CN107727851A - 一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测hit抗体的系统 - Google Patents

一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测hit抗体的系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测HIT抗体的装置。本发明提供的系统，包括血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物、试纸条和反应检测装置；蓝色乳胶微球的粒径为0.1‑1μm；样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的抗人IgG抗体；检测垫上表面具有C线，C线上附着有人IgG蛋白；样品垫上固定过滤膜；过滤膜孔径为0.1‑1.5μm；反应检测装置包括反应部件和检测部件；检测部件为具有试纸条固定区的基板。采用本发明提供的系统检测HIT抗体，检测过程简单、准确、实用，可实现定性检测。

Description

一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测HIT抗 体的系统
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测HIT抗体的系统。
背景技术
肝素是临床中最常使用的抗凝药物。包括普通肝素、低分子量肝素、类肝素以及其它硫酸氨基葡聚糖等肝素制剂。肝素在使用过程中会产生肝素/血小板因子4复合物抗体(AHPF4抗体，又称HIT抗体)，HIT抗体可引起肝素诱导的血小板减少症(heparin-inducedthrombocytopenia，HIT)。普通肝素治疗引起的HIT的发生率为1％-5％，低分子量肝素的引发率低于普通肝素。约50％的HIT患者会合并发生严重的并发症-血栓形成综合症(HITwith thrombosis syndrome，HITTS)，包括深静脉血栓形成、肺栓塞、动脉血栓形成、外周动脉栓塞、脑卒中、肢体坏疽等。
针对HIT，临床上尚无可靠确诊的方法，目前主要根据临床表现并结合HIT抗体检测而诊断。目前HIT抗体相关的检测方法包括功能性测定(检测抗体激活血小板能力)和免疫性测定(检测抗体的滴度。功能性血小板试验包括血小板凝集试验(PAgT)、肝素诱导血小板聚集试验(HIPA)、14C血清素释放试验(SRA)等。SRA是目前最敏感和特异的检测HIT抗体的实验室方法，但它需要放射性同位素示踪剂，且需要新鲜正常的供体血小板，致使试验操作复杂、耗费时间长。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、膜吸附酶联免疫滤过测定法(ELIFA)、粒胶凝集免疫测定法(PaGIA)和流式细胞仪测定等。上述各个现存的HIT抗体检测技术和方法，均存在诸多缺陷，目前尚缺乏一种实用、简便、快捷的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫凝集和胶体金层析试纸条相结合的用于检测HIT抗体的系统。
本发明提供了一种用于检测HIT抗体的系统，包括血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物、试纸条和反应检测装置；
蓝色乳胶微球的粒径为0.1-1μm；
试纸条包括底板1、样品垫2、胶体金垫3、检测垫4、吸水垫5和过滤膜6；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的抗人IgG抗体；检测垫上表面具有C线7，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有人IgG蛋白；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜，孔径为0.1-1.5μm；
反应检测装置包括反应部件和检测部件；检测部件为具有试纸条固定区8的基板；试纸条固定区与试纸条形状对应，设置有对应试纸条的过滤膜的通孔甲9、用于观察试纸条的检测垫的通孔乙10和用于观察试纸条的C线的通孔丙11；通孔乙位于通孔甲和通孔丙之间；通孔甲上方具有凸出基板平面的环形侧壁；反应部件上具有反应池12和导流槽13；导流槽的一端与反应池连通，另一端开口于检测部件的环形侧壁从而与通孔甲连通；导流槽为倾斜状，与反应池连通的一端高于与通孔甲连通的一端；导流槽与反应池连通的部位设有处于闭合状态的开关14。
过滤膜为圆形。
通孔甲为圆形。
通孔甲的孔径小于过滤膜的直径。
过滤膜直径为1cm。
通孔甲直径为0.9cm。
通孔乙为圆形。
通孔乙直径为0.6cm。
蓝色乳胶微球的粒径为0.3μm。
微孔膜的孔径为0.45μm。
C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为0.5-1.5cm(具体可为1cm)。
通孔乙对应的试纸条中的区域到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为3-4cm。
每厘米C线上附着有0.5μg人IgG蛋白。
