
ス（ｐ−ニトロフェニル）テトラゾリウムクロリドおよ
び３，３′−（４，４′−ビフェニレン）−ビス［２，
５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド］等を挙げるこ
とができる。

【００３０】上記テトラゾリウム塩の中で好ましく用い
られるものとしては、３，３′−（３，３′−ジメトキ
シ−４，４′−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−ニト
ロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド］
及び３，３′−（４，４′−ビフェニレン）−ビス
［２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド］を挙げ
ることができ、本発明に係る試薬層に含有させることが
好ましい。

【００３１】本発明に用いられる緩衝剤としては、前記
反応における至適 pＨによって適宜選択される。例え
ば、トリス緩衝剤（トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン及び塩酸トリスヒドロキシメチルアミノメタンの組み
合わせとして知られるもの）、グッドの緩衝剤として知
られるもの、炭酸塩緩衝剤、等が好ましく用いられるこ
とができる。

【００３２】上記緩衝剤は、前述の色素形成性前駆物質
と別異の層に含有することが好ましい。これらは、製造
時及び試料適用時に混合されない状態で、積層されてい
ることはいうまでもない。この為に、上記緩衝剤がバイ
ンダー中に分散されていることが好ましい。

【００３３】本発明に係るバインダーとしては、下記一
般式で示される共重合体（以下「本発明に係る共重合
体」という）を用いることができる。

【００３４】

【化１】 ［式中、Ｒ₁ はメチル基又はエチル基を表わし、ｘ₁ は
２０から９５モルパーセント、ｙ₁ は５から８０モルパ
ーセントを示す。］

【００３５】

【化２】 ［式中、Ｒ₂ は水素原子又はメチル基を表わし、Ｘは置
換又は未置換のフェニル基、シアノ基又は−ＣＯＯＲ₃
基を表わす。Ｒ₃ はメチル基、エチル基、ブチル基を表
わし、ｘ₂ は５０から９５モルパーセント、ｙ₂ は５０
から５モルパーセントを表わす。］

【００３６】以下に本発明に係る共重合体の代表的な具
体例を示すが、これによって本発明が限定されるもので
はない。 例示重合体 （１）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比９５：５） （２）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比８０：２０） （３）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比７０：３０） （４）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比６０：４０） （５）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比５０：５０） （６）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比４０：６０） （７）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比３０：７０） （８）Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体（モ
ル比２０：８０） （９）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共重合
体（モル比９５：５） （10）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共重合
体（モル比９０：１０） （11）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸メチル共重合
体（モル比７５：２５） （12）Ｎ−ビニルピロリドン−メタアクリル酸メチル共
重合体（モル比９０：１０） （13）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸−ｎ−ブチル
共重合体（モル比９０：１０） （14）Ｎ−ビニルピロリドン−アクリロニトリル共重合
体（モル比８５：１５） （15）Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（モル
比９０：１０） （16）Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（モル
比７５：２５） （17）Ｎ−ビニルピロリドン−スチレン共重合体（モル
比５０：５０） 本発明に係る共重合体は、公知の重合法を用いて容易に
得ることができる。

【００３７】上記本発明に係る共重合体を前記緩衝剤と
組み合わせて層にすることにより、例えば保存安定性を
向上させるばかりでなく、発色領域内の呈色の均一度を
向上させ、結果として同時再現性の著しい向上をもたら
すことができる。

【００３８】本発明に係る電子伝達剤および色素形成前
駆物質は、それぞれ、少なくとも１層の試薬層および少
なくとも１層の展開層のうちの何れの層に含有されても
良い。しかし、電子伝達剤がジアホラーゼ以外の場合に
は、流体試料が適用されるまではこれらの電子伝達剤と
色素形成性前駆物質は、不所望の色素を形成することが
ないように互いに反応しない状態で含有されていること
が必要である。従って、ジアホラーゼ以外の電子伝達剤
と色素形成性前駆物質が、少なくとも１層の試薬層およ
び少なくとも１層の展開層のうちの別異の層に含有され
ていることが好ましい。あるいは少なくとも１層の試薬
層および少なくとも１層の展開層のうちの同一の層に含
有される場合においても、これらの電子伝達剤と色素形
成性前駆物質は、それぞれ別々の粒子として含有されて
いることが好ましい。

