JPS60501129A - 強化凝集分析法及びその試剤 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ４、発、明の名称 強化凝集分析法及びその試剤 ・　゛び・ 以下に挙げる文献は、本明細書中で対応する番号によって引用する。

１、Ｈｕｐｆｅｒ、　Ｂ、、　Ｒｉｎｇｓｄｏｒｆ、　Ｈ，、ａｎｄ　５ｃｈｕ ｐｐ、　Ｈ−。

Ｍａｋｒｏｍｏｌ、　Ｃｈ＝ｍ、　１８２：２４７−２５３　（１９８１）。

２、Ｒｅｇｅｎ、　Ｓ、１．、、　、Ｃｚｅｃｈ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｓｉｎｇ ｈ、　Ａ、。

ム」Ｌ匹江見」玉ユ１０２：８８４０−８８４１　（１９８０）。

３、　５ｚｏｋａ、　Ｆ、　Ｊｒ、、　ａｎｄＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 、　Ｄ、、　Ａｎｎ。

■Ｌ」］暉Ｂ工狙」」４９：４Ｂ？−５０８（１９８０）。

４、、　５ｚｏｋａ、　Ｆ、、　Ｊｒ、　ａｎｄ　Ｐａｐａｈａｊｏｐｏｕｌｏ ｓ、　Ｄ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　？５：４１９４＝４１９８　（１！ ３７８）。

５、Ｈｅａｔｈ、　Ｔ、　Ｄ、、　Ｍａｃｈｅｒ、　Ｂ、　Ａ−ａｎｄ　Ｐａｐ ａｈａｄ−ｊｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｄ、、　Ｂｉｏｃｋｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂ１０ ｈ　５ｉｃａ　Ａｃｔａ８４０：８Ｂ−８１（１９８１）。

８、、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｆ、　Ｊ、、　Ｈｕｂｂｓｌｌ、　Ｗ、　Ｌ、、　ａｎ ｄ　Ｐａｐａｈａｄ−ｊｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｄ、、　Ｂｉｏｃｈｅｖａｉｓｔｒ 　、２０：４２２Ｅｌ−４２３８（１８８１）、。

？、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｆ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｐａｐａｈａｄ’ｊｏｐｏｕｌｏｓ 、　Ｄ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５７：２ＢＢ−２８８（１９８２）。

８、Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　 １７３ニア２３−７３’？　’（１！３７８）。

９、Ｃｕｒｍａｎ、Ｂ、、Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｐｅｔａｒｓｏ ｎ。

Ｐ、　Ａ、、ムユ坦りぷａｍ、２５５ニア８２Ｇ−７８２８（１１８０）。

ｔｏ、Ｓ＋＋ｉｔｈ、Ｂ、Ａ、ａｈｄ　ＭｃＣｏｒ＋ｎｅｌ、Ｈ，Ｍ、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：２？５９−２７’ｆ１３　（１９７８）。

１１、Ｌｏｗｒｙ、Ｏ，Ｈ，、、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ｎ、Ｊ、、Ｆａｒｒ。

Ａ、　Ｌ、、　ａｎｄ　Ｒａｎｄａｌｌ、　Ｌ　Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉａｓ、　Ｃ ｂ＋ｓｍ。

１９３：２８５−２７５　（１３５１）。

本発明は、強化粒子凝集分析法、及びこれを実施するための試剤（キット）に関 する。

生化学的なアナライト（分析対象）の存在又は濤度を測定するための種々の方法 がある。分析すべきアナライトとして代表的な物には、生化学的プロセスに重要 な役割を果たす物や、特定の病状や血液型の診断薬がある。幾つかの重要なアナ ライト分析技術として、分析すべきアナライトとアナライト分析試薬に含まれる 抗アナライト間の特異的で高親和性の結合に基づくものがある。この場合、アナ ライトと抗アナライト（ａｎｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ）は高親和性結合対の・相反 子る構成員であり、例えば、抗原−抗体、免疫グロブリン−蛋白質Ａ、炭水化物 −レクチン、運搬体蛋白質−受容蛋白質、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホル モン受容蛋白質、並びに相補的なオリゴヌクレオチドストランドとポリヌクレオ チドストランドの対などがある。本明細書においては、用語「リガンド」及び「 抗リガンド゛」を、この様な結合対の対応する結合構成員を表すためにも使用す る。

特異的なりガント／抗リガンド結合に基づく一般的な分析手順では、粒子が凝集 して可視的な塊を形成する。凝集性粒子はりガント分子で被覆されており、多価 の抗リガンド分子と混合されて可視の粒子塊又は凝集物を形成する。多価の抗リ ガンド分子は、異なる粒子に担われたリガンド間を架橋する機能を果す。従って 、抗リガンド分子は、異なる２個の粒子上のりガント間の架橋を促すような空間 配列をした、少なくとも２個のリガンド結合部位を持たなければならない。抗リ ガンドは２価（この様な結合部位を２個持つことを意味する）のこともあるし、 多価（分子中にこの様な部位が２個以上あることを意味する）のこともある。

本明細書において、は「多価」という用語は、別々の凝集性粒子に担われたリガ ンドを結合することができる結合部位を２個以上含む抗リガンド分子を意味する 。

粒子凝集試験で測定すべきアナライトが、生物学市原試薬を加えると、この様な 細胞特異的表面抗原の存在を証明する細胞凝集体が形成される。また、別の一被 覆された粒子分析試薬の凝集を起こす様に作用する多価の抗リガンドである。典 型的には、後者の型の凝集試験においては、アナライトは免疫グロブリン又は多 価の抗原のような血清成分であり、凝集性粒子はリガンドで被覆された赤血球細 胞、又はラテックス粒子の様な球状重合体（ビーズ）である。

粒子凝集試験は、日常的にはりガントで被覆された凝集性粒子の懸濁液と多価抗 リガンド分子を小さい反応容積において混合して行う。所定時間後（２，３分程 度でもよい）、通常は視覚的に粒子の凝集度を測定する。この様に、粒子凝集試 験は比較的実行が容易で、複雑な装置を用いずに結果を解釈することができる。

更に、典型的な粒子凝集分析試剤（キット）は比較的安価に製造することができ る。□ こうした利点にもかかわらず、従来の凝集試験法は感度上の限界のために、多く のアナライトの分析方法としての適用を阻まれていた。感度の限界とは、一つに は、測定したいアナライト濃度において可視の粒子凝集体が生じないことがある ことであり、また一つには、凝集反応の完了に要する時間が長ずごて試験に時間 がかかりすぎたり、生成する凝集体の程度（凝集した粒子の割合）が低すぎて検 出困難な場合ｒ′あること゛を言う。

、１−濫 ５ 従って、本発明の一つの目的は、分析感度が実質的に強化された粒子凝集分析方 法を提供することにある。

更に詳しくは、本発明の目的は、実質的に従来の粒子凝集法の検出限度以下の濃 度のアナライトの検出に使用可能な分析方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、多くの場合従来の粒子凝集法に要するよりも短時間 で、強力で解読が容易な、高率のポジティブな分析結果を得ることができる方法 を提供することにある。

本発明の特定の目的は、リウマチ因子及び抗核抗体を測定するための改良された 凝集分析法を提供することにある。

本発明の別の特定の目的は、ＨＢ表面抗原を測定するための改良された凝集分析 法を提供することにある。

本発明の更に別の特定の目的は１本発明の強化粒子凝集分析を実施するための粒 子凝集分析試剤（キット）を提供することにある。

また、関連した目的として、比較的安価に製造できるキットを提供することがあ る。

本発明の一態様によれば多価アナライト測定用の強化凝集分析方法が提供される 。この方法においては、表面に結合された抗アナライト分子を有するＩＭＪ性粒 子粒子応媒体中で多価アナライト分子と混合して粒子凝集体を生成させる。こう した混合により生成する凝集物の凝集度はアナライト結合体から成る試薬の添加 によって強化される。各試薬体は、各々の架橋粒子と反応体間の多数のアナライ ト−分子架橋結合によって１粒子を架橋することができる。試薬体上のアナライ ト結合性分子の表面濃度が比較的低くてもこの様な多数のアナライト−分子結合 生成能力が促される様にするため、脂質体１個につき少なくとも１５個のアナラ イト結合性粒子が横に移動できる様に表面に配列した脂質体から成る試薬が有利 である。

本発明はまた、本発明の方法の実施に役立つ粒子凝集分析試剤（キット）をも考 慮している。この試剤は、測定すべき多価アナライトを結合したり、これによっ て架橋されるために通した凝集性粒子を含む。試剤中のアナライト結合性分子は 、アナライト単独で生成する粒子凝集物の凝集度を高める作用をする。

本発明のこれらの及びその他の目的並びに特徴について、以下の発明の詳細な説 明において更に詳細に説明する。

ｌ艶立豊ｊ 本発明は一局面は、多価アナライト定量用の強化数いては、表面に結合した抗ア ナライト分子を持つ凝集性粒子の懸濁液を、反応媒体中でアナライトと混合して 粒子凝集体を生成させる。本発明では、反応媒体中に、個々の架橋された粒子を 架橋性試薬体に結合させる多重のアナライト−分子架橋によって各々がこの様な 粒子を架橋する能力を有するアナライト結合体から成る試薬を添加することによ って、前記の様にして生成する凝集体の凝集度が高められる。

この様な架橋は、各々が、横方向に移動できるアナライト結合性分子の表面配列 を有する脂質体から成る試薬によって特に促される。以下に、凝集性粒子及びア ナ、ライト結合性試薬の製造方法、並びに本発明を実施する上で使用する分析手 順について詳細に説明する。

粒　の は、水性媒体中で懸濁し、小集団として集合もしくは凝集した場合に単独の凝集 していない粒子から容易に区別できるような非水溶性粒子を包含する。通常、集 合又は凝集粒子の塊は、以下に記載する広く使用されている視覚的定量方法のい ずれかによって凝集していない粒子と視覚的”に区別することができる。本発明 においては、粒子の径及び／又は質量に応じて分別遠心分離やろ過等の物理的分 離技術によって、凝集塊を凝集していない粒子と区別することもできる。

本明細書に記載する好ましい型の粒子には、球状高分子即ち、高分子ビーズと生 物学的な細胞の二つがある。高分子ビーズは、ガラス、セルロース、アガロース 、ポリスチレン、ラテックス等から製造される。高分子ビーズは、典型的には、 粒径ｌ〜２０μｍ（直径）の球状粒子である。このビーズは、凝集分析を行うか 又は粒子を貯蔵する際のイオン強度及びｐＨ条件において所望の表面電荷を持つ ように選択したり、化学的に変性することができる。ガレスビーズ及び重合体ビ ーズを含めた、高分子ビーズの表面に荷電グループを結合させる方法は、当業者 間に良く知られている。

