CN102040653B - 一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽及其用于制备酶联免疫固相抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽及其用于制备酶联免疫固相抗原的方法，能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽氨基酸序列为：Phe-Lys-Phe-Trp-Pro-Tyr-Glu-His-Val-Ile-Arg-Gly；其编码核苷酸序列为：TTCAAA TTC TGG CCA TAC GAA CAT GTA ATA CGG GGG。本发明具有如下优势：1、Lig2标签肽对聚苯乙烯载体有较强的亲和结合能力，能引导融合抗原以统一有序的方式导向固定至聚苯乙烯表面，由此避免了抗体结合位点与载体刚性表面直接接触而导致的构象变化或位点遮蔽，最大限度地保持抗体结合活性及良好的空间取向，提高酶联免疫检测灵敏度2.5-3倍；2、本发明可应用于以聚苯乙烯为固定载体的酶联免疫、生物传感器及微阵列芯片等诊断检验技术，提高检测灵敏度。

Description

一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽及其用于制备酶联免疫固相抗原的方法
技术领域
本发明涉及一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽，及用其改善抗原在聚苯乙烯载体表面的固定效果，从而提高酶联免疫检测灵敏度的方法。
背景技术
酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体是将特异性抗原固定于聚苯乙烯载体表面，形成固相抗原，然后通过与待测标本(如血清)中对应的抗体结合而实现其检测，该技术已广泛应用于医学检验的各个领域，成为临床诊断的常规方法[Butler JE，Journal ofimmunoassay &immunochemistry.2000，21：165-209]。其中，抗原固相化是关键环节：抗原的活性与其立体结构、位点取向密切相关，固定于载体表面的抗原常常因构象改变而失活，丧失对靶抗体的识别、结合能力[Butler JE et al，MolecularImmunology.1993，30：1165-1175]。因此，如何在固定抗原的同时最大限度地保持其生物活性和正确的空间取向是免疫分析技术的一大难题[Cho IH et al，Analytical Biochemistry.2007，365：14-23]。
将抗原固定于聚苯乙烯载体的方式大致有物理吸附和共价结合两种。物理吸附主要是依靠抗原与载体间非特异性相互作用将其固定至载体表面，其吸附过程不易控制；共价结合则是利用抗原分子上的氨基，同经过一定化学修饰的载体表面的活性基团共价结合，实现抗原固相化。共价固定相对较稳定，但抗原分子上氨基等功能团较多，导致抗原不能定向结合，另外，通过共价键固定于载体表面的抗原常常因结构改变而变性[章爱娟等，化学进展.2009，21：1408-1417]。无论是依靠非共价键还是共价键与载体结合，这种结合针对抗原分子而言都是随机的，分子在载体表面的排列呈无序状态，如图1所示，只有抗体结合位点暴露的固相抗原才能与靶抗体结合，而部分固相抗原分子因结合位点被遮蔽而无法识别对应的抗体，在酶联免疫的后续检测中不能产生有效免疫响应，难以达到高灵敏的要求[Peluso P et al，AnalyticalBiochemistry.2003，312：113-124]。
发明内容
本发明的目的是提供一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽，以及用该标签肽改善抗原在聚苯乙烯载体表面的固定效果，从而提高酶联免疫检测灵敏度的方法。
本发明的目的是通过如下方式实现的：
一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽，它的氨基酸序列为Lig2：Phe-Lys-Phe-Trp-Pro-Tyr-Glu-His-Val-Ile-Arg-Gly；它的编码核苷酸序列为：TTC AAA TTC TGG CCA TAC GAA CAT GTA ATA CGG GGG。
一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽用于制备酶联免疫固相抗原的方法：
.(1)、将Lig2标签肽编码核苷酸序列用基因融合的方法将其插入目标抗原的原核表达质粒，构建标签肽融合抗原表达质粒；
(2)、表达并纯化标签肽融合抗原；
(3)、将4-40μg/ml的标签肽融合抗原加至聚苯乙烯微孔板，4-6℃下静置固定8-12h，将标签肽融合抗原包被至聚苯乙烯微孔板，得到酶联免疫固相抗原。
本发明具有如下优势：1、Lig2标签肽对聚苯乙烯载体有较强的亲和结合能力，能引导融合抗原以统一有序的方式导向固定至聚苯乙烯表面，由此避免了抗体结合位点与载体刚性表面直接接触而导致的构象变化或位点遮蔽，最大限度地保持抗体结合活性及良好的空间取向(如图1所示)，提高酶联免疫检测灵敏度2.5-3倍。2、本发明可应用于以聚苯乙烯为固定载体的酶联免疫、生物传感器及微阵列芯片等诊断检验技术，提高检测灵敏度。
附图说明
图1抗原分子在聚苯乙烯载体表面的固定示意图；
图2抗原分子通过Lig2标签肽在聚苯乙烯载体表面的固定示意图。
具体实施方式
如图1所示，抗原分子1在聚苯乙烯载体表面2的排列呈无序状态，部分抗原的抗体结合位点发生构象变化或被遮蔽而无法结合靶抗体。
