CN103946686A - 增强免疫测定法中的结合动力学的长刚性间隔物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测样品内的靶分子的装置，其包括用于测量样品内的靶分子的样品容器，第一种颗粒，其中所述第一种颗粒用能够与所述靶分子特异性结合的第一种结合分子功能化，和包含第二种结合分子的表面结构，其中所述表面结构覆盖平坦传感器或存在于第二种颗粒上，其中所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面结构的所述第二种结合分子；其中所述第一种和/或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子间接连接至所述第一种和/或第二种颗粒的颗粒表面和/或平坦传感器表面；其中所述接头分子的长度和一致性这样选择，以便导致所述接头超过60nm的平均延伸长度；并且其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。在进一步方面，本发明涉及检测样品内的靶分子的存在或量的方法。本发明还描述了根据本发明的颗粒用于检测样品内的靶分子的用途。

Description

增强免疫测定法中的结合动力学的长刚性间隔物
技术领域
本发明涉及用于检测样品内的靶分子的装置，其包括用于测量样品内的靶分子的样品容器，第一种颗粒，其中所述第一种颗粒用能够与所述靶分子特异性结合的第一种结合分子功能化，和包含第二种结合分子的表面结构，其中所述表面结构覆盖平坦传感器或存在于第二种颗粒上，其中所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面结构的所述第二种结合分子；其中所述第一种和/或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子间接连接至所述第一种和/或第二种颗粒的颗粒表面和/或平坦传感器表面；其中所述接头分子的长度和一致性这样选择，以便导致所述接头超过60nm的平均延伸长度；并且其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。在进一步方面，本发明涉及检测样品内的靶分子的存在或量的方法。本发明还描述了根据本发明的颗粒用于检测样品内的靶分子的用途。
背景技术
普遍和有效的健康护理的需求使得全世界的体外诊断倾向于集成的随时获取(random-access)和床边(point-of care)方案。这样的方案的实现是迫切的：测试需要为快速、灵敏、定量且精确的。而且，进行测试的平台必须是容易使用且紧凑的。
亲和测定法利用生物分子捕获来自样品的特异性靶分子，并且允许测定其浓度。通常，亲和捕获通过将由捕获分子涂布的纳米颗粒或微粒分散到样品流体内来实现(Luchini等人，2008，Nano Lett.，8(1)，350-361)。通常的基于亲和力的测定法因此用于大量应用中，例如诊断测定法，研究中的生物分子例如蛋白质、肽和核酸检测，从而利用亲和分子例如抗体，其通常特征在于针对特异性生物分子的高结合亲和力。原则上，功能化磁性颗粒吸引至传感器表面，在其中颗粒可以间接地即由于捕获的分析物或直接结合至捕获在表面上印刷的探针例如抗体。结合颗粒数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。通常，在此类生物传感器应用中，颗粒可以使用对在表面上接近的颗粒灵敏的任何技术进行检测，通常此类技术基于光学检测例如散射光或受抑全内反射(FTIR)的检测，如例如Bruls等人，Lab Chip，2009，9.2504-3510中描述的。
WO2008/0833A1公开了用于检测试剂的方法、反应物和仪器。描述了基于常规直接和间接夹心测定法的用于检测样品中的一种或多种目的试剂的测定法形式。
US2004/110220A1公开了用于检测核酸的方法和装置。特别地，检测系统主要基于具有与其连接的寡核苷酸的纳米颗粒(纳米颗粒-寡核苷酸缀合物)。本文描述的寡核苷酸具有与核酸序列的部分互补的部分(识别部分)，以允许与靶核酸杂交。
WO2009/005552A2描述了用于样品中的组分的多价结合和定量捕获的方法和组合物。特别地，描述了常规夹心测定法形式的修饰，以便导致增加表观Kd的多价“亲合力”结合剂。这通过将超过一种抗体或抗原附加至“支架”来实现，所述“支架”可以是主链聚合物例如单链或双链核酸例如PNA、DNA、RNA等。
US2009/148863公开了基于功能化纳米颗粒的检测平台。特别地，纳米颗粒包含适合于与生物部分结合的第一种单层组分，其依次可以适合于与分析物结合。纳米颗粒表面可以进一步包含第二种单层组分，其促成第一种单层组分在表面上的暴露。纳米颗粒经由第一种和第二种单层与捕获分子例如抗体结合，所述捕获分子允许实时单一分子检测。
EP1441217A2描述了通过经由多种手段固定特异性结合成员(SBM)基于直接进入TIR元件或波导装置内的光散射检测。
US2005/0048599公开了在固定基底上的微生物检测。结合基于夹心配置的提供且经由标签结合组分而发生，所述标签结合组分通过对于靶特异性的手段(例如抗体或适体)使标签与靶结合。指示剂组分可通过检测器检测。
然而，现有技术的亲和测定法的重要缺点是下述事实：具有靶分子与表面结合的功能化颗粒的结合仍是非常缓慢、限制速率和无效的。这种缓慢反应的一个原因尤其在于经由小(例如～10nm)靶分子使相对大(例如～500nm)的颗粒与表面结合的困难。不均衡在图3中简述，举例说明靶和颗粒的相对大小。因此，不存在颗粒-靶复合物的许多定向，其导致有效结合。尽管当与表面接触时，颗粒可以旋转，但结合概率仍相当小。
因此存在设计新型颗粒-靶结构的强烈需要，所述颗粒-靶结构能够与表面例如平坦传感器表面和/或颗粒表面有效结合。
发明内容
本发明解决这些需要且提供用于增强颗粒与表面的结合效率的手段。上述目的特别是通过用于检测样品内的靶分子的装置来实现，所述装置包括用于测量样品内的靶分子的样品容器，第一种颗粒，其中所述第一种颗粒用能够与所述靶分子特异性结合的第一种结合分子功能化，和包含第二种结合分子的表面结构，其中所述表面结构覆盖平坦传感器或存在于第二种颗粒上，其中所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面结构的所述第二种结合分子；其中所述第一种和/或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子间接连接至所述第一种和/或第二种颗粒的颗粒表面和/或平坦传感器表面；其中所述接头分子的长度和一致性这样选择，以便导致所述接头超过60nm的平均延伸长度；并且其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
本发明描述了大颗粒与表面的结合概率如何可以通过使靶连接至具有某一长度的颗粒接头分子得到显著增加。令人惊讶的是，可以观察到长且刚性的接头或间隔物分子的提供克服如现有技术中使用的颗粒的结合困难，并且因此允许更有效的结合。
图4举例说明本发明潜在的原理。如果连接点定位进一步远离颗粒，则其中颗粒可以与表面结合的可能定向数目强烈增加。然而，长间隔物分子的使用不一定解决问题。图5举例说明即使使用极长接头，例如PEG分子，分子的柔性也宁可引起导致球状结构的折叠，并且因此引起来自颗粒表面的捕获分子的较小延伸。
不希望与理论结合，观察到的增加结合效率的一种解释是用于将结合分子定位远离颗粒表面的长且刚性的接头分子显著增强使颗粒与表面结合的动力学。本申请的本发明人已认识到所得到的末端至末端距离是分子的平均延伸长度、伸直长度和刚性的函数，并且可以证实这些特征显著促成观察到的增强结合动力学。
在使用500nm链霉抗生物素蛋白涂布的纳米颗粒和刚性dsDNA分子作为多种长度的接头分子的实验中，特别地，可以显示结合颗粒的数目随着dsDNA-接头长度增加(参见图6)。特别地，本发明人可以证实颗粒上的接头分子长度基本上促成在传感器表面上的结合颗粒数目。这些发现及本文详细描述的其他发现已引起改善接头设计的发展。因此，如本文描述的接头体系结构负责增强的结合动力学，因此改善基于纳米颗粒的亲和测定法的速度、功效和精确度。
在本发明的优选实施方案中，第一种和/或第二种颗粒是磁性颗粒。
在进一步优选的实施方案中，所述第一种和/或第二种颗粒的直径是至少约100nm。在进一步优选的实施方案中，如上所述的接头的平均延伸长度是具有至少约100nm的直径的颗粒直径的至少10％。
在另外一个优选实施方案中，所述刚性接头分子具有所述接头分子的伸直长度的至少20％的平均延伸长度。
在本发明的另一个优选实施方案中，第一种结合分子是抗体或其片段、适体、配体或互补核酸。
在本发明的具体实施方案中，所述接头分子的刚性和长度经由接头的均方根末端至末端距离√<R2>进行测定，其中<R2>根据下式描述
<R2>＝2Pl[1-(P/l)(1-e-l/P)]，
其中P是聚合物的持久(persistence)长度，并且1是接头的伸直(contour)长度。
在本发明的优选实施方案中，接头分子是或包含核酸分子或非生物聚合物。在特别优选的实施方案中，接头分子可以选自双链核酸分子例如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。
在另外一个特别优选的实施方案中，双链核酸分子是dsDNA、PNA-DNA双链体或RNA-DNA双链体。
在本发明的最优选实施方案中，接头分子是dsDNA。
在本发明的另一个优选实施方案中，第一种颗粒另外包含直接连接至所述颗粒的表面的排斥表面结构，其中所述排斥表面结构覆盖颗粒的表面，以便导致颗粒的特定净电荷和/或立体排斥，并且其中所述排斥表面结构赋予给所述颗粒朝向所述传感器表面的推送作用。
在本发明的另外一个优选实施方案中，接头分子长于所述排斥表面结构。
在本发明的进一步优选实施方案中，所述排斥表面结构是带电结构。
在特别优选的实施方案中，带电结构是或包含选自下述的分子：核酸例如双链核酸，例如dsDNA、PNA、PNA-DNA双链体、RNA-DNA、水凝胶和聚合物。
在本发明的进一步特别优选的实施方案中，所述排斥表面结构是立体涂层。
在本发明的另一个优选实施方案中，接头分子和/或所述排斥表面结构无法由DNA酶和/或能够切割双链核酸分子的限制性酶切割。
在本发明的另一个优选实施方案中，接头分子进一步包含至少一种短的柔性间隔物。
在另外一个优选实施方案中，短的柔性间隔物包含单链核酸。
在进一步方面，本发明涉及检测样品内的靶分子的存在或量的方法，其包括下述步骤：
(a)使样品和连接至根据本发明的装置中的第一种颗粒的第一种结合分子接触；和
(b)使样品与下述接触：
i)能够连接至平坦表面或第二种颗粒的第二种结合分子，其中第一种结合分子和/或第二种结合分子能够与所述靶分子特异性结合，或
ii)连接至平坦表面或第二种颗粒的靶类似物分子；其中所述靶分子能够干扰第一种结合分子与靶类似物分子的结合；和
(c)借助于第一种结合分子与第二种结合分子的结合，检测与平坦表面或第二种颗粒结合的第一种颗粒数目，
其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
在本发明的进一步优选的实施方案中，施加磁力，使颗粒与所述固体载体或彼此紧密接近，以便促进颗粒聚簇。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述第二种结合分子与平坦表面或第二种颗粒的连接在第二种结合分子与靶分子结合之前或之后发生。
在本发明的另一个优选的实施方案中，结合颗粒的检测经由受抑全内反射(FTIR)或经由在表面附近的来自所述结合颗粒的散射光测量或经由簇形成的光学检测而发生。
在进一步方面，本发明描述了如本文定义的颗粒用于检测样品内的靶分子的用途。
在本发明的特别优选的实施方案中，如本文上文描述的装置、方法或用途背景下提及的靶分子是心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。
附图说明
图1显示FTIR检测的原理。来自光源的光进入药筒，由药筒/流体界面反射且在检测器上成像。如果颗粒存在于在该界面上产生的倏逝场中，则反射光强度下降。
图2显示使用Magnotech技术的夹心免疫测定法。在小图(1)中，涂布有针对靶的一抗的磁性颗粒分散于样品液体中，并且结合靶。在小图(2)中，顶部和底部线圈以脉冲方式致动磁性颗粒，导致与传感器表面的结合，其中二抗可以与结合的靶分子结合。在小图(3)中，未结合的颗粒从传感器表面去除，并且使用倏逝场检测结合颗粒。
图3举例说明夹心在传感器表面和500nm颗粒(未完全展示)之间的10nm靶分子(黑色)的相对大小。左：适当定向以形成键的颗粒；右：未适当定向以形成键的颗粒。
图4举例说明如果连接点(由黑色小圆圈表示)由颗粒进一步延伸，则其中颗粒可以与表面结合的增加定向数目。
图5显示比较经由PEG接头(左)或dsDNA接头(右)连接至表面的抗体延伸的草图，两种接头均具有相同伸直长度。
图6描述显示根据DNA接头长度结合的颗粒数目的曲线图。500nm链霉抗生物素蛋白涂布的颗粒与不同长度的dsDNA一起温育。每种DNA分子含有在DNA分子的一个末端处的一个生物素部分，在分子的另一个末端处的德克萨斯红分子。将含有颗粒和DNA的溶液注入药筒内，并且与传感器表面结合，使用磁吸引涂布有抗德克萨斯红抗体。通过重复记录在短磁性洗涤步骤后已与表面结合的颗粒数目，所述洗涤步骤从表面去除未结合颗粒，测定结合速率(以结合颗粒数目/时间单位表示)。
图7描述显示根据DNA接头长度结合的颗粒数目的曲线图。细节类似于图6，然而，使用具有1000nm直径的颗粒。
图8显示具有接头分子的高表面密度的颗粒。尽管接头分子是相对拉伸的，但高立体阻碍将降低接头移动性。
图9描述接头表面密度对结合动力学的作用。上：测定法形式的草图：涂布有链霉抗生物素蛋白的500nm颗粒(橙色)与单一靶分子结合，所述单一靶分子是在一个末端具有生物素和连接至另一个末端的德克萨斯红分子的dsDNA链(蓝色菱形)，其可用于与涂布有抗德克萨斯红抗体的传感器表面结合。随后，不同量的相同长度的无功能dsDNA(但缺乏德克萨斯红分子)同样与颗粒结合，并且比较颗粒与传感器表面结合的能力。中：使用1999bpdsDNA的颗粒装载实验，展示在装载有无功能DNA后的颗粒结合的相对量，与仅具有1种功能DNA分子的颗粒相比较。下：相同曲线图，但随后使用497bp DNA。
图10显示预装载有经由长刚性接头连接至表面的捕获分子的颗粒。在测定法过程中，靶分子(菱形)与颗粒结合，并且随后与表面结合。
图11描述预装载有直接连接至表面的捕获分子的颗粒。在测定法过程中，靶分子(菱形)与颗粒结合，并且第二种捕获分子识别靶，所述靶连接至长刚性接头。接头的另一个末端连接至识别元件(例如生物素)，其可以与传感器表面上的相容捕获分子(例如链霉抗生物素蛋白)结合。
图12显示通过特异性相互作用(左)或非特异性相互作用(右)与表面结合的颗粒。
图13显示可能接头的设计。
具体实施方式