【００３９】但し、電子伝達剤としてジアホラーゼを用
いる場合にはこの限りではなく、例えばジアホラーゼと
色素形成性前駆物質を同一の層内に含有することが好ま
しい。

【００４０】電子伝達剤と色素形成性前駆物質が別異の
層に含有され、少なくとも１層の試薬層および少なくと
も１層の展開層の何れか１層以上に電子伝達剤を含み、
電子伝達剤を含まない層の何れか１層以上に色素形成性
前駆物質を含有する分析素子においては、電子伝達剤が
展開層の何れか１層に含有され、色素形成性前駆物質が
試薬層に含有されていても良く、その逆の状態で含有さ
れていても良いが、好ましくは前者の状態である。この
場合、電子伝達剤を含む展開層と色素形成性前駆物質を
含む試薬層の間にこれらの電子伝達剤および色素形成性
前駆物質を含まない層が介在していることが、より好ま
しい。

【００４１】ジアホラーゼ以外の電子伝達剤を展開層に
含有する場合、一般的に分散又は溶解によって含有する
ことができるが、電子伝達剤の含有量は極微量の為、分
散を用いた場合十分に均一に展開層中に含有することが
むずかしい。又溶解の場合、製造過程で多層へ移行する
可能性があり、その結果電子伝達剤との共存が好ましく
ない化合物と接触することにより性能の劣化を引き起こ
す可能性がある。この場合、特開昭 57-197466号明細書
に開示された繊維構造展開層が有利に用いることができ
る。即ち、前記電子伝達剤溶液をキシレン等の塗布溶媒
に添加した後、ばらばらの繊維を加え繊維の中に上記電
子伝達剤を含浸し、濾過乾燥したものを用いることで微
量の電子伝達剤を正確に、かつ多層への移行を防止しつ
つ含有することが可能である。

【００４２】電子伝達剤と色素形成性前駆物質を別異の
層に含有させる場合、これらの含有層を設ける方法とし
ては、電子伝達剤または色素形成性前駆物質をバインダ
ー水溶液に溶解させ、更に具体的には水に溶解させた
後、この溶液を水に溶解させたバインダー中に加えて溶
解させたものを塗設する方法が挙げられる。

【００４３】少なくとも１層の試薬層および少なくとも
１層の展開層のうちの同一層に、電子伝達剤と色素形成
性前駆物質が別々の粒子として含有されているとき、こ
れらの電子伝達剤と色素形成性前駆物質の粒径がそれぞ
れ 0.1μ以上となっていることが好ましい。

【００４４】更に電子伝達剤と色素形成性前駆物質が別
異の層に含有されている場合にも、これら電子伝達剤お
よび／または色素形成性前駆物質は粒子状とすることも
できる。

【００４５】電子伝達剤と色素形成性前駆物質を粒子と
して含有する層を設ける方法としては、予め微粉砕した
電子伝達剤と色素形成性前駆物質をそれぞれ有機溶媒中
に懸濁させ、同一の有機溶媒に溶解させたバインダー中
に得られた懸濁物を加えて均一に分散させたものを塗設
する方法、あるいは、電子伝達剤と色素形成性前駆物質
をそれぞれ有機溶媒中に懸濁させて微粉砕し、同一の有
機溶媒に溶解させたバインダー中に加えて均一に分散さ
せたものを塗布する方法、ないしは、電子伝達剤と色素
形成性前駆物質を、バインダーを含む有機溶媒中で微粉
砕した後、均一にしたものを塗設する方法などが挙げら
れる。

【００４６】また展開層が濾紙の如き繊維質多孔物質で
構成される場合は、バインダーを含む有機溶媒中に電子
伝達剤および色素形成性前駆物質を加えた後、多孔質物
質を加えて均一に分散させて塗布する方法が挙げられ
る。

