NO319665B1

NO319665B1 - Maleapparat og system for maling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod

Info

Publication number: NO319665B1
Application number: NO19923399A
Authority: NO
Inventors: Frank Jurik; Geoffrey Mcgarraugh; Ray Underwood; Roger Phillips
Original assignee: Lifescan Inc
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1992-08-31
Publication date: 2005-09-05
Also published as: NO932316L; US20030073152A1; FI93149B; ATE172538T1; NO873372D0; DK419187D0; DE3752241T2; ATE199982T1; ES2046985T3; ES2246558T3; EP0256806A3; NO923399D0; US6887426B2; EP0960946B1; CN1036867C; ATE172499T1; DE3787851D1; NO923399L; GR3035974T3; DE3752328T2

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører måleapparat og system for måling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kvantifisering av kjemiske og biokjemiske komponenter i fargede, vandige fluider, spesielt fargede biologiske fluider slik som fullblod og urin og biologiske fluidderivater slik som blodserum og blodplasma er av stadig økende viktighet. Viktige anvendelser eksisterer i medisinsk diagnostikk og behandling og i kvantifisering av eksponering for terapeutiske medikamenter, toksiske stoffer, skadelige kjemikalier og lignende. I noen tilfeller er mengden av materialer som blir bestemt, enten så små - i omradet på 1 mikro gram eller mindre pr. desiliter - eller så vanskelig å bestemme nøyaktig at apparatet som anvendes blir komplisert og anvendbart bare for utdannet laboratoriepersonale. I dette tilfelle er resultatene hovedsakelig ikke tilgjengelige før noen timer eller dager etter prøvetaking. I andre tilfeller er det ofte en understrekning av evnen til lagoperatører og utføre testen rutinemessig, raskt og reproduserbart utenfor et laboratoireoppsett med hurtig eller øyeblikkelig avlevering av informasjon.

En vanlig medisinsk prøve er måling av blodglukosenivåer ved diabetikere. Vanlig undervisning råder diabetiske pasienter å måle blodglukosenivået fira to til syv ganger om dagen avhengig av naturen og alvorlighetsgrad av deres individuelle tilfelle. Basert på det observerte mønster i det målte glukosenivået gjør pasienten og legen sammen justeringer i diett, mosjon og insulininntak for bedre å beherske sykdommen. Denne informasjon burde klart være tilgjengelig for pasienten omgående.

EP-Al 0 110 173 beskriver en innretning og fremgangsmåte for kolorimetrisk bestemmelse av kjemiske og biokjemiske komponenter i fargede vandige fluider, spesielt fargede biologiske fluider. Testinnretningen er dannet av et tynt sjikt av hydrofilt substrat inneholdende fargedannende reagens som kobles til reflekterende baklag. Fargedannelse i den fargedannende sonen blir bestemt på grunnlag av en fargeforandring istedenfor en absolutt fargeverdi, og ut fra denne fargeforandringen blir glukosenivået beregnet.

Oftest anvendes en metode som blir vidt brukt i USA, en prøveartikkel av typen beskrevet i U.S. Patent 3.298.789, utstedt 17. januar 1967 til Mast. I denne fremgangsmåte blir en prøve av friskt fullblod (typisk 20 - 40 fil) plassert på en etylcellulosebelagt reagenspute som inneholder et enzymsystem som har glukoseoksidase og peroksydase-aktivitet. Enzymsystemet reagerer med glukose og frigjør hydrogenperoksyd. Puten inneholder også en indikator som reagerer med hydrogenperoksyd i nærvær av peroksydase til å gi en farge som er proporsjonal i intensitet med prøvens glukosenivå.

En annen populær blodglukoseprøvemetode anvender lignende kjemi, men i stedet for den etylcellulosebelagte pute anvender den en vannresistent film hvorigjennom enzymene og indikatoren blir dispergert. Denne type system er beskrevet i U.S. patent 3.630.957, utstedt 28. desember 1971 til Rey et al.

I begge tilfeller tillates prøven å forbli i kontakt med reagensputen i en spesifisert tid (typisk ett minutt). Så, i det første tilfellet blir blodprøven vasket av med en vannstrøm, mens i det andre tilfellet blir den tørket av filmen. Reagensputen eller filmen blir så tørket med oppsugningspapir og evaluert. Evalueringen gjøres enten ved å sammenligne den dannede farge med et fargekart, eller ved å plassere puten eller filmen i et diffusreflektans-instrument for å avlese en fargeintensi tets verdi.

Selv om de ovenfor nevnte fremgangsmåter er blitt anvendt i glukosemåling i mange år, har de visse begrensninger. Prøvestørrelsen som kreves er nokså stor for en fingerstikkprøve, og er vanskelig å oppnå for noen mennesker viss kapillærblod ikke siver ut lett.