高分子ビーズ粒子に結合される犠アナライト分子としては、分析すべき多価アナ ライトの一個以上の結合部位に高い親和性を持ち、特異的に結合する能力を有す るものが含まれる。本発明によって意図する７ナラント／抗アナライト結合対に は、抗原−抗体、免疫グロブリン−蛋白質Ａ、炭水化物−レクチン、ビオチン− アビジン、ホルモン−ホルモン受容蛋白質、運搬体蛋白質−受容蛋白質、及び抗 アナライトが対の一方の構成要素である相補的ヌクレオチドストランド等がある 。より一般的には、抗アナライトとしては、アナライト結合部位の少なくとも一 つに対して高い親和性を持ち特異的に結合すること力ｔできる、抗アナライトの ９ フラグメント又は部分のすべてが含まれる０例えば、抗体−抗原対においては、 抗アナライト抗体として抗原結合性Ｆ（ａｂ′）、フラグメント又は、Ｆａｂ′ フラグメントが含まれる。また、別の例として、免疫グロブリン−蛋白質Ａの対 においては、抗アナライト免疫グロブリンとして含まれるのはＦｃ免疫グロブリ ンフラグメントだけである。

リガンド分子は高分子ビーズ粒子に吸着させたり、適当な結合反応によって高分 子ビーズに共有結合的に結合させることができる。適当な場合には、高分子ビー ズ粒子表面を修飾してこの様な共有結合に使用される反応性の高い基を含有させ ることもできる０例えば、ガラスピーズをグリセロール拳プロピルシラン試薬で 処理後カルボニルジイミダゾールで活性化し、次いで過剰のジアミノアルカンと 反応させてアミンガラスに変えることによって、ガラスピーズの表面にチオ官能 基を含むように変性することができる。アミノガラスをＮ−スクシニミジル−３ −（２ピリジルジチオ）プロピオネートと反応させてピリジルジチオガラスに変 性する。続いて、ピリジルジチオガラスをジチオトレイトール又は２−メルカプ トエタノールで還元して、表面にチオ官能基を有する粒子を製造する。ラテック ス粒子の様にカルボキシル基やアミン基等の反応性表面基を有する高分子ビーズ も商業的に入手する１０　特表明ＧＯ−５０１１２９（６）ことができる、吸着 又は共有結合によって高分子ビーズにリガンド分子を結合させる方法は、当業堪 の熟知するところである。

凝集性粒子には、生物学的な細胞、又は細胞膜ゴーストの様な細胞に由来する粒 子も含む。代表的は細胞としては、種々の型の血液細胞、特に赤血球細胞がある 。また、ビールス粒子、バクテリア細胞、及び標準的な細胞培養法によって解離 した細胞の懸濁液として作製可能な種々の植物や動物の組繊細胞も含まれる。

可能であれば、分析すべき多価アナライトによって特異的に認識される内因性の 細胞表面分子を含む細胞も使用される。より一般的には、抗アナライト分子は外 因性のリガンド分子で覆われた細胞粒子試薬を製造するために、既知の手順によ って細胞粒子に結合される。抗アナライト分子の細胞表面への結合は、高分子ビ ーズ粒子について上述したと同様に、吸着、免疫特異性結合、文は共有結合等に よって行うことができる。生物学的細胞粒子の表面は、既知の種々の反応によっ て変性が可能であり、また、所望の細胞表面電荷を得るために細胞粒子媒体のイ オン強度を調整することもできる。

アナライト 粒子凝集性を高めるために本発明で使用するアナライト結合性試薬は、好ましく は、各々に脂質構造並び１ にこの構造の表面に担われた横に移動できるアナライト−結合性分子の列を含む 脂質体番含む、脂質の構造は、内部に、水性領域をｆｆｆする、単ラメラ又は多 重ラメラの二重層が閉じた小胞の形を採ることがあり、〜こうした小胞はリポゾ ームとも呼ばれる。また、リボン状体及び小胞の小凝集体を始めとする無定形の 脂質二重層構造、又は凝集体も含まれる。もう一つの可能な脂質構造は、リン脂 質単一層の様な脂質単一層によって、乳化された油滴を包み込むことによって形 成される。この様な構造の安定性を、例えば前記参考文献１及び２に記載の脂質 単一層重合反応に従って、単一・層の成分を部分的に重合させることによって増 加させ得る場合がある。

脂質体試薬の好ましい製造方法の一つでは、最初に脂質二重層小胞を作製する。

続いてアナライｉ・結合性分子を小胞の表面に反応又は含有させ、小胞性試薬体 を製造する。前述のリボン状構造や凝集構造を持つ非小胞性脂質体は、物理的に 、例えば凍結・融解によって小胞体を破壊することによって製造することができ る。

脂質二重層小胞の特性及び装填方法は文献中に詳細に記述されている。この問題 に関する総合的な解説を得るには前記参考文献３及び４．並びにその中の引用文 献を参照すれば良い。本明細書においては、本発明において使用される試薬の製 造に用いられる脂質小胞の好ましい製造方法、並びに本発明の利点に寄与する小 胞の特性について説明する。

脂質小胞は、典型的にはリン脂質及びステロールを含む脂質混合物から製造され る。リボシートの製造に通常使用されるリン脂質の−・驚異は参考文献３の第４ ７１頁にある。使用する脂質を選択するための一つの基準として、形成された小 胞に望まれる流体の流動性や脂質の充填密度がある。何人かの文献報告渚によっ て報告されているように、これらの特性は、脂質の脂肪族鎖の長さ及び飽和度、 並びに使用した脂肪族鎖脂質に対するステロールの比率によって変化する。本発 明で使用されるアナライト結合性試薬の表面流動性について以下に説明する。充 填密度特性は、アナライト結合性分子を小胞表面に共有結合的に結合させるため に使用する反応を成功させるために重要である。例えば、以下）こ記述する特定 の蛋白質結合反応を成功させるには、少なくとも約１０モル％のコレステロール の包含が重要であることが判っている。流動特性及び充填密度特性は生成した小 胞中の二重層の数及び小胞の大きさにも影響する。

脂質成分は、また、それを通じてアナライト結合性分子が小胞表面に結合できる 特殊な脂質ヘッドグループが必要な数だけ得られるようにも選択する。ヘッドグ ループ又はそれらの必要な変性体は、小胞製造後形成させても良いし、それらを 小胞に導入する前に脂質中に形成させることもできる。好ましい結合反応に使用 される脂質の例は以下に記載する。

極性脂質グループの数及び種類も、選定されたｐＨ及びイオン強度において脂質 小胞上に所望の電荷分布を生じるように選択することができる。電荷分布は。

アナライト結合性分子を小胞に結合させるために用いる結合反応に影響すること があり、試薬体の非特異的は凝集、及び凝集性粒子に対する試薬体の非特異的な 結合を減じる上でも重要である。以下に述べる様に。

一般に、比較的荷電の低い凝集性粒子の結合に使用する場合はより強く負荷電を 帯びた試薬体を供給し、より大きな表面負荷電を帯びた粒子の結合に使用する場 合は負帯電度の比較的偏い試薬を用いるのが好ましい。

本発明に用いる脂質小胞の製造に使用される典型的な脂質成分は、好ましくは、 約１０〜５０％のコレステロール又は他のステロール、並びに試薬の酵素及びリ ガンド分子が個々に結合可能な約２〜５０％の糖脂ジルコリン等の中性リン脂質 、又はリン脂質混合物である。ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセ リン、ホスファチジン酸、糖脂質等の荷電脂質、及びコレステロールホスフェー ト又はコレステロールサルフェート等の荷電コレステロール誘導体も、脂肪小胞 に所望の表面電荷を与えるために用いることができる。

脂質小胞は、特に参考文献３に記載される様な種々の方法によって製造すること ができる。多重ラメラ小胞、すなわち、一連の雀に充填した二重層ラメラから成 る小胞は、脂質混合物を薄膜中で乾燥し１次いで脂質を水性緩衝液で水和するこ とによって作製することができる。形成された脂質小胞中のラメラの大きさ及び 数は、水利時間及び脂質水和時の攪拌量を変化させることによって、ある限度内 で制御可能である。小さくて、比較的大きさが均一な多重ラメラ小胞を得るには 、激しい攪拌、短時間の超音波処理、又はポリカーボネート膜を通しての押出し を使用できる。だが、本発明の方法に使用される試薬の製造には、一般的に、大 きな小胞゛を用いるのが好ましい。

転相蒸発（ｒｅ’ｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔ＋ｏｎ）と呼ばれ る、大きな単ラメラ小胞の好ましい製造方法の一つにおいては、所望の組成の脂 質をジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、又はイソプロピルエーテルとク ロロホルム（Ｌ：１）の様な溶媒混合物等の適当な有機溶媒中に溶解後、脂質・ 溶媒混合物の３〜６倍量の水性溶液を直接添加し、この調合液を短時間超音波処 ５ 理して均一なエマルジョンを形成させる。次いで、有機溶媒又は溶媒混合物を減 圧下に除去して粘稠なゲル状中間相を、形成させる。これから減圧下に残留溶媒 を除去すると、瞬間的に小胞懸濁液が生成す°る。得ら尤る小胞の大きさは、脂 質混合物中に含まれるコレステロール量によって変化する。転相蒸発技術につい ての更に詳しい説明は、参考文献３又は４にある。

転相蒸発技術は、小胞内部空間に水溶性分子を効率的に包蔵させるためにも使用 できる。この特徴は、脂質体を含む凝集塊を見え易くするため小胞内に水溶性染 料等を包み込みたい様な場合には、本発明にとって有利である。本発明の方法に 使用される脂質体の可視性は、既知の技術で脂質小胞の表面に可視の染料は又は けい光分子を結合させることによっても強化することができる。

製造される脂質小胞の大きさは、種々の方法によって、一定の範囲にすることが できる。例えば、ゲルろ過及び超遠心分離によって小さな単ラメラ小胞の径のバ ラツキを減する方法が記されている。また、参考文献４には、選定された孔径な 持つポリカーボネートろ過膜を通して押し出すことによって脂質小胞の径及び径 のバラツキを減する方法が記載されている。

上述のことから、所望の範囲の大きさ、膜厚、流体流動性、表面電荷、並びに反 応特性を有する脂質小胞６ を、脂質成分及び製造技術を適切に選択することによって形成させ得ることが判 る。更に、製造された小胞な物理的な破壊技術で破壊して、後に説明中るように 、よりアモルファスな脂質体を製造することができる。