如图2所示，抗原分子1通过Lig2标签肽3引导在聚苯乙烯载体表面2的排列呈有序状态，抗原的抗体结合位点统一暴露，空间构象保持良好，有利于更好地与待测标本中的靶抗体结合而实现其检测。
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽，它的氨基酸序列为Lig2：Phe-Lys-Phe-Trp-Pro-Tyr-Glu-His-Val-Ile-Arg-Gly；它的编码核苷酸序列为：TTC AAA TTC TGG CCA TAC GAA CAT GTA ATA CGG GGG。
一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽用于制备酶联免疫固相抗原的方法：
本发明方法是通过噬菌体随机展示肽库淘选得到能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽，以及利用该标签肽改善抗原在聚苯乙烯载体表面的固定效果，提高酶联免疫检测灵敏度。
实施例：标签肽引导的融合抗原位点导向固定在抗-HCV(hepatitis Cvirus，丙型肝炎病毒)酶联免疫检测中的应用
(1)、标签肽HCV融合抗原表达质粒的构建
将一对互补单链DNA(5’-TCGAG TTC AAA TTC TGG CCA TAC GAA CAT GTA ATA CGG GGG C-3’和5’-TCGAG CCC CCG TAT TAC ATG TTC GTA TGG CCA GAA TTT GAA C-3’，下划线部分为标签肽编码序列)95℃孵育15min后退火(60min内冷却至30℃)，产物(Xho I-Lig2)插入HCV抗原原核表达质粒pET-hcv的Xho I酶切位点，测序验证后命名为pET-hcv-Lig2，即为标签肽HCV融合抗原表达质粒。
(2)、标签肽HCV融合抗原的表达与纯化
将构建好的标签肽HCV融合抗原表达质粒pET-hcv-Lig2(以pET-hcv作为对照)转化E.coli BL21感受态细胞，涂板培养过夜；挑取单菌落接种于2×YT培养基，8h后1∶100转接摇瓶；继续振荡培养至OD600值0.6时加入IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)，37℃诱导表达3h后5000×g离心收集菌体，置-80℃过夜。
将冷冻的菌体重悬于裂解缓冲液(20mM HEPES-KOH，pH 7.6，20mMKCl，5mM β-巯基乙醇，2mM苯甲基磺酰氟)，加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶，30℃反应15min后冰浴超声破菌；用镍离子螯合亲和层析法对目的蛋白进行纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达纯化产物。
(3)、标签肽HCV融合抗原的固定
将标签肽HCV融合抗原及不带标签肽的对照抗原按25μg/ml的浓度溶于碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)，100μl每孔包被聚苯乙烯微孔板，4℃条件下静置固定12h；弃包被液，室温封闭2h(封闭液为含2％牛血清白蛋白的10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2)，抽干备用。
(4)、酶联免疫分析
将待测血清用标本稀释液(含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液)稀释10倍，100μl每孔加至抗原包被微孔板，37℃温育30min，磷酸盐缓冲液清洗5次后每孔加入100μl酶标二抗HRP-IgG；重复温育与清洗步骤，TMB(tetramethylbenzidine)显色10min，2M H2SO4终止反应后用酶标仪测定其450nm吸光值(A450)。结果如表1所示：标签肽HCV融合抗原包被微孔板的酶联免疫响应灵敏度高于无标签肽的对照抗原，3例抗-HCV阳性血清的A450值提高约2.5-3倍；3例抗-HCV阴性血清的A450值接近，说明标签肽HCV融合抗原包被微孔板灵敏度提高的同时特异性保持良好。以标签肽HCV融合抗原作为固相抗原时信噪比(Signal-to-Noise Ratio，SNR)为28.4，而对照抗原仅为8.8，有效免疫响应灵敏度增强3.2倍。
表1.固相标签肽HCV融合抗原与无标签肽的对照抗原酶联免疫灵敏度、特异性比较
Figure BSA00000259401100051
注：信噪比即酶联免疫响应信号净值(阳性血清A450值减去阴性血清A450值)与背景信号值(阴性血清A450值)之比。

Claims (2)

1.一种能与聚苯乙烯亲和结合的标签肽Lig2，其氨基酸序列为：Phe-Lys-Phe-Trp-Pro-Tyr-Glu-His-Val-Ile-Arg-Gly；其编码核苷酸序列为：TTCAAA TTC TGG CCA TAC GAA CAT GTA ATA CGG GGG。
2.用权利要求1所述的标签肽Lig2制备酶联免疫固相抗原的方法，其特征在于：
(1)、用基因融合的方法将Lig2标签肽编码核苷酸序列插入载带了目标抗原的原核表达质粒，构建标签肽融合抗原表达质粒；
(2)、表达并纯化标签肽融合抗原；
(3)、将4-40μg/ml的标签肽融合抗原加至聚苯乙烯微孔板，4-6℃下静置固定8-12h，将标签肽融合抗原包被至聚苯乙烯微孔板，得到酶联免疫固相抗原。
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