BR112014011514B1

BR112014011514B1 - Sistema para detectar uma molécula-alvo dentro de uma solução e método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula-alvo dentro de uma amostra disposta em um recipiente da amostra

Info

Publication number: BR112014011514B1
Application number: BR112014011514-1A
Authority: BR
Inventors: Toon Hendrik Evers; Maatje Koets
Original assignee: Koninklijke Philips N.V.
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2020-09-15
Also published as: RU2641032C2; US20150177239A1; BR112014011514A2; WO2013072842A8; EP2745091B1; EP2594942A1; JP2014533831A; WO2013072842A1; EP2745091A1; ES2555904T3; JP6173332B2; CN103946686B; CN103946686A; DK2745091T3; BR112014011514B8; RU2014124190A; US10942178B2; PL2745091T3

Abstract

dispositivo para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra, método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula-alvo dentro de uma amostra e uso de uma partícula a presente invenção refere-se a um dispositivo para detectar uma molécula alvo dentro de uma amostra compreendendo um recipiente de amostra para a medição da molécula alvo dentro de uma amostra, uma primeira partícula, em que a dita primeira partícula é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação capaz de se ligar especificamente à dita molécula alvo, e uma estrutura de superfície compreendendo uma segunda molécula de ligação, em que a dita estrutura de superfície cobre um sensor plano ou está presente em uma segunda partícula, em que a dita primeira partícula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da estrutura de superfície diretamente ou indiretamente; em que a dita primeira e/ou segunda molécula de ligação é indiretamente fixada à superfície de partícula da dita primeira e/ou segunda partícula e/ou à superfície de sensor plano através de uma molécula ligante rígida e longa; em que o comprimento e a consistência da dita molécula ligante são selecionados de modo a resultar em um comprimento de extensão médio do dito ligante maior que 60 nm; e em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas alvo presentes na amostra. em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula alvo dentro de uma amostra. a presente invenção também descreve o uso de uma partícula de acordo com a invenção para detectar uma molécula alvo dentro de uma amostra.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um dispositivo para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra compreendendo um recipiente de amostra para a medição da molécula-alvo dentro de uma amostra, uma primeira partícula, em que a dita primeira partícula é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação capaz de se ligar especificamente à dita molécula-alvo, e uma estrutura de superfície compreendendo uma segunda molécula de ligação, em que a dita estrutura de superfície cobre um sensor plano ou está presente em uma segunda partícula, em que a dita primeira partícula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da estrutura de superfície diretamente ou indiretamente; em que a dita primeira e/ou segunda molécula de ligação é indiretamente fixada à superfície de partícula da dita primeira e/ou segunda partícula e/ou à superfície de sensor plano através de uma molécula ligante rigida e longa; em que o comprimento e a consistência da dita molécula ligante são selecionados de modo a resultar em um comprimento de extensão médio do dito ligante maior que 60 nm; e em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra. Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula-alvo dentro de uma amostra. A presente invenção também descreve o uso de uma partícula de acordo com a invenção para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] A demanda por cuidados de saúde universais e eficazes move o mundo dos diagnósticos in vitro em direção a soluções de acesso aleatório integradas e no local da prestação de cuidados. A realização de tais soluções é exigente: os testes precisam ser rápidos, sensíveis, quantitativos e precisos. Além disso, a plataforma na qual o teste é realizado precisa ser fácil de utilizar e compactas.

[003] Os ensaios de afinidade fazem uso de moléculas biológicas para capturar moléculas-alvo específicas de uma amostra e permitir uma determinação de sua concentração. Tipicamente, a captura por afinidade é alcançada pela dispersão de nano ou micropartículas revestidas com moléculas de capturas em fluido de amostra (Luchini et al., 2008, Nano Lett., 8(1), 350 - 361). Ensaios baseados em afinidade típicos são, portanto, utilizados em um grande número de aplicações, tal como ensaios de diagnóstico, detecção de biomoléculas em pesquisa, tal como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, assim, fazendo uso de moléculas de afinidade tais como, por exemplo, anticorpos, os quais são tipicamente caracterizados por uma alta afinidade de ligação a uma biomolécula específica. Em princípio, as partículas magnéticas funcionalizadas são atraídas a uma superfície de sensor, onde as partículas podem indiretamente, isto é, por virtude de um analito capturado ou diretamente se ligam a sondas de captura, tais como anticorpos impressos na superfície. 0 número de partículas ligadas está diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra. Tipicamente, em tais aplicações de biossensores, as partículas podem ser detectadas utilizando qualquer técnica sensível a partículas próximas da superfície, muitas vezes, tais técnicas são baseadas em detecção óptica, tal como a detecção de luz difusa ou reflexão interna total frustrada (FTIR) conforme descrito, por exemplo, em Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510.

[004] O documento WO 2008/0833 Al revela métodos, reagentes e aparelhos para a detecção de agentes. Formatos de ensaio para a detecção de um ou mais agentes de interesse em uma amostra baseados em ensaios sanduíche diretos e indiretos convencionais são descritos.

[005] O documento US 2004/110220 Al revela métodos e dispositivos para detectar ácidos nucleicos. Em particular, o sistema de detecção é principalmente baseado em nanopartículas tendo oligonucleotídeos fixados às mesmas (conjugados nanopartícula-oligonucleotídeo). Os oligonucleotídeos descritos nesse documento possuem uma porção que é complementar a uma porção da sequência do ácido nucleico (porção de reconhecimento) para permitir a hibridização a um ácido nucleico-alvo.

[006] O documento WO 2009/005552 A2 descreve métodos e composições para ligação multivalente e captura quantitativa de componentes em uma amostra. Em particular, modificações de formatos de ensaio sanduíche convencionais de modo a resultar em ligantes de "avidez" polivalentes para aumentar o Kd aparente são descritas. Isto é alcançado ao fixar mais de um anticorpo ou antígeno a uma "estrutura" que pode ser um polímero de espinha dorsal, tal como um ácido nucleico de fita única ou dupla tal como PNA, DNA, RNA, etc.

[007] O documento US 2009/148863 revela plataformas de detecção com base em nanopartículas funcionalizadas. Em particular, as nanopartículas compreendem um primeiro componente de monocamada que é adaptado para se ligar a uma fração biológica, a qual pode, por sua vez, ser adaptada para se ligar a um analito. A superfície de nanopartícula pode adicionalmente compreender um segundo componente de monocamada, o qual contribui para a exposição do primeiro componente de monocamada na superfície. As nanopartículas são ligadas através de uma primeira e uma segunda monocamada a uma molécula de captura, por exemplo, um anticorpo, o que permite a detecção de uma única molécula em tempo real.

[008] O documento EP 1441217A2 descreve um ensaio de ligação de guia de onda óptico com base na detecção da difusão da luz direcionada em elementos TIR ou dispositivos de guia de onda através da imobilização de membros de ligação específica (SBM) por diversos meios.

[009] O documento US 2005/0048599 revela a detecção de microrganismos em um substrato fixo. A ligação é baseada na provisão de uma configuração sanduíche e ocorre através de um componente de ligação de marcador que liga o marcador ao alvo através de um meio que é específico a um alvo (por exemplo, anticorpos ou aptâmeros). Um componente indicador é detectável por um detector.

[010] Uma desvantagem importante dos ensaios por afinidade da técnica anterior, entretanto, é o fato de que a ligação das partículas funcionalizadas tendo ligado uma molécula-alvo à superfície ainda é muito lenta, limitadora de taxa e ineficiente. Um motivo para esta reação lenta, entre outros, reside na dificuldade de ligar uma partícula relativamente grande (por exemplo, -500 nm) a uma superfície através de uma molécula-alvo pequena (por exemplo, -10 nm). A desproporção é esboçada na Figura 3 ilustrando os tamanhos relativos do alvo e da partícula. Como consequência, não existem muitas orientações do complexo partícula-alvo que resultam em uma ligação eficiente. Embora a partícula possa girar quando está em contato com a superfície, a probabilidade de ligação é, no entanto, bastante pequena.

[011] Há, assim, uma forte necessidade de se projetar estruturas de partícula-alvo inovadoras, que sejam capazes de se ligar eficientemente a uma superfície, tal como uma superfície de sensor plano ou uma superfície de partícula.

[012] OBJETOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[013] A presente invenção aborda estas necessidades e provê meios para aumentar a eficiência de ligação de partículas a superfícies. O objetivo acima é, em particular, realizado por um dispositivo para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra compreendendo um recipiente de amostra para a medição da molécula-alvo dentro de uma amostra, uma primeira partícula, em que a dita primeira partícula é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação capaz de se ligar especificamente à dita molécula- alvo, e uma estrutura de superfície compreendendo uma segunda molécula de ligação, em que a dita estrutura de superfície cobre um sensor plano ou está presente em uma segunda partícula, em que a dita primeira partícula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da estrutura de superfície diretamente ou indiretamente; em que a dita primeira e/ou segunda molécula de ligação é indiretamente fixada à superfície de partícula da dita primeira e/ou segunda partícula e/ou à superfície de sensor plano através de uma molécula ligante rígida e longa; em que o comprimento e a consistência da dita molécula ligante são selecionados de modo a resultar em um comprimento de extensão médio do dito ligante maior que 60 nm; e em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra.

[014] A invenção descreve como a probabilidade de ligação de uma partícula grande a uma superfície pode ser aumentada significativamente ao fixar o alvo às moléculas ligantes de partículas tendo um certo comprimento. Surpreendentemente, pôde ser observado que a provisão de uma molécula ligante ou espaçadora longa e rígida supera as dificuldades de ligação das partículas utilizadas na técnica anterior e, assim, permite uma ligação mais eficaz.

[015] A Figura 4 ilustra o princípio fundamental da presente invenção. 0 número de possíveis orientações nas quais uma partícula pode ser ligar à superfície fortemente aumenta se o ponto de fixação for posicionado mais longe da partícula. 0 uso de uma molécula espaçadora longa, entretanto, não necessariamente resolve o problema. A Figura 5 ilustra que, mesmo se um ligante muito longo for utilizado, por exemplo, uma molécula PEG, a flexibilidade da molécula, em vez disso, levaria a uma dobra, resultando em uma estrutura globular e, assim, uma extensão pequena da molécula de captura a partir da superfície da partícula.

[016] Sem desejar vínculo a uma teoria, uma explicação para a maior eficiência de ligação observada é que o uso de moléculas ligantes longas e rígidas para posicionar uma molécula de ligação longe da superfície da partícula melhora significativamente a cinética de ligação de uma partícula à superfície. Os inventores do presente pedido de patente reconheceram que a distância de ponta a ponta é uma função do comprimento de extensão médio, do comprimento de contorno e da rigidez de uma molécula e poderia demonstrar que estas características contribuem significativamente à cinética de ligação melhorada observada.

[017] Em um experimento utilizando nanopartículas revestidas com estreptavidina 500 nm e moléculas de dsDNA como moléculas ligantes de comprimento variado, pôde, em particular, ser mostrado que o número de partículas ligadas aumenta com o comprimento de ligante dsDNA (ver Figura 6) . Em particular, os inventores puderam demonstrar que o comprimento das moléculas ligantes nas partículas essencialmente contribui para o número de partículas ligadas uma superfície de sensor. Estas descobertas e outras descobertas que serão descritas em detalhes neste documento levaram ao desenvolvimento de um projeto de ligante melhorado. Assim, a arquitetura de ligante conforme descrita neste documento é responsável pela cinética de ligação melhorada, assim, melhorando a velocidade, a eficácia e a precisão de ensaios por afinidade baseados em nanopartículas

[018] Em uma realização preferida da presente invenção, a primeira e/ou a segunda partícula é uma partícula magnética.

[019] Em uma realização preferida adicional, o diâmetro da dita primeira e/ou segunda partícula é pelo menos cerca de 100 nm. Em realizações preferidas adicionais, o comprimento de extensão médio de um ligante conforme mencionado acima é pelo menos 10% do diâmetro de uma partícula que possui um diâmetro de pelo menos cerca de 100 nm

[020] Em ainda outra realização preferida, a dita molécula ligante rígida possui um comprimento de extensão médio de pelo menos 20% o comprimento de contorno da dita molécula ligante.

[021] Em outra realização preferida da presente invenção, a primeira molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, um aptâmero, um ligante, ou um ácido nucleico complementar.

[022] Em uma realização específica da presente invenção, a rigidez e o comprimento da dita molécula ligante são determinados através da distância de ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante V<R2>, onde <R2> pode ser descrito de acordo com a fórmula

[023]

[024] em que P é o comprimento de persistência do polímero e 1 é o comprimento de contorno do ligante.

[025] Em uma realização preferida da presente invenção, a molécula ligante é ou compreende uma molécula de ácido nucleico ou um polímero não biológico. Em uma realização particularmente preferida, a molécula ligante pode ser selecionada do grupo que consiste em uma molécula nucleica de fita dupla, tal como dsDNA, uma molécula de PNA, um duplex PNA-DNA, e um duplex RNA-DNA.

[026] Em ainda outra realização particularmente preferida, a molécula de ácido nucleico de fita dupla é um dsDNA, um duplex PNA-DNA, ou um duplex RNA-DNA.

[027] Na realização mais preferida da presente invenção, a molécula ligante é um dsDNA.

[028] Em ainda outra realização preferida da presente invenção, a primeira partícula também compreende uma estrutura de superfície repulsiva que é diretamente fixada à superfície da dita partícula, em que a dita estrutura de superfície repulsiva cobre a superfície da partícula de modo a resultar em uma carga líquida específica e/ou uma repulsão estérica da partícula, e em que a dita estrutura de superfície repulsiva transmite um efeito de empurrar as ditas partículas em direção à dita superfície de sensor.

[029] Em ainda outra realização preferida da presente invenção, a molécula ligante é mais longa que a dita estrutura de superfície repulsiva.

[030] Em uma realização preferida da presente invenção, a dita estrutura de superfície repulsiva é uma estrutura carregada.

[031] Em uma realização particularmente preferida, a estrutura carregada é ou compreende uma molécula selecionada do grupo que consiste em um ácido nucleico, tal como um ácido nucleico de fita dupla, por exemplo, dsDNA, um PNA, um duplex PNA-DNA, um RNA-DNA, um hidrogel, e um polímero.

[032] Em uma realização particularmente preferida adicional da presente invenção, a dita estrutura de superfície repulsiva é um revestimento estérico.

[033] Em outra realização preferida da presente invenção, a molécula ligante e/ou a estrutura de superfície repulsiva não é clivável por DNase e/ou uma enzima de restrição capaz de cortar uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.

[034] Em outra realização preferida da presente invenção, a molécula ligante adicionalmente compreende pelo menos um espaçador flexível curto.

[035] Em ainda outra realização preferida, o espaçador flexível curto compreende um ácido nucleico de fita única.

[036] A presente invenção, em um aspecto adicional, refere-se a um método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula-alvo dentro de uma amostra compreendendo as etapas de (a) contactar a amostra e uma primeira molécula de ligação fixada a uma primeira partícula em um dispositivo de acordo com a presente invenção; e (b) contactar a amostra com i) uma segunda molécula de ligação capaz de se fixar a uma superfície plana ou a uma segunda partícula, em que a primeira molécula de ligação e/ou a segunda molécula de ligação são capazes de se ligar especificamente à dita molécula-alvo, ou ii) uma molécula análoga alvo fixada à superfície plana ou à segunda partícula; em que a molécula-alvo é capaz de interferir com a ligação da primeira molécula de ligação à molécula análoga alvo; e (c) detectar o número de primeiras partículas ligadas à superfície plana ou à segunda partícula em virtude da ligação da primeira molécula de ligação à segunda molécula de ligação,

[037] em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra.

[038] Em uma realização preferida adicional da presente invenção, uma força magnética é aplicada para trazer as partículas em proximidade com o dito suporte sólido ou umas às outras de modo a facilitar a aglomeração das partículas.

[039] Em uma realização preferida adicional da presente invenção, a fixação da dita segunda molécula de ligação à superfície plana ou à segunda partícula ocorre antes ou depois da ligação da segunda molécula de ligação à molécula-alvo.

[040] Em outra realização preferida da presente invenção, a detecção de partículas ligadas ocorre através de reflexão interna total frustrada (FTIR) ou através da medição da luz espalhada pelas ditas partículas ligadas próximo da superfície ou através da detecção óptica da formação de aglomerados.

[041] Em um aspecto adicional, a presente invenção descreve o uso de uma partícula conforme definida neste documento para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra.

[042] Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, a molécula-alvo mencionada no contexto do dispositivo, método ou uso conforme descrito neste documento acima é troponina cardíaca I (cTnl), NT- proBNP ou hormônio da paratireoide.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[043] A Figura 1 mostra o princípio da detecção de FTIR. A luz de uma fonte de luz entra em um cartucho, é refletida da interface cartucho/fluido e digitalizada em um detector. Se as partículas estiverem presentes no campo evanescente, criadas nesta interface, a intensidade da luz refletida diminui.

[044] A Figura 2 mostra um imunoensaio sanduíche utilizando tecnologia Magnotech. No painel (1), as partículas magnéticas revestidas com um anticorpo primário direcionadas contra o alvo se dispersam no líquido de amostra e se ligam ao alvo. No painel (2), as bobinas superior e inferior atuam as partículas magnéticas em uma maneira pulsada, resultando na ligação à superfície de sensor onde um anticorpo secundário pode se ligar à molécula-alvo ligada. No painel (3), as partículas não ligadas são removidas da superfície de sensor e as partículas ligadas são detectadas utilizando um campo evanescente.

[045] A Figura 3 ilustra os tamanhos relativos de uma molécula-alvo de 10 nm (preto) , em sanduíche entre a superfície de sensor e uma partícula de 500 nm (não completamente exibida). Esquerda: partícula adequadamente orientada para formar uma ligação; direita: partícula não adequadamente orientada para formar uma ligação.

[046] A Figura 4 ilustra o maior número de orientações nas quais uma partícula pode se ligar à superfície se o ponto de fixação (representado pelo círculo preto pequeno) for estendido para mais longe da partícula.

[047] A Figura 5 mostra um esboço comparando a extensão de um anticorpo fixado à superfície através de um ligante PEG (esquerda) ou ligante dsDNA (direita), ambos com o mesmo comprimento de contorno.

[048] A Figura 6 ilustra um gráfico mostrando o número de partículas ligadas em função do comprimento do ligante de DNA. Partículas revestidas com estreptavidina 500 nm foram incubadas com dsDNA de comprimento variável. Cada molécula de DNA continha uma fração de biotina em uma extremidade da molécula de DNA, uma molécula de sulforrodamina 101 na outra extremidade da molécula. A solução contendo partículas e DNA foi injetada em um cartucho e ligada à superfície do sensor, revestido com anticorpos de sulforrodamina 101 utilizando atração magnética. Ao registrar repetidamente o número de partículas que se ligaram à superfície após uma curta etapa de lavagem magnética que removeu partículas não ligadas da superfície, a taxa de ligação (expressa em número de partículas ligadas por unidade de tempo) foi determinada.

[049] A Figura 7 ilustra um gráfico mostrando o número de partículas ligadas em função do comprimento do ligante de DNA. Os detalhes são similares para a Figura 6, entretanto, partículas com 1000 nm de diâmetro foram utilizadas.

[050] A Figura 8 mostra partículas com uma alta densidade de superfície de moléculas de ligante. Embora as moléculas ligantes sejam relativamente esticadas, o grande impedimento estérico reduzirá a mobilidade do ligante.

[051] A Figura 9 ilustra o efeito da densidade superficial do ligante na cinética de ligação. Topo: esboço do formato do ensaio: uma partícula de 500 nm, revestida com estreptavidina (laranja) é ligada a uma única molécula-alvo, uma fita de dsDNA com uma biotina em uma extremidade e uma molécula de sulforrodamina 101 fixada à outra extremidade (losango azul) , que está disponível para se ligar a uma superfície de sensor revestida com anticorpos anti- sulforrodamina 101. Em seguida, diferentes quantidades de dsDNA não funcional do mesmo comprimento (mas sem a molécula de sulforrodamina 101) são ligadas à partícula também, e a capacidade das partículas se ligarem à superfície do sensor é comparada. Meio: experimento de carga de partículas utilizando dsDNA 1999 bp exibindo a quantidade relativa de partículas após o carregamento com DNA não funcional, comparado com uma partícula com apenas 1 molécula de DNA funcional. Parte inferior: o mesmo gráfico, mas para DNA 497 bp.