脂質試薬中の脂質体は、各小胞表面に横方向に移動できるアナライト結合性分子 の配列を形成させることによって製造する。アナライト結合性分子は、分析すべ き多価アナライト分子に特異的に高親和性で結合できるような物にする。すなわ ち、アナライト結合性分子とアナライト分子は前記の型の結合対の相対する構成 員である。前述の様に、アナライト結合性分子とアナライトの対には、免疫グロ ブリン−蛋白質Ａ、炭水化物−レクチン、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホル モン受容蛋白質、運搬体蛋白質−受容蛋白質、及び相補的ヌクレオチドストラン ド等がある。より一般的に言えば、！薬のアナライト結合性分子には、アナライ ト分子と特異的で高い親和性を有する結合を形成し得る結合対分子のすべてのフ ラグメント又は部分を含むことができる。

各アナライト分子も粒子状抗アナライト分子に特異的に結合できる第二の結合対 部分を含み、本発明に使用される反応条件において、アナライト結合性分子は粒 子状アンチアナライト分子に対して特異的に高親和１７ 性結合し得るものであってはならないという制限の下で、アナライト結合性分子 は結合対の一方の構成員を含むことができる。

アナライト結合性分子を小胞脂質の極性へ７ドーグループに共有結合させるため の幾つかの方法が知られている。一般的に、結合される分子の特異的な結合活性 を大きく減じない様な結合反応を選択することが大切である。同時に、比較的結 合効率の高い方法を選ぶのが有利である。最後に、試薬成分間の架橋によって（ 個々の脂質／アナライト結合性分子間の結合を除く）常に、表面脂質及び結合し た分子の流動性が減ぜられるため、小胞の脂質成分間や個々に結合したアナライ ト結合性分子間で顕著な架橋を生じるような反応を行うことは避けるように注意 しなければならない。

以下に蛋白質アナライト結合性分子を脂質小胞に対して結合させるための好まし い２種類の方法を記すが、これは本発明の範囲を限定しようとするものではない 。

第１の方法では、結合すべき脂質又は分子のアルデヒド基と、２個の反応試薬剤 のうち他の一方の第１級アミノ基との間でシッフ塩基を形成させる。アルデヒド 基は好ましくは過ヨウ素酸酸化で製造する。また、酸化剤除去後の結合反応は、 還元剤の存在下に行う。

過ヨウ素酸処理によって多くの蛋白質が不活性化されるため、アナライト結合性 蛋白質分子が酸化される可能性があるものの、より一般的にはアルデヒド先駆体 として脂質成分を使用する０代表的なアルデヒド性脂質先駆体としては、ラクト シルセラミド、トリへキンシルセラミド、ガラクトセレブロシド、ホスファチジ ルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びガングリオシド等がある。

実際には、小胞を、脂質の酸化し得る基の大半を酸化するに十分な時間酸化後、 カラムゲルろ過で過ヨウ素酸から分離する。小胞表面のアルデヒド基は、例えば 蛋白質中のりシン基の様な第１級のアミンと結合してシッフ塩基を形成するので 、統いてこれをソジウムポロハイドライド又はソジウムシ７ノボロハイドライド で還元してより安定な結合を形成させる。典型的には、ソジウムポロハイドライ ドで還元された共役対について、全脂質の約５〜１０１１０１Ｌの濃度の酸化さ れた脂質小値をアルカリＰＨ下で蛋白質１０〜３０ｍｇと容積１ｍｌ中で混合す る。この反応は室温で約２時間行う、ソジウムシアノポロハイドライドで還元さ れた共役対については、通常、反応をより長時間かけて行う、更に詳細について は参考文献５に記載されている。

転相蒸発後、孔径０　、２７ｔ−ｍのポリカーボネート膜から押出して作製した 脂質小胞を用いれば、上述の方９ 法により、小胞表面に脂質小胞脂質ｌＪＬ！ｌｏｌ当り釣ることができる。計算 に基づく、小胞脂質１μｍｏｌ当約１．２Ｘ１０　という小胞数から、この結合 比は脂質小胞当り約６００のＩｇＧ分子に相当する。同様に、より小さな分子は 、それに相当する分だけ多くの品質小胞に結合することができる。すなわち、脂 質小胞当り（直径０．２Ｂｍの範囲において）最大、約１８００のＦ　ａ　ｂ’ 抗体が結合することができる。この方法は、選択された脂質中の酸化により生じ たアルデヒドと反応し得る第１級アミノ基が、蛋白質や他の生体分子中に一般に 存在するため、非常に応用性が広い。

第２の一般的な結合技術はチオール含有分子に適用することができ、小胞の脂質 ど結合される分子の間にジスルフィド結合又はチオエーテル結合を形成させる過 程を含む。この技術は特に、脂質小胞にＦ（ａｂ′）２及びＦａｂ′抗体を結合 させるために役立つ。

ジスルフィド交換反応においては、ホスファチジル体分子中の露出したチオール 基との反応性を持つピリジルジチオ誘導体を生成させる。この方法に使用される 反応条件の詳細については参考文献６を参照されたい。ここに報告されている様 に、リン脂Ｊ／ｐｍｏ１当り最大６００ｕのＦ　ａ　ｂ　′抗体フラグメントの 結合比を達成することができる。前述と同様の計算から、この数は、直径０．２ ＪＬｍの小胞当り約６．０００のＦａｂ′抗体分子に相当する。

参考文献７に詳細に記載されているチオエーテル結合反応は、Ｎ−１４（ｐ−マ レイミドフェニル）ブチリル）ホスファチジルエタノールアミンＣＭＦＢ−ＰＥ ）の様なスルフヒドリル反応性リン脂質間導体を脂質小胞中に少量導入すること によって行う。この脂質小胞はチオール含有蛋白質と反応として、蛋白質のチオ ール基とＭＰＢ−ＰＥのマレイミド基の間に木質的にに不可逆的なチオエーテル 結合を形成する。不可欠な存在である蛋白質のチオール基は、蛋白質に対して内 因的なものであっても良いし、或いは参考文献８に報告されている様な既知の方 法で、アミン反応性チオール試嘆によって蛋白質に導入することもできることを 注意しておく。脂質小胞のリン脂質ｇｍｏ１当り最大的３５０　ｍ　ｇのスルフ ヒドリル含有蛋白質の結合比が得られている。

アナライト結合性分子は、洗剤溶液中に分散した遊離の脂質に対してこの分子を まず共有結合させることによっても、脂質小胞に結合させることができる。次い で、脂質とアナライト結合性分子の対を、小胞形成２１ 時に、又は予め形成された小胞に既知の技術で拡散させることによって脂質小胞 中に導入する。

或いは、アナライト結合性分子自身が、それによってリガンドを脂質小胞に導入 できるような内在的な疎水性部（例えば、脂質グループ又はアミノ酸の疎水性部 ）を含む場合もある。−例として、人体の移植抗原は、抗原の疎水性ペプチド部 を小胞に対して固定することによって卵レシチン小胞に結合させ得ることが判っ ている（参考文献９）。

分子を脂質小胞表面に結合させるために（又は分子を小胞表面に取込むために） 用いる反迭条件は、アナライト結合性分子の所望の表面濃度が得られるように選 ぶ。一般的には、望ましい濃度とは、本発明の凝集分析方法における粒子の凝集 が丁度最適な程度に、或いは最適に近い程度に強化される濃度である。本明細書 の裏付けとして実施した研究から、ここに記載した脂質小胞試薬による粒子凝集 性の強化度は、脂質１個当りの表面濃度が最小の約１５分から最大の約２００分 子に上昇するに伴って向上することが判っている（平均直径が約０．２〜０．４ ’７ｉｍの小胞について）。Ｆａｂ′フ”′ラグメント等のドルトン分子量が約 ５０．０００の蛋白質や、直径範囲が０．２ｇｍ以内の小胞については、小胞１ 個当り１５〜２００の分子が大雑把に小胞脂質ｐＬｍｏｌ当り約１．５〜２０Ｊ Ｌｇの蛋白質に相当する。

」二記の、小胞１個当り約２００分子のものでは、試薬の粒子凝集性強化能力に ほとんど改善が認められなかった。試薬分子の表面濃度が高いと、明らかに試薬 分子の価格が重要な考慮対象になる。

上述のように、脂質小胞（直径０．２ｐｍの範囲の）に対して平均して最大ｓ　 、ｏｏｏ分子°（ダルトン分子量５０．０００の範囲で）まで結合可能な反応が 得られる。従って精製血清抗体、モノクローナル抗体及び精製抗原のように比較 的純粋なアナライト結合性分子については、脂質体に結合される分子の最終的な 表面濃度が、到達回部な表面濃度の極く小さな比率（例えば、１％未満）になる ことがある。逆に言えば、例えば特異的なアナライト結合性蛋白質を１％未満し か含まない蛋白質混合物を、不可欠である脂質体１個当り１５０〜２’ＯＯ分子 のアナライト結合性分子を得るに十分な濃度で、小胞に対して結合させることが できる。この特徴は、例えば脂質試薬の形成に使用されるアナライト結合性分子 が、選択されたアナライトに対して特異的な抗体又は抗原フラグメント分子を約 （１）、５％しか含まないことがある、血清起源の抗原フラグメント又は抗体フ ラグメント調合剤中に含まれている様な場合には極めて有利である。例として、 ０．５％のアナライト結合性Ｆａｂ′フラグメントを３ 含むＦａｂ　’フラグメント試合側３，０００分子を脂質小胞に結合させると、 （直径０．２ｇｍの範囲の）小胞１個当り約１５０分子のアナライト結合性Ｆａ ｂ′フラグメント濃度を得ることができる。結合された分子の１／２が結合反応 によって不活性化されると仮定してもなお、この試薬は小胞１個について少なく とも約７５分子のアナライト結合性分子表面濃度を有することになる。

結合反応の終了後、例えば凍結・融解によって、試薬小胞を物理的に破壊して、 より大きく、よりアモルファスな脂質体を作製することができる。凍結会融解過 程に一回処した脂質小胞試薬の顕微鏡検査により、凝集物又は脂質小胞の小さな 凝集体と共に非小胞状のリボン状構造を持つ脂質体が大きな比率で認められた。

より大きい及び／又はよりアモルファスな脂質体は、粒子凝集試験で大きな粒子 凝集性強化能力を示すことがあったが（実施例■）、明らかにそうではない場合 もあった（実施例■及び■）。