本发明涉及用于检测样品内的靶分子的手段和方法。尽管本发明将就具体实施方案而言进行描述，但本说明书并不以限制含义加以解释。
在详细描述本发明的示例性实施方案前，给出对于理解本发明重要的定义。
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”和“一种”还包括各自的复数，除非上下文另有明确说明。
在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”指示技术人员理解仍确保所讨论的特点的技术效应的精确度间隔。该术语通常指示与所示数值±20％、优选±15％、更优选±10％、且甚至更优选±5％的偏差。
应当理解术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由……组成”视为术语“由……包含”的优选实施方案。如果在下文中组定义为包含至少某一数目的实施方案，则这还意欲包含优选仅由这些实施方案组成的组。
此外，在说明书和权利要求中的术语“第一种”、“第二种”、“第三种”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等等用于区分相似元件，并且不一定描述顺序或时间次序。应当理解如此使用的术语在适当情况下可互换，并且本文描述的本发明的实施方案能够以与本文描述或举例说明不同的其他顺序操作。
在术语“第一种”、“第二种”、“第三种”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或测定法步骤的情况下，在步骤之间不存在时间或时间间隔相干性，即步骤可以同时执行，或在此类步骤之间可以存在数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，除非在本文上文或下文所述的在本申请中另有说明。
应当理解本发明并不限于本文描述的具体方法、方案、反应物等，因为这些可以改变。还应当理解本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不预期限制本发明的范围，其将仅受所附权利要求限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
如上文已阐述的，在一个方面，本发明涉及用于检测样品内的靶分子的装置，其包括用于测量样品内的靶分子的样品容器，第一种颗粒，其中所述第一种颗粒用能够与所述靶分子特异性结合的第一种结合分子功能化，和包含第二种结合分子的表面结构，其中所述表面结构覆盖平坦传感器或存在于第二种颗粒上，其中所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面结构的所述第二种结合分子；其中所述第一种和/或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子间接连接至所述第一种和/或第二种颗粒的颗粒表面和/或平坦传感器表面；其中所述接头分子的长度和一致性这样选择，以便导致所述接头超过60nm的平均延伸长度；并且其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
由本发明涵盖的是优选使用生物传感器系统用于检测靶分子的合适装置。检测测试样品或样品体积中的分析物存在和/或数量的多种分析程序是本领域已知的。通常，此类检测系统可以是光学检测颗粒，其由合适的结合分子功能化，以便结合目的分析物。分析物的存在或数量可以由与颗粒结合的分析物数目得出结论。分析物的存在或数量还可以由颗粒簇数目得出结论。在本发明的具体实施方案中，包含如本文描述的装置的生物传感器系统可以能够检测如与如本文描述的平坦传感器结合的单一颗粒或颗粒簇的存在，并且通过由磁场发生器生成的磁场致动颗粒。
如本文使用的“磁场发生器”通常包含用于对样品室生成磁场的在如本文描述的光磁装置内的一个或多个磁体，其中所述磁场应将磁性颗粒导向接触表面。磁场通常具有非零梯度，其允许对磁性(二极)颗粒施加磁力。此类磁力磁场发生器的合适例子或包含磁力磁场发生器的合适系统将是本领域技术人员已知的。在本发明的具体实施方案中，磁场发生器可以是如Bruls等人，Lab Chip，2009，9.2504-3510中所述的磁场发生器，或包含在如Ranzoni等人，2011，Nano Lett.，11，2017–2022中所述的系统中或是其的部分。
通常，磁性颗粒可以通过施加磁场进行致动，从而使得可以加速分析程序。在本发明的具体实施方案中，还涵盖由于非特异性结合的颗粒的去除，磁场的使用可以减少本底信号。图2显示颗粒可以如何致动以从如本文描述的平坦传感器中有效去除非特异性结合或未结合的颗粒的一个例子。可以以脉冲方式致动的顶部和底部磁体有效去除未结合的颗粒，从而使得结合的颗粒在传感器表面上检测到。
如在本发明上下文中使用的磁性致动可以不同使用，即将样品中的磁性颗粒排列成链，以便加速颗粒成簇。本发明还涵盖使用磁性致动以振动且旋转颗粒簇用于测定所形成簇的存在和量。在具体实施方案中，颗粒的磁性致动可以如脉冲的发生，即致动场由脉冲中断至少一次。就重复脉冲而言的动态致动已发现减少非特异性相互作用且增强结合事件数目。关于使用基于颗粒簇检测的靶分子检测的进一步细节和参数将是本领域技术人员已知的，或可以衍生自Ranzoni等人，2011，Nano Lett.，11，2017–2022。
适合用于本发明的生物传感器系统可以包括例如包含样品容器的生物传感器药筒、用于感测颗粒的传感器装置、检测系统和任选的磁场发生器。在进一步的实施方案中，该系统可以包括一个或多个另外的功能单位，例如读出系统例如屏幕或打印机、用于数据库或计算机系统的界面、校正单元、与高流通量装置的直接或间接连接性等。由本发明特别涵盖的是用于快速和即时分析的手提式装置，其中可以插入包括测定法形式的药筒。通常，此类装置包括优选以可充电电池形式的电源、显示器、无线连接性例如WLAN用于快速数据库访问、或对实验室信息系统的访问。可以用于本发明的上下文中的示例性生物传感器系统在Bruls等人，Lab Chip，2009，9.2504-3510中描述。
特别优选的是基于在表面附近和在表面上的颗粒的光学检测的感测装置。不限制于其，图1中举例说明包括光源和光检测系统的示例性装置。
如本文使用的“样品”指任何样品，其包括如本文定义的靶分子。此类样品可以例如包括衍生自或包含下述的样品：粪、全血、血清、血浆、泪、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器液、乳房液、乳、初乳、胎盘液、羊水、汗(perspirate)、滑液、腹水、脑脊髓液、胆汁、胃液、房水、玻璃体液、胃肠液、渗出液、漏出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、从免疫应答部位收集的流体、从合并的收集部位收集的流体、支气管灌洗、尿、例如来自所有合适器官(例如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃等)的活组织检查材料、有核细胞样品、与粘膜表面相关的流体、毛发或皮肤。另外，可以使用来自环境来源的样品例如水样品、肉或家禽样品，来自潜在污染来源的样品等。
如本文使用的术语“靶分子”指由结合分子结合的任何分子，并且可以例如是生物物质例如生物分子，优选生物标记、复合物、细胞级分或细胞。优选地，在本发明的上下文内的靶分子是核酸例如DNA或RNA分子，或者寡核苷酸例如DNA或RNA寡核苷酸。甚至更优选的是靶分子例如肽、多肽或蛋白质、蛋白质或多肽片段、或功能蛋白质或多肽结构域、药物分子、小分子或维生素。
靶分子可以直接得自如本文上文描述的样品。在其他情况下，可以对样品实施例如基于标准方案的样品制备技术，包括例如部分纯化，其致使靶分子对结合配偶体即如本文定义的亲和分子更可接近。例如，可以将血样离心，以使包括全细胞或膜的级分与血清分离，可以将粪便样品切片且用生理学可接受的缓冲液和去污剂匀浆化，可以将痰样品液化且分级。此外，抗生素或杀菌剂可以加入样品以防止存在的任何生物体的进一步生长。全细胞还可以去除或可以裂解以释放其内容物。
如本文使用的“样品容器”指由任何合适材料如玻璃、任何透明塑料或半导体制成的容器，在其中测量样品。如本文描述的磁性颗粒可以在样品引入时已存在于样品容器中，连同样品一起引入，或在样品已注入样品容器内之后引入。样品容器可以进一步包括包含第二种结合分子的传感器表面。优选地，传感器表面位于样品容器的底部。在具体实施方案中，样品容器可以位于可交换药筒内，例如在与传感器装置分离的单独部件中。由于样品的可能污染，此类药筒可以优选是一次性使用的物品，例如通过注入塑型由塑料制成。还涵盖的是可循环药筒或可循环药筒部分，例如药筒或药筒部分，其可以进行清洁或灭菌。
如本文使用的“平坦传感器”限定在其上发生或检测到实际传感器事件的区域。通常，平坦传感器位于样品容器的底部。平坦传感器可以作用于检测结合颗粒的数目，其与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。可以用于本发明背景下的此类平坦传感器和相应传感器的例子在Bruls等人，2009，Lab Chip，9，3504-3510中提供。
如本文使用的术语“颗粒”意指物理性质例如体积或质量可以归于其的局限性小物体。在本发明的上下文中，颗粒包含本领域技术人员已知的任何合适材料或由本领域技术人员已知的任何合适材料组成，例如颗粒可以包含无机或有机材料，或由无机或有机材料组成，或基本上由无机或有机材料组成。通常，颗粒可以包含金属或金属合金或有机材料，或者由金属或金属合金或有机材料组成，或者基本上由金属或金属合金或有机材料组成，或者包含碳水化合物元件，或由碳水化合物元件组成，或基本上由碳水化合物元件组成。涵盖材料的例子包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或复合材料。特别优选的是磁性或铁磁金属、合金或组合物。在本发明中有用的特别优选的颗粒是超顺磁性颗粒。如本文使用的术语“超顺磁性”描述磁性形式，其以小铁磁或铁磁纳米颗粒出现。本领域已知在足够小的纳米颗粒中，磁化可以在温度的影响下随机翻转方向。两次翻转之间的时间被称为Néel弛豫时间。在不存在外部磁场的情况下，当用于测量纳米颗粒磁化的时间比Néel弛豫时间长得多时，磁化看起来处于平均零即顺磁状态中。在此类状态中，外部磁场能够磁化类似于顺磁的纳米颗粒。然而，磁化率比顺磁的那些大得多。在进一步优选的实施方案中，材料可以具有特定性质。材料可以例如是磁性或非磁性的。在其他实施方案中，材料可以是疏水或亲水的。在进一步具体实施方案中，颗粒是塑料颗粒。塑料颗粒的例子包括胶乳或聚苯乙烯珠，例如通常用于纯化的那些。在另外一个实施方案中，颗粒可以是细胞样颗粒。如本文使用的术语“细胞样颗粒”指生物学或半生物学结构，其存在于生物系统中或者具有生物系统或生物系统部分的形式和/或功能。细胞样颗粒的优选例子是脂质体。
如本文使用的术语“脂质体”意指例如包含脂质或磷脂膜或层例如双层的囊泡。通常，脂质体是空心结构，其可以充满分子，例如药物分子或药物组合物，并且可以用于将此类分子递送至靶部位，例如癌细胞或受感染区域等。脂质体可以优选是由磷脂构成的复合结构，并且可以含有少量其他分子，例如由天然衍生的磷脂与混合脂质链(如卵磷脂酰乙醇胺)组成或其他表面活性剂组成。脂质体可以在大小中从纳米范围到数十微米不等。在进一步具体实施方案中，颗粒可以包含琼脂糖凝胶或琼脂糖，基本上由琼脂糖凝胶或琼脂糖组成，或由琼脂糖凝胶或琼脂糖组成。
此外，颗粒就其转运和性质而言基本上表现如同整体单元。颗粒可以相应地具有对称、球状、基本上球状或球形形状，或具有不规则、不对称形状或形式。
由本发明涵盖的颗粒大小通常范围为50nm-50μm。优选的是在纳米和高达几微米的微米范围中的颗粒。在进一步优选的实施方案中，颗粒直径大于100nm。如本文使用的术语“直径”指任何直线区段，其经过颗粒中心并且其终点在颗粒表面上。在非球形或半球形颗粒的情况下，直径应理解为最大和最短直线区段的平均直径，所述最大和最短直线区段经过颗粒中心并且其终点在颗粒表面上。进一步理解如本文定义的颗粒半径是其如本文上文定义的直径的一半。特别优选的是纳米颗粒，例如具有下述直径的颗粒：约100nm-10微米，更优选100nm-3μm，甚至更优选300nm-1000nm，例如300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、620nm、650nm、670nm、700nm、720nm、750nm、770nm、800nm、820nm、850nm、870nm、900nm、920nm、950nm、970nm、1000nm或两者之间的任何值。甚至更优选的是具有约500nm直径的纳米颗粒。
优选地，根据本发明的颗粒由第一种结合分子或第二种结合分子功能化。由本发明的具体实施方案涵盖的还是进一步包含如本文描述的带电结构的颗粒。
在特别优选的实施方案中，材料是磁性材料。在进一步特别优选的实施方案中，如本文上文定义的表面结构存在于其上，或根据本发明的第一种或第二种结合分子连接至其上的实体是磁性纳米颗粒。
在本发明的特别优选实施方案中，材料或颗粒例如纳米颗粒可以是超顺磁性颗粒，其通常分散于水溶液中，并且保留小电荷，例如负或正电荷，或具有一定ζ电位以确保胶体稳定性，保持颗粒分离且避免非特异性聚簇。
由本发明涵盖的是至少两类颗粒，即第一种和第二种颗粒。
如本文使用的术语“第一种颗粒”指由第一种结合分子功能化的如本文描述的颗粒。第一种结合分子可以是能够与目的靶分子特异性结合的任何分子。第一种颗粒因此充当捕获颗粒。第一种结合分子可以经由如本文定义的长且刚性的接头分子间接连接至表面。第一种颗粒的表面可以进一步通过另外结构例如如本文描述的带电结构进行修饰。
如本文使用的术语“第二种颗粒”指由第二种结合分子功能化的如本文描述的颗粒。由本发明涵盖的是第二种颗粒包括包含第二种结合分子如本文描述的表面结构。另外由本发明涵盖的是第二种颗粒可以由于靶分子的结合而与第一种颗粒结合。第二种颗粒因此能够经由第二种第二种结合分子的结合而结合靶分子。涵盖的已捕获靶分子的第一种颗粒与第二种颗粒的结合引起颗粒簇的形成，其可以如本文描述的进行检测。颗粒簇的数目随后与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
如本文使用的术语“结合分子”指对于第二种分子即相互作用配偶体具有结合亲和力的任何分子。在本发明的含义中的结合分子通常包含这样的结合或捕获部分，其能够结合如本文定义的特定靶分子例如生物分子或生物标记，或者能够结合含分子的靶实体，例如病毒、或细胞或细胞片段、或由组织衍生的材料。
在特别优选的实施方案中，结合分子选自适体，肽，蛋白质，寡核苷酸特别是互补核酸，和分子印迹聚合物、配体或受体，和凝集素，其中所述结合分子优选是抗体或其片段或互补核酸。