[052] A Figura 10 mostra uma partícula, pré- carregada com moléculas de captura fixadas à superfície através de um ligante rígido longo. Durante o ensaio, a molécula-alvo (losango) é ligada à partícula e posteriormente à superfície.

[053] A Figura 11 ilustra uma partícula, pré- carregada com moléculas de captura fixadas diretamente à superfície. Durante o ensaio, a molécula-alvo (losango) é ligada à partícula e uma segunda molécula de captura reconhecendo o alvo, o qual é conectado a um ligante longo rígido. A outra extremidade do ligante é conectada a um elemento de reconhecimento (por exemplo, biotina), o qual pode se ligar a uma molécula de captura compatível (por exemplo, estreptavidina) na superfície do sensor.

[054] A Figura 12 mostra partículas ligadas à superfície através de uma interação específica (esquerda) ou uma interação não específica (direita).

[055] A Figura 13 mostra um possível projeto de ligante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES

[056] A presente invenção refere-se a um meio e métodos para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra. Embora a presente invenção seja descrita em relação a realizações específicas, esta descrição não deve ser interpretada em um sentido limitativo.

[057] Antes de descrever em detalhes as realizações da presente invenção, definições importantes para entender a presente invenção são fornecidas.

[058] Conforme utilizado neste relatório descritivo e nas reivindicações apensas, as formas singulares de "um" e "uma" também incluem os respectivos plurais, a menos que o contexto claramente dite o contrário.

[059] No contexto da presente invenção, os termos "cerca de" e "aproximadamente" denotam um intervalo de precisão que um técnico no assunto entenderá para ainda garantir o efeito técnico da característica em questão. 0 termo tipicamente indica um desvio do valor numérico indicado de ±20 %, preferivelmente ±15 %, mais preferivelmente ±10 %, e ainda mais preferivelmente ±5 %.

[060] Deve ser entendido que o termo "compreendendo" não é limitativo. Para os propósitos da presente invenção, o termo "consistindo em" é considerado uma realização preferida do termo "compreendido por". Se a seguir, um grupo for definido para compreender pelo menos um certo número de realizações, isto se destina a também abranger um grupo que preferivelmente consiste apenas nestas realizações.

[061] Além disso, os termos "primeiro", "segundo", "terceiro" ou "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", etc., e semelhantes, na descrição e nas reivindicações, são utilizados para distinguir entre elementos similares, e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim utilizados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas, e que as realizações da invenção descritas neste documento são capazes de operação em sequências diferentes das descritas ou ilustradas neste documento.

[062] No caso dos termos "primeiro", "segundo", "terceiro" ou "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" "i", "ii" etc. se referirem a etapas de um método ou uso ou ensaio, não há coerência de tempo ou de intervalo de tempo entre as etapas, isto é, as etapas podem ser realizadas simultaneamente ou pode haver intervalos de segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses ou mesmo anos entre tais etapas, salvo indicação em contrário no pedido de patente aqui estabelecido acima ou abaixo.

[063] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada a metodologia, protocolos, reagentes, etc., específicos descritos neste documento, uma vez que estes podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia utilizada neste documento é para os propósitos de descrever realizações específicas somente, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações apensas. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento possuem o mesmos significados que o comumente entendido por um técnico no assunto.

[064] Conforme foi estabelecido acima, a presente invenção refere-se, em um aspecto, a um dispositivo para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra compreendendo um recipiente de amostra para a medição da molécula-alvo dentro de uma amostra, uma primeira partícula, em que a dita primeira partícula é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação capaz de se ligar especificamente à dita molécula-alvo, e uma estrutura de superfície compreendendo uma segunda molécula de ligação, em que a dita estrutura de superfície cobre um sensor plano ou está presente em uma segunda partícula, em que a dita primeira partícula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da estrutura de superfície diretamente ou indiretamente; em que a dita primeira e/ou segunda molécula de ligação é indiretamente fixada à superfície de partícula da dita primeira e/ou segunda partícula e/ou à superfície de sensor plano através de uma molécula ligante rígida e longa; em que o comprimento e a consistência da dita molécula ligante são selecionados de modo a resultar em um comprimento de extensão médio do dito ligante maior que 60 nm; e em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra.

[065] É previsto pela presente invenção um dispositivo adequado, preferivelmente para detecção de uma molécula-alvo utilizando um sistema biossensor. Diversos procedimentos analíticos para detectar a presença e/ou a quantidade de um analito em uma amostra de testes ou volume de testes são conhecidos na técnica. Tipicamente, tal sistema de detecção pode detectar partículas opticamente, as quais são funcionalizadas com uma molécula de ligação adequada para ligar o analito de interesse. A presença ou a quantidade do analito pode ser concluída a partir do número de analitos ligados às partículas. A presença ou a quantidade do analito pode também ser concluída a partir do número de aglomerados de partículas. Em realizações específicas da presente invenção, o sistema de biossensor compreendendo o dispositivo conforme descrito neste documento pode ser capaz de detectar partículas únicas ligadas a um sensor plano conforme descrito neste documento ou a presença de aglomerado de partículas, e atuar as partículas por um campo magnético gerado por um gerador de campo magnético.

[066] Um "gerador de campo magnético", conforme utilizado neste documento, tipicamente compreende um ou mais ímãs dentro do dispositivo optomagnético conforme descrito neste documento para gerar um campo magnético com a câmara da amostra, em que o dito campo magnético deve guiar partículas em direção à superfície de contato. 0 campo magnético tipicamente terá um gradiente diferente de zero que permite a exerção de forças magnéticas em partículas magnéticas (dipolos). Exemplos adequados de tais geradores de campo magnético, ou sistema adequados compreendendo tais geradores de campo magnético seriam conhecidos para um técnico no assunto. Em realizações específicas da presente invenção, o gerador de campo magnético pode ter um gerador de campo magnético conforme descrito em Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510, ou ser compreendido ou fazer parte de um sistema conforme descrito em Ranzoni et al. , 2011, Nano Lett., 11, 2017-2022.

[067] Tipicamente, as partículas magnéticas podem ser atuadas ao aplicar um campo magnético, de modo que o procedimento analítico possa ser acelerado. Em realizações específicas da presente invenção, também é previsto que o uso de um campo magnético possa reduzir o sinal de fundo devido à remoção de partículas não especificamente ligadas. A Figura 2 mostra um exemplo de como as partículas podem ser atuadas para efetivamente remover partículas não especificamente ligadas ou não ligadas do sensor plano conforme descrito neste documento. Um ímã superior e inferior que possa ser atuado de maneira pulsada eficientemente remove partículas não ligadas, de modo que as partículas ligadas sejam detectadas na superfície do sensor.

[068] Uma atuação magnética conforme utilizada no contexto da presente invenção pode ser utilizada de maneira diferente, a saber, para dispor partículas magnéticas em uma amostra em cadeias para acelerar a aglomeração de partículas. Também é previsto pela presente invenção o uso de atuação magnética para vibrar e girar aglomerados de partículas para a determinação da presença e da quantidade de aglomerados formados. Em realizações específicas, a atuação magnética das partículas pode ocorrer pulsada, isto é, o campo de atuação é pelo menos uma vez interrompido por uma pausa. Foi descoberto que a atuação dinâmica em termos de pulsos repetidos reduz interações não específicas e melhorar o número de eventos de ligação. Detalhes e parâmetros adicionais referentes à detecção de uma molécula-alvo baseados na detecção de aglomerados de partículas seriam conhecidos por um técnico no assunto ou podem ser derivados de Ranzoni et al., 2011, Nano Lett., 11, 2017-2022.

[069] Sistemas biossensores adequados para uso na presente invenção podem compreender, por exemplo, um cartucho biossensor compreendendo um recipiente de amostra, um dispositivo de sensor para detectar as partículas, sistema de detecção, e opcionalmente um gerador de campo magnético. Os sistemas podem, em realizações adicionais, compreender uma ou mais unidades funcionais adicionais, tal como um sistema de leitura, por exemplo, uma tela ou impressora, uma interface para sistemas de banco de dados ou computadores, uma unidade de calibração, uma conectividade direta ou indireta com dispositivos de alto rendimento, etc. São particularmente previstos pela presente invenção dispositivos portáteis para análise rápida e instantânea onde um cartucho incluindo o formato de ensaio pode ser inserido. Tipicamente, tal dispositivo compreende uma fonte de alimentação, preferivelmente na forma de baterias recarregáveis, uma tela, conectividade sem fios, tal como WLAN, para acesso rápido a banco de dados, ou acesso a um sistema de informações laboratoriais. Um sistema biossensor exemplar, que pode ser utilizado no contexto da presente invenção, é descrito em Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510.

[070] São particularmente preferidos dispositivos de detecção com base em uma detecção óptica de partículas próximas ou em uma superfície. Sem estar limitado ao mesmo, um dispositivo exemplar é ilustrado na Figura 1 compreendendo uma fonte de luz e um sistema de detecção de luz .

[071] Uma "amostra", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer amostra, o que inclui uma molécula-alvo conforme definida neste documento. Tais amostras podem, por exemplo, incluir amostras derivadas de ou compreendendo fezes, sangue inteiro, soro, plasma, lágrimas, saliva, fluido nasal, escarro, fluido do ouvido, fluido genital, fluido das mamas, leite, colostro, fluido da placenta, líquido amniótico, transpiração, líquido sinovial, líquido ascite, líquido cefalorraquidiano, bile, líquido gástrico, humor aquoso, humor vítreo, líquido gastrointestinal, exsudato, transudato, líquido pleural, líquido pericárdico, esperma, líquido das vias aéreas superiores, fluido peritoneal, fluidos colhidos a partir de um sítio de uma resposta imune, fluidos colhidos a partir de um local de coleta agrupada, lavado brônquico, urina, material de biópsia, por exemplo, de todos os órgãos adequados, por exemplo, do pulmão, do músculo, cérebro, fígado, pele, pâncreas, estômago, etc., uma amostra de célula nucleada, um fluido associado a uma superfície mucosa, cabelo ou pele. Além disso, amostras de fontes ambientais, por exemplo, amostras de água, amostras de carnes ou aves, amostras de fontes de contaminação em potencial, etc., podem ser utilizadas.

[072] O termo "molécula-alvo", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer molécula ligada por uma molécula de ligação e pode, por exemplo, ser uma substância biológica, tal como uma biomolécula, preferivelmente um biomarcador, complexos, frações de células ou células. Preferivelmente, uma molécula-alvo dentro do contexto da presente invenção é um ácido nucleico, por exemplo, molécula de DNA ou RNA ou um oligonucleotídeo, tal como um oligonucleotídeo de DNA ou RNA. São ainda mais preferidas moléculas-alvo, tal como um peptídeo, um polipeptídeo ou proteína, um fragmento de proteína ou polipeptídeo, ou proteína funcional ou domínio de polipeptídeo, uma molécula de fármaco, uma molécula pequena, ou uma vitamina.

[073] Uma molécula-alvo pode ser obtida diretamente das amostras descritas acima neste documento. Em outras situações, as amostras podem ser submetidas a técnicas de preparação de amostra, por exemplo, com base em protocolos padrão, incluindo, por exemplo, purificação parcial, que torna as moléculas-alvo mais acessíveis a parceiros de ligação, isto é, uma molécula de afinidade conforme definida neste documento. Por exemplo, amostras de sangue podem ser centrifugadas para separar frações incluindo células inteiras ou membrana do soro, amostras de fezes podem ser cortadas e homogeneizadas com tampão fisiologicamente aceitável e detergente, amostras de escarro podem ser liquefeitas e fracionadas. Além disso, antibióticos ou bactericidas podem ser adicionados a amostras para evitar o crescimento de qualquer organismo presente. Células inteiras podem também ser removidas ou podem ser lisadas para liberar seus conteúdos.

[074] Um "recipiente de amostra", conforme utilizado neste documento, refere-se a um recipiente feito de qualquer material adequado, como vidro, qualquer plástico transparente, ou semicondutor no qual a amostra é medida. As partículas magnéticas descritas neste documento podem já estar presentes no recipiente de amostra quando a amostra é introduzida, ser introduzidas com "a amostra, ou ser introduzidas após a amostra ter sido injetada no recipiente de amostra. 0 recipiente de amostra pode adicionalmente compreender uma superfície de sensor compreendendo uma segunda molécula de ligação. Preferivelmente, a superfície de sensor está localizada na parte inferior do recipiente de amostra. 0 recipiente de amostra pode, em realizações específicas, estar localizado dentro de um cartucho substituível, por exemplo, em um componente autônomo separado do dispositivo sensor. Devido a possível contaminação com uma amostra, tal cartucho pode ser preferivelmente um item descartável, feito, por exemplo, de plástico por moldagem por injeção. Também são previstos cartuchos recicláveis ou peças de cartuchos recicláveis, por exemplo, cartuchos ou peças de cartuchos que possam ser limpos ou esterilizados.

[075] Um "sensor plano", conforme utilizado neste documento, define uma área na qual um evento de sensor real ocorre ou é detectado. Tipicamente, o sensor plano é localizado na parte inferior do recipiente de amostra. 0 sensor plano pode servir para a detecção do número de partículas ligadas, o qual é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes nas amostras. Exemplos de tais sensores planos e sensores correspondentes, que podem ser utilizados no contexto da presente invenção, são providos em Bruls et al. , 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510.

[076] O termo "partícula", conforme utilizado neste documento, significa um objeto pequeno localizado ao qual possa ser atribuída uma propriedade física, tal como volume ou massa. No contexto da presente invenção, uma partícula compreende ou consiste em qualquer material adequado conhecido por um técnico no assunto, por exemplo, a partícula pode compreender, ou consistir em, ou essencialmente consistir em material orgânico ou inorgânico. Tipicamente, uma partícula pode compreender, ou consistir em, ou essencialmente consistir em metal ou uma liga de metais, ou um material orgânico, ou compreender, ou consistir em, ou essencialmente consistir em elementos carboidratos. Exemplos do material previsto incluem agarose, poliestireno, látex, álcool polivinílico, sílica e metais ferromagnéticos, ligas ou materiais de composição. São particularmente preferidos metais magnéticos ou ferromagnéticos, ligas ou composições. Partículas particularmente preferidas úteis na presente invenção incluem partículas superparamagnéticas. 0 termo "superparamagnético", conforme utilizado neste documento, descreve uma forma de magnetismo, a qual aparece em nanopartículas ferromagnéticas ou ferromagnéticas pequenas. É conhecido na técnica que, em nanopartículas suficientemente pequenas, a magnetização pode aleatoriamente mudar de direção sob a influência da temperatura. 0 tempo entre duas viradas é chamado de tempo de relaxamento de Néel. Na ausência de um campo magnético externo, quando o tempo utilizado para medir a magnetização das nanopartículas é muito maior que o tempo de relaxamento de Néel, a magnetização parece ser, em média, zero, isto é, no estado paramagnético. Em tal estado, um campo magnético externo é capaz de magnetizar as nanopartículas de maneira similar a um corpo paramagnético. Entretanto, a suscetibilidade magnética é muito maior que a dos corpos paramagnéticos. Em realizações preferidas adicionais, o material pode ter propriedades específicas. 0 material pode, por exemplo, ser magnético ou não magnético. 0 material pode, em outras realizações, ser hidrofóbico, ou hidrofílico. Em realizações específicas adicionais, a partícula é uma partícula de plástico. Exemplos de partículas de plástico incluem contas de látex ou poliestireno, por exemplo, as comumente utilizadas para purificação. Em ainda outra realização, a partícula pode ser uma partícula semelhante a célula. 0 termo "partícula semelhante à célula", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma estrutura biológica ou semi-biológica, que está presente em sistemas biológicos ou possui a forma e/ou a função de sistemas biológicos ou partes de sistemas biológicos. Um exemplo preferido de uma partícula semelhante à célula é um lipossoma.

[077] O termo "lipossoma", conforme utilizado neste documento, significa uma vesícula, por exemplo, compreendendo uma membrana ou camada, por exemplo, bicamada, lipídica ou fosfolipídica. Tipicamente, os lipossomas são estruturas ocas, que podem ser preenchidas com moléculas, por exemplo, moléculas de fármaco ou composições farmacêuticas, e ser utilizadas para administrar tais moléculas a centros alvo, por exemplo, células cancerosas ou áreas infectadas, etc. Os lipossomas podem preferivelmente ser estruturas compósitas feitas de fosfolipídios e podem conter pequenas quantidades de outras moléculas, por exemplo, ser compostos de fosfolipídios naturalmente derivados com cadeias lipídicas mistas (como fosfatidil etanolamina de ovo) ou outros surfactantes. Um lipossoma pode variar em tamanho de uma faixa de nanômetros a dezenas de micrômetros. Em realizações específicas adicionais, uma partícula pode compreender, consistir essencialmente ou consistir em sefarose ou agarose.

[078] Além disso, uma partícula essencialmente se comporta como uma unidade inteira em termos de seu transporte e suas propriedades. As partículas podem, portanto, ser de um formato simétrico, globular, essencialmente globular ou esférico, ou ser de um formato ou forma irregular assimétrica.

[079] O tamanho de uma partícula prevista pela presente invenção tipicamente varia entre 50 nm e 50 pm. São preferidas partículas na faixa de nanômetros e micrômetros até diversos micrômetros. Em realizações preferidas adicionais, o diâmetro da partícula é maior que 100 nm. 0 termo "diâmetro", conforme utilizado neste documento, refere- se a qualquer segmento de linha reta que passar através do centro da partícula e cujas extremidades estejam na superfície da partícula. Em caso de partículas não esféricas ou semi-esféricas, o diâmetro é entendido como o diâmetro médio do maior e do menor segmento de linha reta que passar através do centro da partícula e cujas extremidades estejam na superfície da partícula. Entende-se ainda que um raio de uma partícula, conforme definido neste documento, é metade de seu diâmetro conforme definido acima neste documento. São particularmente preferidas nanopartículas, por exemplo, partículas de um diâmetro de cerca de 100 nm a 10 micrômetros, mais preferivelmente 100 nm a 3 pm, ainda mais preferivelmente 300 nm a 1000 nm, por exemplo, 300 nm, 310 nm, 320 nm, 330 nm, 340 nm, 350 nm, 360 nm, 370 nm, 380 nm, 390 nm, 400 nm, 410 nm, 420 nm, 430 nm, 440 nm, 450 nm, 460 nm, 470 nm, 480 nm, 490 nm, 500 nm, 510 nm, 520 nm, 530 nm, 540 nm, 550 nm, 560 nm, 570 nm, 580 nm, 590 nm, 600 nm, 620 nm, 650 nm, 670 nm, 700 nm, 720 nm, 750 nm, 770 nm, 800 nm, 820 nm, 850 nm, 870 nm, 900 nm, 920 nm, 950 nm, 970 nm, 1000 nm, ou qualquer valor entre estes. São ainda mais preferidas nanopartículas que tenham um diâmetro de cerca de 500 nm.

[080] Preferivelmente, as partículas de acordo com a presente invenção são funcionalizadas com uma primeira molécula de ligação ou uma segunda molécula de ligação. São também previstas por realizações específicas da presente invenção partículas adicionalmente compreendendo uma estrutura carregada conforme descrita neste documento.

[081] Em uma realização particularmente preferida, o material é um material magnético. Em realizações particularmente preferidas adicionais, a entidade na qual uma estrutura de superfície conforme definida acima neste documento está presente, ou à qual uma primeira ou segunda molécula de ligação de acordo com a presente invenção é fixada, é uma nanopartícula magnética.

[082] Em realizações particularmente preferidas da presente invenção, o material, ou a partícula, por exemplo, nanopartícula, pode ser partículas superparamagnéticas, que são tipicamente dispersas em soluções aquosas e retêm uma pequena carga, por exemplo, uma carga positiva ou negativa, ou possuem um certo potencial zeta para garantir estabilidade coloidal, mantendo as partículas separadas e evitando aglomeração não específica.