凍結法は、更に、一旦凍結された試料は試薬の粒子凝集性強化能力の大きな変化 なしに長期間に渡って貯蔵できるという点でも有■である。試薬小胞は凍結乾燥 保存用に調整することもできる。典型的には、希釈緩衝液中に懸濁した試薬小胞 試剤を常法通り凍結乾燥後、乾燥条件下で貯蔵する。比較的短期間の貯蔵につ４ いては、脂質体試薬を、好ましくは０〜４°Ｃで、溶液中で貯蔵することができ る。脂質体の懸濁液を含む貯蔵溶液は、脂質の酸化による脂質体への損傷を最小 限度にするため、脱酸素するのが好ましい。

脂質体試薬は、場合によっては、粒子凝集分析試験に使用するに先立って、凝集 性粒子と混合して貯蔵することもできる。本発明の一局面の特徴として、抗アナ ライト分子で被覆されたラテックス粒子と試薬脂質体を一緒に、試薬脂質体と粒 子間の結合を最小にように作用する非アナライト蛋白質をも含む溶液中で、非凝 集性の共懸濁液として貯蔵することができる。この様な共懸濁液は、貯蔵に関し て、木質的に懸濁液中の個々の成分と同程度に安定である。

この点については、試薬のアナライト結合性分子は一般に、粒子状抗アナライト 分子に対して直接結合することはできないことが注目される。しかし、アナライ ト／抗アナライト対の中には、この様な反応の防止に有効な非アナライト分子が 存在しない場合、試薬のアナライト結合性分子が粒子状抗アナライト分子と弱く 交差反応するものがある。直接的で弱い試薬粒子の結合が生じる場合には、凝集 試験の反応媒体中にこの様な非アナライト分子を含める必要がある。例えば、実 施例■で後述する様に、抗ＩｇＭアナライト結合性分子を含む脂質試薬によるＩ ｇＧ被覆ラテックス粒子２５ の凝集を防止するには、非アナライトを含む血清が有効である。

次に、本発明の分析方法において重要なアナライト結合性試薬の特性について考 察する。前述の様に、粒子凝集性の強化には脂質体１個当り少なくとも約１５個 のアナライト結合性分子の最低表面濃度を必要とし、アナライト結合性分子の平 均表面濃度が脂質体１個当り約２００迄は、濃度の増加に伴ってより大きな粒子 凝集性の強化が認められる。この知見は、各架橋粒子と架橋試薬体間における多 数（多重）のアナライト分子架橋連結の形成を介して行なわれるこの試薬の作用 機構に一致する。この試薬が、それ自身と架橋された粒子間のシングルのアナラ イト−分子架橋を形成することによって機能しているならば、アナライト結合性 分子の表面濃度がより低くても凝集反応強化作用を期待できるはずである。事実 、アナライト結合性分子の表面濃度が比較的高い試薬は、溶液からアナライト粒 子を除去することにより、実際には低濃度試薬よりも凝集強化効果が低くなって しまうであろううと考えられるかもしれない。しかし、試薬に結合した多重のア ナライト分子は　粒子に対しても結合し、それらの間に多重の架橋結合を形成す るという明瞭な理由により−１この様なことは観察されない。

多重のアナライト架橋結合を介して粒子の凝集を促すという試薬脂質体の能力を 発揮させるには、試薬のアナライト結合性分子が、前述の様に、脂質体１個につ いて少なくとも１５〜２００分子の表面濃度において、高度の可動性又は流動性 を持つことが要求される。脂質二重層内でのリン脂質の拡散について１０−”　 〜１０−’ｌ　ｃ、ｄ／ｓｅｃの拡散定数が測定されている（参考文献１０）。

拡散が速いと、いくつかのアナライト結合性分子がシングルのアナライト分子が 関与する最初の架橋を終えた後短時間内に「架橋形成」位置に移行できるため、 脂質体と各架橋粒子間の多重アナライト分子架橋結合が促されることになる。

強化凝集法における試薬体と凝集性粒子間の相互作用の性質を、アナライト結合 性分子で被覆した重合体ビーズ粒子の粒子凝集反応強化能力を研究することによ って更に検討した。この研究においては、２個のラテックス１゛−ズ試薬を作製 した。そのうち１個は平均直径約３ｐｍ、１個は平均直径約０．４ｐｍのラテッ クスビーズで作った。

上述のいずれかの平均直径を持つポリビーズ−カルボキシレート単分散ラテック ス微小球をＰ　ｏ　ｌ　ｙ　ｓ　ｃ　１−ｅｎｃｅｓ　、Ｉｎｃ、から入手した 。ラテックスビーズ試薬を作製するため、２．５％ラテックスビーズ２ｍ２を後 述の実施例Ｈの様にして得たウサギ抗ヒト７ Ｉ　ｇＭＦ　（ａ　ｂ　′）　２抗体フラグメント２ｍｇと結合させた。−ラテ ックスビーズと抗体フラグメント成分を１−エチル−３（ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＣＤＩ）、の存在下に室温で終夜反応さ せた。この反応で、抗体フラグメン；・の約６５％がラテックスビーズに結合し た。直径３ｐｍ及び０．４７ｚｍのビーズを用いて作成されたラテックスビーズ 試薬はいずれも直径０．４７ｚｍの粒子径に基づいて、粒子１個当り５０〜２０ ０分子の範囲の活性で表面に接近できる抗Ｉ　ｇ　Ｍ　Ｆ　ａ　ｂ　′フラグメ ント濃度を持つと計算された。このビーズの懸濁液はヒ）ＩｇＭ分子に加えるこ とによって直接凝集可能であり、これはビーズ表面の抗ＩｇＭＦａｂ′フテグメ ント分子が溶液アナライトと免疫反応性であることを示している。

各ラテックスビーズ試薬につき、後述の実施例■及び■に記載する材用及び分析 方法を用いて、ＲＦ＋血清の存在下に、３種類の市販リウマチ因子（ＲＦ）とラ テックス粒子の間の凝集反応の強化能力を試験した。各試薬は広い濃度範囲で試 験した。その結果、実施例■及び■で使用した脂質体で観察されたのとは異なり 、いずれのラテックスビーズ試薬を用いた試験においても、測定可能゛なＲ，Ｆ −ラテックス粒子の粒子凝集反応強化作用は全く生じなかった。

この試薬のラテックス粒子は、粒子と工ｇＭの凝集反応で証明される様に、他の ラテックス粒子とアナライト−分子架橋結合を形成するに十分なアナライト結合 性蛋白質表面濃度を有している。従って、ラテックス粒子試薬の粒子凝集反応強 化使方の欠如は、部分的に凝集した粒子と多重アナライト分子架橋結合を形成す る能力が欠けているためであり、この能力の欠如はラテックス粒子表面でのアナ ライト結合性蛋白質に横れる。後述の実施例■から判るように、アナライト結合 性分子で被覆したバクテリア粒子も１本発明の方法によって粒子凝集反応を強化 する能力がない。

九訳土１ 本発明の一つの実行手順では、先ず凝集性粒子を多価アナライトと混和し、２成 分を所定時間保持後アナライト結合性試薬を加える。この手順は、本発明の方法 の実施に一般的に適用することができる。或いは、場合によっては、あらかじめ 混合した粒子と試薬脂質体へ共感濁液に対してアナライトを加えることもできる 。この手順は、分析試験手順の容易さ及び簡便さという点で明らかに有利であり 、この方法に基づく試剤（キット）は、粒子と脂質試薬を単一混合物として供給 できることから幾分安価である。

本発明の分析反応は、分析すべき多価アナライトを含み、血清試料等の生物学的 試料原体等を含むような適当な反応媒体中で行う。反応媒体のｐＨは、リガン２ ９ ド／抗リガンド結合反応に適当な値とするが、好ましくは約５−〜９とする。更 に詳しくは、反応媒体のｐＨ及び／又はイオン強度は、凝集性粒子と試薬脂質体 間の望ましい電荷相互作用が達成されるように調整する、一般的には、反応中に 粒子と試薬脂質体間に適度の電荷の反発が生じるようなイオン強度及びｐＨで反 応させるのが有利である。こうした電荷の反発がない場合は、粒子が脂質体によ って非特異的に凝集され、擬似陽性の原因になることがある。一方、粒子と脂質 体間の電荷の反発が大きすぎると、凝集反応が抑制され、試験感度が低下する。

実験的に、赤血球細胞凝集性粒子について最適な凝集反応の強化が起こるのは、 赤血球細胞が僅かに負電荷を帯び、脂質体が約１０〜２０モル％の負電荷を帯び た脂質成分を含むように調整されている場合であることが判った。

ラテックス粒子等の実質的に電荷を帯びていない重合体ビーズについては、同様 のｐＨ及びイオン強度条件下で、負電荷を帯びた脂質成分を約２ＯＮ５０モル％ 含む試薬脂質体で最良の結果が観察された。

つの反応成分、すなわち、凝集性粒子、アナライト分子、及びアナライト結合性 試薬の相対的な濃度に依存する。最適な凝集強化効果を得るのに要する試薬体濃 度は、通常は、アナライト結合性分子の表面濃度が高い試薬体はど低い。

この様な分析試験における成分比は、標準濃度の凝集性粒子を多価アナライトの 段階的な希釈液と混合し、脂質体試薬が存在しない状態における粒子凝集反応の 感度の限界を測定することによって最適化できる。

アナライト結合性試薬の一連の希釈液を粒子及びしきい量のアナライトが入った 液に加える。各試料で観察された凝集度を、通常はｌ十〜４＋までの等級スケー ル（後述）で定量的に計数する０本発明の方法において凝集強化作用を生じるア ナライト結合性試薬の濃度は、典型的にはｌＯルｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲に納 まる。

本発明の方法の典型的な実施例においては、反応成分をガラス製顕微鏡スライド 上で小反応容積、典型的には釣５０−１００１Ｌ、！で混和する。適切な反応時 間内にアナライト結合性試薬を添加した後、好ましくは光学顕微鏡を使って、滴 を視覚的に検査して凝集度を測定する。以下に記載する実施例の幾つかについて は、次の定義に従う、て粒子凝集度を１＋、２＋、３＋、又は４＋の等級で表わ す、ここで、１＋は最大２５％、２＋は２５〜５０％、３＋は５０〜７０％、及 び４＋は１００％の粒子が凝集したことを示す。

１ 本発明の凝集反応法は、小容積の遠心分離管中で折離によってペレット化する。

典型的には、凝集性粒子を適当な反応条件下でアナライト試料及び脂質体試薬と 反応・させ、次いで、反応管を、例えば１，０００ｘＧで１分間、遠心分離し、 凝集性粒子及びこれに付随ないし会合する反応成分をペレット化する。使用され る遠心分離条件においては、アナライト結合性試薬体は反応溶媒中に懸濁したま ま残る。