如在结合分子的上下文内使用的“适体”可以是短核酸分子，例如RNA、DNA或PNA分子或本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式，能够与如本文定义的靶分子结合，优选与如本文定义的核酸靶分子结合。此外，本发明涵盖肽适体，即这样的适体，其能够与(a)包含一种或多种特定氨基酸序列的一种或多种蛋白质、一种或多种多肽或一种或多种肽特异性结合。通常，(a)一种或多种肽适体是一种或多种可变肽环，包含例如10–20个氨基酸。在本发明的上下文中，在具体实施方案中，一种或多种肽适体可以在一个或两个末端处连接至支架结构。支架结构可以是任何分子，优选蛋白质例如具有良好可溶性性质的蛋白质。合适的支架分子将是本领域技术人员已知的。待在本发明的上下文中使用的合适支架分子的例子是细菌蛋白质硫氧还蛋白-A。适体肽环可以优选插入支架分子的还原活性部位内。可替代地，葡萄球菌蛋白质A及其结构域和这些结构域的衍生物例如蛋白质Z或脂质运载蛋白可以用作本发明的上下文中的支架结构。核酸或肽适体可以根据本领域技术人员已知的任何合适方法生成，例如经由PCR或分子合成方法或酵母双杂交方法。
“肽”由氨基酸链组成。如在结合分子的上下文内使用的肽可以包含2–35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段，或者可替代地由2–35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段组成。肽可以是线性的、分支的、环状的或其混合物。肽亲和分子还可以连接至如本文上文定义的支架结构。
“蛋白质”是由肽键连接的氨基酸聚合物，其可以包含一条多肽链或通常以生物学功能方式拼凑的超过一条多肽链。如在结合分子的上下文内使用的蛋白质可以包含超过约35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段，或者可替代地超过约35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段组成。蛋白质可以具有线性、分支、环状形式或由这些形式的混合物组成。蛋白质结合分子还可以连接至如本文上文定义的支架结构。
如在结合分子的上下文内使用的“寡核苷酸”可以包含下述或可替代地由下述组成：约5–120个核苷酸的段，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，优选约15-60个核苷酸的段。寡核苷酸结合分子可以优选是RNA、DNA或PNA分子或其混合物。涵盖的是其为互补核酸分子的结合分子。术语“互补核酸分子”指具有限定序列的分子，其中单链彼此互补。本领域已知双链核酸分子的互补链由于碱基配对的形成，具有与彼此的强亲和力。还涵盖的是单链寡核苷酸序列，其连接至或整合到如本文定义的接头分子结构内。在特别优选的实施方案中，此类合适接头还包含核酸分子或由核酸分子组成。单链段能够识别目的互补核苷酸序列，且以高亲和力与目的互补核苷酸序列杂交。在此类分析中，靶分子包含与结合分子互补或几乎互补的寡核苷酸。
如本文使用的术语“分子印迹聚合物”指这样的聚合物，其在其后提取的分子的存在下形成，留下互补腔。通常，分子印迹聚合物显示对于原始分子的一定化学亲和力。分子印迹聚合物可以由本领域技术人员已知的任何合适的聚合单位组成。用于其生产的技术包括聚合技术例如堆积、沉淀、乳化、悬浮、分散、胶凝和多步膨胀聚合。特别优选的是分层印迹方法。
如在结合分子的上下文内使用的“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以具有免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2)或亚类。本发明的抗体可以就它们识别或特异性结合的靶分子(例如本发明的多肽)的一种或多种表位或一个或多个部分而言进行描述或指定。特定表位及其与抗体的相互作用将是本领域技术人员已知的。如本文使用的术语“特异性结合”指抗体与抗原表位的免疫特异性检测和结合。术语“特异性结合”排除非特异性结合，但不一定排除与其他抗原特别是与包含由本文抗体检测的相同抗原表位的抗原的交叉反应性。
抗体可以是多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体，或构成Fab片段、Fab'片段、由Fab表达文库产生的片段、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、小抗体、双抗体、scFv、sc(Fv)2、整体免疫球蛋白分子、小模块免疫药物(SMIP)、结合-结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼科抗体、含VHH抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任何的任何一种或多种表位结合片段。最优选地，抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，并且包括Fab、Fab'和F(ab')2、Fv、单链Fvs(scFv)、sc(Fv)2、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。
根据本发明的抗体可以来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。
根据本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对于靶分子的不同表位是特异性的，例如根据本发明的多肽，或可以对于两种靶分子是特异性的，例如根据本发明的多肽以及异源表位例如异源多肽或固体载体材料。优选的是单特异性抗体。
如本文使用的术语“配体”一般指这样的物质，其与靶分子例如生物分子形成复合物，并且因此可以以高结合亲和力与分子特异性结合。特别地，配体可以是能够与靶蛋白质上的位点结合的信号触发分子。配体通常与被称为受体的结合配偶体结合。用于检测靶分子的受体-配体结合系统是本领域已知的。通常，与受体的配体结合改变化学构象，即受体蛋白质的三维形状。受体蛋白质的构象状态决定受体的功能状态。在本发明的上下文内的合适配体可以包括例如酶底物、酶抑制剂、受体激动剂和抑制剂、激活物例如DNA结合蛋白或神经递质。
如本文使用的术语“凝集素”指能够特异性识别且可逆地结合复杂糖缀合物的碳水化合物部分的蛋白质或糖蛋白，而不改变识别的糖基配体中的任何的共价结构。在本发明的上下文内的合适凝集素的例子包括单价凝集素如细菌和植物毒素，其能够与细胞壁或膜中的糖部分结合。在本发明的意义内的其他合适凝集素是甘露糖结合凝集素、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺(acetylgalactoseamine)结合凝集素、N-乙酰葡糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素或岩藻糖结合凝集素。
如本文使用的术语“第一种结合分子”指能够与样品内的靶分子特异性结合的如本文描述的结合分子。第一种结合分子可以通过任何合适方法或以本领域技术人员已知的任何合适方式，经由如本文描述的长且刚性的接头分子连接至颗粒表面。
如本文使用的术语“连接至颗粒表面或平坦传感器表面”指第一种结合分子或第二种结合分子与颗粒表面的共价或非共价结合或偶联。特别地，此类偶联可以例如是共价结合、范德华结合或层之间的静电结合。与表面的连接可以是可逆的或可以是可终止的，例如通过改变pH、温度、离子浓度、通过用光照明、通过酶促降解或酶促切割等。
应当理解第一种或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子连接至颗粒表面或平坦传感器表面。这应意指第一种和/或第二种结合分子两者均可以与如下文定义的长且刚性的接头分子偶联。本发明涵盖在第一种颗粒和第二种颗粒之间或者在第一种颗粒和平坦传感器表面之间提供一定距离。本领域技术人员应当立即理解为此目的，至少一种结合分子必须与长且刚性的接头偶联，以便提供涵盖的平均延伸长度。例如，如果第一种结合分子与长且刚性的接头分子偶联，则第二种结合分子可以直接连接至第二种颗粒的表面或平坦传感器表面。如果第二种结合分子与长且刚性的接头一起提供，则第一种结合分子可以直接连接至第一种颗粒的表面。还可涵盖第一种和第二种结合分子两者均与长且刚性的接头一起提供，以便建立有利距离。在本发明的上下文内，应当理解应避免如图12(右图)中所示的情况，其中第一种和第二种结合分子两者均不与接头结构一起提供，因为此类排列将导致仅如本文定义的最低限度平均延伸长度，其对于实现涵盖的结合动力学中的增加将是不足够的。
在具体实施方案中，第一种结合分子经由长且刚性的接头分子连接至颗粒表面。在进一步具体的实施方案中，第二种结合分子不经由长且刚性的接头分子连接至颗粒表面。
在本发明的具体实施方案中，第一种和/或第二种结合分子与颗粒例如磁性颗粒或颗粒表面或平坦传感器表面的偶联、结合或连接可以是直接或间接结合。
如本文使用的术语“直接结合”意指第一种结合分子具有与颗粒例如磁性颗粒的直接连接，而无中间、桥接或连接物分子或官能团的存在。
如本文使用的术语“间接结合”意指结合分子不直接连接至颗粒例如磁性颗粒的表面，而是可以经由进一步的中间、桥接或连接物分子例如其他结合分子、接头分子或带电结构间接连接。例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白衍生物、(链霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白关联蛋白质、抗生物素蛋白样实体例如tamavidin1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用作颗粒例如磁性颗粒和包含相容结合部分例如生物素的相互作用分子之间的连接物。
在具体实施方案中，颗粒例如磁性颗粒可以涂布有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白连接物，或者由抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白连接物覆盖。用作连接物分子的相互作用对的进一步优选例子是生物素/抗生物素蛋白、任何抗体/抗原对例如抗FITC、FITC、抗德克萨斯红/德克萨斯红、抗地高辛(digoxygenin)/地高辛和如本文上文提及的核酸互补链。由于几乎无限制的特定组合的高度多路化，由本发明涵盖的特别是核酸互补链的使用。本领域技术人员还应当理解：由核酸序列组成或包含核酸序列的此类连接物分子可以容易地整合到接头结构内。
根据本发明的“表面结构”可以是包含分子的任何结构或者适合于覆盖表面例如平坦传感器表面或颗粒表面的分子网络。涵盖的表面结构因此作用于已捕获目的靶分子的第一种颗粒的识别、结合和后续检测。
如本文使用的“平坦传感器”限定在其上发生或检测到实际传感器事件的区域。通常，平坦传感器位于样品容器的底部。平坦传感器可以作用于检测结合颗粒的数目，其与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。可以用于本发明背景下的此类平坦传感器和相应传感器的例子在Bruls等人，2009，Lab Chip，9，3504-3510中提供。
如本文使用的术语“第二种结合分子”指结合分子，其包含在表面结构内，并且直接或间接连接至如本文描述的平坦传感器表面或如本文描述的第二种颗粒的表面。第二种结合分子可以是与第一种结合分子相同类型的分子或可以是不同分子。在本发明的优选实施方案中，第一种和第二种结合分子是相同类型或种类的分子。在本发明的具体实施方案中，第二种结合分子是抗体或其片段，优选如本文上文定义的抗体。在本发明的特别优选的实施方案中，第二种结合蛋白能够特异性识别且结合样品内的靶分子，然而，在与由第一种结合分子识别的靶分子不同的结合位点或表位处。在进一步优选的实施方案中，第二种结合分子可以是第二种抗体，例如如本文上文定义的抗体，其识别第一种结合分子，例如第一种抗体，其可以是如本文上文定义的抗体。
如本文使用的术语“所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面的所述第二种结合分子”应意指由第一种结合分子功能化的第一种颗粒由于与靶分子的结合而与第二种结合分子结合。相比之下，不由如本文定义的靶分子介导的第一种颗粒与表面结构的任何其他结合视为非特异性结合。
在这个上下文中的“直接结合”因此意指充当捕获分子的第一种结合分子识别且结合靶分子，从而形成捕获复合物，并且其依次由表面结构的第二种结合分子结合且识别。在这点上，“间接结合”意指第一种颗粒经由一种或几种捕获复合物与第二种结合分子结合。还可涵盖几种靶分子–结合分子聚集物或复合物介导第一种颗粒与表面结构的第二种结合分子的间接结合，而结合仍视为特异性的，因为它由靶分子介导。
如本文描述的术语“接头分子”可以是适合于提供第一种结合分子和/或第二种结合分子与表面的连接的任何结构。技术人员将知道用于使接头分子与颗粒表面或平坦传感器表面偶联的手段和方法。根据本发明的进一步具体实施方案，通过提供平坦传感器表面的表面结构与具有足够长的平均延伸的接头分子，可以实现如本文描述的关于增强结合动力学所需的增加的末端至末端距离。
为此目的，表面和/或接头分子可以包含能够使接头与表面偶联的锚定部分。如本文使用的“锚定部分”应理解为在如本文定义的接头分子和表面或直接在颗粒表面上的一种或多种表面分子之间的连接物。特别有关的因此是如本文描述的任何桥接或连接物分子。例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白衍生物、(链霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白关联蛋白质、抗生物素蛋白样实体例如tamavidin1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用于锚定如本文描述的接头分子和表面或表面结构。例如，锚定部分可以包含生物素，而表面涂布有链霉抗生物素蛋白或由链霉抗生物素蛋白功能化。用于使表面涂布有链霉抗生物素蛋白的手段和方法是技术人员已知的，或可以衍生自合适的教科书或文献来源。
适合作为用于锚定的连接物分子的相互作用对的进一步优选例子是生物素/抗生物素蛋白、任何抗体/抗原对例如抗FITC、FITC、抗德克萨斯红/德克萨斯红、抗地高辛/地高辛、如本文上文提及的核酸互补链。由于几乎无限制的特定组合的高度多路化，锚定部分还可以包含核酸互补链。本领域技术人员还应当理解：由核酸序列组成的此类连接物分子可以容易地整合到接头结构内。
另外由本发明涵盖的是包含化学基团或由化学基团组成的锚定部分，所述化学基团可以通过偶联化学共价连接(例如交叉连接)至表面或与表面结合的分子。交叉连接是通过通常被称为生物缀合的共价键化学连接两种或更多种分子的过程。通常，交叉连接反应物(或交联剂)是含有两个或更多个反应末端的分子，其能够或化学连接至蛋白质或其他分子上的特定官能团，例如蛋白质官能团，例如伯胺(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基或羰基(-CHO)，或交联剂反应基团例如碳化二亚胺(例如EDC)、NHS酯、亚氨酸酯、PFP酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰(溴代或碘代)、吡啶基二硫化物、乙烯砜、酰肼、二氮丙啶(diazirine)、芳基叠氮化物或异氰酸酯(isocyantate)。