[083] São previstos pela presente invenção pelo menos dois tipos de partículas, a saber, uma primeira e uma segunda partícula.

[084] O termo "primeira partícula", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma partícula conforme descrita neste documento que é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação. A primeira molécula de ligação pode ser qualquer molécula capaz de se ligar especificamente a uma molécula-alvo de interesse. A primeira partícula, assim, funciona como uma partícula de captura. A primeira molécula de ligação pode ser fixada à superfície indiretamente através de uma molécula ligante longa e rígida conforme descrita neste documento. A superfície da primeira partícula pode ser adicionalmente modificada por estruturas adicionais, tal como uma estrutura carregada conforme descrita neste documento.

[085] O termo "segunda partícula", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma partícula conforme descrita neste documento que é funcionalizada com uma segunda molécula de ligação. É previsto pela presente invenção que a segunda partícula compreende uma estrutura de superfície descrita neste documento compreendendo uma segunda molécula de ligação. Também é previsto pela presente invenção que a segunda partícula pode se ligar à primeira partícula em virtude da ligação da molécula-alvo. A segunda partícula é, assim, capaz de se ligar à molécula-alvo através da ligação da segunda molécula de ligação. A ligação prevista da primeira partícula tendo capturado a molécula-alvo à segunda partícula leva à formação de aglomerados de partículas, que podem ser detectados conforme descrito neste documento. 0 número de aglomerados de partículas está, então, diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra.

[086] O termo "molécula de ligação", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer molécula tendo uma alta afinidade de ligação por uma segunda molécula, isto é, um parceiro de interação. Uma molécula de ligação no sentido da presente invenção tipicamente compreende frações de ligação ou captura capazes de se ligar a uma molécula-alvo específica conforme definida neste documento, tal como uma biomolécula ou um biomarcador, ou capaz de se ligar a uma entidade-alvo contendo a molécula, tal como, por exemplo, um vírus, ou uma célula ou um fragmento de célula, ou material derivado de tecido.

[087] Em uma realização particularmente preferida, a molécula de ligação é selecionada do grupo que consiste em aptâmeros, peptídeos, proteínas, oligonucleotídeos, em particular, ácidos nucleicos complementares, e polímeros com imprinting molecular, ligantes ou receptores, e lectinas, em que a molécula de ligação preferivelmente é um anticorpo ou um fragmento do mesmo ou um ácido nucleico complementar.

[088] Um "aptâmero" conforme utilizado no contexto de uma molécula de ligação pode ser uma molécula de ácido nucleico curta, por exemplo, uma molécula de RNA, DNA, ou PNA ou qualquer outro formato de ácido nucleico adequado conhecido pelo técnico no assunto, sendo capaz de se ligar a uma molécula-alvo conforme definida neste documento, preferivelmente a uma molécula-alvo de ácido nucleico conforme definida neste documento. Além disso, a presente invenção prevê aptâmeros de peptídeos, isto é, aptâmeros que são capazes de especificamente se ligar uma (s) proteína(s), polipeptídeo(s) ou peptídeo(s) compreendendo uma sequência(s) de aminoácido(s) específica(s) . Tipicamente, (a) aptâmero(s) de peptídeos é/são (um) laço(s)de peptídeos, compreendendo, por exemplo, 10 a 20 aminoácidos. No contexto da presente invenção, o(s) aptâmero(s) de peptídeos pode(m), em realizações específicas, ser fixado(s) em uma ou ambas as extremidades a uma estrutura de andaime. A estrutura de andaime pode ser qualquer molécula, preferivelmente uma proteína, por exemplo, uma proteína que tenha boas propriedades de solubilidade. Moléculas de estrutura de andaime adequadas são conhecidas por um técnico no assunto. Um exemplo de uma molécula de estrutura de andaime adequada a ser utilizada no contexto da presente invenção é a proteína bacteriana tioredoxina-A. 0 laço de peptídeo do aptâmero pode preferivelmente ser inserido dentro de um sítio ativo redutivo da molécula de estrutura. Alternativamente, a proteína estafilocócica A e domínios da mesma e derivados destes domínios, tal como proteína Z ou lipocalinas podem ser utilizados como estruturas no contexto da presente invenção. Os aptâmeros de ácido nucleico ou de peptídeo podem ser gerados de acordo com qualquer método adequado conhecido pelo técnico no assunto, por exemplo, através de abordagens de PCR ou síntese molecular ou abordagens de dois híbridos de levedura.

[089] Um "peptídeo" consiste em cadeias de aminoácidos. Um peptídeo conforme utilizado dentro do contexto de uma molécula de ligação pode compreender ou alternativamente consistir em um trecho de 2 a 35 aminoácidos, derivados de aminoácidos ou uma mistura dos mesmos. 0 peptídeo pode ser linear, ramificado, circular ou mistura dos mesmos. Uma molécula de afinidade de peptídeo pode também ser fixada a uma estrutura de andaime conforme definida acima neste documento.

[090] Uma "proteína" é um polímero de aminoácidos ligado por ligações peptídicas, que pode compreender uma cadeia polipeptídica ou mais de uma cadeia polipeptídica colocadas juntas em uma maneira biologicamente funcional. Uma proteína conforme utilizada dentro do contexto de uma molécula de ligação pode compreender ou alternativamente consistir em um trecho de mais de cerca de 35 aminoácidos, derivados de aminoácidos ou uma mistura dos mesmos. A proteína pode ter uma forma linear, ramificada, circular ou ser compreendida por uma mistura destas formas. Uma molécula de ligação a proteína pode também ser fixada a uma estrutura conforme definida acima neste documento.

[091] Um "oligonucleotídeo" conforme utilizado dentro do contexto de uma molécula de ligação pode compreender ou alternativamente consistir em um trecho de cerca de 5 a 120 nucleotídeos, por exemplo, um trecho de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 15 a 60 nucleotídeos. Uma molécula de ligação a oligonucleotídeo pode preferivelmente ser uma molécula de RNA, DNA ou PNA, ou uma mistura das mesmas. São previstas moléculas de ligação que são moléculas de ácido nucleico complementares. 0 termo "molécula de ácido nucleico complementar" refere-se a uma molécula de uma sequência definida, onde as fitas únicas são complementares umas às outras. É sabido na técnica que fitas complementares de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla possuem uma forte afinidade uma à outra devido à formação de emparelhamento de bases. Também são previstas sequências oligonucleotídicas de fita única, que são fixadas ou integradas à estrutura de molécula ligante conforme definida neste documento. Em realizações particularmente preferidas, tal ligante adequado também compreende ou consiste em uma molécula de ácido nucleico. 0 trecho de fita única é capaz de reconhecer e hibridizar à sequência nucleotídica complementar de interesse com alta afinidade. Em tal análise, a molécula- alvo compreende um oligonucleotídeo que é complementar ou quase complementar à molécula de ligação.

[092] O termo "polímero com imprinting molecular", conforme utilizado neste documento, refere-se a um polímero que foi formado na presença de uma molécula que é extraída em seguida, deixando cavidades complementares para trás. Tipicamente, um polímero com imprinting molecular apresenta uma certa afinidade química pela molécula original. Um polímero com imprinting molecular pode ser composto por qualquer unidade polimérica adequada conhecida por um técnico no assunto. Técnicas para sua produção incluem técnicas de polimerização, tal como polimerização a granel, precipitação, emulsão, suspensão, dispersão, gelificação, e polimerização por inchaço multi-etapa. São particularmente preferidos métodos de imprinting hierárquico.

[093] Um "anticorpo" conforme utilizado dentro do contexto de uma molécula de ligação refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a um antígeno que imunoespecificamente se liga a um antígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, lgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos da presente invenção podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de uma molécula-alvo, por exemplo, polipeptídeo da presente invenção, que eles reconhecem ou aos quais se ligam especificamente. Epítopos específicos e sua interação com anticorpos seriam conhecidos pelo técnico no assunto. 0 termo "especificamente se ligando", conforme utilizado neste documento, refere-se à detecção e ligação imunoespecífica de um anticorpo a um epítopo antigênico. 0 termo "especificamente se ligando" exclui ligação não específica, mas não necessariamente exclui reatividade cruzada com outros antígenos, em particular, com antígenos compreendendo o mesmo epítopo antigênico detectado pelo presente anticorpo.

[094] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, monoclonal, multiespecífico, humano, humanizado ou quimérico, anticorpo de cadeia única, ou constituir um fragmento Fab, fragmento Fab', um fragmento produzido por uma biblioteca de expressão de Fab, F(ab')2, Fv, Fv ligado a dissulfeto, minicorpo, diacorpo, scFv, sc(Fv)2, molécula de imunoglobulina inteira, imunofarmacêutico modular pequeno (SMIP), proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação, anticorpo camelizado, anticorpo contendo VHH, anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) e qualquer fragmento de ligação a epítopo de qualquer um dos itens acima. Mais preferivelmente, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno humanos da presente invenção e incluem Fab, Fab' e F(ab')2, Fv, Fvs de cadeia única (scFv), sc(Fv)2, anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv) e fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH.

[095] Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos (por exemplo, de camundongo e rato), de burro, macaco, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, cavalo, ou galinha.

[096] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de uma molécula-alvo, por exemplo, um polipeptídeo de acordo com a presente invenção ou podem ser específicos tanto para uma molécula-alvo, por exemplo, polipeptídeo de acordo com a presente invenção, bem como para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. São preferidos anticorpos monoespecíficos.

[097] O termo "ligante" conforme utilizado neste documento refere-se, de maneira geral, a uma substância que forma um complexo com uma molécula-alvo, tal como uma biomolécula, e pode, assim se ligar especificamente à molécula com uma alta afinidade de ligação. Em particular, um ligante pode ser uma molécula de disparo de sinal capaz de se ligar a um sítio na proteína-alvo. Um ligante muitas vezes se liga a um parceiro de ligação, muitas vezes chamado de um receptor. Sistemas de receptor-ligante para uso na detecção de moléculas-alvo são conhecidos na técnica. Tipicamente, o ligante que se liga a um receptor altera a conformação química, isto é, o formato tridimensional da proteína do receptor. 0 estado conformacional de uma proteína de receptor determina o estado funcional de um receptor. Ligantes adequados dentro do contexto da presente invenção podem incluir, por exemplo, substratos enzimáticos, inibidores de enzimas, agonistas e antagonistas de receptor, ativadores, tal como proteínas de ligação a DNA, ou neurotransmissores.

[098] O termo "lectina", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma proteína ou glicoproteína capaz de reconhecimento específico de, e ligação reversível a frações de carboidratos de glicoconjugados complexos sem alterar a estrutura covalente de qualquer um dos ligantes de glicosil reconhecidos. Exemplos de lectinas adequadas dentro do contexto da presente invenção incluem lectinas monovalentes como toxinas bacterianas e vegetais, que são capazes de se ligar a frações de açúcar em paredes ou membranas celulares. Outras lectinas adequadas dentro do significado da presente invenção incluem lectinas de ligação à manose, lectinas de ligação à galactose/N- acetilgalactoseamina, lectinas de ligação à N- acetilglicosamina, lectinas de ligação à ácido N- acetilneuramínico ou lectinas de ligação à fucose.

[099] O termo "primeira molécula de ligação", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma molécula de ligação conforme descrita neste documento, capaz de se ligar especificamente a uma molécula-alvo dentro de uma amostra. A primeira molécula de ligação pode ser fixada à superfície da partícula por qualquer método adequado ou em qualquer maneira adequada conhecida pelo técnico no assunto através de uma molécula ligante longa e rígida conforme descrita neste documento.

[100] O termo "fixada à superfície da partícula ou à superfície de sensor plano", conforme utilizado neste documento, refere-se à ligação ou ao acoplamento covalente ou não covalente da primeira molécula de ligação ou segunda molécula de ligação à superfície da partícula. Em particular, tal acoplamento pode, por exemplo, ser uma ligação covalente, uma ligação de van-der-Waals ou uma ligação eletrostática entre as camadas. A fixação à superfície pode ser reversível ou pode ser encerrável, por exemplo, mudando o pH, a temperatura, a concentração de íons, iluminando com luz, por degradação enzimática ou clivagem enzimática, etc.

[101] Deve ser entendido que a primeira ou a segunda molécula de ligação é fixada à superfície da partícula ou superfície de sensor plano através de uma molécula ligante longa e rígida. Isto deve significar que ambas a primeira e/ou a segunda moléculas de ligação podem ser acopladas a uma molécula ligante longa e rígida conforme definido a seguir. É previsto pela presente invenção a provisão de uma certa distância entre a primeira partícula e a segunda partícula ou entre a primeira partícula e a superfície de sensor plano. Será imediatamente apreciado pelo técnico no assunto que, para este propósito, pelo menos uma molécula de ligação deve ser acoplada a um ligante longo e rígido para prover o comprimento de extensão médio previsto. Por exemplo, se uma primeira molécula de ligação for acoplada a uma molécula ligante longa e rígida, a segunda molécula de ligação pode ser diretamente fixada à superfície da segunda partícula ou à superfície de sensor plano. Se a segunda molécula de ligação for provida de um ligante longo e rígido, a primeira molécula de ligação pode ser diretamente fixada à superfície da primeira partícula. Também é concebível que ambas a primeira e a segunda molécula de ligação sejam providas de um ligante longo e rígido para estabelecer a distância vantajosa. Dentro do contexto da presente invenção, deve ser entendido que uma situação conforme a ilustrada na Figura 12 (painel direito) deve ser evitada, onde ambas as primeira e segunda moléculas de ligação não são providas de uma estrutura de ligante, uma vez que tal disposição resultaria em um comprimento de extensão médio apenas mínimo conforme definido neste documento, o que seria insuficiente para atingir o aumento previsto na cinética de ligação.

[102] Em realizações específicas, a primeira molécula de ligação é fixada à superfície da partícula através de uma molécula de ligante longa e rígida. Em uma realização adicional específica, a segunda molécula de ligante não é fixada à superfície da partícula através de uma molécula de ligante longa e rígida.

[103] Em realizações específicas da presente invenção, o acoplamento, a ligação ou a fixação da primeira e/ou segunda molécula de ligação à partícula, por exemplo, partícula magnética, ou superfície de partícula, ou à superfície de sensor plano pode ser uma ligação direta ou indireta.

[104] O termo "ligação direta", conforme utilizado neste documento, significa que a primeira molécula de ligação possui uma conexão imediata à partícula, por exemplo, partícula magnética, sem a presença de moléculas ou funcionalidades intermediárias, de ponte ou conectoras.

[105] O termo "ligação indireta", conforme utilizado neste documento, significa que a molécula de ligação não é diretamente fixada à superfície da partícula, por exemplo, partícula magnética, mas pode ser ligada indiretamente através de moléculas intermediárias, de ponte ou conectoras adicionais, tal como, por exemplo, outras moléculas de ligação, moléculas ligantes ou estruturas carregadas. Por exemplo, avidina, derivados de estreptavidina, (estrept)avidina, proteínas relacionadas a avidina, entidades semelhantes a avidina, tal como tamavidin 1 e 2, bradavidin, NeutrAvidin, etc., podem ser utilizadas como conector entre uma partícula, por exemplo, partícula magnética, e uma molécula de interação que compreende uma fração de ligação compatível, tal como biotina.

[106] Em uma realização específica, uma partícula, por exemplo, partícula magnética, pode ser revestida ou coberta com um conector de avidina ou estreptavidina. Exemplos preferidos adicionais de pares de interação úteis como moléculas conectoras incluem biobina/avidina, qualquer par de anticorpo/antígeno, por exemplo, anti FITC, FITC, anti-sulforrodamina 101/sulforrodamina 101, anti-digoxigenina/digoxigenina, e fitas complementares de ácido nucleico como mencionadas acima neste documento. É previsto pela presente invenção, em particular, o uso de fitas complementares de ácido nucleico, porque o alto grau de multiplexação devido às combinações específicas quase ilimitadas. Será também apreciado pelo técnico no assunto que tais moléculas conectoras que consistem ou compreendem uma sequência de ácido nucleico podem ser facilmente integradas em uma estrutura de ligante.

[107] Uma "estrutura de superfície", de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer estrutura compreendendo moléculas ou uma rede de moléculas adequadas para cobrir uma superfície, tal como uma superfície de sensor plano ou uma superfície de partícula. A estrutura de superfície prevista, assim, serve para o reconhecimento, a ligação e a detecção posterior das primeiras partículas tendo capturado uma molécula-alvo de interesse.

[108] Um "sensor plano", conforme utilizado neste documento, define uma área na qual um evento de sensor real ocorre ou é detectado. Tipicamente, o sensor plano é localizado na parte inferior do recipiente de amostra. 0 sensor plano pode servir para a detecção do número de partículas ligadas, o qual é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes nas amostras. Exemplos de tais sensores planos e sensores correspondentes, que podem ser utilizados no contexto da presente invenção, são providos em Bruls et al., 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510.

[109] O termo "segunda molécula de ligação", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma molécula de ligação, que é compreendida dentro da estrutura de superfície e que é diretamente ou indiretamente fixada à superfície de sensor plano conforme descrito neste documento ou a superfície da segunda partícula conforme descrito neste documento. A segunda molécula de ligação pode ser o mesmo tipo de molécula que a primeira molécula de ligação ou pode ser uma molécula diferente. Em realizações preferida da presente invenção, primeiras e segundas moléculas de ligação são do mesmo tipo ou classe de moléculas. Em realizações específicas da presente invenção, a segunda molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, preferivelmente um anticorpo conforme definido neste documento acima. Em realizações específicas preferidas da presente invenção, a segunda proteína de ligação é capaz de especificamente reconhecer e se ligar à molécula-alvo dentro de uma amostra, entretanto, em um diferente sítio de ligação ou epítopo da molécula-alvo do que o reconhecido pela primeira molécula de ligação. Em uma realização preferida adicional, a segunda molécula de ligação pode ser um segundo anticorpo, por exemplo, um anticorpo conforme definido neste documento acima, que reconhece uma primeira molécula de ligação, por exemplo, um primeiro anticorpo, que pode ser um anticorpo conforme definido neste documento acima.

[110] O termo "dita primeira partícula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da superfície diretamente ou indiretamente" conforme utilizado neste documento, deve significar que a primeira partícula funcionalizada com uma primeira molécula de ligação se liga à segunda molécula de ligação em virtude da ligação à molécula- alvo. Em contraste, qualquer outra ligação da primeira partícula à estrutura de superfície que não é mediada pela molécula-alvo conforme definido neste documento é considerada uma ligação não específica.

[111] "Ligando diretamente" neste contexto, assim, significa que a primeira molécula de ligação, que atua como uma molécula de captura, reconhece e se liga à molécula- alvo, formando, assim, um complexo de captura, e que, por sua vez, é ligado e reconhecido pela segunda molécula de ligação da estrutura de superfície. A este respeito, "ligando indiretamente" significa que a primeira partícula é ligada através de um ou diversos complexos de captura à segunda molécula de ligação. Também é concebível que diversas moléculas-alvo - moléculas de ligação agregadas ou complexas mediam a ligação indireta da primeira partícula à segunda molécula de ligação da estrutura de superfície, enquanto a ligação ainda é considerada sendo específica, uma vez que é mediada pela molécula-alvo.

[112] O termo "molécula ligante", conforme descrito neste documento, pode ser qualquer estrutura adequada para prover a fixação da primeira molécula de ligação e/ou a segunda molécula de ligação à superfície. 0 técnico no assunto estaria ciente de meios e métodos para acoplar uma molécula ligante a uma superfície de partícula ou uma superfície de sensor plano. De acordo com uma realização específica adicional da presente invenção, a maior distância de ponta a ponta necessária para uma melhor cinética de ligação conforme descrito neste documento pode ser atingida ao prover a estrutura de superfície da superfície de sensor plano com uma molécula ligante tendo uma extensão média longa o suficiente.