I tillegg har disse fremgangsmåter en felles begrensning med andre enkle lagoperator kolometriske bestemmelser ved at deres resultat er basert på en absolutt fargeavlesning som videre er forbundet med den absolutte reaksjonsgrad mellom prøven og testreagensene. Det faktum at prøven må vaskes eller tørkes av reagensputen etter det tidsangitte reaksjonsintervall, krever at brukeren må være klar ved slutten av tidsintervallet og tørke eller påføre en vaskestrøm ved det påkrevde tidspunkt. Det faktum at reaksjonen stoppes ved å fjerne prøven, fører til noen grad av usikkerhet i resultatet, spesielt i hendene til en hjemmebruker. Overvasking kan gi lave resultater og undervasking kan gi høye resultater.

Et annet problem som ofte eksisterer i enkle lagoperatorkolometriske bestemmelser er nødvendigheten av å starte en tidsmålingssekvens når blodet påføres på reagensputen. En bruker vil typisk ha utført et stikk i fingeren for å oppnå en blodprøve og vil så være nødt til å samtidig påføre blodet fra fingeren til en reagenspute mens han eller hun starter en tidsmålingsklokke med sin annen hånd, og derved kreves anvendelse av begge hender samtidig. Dette er spesielt vanskelig, siden det ofte er nødvendig å sikre seg om at tids-avlesningskretsen startes bare når blodet påføres på reagensputen. Alle de tidligere metoder på området krever tilleggsmanipulasjoner eller tilleggskrets for å oppnå dette resultat. Følgelig er forenkling av dette aspekt av reflektansavlesningsinstrumenter ønskelig.

Tilstedeværelse av røde blodceller eller andre fargede komponenter interfererer ofte med målingene av disse absolutte verdier, og kaller derved på en utelukkelse av røde blodceller i disse to tidligere metoder siden de blir mest vidt praktisert. I utstyret i US patent 3.298.789 forhindrer en etylcellulosemembran røde blodceller fra å gå inn i reagensputen. På samme måte forhindrer den vannresistente film i US patent 3.630.957 røde blodceller fra å gå inn. I begge tilfeller virker skyllingen eller tørkingen også til å fjerne disse potensielt interfererende røde blodceller før måling.

Følgelig gjenstår et behov for et system for påvisning av analyter i fargede væsker, slik som blod, som ikke krever fjerning av overskuddsvæske fra en reflektantstrimmel hvorfra en reflektantavlesning blir oppnådd.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig måleapparat for måling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod, som er tilpasset for på fjernbar måte å motta en porøs, hydrofil matriks som inneholder et signalproduserende system som har evne til å reagere med nevnte analytt for å produsere et lysabsorberende fargeprodukt, idet nevnte matriks har en første overflate, for mottagelse av en ikke-målt prøve av nevnte fullblod, og en andre overflate, motsatt nevnte første overflate, hvortil minst en del av nevnte prøve kan vandre igjennom nevnte matriks, kjennetegnet ved at nevnte måleapparat omfatter: anordninger for belysning av nevnte andre overflate av nevnte matriks med lys av en første bølgelengde, som kan bli absorbert av nevnte lysabsorberende fargeprodukt, og lys av en andre, forskjellig bølgelengde, som kan bli absorbert av fullblod;

anordninger for detektering og kvantifisering av lys reflektert fra nevnte andre overflate til nevnte matriks ved nevnte første og andre bølgelengder;

anordninger for beregning av konsentrasjonen til nevnte analytt i nevnte prøve basert på en avlesning av reflektert lys av nevnte første bølgelengde, korrigert for absorbansen til fullblod basert på en avlesning av reflektert lys av nevnte andre bølgelengde; og

anordninger for rapportering av den beregnede konsentrasjon av nevnte analytt.

Det er videre beskrevet system for måling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod, kjennetegnet ved at det omfatter:

måleapparatet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10; og

en porøs hydrofil matriks som inneholder et signalproduserende system som har evne til å reagere med nevnte analytt for å produsere et lysabsorberende fargeprodukt, idet nevnte matriks har en første overflate, for mottagelse av en ikke-målt prøve av nevnte fullblod, og en andre overflate, motsatt nevnte første overflate, hvortil minst en del av nevnte prøve kan vandre gjennom nevnte matriks.