另外由本发明涵盖的是接头分子具有一定长度，以便充当间隔物分子，即提供结合分子和颗粒表面的一定距离。应当理解此类距离的提供可以提供几个其他优点：
例如，一定距离可以导致颗粒与其他分子和彼此更少的非特异性结合。此外，通常发生的颗粒例如磁性颗粒的非特异性聚簇可以降到最低。
根据本发明的接头分子因此可以具有连接物分子的功能和/或间隔物的功能。为此目的，这些聚合分子优选具有一定长度、强度和/或刚性，以便能够如同聚合纤维起作用。
另外由本发明涵盖的是例如通过二聚化或更高级别的多聚化以纤维装配的聚合物的使用。涵盖的优点是如本文定义的刚性可以得到增加。还涵盖的是“辅助分子”的使用，其帮助建立具有涵盖刚性的更高级别结构，其依次导致涵盖的接头的平均延伸长度。一个涵盖的例子是单链核酸分子，其可以装配成二聚螺旋结构，并且其依次可以与辅助分子装配。其他涵盖的辅助分子的例子是能够结合核酸例如ssDNA、dsDNA或两者(例如DNA结合蛋白)或者ssRNA、dsRNA或两者的蛋白质(例如RNA结合蛋白)。此类因子或蛋白质的结合可以优选由结合蛋白识别的特异性结合基序引导，所述结合基序可以存在于核酸分子例如dsDNA或ssDNA或ssRNA中。一旦此类结合因子在核酸分子上结合，接头的刚性就可以得到增强且引起具有增加的平均延伸长度的接头。此类接头修饰可以在测定法之前或过程中执行。在本发明的进一步具体实施方案中，辅助分子例如RNA或DNA结合蛋白可以包含蛋白质-蛋白质相互作用结构域，例如SH3、PDZ、14-3-3、SH2结构域或本领域技术人员已知的任何其他合适结构域。可以相应地提供包含相容识别结构域或相互作用结构域的次级结合因子，允许包含由辅助分子结合的核酸的复合物装配，所述辅助分子依次可以由次级相互作用分子结合。在进一步的实施方案中，刚性接头结构可以以聚合多肽的形式提供，例如基于胶原或胶原样蛋白质例如Scl1、Scl2、SclA或SclC的形式和/或分子同一性。这些分子可以进一步与如本文定义的其他接头分子或官能团组合。
在本发明的进一步具体实施方案中，聚合接头分子可以是能够在合适条件下自装配的聚合分子。相应地，结合分子可以与颗粒结合提供，引起聚合物在颗粒表面上的装配。自装配可以通过合适参数加以控制，例如聚合所需的单体或聚合单位的浓度、单体或聚合单位的桥接因子的浓度、反应环境的pH、温度、离子的存在、辅助因子例如蛋白质的存在等。在进一步的实施方案中，自装配的聚合物可以在此类合适条件的改变下崩解，例如通过改变pH、降低或增加因子或单体的浓度、改变温度等。
还可涵盖接头分子包含如本文定义的带电结构或由如本文定义的带电结构组成，或者可以整合在如本文描述的立体表面结构中。
在本发明的进一步具体实施方案中，接头分子可以是线性、环状或分支样分子或其混合物。
在本发明的上下文内的合适接头分子可以是例如核酸、核糖核酸、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树枝状聚合物、树状分子(dendrons)、纳米管或其任何合适衍生物或组合。
如本文上文定义的核酸分子可以有利地还用作“核酸接头分子”。这些接头分子可以包含单链和/或双链核酸分子，优选DNA分子，或其任何类型的衍生物。DNA可以例如以例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式，或这些形式的任何混合物。接头分子还可以是PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子，或其任何混合物或组合，或与如本文定义的其他接头分子例如与任何类型的核酸例如DNA或RNA的任何混合物或组合。
术语“PNA”涉及肽核酸，即类似于DNA或RNA的人工合成的聚合物，其用于生物学研究和医学治疗中，但未知天然存在。PNA主链通常由通过肽键连接的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位组成。多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至主链。PNA一般描述为如同肽，具有在第一个(左侧)位置处的N末端和在右侧处的C末端。虽然DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖主链，但PNA-主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位组成。本领域已知PNA寡聚物还显示在与互补DNA结合中的更大特异性。进一步的细节可以衍生自任何合适的文献来源或教科书，例如NielsenPE，Egholm M(1999)，An Introduction to Peptide Nucleic Acid，Curr.IssuesMol.Biol.1(2)：89–104。
术语“CNA”涉及氨基环己基乙酸核酸。此外，该术语涉及环戊烷核酸，即包含例如2'-脱氧卡巴鸟苷的核酸分子。
术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即由标准核碱基和磷酸化的1，5-失水己糖醇主链构建的DNA类似物。
术语“LNA”涉及锁核酸。通常，锁核酸是经修饰的并因此是无法接近的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以用连接2'和4'碳的额外桥进行修饰。此类桥锁定在3'内结构构象中的核糖。被锁定的核糖构象增强碱基堆积和主链的预组构。这可以显著增加热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。
术语“ANA”涉及阿糖核酸或其衍生物。在本发明的上下文中优选的ANA衍生物是2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖核苷(2'F-ANA)。
在本发明的特定实施方案中，核酸接头分子可以以双链或双链体形式存在，即包含由链间的碱基配对结合的核酸分子的链和互补或反平行相反链，或核酸分子的有义或反义链。如本文使用的术语“有义链”指包含序列的分子，所述序列与信使RNA拷贝的那种相同，所述信使RNA拷贝是或可以翻译成蛋白质。在本发明的上下文内的术语另外指包含双链体核酸分子的一条链的分子，所述一条链与其互补相反链不相同。相应地，如本文使用的术语“反义链”指包含就如上定义的有义链而言的互补或相反链的分子。在进一步具体实施方案中，核酸接头分子可以是双链或双链体核糖核酸分子。可替代地，核酸接头分子可以包含单链核酸或单链核糖核酸分子。
在具体实施方案中，接头分子是核糖核酸分子，或核糖核酸与任何其他提及的核酸分子或如本文定义的任何其他接头分子、优选RNA分子或其任何类型的衍生物的任何混合物。RNA可以是以例如p-RNA即吡喃基-RNA的形式或结构上修饰的形式，如发夹RNA或茎环RNA。
核酸包括核糖核酸分子可以具有如本文定义的不同的碱基组成和/或长度。接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是因为如果用作接头，则核酸分子可以为颗粒提供特定净电荷)，任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，核酸接头分子可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电核酸接头分子”涉及约0的分子净电荷。
在本发明的特别优选的实施方案中，接头分子是或包含选自下述的分子：双链或dsDNA、双链或dsRNA、PNA、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。
还由本发明的进一步优选实施方案涵盖的一个有利方面是PNA和PNA/DNA或PNA/DNA双链体无法由核酸酶或蛋白酶容易识别，使得它们对酶促降解抗性。
在本发明的进一步实施方案中，合适的核酸还可以包含具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子，或由具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子组成。单链分子可以例如包含碱基序列的重复，是完全随机的，或衍生自自然界，或仅具有一种碱基例如AAA等、TTT等、CCC等或GGG等；或包含此类单碱基区域的段，例如仅由A和C或C和T组成。
由于其形式、刚性和构象，肽、多肽或蛋白质可以是合适的接头。肽分子接头可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。肽分子接头的长度可以在约3个氨基酸至约35个氨基酸之间改变。还涵盖的是在所示范围内的其他长度或任何长度值。肽接头分子可以例如具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个氨基酸的长度。氨基酸组成可以在单氨基酸组成之间改变，例如天然产生的氨基酸或其任何衍生物或可合成获得的氨基酸中的仅一种，和包含或选自所有已知氨基酸的完全随机的氨基酸组成。还涵盖的是包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个不同氨基酸的组合物。氨基酸可以以相同氨基酸的段存在或以模式或基序的形式提供，或是随机分布的。
在具体实施方案中，肽分子接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是因为如果用作接头，则肽分子可以为颗粒提供特定净电荷)，任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，肽接头分子可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电肽接头分子”涉及约0的分子净电荷。
蛋白质或多肽接头分子可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。蛋白质或多肽分子的长度可以在约35个氨基酸至约500个氨基酸或更多之间改变。还涵盖的是在所示范围内的其他长度或任何长度值。肽分子可以例如具有35、40、50、60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸或更多的长度。
在具体实施方案中，蛋白质或多肽分子接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文上文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是因为如果用作接头，则蛋白质或多肽分子可以为颗粒提供特定净电荷)，任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，多肽或蛋白质接头分子可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电多肽或蛋白质分子”涉及约0的分子净电荷。
由于其形式、刚性和构象，“碳水化合物分子”可以是合适的接头。此类碳水化合物可以具有不同的组成和/或长度。分子的长度可以在约5个C原子至约100个C原子或更多之间改变。还涵盖的是在所示范围内的其他长度或任何长度值。碳水化合物分子可以例如具有5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个C原子或所示值之间的任何其他数目的C原子的长度。
在具体实施方案中，碳水化合物接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是因为如果用作接头，则碳水化合物分子可以为颗粒提供特定净电荷)，任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，碳水化合物接头分子可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电碳水化合物分子”涉及约0的分子净电荷。
由于其形式、刚性和构象，“脂质”可以是合适的接头分子。脂质构成广泛的天然存在的分子组，包括但不限于脂肪、蜡、苯乙烯、脂溶性微生物(例如维生素A、D、E和K)、甘油单酯、甘油二酯、磷脂。此类脂质通常由脂质尾和首基构建。合适脂质的例子包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺。特别优选的是磷脂MPPC、DPPC、DPPE-PEG2000或Liss Rhod PE。脂质可以具有不同的组成和/或长度。分子的长度可以在约5个C原子至约100个C原子或更多之间改变。还涵盖的是在所示范围内的其他长度或任何长度值。脂质分子可以例如具有约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个C原子或所示值之间的任何其他数目的C原子的长度。
在具体实施方案中，脂质接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是因为如果用作接头，则脂质分子可以为颗粒提供特定净电荷)，任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，脂质间隔物分子可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电脂质分子”涉及约0的分子净电荷。
在进一步优选的实施方案中，接头结构还可以包含非生物聚合物或由非生物聚合物组成。如本文使用的术语“非生物聚合物”指这样的聚合物，其并非来自生物来源(生物聚合体)且是化学合成的。为此目的的合适聚合物已在本领域中得到描述(例如由Ratner，B.D.；Hoffman，A.S.；Schoen，F.J.；Lemons，J.E.，Biomaterials Science，第2版；编辑；Elsevier：London，2004)。合适的非生物聚合物的例子是生物可降解的聚合物例如聚(乙醇酸)(PGA)或聚(乳酸)(PLA)、聚(己内酯)(PCL)、聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)(PVP)、聚二噁烷酮(PDS)、或聚(乙二醇)(PEG)或其衍生自两个(或更多个)单体种类的共聚物也称为杂聚物。如本文使用的术语“嵌段聚合物”指包含由共价键连接的两个或更多个均聚物亚基的共聚物。具有两个或三个不同嵌段的嵌段共聚物分别被称为二嵌段共聚物和三嵌段共聚物。优选的嵌段共聚物包括但不限于聚(丙交酯共乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)(PEP-PPO)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)聚(环氧乙烷)(PEP-PPO-PEO)、聚(环氧乙烷)-嵌段聚(L-丙交酯)(PEG-PLLA)、聚(环氧乙烷)-嵌段聚(己交酯)(PEG-PCL)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(α-羟酸)(PEG-PHA)或普流尼克P-105。