[113] Para este propósito, a superfície e/ou a molécula ligante pode compreender uma fração de ancoragem capaz de acoplar um ligante a uma superfície. A "fração de ancoragem", conforme utilizado neste documento, deve ser entendida como um conector entre uma molécula ligante conforme definido neste documento e a superfície ou uma ou mais moléculas de superfície diretamente na superfície de partícula. É de relevância específica, assim, qualquer molécula de ponte ou conectora conforme descrita neste documento. Por exemplo, avidina, derivados de estreptavidina, (estrept)avidina, proteínas relacionadas à avidina, entidades semelhantes à avidina, como tamavidin 1 e 2, bradavidin, NeutrAvidin, etc., podem ser utilizados para ancoragem de uma molécula ligante e uma superfície ou estrutura de superfície conforme descrito neste documento. Por exemplo, a fração de ancoragem pode compreender biotina, enquanto a superfície é revestida ou funcionalizada com estreptavidina. Meios e métodos para revestir uma superfície com estreptavidina são conhecidos pelo técnico no assunto ou podem ser derivados de livros didáticos ou fontes da literatura adequadas.

[114] Exemplos preferidos adicionais de pares de interação adequados como moléculas conectoras para ancoragem incluem biobina/avidina, qualquer par de anticorpo/antígeno, por exemplo, anti FITC, FITC, anti- sulforrodamina 101/sulforrodamina 101, anti- digoxigenina/digoxigenina, e fitas complementares de ácido nucleico como mencionadas acima neste documento. A fração de ancoragem pode também compreender fitas complementares de ácido nucleico, devido ao alto grau de multiplexação devido às combinações específicas quase ilimitadas. Será também apreciado pelo técnico no assunto que tais moléculas conectoras que consistem em uma sequência de ácido nucleico podem ser facilmente integradas em uma estrutura de ligante.

[115] Também é previsto pela presente invenção frações de ancoragem compreendendo ou consistindo em um grupo químico que pode ser ligado covalentemente (por exemplo, reticulado) por química de acoplamento a uma superfície ou uma molécula ligada a uma superfície. A reticulação é o processo de unir quimicamente duas ou mais moléculas por uma ligação covalente chamada de bioconjugação. Tipicamente, reagentes de reticulação (ou reticuladores) são moléculas que contêm duas ou mais extremidades reativas capazes ou que se fixam quimicamente a grupos funcionais específicos em proteínas ou outras moléculas tal como grupos funcionais de proteínas, por exemplo, amina primária (-NH2), carboxilas (- COOH), sulfidrilas, ou carbonilas (-CHO), ou grupos reativos tal como carbodiimida (por exemplo, EDC), NHS éster, imidoéster, PFP éster, hidroximetil fosfina, maleimida, haloacetil (bromo- ou iodo-), piridildisulfeto, vinil sulfona, hidrazida, diazirina, aril azida, ou isociantato.

[116] Também é previsto pela presente invenção que a molécula ligante possui um certo comprimento, de modo a atuar como uma molécula espaçadora, isto é, para prover uma certa distância entre a molécula de ligação e a superfície de partícula. É entendido que a provisão de tal distância pode prover diversas outras vantagens:

[117] Por exemplo, uma certa distância pode resultar em menos ligação não específica das partículas a outras moléculas e umas às outras. Além disso, o agrupamento não específico das partículas, por exemplo, partículas magnéticas, que geralmente ocorre pode ser minimizado.

[118] Moléculas ligantes de acordo com a presente invenção, assim, podem ter a função de uma molécula conectora e/ou a função de um espaçador. Para este propósito, estas moléculas poliméricas preferivelmente têm um (a) certo(a) comprimento, força, e/ou rigidez para ser capaz de atuar como fibras poliméricas.

[119] Também é previsto pela presente invenção o uso de polímeros que se organizam em fibras, por exemplo, por dimerização ou multimerização de ordem superior. A vantagem prevista é que a rigidez definida neste documento pode ser aumentada. Também é previsto o uso de "moléculas assistentes" que ajudam a estabelecer uma estrutura de ordem superior tendo a rigidez prevista, o que, por sua vez, resulta no comprimento de extensão médio previsto do ligante. Um exemplo previsto é uma molécula de ácido nucleico de fita única, que pode se organizar em uma estrutura em hélice dimérica, e que, por sua vez, pode se unir a uma molécula assistente. Outros exemplos previstos para moléculas assistentes incluem proteínas capazes de ligar ácidos nucleicos, tal como, ssDNA, dsDNA, ou ambos (por exemplo, proteínas de ligação a DNA) ou a ssRNA, dsRNA, ou ambos (por exemplo, proteínas de ligação a RNA) . A ligação de tais fatores ou proteínas pode preferivelmente ser guiada por motivos de ligação específicos reconhecidos pela proteína de ligação, que podem estar presentes na molécula de ácido nucleico, por exemplo, o dsDNA ou ssDNA ou ssRNA. Uma vez que tais fatores de ligação são ligados à molécula de ácido nucleico, a rigidez do ligante pode ser melhorada e levar a ligantes com maior comprimento de extensão médio. Tal modificação de ligante pode ser realizada antes ou durante um ensaio. Em realizações específicas adicionais da presente invenção, moléculas assistentes, tal como proteínas de ligação a RNA ou DNA, pode compreender domínios de interação proteína-proteína, por exemplo, domínios SH3, PDZ, 14-3-3 e SH2 ou qualquer outro domínio adequado conhecido pelo técnico no assunto. Fatores de ligação secundários, que compreendem domínios de reconhecimento ou domínios de interação compatíveis, podem, portanto, ser providos, permitindo a montagem de complexos compreendendo ácidos nucleicos ligados por moléculas assistentes, que, por sua vez, podem ser ligadas por moléculas de interação secundárias. Em realizações adicionais, estruturas ligantes rígidas podem ser providos na forma de polipeptídeo poliméricos, por exemplo, com base na forma e/ou identidade molecular de colágeno, ou proteínas semelhantes a colágeno, tal como Sell, Scl2, SclA, ou SclC. Estas moléculas podem também ser combinadas com outras moléculas ligantes ou grupos funcionais definidos neste documento.

[120] Em realizações específicas da presente invenção, as moléculas ligantes poliméricas podem ser moléculas poliméricas capazes de auto-montagem sob condições adequadas. Portanto, as moléculas poliméricas podem ser providas em conjunto com partículas levando à montagem dos polímeros na superfície da partícula. A auto-montagem pode ser controlada por parâmetros adequados, por exemplo, a concentração de monômeros ou unidades poliméricas necessárias para a polimerização, a concentração de fatores de ponte para monômeros ou unidades poliméricas, o pH do ambiente de reação, a temperatura, a presença de ions, a presença de fatores assistentes, tal como proteínas, etc. Os polímeros auto-montados podem, em realizações adicionais, ser desintegrados após a mudança de tal condição adequada, por exemplo, pela mudança do pH, a redução ou o aumento da concentração de fatores ou monômeros, a mudança de temperatura, etc.

[121] Também é concebível que a molécula ligante compreenda ou consista em uma estrutura carregada conforme definida neste documento ou seja integrada em uma estrutura de superfície estérica conforme descrita neste documento.

[122] Em realizações específicas adicionais da presente invenção, as moléculas ligantes podem ser lineares, circulares, ou moléculas de tipo ramificadas, ou uma mistura das mesmas.

[123] Moléculas ligantes adequadas dentro do contexto da presente invenção podem ser, por exemplo, ácidos nucleicos, ácidos ribonucleicos, peptideos, polipeptídeos, proteínas, carboidratos, lipídios, polietilenoglicol, polissacarídeos, dendrímeros, dendritos, nanotubos, ou quaisquer derivados ou combinações dos mesmos adequadas.

[124] Moléculas de ácido nucleico, conforme definidas neste documento, podem ser vantajosamente também utilizadas como "moléculas ligante de ácido nucleico". Estas moléculas ligantes podem compreender moléculas de ácido nucleico de fita única e/ou dupla, preferivelmente moléculas de DNA, ou qualquer tipo de derivado das mesmas. 0 DNA pode, por exemplo, ser na forma de, por exemplo, A-DNA, B-DNA ou Z- DNA ou qualquer mistura destas formas. A molécula ligante pode também ser uma molécula de PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA, ou qualquer mistura ou combinação das mesmas, ou qualquer mistura ou combinação com outra molécula ligante definida neste documento, por exemplo, com um tipo de ácido nucleico, tal como DNA ou RNA.

[125] O termo "PNA" refere-se a um ácido nucleico de peptídeo, isto é, um polímero sintetizado artificialmente similar a DNA ou RNA que é utilizado em pesquisa biológica e tratamentos médicos, mas que não é conhecido por ocorrer naturalmente. A espinha dorsal do PNA é tipicamente composta por unidades repetidas de N-(2- aminoetil)-glicina ligadas por ligações peptídicas. As diversas bases de purina e pirimidina são ligadas à espinha dorsal por ligações de carbonila metileno. PNAs são geralmente ilustrados como peptídeos, com o N-terminal na primeira posição (esquerda) e o C-terminal à direita. Enquanto o DNA e o RNA possuam uma espinha dorsal de desoxirribose e ribose, respectivamente, a espinha dorsal de PNA é composta por unidades repetidas de N-(2-aminoetil)- glicina ligadas por ligações peptídicas. É conhecido na técnica que oligômeros de PNA também apresentam maior especificidade na ligação a DNAs complementares. Detalhes adicionais podem ser derivados de qualquer fonte ou livro didático da literatura, por exemplo, Nielsen PE, Egholm M (1999) , An Introduction to Peptide Nucleic Acid, Curr. Issues Mol. Biol. 1 (2): 89-104.

[126] O termo "CNA" refere-se a um ácido de aminociclohexiletano e ácido nucleico. Além disso, o termo refere-se a um ácido nucleico de ciclopentano, isto é, uma molécula de ácido nucleico compreendendo, por exemplo, 2'- desoxicarbaguanosina.

[127] O termo "HNA" refere-se a ácidos nucleicos de hexitol, isto é, análogos de DNA que são construídos a partir de nucleobases padrão e uma espinha dorsal de 1,5-anidrohexitol fosforilada.

[128] O termo "LNA" refere-se a ácidos nucleicos bloqueados. Tipicamente, um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo de RNA modificado e, assim, inacessível. A fração de ribose de um nucleotídeo de LNA pode ser modificada com uma ponte extra conectando os carbonos 2' e 4'. Tal ponte bloqueia a ribose em uma conformação estrutural 3'-endo. A conformação de ribose bloqueada melhora o empilhamento de bases e a pré-organização da espinha dorsal. Isto pode aumentar significativamente a estabilidade térmica, isto é, a temperatura de fusão do oligonucleotídeo.

[129] O termo "ANA" refere-se a ácidos nucleicos arabinoicos ou derivados dos mesmos. Um derivado de ANA preferido no contexto da presente invenção é um 2'- desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleosídeo (2'F-ANA).

[130] Em certas realizações da presente invenção, uma molécula ligante de ácido nucleico pode estar presente em uma forma de fita dupla ou duplex, isto é, compreendendo uma fita e uma contra-fita complementar ou anti-paralela de uma molécula de ácido nucleico associada por pareamento de bases entre as fitas, ou uma fita de sentido ou anti-sentido de uma molécula de ácido nucleico. 0 termo "fita de sentido", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma molécula compreendendo a sequência, que é a mesma que uma cópia de RNA mensageiro que é ou pode ser traduzida em uma proteína. 0 termo, dentro do contexto da presente invenção, adicionalmente refere-se a moléculas compreendendo uma fita de uma molécula de ácido nucleico duplex, que não é idêntica a sua contra-fita complementar. Portanto, o termo "fita anti- sentido", conforme utilizado neste documento, refere-se à molécula compreendendo a fita complementar ou oposta em relação à dita de sentido conforme definida acima. Em realizações específicas adicionais, uma molécula ligante de ácido nucleico pode ser uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla ou duplex. Alternativamente, a molécula ligante de ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico de fita única ou uma molécula de ácido ribonucleico de fita única.

[131] Em realizações específicas, a molécula ligante é uma molécula de ácido ribonucleico, ou qualquer mistura de um ácido ribonucleico com qualquer uma das outras moléculas de ácido nucleico mencionadas ou com qualquer outra molécula ligante conforme definida neste documento, preferivelmente uma molécula de RNA, ou qualquer tipo de derivado da mesma. 0 RNA pode estar na forma de, por exemplo, p-RNA, isto é, piranosil-RNA ou formas estruturalmente modificadas como RNA na forma de grampo ou um RNA na forma de laço de haste.

[132] O ácido nucleico, incluindo moléculas de ácido ribonucleico, pode ser de diferentes composições de base e/ou comprimentos conforme definido neste documento. 0 comprimento da molécula ligante pode se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas neste documento, da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular, uma vez que as moléculas de ácido nucleico se utilizadas como ligantes podem prover uma carga líquida específica à partícula, qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula ligante de ácido nucleico pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula ligante de ácido nucleico não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0 .

[133] Em uma realização preferida específica da presente invenção, a molécula ligante é ou compreende uma molécula selecionada do grupo que consiste em um DNA de fita dupla ou dsDNA, RNA de fita dupla ou dsRNA, PNA, um duplex PNA-DNA, e um duplex RNA-DNA.

[134] Um aspecto vantajoso, que também é previsto por realizações adicionais preferidas da presente invenção, é que PNAs e duplex PNA/DNA ou PNA/DNA não são facilmente reconhecidos por nucleases ou proteases, tornando- os resistentes à degradação enzimática.

[135] Em realizações adicionais da presente invenção, ácidos nucleicos adequados também compreendem ou consistem em moléculas de DNA de fita única de diferentes composições de bases e/ou comprimentos. As moléculas de fita única podem, por exemplo, abranger a repetição de sequência de base, ser totalmente aleatórias, ou ser derivadas da natureza, ou ser de apenas uma base, por exemplo, AAA etc., TTT etc. , CCC etc. , ou GGG etc. ; ou compreender trechos de tais regiões de monobase, por exemplo, ser compreendidas apenas por A e C, ou C e T.

[136] Peptídeos, polipeptídeos ou proteínas podem ser ligantes adequados devido à sua forma, rigidez e conformação. Ligantes de molécula peptídica podem ser de diferentes composições de aminoácidos e/ou comprimentos. 0 comprimento de um ligante de molécula peptídica pode variar entre cerca de 3 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos. Também são previstos outros comprimentos ou qualquer valor de comprimento dentro da faixa indicada. A molécula ligante de peptídeo pode, por exemplo, ter um comprimento de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais aminoácidos. A composição de aminoácidos pode variar entre composições de mono aminoácido, por exemplo, apenas um dos aminoácidos naturalmente produzidos ou qualquer derivado dos mesmos ou de aminoácidos sinteticamente disponíveis, e composições de aminoácidos completamente aleatórias compreendendo ou sendo selecionados dentre todos os aminoácidos conhecidos. Também são previstas composições compreendendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 ou mais aminoácidos diferentes. Os aminoácidos podem estar presentes em trechos de aminoácidos idênticos ou ser providos na forma de padrões ou motivos, ou ser distribuídos aleatoriamente.

[137] O comprimento da molécula ligante de moléculas peptídicas pode, em realizações específicas, se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas neste documento, da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular, uma vez que as moléculas peptídicas, se utilizadas como ligantes, podem prover uma carga líquida específica à partícula, qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula ligante de peptídeo pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula ligante de peptídeo não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0 .

[138] As moléculas ligantes de proteína ou polipeptídeo podem ser de diferentes composições de aminoácidos e/ou comprimentos. 0 comprimento da molécula de proteína ou polipeptídeo pode variar entre cerca de 35 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, ou mais. Também são previstos outros comprimentos ou qualquer valor de comprimento dentro da faixa indicada. A molécula de peptídeo pode, por exemplo, ter um comprimento de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 aminoácidos ou mais.

[139] O comprimento da molécula ligante de proteína ou polipeptídeo pode, em realizações específicas, se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas acima neste documento, da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular, uma vez que as moléculas de proteína ou polipeptídeo, se utilizadas como ligantes, podem prover uma carga líquida específica à partícula, qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula ligante de polipeptídeo ou proteína pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula de polipeptídeo ou proteína não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0.

[140] "Moléculas de carboidratos" podem ser ligantes adequados devido à sua forma, rigidez e confirmação. Tais carboidratos podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos. 0 comprimento da molécula pode variar entre cerca de 5 átomos de C a cerca de 100 átomos de C, ou mais. Também são previstos outros comprimentos ou qualquer valor de comprimento dentro da faixa indicada. A molécula de carboidrato pode, por exemplo, ter um comprimento de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 átomos de C ou qualquer outro número de átomos de C entre os valores indicados.

[141] O comprimento da molécula ligante carboidratos pode, em realizações específicas, se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas neste documento, da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular, uma vez que as moléculas de carboidratos, se utilizadas como ligantes, podem prover uma carga líquida específica à partícula, qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula ligante de carboidratos pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula ligante de carboidrato não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0.

[142] "Lipídios" podem ser moléculas ligantes adequadas devido à sua forma, rigidez e confirmação. Os lipídios constituem um amplo grupo de moléculas que ocorrem naturalmente, incluindo, entre outras, gorduras, ceras, estiróis, vitaminas lipossolúveis (tais como vitaminas A, D, E e K) , monoglicerídeos, diglicerídeos, fosfolipídios. Tais lipídios são tipicamente construídos a partir de uma cauda lipídica e um grupo de cabeça. Exemplos de lipídios adequados incluem fosfolipídios, por exemplo, fosfatidil-etanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidil-etanolamina de ovo, dioleoilfosfatidil etanolamina. São particularmente preferidos os fosfolipídios MPPC, DPPC, DPPE-PEG2000 ou Liss Rhod PE. Os lipídios podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos. 0 comprimento da molécula pode variar entre cerca de 5 átomos de C a cerca de 100 átomos de C, ou mais. Também são previstos outros comprimentos ou qualquer valor de comprimento dentro da faixa indicada. A molécula de lipídio pode, por exemplo, ter um comprimento de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 átomos de C ou qualquer outro número de átomos de C entre os valores indicados.

[143] O comprimento da molécula ligante de lipídio pode, em realizações específicas, se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas neste documento, da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular, uma vez que as moléculas lipídicas, se utilizadas como ligantes, podem prover uma carga líquida específica à partícula, qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula espaçadora lipídica pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula ligante de lipídio não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0.

[144] Em uma realização preferida adicional, a estrutura de ligante pode também compreender ou consistir em um polímero não biológico. 0 termo "polímero não biológico", conforme utilizado neste documento, refere-se a um polímero que não é de uma fonte biológica (biopolímero) e é quimicamente sintetizado. Polímeros adequados para este propósito foram descritos na técnica (por exemplo, por Ratner, B.D.; Hoffman, A.S.; Schoen, F.J.; Lemons, J.E., Biomaterials Science, 2a Ed.; Eds.; Elsevier: Londres, 2004) . Exemplos de polímeros não biológicos adequados incluem polímeros biodegradáveis, tal como poli(ácido glicólico) (PGA) ou poli(ácido láctico) (PLA), poli(caprolactona) (PCL, poli(W-vinil-2-pirrolidona) (PVP), polidioxanona (PDS), ou poli(etilenoglicol) (PEG) ou copolímeros dos mesmos, também chamados de heteropolímeros, que são derivados de duas (ou mais) espécies monoméricas. 0 termo "polímero em bloco", conforme utilizado neste documento, refere-se a copolímeros compreendendo duas ou mais subunidades de homopolímero ligadas por ligações covalentes. Copolímeros em bloco com dois ou três blocos distintos são chamados copolímeros em dibloco e copolímeros em tribloco, respectivamente. Copolímeros em bloco preferidos incluem, entre outros, copolímeros poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA), poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno) (PEP-PPO) poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno) poli(óxido de etileno) (PEP-PPO-PEO), poli(óxido de etileno)-bloco-poli(L-lactídeo) ('PEG-PLLA) , poli (óxido de etileno)-bloco-poli (caprolactona) (PEG-PCL), poli(etilenoglicol)-bloco-poli(ácido a-hidroxi) (PEG-PHA) ou Pluronic P-105.