每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向；试纸条的宽度为1cm；试纸条的总长度为12cm，其中样品垫的长度为1.5cm，胶体金垫的长度为1.5cm，检测垫的长度为8cm，吸水垫的长度为1cm。
样品垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
胶体金垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
检测垫的材质具体可为硝酸纤维素膜。
吸水垫的材质具体可为吸水纸。
过滤膜的材质为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或者聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，简称PVDF膜)。
底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如软质塑料。
开关具体可为一次性阀门。
本发明还保护一种用于检测HIT抗体的系统，包括血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物和试纸条；
蓝色乳胶微球的粒径为0.1-1μm；
试纸条包括底板1、样品垫2、胶体金垫3、检测垫4、吸水垫5和过滤膜6；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的抗人IgG抗体；检测垫上表面具有C线7，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有人IgG蛋白；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜，孔径为0.1-1.5μm。
过滤膜为圆形。
过滤膜直径为1cm。
蓝色乳胶微球的粒径为0.3μm。
微孔膜的孔径为0.45μm。
C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为0.5-1.5cm(具体可为1cm)。
每厘米C线上附着有0.5μg人IgG蛋白。
每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向；试纸条的宽度为1cm；试纸条的总长度为12cm，其中样品垫的长度为1.5cm，胶体金垫的长度为1.5cm，检测垫的长度为8cm，吸水垫的长度为1cm。
样品垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
胶体金垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
检测垫的材质具体可为硝酸纤维素膜。
吸水垫的材质具体可为吸水纸。
过滤膜的材质为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或者聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，简称PVDF膜)。
底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如软质塑料。
以上任一所述系统中，血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物的制备方法具体如下：
1、取PBS缓冲液(pH7.4、10mM)，加入血小板因子4蛋白并使其浓度为4mg/mL，即为血小板因子4蛋白溶液。
2、取PBS缓冲液(pH7.4、10mM)，加入肝素并使其浓度为1mg/mL，即为肝素溶液。
3、将步骤1制备的血小板因子4蛋白溶液和步骤2制备的肝素溶液等体积混合，然后4℃静置反应10小时。
4、取离心管，加入100μL MES缓冲液(pH5-6、500mM)，然后加入900μL超纯水，然后加入100μL 10％蓝色乳胶微球溶液、230μL 50mg/mL NHS水溶液、100μL52μmol/mL EDAC水溶液，混匀，37℃、120rpm振荡反应30min，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
5、取步骤4得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH5-6、50mM)并混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
6、取步骤5得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH5-6、50mM)并混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
7、取步骤6得到的沉淀，加入100μL MES缓冲液(pH5-6、500mM)，然后加入900μL超纯水，然后加入1mL步骤3得到的溶液，混匀，37℃、120rpm振荡反应2h，然后13000rpm离心20min，收集沉淀。
8、取步骤7得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
9、取步骤8得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