ペレット化した粒子の凝集度は、この試料を反応媒体の上澄液中に粒子が再懸濁 するようにして攪拌して定量的に測定する。再懸濁させると凝集粒子は粒子ペレ ットから特徴的な塊状体として分離するが、非凝集粒子は反応上澄液中により均 一に分散するのを識別することができる。最初の再懸濁に続いて大きい凝集塊が 比較的速やかに沈降するので、ここで混濁度又は再懸濁した粒子によって反応媒 体に付与された曇りの程度又は色の度合によって凝集度を祝電的に測定できる。

この試験法は血液細胞粒子の凝集測定に特に良く使用される。

第三の反応方法においては、反応成分をミクロタイターウェル中で混合する。粒 子が沈降するに伴い、ウェルの底に凝集粒子が非凝集粒子かの区別の目安になる パターンが形成される。この試験手順は、特に、２ 赤血球細胞等の生物学的細胞に使用される。

灸豆ム羞】 顕著に向上させることができる。感度の向上の一つの表われは、−定のアナライ ト濃度で得られる凝集度の増加である。後述の実施例ｍ〜■で判るように、本発 明の方法により、アナライト濃度が比較的低い範囲では市販分析試薬で観察され る凝集度が２〜３倍にも強化される。

感度の向上は、従来の凝集試験では準しきい領域に属する濃度のアナライトでも 十分検出能力を示す点でも表われる。実施例■及び■から判るように、本発明の 方法においては、従来の粒子凝集法に較べて検出限界を２〜４倍増進することが できる。

凝集試験によって、本発明の方法によって粒子凝集時間を短縮することができる 。実施例Ｖで詳細に後述するリウマチ因子（ＲＦ）の分析試験においては、□強 化凝集試験の完了に要する時間は従来技術の試験反応に要する時間のＨ未満だっ た。

前述したように本発明のもう一つの局面の特徴は、多価アナライト測定用の改善 された凝集分析試剤（キット）を供給することにある。本発明の試剤には、アナ ライ１分子で凝集されるために用いる粒子の３３ 他に、アナライト結合性脂質体から成る試薬を含み、この各々が各試薬体と架橋 粒子間の多重アナライ）−分子架橋結合によってこの様な粒子を架橋することが できる。脂質体中に組み込める表面分子数が比較的多く、強化凝集反応を生じさ せるのに要するアナライト結合性分子が比較的少ないため、この試薬の製造に用 いるアナライト結合性分子の原料は、アナライト結合性分子を約０．５モル％し か含まない比較的不純な調合剤で良い。後述の実施例Ｉ及び■で未分別の抗体フ ラグメントを用いる脂質体製造方法について記述する。

この試剤中の粒子成分及び試薬成分は、長期保存に適した形で供給することがで きる。事実、試薬脂質体を保存のために凍結すると、脂質体が破壊され、試薬の 粒子凝集反応強化能力が高められることがある。この特徴については、特に実施 例■で議論する。

この試験の粒子成分及び試薬成分は共感濁液として供給することもでき、分析試 験においてこれを使用するには単に分析すべきアナライトを添加すれば良い。

実施例■及び■でラテックスビーズと試薬脂質粒子の安定な貯蔵混合物について 後述する。

以下に実施例を用いて本発明の実施態様及び用途を説明する。

実」１例 ［実］１例−一↓］ し脂」Ｌ小」１Ｑ」を製］ ０．１０又は２０モル％のホスファチジルグリで製造した。この小胞はＰＧの他 に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール、ＭＰＢ−ＰＥ、並びにア ナライト結合性分子を小胞に結合させるために用いる負電荷を帯びた、スルフヒ ドリル反応性リン脂質を含んでいた。３種類の小胞調合剤における脂質成分のモ ル比を表工に示す６表■の数値は、各々の小胞調合剤の作製に使用した各脂質成 分のｌＬｍｏｌ量を示す。各小胞調合剤の負電荷を帯びたリン脂質成分のモル比 は、ＰＧ及びＭＰＢ−ＰＥ成分の合計、すなわち、全リン脂質の１０．２０．又 は３０モル％である。

脂質成分をジエチルエーテル／　ｍ　ｉ中に溶解した。

各脂質試料に、ＮａＰＯ４［ＮａＨ２ＰＯ４］　１１０ｍＭＮａＣＬｌｏｍＭ、 ＥＤＴＡ２ｍＭを含むｐＨ６の緩衝溶液３５５ＩＬ文を添加し、パスソニケータ ー中で２５℃で１分間超音波処理し２層を乳化させた。減圧下、室温でエマルジ ョン中からエーテルを除去し脂質小胞を作製した。

５ ＰＣＰＧ　ＭＰＢ　−ＰＥ　Ｃｈｏ　１　。

θ％ＰＧ９０１　１０ １　Ｏ％ＰＧ　８　１　１　１０ ２０％ＰＧ７２１　１０ 各脂質小胞調合剤を光学顕微鏡で検査した。脂質構造はほぼ排他的に小胞性状を 示し、大部分の小胞は直径０．１〜１０．０ｐｍの範囲で、■又は２．３の二重 層ラメラを持っていた。

［１竃■−」］ ［ｒ′ヒ　ト　エ　Ｍ　の　］ 推定１〜３％のウサギ抗ヒ）　Ｉ　ｇＭ抗体を含むウサギ抗体の精製調合剤を常 法に従って作製した。

Ｆ　（ａｂ’）２ダイマーを、この抗体調合剤のペプシン消化によって製造した 。ダイマーフラグメントをジチオトレイトールを用いてｐＨ４，８で還元しＦａ ｂ’モノマーフラグメントを製造した。この反応をＰＨ４，８よりかなり高いｐ Ｈ（すなわち、ｐＨ５，０）で行うと過還元が起きて抗体フラグメントが失活す ることがあるし、一方、低ｐＨ（すなわち、ｐＨ４，５）では還元が不十分にな り小胞の結合効率が比較的低くなることがあるため、還元反応のｐＨは重要であ る。Ｆａｂ’千ツマ−試料はンジウムドデシルサルフェートポリアクリルアミド ゲル電気泳動６ （ＳＯ５−ＰＡＧＥ）による分析で単一バンドを示し、全体が完全に還元された 実質的に均一な調合剤で不純物を含まないことが判った。

各脂質小胞の調合剤について、０．４ｇｍのフィルターを通して押出した脂質小 胞１ｇ、ｍｏｌを、表ＩＩに示した０・６〜１．４ｍｇ／ｍ文の蛋白質濃度のい ずれかで、製造したばかりのＦａｂ’フラグメントと反応させた。結合反応は、 ｐＨ６，８にてＮａＰＯ４［ＮａＨ２ＰＯ４］　１０ｍ１．Ｎ、ａ、０文１０ｍ １及びＥＤＴＡ２ｍＭ中の溶液中で室温で終夜実施した。結合反応終了後、１７ ．００Ｏｒｐｍで４０分間遠心−分離処理しペレット化して未結合の蛋白質から りボゾームを遊離した６次いで、ペレット化した試薬試料を４°Ｃで最終濃度が ｌｐＬｍｏｌ／ｍ文になるように低塩緩衝溶液中に懸濁させた。

試薬試料の蛋白質濃度を参考文献１１に記載の方法で掛定した。作製した１５の 試薬試料の各々の蛋白質濃度を表ＩＩに示す（単位はｐ−ｇ−Ｆａｂ’／ｐＬｍ ｏ　ｌ　−小胞脂質で表した）。

各小胞（直径０．４ｐｍの範囲）に結合したＦａｂ’分子の大体の平均数は、表 ＩＩに示す蛋白質濃度に４０を掛けて計算できる。すなわち、ＰＧ含量Ｏ％の脂 質小胞を０．６ｍｇ／＋ｎＪＪのＦａｂ’と反応させて得た試料は、小胞１個に ついて約４’、８００のＦａｂ’を含む。試薬中のＦａｂ’分子の全数の約１％ が抗ヒ）Ｉ結合反応で失活すると仮定すると、この試料は小胞１個当たり約２４ 個の活性な抗ヒ）ＩｇＭ分子を含むことが判る。同様にして、ＰＧ含量１０ｍｏ １％の小胞を１．４ｍｇ／ｍｊＬの蛋白質と反応させて得た試料は（蛋白質濃度 が最も高い試料が得られる）、小胞１個当たり約１１６個の活性抗ヒ）　Ｉ　ｇ Ｍ分子を含む。

０．８　０．８　１．０　１．２　１．４　ｍｇ／ｍｌ［文１」（−皿］ ［ラーークス　シスームに　ける　− 価］ 実施例ＩＩで作製した１５種類の抗ＩｇＭ試薬試料に関する、市販リウマチ因子 （ＲＦ）凝集試験における粒子凝集反応能力を検討した。ＲＦとは、リウマチ性 関節炎患者に多く認められるＩｇＭクラスの免疫グロブリンの広範なグループを 言う、ＩｇＭアナライトは（凝集性粒子に担われた）ＩｇＧに対して特異的に結 合することができ、（脂質小試薬中の）抗ＩｇＭ抗体によって特異的に認識され る。

リウマチ因子（ｕＦ）１集試験試剤（キット）は。

Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（テキサス州Ｂｅａｈｍｏｎｔ）及 びＯｒｇａｎｏｎ　Ｄｊａｇｎｏｓｔｉｃｓ　、（＝ニーシャーシー州　Ｗｅｓ ｔＯｒａｎｇｅ）から入手−た０両社からのラテックス試料をＲＦ十試験血稿と 共にそれぞれ１５分間恒温保持した。

使用した試験血清量は、ラテックス粒子のみと恒温保持した場合に、前述の４等 級のスケールで大体１＋のの抗ＩｇＭ試薬試料をその反応混合物中に加え、この 混合物を３７℃で更に３０分間攪拌した０、次いで、各、ヤの管をｉ、ｏｏｏｘ ｃで１分間遠心分離し、凝集を視覚的に検査した。

この測定により、ＰＧを２０モル％含む試薬試料（負荷電脂質３０モル％）で最 高の凝集強化作用が得られ、ＰＧ含量０％の試料では凝集強化作用がほとんど認 められなかった。蛋白質濃度がリン脂質ｌＪＬｇ当り約２５０ｇｇ　（直径約０ ．４ＪＬｍの脂質小胞当り約５０分子の活性ＩｇＭ分子）をａえる試料は、蛋白 質濃度がより低い試料よりも高い凝集強化作用を示した。試験した中で最良の試 料は、　Ｈｅ１ｅｎａ試験試剤では約１＋〜２＋又は３＋、また、Ｏｒｇａｎｏ ｎ試験試剤では９ 約２十〜３＋の凝集強化作用を生じた。すなわち、この試薬の添加によって、所 定のアナライト濃度における試験時の凝集粒子数が約２〜３倍に増加した。