[145] As moléculas de polietilenoglicol podem, em particular, ser utilizadas como "moléculas ligantes de polietilenoglicol" no contexto da presente invenção devido a sua forma, rigidez em potencial e confirmação. Os polietilenoglicóis previstos pela presente invenção podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos. Variantes de polietilenoglicol (PEG) preferidas incluem moléculas de PEG polidispersas ou monodispersas. É particularmente preferido PEG monodisperso. Os PEGs podem ainda ser ramificados, por exemplo, tendo 3 a 10 cadeias de PGE emanando de um grupo de núcleo central, ser PEGs estrela tendo 10 a 100 cadeias de PEG emanando de um grupo de núcleo central, ou ser PEGs em pente, que possuem múltiplas cadeias de PEG enxertadas a uma diferente espinha dorsal de polímero ou PEG linear. De acordo com os pesos moleculares médios do PEG, PEGs previstos podem ser PEG 10.000, PEG 12.000, PEG 15.000, PEG 20.000 ou PEGs tendo maiores pesos moleculares. É particularmente preferido um PEG maior que PEG 10.000.

[146] Moléculas de PEG menores, tal como, por exemplo, PEG 400, PEG 600, PEG 800, PEG 1000, PEG 1500, PEG 2000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, ou PEG 8000 podem também ser utilizadas como parte de estruturas ligantes, por exemplo, em combinação com uma ou mais moléculas ligantes conforme definidas neste documento.

[147] O comprimento das moléculas ligantes de polietilenoglicol pode, em realizações específicas, se tornar dependente do tamanho ou do diâmetro da partícula, da presença, tamanho ou do comprimento de moléculas de estrutura carregada conforme definidas neste documento, ou da carga líquida específica geral prevista da partícula, em particular se derivados da molécula de polietilenoglicol que portem cargas elétricas forem utilizados, ou qualquer distância de ponta a ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, ou qualquer flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante. Em certas realizações da presente invenção, a molécula ligante de polietilenoglicol, em particular, um derivado da mesma ou versão modificada da mesma, pode ser uma molécula carregada ou não carregada. 0 termo "molécula de polietilenoglicol não carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma carga líquida da molécula de cerca de 0.

[148] "Dendrímeros" ou "Moléculas ligantes dendriméricas" podem ser quaisquer moléculas grandes aproximadamente esféricas repetidamente ramificadas. Tais dendrímeros podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos, e/ou graus de ramificação. 0 comprimento pode se tornar dependente da carga líquida específica geral prevista, da distância ponta-a-ponta prevista entre a molécula de ligação e a superfície da partícula, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas carregadas por partícula. Dendrímeros conforme previstos pela presente invenção podem compreender espécies de baixo peso molecular ou alto peso molecular. Os dendrímeros de acordo com a presente invenção são preferivelmente não carregados, isto é, as moléculas mostram uma carga líquida de 0.

[149] Também é previsto pela presente invenção o uso de dendrímeros de acordo com a presente invenção como parte de um ligante. Para este propósito, os dendrímeros podem, em certas realizações, compreender grupos funcionais na superfície molecular, por exemplo, grupos hidrofílicos, ou alternativamente, ter funcionalidade interna. Dendrímeros conforme previstos para os propósitos da presente invenção podem ser dendrímeros de Ia, 2a, 3a, 4a geração ou geração superior. Dendrímeros preferidos incluem, por exemplo, dendrímero newkome ou arbolol, e Poliamidoamina (PAMAM). Será apreciado por um técnico no assunto que os dendrímeros levam a estruturas que podem ser vantajosamente utilizadas para prover uma estrutura de superfície volumosa e estérica na superfície da partícula ou superfície plana em que a molécula de ligante conforme descrita acima neste documento faz parte de tal estrutura ou é incorporada na mesma. Variantes adicionais a serem utilizadas dentro do contexto da presente invenção, bem como métodos de síntese, etc. seriam conhecidas pelo técnico no assunto ou podem ser derivadas de documentos adequados, tal como "Dendrimers and other dendritic polymers", Frechet e Tomalia, J. Wiley.

[150] "Dendritos" ou "moléculas ligantes dendríticas" são entendidos contendo um único grupo de dendrímeros quimicamente abordável, isto é, um ponto focal de um dendrímero conforme definido acima neste documento. Os dendritos de acordo com a presente invenção são preferivelmente não carregados, isto é, as moléculas mostram uma carga líquida de 0. Em realizações específicas da presente invenção, os dendritos podem ser utilizados como parte de um ligante conforme definido neste documento.

[151] O termo "nanotubo", conforme utilizado neste documento, refere-se a nanotubos de carbono, isto é, alótropos de carbono com uma nanoestrutura cilíndrica. Tais nanotubos podem ser nanotubos de parede única ou nanotubos de paredes múltiplas. A presente invenção também prevê moléculas ligantes da família estrutural fulereno de diferentes tipos, formas e complexidades, por exemplo, esféricas, ou formas de fulereno elipsoides, fulereno, ou uma combinação de nanotubos com fulerenos, etc. Os nanotubos de acordo com a presente invenção ou outras moléculas ligantes adequadas conhecidas pelo técnico no assunto são preferivelmente não carregados, isto é, as moléculas apresentam uma carga líquida de 0.

[152] A molécula ligante de acordo com a presente invenção preferivelmente possui certo comprimento e consistência para ser capaz de aumentar a probabilidade de ligação da partícula a uma superfície para resultar em melhor cinética de ligação. Na técnica anterior, o ligante ou os espaçadores foram meramente considerados para a conexão de uma molécula de ligação a superfícies e em termos de acessibilidade das moléculas de ligação. Entretanto, o comprimento de um ligante, especialmente em relação a uma extensão máxima da partícula, não foi descrito previamente. É previsto pelo presente pedido de patente, portanto, a provisão de moléculas ligantes adequadas tendo um certo comprimento que sejam adequadas para estender o ponto de fixação da molécula de ligação conforme definido neste documento mais afastado da superfície da partícula ou da superfície de sensor plano. Conforme pode ser visto na Figura 4, a abordagem prevista abre um maior número de orientações nas quais uma partícula pode se ligar à superfície.

[153] Também é previsto pela presente invenção, assim, uma partícula conforme definida neste documento, onde a molécula de captura ou ligação é fixada à superfície da partícula através de uma molécula ligante tendo um certo comprimento de extensão médio conforme definido neste documento. Em um exemplo específico da presente invenção, o uso de uma molécula de dsDNA longa e rígida como um ligante resulta em uma extensão média significativa da molécula de ligação à superfície. A abordagem prevista resulta em uma melhoria significativa da cinética de ligar uma partícula ao sensor plano ou à superfície de partícula conforme definido neste documento. Conforme pode ser derivado a partir das Figuras 6 e 7, pôde ser demonstrado que o número de partículas ligadas é uma função do comprimento do ligante. Nestes exemplos, partículas revestidas com estreptavidina 500 nm e 1000 nm foram incubadas com ligante de dsDNA de comprimento variável. Cada molécula de ligante de dsDNA continha uma molécula de biotina em uma extremidade e uma molécula de sulforrodamina 101 na outra extremidade e a superfície de sensor plano foi revestida com anticorpos anti sulforrodamina 101. Os gráficos de acordo com as Figuras 6 e 7 mostram o aumento do número de partículas ligadas com o aumento do comprimento (bp) da molécula de ligante de dsDNA. 0 comprimento ideal maior que 700 bp para partículas de 500 nm correspondem a um comprimento de contorno maior que 240 nm e um comprimento de extensão médio maior que 140 nm. Conforme pode ser visto na Figura 7, o comprimento de ligante ideal é 1000 bp, correspondendo a um comprimento de contorno de 340 nm para uma partícula maior (por exemplo, 1000 nm) e um comprimento de extensão médio de cerca de 170 nm. 0 comprimento de ligante ideal é, assim, dependente do tamanho de partícula e pode, em certas realizações da presente invenção, ser adaptado para o tamanho de partícula ou diâmetro de partícula, por exemplo, com base nos resultados experimentais descritos na porção de Exemplos abaixo neste documento.

[154] O termo "comprimento de extensão médio", conforme utilizado neste documento, é definido como a distância de ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante

que pode ser descrito de acordo com o seguinte modelo de cadeia vermiforme como:

[155]

[156] em que P é o comprimento de persistência do polímero e 1 é o comprimento de contorno do ligante.

[157] O termo "comprimento de contorno", conforme utilizado neste documento, refere-se ao comprimento de contorno de uma cadeia de polímero como o comprimento na extensão máxima fisicamente possível.

[158] Diversos polímeros biologicamente importantes podem ser efetivamente modelados como cadeias vermiformes, incluindo DNA e RNA de fita dupla, RNA não estruturado e polímeros não estruturados. 0 modelo de cadeia vermiforme de Kratky Porod é adequado para modelagem de polímeros semi-flexíveis para aproximar distâncias de ponta a ponta e comprimentos de persistência. 0 técnico no assunto, entretanto, está ciente de diversos outros modelos teóricos, por exemplo, conforme descrito a seguir, para distâncias de ponta-a-ponta aproximadas e comprimentos de persistência.

[159] O termo "comprimento de persistência, P" conforme utilizado neste documento refere-se a uma propriedade mecânica básica quantificando a firmeza ou rigidez de um polímero ou uma cadeia e é definido como o comprimento ao longo do qual correlações na direção da tangente são perdidas. Na química, pode também ser definida a soma média das projeções de todas as ligações j > i na ligação i em uma cadeia infinitamente longa (Flory, Paul J. (1969), Statistical Mechanics of Chain Molecules, Nova Iorque: Interscience Publishers). Quando o ângulo θ entre um vetor que é tangencial ao polímero na posição 0 (zero) e um vetor de tangente em uma distância L longe da posição 0, o valor de expectativa do cosseno do ângulo decai exponencialmente com a distância,

[160

[161] onde P é o comprimento de persistência e os colchetes denotam a média ao longo de todas as posições de partida. Os polímeros flexíveis, tal como PEG, podem ser descritos utilizando o modelo de Flory (passe aleatório).

[162] O comprimento de persistência pode também ser definido utilizando a rigidez em flexão Bs, o módulo E de Young e a seção da cadeia polimérica, conforme descrito em Mofrad, M.R.K, "Cytoskeletal mechanics: measurements", Cambridge Univ Press, 2006.

[163] No caso de uma haste rígida e uniforme, I pode ser expresso como:

[164] onde a ê o raio.

[165] Na ciência de polímeros, o comprimento de persistência pode também ser definido como metade do comprimento de Kuhn, isto é, o comprimento de segmentos hipotéticos em que a cadeia pode ser considerada como unida livremente. 0 comprimento de persistência é igual à projeção média do vetor ponta a ponta na tangente ao contorno de cadeia em uma extremidade de cadeia no limite do comprimento de cadeia infinito.

[166] Conforme pode ser visto na Figura 5, o comprimento de uma molécula ligante em si não é um critério para gerar uma alta extremidade-a-distância, isto é, para posicionar a molécula de ligação para longe da superfície de partícula ou superfície de sensor plano. A Figura 5 exemplarmente mostra um esboço comparando a extensão de um anticorpo fixado à superfície através de um ligante PEG (esquerda) contra um ligante de dsDNA (direita) ambos tendo o mesmo comprimento de contorno. 0 uso de moléculas ou polímeros que são muito longos em termos de comprimento de contorno, mas também flexíveis, podem, entretanto, resultar em uma dobra da molécula, e finalmente, uma estrutura globular com uma extensão pequena. É previsto, assim, uma extensão melhorada da molécula de ligação da superfície ou uma maior distância de ponta a ponta que pode ser atingida pela provisão de um ligante longo e também rígido conforme descrito neste documento. No exemplo ilustrado na Figura 5, o comprimento de extensão médio de uma molécula de dsDNA de 170 nm, que é considerado rígido, conforme definido neste documento, é 10 vezes maior que o comprimento de extensão médio de uma molécula de PEG do mesmo contorno. Entretanto, é concebível também o uso de ligantes muito flexíveis com um grande comprimento de contorno, contanto que a extensão média resultante seja suficiente grande para prover o efeito previsto.

[167] É prevista pelo presente pedido de patente também a provisão de condições adequadas sob as quais o comprimento de extensão médio definido neste documento é aumentado para resultar em cinética de ligação melhorada. Em realizações particularmente preferidas da presente invenção, exemplos para ligantes longos e rígido adequados incluem moléculas baseadas em ácido nucleico de fita dupla. Por exemplo, devido à alta rigidez, um ligante de dsDNA de 700 bp √<R2>Type equation here. seria igual a -140 nm, um ligante de 1000 bp resultaria em √<R2> de cerca de -170 nm.

[168] Em realizações específicas da presente invenção, as moléculas de ligante podem ter um comprimento de extensão médio de pelo menos cerca de 60 nm, preferivelmente até cerca de 500 nm, preferivelmente de pelo menos cerca de 6 5 nm, 7 0 nm, 7 5 nm, 8 0 nm, 8 5 nm, 9 0 nm 9 5 nm ou 100 nm, ainda mais preferivelmente de pelo menos cerca de 110 nm, 120 nm, 13 0 nm, 14 0 nm, 150 nm, 16 0 nm, 17 0 nm, 180 nm, 190 nm, ou 200 nm, ainda mais preferivelmente de pelo menos cerca de 220 nm, 250 nm, 270 nm, ou 300 nm, mais preferivelmente de pelo menos 320 nm, 350 nm, 370 nm, ou 400 nm. Em realizações adicionais, o comprimento de extensão médio da molécula ligante pode também ser maior que 400 nm. A molécula ligante pode também ter qualquer outro comprimento de extensão médio entre os valores indicados.

[169] Em realizações específicas da presente invenção, o comprimento de extensão médio ideal da molécula de ligante é pelo menos 1/10, preferivelmente pelo menos 1/9, preferivelmente 1/8, mais preferivelmente pelo menos 1/4, e mais preferivelmente 2/3 do diâmetro de uma partícula conforme descrita neste documento.

[170] Em uma realização adicional preferida, o comprimento de extensão médio é pelo menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, ou 19%, mais preferivelmente 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% , ou 29%, ainda mais preferivelmente 30%, 31%, 32%, 34%, 35% , 36% 37%, 38%, 39%, mais preferivelmente 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50% do diâmetro de uma partícula conforme desci :ita neste documento.

[171] Em realizações particularmente preferidas, uma partícula de um diâmetro de cerca de 500 nm pode compreender moléculas ligantes mostrando um comprimento de extensão médio de cerca de 25 a 30%, mais preferivelmente de cerca de 27% do diâmetro da partícula. Em realizações preferidas adicionais, uma partícula de um diâmetro de cerca de 1000 nm pode compreender moléculas ligantes mostrando um comprimento de extensão médio de cerca de 15 a 20%, mais preferivelmente de cerca de 17% do diâmetro da partícula.

[172] Também é previsto pela presente invenção a provisão de condições de detecção ou mudanças em condições de detecção, tal como mudança de pH ou uma mudança de temperatura levando a uma mudança conformacional da molécula ligante e/ou uma mudança nas características de rigidez da molécula ligante. Por exemplo, uma molécula ligante com um alto comprimento de contorno, mas baixa rigidez que é dobrada poderia ser estendida pela abordagem prevista. Também é concebível adicionar um(a) composto, composição, molécula, solvente, e/ou íon adicional que possa interagir ou reagir com a molécula ligante de modo a resultar em uma maior rigidez da molécula ligante e para uma melhor extensão média da molécula ligante conforme definida acima neste documento.

[173] Também é concebível forçar uma maior extensão em virtude do aumento da densidade de superfície da molécula ligante. É apreciado que, embora o comprimento de extensão médio dos polímeros flexíveis seja reduzido devido à formação de estruturas globulares, um aumento da densidade da molécula ligante sobre a partícula ou superfície de sensor plano pode resultar em uma sobreposição de moléculas, de modo que as moléculas ligantes possam estabilizar umas às outras como pode ser visto na Figura 8. Os resultados mostrados na Figura 9, entretanto, demonstram que a flexibilidade do ligante é um aspecto importante contribuindo para uma melhor cinética de ligação. Os gráficos na Figura 9 demonstram que a cinética de ligação é reduzida como resultado de menor mobilidade após sobrecarregar a superfície com mais moléculas de dsDNA. É previsto, assim, uma molécula ligante longa e rígida que pode ainda reter uma certa mobilidade suficiente para realizar as diferentes orientações da molécula ligante para chegar no aumento de cinética de ligação previsto. 0 número e/ou o comprimento de moléculas ligantes podem, portanto, ser adaptados às propriedades da partícula, em particular, ao tamanho da partícula.

[174] Conforme utilizado neste documento, "rigidez" ou "rígido", também chamado de "firmeza", define a propriedade de um corpo sólido de resistir à deformação. É apreciado que a rigidez de uma molécula ligante essencialmente contribui para o comprimento de extensão médio. "Flexível", conforme utilizado neste documento, refere-se à propriedade de um corpo sólido que pode ser facilmente deformado. No contexto da presente invenção, uma molécula, um polímero, ou ligante flexível, assim, possui uma baixa rigidez conforme definido neste documento, o que pode resultar em uma flexão e dobra da molécula.

[175] Em uma realização específica da presente invenção, a rigidez de uma molécula ligante é determinada através da distância de ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante √<R2> como definido acima. Em certas realizações, a rigidez pode, portanto, ser medida em termos da distância ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante em comparação com seu comprimento de contorno conforme definido neste documento. Assim, por exemplo, um comprimento de contorno de uma molécula ligante, que é essencialmente idêntico ao comprimento de extensão médio de uma molécula ligante, indica uma alta rigidez da molécula ligante. Por outro lado, um comprimento de contorno de uma molécula ligante que é significativamente maior que o comprimento de extensão médio do dito ligante indica uma baixa rigidez da molécula ligante.

[176] Em realizações preferidas da presente invenção, a rigidez e o comprimento da molécula ligante são selecionados de modo que a distância de ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante √<R2> seja pelo menos cerca de 5%, 10%, ou 15%, preferivelmente cerca de 20%, 25%, ou 30%, 35%, ainda mais preferivelmente cerca de 40%, 45%, ou 50%, mais preferivelmente cerca de 55%, 60%, 65%, 70% ou 75% em relação ao diâmetro da partícula.

[177] Em outra realização preferida da presente invenção, a rigidez e o comprimento da dita molécula ligante são selecionados de modo que a distância de ponta a ponta de valor quadrático médio do ligante √<R2> seja pelo menos cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, ou 19%, mais preferivelmente 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, ou 29%, ainda mais preferivelmente 30%, 31%, 32%, 34%, 35%, 36% 37%, 38%, 39%, mais preferivelmente 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50% em relação ao diâmetro da partícula.

[178] Em realizações preferida da presente invenção, um maior aumento de sensibilidade e cinética de ligação pode ser atingido quando ambas as estruturas de superfície, a saber, a superfície da partícula e a superfície de sensor plano compreendem um ligante longo e rígido conforme descrito acima neste documento.

[179] Também é previsto pelo presente pedido de patente que o ligante seja provido a uma partícula antes de um ensaio, isto é, antes da captura de uma molécula-alvo. A Figura 10 mostra partículas que são pré-carregadas com moléculas de ligação fixadas à superfície através de uma molécula ligante longa e rígida conforme definido neste documento acima.

[180] Em realizações particularmente preferidas da presente invenção, a estrutura de superfície da superfície de sensor plano é formada após a segunda molécula de ligação que é fixada a um ligante longo reconheceu a molécula-alvo tendo ligado a primeira molécula de ligação. Conforme ilustrado na Figura 11, a segunda molécula de ligação é fixada a uma molécula ligante. A outra extremidade da molécula ligante compreende uma molécula para ancorar a molécula ligante à superfície. Uma molécula exemplar para este propósito é, por exemplo, biotina que é capaz de se ligar à estreptavidina na superfície de sensor plano. 0 efeito previsto desta abordagem é mostrado na Figura 12, onde a ligação específica pode apenas ocorrer em virtude da ligação da segunda molécula de ligação com um ligante longo levando a uma maior distância ponta a ponta da partícula e da superfície de sensor plano.