10、取步骤9得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
11、取步骤10得到的沉淀，加入MES缓冲液(pH8、50mM)至体积为1mL，加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，得到复合物致敏蓝色乳胶溶液。复合物致敏蓝色乳胶溶液中，含有血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物。
以上任一所述系统中，胶体金垫的制备方法具体如下：
1、将玻璃纤维膜完全浸没于前处理溶液中，室温静置30分钟，然后干燥处理。
前处理溶液：含6g/100mL蔗糖、1g/100mL海藻糖、0.1g/100mL Tween20、0.5g/100mL BSA，余量为水。
2、取完成步骤1的玻璃纤维膜，在上表面均匀喷施金标抗体溶液(喷施量为：30μL/cm2)，然后干燥处理。
金标抗体溶液的制备方法具体如下：
1、将四氯金酸溶于水，使四氯金酸的浓度为0.01g/100mL，即为四氯金酸溶液。
2、将柠檬酸三钠溶于水，使柠檬酸三钠的浓度为1g/100mL，即为柠檬酸三钠溶液。
3、将步骤1制备的50mL四氯金酸溶液加热至沸腾，然后迅速加入0.5ml步骤2制备的柠檬酸三钠溶液，待颜色稳定后继续煮沸10分钟后自然冷却，即为胶体金溶液。
4、取100mL步骤3制备的胶体金溶液，用1g/100mL K2CO3水溶液调pH至8.2，然后加入2mg兔抗人IgG抗体，采用磁力搅拌器室温搅拌10分钟，然后加入0.5g BSA和1g海藻糖，然后4℃静置反应10小时。
5、完成步骤4后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
重悬液：含0.5g/100mL BSA、1g/100mL海藻糖、0.1g/100mL Tween20，余量为水。
6、完成步骤5后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
7、完成步骤6后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
8、完成步骤7后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入重悬液至体积为5mL，然后加入叠氮钠并使其浓度为0.01g/100mL，即为金标抗体溶液。
以上任一所述系统中，检测垫的制备方法具体如下：
1、采用PBS缓冲液(pH7.4、10mM)为溶剂，使人IgG蛋白的浓度为1mg/mL，得到人IgG蛋白溶液。
2、取步骤1制备的人IgG蛋白溶液，采用划膜仪在硝酸纤维素膜的上表面喷一条C线(C线线宽为1mm；C线线长方向，每厘米C线喷0.5μL人IgG蛋白溶液)。
本发明还保护所述系统的制备方法：包括如下步骤：
(1)将样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫固定在底板上，然后在样品垫上固定过滤膜，得到试纸条；
(2)将步骤(1)得到的试纸条固定于反应检测装置的试纸条固定区，试纸条的上表面与试纸条固定区的下表面相接，得到组件Ⅰ；
(3)将血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物作为组件Ⅱ；
(4)分别独立包装组件Ⅰ和组件Ⅱ，得到系统。
本发明还保护一种用于检测针对抗原甲的抗体的系统，包括抗原甲与有色乳胶微球的偶联物、试纸条和反应检测装置；
试纸条包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫、吸水垫和过滤膜；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的针对抗原乙的抗体；检测垫上表面具有C线，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有抗原乙；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜；微孔膜的孔径大于抗原甲与有色乳胶微球的偶联物，且微孔膜的孔径小于“针对抗原甲的抗体”和“抗原甲与有色乳胶微球的偶联物”的复合物；
反应检测装置包括反应部件和检测部件；检测部件为具有试纸条固定区的基板；试纸条固定区与试纸条形状对应，设置有对应试纸条的过滤膜的通孔甲、用于观察试纸条的检测垫的通孔乙和用于观察试纸条的C线的通孔丙；通孔乙位于通孔甲和通孔丙之间；通孔甲上方具有凸出基板平面的环形侧壁；反应部件上具有反应池和导流槽；导流槽的一端与反应池连通，另一端开口于检测部件的环形侧壁从而与通孔甲连通；导流槽为倾斜状，与反应池连通的一端高于与通孔甲连通的一端；导流槽与反应池连通的部位设有处于闭合状态的开关。
所述有色乳胶微球为蓝色乳胶微球。
所述抗原乙为人IgG蛋白。
所述针对抗原乙的抗体为抗人IgG抗体。
过滤膜为圆形。
通孔甲为圆形。
通孔甲的孔径小于过滤膜的直径。
过滤膜直径为1cm。
通孔甲直径为0.9cm。
通孔乙为圆形。
通孔乙直径为0.6cm。
蓝色乳胶微球的粒径为0.3μm。
微孔膜的孔径为0.45μm。