由于其形式、潜在刚性和构象，聚乙二醇分子可以特别用作本发明的上下文中的“聚乙二醇接头分子”。由本发明涵盖的聚乙二醇可以具有不同组成和/或长度。优选的聚乙二醇(PEG)变体包括多分散或单分散的PEG分子。特别优选的是单分散的PEG。PEG可以进一步是分支的，例如具有源自中央核心基团的3-10条PGE链，是具有源自中央核心基团的10-100条PGE链的星形PEG，或是具有移植至不同聚合物或线性PEG主链的多重PEG链的梳状PEG。根据PEG的平均分子量，涵盖的PEG可以是PEG10,000、PEG12,000、PEG15,000、PEG20,000或具有更高分子量的PEG。特别优选的是大于PEG10,000的PEG。
更小的PEG分子例如PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG6000或PEG8000也可以用作接头结构的部分，例如与如本文定义的一种或多种接头分子组合。
在具体实施方案中，聚乙二醇接头分子的长度可以取决于下述进行制备：颗粒大小或直径，如本文定义的带电结构分子的存在、大小或长度，或涵盖的颗粒总体特定净电荷(特别是如果使用携带电荷的聚乙二醇分子衍生物)，或任何涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，或任何涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中，聚乙二醇接头分子，特别是其衍生物或其修饰形式，可以是带电或非带电分子。如本文使用的术语“非带电聚乙二醇分子”涉及约0的分子净电荷。
“树枝状聚合物”或“树枝状聚合物接头分子”可以是任何重复分支、大致球形的大分子。此类树枝状聚合物可以具有不同组成和/或长度、和/或支化度。长度可以取决于下述进行制备：涵盖的总体特定净电荷，涵盖的在结合分子和颗粒表面之间的末端至末端距离，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的带电分子数目/颗粒。如由本发明涵盖的树枝状聚合物可以包含低分子量或高分子量种类。根据本发明的树枝状聚合物优选是非带电的，即分子显示净电荷0。
另外由本发明涵盖的是根据本发明的树枝状聚合物作为接头的部分的使用。为此目的，在特定实施方案中，树枝状聚合物可以包含在分子表面上的官能团，例如亲水基团，或可替代地具有内部功能性。如为了本发明的目涵盖的树枝状聚合物可以是第1、2、3、4或更高代的树枝状聚合物。优选的树枝状聚合物包括例如newkome树枝状聚合物或arbolol、和聚酰胺胺(PAMAM)。本领域技术人员应当理解树枝状聚合物引起可以有利地用于在颗粒表面或平坦表面上提供大体积和立体表面结构的结构，其中如本文上文描述的接头分子是此类结构的部分或嵌入其中。待在本发明的上下文内使用的进一步变体以及合成方法等将是技术人员已知的，或可以衍生自合适文件，例如"Dendrimers and other dendritic polymers"，Frechet和Tomalia，J.Wiley。
“树状分子”或“树状分子接头分子”应理解为含有单一可化学寻址的树枝状聚合物基团，即如本文上文定义的树枝状聚合物的焦点。根据本发明的树状分子优选是非带电的，即分子显示净电荷0。在本发明的特定实施方案中，树状分子可以用作如本文定义的接头的部分。
如本文使用的术语“纳米管”指碳纳米管，即具有圆柱状纳米结构的碳同素异形体。此类纳米管可以是单壁纳米管或多壁纳米管。本发明还涵盖不同类型、形式和复杂性的富勒烯结构家族的接头分子，例如球形或椭圆形巴克球(buckyball)形式、巴克球富勒烯、或纳米管与巴克球的组合等。根据本发明的纳米管或本领域技术人员已知的其他接头合适的接头分子优选是非带电的，即分子显示净电荷0。
根据本发明的接头分子优选具有一定长度和一致性，以便能够增加颗粒与表面的结合概率，以导致改善的结合动力学。在现有技术中，接头或间隔物仅考虑用于结合分子与表面的连接和在结合分子的可接近性方面。然而，先前未描述尤其就来自颗粒的最大延伸而言的接头长度。由本发明涵盖的因此是提供具有一定长度的合适接头分子，其适合于延伸如本文定义的结合分子的连接点进一步远离颗粒表面或平坦传感器表面。如图4中可见的，涵盖的方法打开增加数目的其中颗粒可以与表面结合的定向。
另外由本发明涵盖的因此是如本文定义的颗粒，其中捕获或结合分子经由具有如本文定义的一定平均延伸长度的接头分子连接至颗粒表面。在本发明的具体例子中，长且刚性的dsDNA分子作为接头的使用导致结合分子从表面的显著平均延伸。涵盖的方法导致颗粒与如本文定义的平坦传感器或颗粒表面的结合动力学的显著增强。如由图6和7可衍生的，可以证实结合颗粒的数目是接头长度的函数。在这些例子中，500nm和1000nm链霉抗生物素蛋白涂布的颗粒与不同长度的dsDNA接头一起温育。每种dsDNA接头分子含有在一个末端处的一个生物素分子和在另一个末端处的德克萨斯红分子，并且平坦传感器编码涂布有抗德克萨斯红抗体。根据图6和7的曲线图显示随着dsDNA接头分子的长度(bp)增加而增加的结合颗粒数目。对于500nm颗粒大于700bp的最佳长度对应于超过240nm的伸直长度和超过140nm的平均延伸长度。如图7中可见的，最佳接头长度是1000bp，对应于对于更大颗粒(例如1000nm)340nm的伸直长度和约170nm的平均延伸长度。最佳接头长度因此取决于颗粒大小，并且在本发明的特定实施方案中，可以适合于颗粒大小或颗粒直径，例如基于本文下文实施例部分中所述的实验结果。
如本文使用的，术语“平均延伸长度”定义为接头的均方根末端至末端距离√<R2>，其可以根据蠕虫状链模型描述为：
<R2>＝2Pl[1–(P/l)(1-e-l/P)],
其中P是聚合物的持久长度，并且1是接头的伸直长度。
如本文使用的术语“伸直长度”指作为在最大物理可能延伸处的长度的聚合物链的伸直长度。
几种生物学重要的聚合物可以有效地建模为蠕虫状链，包括双链DNA和RNA、非结构化RNA和非结构化多肽。Kratky-Porod蠕虫状链模型适合于建模半柔性聚合物，以便估计末端至末端距离和持久长度。然而，技术人员知道例如如下文描述的众多其他理论模型，以估计末端至末端距离和持久长度。
如本文使用的术语“持久长度，P”指定量聚合物或串的刚度或刚性的基础机械性质，并且定义为超过其在切线方向中的相互关系不成立时的长度。在化学中，它还可以定义为在无限长链中的键i上所有键j≥i的投影平均总和(Flory，Paul J.(1969)，Statistical Mechanics of Chain Molecules，New York：Interscience Publishers)。当角度θ在对位置0(零)的聚合物切线的向量和远离位置0距离L处的切向量之间时，角度余弦的期望值随着距离指数下降，
<cosθ>＝e–(L/P)
其中P是持久长度，并且尖括号指示在所有起始位置上的平均值。柔性聚合物例如PEG可以使用Flory模型(随机游动)进行描述。
持久长度还可以使用弯曲刚度Bs、杨氏模量E和聚合物链的截面进行定义，如Mofrad，M.R.K，"Cytoskeletal mechanics：models and measurements"，Cambridge Univ Press，2006中描述的。
p l = B s k B T
Bs＝EI
在刚性且均匀的杆的情况下，I可以表示为：
I = &pi;a 4 4
其中a是半径。
在高分子科学中，持久长度可以定义为库恩长度的一半，即链可以视为自由连接的假设区段的长度。持久长度等于在无限链长极限中的链末端处的链轮廓的切线上的末端至末端矢量的平均投影。
如图5中可见的，接头分子自身的长度不是为了生成高末端至末端距离的充分标准，即，使结合分子定位远离颗粒表面或平坦传感器表面。图5示例性显示比较经由PEG接头(左)相对于dsDNA接头(右)连接至表面的抗体延伸的草图，两种接头均具有相同伸直长度。在伸直长度方面非常长但仍是柔性的分子或聚合物的使用可以导致分子折叠，并且最终导致具有较小延伸的球状结构。涵盖的因此是来自表面的结合分子的增强延伸或增加的末端至末端距离，其可以通过提供如本文描述的长以及刚性的接头来实现。在如图5中举例说明的例子中，视为如本文定义的刚性的170nm dsDNA分子的平均延伸长度比相同伸直长度的PEG分子的平均延伸长度大10倍。然而，可涵盖还使用具有长伸直长度的非常柔性的接头，条件是所得到的平均延伸足够大以提供涵盖的效应。
由本发明涵盖的还是提供在其下如本文定义的平均延伸长度增加以便导致增强的结合动力学的合适条件。在本发明的特别优选的实施方案中，合适的长且刚性接头的例子是基于双链核酸的分子。例如，由于高刚性，700bp dsDNA接头√<R2>将等于～140nm，1000bp接头将导致约～170nm的√<R2>。
在本发明的具体实施方案中，接头分子可以具有下述平均延伸长度：至少约60nm，优选高达约500nm，优选至少约65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm95nm或100nm，甚至更优选至少约110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm，甚至更优选至少约220nm、250nm、270nm或300nm，最优选至少320nm、350nm、370nm或400nm。在进一步的实施方案中，接头分子的平均延伸长度还可以大于400nm。接头分子还可以具有在所述值之间的任何其他合适的平均延伸长度。
在本发明的具体实施方案中，接头分子的最佳平均延伸长度是如本文描述的颗粒直径的至少1/10，优选至少1/9，优选1/8，更优选至少1/4，且最优选2/3。
在进一步优选的实施方案中，平均延伸长度是如本文描述的颗粒直径的至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％，更优选20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％，甚至更优选30％、31％、32％、34％、35％、36％37％、38％、39％，最优选40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。
在特别优选的实施方案中，具有约500nm直径的颗粒可以包含这样的接头分子，其显示约25-30％，更优选约27％颗粒直径的平均延伸长度。在进一步优选的实施方案中，具有约1000nm直径的颗粒可以包含这样的接头分子，其显示约15-20％，更优选约17％颗粒直径的平均延伸长度。
另外由本发明涵盖的是提供检测条件或检测条件中的改变，例如pH漂移或温度漂移，引起接头分子的构象改变和/或接头分子的刚性特征中的改变。例如，折叠的具有高伸直长度但低刚性的接头分子可以通过涵盖的方法延伸。还可涵盖添加进一步的化合物、组合物、分子、溶剂和/或离子，其可以与接头分子相互作用或反应，以便导致接头分子的刚性增加和如本文上文定义的接头分子的平均延伸增强。
还可涵盖由于增加接头分子的表面密度迫使增加的延伸。应当理解尽管柔性聚合物的平均延伸长度由于球状结构的形成而减少，但在颗粒或平坦传感器表面上的接头分子的密度增加可以导致分子的折叠，从而使得接头分子可以彼此稳定，如图8中可见的。然而，图9中所示的结果证实接头的柔性是促成增强的结合动力学的重要方面。图9中的图表证实结合动力学由于在表面过装载更多dsDNA分子后减少的移动性而减少。涵盖的因此是这样的长且刚性的接头分子，其仍可以保留一定移动性，足以进行接头分子的不同定向，以便取得涵盖的结合动力学增加。接头分子的数目和/或长度可以相应地适合于颗粒性质，特别是颗粒大小。
如本文使用的“刚性”或“刚性的”也称为“刚度”限定固体抵抗变形的性质。应当理解接头分子的刚性基本上促成平均延伸长度。如本文使用的“柔性”因此指可以容易地变形的固体性质。在本发明的背景下，柔性分子、聚合物或接头因此具有如本文定义的低刚性，其可以导致分子的弯曲和折叠。
在本发明的具体实施方案中，接头分子的刚性经由如上定义的接头的均方根末端至末端距离√<R2>进行测定。在特定实施方案中，刚性可以相应地依据与其如本文定义的伸直长度相比较，接头的均方根末端至末端距离或平均延伸长度进行测量。因此，例如，与接头分子的平均延伸长度基本上相同的接头分子的伸直长度指示接头分子的高刚性。另一方面，显著大于所述接头的平均延伸长度的接头分子的伸直长度指示接头分子的低刚性。
在本发明的优选实施方案中，接头分子的刚性和长度这样进行选择，从而使得接头的均方根末端至末端距离√<R2>是就颗粒直径而言的至少约5％、10％或15％，优选约20％、25％或30％、35％，甚至更优选约40％、45％或50％，最优选约55％、60％、65％、70％或75％。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述接头分子的刚性和长度这样进行选择，从而使得接头的均方根末端至末端距离√<R2>是就颗粒直径而言的至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％，更优选20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％，甚至更优选30％、31％、32％、34％、35％、36％37％、38％、39％，最优选40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。
在本发明的特别优选的实施方案中，当表面结构，即颗粒表面和平坦传感器表面两者均包含如本文上文描述的长且刚性的接头时，可以实现灵敏度和结合动力学的更高增加。
另外由本发明涵盖的是接头在靶分子的先前捕获的测定法之前提供给颗粒。图10显示预装载有结合分子的颗粒，所述结合分子经由如本文上文定义的长且刚性的接头分子连接至表面。
在本发明的特别优选的实施方案中，在连接至长接头的第二种结合分子已识别已结合第一种结合分子的靶分子后，形成平坦传感器表面的表面结构。如图11中举例说明的，第二种结合分子连接至接头分子。接头分子的另一个末端包含用于将接头分子锚定至表面的分子。为此目的的示例性分子是例如能够与平坦传感器表面上的链霉抗生物素蛋白结合的生物素。涵盖的这种方法的效应显示于图12中，其中特异性结合可以仅由于第二种结合分子与长接头的结合而发生，引起增加的颗粒和平坦传感器表面的末端至末端距离。