【００４７】本発明に用いられる電子伝達剤を本発明の
分析素子に含有させる量は、前記特定成分の量に応じて
変わるが、ジアホラーゼ以外の電子伝達剤の場合、通常
は１mg／m²〜１g ／m²、好ましくは10〜500mg ／m²であ
る。

【００４８】更に、ジアホラーゼを電子伝達剤として用
いる場合、前記特定成分の量に応じてかわるだけでな
く、ジアホラーゼの由来及び活性値の測定法に応じて変
わる。通常は 100Ｕ／m²〜 100,000Ｕ／m²、好ましくは
500Ｕ／m²〜50,000Ｕ／m²を含有させることができる。

【００４９】また、本発明に係る色素形成性前駆物を本
発明の分析素子に含有させる量は、通常は10mg／m²〜10
g ／m²、好ましくは50mg／m²〜３g ／m²である。更に、
本発明に係る酸化型補酵素を本発明の分析素子に含有さ
せる量は、通常は10mg／m²〜50g ／m²、好ましくは50mg
／m²〜10g ／m²である。

【００５０】前記電子伝達剤を含有する層および色素形
成性前駆物質を含有する層を形成するために用いられる
バインダーは、特に制限されないが親水性コロイド物質
を用いる事が好ましい。例えばゼラチン、及びその誘導
体、ポリアクリルアミド及びその共重合体、ポリメタア
クリルアミド及びその共重合体、ポリヒドロキシ、エチ
ル、アクリレート及びその共重合体、ポリビニルアルコ
ール、アガロース、カルボキシ、メチル、セルロースナ
トリウム塩、ヒドロキシエチル、セルロース等の親水性
セルロース誘導体等が挙げられる。好ましくは、ゼラチ
ン及びその誘導体が上記目的に対して用いられる。層を
形成させる方法は特に制限されない。

【００５１】この様にして構成された本発明の分析素子
は、分析素子のカブリ濃度をはじめとして、作製した素
子の保存安定性が飛躍的に向上し、高い識別能を得るこ
とが可能となった。

【００５２】本発明に係る展開層は、（１）一定容量の
流体試料を、単位面積あたり一定容量を試薬層に均一に
配布する機能を有するものである。その上、更に、特公
昭53-21677号公報に記載された性能、即ち、（２）流体
試料中の分析反応を阻害する物質または要因を除去する
機能、および／または（３）分光光度分析を行なうとき
に支持体を経て透過する測定光を反射するバックグラウ
ンド作用を行なう機能を有するものであれば好ましい。
従って、本発明に係る展開層は、上記（１）の機能のみ
を有する層、（１）に加えて（２）および／または
（３）の機能を併せて有する層の何れかとすることがで
き、あるいは（１）を包含する複数の機能を適宜分離
し、各機能毎に別の層を使用することも可能である。更
に（１）、（２）および（３）の機能のうち、２つの機
能を有する層と、残りの１つの機能を有する層を組み合
わせて使用することもできる。例えば、前述の特公昭53
-21677号公報に記載された二酸化チタンおよび二酢酸セ
ルロースから成るブラッシュポリマーと呼称される非繊
維多孔質媒体の展開層、特開昭56-24576号、同 57-1258
47号および同 57-197466号明細書などに記載された繊維
構造展開層が挙げられる。特に上記繊維構造展開層は、
血球部分も速やかに移送することが可能な素材として特
に有用であり、更に本発明の目的の一つである酵素の如
き巨大分子の展開移送に有用なものである。本発明の分
析素子における展開層の膜厚は、その空隙率によって決
定されるべきであるが、好ましくは約 100〜約 500ミク
ロン、更に好ましくは約 150〜 350ミクロンである。ま
た、空隙率は好ましくは約20〜約85％である。

【００５３】本発明に係る試薬層は、流体試料中の特定
物質が、選択された反応により最終的に電子伝達剤を介
し、色素形成性前駆物質が色素に変化する際、該色素形
成性前駆物質が該試薬層内で色素に変化するか、あるい
は少なくとも色素形成性前駆物質から変化した色素を受
容し、分光学的観測量の変化として検知するための場と
する目的で設けられるものであり、この目的に反しない
限りにおいて種々の試薬類および各種の付加的な添加剤
を含有することが可能である。