C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为0.5-1.5cm(具体可为1cm)。
通孔乙对应的试纸条中的区域到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为3-4cm。
每厘米C线上附着有0.5μg人IgG蛋白。
每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向；试纸条的宽度为1cm；试纸条的总长度为12cm，其中样品垫的长度为1.5cm，胶体金垫的长度为1.5cm，检测垫的长度为8cm，吸水垫的长度为1cm。
样品垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
胶体金垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
检测垫的材质具体可为硝酸纤维素膜。
吸水垫的材质具体可为吸水纸。
过滤膜的材质为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或者聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，简称PVDF膜)。
底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如软质塑料。
开关具体可为一次性阀门。
本发明还保护一种用于检测针对抗原甲的抗体的系统，包括抗原甲与有色乳胶微球的偶联物和试纸条；
试纸条包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫、吸水垫和过滤膜；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的针对抗原乙的抗体；检测垫上表面具有C线，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有抗原乙；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜；微孔膜的孔径大于抗原甲与有色乳胶微球的偶联物，且微孔膜的孔径小于“针对抗原甲的抗体”和“抗原甲与有色乳胶微球的偶联物”的复合物。
所述有色乳胶微球为蓝色乳胶微球。
所述抗原乙为人IgG蛋白。
所述针对抗原乙的抗体为抗人IgG抗体。
过滤膜为圆形。
过滤膜直径为1cm。
蓝色乳胶微球的粒径为0.3μm。
微孔膜的孔径为0.45μm。
C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为0.5-1.5cm(具体可为1cm)。
每厘米C线上附着有0.5μg人IgG蛋白。
每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向；试纸条的宽度为1cm；试纸条的总长度为12cm，其中样品垫的长度为1.5cm，胶体金垫的长度为1.5cm，检测垫的长度为8cm，吸水垫的长度为1cm。
样品垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
胶体金垫的材质具体可为玻璃纤维膜。
检测垫的材质具体可为硝酸纤维素膜。
吸水垫的材质具体可为吸水纸。
过滤膜的材质为硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或者聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，简称PVDF膜)。
底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如软质塑料。
以上任一所述抗人IgG抗体具体可为兔抗人IgG抗体。
本发明还保护以上任一所述系统在检测HIT抗体中的应用。
本发明还保护以上任一所述系统在检测针对抗原甲的抗体中的应用。
采用本发明提供的系统检测HIT抗体，检测过程简单、准确、实用，可实现定性检测，本发明为我国临床肝素诱导的血小板减少症以及相关并发症的诊断提供了可靠实用的方法。
附图说明
图1为试纸条的俯视结构示意图。
图2为试纸条轴心的纵剖的结构示意图。
图3为检测部件俯视的结构示意图。
图4为反应检测装置俯视的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
兔抗人IgG抗体：Abcam公司，货号ab216446。人IgG蛋白：北京博尔西公司，货号B1107。血小板因子4蛋白：北京舜雷科技公司，货号C0813。肝素：阿拉丁公司，货号H104201。牛血清白蛋白(BSA)：Solarbio公司，货号A8020。海藻糖：国药集团化学试剂公司，货号63011536。玻璃纤维膜：Ahlstrom公司，货号6613。硝酸纤维素膜：Millipore公司，货号135S。10％蓝色乳胶微球溶液(微球粒径0.3μm)：Magsphere公司，货号CAB300NM。吸水纸：上海金标生物科技有限公司，货号SX42。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，孔径0.45μm)：Merck公司，货号HVLP2932A。
实施例1、组件的制备
一、金标抗体的制备
1、将四氯金酸溶于水，使四氯金酸的浓度为0.01g/100mL，即为四氯金酸溶液。