在本发明的进一步优选的实施方案中，如本文定义的第一种和/或第二种颗粒可以进一步包含排斥表面结构。如本文使用的术语“排斥表面结构”指可以直接或间接连接至如本文描述的颗粒表面的结构。在本发明的意义内的排斥表面结构包含能够赋予排斥力的分子、聚合物和/或分子筛。如本文使用的术语“排斥力”指引起分子或颗粒的排斥的力。优选由本发明涵盖的是磁性颗粒的排斥。一般而言，在颗粒间的排斥力可以是颗粒间力例如排除体积排斥、静电排斥、熵力或聚合物覆盖表面间的立体力的结果。术语“排除体积排斥”意指在固体颗粒之间的任何重叠的不可能性，或适用时，在固体颗粒包括存在于颗粒上的表面结构之间的任何重叠的不可能性。当颗粒携带净电荷时，观察到颗粒间的“静电排斥”。如果两种颗粒携带相同净电荷，即正或负电荷，则它们将彼此排斥。术语“熵力”指基于热力学第二定律的力，描述系统进行至其中熵达到最大的状态的趋势。这可以导致固体球例如磁性颗粒之间的有效排斥力。术语“立体排斥力”基于空间效应。应当理解在原子水平上，空间效应起于分子内的每个原子占据一定量空间的事实。如果原子彼此达到接近，则能量中的相关成本由于重叠电子云(Pauli或Born排斥)很高，并且可以影响分子的优选形状或构象和反应性。因此，立体阻碍或空间效应可以视为个别原子的电子云之间的排斥，并且原则上可以定义为原子水平上的静电排斥的结果。
如本文使用的措辞“其中所述排斥表面结构赋予给所述颗粒朝向所述传感器表面的推送作用”意指颗粒的整个总体被朝向传感器表面推送。该总体推送效应基于下述或由下述引起：颗粒的排斥表面结构的静电推送效应，例如两种或更多种颗粒之间的静电推送效应，或颗粒的排斥表面结构的立体推送效应，例如两种或更多种颗粒之间的立体推送效应，或两者的组合，颗粒例如两种或更多种颗粒之间的静电推送效应和立体推送效应。总体推送效应可以例如取决于测定法中的颗粒数目、传感器表面附近的颗粒数目、两种或更多种颗粒的总体电荷、静电相对于立体推送的比例、和本领域技术人员已知的进一步参数。这些参数可以按照如本文所述执行的装置或测定法的实施方案的具体需要和必要性进行调整和/或修饰。
在本发明的进一步优选的实施方案中，如本文上文定义的总体推送效应通过测量表面相互作用的增加进行测定。如本文使用的术语“表面相互作用的增加”指根据本发明由于颗粒例如磁性颗粒间的排斥力，存在于或接近于传感器表面的颗粒量或数目的增加。换言之，表面相互作用的增加因此意指颗粒与传感器表面的相互作用增加。表面相互作用的增加可以经由颗粒与传感器表面紧密接触花费的时间量进行测量。术语“紧密接触”意指颗粒在表面附近或在表面上，以便在与传感器表面足够接近时生成信号，例如光信号，使用适当的测量方法。用于测量在传感器表面附近或在传感器表面上的颗粒的合适方法是技术人员已知的，并且已例如在Bruls等人，Lab Chip，2009，9.2504-3510中描述。
在本发明的优选实施方案中，表面相互作用中的增加通过在测量测定法过程中的信号幅度进行测定。不限制于其，测定表面相互作用增加的一个涵盖例子是经由如本文描述的受抑全内反射(FTIR)的信号幅度测量。所得到的FTIR信号幅度随后对应于在倏逝场中存在的颗粒数目。
表面相互作用的增加由下述进行计算：起因于使用由如本文上文定义的排斥表面结构功能化的颗粒例如磁性颗粒测量的信号幅度，相对于起因于使用非功能化颗粒例如磁性颗粒(即不含任何排斥表面结构的颗粒)测量的信号幅度。例如，如果表面接触的增加提高两倍，即使用由排斥表面结构功能化的磁性颗粒的信号幅度是非功能化颗粒例如磁性颗粒的信号幅度的两倍，则表面相互作用中的增加是100％。
在本发明的优选实施方案中，颗粒和传感器表面之间的表面相互作用的增加可以是至少约1％。表面相互作用的增加可以例如是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％、400％、420％、440％、460％、480％、500％或超过500％。
在本发明的特别优选的实施方案中，排斥表面结构可以是颗粒例如磁性颗粒上存在的带电结构或立体涂层。
如本文使用的“立体涂层”指表面结构，其可以以涂层的形式存在于颗粒上，并且提供颗粒间的排斥。由本发明涵盖的一种重要效应是此类立体涂层的存在将导致增加的颗粒相互排斥，所述排斥依次引起推送力的形成，因此导致颗粒朝向平坦传感器的推送，而无需增加如本领域描述的颗粒浓度(推送效应)。涵盖的方法因此具有颗粒的表面接触随着颗粒的排斥力增加的效应，因此引起增加的反应率和最终在测定法结束时增加的信号改变。
本发明描述了该效应可以如何实现的一种方法，即通过在颗粒表面上提供分子筛，其可以充当立体涂层或障碍，以防止无关分子的非特异性结合，或使其他分子或颗粒处于一定距离。本领域技术人员应当理解具有此类立体涂层，例如以包含分子筛的涂层形式的颗粒可以发挥一定的立体排斥。
在颗粒上的涂层可以是这样的，从而使得它们形成网络或分子筛。因此，根据本发明的涂布层可以由小单元或实体组成，所述小单元或实体具有相同或相似的化学、物理和/或生物性质。优选地，如本文描述的涂布层可以包含能够形成一定长度的聚合物的生物或化学分子。合适的聚合物是例如碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树枝状聚合物、树状分子、纳米管或其混合物。优选地，这些聚合实体包含在接头或间隔物分子中。在本发明的具体实施方案中，涂层可以由单一表面层或多层壳结构组成。
如本文使用的术语“间隔物分子”指主要具有间隔物功能的分子。为此目的，这些聚合分子具有一定长度和强度，以便能够如同聚合纤维起作用。
在本发明的具体实施方案中，间隔物分子可以具有高达约500nm，例如高达约450、400、350、300、250nm、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nm的长度。
在本发明的进一步具体的实施方案中，间隔物分子可以是线性、环状或分支样分子或其混合物。如果它们是分支的，则它们可以以不同程度分支，例如显示2、3、4、4或更多的分层水平。本发明进一步涵盖在网络、层或壳结构内的间隔物分子的不同类型例如线性和分支、不同分支度、不同间隔物长度等的组合。在本发明的可替代实施方案中，间隔物分子或间隔物分子的混合物提供均匀筛或网络，即具有基本上相同大小的开口的平均间隔的筛或网络。还涵盖筛可以与开口一起提供。特别优选如果筛如此均匀，从而使得筛就分子可接近性和分子的运动自由而言的功能性质是均匀的。这些参数可以由间隔物分子的长度、支化度等进行调整。
在进一步优选的实施方案中，接头分子长于表面结构。如本文使用的术语“更长的”意指接头分子的平均延伸长度大于表面结构的平均延伸长度。平均延伸长度中的差异可以是5％、10％、15％、20％、30％、50％、75％、100％、200％、300％、500％、1000％或更多。
在本发明的进一步具体的实施方案中，间隔物分子可以直接或间接互连，以便形成三维分子筛。此类互连可以基于在分子末端处的官能团，或位于分子中心，例如在涵盖分支的情况下。互连、其程度等的控制可以根据本领域技术人员已知的原则和方法实现，所述原则和方法例如来自合格教科书例如"Bioconjugate techniques"，Hermanson，第2版Academic Press，Elsevier或"Dendrimers and other dendritic polymers"Frechet和Tomalia，J.Wiley。
在本发明的上下文内的合适间隔物分子可以例如是如本文定义的碳水化合物、脂质、聚乙二醇(PEG)、多糖、树枝状聚合物、树状分子或纳米管、或其合适衍生物或组合。间隔物分子组可以进一步包含基于烃的表面活性剂、胆固醇、糖脂、胆汁酸、皂苷、脂肪酸、合成两亲嵌段共聚物、天然产物如蛋黄磷脂。
适合于立体涂层的间隔物分子的优选例子是聚乙二醇(PEG)分子。聚乙二醇分子能够在表面上形成致密和体积大的分子筛。技术人员还应当理解PEG分子可以互连，以形成如本文上文描述的合适立体涂层。用于PEG分子互连的合适分子是如本文描述的连接物分子。长度可以根据下述进行制备：涵盖的所得到的涂布层的总体厚度，涵盖的接头分子长度，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的结构分子数目/颗粒。
另外由本发明涵盖的是在颗粒上连接的聚乙二醇分子数目。应当理解连接至颗粒的分子越多，涂布层的密度和厚度越高，引起通过空间效应的颗粒-颗粒排斥。因此应当理解颗粒的立体排斥取决于涂布层的厚度，其取决于磁性颗粒上的PEG分子数目、PEG分子长度和PEG分子之间的键数目。分子数目/颗粒可以是至少约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选至少约100、150、200、250，甚至更优选至少约300、350、400或450，且最优选至少约500或1000。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的如本文上文定义的聚乙二醇分子数目可以改变。在具体实施方案中，每个颗粒的聚乙二醇分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选约100、150、200、250，甚至更优选约300、350、400或450，且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中，每个颗粒的聚乙二醇分子数目可以设为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每个颗粒的聚乙二醇分子数目可以进一步取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、聚乙二醇分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。
在进一步的实施方案中，颗粒由聚乙二醇分子的表面覆盖可以是颗粒的总体表面的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者这些值之间的任何值。
在进一步的实施方案中，如本文定义的立体涂层赋予如本文定义的颗粒半径的至少约105％的根据本发明颗粒的流体力学半径。如本文使用的术语“颗粒的流体力学半径”指在溶液中包含立体涂层的水合颗粒的有效半径，或在溶液中包含立体涂层的颗粒的表观大小。优选地，立体涂层指大量例如所有分子均促成如本文描述的空间效应。如本文定义的包含立体涂层的颗粒的流体力学半径可以是如本文定义的颗粒半径，特别是不包含此类立体涂层的颗粒半径的至少约105％。如本文定义的包含立体涂层的颗粒的流体力学半径可以是如本文定义的颗粒例如磁性颗粒，特别是不包含此类立体涂层的颗粒半径的约105％、110％、120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％或这些值之间的任何值或更多。
在本发明的其他特别优选的实施方案中，颗粒可以包含带电结构，以便生成颗粒间的排斥力。如本文使用的术语“带电结构”指促成根据本发明的颗粒的净电荷的实体。根据本发明的带电结构可以具有可以为正或负的净电荷。应当理解带电结构并不限于特定类型或形式的分子。带电结构可以例如包含一个类型的分子或者两个或更多个不同类型的分子的聚合物，不同分子或实体的复合物，或包含具有不同电荷的几种分子的化合物，例如不同正电荷、不同负电荷、或(不同)正和负电荷，导致正或负电荷总体净电荷。用于电荷计算的工具和方法是技术人员已知的，例如来自Dewar，M.J.S.，The Molecular Orbital Theory of Organic Chemistry，McGraw-Hill，and Inc.，1969；或Stewart，R.，The Proton：Applications to Organic Chemistry，Academic Press，Inc.，1985，72。
在本发明的具体实施方案中，带电结构可以直接或间接连接至颗粒，以便导致颗粒的特定净电荷。特定净电荷可以是正或负的。还可涵盖不同带电结构连接至相同颗粒上，以导致带电结构的混合物。在本发明的上下文内，带电结构可以覆盖颗粒表面，一般提供具有特定净电荷的总体带电分子。本领域技术人员已知纳米颗粒的净电荷可以例如经由测量ζ电位进行测定。
一个涵盖的优点是由于颗粒优选磁性颗粒上增加的电荷的存在而增加的排斥引起增加的静电排斥，其依次使颗粒的非特异性聚簇降到最低。非特异性聚簇的减少可以帮助减少本底水平，而无需使用表面活性剂，因此引起如本文描述的光磁检测测定法中的空白水平的改善，并且因此改善检测限度。由本发明涵盖的另一个重要效应是在颗粒上增加的电荷(负或正电荷)的存在，将导致增加的颗粒相互静电排斥，其依次引起静电“推送”力的形成，因此导致颗粒朝向平坦传感器的推送，而无需如本领域描述的增加颗粒浓度。涵盖的方法具有颗粒的表面接触可以随着颗粒电荷增加的效应，因此引起增加的反应速率和最终在测定法结束时增加的信号改变。
在进一步优选的实施方案中，通过提供包含带电结构或由带电结构组成的如本文描述的接头分子，或通过提供连接至颗粒的带电结构加上接头分子，可以实现在颗粒上增加的电荷存在。
在本发明的具体实施方案中，带电结构可以覆盖颗粒的整个表面，以便提供具有特定净电荷的总体带电分子。在可替代的实施方案中，带电结构可以仅覆盖颗粒的部分、区域或扇区，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或更少的颗粒总表面，或这些值之间的任何值。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的带电结构分子数目可以例如按照涵盖的颗粒总体净电荷加以改变。应当理解颗粒的总体净电荷改变，例如随着连接至颗粒的带电分子数目而增加或减少。ζ电位(mV)可以相应地随着增加的颗粒量以及增加的分子长度而增加(负)。因此可涵盖颗粒上存在的电荷总和促成总体净电荷。进一步理解颗粒的总体净电荷尤其是磁性颗粒上存在的分子数目和分子长度、其正或负电荷等的函数。在具体实施方案中，每个颗粒的带电结构分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每个颗粒的带电结构分子数目可以是不同的或取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电结构分子的分子或化学同一性、涵盖的用途例如测定法或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。
为了获得如本文描述的该静电推送效应的合适带电结构可以包含能够促成特定净电荷的生物或化学结构或化合物，例如核酸、核糖核酸、肽、多肽或蛋白质、碳水化合物、脂质、或多糖、或其任何合适的衍生物或组合。还涵盖的是水凝胶和聚合带电结构。优选的是基于核酸的带电结构分子的使用。