Kort beskrivelse av tegningene

Den foreliggende oppfinnelse kan lettere forstås med referanse til den følgende detaljerte beskrivelse, når den leses i sammenheng med de vedlagte tegninger, hvor: Fig. 1 er et perspektivbilde av en utførelsesform av en testanordning som inneholder reaksjonsputen hvortil fluidum som skal analyseres, påføres. Fig. 2 er et blokkdiagramskjema av et apparat som kan anvendes i utførelsen av oppfinnelsen. Fig. 3 er et blokkdiagramskjema av et alternativt apparat som kan anvendes i utførelsen av oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Reagenselementet

Den tilgrunnliggende oppfinnelse gir en forbedret, hurtig og enkel fremgangsmåte som anvender pålitelige og lett opererbart apparat for bestemmelse av analyter slik som glukose, som spesielt involverer et enzymsubstrat som resulterer i produksjon av hydrogenperoksyd som enzymprodukt. Fremgangsmåten ligger i påføring til en porøs matriks av et lite volum fullblod, tilstrekkelig til å mette matriksen. Bundet til matriksen er en eller flere reagenser i et signalproduserende system, som resulterer i produksjon av et produkt som resulterer i en startforandring i graden av reflektans for matriksen. Matriksen er typisk tilstede i et reflektansmåleapparat når blod påføres. Væskeprøven trenger igjennom matriksen, hvilket resulterer i en startforandring i reflektans ved målingsoverflaten. En avlesning blir så tatt ved ett eller flere tidspunkter etter startforandring i reflektans for å relatere den videre forandring i reflektans ved målingsoverflaten eller i matriksen som et resultat av dannelse av reaksjonsprodukt med mengden av analytt i prøven.

For målinger i blod, spesielt glukosemålinger, blir fullblod typisk anvendt som målingsmedium. Matriksen inneholder et oksidasesystem, som produserer hydrogenperoksyd. Også inneholdt i matriksen vil det være et annet enzym, spesielt en peroksidase, og et fargesystem som produserer et lysabsorberende produkt i forbindelse med peroksidasen. Det lysabsorberende produkt forandrer reflektanssignalet. Med fullblod blir avlesninger tatt ved to forskjellige bølgelengder med avlesning ved en bølgelengde anvendt til å substrahere ut bagrunnsinterferens forårsaket av hematokrit, blodoksygenering og andre variabler som kan påvirke resultatet.

Et reagenselement anvendes, som omfatter matriksen og ingrediensene av det signalproduserende system inneholdt i matriksen. Reagenselementet kan inkludere andre komponenter til spesielle anvendelser. Fremgangsmåten krever påføring av et lite blod-volum, som typisk ikke har vært underkastet tidligere behandling, (annen enn eventuell behandling med et antikoagulerende middel), til matriksen. Tidsangivelse av målingen oppnås ved et apparat som automatisk påviser en forandring i reflektans i matriksen når fluid trenger gjennom matriksen. Forandringen i reflektans over en forutbestemt tids-periode som et resultat av dannelse av reaksjonsprodukt, blir så relatert til mengden av analytt i en prøve.

Den første komponent av den foreliggende oppfinnelse som skal betraktes, er et reagenselement, passende i form av en pute, som omfatter en inert, porøs matriks, og en komponent eller komponenter i et signalproduserende system, hvor dette systemet er i stand til å reagere med en analytt for å produsere et lysabsorberende reaksjonsprodukt, impregnert inn i porene av den porøse matriks. Det signalproduserende system påvirker ikke væskestrømmen gjennom matriksen på noen signifikant måte.

For å assistere i avlesning av reflektans er det foretrukket at matriksen har minst en side som er i det vesentlige glatt og flat. Typisk vil matriksen bli formet til en tynn plate med minst en glatt, flat side. I anvendelse blir væskeprøven som blir analysert, påført på en side av platen, hvorved en hvilken som helst målingsforbindelse til stede passerer gjennom reagenselementet ved hjelp av kapillær-, veke-, gravitasjonsstrøm- og/eller diffusjonsvirkninger. Komponentene i det signalproduserende system tilstede i matriksen vil reagere til å gi et lysabsorberende reaksjonsprodukt. Innfallende lys støter mot reagenselementet ved en lokalisering som er forskjellig fra lokaliseringen hvortil prøven påføres. Lys reflekteres fra overflaten av elementet som diffust, reflektert lys. Dette diffuse lys oppsamles og måles, f.eks. av en detektor i et reflektansspektrofotometer. Mengden av reflektert lys vil være relatert til mengden av analytt i prøven, som vanligvis er en invers funksjon av mengden av analytt i prøven.

Matriks

Hver av komponentene som er nødvendige for produksjon av reagenselement, vil bli beskrevet senere. Den første komponent er selve matriksen.