【００５４】また他の付加的な添加剤として、例えば保
恒剤、界面活性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加
することが出来る。

【００５５】特に界面活性剤は、流体試料を本発明の素
子に適用した際の浸透速度の調節等有効に用いることが
できる。

【００５６】使用可能な界面活性剤としては、イオン性
（アニオン性またはカチオン性）、非イオン性を問わず
使用することが可能であるが、非イオン性界面活性剤が
有効である。非イオン性界面活性剤の例としては、例え
ば２，５−ジ−ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリ
コール、ｐ−オクチルフェノキシポリエチレングリコー
ル、ｐ−イソノニルフェノキシポリエチレングリコール
等のアルキル置換フェノールのポリアルキレングリコー
ル誘導体、高級脂肪酸のポリアルキレングリコールエス
テルなどが挙げられる。これらの界面活性剤は流体試料
の試薬層への浸透速度を調節し、同時に好ましからざる
「クロマトグラフィ現象」発生を抑制する効果を有す
る。

【００５７】上記界面活性剤は広範に選択された量を用
いることが可能であるが、塗布液の重量に対して25重量
パーセント乃至 0.005重量パーセント、好ましくは15重
量パーセント乃至 0.05 重量パーセント用いることがで
きる。

【００５８】本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透
性の光透過性支持体（以下、本発明に係る支持体と略
す。）は、液体不浸透性で、かつ光透過性であればその
種類を問わないが、例えば酢酸セルロース、ポリエチレ
ンテレフタレート、ポリカーボネートまたはポリスチレ
ンのような種々の重合体材料が、この使用目的に適す
る。更には上記重合体材料のみならず、ガラスの如き無
機材料も同様に用いることが可能である。本発明に係る
支持体の厚さは任意であるが、好ましくは約50〜約250
ミクロンである。また、本発明に係る支持体の観測側の
一側面は、その目的に応じて任意に加工することが可能
である。更に試薬層を積層する側の支持体面に、場合に
よっては光透過性の下塗り層を使用して試薬層と支持体
との接着性を改良することができる。

【００５９】本発明の分析素子は必要に応じて、例えば
米国特許第 3,992,158号記載の反射層、下塗り層、米国
特許第 4,042,335号記載の放射線ブロッキング層、米国
特許第 4,066,403号記載のバリヤー層、米国特許第 4,1
66,093号記載のマイグレーション阻止層、特開昭55-908
59号記載のスカベンジャー層、および米国特許第 4,11
0,079号記載の破壊性ポッド状部材等を任意に組み合せ
て本発明の目的に合わせた任意の構成とすることができ
る。

【００６０】これら分析素子の種々の層は、本発明に係
る支持体上に所望の構成に従い、従来写真工業において
公知のスライドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗
布法等を適宜選択して用い、順次積層することで任意の
厚みの層を塗設することができる。

【００６１】本発明の分析素子を用いて、流体試料中の
特定成分の量を、本発明に係る支持体側から反射スペク
トロフォトメトリーにより初速度法または反応終点法に
従って測定することができる。このようにして得られた
測定値は、予め作成しておいた検量線に当てはめること
で特定成分の量を決定することができる。

【００６２】本発明の分析素子に適用される流体試料の
量は任意に定めることができるが、好ましくは約５μｌ
から約５０μｌであり、更に好ましくは５μｌから２０
μｌである。通常１０μｌの流体試料を適用するのが好
ましい。

【００６３】本発明の分析素子は全血液、血清および血
漿のいずれの分析にも不都合なく用いることができる。
更には尿、リンパ液、髓液等の他の体液も不都合なく用
いられる。全血液を用いる場合には、必要に応じて検出
のための放射線が血球により妨害を受けるのをさけるた
めに、前述の放射線ブロッキング層または他の隠蔽層を
設けることができる。