［支厳班−１］ ヒ）ＩｇＧで被覆されたラテックス粒子から成るＲＦ−ラテックス調合剤（ロッ ト００２）をＣｏｏｐｅｒｌｌｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ　（カリフォル ニア州パロアルト）から入手した。実施例工に準じてＰＧを２０％含む脂質小胞 を作製し、実施例ＩＩの方法に準じて、最終的な蛋白質濃度がリン脂質１ｐｍｏ １当り約２６０ｇｇになるようにウサギ抗ヒトＩｇＭＦａｂ’フラグメントと結 合させた。続いて脂質小胞試薬を凍結・融解して破壊した後装■に示占た所定の 粗さのポリカーボネート微細孔フィルターを通しての分粒、又は凍結融解処理の 一方又は双方を実施した。凍結・融解処理した試薬体を光学顕微鏡で検査した結 果、小胞体と共に、高率のリボン状非小胞脂質構造及び無定形の凝集（ｆ　ｌｏ ｃｃｕｌｇｎｔ）脂質体を含むことが判った。試薬体を表■に示した孔径をｉつ 膜を通すことにより、最大直径がほぼ膜の孔径に等しい脂質体が得られた。

各分析試験においては、表中に示した試薬２ル文をＲＦラテックス試薬２０衿立 及びＲＦ十血清２０　＃Ｌ１とガラススライド状で２分間混合した。凝集度は前 述の４等級スケールで区分した。表■の等級ｉ−は、実質的に１＋の凝集水準よ り低ル１僅かに検出可能な塊の形成を示す。

表−１ 番及ヌ遺　凝集度 添加せず　１− 凍結、押出しせず　４＋ 凍結、１　、ＯＩＬｍの膜で押出　２＋凍結、０．８ｐｍの膜で押出　１＋ 凍結、０．６ｐｍの膜で押出　１＋ 凍結せず、押出せず・　３＋ 凍結せず、１．ＯＩＬｍの膜で押出　１＋〜２＋凍結せず、０．８終ｍの膜で押 出　ｌ＋凍結せず、０．６疼ｍの膜で押出　１＋この表のデータから判るように 、使用した各脂質体が高められた。観察された凝集度は、凍結後所定の孔径の膜 を通して分粒しないものが最も顕著に増加した。異なった脂質体試薬から得られ たデータを比較した結果、凝集強化作用に関して、凍結・融解して破壊された脂 質体は同等の大きさの小胞体より有効であり、また大きな脂質体は構造が等しい より小さな脂質体よりも有効であることが示唆された。

４１ ［実ＪＬｆＬｕｌ ［リウアチ因　るため　ヒｊ　−−］ ＩｇＭ結合性脂質体試脂質ＲＦ粒子凝集分析試験での凝集強化能力を調べた。表 ■に示した実験においては、凝集粒子としてＣｏｏｐｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ、　Ｉｎｃ、から入手したＲＦラテックス粒′子を用いた。使用したＲＦ結 合性試薬は、実施例■に従って作製した。試薬体は凍結・融解して物理的に破壊 し、粒径は調整しなかった。ＲＦ−試料１個とＲＦ＋試料１０個を含む、合計１ １個の梅漬試料を試験した。

各々の試験では、ラテックス粒子２０　ｇＬ、２０倍希釈血清試料２０．１．、 及び脂質体試薬２ルＬをガラススライド上で液滴状で２分間恒温保持した。続い て、この液滴を直ちに凝集検査し、ｌ十〜４＋の等級をつけた。結電を表■に示 す。実施例■と同様に、等級表示ｌ−は、凝集率が実質的に約２５％未満の極〈 僅かの凝集を示す。

４２　特表昭ＧＯ−５０１１２９（１４）直−１ 試料　試薬無添加　試薬添加 このデータから判るように、脂質体の添加は、試料１　ａＲＦ−血清の読取り結 果にも、強い正荷電を帯びたＲＦ十試料１１の凝集度にも影響しなかった。試薬 無添加時に１−〜３＋の等級を示した他の９個の試料については、脂質体試薬の 添加により６個で１又は２の凝集等級の上昇が認められた。

上記のデータは、本発明の強化凝集法の重要な長所の一つが、強力な陽性（３＋ 、４＋）が生じる率が高いことによる試験の読取り性の改善にあることを示唆し ている。この特徴を更に検討するため、正常の供血３ む、７１個の試料血清を上述の強化凝集法で試験した。正常供血者からの３０個 の試料のうち、強化凝集試験で２９個が陰性、１個が陽性（ｌ＋）を示した。

リウマチ性関節炎患者からの４２試料のうち、１１個が陰性で４個が２＋以下、 ２７個が３＋以上だった。

すなわち、陽性の読取り結果が得られた３１個の試料のうち２７個が、強い陽性 で読取り易い３＋又は４＋の等級を示した。３＋又は４＋の凝集反応が観測され る割合という点で、この試験の読取り性は、市販ＲＦラテックス試剤を用いて平 行して行った試験で得られた結果よりも実質的に優れていた。更に、強化凝集試 験においては、最大の凝集を生じるまでに要する時間が、市販ＲＦラテックス分 析試剤で完全な凝集を得るのに要する時間の局未満だった。

［丸亀Ｕ］ ［粒子及び試薬脂質体の共感濁液としての貯蔵１本実施例においては、本発明の 実施に使用すべく設濁液として保存し、単一の試薬として使用し得ることを示す 。粒子成分及び試薬成分としては、それぞれ、Ｃｏｏｐｅｙ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ、Ｉｎｃ、　（カリフォルニア州パロアルト）から入手したＲＦラテック ス粒子（ロット００３）と前述の実施例■及びＶで使用した抗ＩｇＭ脂質体試薬 を使用した。

この粒子と脂質体を梅漬試料のない状態で一緒に貯蔵すると、恐らくは脂質体に 担持されたウサギ抗ヒトＩｔＭとラテックス粒子に相持された変性ヒ）ＩｇＧと の相互反一応性のため、粒子の凝集が幾分認められた。この凝集は、粒子脂質試 薬混合物に少量のＲＦ−血清を添加することによって回避された。実験的に、ラ テックス粒子１００色文、希釈ＲＦｌ＋清（２２／）ｔ３ｍ’Ｊ１）１００ＩＪ 、ｉ、及び脂質体試薬１０ｐＬｉ　（３０ｎｍｏｌ）を混合し、４０℃で終夜貯 蔵した。強化凝集分析試験においては１粒子／試薬混合物を予備希釈したＲＦ＋ 血清５０Ｊｉ、ｕと混合し、１〜４分間恒温保持（ｉｍｕｂａｔｅ）　した。こ の結果を同量のラテックス粒子のみ（粒子／試薬混合物中の粒子濃度まで希釈し たもの）にＲＦ＋血清５０ｐＬｕを加えて得た凝集と比較した。粒子／試薬混合 物を同量のＲＦ−血清と混合して得られる凝集度も測定した。

４５ 直−Ｎ １分間　２分間　３分間　４分間 粒子／試薬混合物　１−　２＋　４＋　４＋＋ＲＦ÷ 粒子＋ＲＦ＋　１−　１−　１−　１−粒子／試薬混合物　−−ｍ− ＋ＲＦ 表Ｖの初めの２列のデータの比較から、凝集性粒子と脂質体試薬から成る試薬混 合物を用いるとＲＦラテックス粒子だけを用いた場合に較べてＲＦ十粒子の凝集 （４分後）が３等級、以上強化されることが判る。

また、３りｄ目のデータから、ＲＦ＋アナライトが存在しないと粒子試薬中でほ とんど又は全く粒子の凝集が生じないことが判る。

［支厳班−１］ 肝炎８表面抗原（Ｈ８表面抗原）は、肝炎患者の梅漬中に見出される多価抗原で ある。Ｈ８表面抗原の結合に使用した３種類の脂質体を、表Ｉに示した３種類の 脂質組成を持つ小胞から作成した。一つのＨＢ表面抗原サブユニットに対する特 異性を持つ３種類のモノクローナル抗ＨＢ表面抗原抗体の混合物を、参考文献９ で報告された方法に従って、１８倍モル過剰量のＭ−スクシンイミ、ジル３−（ ３−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いて室温で２０分間チオ ール化した。この反応により、抗体１分子当たり平均的４．６個のＳＨ基が導入 された。チオール化した抗体をジチオトレイトール゛を用いてＰＨ４，５で還元 後、脂質小胞調合剤と結合させた０反応媒体をＰＨ４，５にすると蛋白質の約・ 局が沈澱として失われた。

（ＰＧを０．ｔｏ、又は２０モル％含む）各小胞調合剤ごとに、１ｍＪＬ当たり ｌ＃Ｌｍｏｌの脂質濃度の小胞を、ＰＨ６，８の、Ｎ　５Ｌ　Ｐ　Ｍ　Ｍ　、　 Ｎ　ａ　ＣｆＬｌｏｍＭ、及びＥＤＴＡＺｍＭ中テ１　ｍ　ｆｔ当たり１ｍｇの チオール化抗体と共に室温で終夜恒温保持した。結合反応完了後、１７．ＯＯＯ ｒｐｍで４０分間の遠心分離によりペレット化して蛋白質から蛋白質被覆脂質体 を遊離させた。小胞に結合した蛋白質量は、ＰＧ含量０％の小胞での小胞リン脂 質１＃Ｌｍｏ１当り約１．６ｍｇの最高値から、ＰＧ含量２０％の小胞での小胞 リン脂質ＩＪＬｍｏ１当り約１．２ｍｇまでの範囲だった。

上記の３種類のモノクローナル抗ＨＢ表面抗原抗体の混合物を用いて、Ｃｏｏｐ ｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　、Ｉｎｃ、　（カリフォルニア州パロアルト） から入手したラテックス７ ビーズを活性化した。試験用アナライトは、精製ＨＢ表面抗厚、ａｄｗ２及びａ ｙｗ３とした。先ず、ラテックス試薬２０ｐＬ−ｅをスライドガラス上で試験試 料と共に４又は５分間恒温保持し、次いで凝集を視覚的に検査した。ＨＢ表面抗 原ラテックス粒子のみで検出し得るＨＢ表面表面抗原の限界は、サブタイプ（亜 型）ａｃ１ｗ２ａ＠約１ｗ１Ｌｇ／ｍｌまた、サブタイプａＶＷ３について２０ 　ｇ　ｇ　／　ｍ　ｌである。

第２系列の試験ではラテックス試薬２０ル文をスライドガラス上で試験試料と共 に１分間恒温保持後、所定濃度の３種類の異なる脂質体試薬のいずれか−を添加 し、スライド上で更に４分間恒温保持後、凝集度を測定した。