“基于核酸的带电结构分子”可以是任何核酸分子、或其衍生物或类似物。此类带电结构分子可以例如包含单链和/或双链DNA或RNA分子、或其任何类型的衍生物。此类带电结构分子可以进一步包含下述或由下述组成：如本文上文定义的PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子，或其任何混合物或组合，例如DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA和ANA中的任何一种的组合，或LNA核苷酸与DNA或RNA碱基的混合物，或具有如本文定义的任何其他带电结构分子的任何混合物或组合。在基于核酸的带电结构的上下文中，核酸或其类似物可以另外与携带电荷的化学基团或单位一起提供。例如，可以包括或添加磷酸基、带电氮衍生物或带电硫衍生物。此外，可以通过提供其中至少一种分子包含电荷的双链体分子，例如包含DNA的双链体来积累电荷。
在本发明的特别优选的实施方案中，颗粒例如磁性颗粒可以由可以具有不同长度的带电结构进行功能化，所述带电结构例如单链或双链核酸特别是dsDNA。颗粒上的电荷可以相应地由于其ζ电位进行测量。由本发明涵盖的是颗粒的表面接触随着颗粒的电荷而增加，因此引起增加的反应速率和最终在测定法结束时增加的信号改变。在本发明的特定实施方案中，带电结构例如核酸可以以双链或双链体形式存在，即包含由链间的碱基配对结合的核酸分子的链和互补或反平行相反链，或核酸分子的有义或反义链。可替代地，带电结构可以包含单链核酸或单链核糖核酸分子。
在本发明的特别优选的实施方案中，带电结构包含选自下述的分子：双链或dsDNA、双链或dsRNA、PNA、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。还由本发明的进一步优选实施方案涵盖的一个有利方面是PNA和PNA/DNA或PNA/DNA双链体无法由核酸酶或蛋白酶容易识别，使得它们对酶促降解抗性。
在本发明的进一步实施方案中，合适的基于核酸的带电结构分子还可以包含具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子，或由具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子组成。单链分子可以例如包含碱基序列的重复，是完全随机的，或衍生自自然界，或仅具有一种碱基。
如本文上文定义的基于核酸的带电结构分子或其组合可以具有不同的碱基组成和/或长度。分子的长度可以在约5个核苷酸至约5000个氨基酸之间改变，优选约50个核苷酸至约3000个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸至约2000个核苷酸，最优选约400个核苷酸至约1000个核苷酸。还涵盖的是在所示范围内的其他长度或任何长度值。该分子可以例如具有约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000个核苷酸或更多，或所述值之间的任何数目的核苷酸的长度。
基于核酸的带电结构分子的长度可以取决于下述进行制备：涵盖的总体特定净电荷，涵盖的接头分子长度，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的带电结构分子数目/颗粒。用于计算净电荷的合适方法将是本领域技术人员已知的，或可以衍生自合适的文献来源。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的如本文上文定义的基于核酸的带电结构分子数目可以例如按照涵盖的颗粒总体净电荷加以改变。应当理解颗粒的总体净电荷改变，例如随着连接至颗粒的基于核酸的带电结构分子数目而增加或减少。在具体实施方案中，每个颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选约100、150、200、250，甚至更优选约300、350、400或450，且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中，每个颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以设为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000或150000。每个颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以进一步取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、基于核酸的带电结构分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中，颗粒由基于核酸的带电结构分子的表面覆盖可以是颗粒的总体表面的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者这些值之间的任何值。
由于在氨基酸内的带电实体的存在，例如如本文上文定义的肽分子、多肽分子或蛋白质分子还可以是或包含合适的带电结构。本领域描述在氨基酸中发现的胺和羧酸官能团允许其具有两性性质。羧酸基团(-CO2H)可以去质子化，以变成负羧酸盐(-CO2 -)，并且α-氨基(NH2-)可以质子化，以变成正α-铵基(+NH3-)。技术人员还了解在大于羧酸基团的pKa的pH值时，负羧酸盐离子占优势。在低于α-铵基的pKa的pH值时，氮占优势地质子化为带正电的α-铵基。技术人员进一步知道氨基酸的净电荷取决于pH和pKa值的事实。计算氨基酸、肽、多肽或蛋白质的净电荷的工具和方法将是本领域技术人员已知的，或可以衍生自合适的文献来源例如ComputepI/Mw工具，其允许计算UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot或TrEMBL)条目列表或用户输入序列(Gasteiger E.等人；Protein Identification and AnalysisTools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(编辑)：The ProteomicsProtocols Handbook，Humana Press(2005)的理论pI(等电点)和Mw(分子量)。此类肽、多肽或蛋白质带电结构可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。长度可以取决于下述进行制备：涵盖的总体特定净电荷，涵盖的接头分子长度，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的带电结构分子数目/颗粒。应当理解颗粒的总体净电荷是颗粒例如磁性颗粒上的蛋白质或肽分子数目和分子长度的函数。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的如本文上文定义的带电肽、多肽或蛋白质分子数目可以例如按照涵盖的颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中，每个颗粒的带电肽、多肽或蛋白质分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选约100、150、200、250，甚至更优选约300、350、400或450，且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中，每个颗粒的带电肽、多肽或蛋白质分子数目可以设为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每个颗粒的带电肽、多肽或蛋白质分子数目可以进一步取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电多肽或蛋白质分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中，颗粒由带电肽、多肽或蛋白质分子的表面覆盖可以是颗粒的总体表面的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者这些值之间的任何值。
在进一步的实施方案中，带电结构还可以是或包含例如如本文上文定义的碳水化合物分子，其包含能够促成在颗粒上的总体净电荷的带电实体。此类碳水化合物可以具有不同的组成和/或长度。长度可以取决于下述进行制备：涵盖的总体特定净电荷，涵盖的接头分子长度，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的带电结构分子数目/颗粒。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的如本文上文定义的带电碳水化合物分子数目可以例如按照涵盖的颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中，每个颗粒的带电碳水化合物分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选约100、150、200、250，甚至更优选约300、350、400或450，且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中，每个颗粒的带电碳水化合物分子数目可以设为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每个颗粒的带电碳水化合物分子数目可以进一步取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电碳水化合物分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中，颗粒由带电碳水化合物分子的表面覆盖可以是颗粒的总体表面的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者这些值之间的任何值。
合适的带电结构可以进一步是例如如本文上文定义的任何脂质分子，其包含能够促成在颗粒上的总体净电荷的带电实体。脂质尤其是磷脂中的电荷通常由首基的电荷决定。能够赋予脂质分子净电荷的合适首基的优选例子是选自下述的首基：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)或其任何组合。
此类脂质可以具有不同的组成和/或长度。长度可以取决于下述进行制备：涵盖的总体特定净电荷，涵盖的接头分子长度，涵盖的接头分子的柔性、刚性或稳定性，和/或涵盖的带电结构分子数目/颗粒。
在本发明的进一步实施方案中，连接至颗粒的如本文上文定义的带电脂质分子数目可以例如按照涵盖的颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中，每个颗粒的带电脂质分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90，更优选约100、150、200、250，甚至更优选约300、350、400或450，且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中，每个颗粒的带电脂质分子数目可以设为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每个颗粒的带电脂质分子数目可以进一步取决于下述进行制备：颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电脂质分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中，颗粒由带电脂质分子的表面覆盖可以是颗粒的总体表面的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或者这些值之间的任何值。
包含带电结构的“水凝胶”指聚合物链的三维网络，其是亲水的，有时作为其中水是分散介质的胶体凝胶发现。通常，水凝胶是高度吸收的，即它们可以含有超过99.9％水、天然或合成聚合物，并且能够保留大量水伴随网络结构的保存。由于其显著的含水量，水凝胶还可以具有非常类似于天然组织的灵活度。因为高含水量，水凝胶一般视为生物相容性材料，其使得它们特别有利于生物医学和药物应用。水凝胶的常见成分可以包含例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、具有丰富亲水基团的丙烯酸盐聚合物和丙烯酸盐共聚物。还涵盖的是天然水凝胶材料例如包括琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸及其他天然衍生的聚合物的材料。进一步优选水凝胶另外包含下述、包含下述或由下述组成：带电元件例如带电聚合物或任何其他带电分子或部分，其可以用作颗粒表面的带电涂层。均质水凝胶结构可以有利地促成颗粒的总体净电荷，引起颗粒的静电排斥。在具体实施方案中，接头分子及涂层或表面结构的其他组分可以嵌入含水水凝胶构架系统内，其可以进一步提供一定的分子稳定性。技术人员将了解如何选择合适的带电聚合物，以便获得具有总体净电荷的水凝胶。另外，用于产生合适水凝胶且将这些连接在颗粒表面上的手段和方法将是本领域已知的。如本文上文描述的水凝胶还可以包含如本文描述的聚合带电分子。
在进一步的实施方案中，带电结构还可以是“聚合带电分子”。如本文使用的术语“聚合带电分子”或“带电聚合物”指包含选自带负电或带正电重复单位的多个重复单位的聚合物或共聚物。此类聚合物或共聚物因此作为聚电解质工作。应当理解电荷可以衍生自在重复单位内带负电或带正电的基团。特别优选的是选自下述的带正电的基团：季铵基团、伯胺基团、仲胺基团、叔胺基团、季磷基团、叔磷基团、酰胺基、杂芳香族氮基团和锍基团。
所得到的带正电的聚合物也称为阳离子聚合物。聚合带电分子的正电荷可以有利地防止卷曲聚合物的形成。这允许其更多促成其拉伸状态中的粘度，因为伸长的聚合物占据更多空间。
优选的带负电的聚合物包括但不限于硫酸酯基团、羧酸酯基团、磷酸酯基团、砜基团、硫化物基团、二硫化物基团、原酸酯基团、酐基团和β-酮砜基团或其任何组合。
聚电解质已用于形成称为聚电解质多层(PEM)的新型材料。这些薄膜使用逐层(LbL)沉积技术进行构建。在LbL沉积过程中，合适的生长基底(通常为带电的)在带正电和带负电的聚电解质溶液的稀释浴之间来回浸渍。在每次浸渍过程中，吸收少量聚电解质，并且表面电荷逆转，允许聚阳离子-聚阴离子层的静电交联薄膜的逐步和控制叠加。应当理解此类聚电解质多层适合于提供具有总体正或负净电荷的本发明的颗粒。
在本发明的特别优选的实施方案中，如本文定义的接头分子和/或如本文定义的排斥表面结构无法由DNA酶切割。在本发明的进一步具体的实施方案中，如本文定义的接头分子和/或如本文定义的排斥表面结构无法由RNA酶切割。另外或可替代地，如本文定义的接头分子和/或如本文定义的排斥表面结构可能无法由能够切割双链核酸分子的限制性酶切割。通过提供不代表DNA酶的底物或识别基序的接头分子或排斥表面结构，可以实现此类由DNA酶、RNA酶或限制性酶的无法切割性。通常，该效应可以通过使用DNA类似物例如本文定义的PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子，或通过使用聚合分子例如PEG来实现。