[181] Em realizações adicionais preferidas da presente invenção, a primeira e/ou a segunda partícula conforme definidas neste documento podem adicionalmente compreender uma estrutura de superfície repulsiva. 0 termo "estrutura de superfície repulsiva", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma estrutura que pode ser diretamente ou indiretamente fixada à superfície de uma partícula conforme descrito neste documento. Uma estrutura de superfície repulsiva dentro do significado da presente invenção compreende moléculas, polímeros e/ou uma malha de moléculas capazes de conferir uma força repulsiva. O termo "força repulsiva", conforme utilizado neste documento, refere-se a forças que levam a uma repulsão de moléculas ou partículas. É preferivelmente previsto pela presente invenção a repulsão de partículas magnéticas. Em geral, uma força repulsiva entre partículas pode ser o resultado de forças entre partículas, tal como repulsão de volume excluído, repulsão eletrostática, forças entrópicas, ou forças esféricas entre superfícies cobertas com polímero. 0 termo "repulsão de volume excluído" significa a impossibilidade de qualquer sobreposição entre partículas sólidas ou, se for o caso, entre partículas sólidas incluindo estruturas de superfície presentes nas partículas. "Repulsão eletrostática" entre partículas é observada quando as partículas portam uma carga elétrica líquida. Se duas partículas portarem a mesma carga líquida, isto é, carga positiva ou negativa, elas se repelirão. 0 termo "forças entrópicas" refere-se a forças que são baseadas na segunda lei de termodinâmica, descrevendo a tendência de um sistema a progredir a um estado no qual a entropia é maximizada. Isto pode resultar em forças repulsivas eficazes entre esferas sólidas, por exemplo, partículas magnéticas. 0 termo "força repulsiva estérica" é baseado em um efeito estérico. Deve ser entendido que, no nível atômico, os efeitos esféricos surgem do fato de que cada átomo dentro de uma molécula ocupa uma certa quantidade de espaço. Se átomos forem trazidos próximos uns aos outros, o custo associado em energia é alto devido a nuvens de elétrons sobrepostas (repulsão de Pauli ou Born) e pode afetar o formato ou a conformação preferidos da molécula e sua reatividade. Assim, o impedimento estérico ou efeitos esféricos podem ser vistos como repulsão entre as nuvens de elétrons dos átomos individuais e podem, em princípio ser definidos como um resultado de repulsão eletrostática no nível atômico.

[182] A expressão "em que a dita estrutura de superfície repulsiva transmite um efeito de empurrar as ditas partículas em direção à dita superfície de sensor", conforme utilizado neste documento, significa que todo um conjunto de partículas é empurrado em direção à superfície do sensor. Este efeito repulsivo geral é baseado ou causado por efeitos repulsivos eletrostáticos de estruturas de superfície repulsivas de uma partícula, por exemplo, um efeito repulsivo eletrostático entre duas ou mais partículas, ou efeitos repulsivos esféricos de estruturas de superfície repulsivas de uma partícula, por exemplo, um efeito repulsivo estérico entre duas ou mais partículas, ou uma combinação de ambos, um efeito repulsivo eletrostático e um efeito repulsivo estérico de uma partícula, por exemplo, entre duas ou mais partículas. 0 efeito repulsivo geral pode, por exemplo, ser dependente do número de partículas no ensaio, do número de partículas na vizinhança da superfície do sensor, da carga geral de duas ou mais partículas, da proporção de repulsão eletrostática vs. estérica, e parâmetros adicionais conhecidos pelo técnico no assunto. Estes parâmetros podem ser ajustados e/ou modificados de acordo com necessidades específicas de realizações do dispositivo ou ensaios realizados conforme descrito neste documento.

[183] Em uma realização preferida adicional da presente invenção, o efeito repulsivo geral definido neste documento é determinado ao medir o aumento da interação de superfície. 0 termo "aumento da interação de superfície" conforme utilizado neste documento refere-se a um aumento da quantidade ou do número de partículas presentes na superfície de sensor ou próximo dela como resultado das forças de repulsão entre partículas, por exemplo, partículas magnéticas, de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, o aumento de interação de superfície, assim, significa o aumento da interação de partículas com a superfície do sensor. 0 aumento de interação de superfície pode ser medido através da quantidade de tempo em que as partículas passam em contato com a superfície do sensor. 0 termo "contato próximo" significa que as partículas estão próximas ou na superfície de modo a gerar um sinal quando próximas o suficientes à superfície do sensor, por exemplo, um sinal de luz, utilizando métodos de medição apropriados. Métodos adequados para a medição de partículas próximas ou na superfície do sensor são conhecidos pelo técnico no assunto e foram descritos, por exemplo, em Bruls et al. , Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510.

[184] Em realizações preferidas da presente invenção, o aumento na interação de superfície é determinado ao medir a amplitude do sinal durante o ensaio. Sem estar limitado ao mesmo, um exemplo previsto de determinação do aumento de interação de superfície é a medição da amplitude do sinal através de reflexão interna total frustrada (FTIR) conforme descrito neste documento. A amplitude do sinal FTIR resultante, então, corresponde ao número de partículas presentes no campo evanescente.

[185] O aumento de interação de superfície é calculado a partir da amplitude de sinal resultante da medição utilizando partículas, por exemplo, partículas magnéticas, funcionalizadas com uma estrutura de superfície repulsiva conforme definida acima neste documento em relação à amplitude do sinal resultante da medição utilizando partículas não funcionalizadas, por exemplo, partículas magnéticas, isto é, partículas sem nenhuma estrutura de superfície repulsiva. Por exemplo, se o aumento do contato de superfície for aumentado em um fator de dois, isto é, a amplitude do sinal utilizando partículas magnéticas funcionalizadas com uma estrutura de superfície repulsiva é o dobro da amplitude de sinal de partículas não funcionalizadas, por exemplo, partículas magnéticas, o aumento na interação de superfície é 100%.

[186] Em realizações preferidas da presente invenção, o aumento da interação de superfície entre partículas e a superfície do sensor, pode ser pelo menos cerca de 1%. 0 aumento da interação de superfície pode, por exemplo, ser 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%,180%, 200%, 220%, 240%, 260%, 280%, 300%, 320%, 340%, 360%, 380%, 400%, 420%, 440%, 460%, 480%, 500% OU mais de 500%.

[187] Em realizações particularmente preferidas da presente invenção, uma estrutura de superfície repulsiva pode ser uma estrutura carregada ou um revestimento estérico presente na partícula, por exemplo, partícula magnética.

[188] Um "revestimento estérico" conforme utilizado neste documento refere-se a uma estrutura de superfície que pode estar presente em uma partícula na forma de um revestimento, e que provê repulsão entre partículas. Um efeito importante previsto pela presente invenção é que a presença de tal revestimento estérico resultará em uma maior repulsão mútua das partículas, cuja repulsão, por sua vez, leva à formação de uma força de repulsão, assim, resultando em uma repulsão das partículas em direção ao sensor plano sem a necessidade de aumentar a concentração de partículas conforme descrito na técnica (efeito de repulsão). A abordagem prevista, assim, tem o efeito de que o contato da superfície das partículas aumenta com a força de repulsão das partículas, assim, levando a uma maior taxa de reação e, finalmente, a maiores mudanças de sinal no final do ensaio.

[189] A presente invenção descreve uma maneira de como este efeito pode ser atingido, a saber, provendo uma malha de moléculas na superfície das partículas que pode atuar como um revestimento estérico ou barreira para prevenir ligação não específica ou moléculas não relacionadas, ou, que mantém outras moléculas ou partículas em uma certa distância. Será apreciado pelo técnico no assunto que as partículas tendo tal revestimento estérico, por exemplo, na forma de um revestimento compreendendo uma malha de moléculas, podem exercer uma certa repulsão esféricas.

[190] O revestimento nas partículas pode ser tal que ele forme uma rede ou malha de moléculas. Portanto, uma camada de revestimento de acordo com a presente invenção pode ser compreendido por unidades ou entidades pequenas, que possuem propriedades químicas, físicas e/ou biológicas idênticas ou similares. Preferivelmente, uma camada do revestimento conforme descrita neste documento compreende moléculas biológicas ou químicas capazes de formar polímeros de um certo comprimento. Polímeros adequados incluem, por exemplo, carboidratos, lipídios, polietilenoglicol, polissacarídeos, dendrímeros, dendritos, nanotubos, ou uma mistura dos mesmos. Preferivelmente, estas entidades poliméricas são compreendidas em moléculas ligantes ou espaçadoras. Em realizações específicas da presente invenção, o revestimento pode ser compreendido por uma única camada de superfície ou uma estrutura de casco multicamada.

[191] O termo "moléculas espaçadoras", conforme utilizado neste documento, refere-se a moléculas que principalmente têm a função de um espaçador. Para este propósito, estas moléculas poliméricas têm um(a) certo(a) comprimento e força para ser capaz de atuar como fibras poliméricas.

[192] Em realizações específicas da presente invenção, as moléculas espaçadoras podem ter um comprimento de até 500 nm, por exemplo, até cerca de 450, 400, 350, 300, 250 nm, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ou 10 nm.

[193] Em realizações específicas adicionais da presente invenção, as moléculas espaçadoras podem ser lineares, circulares, ou moléculas de tipo ramificadas, ou uma mistura das mesmas. Se forem ramificadas, elas podem ser ramificadas em diferentes graus, por exemplo, apresentar 2, 3, 4, 4 ou mais níveis hierárquicos. A presente invenção adicionalmente prevê uma combinação de diferentes tipos, por exemplo, linear e ramificado, diferentes graus de ramificação, diferentes comprimentos de espaçador, etc., de moléculas espaçadoras dentro de uma rede, camada ou estrutura de casco. Em realizações alternativas da presente invenção, a molécula espaçadora ou mistura de moléculas espaçadoras provêm uma malha ou rede uniforme, isto é, uma malha ou rede igualmente espaçada, com aberturas essencialmente do mesmo tamanho. Também é previsto que a malha seja provida com aberturas. Ê, em particular, preferível que a malha seja uniforme, de modo que propriedades funcionais da malha em relação à acessibilidade das moléculas e a liberdade de movimento das moléculas sejam uniformes. Estes parâmetros podem ser ajustados pelos comprimentos, grau de ramificação, etc. das moléculas espaçadoras.

[194] Em realizações preferidas adicionais, a molécula ligante é mais longa que a estrutura da superfície. 0 termo "mais longa", conforme utilizado neste documento, significa que o comprimento de extensão médio da molécula ligante é maior que o comprimento de extensão médio da superfície da estrutura. A diferença em comprimento de extensão médio pode ser 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000% ou mais.

[195] Em realizações específicas adicionais da presente invenção, as moléculas espaçadoras podem ser diretamente ou indiretamente interligadas de modo a formar uma malha tridimensional de moléculas. Tal interligação pode ser baseada em grupos funcionais nos terminais de uma molécula, ou estar localizada no centro de uma molécula, por exemplo, no caso de ramificações serem previstas. 0 controle da interligação, seu grau, etc., podem ser implementados de acordo com princípios e métodos conhecidos pelo técnico no assunto, por exemplo, a partir de um livro didático qualificado, tal como "Bioconjugate techniques", Hermanson, 2a Ed. Academic Press, Elsevier ou "Dendrimers and other dendritic polymers" Frechet e Tomalia, J. Wiley.

[196] Moléculas espaçadoras adequadas dentro do contexto da presente invenção podem ser, por exemplo, carboidratos, lipídios, polietilenoglicol (PEG), polissacarídeos, dendrímeros, dendritos, ou nanotubos conforme definidos neste documento, ou qualquer derivado adequado ou combinações dos mesmos. 0 grupo de moléculas espaçadoras pode adicionalmente compreender surfactantes à base de hidrocarbonetos, colesterol, glicolipídios, ácidos biliares, saponinas, ácidos graxos, copolímeros em bloco anfipáticos sintéticos, produtos naturais como fosfolipídios da gema de ovo.

[197] Um exemplo preferido de uma molécula espaçadora adequada para revestimentos esféricos é uma molécula de polietilenoglicol (PEG). As moléculas de polietilenoglicol são capazes de formar uma malha densa e voluminosa de moléculas em uma superfície. Será também apreciado pelo técnico no assunto que moléculas de PEG podem ser interligadas para formar um revestimento estérico adequado conforme descrito acima neste documento. Moléculas adequadas para interligar moléculas de PEG são moléculas conectoras conforme descritas neste documento. 0 comprimento pode se tornar dependente da espessura geral prevista da camada de revestimento resultante, do comprimento previsto da molécula ligante, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas de estrutura por partícula.

[198] Também é previsto pela presente invenção o número de moléculas de polietilenoglicol fixadas à partícula. É entendido que quanto mais moléculas forem fixadas à partícula, maior a densidade e a espessura da camada de revestimento, levando a uma repulsão de partícula- partícula através do efeito estérico. Assim, é entendido que a repulsão estérica da partícula é dependente da espessura da camada de revestimento, o que depende do número de moléculas de PEG sobre as partículas magnéticas, do comprimento da molécula de PEG e do número de ligações entre as moléculas de PEG. 0 número de moléculas por partícula pode ser pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 500 ou 1000.

[199] Em realizações adicionais da presente invenção, o número de moléculas de polietilenoglicol conforme definido acima neste documento fixadas à partícula pode ser variado. Em realizações específicas, o número de moléculas de polietilenoglicol por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente em cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente em cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente em cerca de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000. Em realizações adicionais, o número de moléculas de polietilenoglicol por partícula pode ser definido em cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 , 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000, ou mais. 0 número de moléculas de polietilenoglicol por partícula pode adicionalmente se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade molecular das moléculas de polietilenoglicol ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto.

[200] Em realizações adicionais, a cobertura da superfície de uma partícula por moléculas de polietilenoglicol pode ser cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da superfície geral da partícula ou qualquer valor entre estes valores.

[201] Em realizações adicionais, um revestimento estérico conforme definido neste documento transmite um raio hidrodinâmico de uma partícula de acordo com a presente invenção de pelo menos cerca de 105% do raio de uma partícula, conforme definida neste documento. 0 termo "raio hidrodinâmico de uma partícula", conforme utilizado neste documento, refere-se ao raio eficaz de uma partícula hidratada compreendendo um revestimento estérico em solução, ou o tamanho aparente da partícula compreendendo um revestimento estérico em solução. Preferivelmente, um revestimento estérico refere-se a uma variedade, por exemplo, todas as moléculas que contribuem ao efeito estérico descrito neste documento. 0 raio hidrodinâmico de uma partícula compreendendo um revestimento estérico conforme definido neste documento pode ser pelo menos cerca de 105% o raio de uma partícula conforme definida neste documento, em particular, o raio de uma partícula que não compreende tal revestimento estérico. 0 raio hidrodinâmico de uma partícula compreendendo um revestimento estérico conforme definido neste documento pode ser, por exemplo, cerca de 105%, 110%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250% ou qualquer valor entre estes valores ou mais do raio de uma partícula conforme definida neste documento, por exemplo, uma partícula magnética, em particular, de uma partícula que não compreende tal revestimento estérico.

[202] Em outras realizações particularmente preferidas da presente invenção, as partículas podem compreender uma estrutura carregada para gerar uma força de repulsão entre as partículas. 0 termo "estrutura carregada", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma entidade que contribui à carga líquida de uma partícula de acordo com a presente invenção. Estruturas carregadas de acordo com a presente invenção podem ter uma carga líquida que pode ser positiva ou negativa. É entendido que uma estrutura carregada não é limitada a um tipo ou formato específico de moléculas. Uma estrutura carregada pode, por exemplo, compreender um polímero de um tipo de moléculas ou de dois ou mais tipos diferentes de moléculas, um complexo de diferentes moléculas ou entidades, ou um composto compreendendo diversas moléculas tendo diferentes cargas, por exemplo, diferentes cargas positivas, cargas negativas diferentes, ou cargas positivas e negativas (diferentes), resultando em uma carga líquida geral positiva ou negativa. Ferramentas e métodos para cálculo de carga são conhecidas pelo técnico no assunto, por exemplo, em Dewar, M.J.S., The Molecular Orbital Theory of Organic Chemistry, McGraw-Hill, and Inc., 1969; ou Stewart, R., The Proton: Applications to Organic Chemistry, Academic Press, Inc., 1985, 72.

[203] Em realizações específicas da presente invenção, a estrutura carregada pode ser fixada à partícula diretamente ou indiretamente de modo a resultar em uma carga líquida específica da partícula. A carga líquida específica pode ser positiva ou negativa. Também é concebível que diferentes estruturas carregadas são fixadas na mesma partícula para resultar em uma mistura de estruturas carregadas. Dentro do contexto da presente invenção, uma estrutura carregada pode cobrir a superfície da partícula de modo a prover uma molécula carregada geral tendo uma carga líquida específica. É conhecido pelo técnico no assunto que uma carga líquida de uma nanopartícula pode ser determinada, por exemplo, através da medição do potencial zeta.

[204] Uma vantagem prevista é que a maior repulsão devido à presença de maiores cargas na partícula, preferivelmente partícula magnética, leva a uma maior repulsão eletrostática, o que, por sua vez, minimiza a aglomeração não específica das partículas. A redução de aglomeração não específica pode ajudar a reduzir o nível de fundo sem o uso de um surfactante, assim, levando a uma melhoria do nível em branco em ensaios de detecção optomagnética conforme descrito neste documento e, assim, melhora o limite da detecção. Outro efeito importante previsto pela presente invenção é que a presença de uma maior carga nas partículas, sendo uma carga negativa ou positiva, resultará em uma maior repulsão eletrostática mútua das partículas, que, por sua vez, leva à formação de uma força de "repulsão" eletrostática, assim, resultando em uma repulsão das partículas em direção ao sensor plano sem a necessidade de aumentar a concentração de partículas conforme descrito na técnica. A abordagem prevista tem o efeito de que o contato da superfície das partículas pode aumentar com a carga das partículas, assim, levando a uma maior taxa de reação e, finalmente, a maiores mudanças de sinal no final do ensaio.

[205] Em realizações preferidas adicionais, a maior presença de uma carga nas partículas pode ser atingida ao prover uma molécula ligante conforme descrita neste documento compreendendo ou consistindo em uma estrutura carregada ou ao prover uma estrutura carregada fixada às partículas além de uma molécula ligante.

[206] Em realizações específicas da presente invenção, as estruturas carregadas podem cobrir toda a superfície de uma partícula, de modo a prover uma molécula carregada de maneira geral, tendo uma carga líquida específica. Em realizações alternativas, as estruturas carregadas podem cobrir apenas porções, áreas ou setores de uma partícula, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% ou menos da superfície geral de uma partícula, ou qualquer valor entre estes valores.

[207] Em outras realizações da presente invenção, o número de moléculas de estrutura carregada fixadas à partícula pode ser variado, por exemplo, de acordo com uma carga líquida geral prevista da partícula. Ê entendido que a carga líquida geral da partícula varia, por exemplo, aumenta ou diminui, com o número de moléculas carregadas sendo fixadas à partícula. 0 potencial zeta (mV) pode, portanto, aumentar (negativamente) com uma crescente quantidade de partículas, bem como com um crescente comprimento das moléculas. É, assim, concebível que a soma das cargas presentes em uma partícula contribua para a carga líquida geral. É adicionalmente apreciado que a carga líquida geral da partícula seja uma função, entre outros, do número de moléculas presentes na partícula magnética e do comprimento da molécula, sua carga positiva ou negativa, etc. Em realizações específicas, o número de moléculas de estrutura carregada por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000 , 110000, 120000, 150000, ou mais. 0 número das moléculas de estrutura carregada por partícula pode ser diferente ou se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade química molecular das moléculas de estrutura carregadas, do uso previsto, por exemplo, ensaio, ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto.