2、将柠檬酸三钠溶于水，使柠檬酸三钠的浓度为1g/100mL，即为柠檬酸三钠溶液。
3、将步骤1制备的50mL四氯金酸溶液加热至沸腾，然后迅速加入0.5ml步骤2制备的柠檬酸三钠溶液，待颜色稳定后继续煮沸10分钟后自然冷却，即为胶体金溶液。
4、取100mL步骤3制备的胶体金溶液，用1g/100mL K2CO3水溶液调pH至8.2，然后加入2mg兔抗人IgG抗体，采用磁力搅拌器室温搅拌10分钟，然后加入0.5g BSA和1g海藻糖，然后4℃静置反应10小时。
5、完成步骤4后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
重悬液：含0.5g/100mL BSA、1g/100mL海藻糖、0.1g/100mL Tween20，余量为水。
6、完成步骤5后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
7、完成步骤6后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入100mL重悬液并混匀。
8、完成步骤7后，8000rpm离心30min，将管底部暗红色的液相转移到新的离心管中，加入重悬液至体积为5mL，然后加入叠氮钠并使其浓度为0.01g/100mL，即为金标抗体溶液。
二、胶体金垫的制备
本步骤中的干燥处理均为：在含水量为20％以下的环境中37℃静置2小时。
1、将玻璃纤维膜完全浸没于前处理溶液中，室温静置30分钟，然后干燥处理。
前处理溶液：含6g/100mL蔗糖、1g/100mL海藻糖、0.1g/100mL Tween20、0.5g/100mL BSA，余量为水。
2、取完成步骤1的玻璃纤维膜，在上表面均匀喷施步骤一制备的金标抗体溶液(喷施量为：30μL/cm2)，然后干燥处理。
三、检测垫制备
1、采用PBS缓冲液(pH7.4、10mM)为溶剂，使人IgG蛋白的浓度为1mg/mL，得到人IgG蛋白溶液。
2、取步骤1制备的人IgG蛋白溶液，采用划膜仪在硝酸纤维素膜的上表面喷一条C线(C线线宽为1mm；C线线长方向，每厘米C线喷0.5μL人IgG蛋白溶液)。
四、复合物致敏蓝色乳胶的制备
1、取PBS缓冲液(pH7.4、10mM)，加入血小板因子4蛋白并使其浓度为4mg/mL，即为血小板因子4蛋白溶液。
2、取PBS缓冲液(pH7.4、10mM)，加入肝素并使其浓度为1mg/mL，即为肝素溶液。
3、将步骤1制备的血小板因子4蛋白溶液和步骤2制备的肝素溶液等体积混合，然后4℃静置反应10小时。完成本步骤后，液相中得到血小板因子4/肝素复合物。
4、取离心管，加入100μL MES缓冲液(pH5-6、500mM)，然后加入900μL超纯水，然后加入100μL 10％蓝色乳胶微球溶液、230μL 50mg/mL NHS水溶液、100μL52μmol/mL EDAC水溶液，混匀，37℃、120rpm振荡反应30min，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。本步骤的目的是活化蓝色乳胶微球，使其可以在后续操作中实现与血小板因子4/肝素复合物的偶联。
5、取步骤4得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH5-6、50mM)并混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
6、取步骤5得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH5-6、50mM)并混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
7、取步骤6得到的沉淀，加入100μL MES缓冲液(pH5-6、500mM)，然后加入900μL超纯水，然后加入1mL步骤3得到的溶液，混匀，37℃、120rpm振荡反应2h，然后13000rpm离心20min，收集沉淀。
8、取步骤7得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
9、取步骤8得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
10、取步骤9得到的沉淀，加入1mL MES缓冲液(pH8、50mM)，然后加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，混匀，然后13000rpm离心30min，收集沉淀。
11、取步骤10得到的沉淀，加入MES缓冲液(pH8、50mM)至体积为1mL，加入BSA并使至其浓度为1g/100mL，得到复合物致敏蓝色乳胶溶液。复合物致敏蓝色乳胶溶液中，含有血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物。
实施例2、试纸条的制备
试纸条包括底板1、样品垫2、胶体金垫3、检测垫4、吸水垫5和过滤膜6。沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上。
沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为1cm。试纸条的总长度为12cm，其中样品垫的长度为1.5cm，胶体金垫的长度为1.5cm，检测垫的长度为8cm，吸水垫的长度为1cm。