（それぞれ、０％、１０％、又は２０％のＰＧ）を含む３種類の脂質体試薬の検 出感度限界は、ＨＢ表面抗原サすタイプａｄｗ２に関して約４倍、ＨＢ表面抗原 サすタイプａｙｗ３に関して約２倍強化された。すなわち、強化凝集試験で検出 し得るＨ８表面抗原の限界は、いずれのＨ８表面抗原のサブタイプについても約 ｌＯル、、ｇ／ｍｌだった。観察された凝集度は、脂質体試薬により、同じＨＢ 表面抗原濃度で試薬が存在しない場合に観察された凝集度よりも２等級以上強化 された。ここで凝集度の強化に用いた脂質体の能力は、試薬を１回以上凍結融解 処理しても増強されなかっ８ た。

［支ＪＪＬｊ！［］ ［ＨＢ−るー　） 区摺］ 実施例■の３種類の脂質体試薬について、市販ＨＢ表面抗原赤血球凝集試剤と比 較した、Ｈ８表面抗原感作赤血球の凝集性強化能力も試験した。

抗ＨＢ表面抗体（モルモット）で感作された赤血球は、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｔｒ ｏｒａｔｏｒｉｅｇ　（イリノイ州ノースジカゴ）から入手した。また、試験し たアナライトは、実施例■で用いた精製ＨＢ表面抗原サすタイプａｄｗ２及Ｕ　 ａ　ｙ　ｗ　３　とした。強化凝集反応は、ミクロタイタープレート上で感作赤 ・血球と脂質体試薬の混合物５０　ｐ、ｚに対して所定濃度のアナライト試料２ ル１を加えて行った。１．５時間後、ミクロタイタープレートを試験読取ミラー の頂部に置き、常法に従って凝集パターンを測定した。

その結果、Ｈ８表面抗原の凝集試験における感作赤血球単体の感度は、サブタイ プａｄｗ２について約２５　ｎ　ｇ　／　ｍ−ｅ、サブタイプａｙｗ３について 約１６０ｎｇ／ｍ２と測定された。抗ＨＢ表面抗原脂質体試薬を添加すると、特 にＰＧ含量０％の試薬では、試験の感度及び読取り性が顕著に向上し、Ｈ８表面 抗原の検出感度の限度がサブタイプａｄｗ２について約・　、４９ ち、強化凝集試験により、ＨＢ表面抗原サすタイプａｄｗ２は約６ｎｇ／′ｍ文 、サブタイプａ、ｙ　ｗ　３は約８０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｆＬの濃度を検出でき た。また、同等のＨＢ表面抗原アナライトについて、脂質体試薬が存在しない場 合に較べて凝集度が約２等級強化された。

ＰＧ含量Ｏ％の脂質小胞から作製した脂質体が、ＰＧ含量１０％又は２０％の小 胞から作製した脂質体試薬よりも高い、最高の凝集強化作用を示した。赤血球、 ナナライトのＨＢ表面抗原、及び脂質体試薬をミクロ験での感度と読取り性の向 上は、脂質体試薬を赤血球とアナライトＨ８表面抗原の予備恒温保持後に加えた 試験とほぼ等しかった。

［支凰亘−ｙ］ 抗核抗体（ＡＮＡ）には、多様な核抗原と免疫反応するＩｇＧ型抗体族が含まれ る。−この抗体は、リウマ抗体のＦｃ部分は、他の種々の免疫グロブリンにも強 く結合するバクテリアの表面蛋白質である蛋白質Ａに強く結合する。

蛋白質Ａが表面に配列した脂質体試薬は、表Ｉに示した脂質組成の小胞（小胞の ＰＧ含量はｉｏ％）から作製シた。スタフイロココ・ンカス・アウレウス（Ｓｔ ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来の蛋白質Ａは、ＳｉｇｍａＣｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（ミズーリ州セントルイス）から入手しＩｇＧ約１２． ５ｍｇだった。蛋白質Ａ５ｍｇを、参考文献８で報告されている方法に従って、 ｐＨ７、５反応させてチオール化した。未反応５ＰＤＰはセファデックスＧ−２ ５カラムクロマトグラフイーで除去した。この反応によって、蛋白質１分子につ いてＳＫＩ基１個の平均チオール化度が得られた。次いで１．チオール化蛋白質 Ａをジチオトレイトール２０ｍｍｏｌを用いて、ｐＨ６，０で室温下で２０分間 還元後、脂質小胞調合剤に結合させた。

脂質〕＼胞０．５ｐｍｏｌをチオール蛋白質Ａ０．４ｍｇとｐＨ６，６で終夜反 応させて脂質体試薬を作製した。結合反応完了後、１７．００Ｏｒｐｍで４０分 間ペレット処理して未結合の蛋白質から脂質体を含む蛋白質Ａを単離した。小胞 に結合した蛋白質Ａの量は小胞リン脂質）、ｇｍｏ１当り約１１００ｐだった。

ウシ胎児胸腺染色質で被覆したラテックス粒子から１ 成るＡＮＡラテ・ンクス粒子は、Ｃａａｐｅｒ　ｒＨａｇｎａｓｔｒｃｓ（カリ フォルニア州バロアルト）（ロッ）００３）から入手した。陽性制御ＡＮＡ血清 は、Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂ、。

Ｉｎｃ　、のハイランド診断薬事業部（イリノイ州ディアフィールド）から入手 し、塩水で１：４に希釈した。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）は　Ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ社（カリ７オルニ ア州ラジゴーラ）から１０ｗ／ｖ％懸濁液として入手した。

この懸濁液には、約２　ｍ　ｇ　／　ｍ文のヒトＩｇＧ結合能力があった。

先ず、ｌ：４希釈血清５０川！をＡＮＡラテックス５０４ノと共にスライドーヒ で２分間恒温保持後、凝集を視覚検査した。凝集度の等級は約１＋だった。上記 血清５０＃ＬｉをＡＮＡラテックス５０ＩＬｕと脂質体試薬６　ｐ、ｎ　（１８ ｐｎｍｏ　１）を含む混合物と共に同様の条件で恒温保持し、強化凝集分析を実 施した。この脂質試薬の添加により、凝集度は１等級上昇して２＋となった。血 清５０舊１をラテックス粒子５０ＩＬｌと脂質体試薬９ｐ文（２７ｎ、ｍ　ｏ　 １．）を含む混合物と混合した試験では、２等級の向上が認められた。

抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆した脂質小胞から成る脂質体試薬のＡＮＡラテックス凝 集強化能力についても検査した。実質的に実施例ＩＩに記載した方法に準じて作 製したこの試薬によっては、ＡＮＡラテックス凝集反応の強化は観察されなかっ た。抗ヒ）ＩｇＧ含有脂質脂質薬のラテックス凝集強化能力の欠如は、分析に使 用したｌ：４希釈血清中に含まれる比較的高濃度の非ＡＮＡ免疫グロブリン分子 により試薬抗体が中和されたためらしい。蛋白質Ａを含む脂質体試薬が何故同様 に血清Ｉ２０分子によって中和されないのかは不明だが、一つの説明として、蛋 白質Ａは免疫特異的抗原と複合体を形成するＩｇＧ分子と未結合ＩｇＧよりも強 く結合することが挙げられる。

表面に蛋白質Ａを被覆したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞の、ＡＮＡ試験におけるラテー７クス粒子凝 集強化能力についても研究した。表面に活性蛋白質Ａの分子が強固に配列したバ クテリア細胞を既知の方法で殺菌した。一つの試験では、ＡＮＡ陽性血清をラテ ックス５０ｐＬｕ及び種々の量のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ ７１ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞と混合したが、これは、最高細胞濃 度において、蛋白質Ａ含有脂質体試薬２７ｎｍｏ見よりも反応混合物中の蛋白質 Ａの濃度を高めるのに寄与した。Ｓ、　ａｕｒｅｕｓを添加しなかった場合には 、う５３ テックスの凝集強化は観察ごれなかった。２段階恒温保持分析法（陽性制御血清 をＡＮＡラテックス粒子と恒温保持して凝集を形成後、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ細胞 を加える方法）でのＳ、　ａｕｒｅｕｓ細胞の凝集強化能力についても研究した が、細胞濃度にかかわらず凝集強化は認められなかった。Ｓ、ａｕｒｅｕｓ細胞 の大きさは試薬脂質体（直径約ＩＩｉ、ｍ）と同程度であり、蛋白質Ａの表面濃 度も十分なので、これらの細胞の凝集強化能力の欠如は、明らかに、バクテリア 細胞壁上の蛋白質Ａ分子が比較的可動性に乏しく、この細胞がラテックス粒子と 多重アナライト架橋結合を形成するのが妨たげられることによる。

蛋白質Ａ含有脂質体試薬の長所は、この試薬が、ヒトＩ　ｇＧのサブクラス１． ２及び４．並びにヒトＩｇＡ及びＩｇＭのいくつかのサブクラスを始めとする他 の免疫グロブリンとも特異的に反応できる点にある。従って、この試薬は、数種 の他の免疫グロブリンアナライト測定用試剤の凝集強化にも使用することができ る。

蛋白質Ａ含有脂質体試薬は、ＡＮＡラテックス粒子と共に貯蔵しても安、定であ る。従って、この試薬とラテックス粒子は、単一の試薬懸濁液として供給し、使 用することができる。

本発明を特定の実施例に基づいて説明したが、これ５４　（存表日ｆｆＧＯ−５ ０１１２９（１ン）らの実施例は本発明を制限するものではなく、本発明の精神 から逸脱することなしに種々の変更や修正を加えることができる。