【００６４】本発明の分析素子に用いられる分析反応
は、その目的により任意に定めることができるが、例え
ば臨床化学の分野に有用であり、特に生物学的液体試
料、すなわち血液（血清、血等を含む）または尿中の成
分の分析に用いられる。

【００６５】以上詳述したように、本発明の分析素子に
よれば、流体試料を適用するまでは、電子伝達剤と色素
形成性前駆物質とが互いに反応し得ない状態で構成層中
に含有せしめることができたので試薬の保存、安定性が
改良され、カブリ濃度が低減し、発色性に優れているだ
けでなく、不均一濃度の発生や、クロマトグラフィ現象
もほとんど見られず、可視光を使用して通常の分光光度
計により、簡便かつ迅速に流体試料、特に生物学的流体
試料中の成分の高精度乾式定量分析に用いることが可能
となり、極めて実用的に有利である。

【００６６】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、これによって本発明の実施態様が限定さ
れるものではない。

【００６７】

【実施例】

実施例−１ 180μm の下引き済の透明なポリエチレンテレフタレー
ト支持体上に、下記表１に示す組成の層を順次塗布して
分析素子を作成した。ただし各層の乾燥膜厚は第１の試
薬層が約２３μm 、第２の試薬層が約１５μm 、展開層
が約 250μm となるようにした。

【００６８】上記本発明の分析素子１〜２および比較の
分析素子１〜３に各種ＧＰＴ活性（２５Ｋ−Ｕ，９８Ｋ
−Ｕ， 323Ｋ−Ｕ）のヒト血清を１０μｌ適下した後、
３７℃にインキュベーションし、滴下後、２分後及び４
分後の反射濃度を反射分光光度計で546nm のフィルター
を通して測定し、この反射濃度の差を算出した。その結
果を表２に示す。

【００６９】

【表１】

【００７０】

【表２】 表２から明らかなように、本発明の分析素子は比較の分
析素子に比べて高感度であることがわかった。

【００７１】実施例−２ 実施例−１と同様にして作成した本発明の分析素子１〜
２および比較の分析素子１〜３に各種ＧＰＴ活性のヒト
血清を１０μｌ滴下した後、３７℃にインキュベーショ
ンし、滴下後、２分後及び４分後のそれぞれの反射濃度
を反射分光光度計で546nm のフィルターを通して測定
し、この反射濃度の差と標準法で測定したヒト血清のＧ
ＰＴ活性値からあらかじめ各素子の即日の検量線を作成
しておいた。

【００７２】次いで実施例−１と同様にして作成した本
発明の分析素子１〜２および比較の分析素子１〜３を、
４０℃、５５％相対湿度で７日間保存した後に、正常値
（２５Ｋ−Ｕ）および異常値（９８Ｋ−Ｕ）のヒト血清
を滴下し、同様の操作を行ない、反射濃度の差を算出し
た後、即日の検量線にあてはめ、活性値に変換し、変動
率を求めた。その結果を表３に示す。

【００７３】

【表３】 表３から明らかなように本発明の分析素子は保存安定性
に優れていることがわかった。

【００７４】以上の結果から、本発明の分析素子は高感
度でかつ保存安定性に優れていることがわかった。

【００７５】

【発明の効果】以上詳しく説明したように、本発明によ
り試薬の安定性および測定精度に優れ、生物学的流体試
料中の特定成分を還元型補酵素を介して簡便に分析する
ための分析素子を提供することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日高 誠司 東京都日野市さくら町１番地 コニカ株式 会社内 (72)発明者 須加尾 政一 東京都日野市さくら町１番地 コニカ株式 会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光透過性かつ液体不浸透性の支持体上に
   試薬層及び多孔性展開層を有し、電子伝達剤であるジア
   ホラーゼ、少なくとも一種の色素形成前駆物質、少なく
   とも一種の酸化型補酵素、少なくとも一種の緩衝剤及び
   前記酸化型補酵素を還元型補酵素に変換しうる少なくと
   も一種の試薬を含有する、液体試料中の特定成分を分析
   する分析素子において、前記色素形成前駆物質と前記ジ
   アホラーゼを同一層内に含有することを特徴とする分析
   素子。