[208] Estruturas carregadas adequadas para obter este efeito de repulsão eletrostático descritas neste documento podem compreender uma estrutura ou um composto biológico ou químico capaz de contribuir para uma carga líquida específica, tal como um ácido nucleico, um ácido ribonucleico, um peptídeo, um polipeptídeo ou proteína, um carboidrato, um lipídio, ou um polissacarídeo, ou qualquer derivado adequado ou combinações dos mesmos. Também são previstos um hidrogel, e estruturas carregadas poliméricas. É preferido o uso de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico.

[209] "Moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico" podem ser moléculas de ácido nucleico, ou um derivado ou análogo das mesmas. Tais moléculas de estrutura carregada podem, por exemplo, compreender moléculas de DNA ou RNA de fita única e/ou dupla, ou qualquer tipo de derivado das mesmas. Tais moléculas de estrutura carregada podem adicionalmente compreender, ou consistir em uma molécula de PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA conforme definida acima neste documento, ou qualquer mistura ou combinação dos mesmos, por exemplo, uma combinação de qualquer um dentre DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA e ANA ou uma mistura de nucleotídeos de LNA com bases de DNA ou RNA, ou qualquer mistura ou combinação, com qualquer outra molécula de estrutura carregada conforme definido neste documento. No contexto de estruturas carregadas à base de ácido nucleico, ácidos nucleicos ou análogos dos mesmos podem ser adicionalmente providos de grupos ou unidades químicas que portem uma carga. Por exemplo, grupos fosfato, derivados de nitrogênio carregados ou derivados de enxofre carregados podem ser incluídos ou adicionados. Além disso, as cargas podem ser acumuladas ao prover moléculas duplex das quais pelo menos uma molécula compreende cargas, por exemplo, um DNA compreendendo duplex.

[210] Em realizações particularmente preferidas da presente invenção, as partículas, por exemplo, partículas magnéticas, podem ser funcionalizadas com estruturas carregadas, por exemplo, ácido nucleico de fita única ou fita dupla, em particular, dsDNA, o qual pode ter um comprimento variável. A carga nas partículas pode, portanto, ser medida em virtude de seu potencial zeta. É previsto pela presente invenção que o contato de superfície das partículas aumente com a carga das partículas, assim, levando a uma maior taxa de reação e, finalmente, a maiores mudanças de sinal no final do ensaio. Em certas realizações da presente invenção, uma estrutura carregada, tal como um ácido nucleico, pode estar presente em uma forma de fita dupla ou duplex, isto é, compreendendo uma fita e uma contra-fita complementar ou anti-paralela de uma molécula de ácido nucleico associada por pareamento de bases entre as fitas, ou uma fita de sentido ou anti-sentido de uma molécula de ácido nucleico. Alternativamente, a estrutura carregada pode compreender um ácido nucleico de fita única ou uma molécula de ácido ribonucleico de fita única.

[211] Em uma realização preferida específica da presente invenção, a estrutura carregada compreende uma molécula selecionada do grupo que consiste em um DNA de fita dupla ou dsDNA, RNA de fita dupla ou dsRNA, PNA, um PNA-DNA duplex, e um duplex RNA-DNA. Um aspecto vantajoso, que também é previsto por realizações adicionais preferidas da presente invenção, é que PNAs e duplex PNA/DNA ou PNA/DNA não são facilmente reconhecidos por nucleases ou proteases, tornando- os resistentes à degradação enzimática.

[212] Em realizações adicionais da presente invenção, moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico adequadas também compreendem ou consistem em moléculas de DNA de fita única de diferentes composições de bases e/ou comprimentos. As moléculas de fita única podem, por exemplo, abranger a repetição de sequência de base, ser totalmente aleatórias, ou ser derivadas da natureza, ou ser de apenas uma base.

[213] Moléculas de estrutura à base de ácido nucleico ou combinações das mesmas conforme definidas neste documento podem ser de composições de base e/ou comprimentos diferentes. 0 comprimento da molécula pode variar entre cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 5000 nucleotídeos, preferivelmente entre cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 3000 nucleotídeos, entre cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 2000 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente, mais preferivelmente entre cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos. Também são previstos outros comprimentos ou qualquer valor de comprimento dentro da faixa indicada. A molécula pode, por exemplo, ter um comprimento de cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 nucleotídeos ou mais, ou qualquer número de nucleotídeos entre os valores mencionados.

[214] O comprimento das moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico pode se tornar dependente da carga líquida específica geral prevista, do comprimento previsto da molécula ligante, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas de estrutura carregadas por partícula. Métodos adequados para o cálculo de cargas líquidas seriam conhecidos pelo técnico no assunto, ou podem ser derivados de fontes da literatura adequadas.

[215] Em realizações adicionais da presente invenção, o número de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico conforme definido neste documento fixadas à partícula pode ser variado, por exemplo, de acordo com uma carga líquida geral prevista da partícula. É entendido que a carga líquida geral da partícula varia, por exemplo, aumenta ou diminui, com o número de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico sendo fixadas à partícula. Em realizações específicas, o número de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente em cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente em cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente em cerca de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000. Em realizações adicionais, o número de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico pode ser definido em cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, ou 150000. 0 número de moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico por partícula pode adicionalmente se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade molecular das moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto. Em realizações adicionais, a cobertura da superfície de uma partícula por moléculas de estrutura carregada à base de ácido nucleico pode ser cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da superfície geral da partícula ou qualquer valor entre estes valores.

[216] Moléculas de peptídeos, moléculas de polipeptídeo ou moléculas de proteína, por exemplo, conforme definido acima neste documento, podem também ser ou compreender estruturas carregadas adequadas devido à presença de entidades carregadas dentro dos aminoácidos. É descrito na técnica que os grupos funcionais de ácido carboxílico encontrados em aminoácidos os permitem ter propriedades anfipróticas. Os grupos de ácido carboxílico (-CO2H) podem ser desprotonados para se tornarem carboxilatos negativos (- C02") , e grupos alfa-amino (NH2-) podem ser protonados para se tornarem grupos alfa-amônio positivos (+NH3-) . 0 técnico no assunto também sabe que, em valores de pH maiores que o pKa do grupo de ácido carboxílico, o íon de carboxilato negativo predomina. Em valores de pH menores que o pKa do grupo alfa- amônio, o nitrogênio é predominantemente protonado como um grupo alfa-amônio positivamente carregado. 0 técnico no assunto está adicionalmente ciente do fato de que a carga líquida de um aminoácido depende do pH e do valor de pKa. Ferramentas e métodos para calcular a carga líquida de aminoácidos, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas seriam conhecidos pelo técnico no assunto ou podem ser derivados de referências da literatura qualificada, tal como a ferramenta Compute pI/Mw, que permite a computação do pl teórico (ponto isoelétrico) e Mw (peso molecular) para uma lista de entradas da Base de Conhecimento UniProt (Swiss-Prot ou TrEMBL) ou para sequências inseridas pelo usuário (Gasteiger E., et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed) : The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). Tais estruturas carregadas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína podem ser de diferentes composições de aminoácidos e/ou comprimentos. 0 comprimento pode se tornar dependente da carga líquida específica geral prevista, do comprimento previsto da molécula ligante, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas de estrutura carregada por partícula. Entende-se que a carga líquida geral da partícula é uma função do número de moléculas de proteína ou peptídeo na partícula, por exemplo, partícula magnética, e do comprimento da molécula. Em realizações adicionais da presente invenção, o número de moléculas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína carregadas conforme definido neste documento fixadas à partícula pode ser variado, por exemplo, de acordo com uma carga líquida geral prevista da partícula. Em realizações específicas, o número de moléculas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente em cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente em cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente em cerca de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000.

[217] Em realizações adicionais, o número de moléculas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, . 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000, ou mais. 0 número de moléculas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína carregadas à base de ácido nucleico por partícula pode adicionalmente se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade molecular das moléculas de polipeptídeo ou proteína carregadas ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto. Em realizações adicionais, a cobertura da superfície de uma partícula por moléculas de peptídeo, polipeptídeo ou proteína carregadas pode ser cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da superfície geral da partícula ou qualquer valor entre estes valores.

[218] Uma estrutura carregada pode, em realizações adicionais, também ser ou compreender uma molécula de carboidrato, por exemplo, conforme definida acima neste documento, que compreende uma entidade carregada capaz de contribuir a uma carga líquida geral na partícula. Tais carboidratos podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos. 0 comprimento pode se tornar dependente da carga líquida específica geral prevista, do comprimento previsto da molécula ligante, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas de estrutura carregada por partícula.

[219] Em realizações adicionais da presente invenção, o número de moléculas de carboidrato carregadas, conforme definido neste documento, fixadas à partícula pode ser variado, por exemplo, de acordo com uma carga líquida geral prevista da partícula. Em realizações específicas, o número de moléculas de carboidrato carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente em cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente em cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente em cerca de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000. Em realizações adicionais, o número de moléculas de carboidrato carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000, ou mais. 0 número de moléculas de carboidrato carregadas por partícula pode adicionalmente se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade molecular das moléculas de carboidrato carregadas ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto. Em realizações adicionais, a cobertura da superfície de uma partícula por moléculas de carboidrato carregadas pode ser cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da superfície geral da partícula ou qualquer valor entre estes valores.

[220] Uma estrutura carregada pode também ser qualquer molécula lipídica, por exemplo, conforme definida acima neste documento, que compreende uma entidade carregada capaz de contribuir a uma carga líquida geral na partícula. A carga em lipídios, especialmente fosfolipídios, é tipicamente determinada pela carga do grupo de cabeça. Exemplos preferidos de grupos de cabeça adequados capazes de conferir uma carga líquida da molécula lipídica incluem grupos de cabeça selecionados do grupo que consiste em fosfatidilcolina (PC), fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilglicerol (PG), ou qualquer combinação dos mesmos.

[221] Tais lipídios podem ser de diferentes composições e/ou comprimentos. 0 comprimento pode se tornar dependente da carga líquida específica geral prevista, do comprimento previsto da molécula ligante, da flexibilidade, rigidez ou estabilidade prevista da molécula ligante, e/ou do número previsto de moléculas de estrutura carregada por partícula.

[222] Em realizações adicionais da presente invenção, o número de moléculas lipídicas carregadas conforme definido neste documento fixadas à partícula pode ser variado, por exemplo, de acordo com uma carga líquida geral prevista da partícula. Em realizações específicas, o número de moléculas lipídicas carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90, mais preferivelmente em cerca de 100, 150, 200, 250, ainda mais preferivelmente em cerca de 300, 350, 400, ou 450, e mais preferivelmente em cerca de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000. Em realizações adicionais, o número de moléculas lipídicas carregadas por partícula pode ser definido em cerca de 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000, ou mais. 0 número de moléculas lipídicas carregadas por partícula pode adicionalmente se tornar dependente do tamanho ou o diâmetro da partícula, da área na qual a fixação é possível ou adequada, da relação entre o tamanho ou diâmetro da partícula e do comprimento da partícula, da identidade molecular das moléculas lipídicas carregadas ou qualquer outro parâmetro adequado conhecido pelo técnico no assunto. Em realizações adicionais, a cobertura da superfície de uma partícula por moléculas lipídicas carregadas pode ser cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da superfície geral da partícula ou qualquer valor entre estes valores.

[223] Um "hidrogel" compreendendo uma estrutura carregada refere-se a três dimensões de uma rede de cadeias poliméricas que são hidrofílicas, às vezes encontrada em gel coloidal no qual a água está no meio de dispersão. Tipicamente, os hidrogéis são altamente absorventes, isto é, eles podem conter mais de 99,9% de água, polímeros naturais ou sintéticos, e são capazes de reter grandes quantidades de água com conservação da estrutura da rede. Os hidrogéis podem também possuir um grau de flexibilidade muito similar ao tecido natural, devido a seu teor de água significativo. Como resultado do alto teor de água, os hidrogéis são geralmente considerados materiais biocompatíveis, que os tornam particularmente interessantes para aplicações biomédicas e farmacêuticas. Ingredientes comuns de hidrogéis podem compreender, por exemplo, álcool polivinílico, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato e copolímeros de acrilato com uma abundância de grupos hidrofílicos. Também são previstos materiais de hidrogel naturais, tais como materiais incluindo agarose, metilcelulose, ácido hialurônico e outros polímeros derivados naturalmente. É adicionalmente preferido que hidrogéis adicionalmente compreendam, compreendam ou consistam em elementos carregados, tal como polímeros carregados ou qualquer outra molécula ou fração carregada, que possam ser utilizados como revestimento carregado da superfície da partícula. Uma estrutura de hidrogel homogênea pode vantajosamente contribuir a uma carga líquida geral da partícula, levando à repulsão eletrostática das partículas. Em uma realização específica, as moléculas ligantes e outros componentes do revestimento ou da estrutura de superfície podem ser incorporadas dentro de um sistema de estrutura de hidrogel aquosa, o que pode ainda prover uma certa estabilidade das moléculas. 0 técnico no assunto saberia como selecionar polímeros carregados adequados para obter um hidrogel com uma carga líquida geral. Além disso, meios e métodos para produzir hidrogéis adequados e fixá-los na superfície da partícula seriam conhecidos na técnica. Os hidrogéis descritos acima neste documento podem também compreender uma molécula carregada polimérica conforme descrito neste documento.

[224] Uma estrutura carregada pode, em realizações adicionais, também ser uma "molécula carregada polimérica". 0 termo "molécula carregada polimérica" ou "polímero carregado", conforme utilizado neste documento, refere-se a um "polímero ou copolímero compreendendo uma pluralidade de unidades repetidas selecionadas dentre unidades repetidas negativamente ou positivamente carregadas. Tal polímero ou copolímero, assim, funciona como um polieletrólito. É entendido que a carga pode ser derivada de grupos carregados negativamente ou positivamente dentro da unidade repetida. É particularmente preferido um grupo positivamente carregado selecionado do grupo que consiste em grupo amónio quaternário, um grupo amina primário, um grupo amina secundário, um grupo amina terciário, um grupo fosfônio quaternário, um grupo fosfônio terciário, um grupo amida, um grupo nitrogênio heteroaromático, e um grupo sulfônio.

[225] Os polímeros positivamente carregados resultantes são também chamados de polímeros catiônicos. A carga positiva de uma molécula carregada polimérica pode vantajosamente evitar a formação de polímeros em espiral. Isto permite que eles contribuam mais à viscosidade em seu estado estivado, porque o polímero esticado ocupa mais espaço.

[226] Polímeros carregados negativamente incluem, entre outros, um grupo éster sulfato, um grupo éster carboxilato, um grupo éster fosfato, um grupo sulfona, um grupo sulfeto, um grupo dissulfeto, um grupo orto éster, um grupo anidrido, um grupo beta-cetossulfona, ou qualquer combinação dos mesmos.

[227] Os polieletrólitos foram utilizados na formação de novos tipos de materiais conhecidos como multicamadas de polieletrólito (PEMs). Estas películas finas são construídas utilizando uma técnica de deposição camada por camada (LbL). Durante a deposição LbL, um substrato de crescimento adequado (geralmente carregado) é mergulhado repetidamente entre banhos diluídos de soluções de polieletrólitos carregadas positivamente e negativamente. Durante cada mergulho, uma quantidade pequena de polieletrólitos é adsorvida, e a carga da superfície é invertida, permitindo o acúmulo gradual e controlado de películas eletrostaticamente reticuladas de camadas de policátion-poliânion. Será apreciado que que tais multicamadas de polieletrólitos são adequadas para prover partículas da presente invenção com carga líquida geral positiva ou negativa.

[228] Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, a molécula ligante conforme definida neste documento e/ou a estrutura de superfície repulsiva conforme definida neste documento não é clivável por DNase. Em realizações específicas adicionais da presente invenção, a molécula ligante conforme definida neste documento e/ou a estrutura de superfície repulsiva conforme definida neste documento não é clivável por RNase. Além disso ou alternativamente, a molécula ligante conforme definida neste documento e/ou a estrutura de superfície repulsiva conforme definido neste documento pode não ser clivável por uma enzima de restrição capaz de cortar uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. Tal não clivabilidade por DNase, RNase, ou uma enzima de restrição pode ser atingida ao prover moléculas ligantes ou estruturas de superfície repulsiva que não representem um substrato ou motivo de reconhecimento para uma enzima de DNase. Tipicamente, o efeito poderia ser atingido utilizando análogos de DNA, tal como moléculas de PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA conforme definidas neste documento, ou utilizando moléculas poliméricas, tal como PEG.

[229] Em outra realização preferida da presente invenção, a molécula ligante, conforme definido neste documento, adicionalmente compreende pelo menos um espaçador flexível curto. É, portanto, previsto pela presente invenção que as estruturas ligantes conforme definidas neste documento, preferivelmente ligantes longos e rígidos conforme definidos neste documento, portem em uma ou ambas as extremidades, um espaçador flexível curto. Um projeto de ligante preferido é mostrado na Figura 13. É apreciado que uma certa flexibilidade devido à presença de tal espaçador flexível seja adicionada à molécula ligante rígida. As estruturas espaçadoras flexíveis podem, assim, servir como uma articulação flexível, o que contribui para a mobilidade da molécula ligante, mantendo sua rigidez geral. Conforme mostrado na Figura 4, o número de possíveis orientações é aumentado ou facilitado por tal espaçador flexível. 0 espaçador flexível pode ser qualquer molécula flexível adequada, por exemplo, uma molécula polimérica, peptídeo, grupo químico, etc.

[230] Em uma realização particularmente preferida, o espaçador flexível curto compreende um ácido nucleico de fita única, por exemplo, um DNA de fita única ou molécula de RNA conforme definido neste documento, ou qualquer outra forma de ácido nucleico de fita única conforme definida neste documento ou conforme conhecida pelo técnico no assunto.

[231] A presente invenção, em um aspecto adicional, refere-se a um método de detectar a presença ou a quantidade de uma molécula-alvo dentro de uma amostra compreendendo as etapas de (a) contactar a amostra e uma primeira molécula de ligação fixada a uma primeira partícula em um dispositivo conforme descrito acima neste documento, e (b) contactar a amostra com i) uma segunda molécula de ligação capaz de se fixar a uma superfície plana ou a uma segunda partícula, em que a primeira molécula de ligação e/ou a segunda molécula de ligação são capazes de se ligar especificamente à dita molécula-alvo, e opcionalmente ii) uma molécula análoga alvo fixada à superfície plana ou à segunda partícula; em que a molécula-alvo é capaz de interferir com a ligação da primeira molécula de ligação à molécula análoga alvo; e (c) detectar o número de primeiras partículas ligadas à superfície plana ou à segunda partícula,

[232] em que o número de aglomerados de partículas ou de partículas ligadas é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra.

[233] São previstos pela presente invenção formatos de ensaios, que podem ser ensaios competitivos típicos ou não competitivos para a detecção da presença e/ou da quantidade de uma molécula-alvo. Será apreciado pelo técnico no assunto que o dispositivo conforme descrito neste documento, bem como o método de acordo com a presente invenção são adequados para realizar tal análise.

[234] No formato não competitivo previsto, ambas a primeira e a segunda moléculas de ligação são capazes de se ligar especificamente à molécula-alvo. É concebível que, em uma primeira etapa, a primeira molécula de ligação presente em uma primeira partícula possa reconhecer e se ligar ao alvo. Em uma segunda etapa, a primeira partícula tendo ligado a molécula-alvo pode ser direcionada por difusão ou atuação magnética a uma segunda molécula de ligação presente em uma segunda partícula ou em uma superfície de sensor plano. A ligação à superfície da segunda partícula ou do sensor plano é mediada pela ligação da segunda molécula de ligação ao alvo. Também são previstas uma ou mais etapas de lavagem, onde partículas ligadas não especificamente são removidas da superfície. Em realizações específicas da presente invenção, tais etapas de lavagem ocorrem via atuação magnética pulsada. 0 número de partículas ligadas é posteriormente detectado em virtude do número de aglomerados de partículas ou através da quantidade de partículas ligadas à superfície de sensor plano, conforme definido acima neste documento. 0 número determinado de partículas corresponde diretamente ao número de moléculas-alvo dentro das amostras.