在本发明的另一个优选实施方案中，如本文定义的接头分子进一步包含至少一个短的柔性间隔物。相应地由本发明涵盖的是如本文定义的接头结构，优选如本文定义的长且刚性的接头，在一个或两个末端处携带短的柔性间隔物。优选的接头设计显示于图13中。应当理解由于此类柔性间隔物的存在的一定柔性加入刚性接头分子中。弹性间隔物结构因此可以充当柔性连接，其促成接头分子的移动性，同时保留其总体刚性。如图4中所示，可能定向的数目由此类柔性间隔物得到增加或促进。柔性间隔物可以是任何合适的柔性分子，例如聚合物分子、肽、化学基团等。
在特别优选的实施方案中，短的柔性间隔物包含单链核酸，例如如本文定义的单链DNA或RNA分子，或如本文定义的或如本领域技术人员已知的任何其他单链核酸形式。
在进一步方面，本发明涉及检测样品内的靶分子的存在或量的方法，其包括下述步骤：
(a)使样品和连接至如本文上文描述的装置中的第一种颗粒的第一种结合分子接触；和
(b)使样品与下述接触：
i)能够连接至平坦表面或第二种颗粒的第二种结合分子，其中第一种结合分子和/或第二种结合分子能够与所述靶分子特异性结合，和任选地
ii)连接至平坦表面或第二种颗粒的靶类似物分子；其中所述靶分子能够干扰第一种结合分子与靶类似物分子的结合；和
(c)检测与平坦表面或第二种颗粒结合的第一种颗粒数目，
其中颗粒簇或结合颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
由本发明涵盖的是测定法形式，其可以是用于检测靶分子的存在和/或量的典型竞争或非竞争测定法。本领域技术人员应当理解如本文描述的装置以及根据本发明的方法适合于执行此类分析。
在涵盖的非竞争测定法形式中，第一种和第二种结合分子两者均能够与靶分子特异性结合。可涵盖在第一个步骤中，在第一种颗粒上存在的第一种结合分子可以识别且结合靶。在第二个步骤中，已结合靶分子的第一种颗粒可以通过扩散或磁性致动导向第二种颗粒或平坦传感器表面上存在的第二种结合分子。与第二种颗粒或平坦传感器的表面结合由第二种结合分子与靶的结合介导。还涵盖的是一个或多个洗涤步骤，其中从表面去除非特异性结合的颗粒。在本发明的具体实施方案中，此类洗涤步骤经由脉冲磁性致动发生。结合颗粒的数目随后由于颗粒簇数目或经由与如本文上文定义的平坦传感器表面结合的颗粒量进行检测。测定的结合颗粒数目直接对应于样品内的靶分子数目。
还涵盖的是基于竞争测定法的测定法形式，其通常需要竞争者或靶类似物的存在。如本文使用的术语“靶类似物分子”指任何分子，其与靶分子竞争结合如本文定义的第一种结合分子。在此类情况下，靶分子可以干扰第一种结合分子与靶类似物分子的结合。由本发明涵盖的是竞争或抑制测定法形式，其中第一种结合分子可以结合连接在平坦表面或如本文上文定义的颗粒表面上的靶类似物分子。如果如本文描述的靶分子存在于样品中，并且如果这种靶分子首先与抗体结合，则这种结合可以得到防止。例如，如果药物分子的类似物例如固定至平坦传感器表面，则小药物分子可以使用涵盖的方法进行检测。如果样品中不存在药物分子，则具有识别靶分子的结合分子的所有颗粒均可以与表面上的靶类似物分子结合。然而，在干扰这种结合的药物(靶)分子的存在下，抗药物结合分子不能结合或更少结合表面上的靶类似物。在此类情况下，表面上的颗粒量与靶分子的量反相关。
进一步由本发明涵盖的是如本文上文定义的磁性颗粒的特异性使用，其可以通过施加磁场进行致动，从而使得可以加速分析程序。本发明还涵盖由于非特异性结合的颗粒的去除，磁场的使用可以减少本底信号。适合于根据本发明的检测方法的示例性光磁系统在图1中举例说明。
在本发明的进一步优选的实施方案中，施加磁力，使颗粒与平坦表面或彼此紧密接近，以便促进颗粒聚簇。
术语“能够连接至平坦表面或第二种颗粒”意指第二种结合分子不一定恒定结合平坦表面或第二种颗粒或以预定方式连接，其意指在测定法开始时已连接至表面。应当理解第二种结合分子直接或经由如本文上文定义的接头分子与表面的连接可以在测定法过程中的任何时间点发生。本领域技术人员应当理解选择的连接时间点开放进行测定法的广泛范围的可能性。由本发明涵盖的因此是可以充当分离模块的第二种结合分子-接头复合物，而不依赖于其与表面的结合。此类复合物例如在图11中描述。本领域技术人员应当理解不恒定固定或连接在平坦表面上的第二种结合分子-接头复合物可以具有几个优点。一个涵盖的优点是未连接的第二种结合分子-接头复合物可以自由和快速扩散，因此增强经由与靶分子的结合而与捕获复合物的结合。术语“捕获复合物”描述其中第一种结合分子或捕获分子直接或间接连接至已捕获靶分子的第一种颗粒的状态。在这个例子中，第二种结合分子/接头分子与靶分子(其由第一种结合分子捕获)的结合可以时间非依赖性发生，即在其与表面连接前发生。
在特别优选的实施方案中，所述第二种结合分子与平坦表面或第二种颗粒的连接在第二种结合分子与靶分子结合之前或之后发生。在本发明的具体实施方案中，在测定法的第一个步骤中或在测定法开始前(这是加入如本文上文定义的样品的时间点)，优选经由如本文定义的接头分子，允许第二种结合分子连接至表面。在此类情况下，捕获复合物首先形成并且在后续步骤中与预形成的表面结构结合，所述表面结构包含连接至表面的第二种结合分子。
在本发明的进一步优选的实施方案中，第二种结合分子-接头分子由于其首先与靶分子的特异性结合而与捕获复合物结合，并且整体捕获–第二种结合分子–接头复合物随后导向平坦表面或第二种颗粒的表面，以便使捕获复合物与表面连接。涵盖的想法在图11中举例说明。在这个例子中，有利的距离由连接至二抗的长接头生成，而第一种结合分子直接连接至第一种颗粒的表面。换言之，已连接长且刚性的接头的第二种结合分子生成引起增强的结合动力学的效应。该具体例子证实由于如本文上文描述的模块样连接，捕获复合物由第二种结合分子的识别速度可以达到最大。重要的是，超过本领域的主要是如本文上文描述的长且刚性的接头的存在引起增强结合动力学所需的距离。该例子因此证实长且刚性的接头获得增强的结合动力学的原理决不限制于用于第一种结合分子与第一种颗粒的连接的接头。
然而，还可涵盖两种结合分子均与长接头偶联，以便进一步增加或累积第一种颗粒和平坦表面或第二种结合分子的表面之间的有利距离。
在本发明的另一个优选实施方案中，结合颗粒例如磁性颗粒的检测经由受抑全内反射(FTIR)或经由在表面附近的来自所述结合颗粒的散射光测量或经由簇形成的光学检测而发生。
特别优选的是基于颗粒尤其是磁性颗粒的光学检测的感测装置。相应细节可以衍生自图1中举例说明的示例性装置，其包含光源和光检测系统，并且构成根据本发明的具体实施方案。用于检测的光学方法通常测量光信号中的改变，其意指由磁性颗粒反射的光中的差异且可以通过光学手段检测。例如，此类方法可以包括技术例如散射光的检测或基于全内反射(TIR)或受抑全内反射(FTIR)的检测。优选地，光信号中的改变仅指由于第二种结合分子与传感器表面的结合而结合的那些磁性颗粒。细节将是本领域技术人员已知的，或可以衍生自合适的参考文献，例如Bruls等人，Lab Chip，2009，9.2504-3510。
如本文使用的术语“全内反射”描述当光以大于特定角度的入射角从具有更高的折射率的另一种材料进入一种材料时，在某些材料中存在的条件。这在其下发生的特定角度取决于两种材料的折射率，也称为临界角度并且可以数学计算(斯涅尔(Snell)定律，折射定律)。在不存在颗粒例如磁性颗粒的情况下，不发生折射并且来自光源的光束被完全反射。如果颗粒例如磁性颗粒接近于表面或与表面接触，则光线被说成由颗粒抑制且在该点处的反射不再完全。
可以计算可以定义为全内反射信号减少的信号。信号或多或少是线性的，取决于表面上的颗粒浓度(表面密度)。信号可以表示为：
S = &beta; n ~
其中S是以％表示的测量的信号改变，并且β是从表面密度到信号改变的换算因子。
在本发明的优选实施方案中，结合颗粒例如磁性颗粒的检测经由受抑全内反射(FTIR)或经由在表面附近的来自所述结合颗粒的散射光测量而发生。
还涵盖的是如Bruls等人，2009，Lab Chip，9，3504-3510中描述的基于颗粒簇的测量的方法。在本发明的另一个优选实施方案中，检测可以经由包含至少两种颗粒例如磁性颗粒和至少一种靶分子的簇的检测来执行。例如，在能够使两种颗粒桥接或组合的待检测的至少一种靶分子的存在下，如本文上文定义的颗粒例如磁性颗粒可以与进一步的至少一种进一步颗粒例如磁性颗粒聚簇。在具体实施方案中，颗粒簇包含如本文描述的第一种和第二种颗粒。在特别优选的实施方案中，检测可以在光磁系统中执行，其中所述颗粒是磁性颗粒，其是磁性致动的且在静止样品流体中光学检测，包括步骤(i)例如如本文上文定义的靶分子捕获，(ii)磁性致动，和(iii)检测。
在另一个方面，本发明涉及如本文定义的颗粒例如磁性颗粒用于检测样品例如如本文上文定义的样品内的靶分子的用途。
在本发明的特别优选的实施方案中，如在如本文上文描述的装置、方法或用途的上下文中提及的靶分子是心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。本发明还针对进一步的靶分子或靶分子种类的检测。特别优选的是心肌肌钙蛋白I(cTnI)。
实施例
实施例1–使用长dsDNA作为接头
接头的长度(延伸)在一组实验中进行分析。为此，其为非常刚性的分子并且因此还导致来自表面的远延伸的长dsDNA用作接头。特别地，500nm链霉抗生物素蛋白涂布的颗粒与不同长度的dsDNA一起温育。每种DNA分子含有在DNA分子的一个末端处的一个生物素部分，在分子的另一个末端处的德克萨斯红分子。将含有颗粒和DNA的溶液注入药筒内，并且与传感器表面结合，使用磁吸引涂布有抗德克萨斯红抗体。在从表面去除未结合颗粒的磁性洗涤步骤后，测定与表面结合的颗粒数目。
发现颗粒与表面的结合动力学得到显著增强。例如，对于具有～500nm平均直径的磁性纳米颗粒，观察到具有～700碱基对(bp)的最佳dsDNA长度，对应于～240nm的伸直长度和～140nm的平均延伸(参见图6)。
用1000nm链霉抗生物素蛋白涂布的颗粒执行相似实验。如图7中可见的，1000bp的最佳接头长度(对应于～340nm的伸直长度)也大致大两倍。根据这些测量，最佳DNA伸直长度看起来大致是颗粒半径的2/3。
实施例2–接头表面密度对结合动力学的作用
在测定法形式中测试接头表面密度对结合动力学的作用，所述测定法形式使用涂布有链霉抗生物素蛋白的500nm颗粒，其与单一“靶分子”结合，所述靶分子是在一个末端具有生物素和连接至另一个末端的德克萨斯红分子的dsDNA链(参见图9，左图，菱形)，其可用于与涂布有抗德克萨斯红抗体的传感器表面结合。随后，不同量的相同长度的无功能dsDNA(但缺乏德克萨斯红分子)同样与颗粒结合，并且比较颗粒与传感器表面结合的能力。
在进一步的实验中，颗粒装载有1999bp dsDNA。图9，中图，显示在装载有无功能DNA后的颗粒结合的相对量，与仅具有一种“功能”DNA分子的颗粒相比较。
在进一步的实验中，颗粒装载有497bp dsDNA。图9，下图显示显示在装载有无功能DNA后的颗粒结合的相对量，与仅具有一种“功能”DNA分子的颗粒相比较。

Claims (15)

1.一种用于检测样品内的靶分子的装置，其包括：
(a)用于测量样品内的靶分子的样品容器，
(b)第一种颗粒，其中所述第一种颗粒用能够与所述靶分子特异性结合的第一种结合分子功能化，和
(c)包含第二种结合分子的表面结构，其中所述表面结构覆盖平坦传感器或存在于第二种颗粒上，
其中所述第一种颗粒能够直接或间接结合表面结构的所述第二种结合分子；其中所述第一种和/或第二种结合分子经由长且刚性的接头分子间接连接至所述第一种和/或第二种颗粒的颗粒表面和/或所述平坦传感器表面；其中所述接头分子的长度和一致性这样选择，以便导致所述接头超过60nm的平均延伸长度；并且其中所述颗粒簇或结合颗粒的数目与所述样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
2.权利要求1的装置，其中所述第一种和/或第二种颗粒是磁性颗粒。
3.权利要求1或2的装置，其中所述第一种和/或第二种颗粒的直径是至少约100nm，并且其中所述平均延伸长度是所述直径的至少10％。
4.权利要求1–3中任一项的装置，其中刚性的接头分子具有所述接头分子的伸直长度的至少20％的平均延伸长度。
5.权利要求1–4中任一项的装置，其中所述第一种结合分子是抗体或其片段、适体、配体或互补核酸。
6.权利要求1–5中任一项的装置，其中所述接头分子是或包含核酸分子或非生物聚合物，优选地所述接头分子是或包含选自下述的分子：双链核酸分子例如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。
7.权利要求1–6中任一项的装置，其中所述第一种颗粒另外包含直接连接至所述颗粒的表面的排斥表面结构，其中所述排斥表面结构覆盖所述颗粒的表面，以便导致所述颗粒的特定净电荷和/或立体排斥，并且其中所述排斥表面结构赋予给所述颗粒朝向所述传感器表面的推送作用，其中优选地所述接头分子长于所述排斥表面结构。
8.权利要求7的装置，其中所述排斥表面结构是带电结构，优选包含选自下述的分子：核酸分子，例如dsDNA、PNA、PNA-DNA双链体、RNA-DNA双链体、水凝胶和聚合物；或立体涂层。
9.权利要求7或8的装置，其中所述接头分子和/或所述排斥表面结构无法由DNA酶和/或能够切割双链核酸分子的限制性酶切割。
10.权利要求1–9中任一项的装置，其中所述接头分子进一步包含至少一种短的柔性间隔物，优选包含单链核酸的短的柔性间隔物。
11.检测样品内的靶分子的存在或量的方法，其包括下述步骤：
(a)使所述样品和连接至根据权利要求1–10的装置中的第一种颗粒的第一种结合分子接触，和
(b)使所述样品与下述接触：
i)能够连接至平坦表面或第二种颗粒的第二种结合分子，其中所述第一种结合分子和/或所述第二种结合分子能够与所述靶分子特异性结合，和任选地
ii)连接至所述平坦表面或所述第二种颗粒的靶类似物分子；其中所述靶分子能够干扰所述第一种结合分子与所述靶类似物分子的结合；和
(c)检测与所述平坦表面或所述第二种颗粒结合的所述第一种颗粒数目，
其中所述颗粒簇或结合颗粒的数目与所述样品中存在的靶分子的量直接相关或反相关。
12.权利要求11的方法，其中施加磁力，使所述颗粒紧密接近所述固体载体，或彼此紧密接近，以便促进所述颗粒聚簇。
13.权利要求11或12的方法，其中所述第二种结合分子与所述平坦表面或所述第二种颗粒的连接在所述第二种结合分子与所述靶分子结合之前或之后发生。
14.如权利要求1–10中任一项中限定的颗粒用于检测样品内的靶分子的用途。
15.权利要求1–10中任一项的装置、权利要求11–13中任一项的方法或权利要求14的用途，其中所述靶分子是心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。
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