样品垫上表面固定有过滤膜；过滤膜为圆形，直径为1cm。
胶体金垫上均匀附着胶体金标记的兔抗人IgG抗体。每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体(以蛋白量计)。
检测垫上具有质控线，又称C线7。C线与样品流动方向垂直，C线的线宽为1mm、线长为1cm。C线上均匀附着人IgG蛋白。每厘米C线(线长)上附着有0.5μg人IgG蛋白。C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为1cm。
样品垫的材质为玻璃纤维膜。胶体金垫的材质为玻璃纤维膜。检测垫的材质为硝酸纤维素膜。吸水垫的材质为吸水纸。过滤膜的材质为PVDF膜。底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如软质塑料。
试纸条的俯视结构示意图见图1。试纸条轴心的纵剖的结构示意图见图2。
实施例3、反应检测装置的制备
反应检测装置是与实施例2制备的试纸条配套使用的。
反应检测装置包括反应部件和检测部件。
检测部件为具有试纸条固定区8的基板。试纸条固定区与试纸条形状对应，设置有对应试纸条的过滤膜的通孔甲9、用于观察试纸条的检测垫的通孔乙10和用于观察试纸条的C线的通孔丙11。通孔乙位于通孔甲和通孔丙之间。通孔甲上方具有凸出基板平面的环形侧壁。通孔甲为圆形，直径为0.9cm。通孔乙为圆形，直径为0.6cm。通孔丙为圆形、长方形等，只要可以实现观察C线即可。通孔乙对应的试纸条中的区域到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为3-4cm。
反应部件上具有反应池12和导流槽13。导流槽的一端与反应池连通，另一端开口于检测部件的环形侧壁从而与通孔甲连通。导流槽为倾斜状，与反应池连通的一端高于与通孔甲连通的一端。导流槽与反应池连通的部位设有处于闭合状态的开关14。当开关打开时、导流槽与反应池连通，当开关闭合时、导流槽与反应池不连通。开关具体可为一次性阀门。
反应检测装置还包括与反应部件匹配的用于反应部件防尘的外壳。
检测部件俯视的结构示意图见图3。
反应检测装置俯视的结构示意图见图4。
实施例4、系统的制备
将实施例2制备的试纸条粘结固定于实施例3制备的反应检测装置的试纸条固定区，试纸条的上表面与试纸条固定区的下表面相接，作为组件Ⅰ。
实施例1的步骤四制备的复合物致敏蓝色乳胶溶液作为组件Ⅱ。
分别独立包装的组件Ⅰ和组件Ⅱ组成系统。
系统的工作原理：血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物的粒径小于过滤膜的孔径，因此可以通过过滤膜到达样品垫，在吸水垫的吸力作用下，进一步依次泳动通过胶体金垫并到达检测垫，因此可以通过通孔乙在检测垫上观察到蓝色显示；随着样品泳动，胶体金垫上的胶体金标记的兔抗人IgG抗体也到达检测垫，和C线上的人IgG蛋白结合，因此可以通过通孔丙观察到C线显示为红色；如果待测血清中含有HIT抗体，HIT抗体与“血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物”形成复合物，粒径大于过滤膜的孔径，因此不能通过过滤膜到达样品垫，样品垫无蓝色显示。
实施例5、系统的使用方法
1、取待测者的静脉血，分离血清。
2、充分混悬组件Ⅱ，然后取300μL加入组件Ⅰ的反应池中，再加入20μL步骤1得到的血清。
3、将组件Ⅰ剧烈晃动装置8秒(剧烈晃动的同时要保证反应池中的液体不洒出)，然后静置1分钟。
4、将组件Ⅰ放置在水平工作台上，打开开关，10分钟内观察结果。
判读结果的标准见表1。结果判读为阳性，说明待测者静脉血中含HIT抗体。结果判读为阴性，说明待测者静脉血中不含HIT抗体。
表1
检测窗(通孔乙) 质控窗(通孔丙) 结果判读
无蓝色显示 有红色显示 阳性
有蓝色显示 有红色显示 阴性
无蓝色显示 无红色显示 无效
有蓝色显示 无红色显示 无效
实施例6、特异性和敏感性检测
采用实施例4制备的系统，按照实施例5的方法进行操作，检测经SRA验证的阳性血清样本和阴性血清样本。
54份SRA验证为阳性的血清样本中，有4份检测到阴性结果，敏感性(灵敏度)为92.6％。
157份SRA验证为阴性的血清样本中，有2份检测到阳性结果，特异性为98.7％。
实施例7、再现性检测
采用实施例4制备的系统，按照实施例5的方法进行操作。
取5份血清，每份均分为3小份，第1小份和第2小份进行日内检测，第1小份和第3小份进行日间检测，以评估再现性。结果显示，日内再现性和日间再现性均为100％。

Claims (10)

1.一种用于检测HIT抗体的系统，包括血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物、试纸条和反应检测装置；
蓝色乳胶微球的粒径为0.1-1μm；
试纸条包括底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、检测垫(4)、吸水垫(5)和过滤膜(6)；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的抗人IgG抗体；检测垫上表面具有C线(7)，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有人IgG蛋白；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜，孔径为0.1-1.5μm；