[235] Também são previstos formatos de ensaio com base em ensaios competitivos, os quais tipicamente exigem a presença de um concorrente ou análogo do alvo. 0 termo "molécula análoga alvo", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer molécula que concorra com a molécula- alvo para a ligação à primeira molécula de ligação conforme definido neste documento. Em tal caso, a molécula-alvo pode interferir com a ligação da primeira molécula de ligação à molécula análoga alvo. São previstos pela presente invenção formatos de competição ou inibição, onde a primeira proteína de ligação pode se ligar a uma molécula análoga alvo fixada à superfície da superfície plana ou uma partícula conforme definida acima neste documento. Esta ligação pode ser evitada se uma molécula-alvo conforme descrita neste documento estiver presente na amostra e se esta molécula-alvo se ligar ao anticorpo primeiro. Por exemplo, uma pequena molécula de fármaco pode ser detectada utilizando o método previsto se um análogo da molécula de fármaco for, por exemplo, imobilizada à superfície de sensor plano. Se nenhuma molécula de fármaco estiver presente na amostra, todas as partículas com a molécula de ligação reconhecendo a molécula-alvo podem se ligar à molécula análoga alvo na superfície. Entretanto, na presença de moléculas de fármaco (alvo), que interferem com esta ligação, as moléculas anti-ligação a fármaco não podem se ligar ou se ligam menos ao análogo do alvo na superfície. Nesse caso, a quantidade de partículas na superfície é inversamente relacionada à quantidade de moléculas-alvo.

[236] Também é previsto pela presente invenção o uso específico de partículas magnéticas conforme definido acima neste documento, que podem ser atuadas aplicando um campo magnético, de modo que o procedimento analítico possa ser acelerado. Também é previsto pela presente invenção que o uso de um campo magnético possa reduzir o sinal de fundo devido à remoção de partículas não especificamente ligadas. Um sistema optomagnético exemplar adequado para o método de detecção de acordo com a presente invenção é ilustrado na Figura 1.

[237] Em uma realização preferida adicional da presente invenção, uma força magnética é aplicada para trazer as partículas em proximidade com a superfície plana ou a cada uma de modo a facilitar a aglomeração das partículas.

[238] O termo "capaz de se fixar à superfície plana ou segunda partícula" significa que a segunda molécula de ligação não é necessariamente constantemente ligada à superfície plana ou segunda partícula ou fixada de maneira predeterminada, isto significa que está fixada à superfície já no início do ensaio. Deve ser entendido que a fixação da segunda molécula de ligação à superfície diretamente ou através de uma molécula ligante conforme definido acima neste documento pode ocorrer em qualquer momento durante o ensaio. Será apreciado por um técnico no assunto que um momento de fixação seletivo abre uma ampla gama de possibilidades para conduzir um ensaio. É previsto pela presente invenção, assim, um complexo de segunda molécula de ligação-ligante que possa atuar como um módulo separado independentemente de sua ligação à superfície. Tal complexo é, por exemplo, ilustrado na Figura 11. Será apreciado pelo técnico no assunto imediatamente que um complexo de segunda molécula de ligação- ligante que não é constantemente fixado ou anexado à superfície plana possa ter diversas vantagens. Uma vantagem prevista é que o complexo de segunda molécula de ligação- ligante pode ser difundido livremente e rápido, assim, melhorando a ligação ao complexo de captura através da ligação à molécula-alvo. 0 termo "complexo de captura" descreve um estado onde a primeira molécula de ligação ou molécula de captura que é diretamente ou indiretamente fixada a uma primeira partícula tendo capturado a molécula-alvo. Neste exemplo, a ligação da segunda molécula de ligação/molécula ligante à molécula-alvo que foi capturada pela primeira molécula de ligação pode ocorrer independente do tempo, isto é, ocorrer antes de sua fixação à superfície.

[239] Em realizações preferidas específicas, a fixação da dita segunda molécula de ligação à superfície plana ou segunda partícula ocorre antes ou depois da ligação da segunda molécula de ligação à molécula-alvo. Em realizações específicas da presente invenção, a segunda molécula de ligação é autorizada a se fixar à superfície, preferivelmente através de uma molécula ligante conforme definida neste documento, em uma primeira etapa do ensaio ou antes do início do ensaio, o que é o momento onde a amostra conforme definida acima neste documento é adicionada. Nesse caso, o complexo de captura é formado primeiro e se liga, em uma etapa posterior, a uma superfície pré-formada compreendendo a segunda molécula de ligação fixada à superfície.

[240] Em realizações preferidas adicionais da presente invenção, o módulo de segunda molécula de ligação- ligante se liga ao complexo de captura em virtude de sua ligação específica à molécula-alvo primeiro, e todo o complexo de captura - segunda molécula de ligação - ligante é posteriormente guiado à superfície plana ou superfície da segunda partícula, de modo a ligar o complexo de captura à superfície. A ideia prevista é ilustrada na Figura 11. Neste exemplo, a distância vantajosa é gerada por um ligante longo fixado ao segundo anticorpo, enquanto a primeira molécula de ligação é fixada à superfície da primeira partícula diretamente. Em outras palavras, a segunda molécula de ligação tendo fixado um ligante longo e rígido gera o efeito que leva a uma cinética de ligação melhorada. Este exemplo específico demonstra que a velocidade do reconhecimento do complexo de captura pela segunda molécula de ligação pode ser maximizada devido à fixação semelhante a módulo conforme descrita acima neste documento. É importante ressaltar que uma grande vantagem em relação à técnica é que a presença de um ligante longo e rígido conforme descrito acima neste documento leva à distância necessária para melhorar a cinética de ligação. 0 exemplo, assim, demonstra que o princípio de um ligante longo e rígido para obter uma melhor cinética de ligação não é limitado de maneira alguma ao ligante para fixação da primeira molécula de ligação à primeira partícula.

[241] É, entretanto, também concebível que ambas as moléculas de ligação sejam acopladas a um ligante longo para aumentar ou acumular ainda mais a distância vantajosa entre a primeira partícula e a superfície plana ou a superfície da segunda molécula de ligação.

[242] Em outra realização preferida da presente invenção, a detecção de partículas ligadas, por exemplo, partículas magnéticas, ocorre através de reflexão interna total frustrada (FTIR) ou através da medição da luz espalhada pelas ditas partículas ligadas próximo da superfície ou através da detecção óptica da formação de aglomerados.

[243] São particularmente preferidos dispositivos de detecção com base em uma detecção óptica de partículas, especialmente partículas magnéticas. Detalhes correspondentes podem ser derivados do dispositivo exemplar ilustrado na Figura 1, que compreende uma fonte de luz e um sistema de detecção de luz, e constitui uma realização específica de acordo com a presente invenção. Os métodos ópticos utilizados para detecção tipicamente medem uma mudança no sinal de luz que signifique uma diferença em luz refletida das partículas magnéticas e que possa ser detectada por meios ópticos. Por exemplo, tais métodos podem incluir técnicas tal como a detecção de luz espalhada ou detecção baseada em reflexão interna total (TIR) ou reflexão interna total frustrada (FTIR). Preferivelmente, a mudança no sinal de luz refere-se apenas às partículas magnéticas sendo ligadas em virtude da ligação da segunda molécula de ligação à superfície do sensor. Detalhes seriam conhecidos por um técnico no assunto, ou podem ser derivados de referências adequadas, tal como Bruls et al. , Lab Chip, 2009, 9. 2504- 3510 .

[244] Conforme utilizado neste documento, o termo "reflexão interna total" descreve uma condição presente em certos materiais quando a luz entra em um material a partir de outro material com índice de refração mais alto em um ângulo de incidência maior que um ângulo específico. 0 ângulo específico no qual isto ocorre depende dos índices de refração de ambos os materiais, também chamado de ângulo crítico, e pode ser calculado matematicamente (lei de Snell, lei da refração). Na ausência de partículas, por exemplo, partículas magnéticas, nenhuma refração ocorre, e o feixe de luz da fonte de luz é refletido totalmente. Se uma partícula, por exemplo, partícula magnética, estiver próxima da superfície ou estiver em contato com a superfície, os raios de luz são considerados frustrados pela partícula, e a reflexão nesse ponto não é mais total.

[245] O sinal, que pode ser definido como a redução do sinal refletido totalmente internamente, pode ser calculado. 0 sinal é mais ou menos linearmente dependente da concentração de partículas na superfície (densidade de superfície n). 0 sinal pode ser expresso como:

[246] S = β n

[247] em que S é a mudança no sinal medida em % e β é um fator de conversão da densidade de superfície para mudança de sinal.

[248] Em uma realização preferida da presente invenção, a detecção de partículas ligadas, por exemplo, partículas magnéticas, ocorre através de reflexão interna total frustrada (FTIR) ou através da medição da luz espalhada pelas ditas partículas ligadas próximo da superfície.

[249] Também são previstos métodos baseados na medição de aglomerados de partículas descritos em Bruls et al. , 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510. Em outra realização preferida da presente invenção, a detecção pode ser realizada através da detecção de aglomerados compreendendo pelo menos duas partículas, por exemplo, partículas magnéticas e pelo menos uma molécula-alvo. Por exemplo, uma partícula, por exemplo uma partícula magnética, conforme definida acima neste documento, pode se aglomerar também com pelo menos uma partícula adicional, por exemplo, partícula magnética, mediante a presença de pelo menos uma molécula-alvo a ser detectada, que é capaz de colmatar ou combinar ambas as partículas. Em realizações específicas, o aglomerado de partículas compreende uma primeira e uma segunda partícula conforme descritas neste documento. A detecção pode, em uma realização particularmente preferida, ser realizada em um sistema optomagnético, em que as ditas partículas são partículas magnéticas que são atuadas magneticamente e opticamente detectadas em um fluido de amostra estacionário, compreendendo as etapas de (i) captura da molécula-alvo, por exemplo, conforme definido acima neste documento, (ii) atuação magnética, e (iii) detecção.

[250] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma partícula conforme definida neste documento, por exemplo, uma partícula magnética, para detectar uma molécula-alvo dentro de uma amostra, por exemplo, uma amostra conforme definida acima neste documento.

[251] Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, a molécula-alvo mencionada no contexto do dispositivo, método ou uso conforme descrito neste documento acima é troponina cardíaca I (cTnl), NT- proBNP ou hormônio da paratireoide. A presente invenção também visa a detecção de mais moléculas-alvo ou classes de moléculas-alvo. É particularmente preferida troponina I (cTnl).

[252] EXEMPLOS

[253] EXEMPLO 1 - UTILIZANDO dsDNA LONGO COMO UM LIGANTE

[254] O comprimento (extensão) do ligante foi analisado em um conjunto de experimentos. Para esta finalidade, o dsDNA, que é uma molécula muito rígida e, portanto, também resulta em uma extensão longe da superfície, foi utilizado como um ligante. Em particular, partículas revestidas com estreptavidina 500 nm foram incubadas com dsDNA de comprimento variável. Cada molécula de DNA continha uma fração de biotina em uma extremidade da molécula de DNA, uma molécula de sulforrodamina 101 na outra extremidade da molécula. A solução contendo partículas e DNA foi injetada em um cartucho e ligada à superfície do sensor, revestido com anticorpos de sulforrodamina 101 utilizando atração magnética. Após uma etapa de lavagem magnética que removeu partículas não ligadas da superfície, a quantidade de partículas que foram ligadas à superfície foi determinada.

[255] Foi descoberto que a cinética de ligação de uma partícula à superfície foi melhorada significativamente. Por exemplo, para nanopartículas magnéticas com um diâmetro médio de ~ 500 nm, um comprimento ideal de dsDNA de ~ 700 pares de bases (bp), correspondente a um comprimento de contorno de ~ 240 nm e uma extensão média de ~ 140 nm foi observado (ver Figura 6).

[256] Um experimento similar foi realizado com partículas revestidas com estreptavidina 1000 nm. Conforme pode ser visto na Figura 7, o comprimento de ligante ideal de 1000 bp (correspondente a um comprimento de contorno de ~ 340 nm) também é aproximadamente duas vezes maior. A partir destas medições, o comprimento de contorno de DNA ideal parece ser aproximadamente 2/3 do raio da partícula.

[257] EXEMPLO 2 - EFEITO DA DENSIDADE DE SUPERFÍCIE DE LIGANTE NA CINÉTICA DE LIGAÇÃO

[258] O efeito da densidade de superfície de ligante na cinética de ligação foi testado em um formato de ensaio utilizando uma partícula de 500 nm, revestida com estreptavidina que é ligada a uma única "molécula-alvo", uma fita de dsDNA com uma biotina em uma extremidade e uma molécula de sulforrodamina 101 fixada à outra extremidade (ver Figura 9, painel esquerdo, losango), que está disponível para se ligar a uma superfície de sensor revestida com anticorpos anti-sulforrodamina 101. Em seguida, diferentes quantidades de dsDNA não funcional do mesmo comprimento (mas sem a molécula de sulforrodamina 101) foram ligadas à partícula também, e a capacidade das partículas se ligarem à superfície do sensor foi comparada.

[259] Em um experimento adicional, uma partícula foi carregada com dsDNA 1999 bp. A Figura 9, painel do meio, mostra a quantidade relativa de partículas que se ligam após carregamento com DNA não funcional, comparado com uma partícula com apenas uma molécula de DNA "funcional".

[260] Em um experimento adicional, uma partícula foi carregada com dsDNA 497 bp. A Figura 9, painel inferior, mostra a quantidade relativa de partículas que se ligam após carregamento com DNA não funcional, comparado com uma partícula com apenas uma molécula de DNA "funcional".

Claims

1. SISTEMA PARA DETECTAR UMA MOLÉCULA-ALVO DENTRO DE UMA SOLUÇÃO, caracterizado por compreender (a) um recipiente de amostra para a medição da molécula-alvo dentro da solução, (b) uma primeira particula na solução, em que a dita primeira particula é funcionalizada com uma primeira molécula de ligação capaz de se ligar especificamente à dita molécula- alvo, e (c) uma estrutura de superfície compreendendo uma segunda molécula de ligação capaz de se ligar à molécula-alvo na solução, em que a dita estrutura de superfície cobre um sensor plano ou está presente em uma segunda particula, em que a dita particula é capaz de se ligar à dita segunda molécula de ligação da estrutura de superfície diretamente ou indiretamente através da molécula-alvo; em que (a) a dita primeira molécula de ligação é fixada à primeira particula através de uma molécula ligante rigida e longa, e/ou (b) a dita segunda molécula de ligação é fixada à superfície de particula da dita segunda particula ou à superfície de sensor plano através de uma molécula ligante rigida e longa; em que o comprimento e a consistência de cada uma da dita molécula ligante longa e rigida inclui em um comprimento de extensão médio definido como a raiz quadrada média da distância ponta a ponta da dita molécula ligante longa e rigida na solução de mais de 60 nm.

2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira e/ou a segunda particula ser uma particula magnética.

3. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo diâmetro da dita primeira e/ou segunda particula ser pelo menos 100 nm e em que o dito comprimento de extensão médio é pelo menos 10% do diâmetro.

4. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela molécula ligante longa e rigida possuir um comprimento de extensão médio de pelo menos 20% o comprimento de contorno da dita molécula ligante longa e rigida.

5. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita primeira molécula de ligação ser um anticorpo ou um fragmento do mesmo, um aptâmero, um ligante, ou um ácido nucleico complementar.

6. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira molécula de ligação ser capaz de conectar à primeira particula através da molécula ligante longa e rigida, em que a dita primeira particula compreende adicionalmente uma estrutura de superfície repulsiva, a qual é diretamente fixada à superfície da dita primeira particula, em que a dita estrutura de superfície repulsiva cobre a superfície da primeira particula de modo a resultar em uma carga liquida especifica e/ou uma repulsão esférica da primeira particula, e em que a dita estrutura de superfície repulsiva transmite um efeito de empurrar as ditas primeiras partículas em direção à dita superfície de sensor, em que a molécula ligante longa e rigida é mais longa que a dita estrutura de superfície repulsiva.

7. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela dita estrutura de superfície repulsiva ser uma estrutura carregada que compreende uma molécula selecionada do grupo que consiste em dsDNA, PNA, um duplex PNA-DNA e um duplex RNA-DNA.

8. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela dita estrutura de superfície repulsiva não ser clivável por DNase.

9. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita molécula ligante longa e rigida compreender adicionalmente pelo menos um espaçador flexível curto compreendendo ácido nucleico de fita única.

10. MÉTODO DE DETECTAR A PRESENÇA OU A QUANTIDADE DE UMA MOLÉCULA-ALVO DENTRO DE UMA AMOSTRA DISPOSTA EM UM RECIPIENTE DE AMOSTRA, caracterizado por compreender: (a) contactar a amostra disposta no recipiente de amostra e uma primeira molécula de ligação fixada a uma primeira partícula disposta no recipiente de amostra, e (b) contactar a amostra disposta no recipiente de amostra com i) uma segunda molécula de ligação capaz de se fixar a uma superfície plana disposta na amostra ou a uma segunda partícula disposta no recipiente de amostra, em que a primeira molécula de ligação e a segunda molécula de ligação são capazes de se ligar especificamente à dita molécula-alvo, ii) uma molécula análoga alvo fixada à superfície plana ou à segunda partícula, em que a molécula-alvo é capaz de interferir com a ligação da primeira molécula de ligação à molécula análoga alvo; e (c) detectar o número de primeiras partículas ligadas à superfície plana ou à segunda partícula, em que o número de primeiras ligadas à superfície plana ou à segunda partícula é diretamente ou inversamente relacionado à quantidade de moléculas-alvo presentes na amostra; em que (I) a primeira molécula de ligação é fixada à primeira particula através da molécula ligante longa e rigida, e/ou (II) a dita segunda molécula de ligação é fixada à superfície da dita segunda particula ou à superfície plana de sensor através uma molécula ligante longa e rigida, e em que um comprimento e uma consistência de cada uma da dita molécula ligante longa e rigida produz em um comprimento de extensão médio definido como a raiz quadrada média da distância ponta a ponta da dita molécula ligante longa e rigida na solução de mais de 60 nm.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado adicionalmente por compreender: aplicar uma força magnética à amostra disposta no recipiente de amostra para trazer as primeiras partículas em proximidade com a dita superfície plana ou a segunda particula de modo a facilitar a aglomeração das partículas.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela fixação da dita segunda molécula de ligação à superfície plana ou segunda particula ocorrer depois da ligação da segunda molécula de ligação à molécula-alvo.

14. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita molécula-alvo ser troponina cardiaca I (cTnl), NT-proBNP ou hormônio da paratireoide.

15. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo comprimento de extensão médio ser V<R2>, onde:

onde 1 é um comprimento na extensão fisicamente máxima possivel da molécula ligante longa e rigida, e P é um comprimento da molécula ligante longa e rigida sobre a qual as correlações nas direções das tangentes são perdidas.

15. SISTEMA PARA DETECTAR UMA MOLÉCULA-ALVO DENTRO DE UMA SOLUÇÃO, caracterizado por compreender: um recipiente de amostra configurado para receber uma solução incluindo uma primeira particula disposta no recipiente de amostra; primeiras moléculas de ligação na solução configurada para ligação especifica à dita molécula-alvo de ligação; uma estrutura de superfície disposta no recipiente de amostra; segundas moléculas de ligação configuradas para se ligarem às moléculas-alvo na solução; moléculas ligantes longas e rigidas configuradas para pelo menos um dos seguintes: -conectar as primeiras moléculas de ligação às primeiras partículas, ou -conectar as segundas moléculas de ligação à estrutura de superfície, em que as moléculas ligantes longas e rigidas possuem um comprimento e uma consistência com um comprimento de extensão médio definido como a raiz quadrada média da distância ponta a ponta da dita molécula ligante longa e rigida na solução de mais de 60 nm.

16. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela molécula ligante longa e rigida incluir um DNA de fita dupla (dsDNA) de pelo menos 220 pares base (pb).

17. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela molécula ligante longa e rigida incluir dsDNA de pelo menos 700 bp.

18. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela molécula ligante longa e rigida incluir um DNA de fita dupla (dsDNA) de pelo menos 220 pb.

19. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela molécula ligante longa e rigida incluir um DNA de fita dupla (dsDNA) de pelo menos 700 bp.