１際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　表面に結合した抗アナライト分子を有する凝集性粒子を提供することと、 この凝集性粒子を反応媒体中でアナライトと混合して粒子凝集反応を生じさせる ことと、該反応媒体に、各々の表面に横方向に移動できるアナライト結合性分子 が脂質体１個当り少なくとも約１５分子の平均濃度で配列する脂質体から成る試 薬を加えることによって、前記混合により得られる凝集の程度を高めることから 成り、アナライト結合性分子自体は前記反応媒体中で粒子状抗アナライト分子に 直接結合することができないことを特徴とする多価アナライト測定用の強化分析 法。 ２、　各脂質体のアナライト結合性分子の濃度が、架橋された各粒子をその脂質 体に対して結合する複数のアナライト分子架橋を介して、２個の粒子のこの様な 脂質体による架橋を促すのに十分であることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載の方法。 ３、　脂質体が、共に脂質二重層構造から成る、小胞体とリボン状体の混合物を 含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、リボン状体を小胞体の凍結・融解によって作製することを特徴とする請求の 範囲第３項に記載の方法。 ５、　脂質体を反応媒体に、最終濃度が約１０６ ｐｍｏ文／見〜１　ｍ　ｍ　ｏ文／文になるように加えることを特徴とする請求 の範囲第１項記載の方法。 ６、　脂質体が、直径０．４〜１０ルｍの範囲の脂質二重層小胞から成ることを 特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ７゜　試薬のアナライト結合性分子が、脂質体表面に共有結合した抗体又は抗体 フラグメントの全数の約０．５〜２０％を構成する抗体又は抗体フラグメントを 含み、脂質体表面に結合した分子が、前記反応媒体中で粒子状抗アナライト分子 に実質的に直接結合でき法。 ８、　試薬のアナライト結合性分子が、脂質体の表面脂質成分にチオエーテル又 はジスルフィド結合を介して共有結合したＦａｂ’抗体フラグメント分子を含む −ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ９、　試薬のアナライト結合性分子が、脂質体の表面脂質成分“、に脂質体脂質 １ｐｍＯ文当り約２〜２０ｐ−ｇの蛋白質濃度で共有結合する抗アナライト抗体 又は抗アナライト抗体フラグメント分子から成ることを特徴とする請求の範囲第 １項に記載の方法。 １０、凝集性粒子が重合体ビーズを含み、脂質体が負荷電脂質成分を約２０モル ％以上含むことを特徴と５７ する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ・　１１．凝集性粒子が赤血球細胞を含み、脂質体１が負荷電脂質成分を約２０ モル％未満含むことを特徴とする請求 １２、アナライト分子が粒子状抗アナライト分子に・　免疫特異的に結合するた めに適“した抗体分子を含み、試薬のアナライト結合性分子がアナライト抗体分 子に特異的に結合するために適した結合性蛋白質を含むことを特徴とする、請求 の範囲第１項に記載の方法。 Ｊ　、３−　、、アナライト分子がＩｇＭ分子を含み、アナライト結合性分子が 脂質体の表面脂質成分に共有結合しない状態ではこの様な試薬体によるこの様な 粒子の凝集を防止できるような血清試料中に含まれていることを特徴とする，請 求の範囲第１３項に記載の方法。 １５、ＩｇＭ分子がリウマチ因子を含むことを特徴とする、請求の範囲第１３項 に記載の方法。 １６、アナライト分子が多価抗原分子を含み、粒子・　状抗し＋ウィ，分イツ， ツえ。アヶ，イ，カ。□カイが共に抗抗原抗体又は抗抗原抗体フラグメント分子 を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法工 ラグメント分子が抗ＨＢ表面抗原抗体を含むことを特徴とする、請求の範囲第１ ６項に記載の方法。 １８、凝・集性粒子が血液細胞を含み、脂質体の負荷電脂質成分含量が約２０モ ル％以下で多るこ１とを特徴とする、請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９、前記凝集性粒子がラテックス粒子を含み、脂質体の負荷電脂質成分含量が 約２０モル％以上であることを特徴とする，請求の範囲第１７項に記載の方法。 　・ ２０、アナライトが蛋白質Ａによって特異的に認識される免疫グロブリンを含み 、アナライト結合性分子か蛋白質Ａ分子を含むことを゛特徴とする、請求の範囲 第１項に記載の方法。 ２１、アナライトが、蛋白質Ａによっても特異的に認識される非抗原特異性免疫 グロブリンを含む試料中に含有される抗核抗体を含むこ・とを特徴とする、請求 の範囲第２０項に記載の方法。 ２２、抗アナライト分子で被覆された凝集性粒子の懸濁液に所定量の多価アナラ イト分子を加えた爵に生じる凝集反応の程度を高める方法であって、前記方法は 、該懸濁液中に、各架橋粒子を試薬体に結合する複数のアナライト分子架橋によ って前記凝集性粒子を架９ 橋することができるアナライト結合性体から成る試薬を加えることを含むことを 特徴とする方法。 ２３、試薬が、各々の表面に横方向に移動できるアナライト結合性分子が脂質体 １個につき少なくとも約１５分子の平均濃度で配列する脂質体から成り、アナラ イト結合性分子自体はこの様な反応媒体中で粒子状抗アナライト分子に直接結合 できないことを特徴とする、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４、脂質体が、脂質二重層構造から成る、小胞体とリボン状体の混合物を含む ことを特徴とする、請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５、リボン状体を小胞体の凍結・融解によって作製することを特徴とする、請 求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６、脂質体を反応媒体ト、最終濃度が約１０ｐＬｍＯ文／文〜１　ｍ　ｍ　ｏ 　ｌ　／　ｌになるように加えることを特徴とする、請求の範囲第２３項に記載 の方法。 ２７、脂質体が、直径０．４〜１０ルｍの範囲の脂質二重層小胞から成ることを 特徴とする、請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２８、蛋白質Ａによっても特異的に認識され、蛋白質Ａによっても特異的に認識 される非抗原特異性免疫グロブリンを含む試料中に含有される、抗原特異性免０ 疫グロブリン測定用の強化凝集分析方法であって、前記分析方法は、表面に結合 した抗原分子を有する凝集性粒子を提供することと、この粒子をアナライトを含 む試料を混合することと、この粒子に、各々の表面に横方向に移動できる蛋白質 Ａ分子が脂質体１個当り少なくとも１５分子の平均濃度で配列する脂質体から成 る試薬を水性媒体中で加えることにより前記混合によって得られる凝集の程度を 高めることから成り、ここで、蛋白質Ａ分子自体はこの様な水性媒体中で粒子状 抗原分子に直接結合することができないことを特徴とする強化凝集分析方法。 ２９、アナライトが、非抗核抗体をも含む血清試料中に含まれる抗核抗体を含む ことを特徴とする、請求の範囲第２８項↓こ記載の方法。 ３０６前記粒子をアナライトと混合する前に、前記粒子に試薬を添加することを 特徴とする、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１、多価アナライト測定用の凝集分析試剤であって、この試剤は、この様なア ナライト分子と反応して及びアナライト分子によって架橋されて粒子凝集体を生 じるような、表面に結合した抗アナライト分子を有する凝集性粒子と、各々の表 面に、横方向に移動できるアナライト結合性分子が、各架橋粒子を架橋性試薬体 に結合する複数のアナライト分子架橋によってこの６１ 様な粒子を架橋するのに適した濃度で配列する脂質体から成る試薬とから成り、 この試薬体は、前記凝集性粒子、アナライト分子、及び脂質試薬体を水性媒体中 で反応させた場合に、この試薬体を加えずに粒子とアナライトを反応させて得ら れるよりも実質的に高い凝集の程度が得られるような量供給されることを特徴と する凝集分析試剤。 ３２、脂質体が脂質二重層体を含み、各脂質二重層体が、その外表面に共有結合 した少なくとも平均１５個のアナライト結合性分子を有することを特徴とする請 求の範囲第３１項記載の試剤。 ３３、供給される脂質□体の濃度が、反応媒体中に約２０ｐｍｏ文／文〜１　ｍ 　ｍ　ｏ　ｎ　／文であることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ３４、脂質体が、脂質二重層小胞から成る、小胞体とリボン状体の混合物を含む ことを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ３５、リボン状体を、小胞体を凍結・融解することによって作製することを特徴 とする請求の範囲第３４項に記載の試剤。 ３６、脂質体が、直径０．４〜１’Ｏｐｍの範囲の脂質二重層小胞から成ること を特徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ３７、前記試薬のアナライト結合性分子が、脂質体表面に共有結合した抗体又は 抗体フラグメント分子の全数の約０．５〜２０％を構成する抗体又は抗体フラグ メントを含み、ここで、脂質体の表面に結合した分子は、この様な媒体中で、粒 子状抗アナライト分子に直接結合することは実質的にできないことを特徴とする 請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ３８、試薬のアナライト結合性分子が脂質体の表面脂質にチオエーテル又はジス ルフィド結合を介して共有結合するＦａｂ’抗体フラグメント分子を含むことを 特徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ３９、脂薬のアナライト結合性分子が、脂質体の表面脂質成分に脂質体脂質１７ ｔｍｏ文当たり約２〜２′Ｏｐｇの蛋白質濃度で共有結合した抗アナライト抗体 又は抗アナライト抗体フラグメント分子から成ることを特徴とする請求の範囲第 ３１項記載の試剤。 約２０モル％以上の負荷電脂質成分を含むことを特徴とする請求の範囲第３１項 に記載の試剤。 ４１、前記粒子が赤血球細胞を含み、脂質体が約２０モル％以下の負荷電脂質成 分を含むことを特徴とする請求の範囲第３１項記載の試剤。 ４２、粒子状抗アナライト分子及び試薬のアナライト結合性分子が、アナライト 抗体の分子を特異的に結３ 合するのに適した結合性蛋白質を含むことを特徴とする、抗体アナライト検出用 の、請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ４３、粒子状抗アナライト分子がＩｇＧ分子を含み、試薬のアナライト結合性分 子が、脂質体の表面脂質成分に共有結合した抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＭ抗体フラ グメント分子を含むことを特徴とする、リウマチ因子等のＩｇＭアナライト測定 用の、請求の範囲第４２項に記載の試剤。 ４４、粒子状抗アナライト分子及び試薬アナライト結合性分子が共に抗抗原抗体 又は抗抗原抗体フラグメント分子を含むことを特徴とする、多価抗原測定用の、 請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ４５、抗体又は抗体フラグメント分子が抗ＨＢ表面抗原抗体を含むことを、特徴 とする、ＨＢ表面抗原測定用の、請求の範囲第４４項に記載の試剤。 ４６、前記凝集性粒子が赤血球細胞を含み、脂質体が約２０モル％以下の負荷電 脂質成分を含むことを特徴とする請求の範囲第４５項に記載の試剤。 ４７、前記凝集性粒子がラテックス粒子を含み、脂質体が約２０〜５０モル％の 負荷電脂質成分を含むことを特徴とする請求の範囲第４５項に記載の試剤。 ４８、前記凝集性粒子及び試薬体を、アナライトが４ 存在しない状態での脂質体による粒子の凝集を防ぐ様な蛋白質のＤａ下に共感濁 液として貯蔵することを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ４９、蛋白質Ａによって特異的に認識され、蛋白質　Ａによって特異的に認識さ れる非抗原特異性免疫グロン測定用であって、前記凝集性粒子が表面に結合した 抗原・分子を有し、試薬のアナライト結合性分子が蛋白質Ａ分子を含むことを特 徴とする請求の範囲第３１項に記載の試剤。 ５０、抗原が抗核抗体を含むことを特徴とする請求の範囲第４９項に記載の試剤 。 ５１、凝集性粒子がラテックス粒子を含み、前記凝特徴とする、請求の範囲第４ ９項に記載の試剤。 １