反应检测装置包括反应部件和检测部件；检测部件为具有试纸条固定区(8)的基板；试纸条固定区与试纸条形状对应，设置有对应试纸条的过滤膜的通孔甲(9)、用于观察试纸条的检测垫的通孔乙(10)和用于观察试纸条的C线的通孔丙(11)；通孔乙位于通孔甲和通孔丙之间；通孔甲上方具有凸出基板平面的环形侧壁；反应部件上具有反应池(12)和导流槽(13)；导流槽的一端与反应池连通，另一端开口于检测部件的环形侧壁从而与通孔甲连通；导流槽为倾斜状，与反应池连通的一端高于与通孔甲连通的一端；导流槽与反应池连通的部位设有处于闭合状态的开关(14)。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：蓝色乳胶微球的粒径为0.3μm；微孔膜的孔径为0.45μm。
3.如权利要求1或2所述的系统，其特征在于：C线到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为0.5-1.5cm；通孔乙对应的试纸条中的区域到吸水垫与检测垫的边缘线的距离为3-4cm。
4.如权利要求1至3中任一所述的系统，其特征在于：每厘米C线上附着有0.5μg人IgG蛋白；每平方厘米胶体金垫上附着有12μg胶体金标记的兔抗人IgG抗体。
5.一种用于检测HIT抗体的系统，包括血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物和试纸条；
蓝色乳胶微球的粒径为0.1-1μm；
试纸条包括底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、检测垫(4)、吸水垫(5)和过滤膜(6)；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的抗人IgG抗体；检测垫上表面具有C线(7)，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有人IgG蛋白；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜，孔径为0.1-1.5μm。
6.权利要求1至4中任一所述系统的制备方法：包括如下步骤：
(1)将样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫固定在底板上，然后在样品垫上固定过滤膜，得到试纸条；
(2)将步骤(1)得到的试纸条固定于反应检测装置的试纸条固定区，试纸条的上表面与试纸条固定区的下表面相接，得到组件Ⅰ；
(3)将血小板因子4/肝素复合物与蓝色乳胶微球的偶联物作为组件Ⅱ；
(4)分别独立包装组件Ⅰ和组件Ⅱ，得到系统。
7.权利要求权利要求1至5中任一所述系统在检测HIT抗体中的应用。
8.一种用于检测针对抗原甲的抗体的系统，包括抗原甲与有色乳胶微球的偶联物、试纸条和反应检测装置；
试纸条包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫、吸水垫和过滤膜；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的针对抗原乙的抗体；检测垫上表面具有C线，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有抗原乙；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜；微孔膜的孔径大于抗原甲与有色乳胶微球的偶联物，且微孔膜的孔径小于“针对抗原甲的抗体”和“抗原甲与有色乳胶微球的偶联物”的复合物；
反应检测装置包括反应部件和检测部件；检测部件为具有试纸条固定区的基板；试纸条固定区与试纸条形状对应，设置有对应试纸条的过滤膜的通孔甲、用于观察试纸条的检测垫的通孔乙和用于观察试纸条的C线的通孔丙；通孔乙位于通孔甲和通孔丙之间；通孔甲上方具有凸出基板平面的环形侧壁；反应部件上具有反应池和导流槽；导流槽的一端与反应池连通，另一端开口于检测部件的环形侧壁从而与通孔甲连通；导流槽为倾斜状，与反应池连通的一端高于与通孔甲连通的一端；导流槽与反应池连通的部位设有处于闭合状态的开关。
9.一种用于检测针对抗原甲的抗体的系统，包括抗原甲与有色乳胶微球的偶联物和试纸条；
试纸条包括底板、样品垫、胶体金垫、检测垫、吸水垫和过滤膜；沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；胶体金垫上附着有胶体金标记的针对抗原乙的抗体；检测垫上表面具有C线，C线与样品流动方向垂直，C线上附着有抗原乙；样品垫上表面固定过滤膜；过滤膜为微孔膜；微孔膜的孔径大于抗原甲与有色乳胶微球的偶联物，且微孔膜的孔径小于“针对抗原甲的抗体”和“抗原甲与有色乳胶微球的偶联物”的复合物。
10.权利要求8或9所述系统在检测针对抗原甲的抗体中的应用。
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