Matriksen vil være en hydrofil, porøs matriks, hvortil reagenser kan være kovalent eller ikke-kovalent bundet. Matriksen vil tillate strøm av et vandig medium gjennom matriksen. Den vil også tillate binding av proteinsammensetninger til matriksen uten på en ugunstig, signifikant måte å påvirke den biologiske aktivitet av proteinet, f.eks. en enzymatisk aktivitet av et enzym. I den utstrekning som proteiner vil bli kovalent bundet, vil matriksen ha aktive steder for kovalent binding eller kan aktiveres ved måter kjent på fagområdet. Sammensetningen av matriksen vil være reflekterende og vil være av tilstrekkelig tykkelse til å tillate dannelse av en lysabsorberende farge i porevolumet eller på overflaten for på en vesentlig måte å påvirke reflektansen fra matriksen. Matriksen kan være av en uniform sammensetning eller et belegg på et stoff som gir den nødvendige struktur og de nødvendige fysiske egenskaper.

Matriksen vil vanligvis ikke deformeres den blir våt, og bevarer således sin opprinnelige form og størrelse. Matriksen vil ha en definert absorbeirngsevne, slik at volumet som absorberes, kan beregnes innen rimelige grenser, idet variasjoner vanligvis opprettholdes under omtrent 50 %, fortrinnsvis ikke større enn 10 %. Matriksen vil ha tilstrekkelig våt styrke til å tillate rutinefremstilling. Matriksen vil tillate at ikke-kovalent

bundet reagenser blir relativt uniformt fordelt på overflaten av matriksen.

Som eksempel på matriksoverflater er polyamider, spesielt med prøver som involverer fullblod. Polyamidene som er best egnet, er kondensasjonspolymerer av monomerer på fra 4 til 8 karbonatomer, hvor monomerene er laktamer eller kombinasjoner av diaminer og dikarboksylsyrer. Andre polymeriske sammensetninger som har sammen-lignbare egenskaper, kan også finne anvendelse. Polyamidsammensetningene kan modifiseres til å innføre andre funksjonelle grupper som gir ladede strukturer, slik at overflatene av matriksen kan være nøytrale, positive eller negative, så vel som nøytrale, basiske eller sure. Foretrukne overflater er positivt ladet.

Når anvendt i fullblod har den porøse matriks fortrinnsvis porer med en gjennom-snittsdiameter i området på fra omtrent 0,1 til 2,0 fim, mer fortrukket på fra omtrent 0,6 til 1,0 fim.

En foretrukket måte å fremstille det porøse materialet på, er å støpe den hydrofile polymer på en kjerne av ikke-vevde fibere. Kjemefibrene kan være et hvilket som helst fibrøst materiale som produserer den beskrevne integritet og styrke, slik som polyestere og polyamider. Reagenset som vil danne det lysabsorberende reaksjonsprodukt, som er diskutert senere i detalj, er tilstede i porene i matriksen, men ikke blokkerer matriksen, slik at væskedelen i prøvemediet, f.eks. blod som blir analysert, kan flyte gjennom porene i matriksen, mens partikler, slik som erytrocytter, blir holdt på overflaten.

Matriksen er i det vesentlige reflekterende, slik at den gir en diffus reflektans uten anvendelse av et reflekterende underlag. Fortrinnsvis minst 25 %, mer foretrukket minst 50 %, av det innfallende lys tilført i matriksen, blir reflektert og sendt ut som diffus reflektans. En matriks på mindre enn omtrent 0,5 mm tykkelse, blir vanligvis anvendt, med fra omtrent 0,01 til 0,3 mm som foretrukket. En tykkelse på fra omtrent 0,1 til 0,2 mm er mest foretrukket, spesielt for en nylon matriks.

Typisk vil matriksen være festet til en holder for å gi den fysisk for og fasthet, selv om dette ikke behøver å være nødvendig. Figur 1 viser en utførelsesform av oppfinnelsen hvor en tynn hydrofil matrikspute II er plassert i en ende av en plastholder 12 ved hjelp av et klebemiddel 13 som direkte og fast fester reagensputen til håndtaket. Et hull 14 er tilstede i plastholder 12 i området hvortil reagenspute 11 er festet, slik at prøven kan påføres på en side av reagensputen og lys reflekteres fra den andre side.

En væskeprøve som skal testes, påføres på pute 11. Generelt, med blod som eksempel på en prøve som blir testet, vil reagensputen være av størrelsesorden på omtrent 10 mm<2> til 100 mm<2> i overflateområdet, spesielt 10 mm<2> til 50 mm<2> i området, som normalt er et volum som 5-10 mikro liter prøve vil mer enn mette.

Diffuse reflektansmålinger innen den tidligere fagkunnskap er typisk blitt tatt ved å anvende en reflekterende bakgrunn, festet til eller plassert bak matriksen. Ingen slik bakgrunn trengs eller vil normalt være tilstede under utførelsen av den foreliggende

oppfinnelse, enten som en del av reagenselementet eller reflektansapparatet.

Som det kan sees fra fig. 1 holder bæreren reagenspute U, slik at en prøve kan påføres på en side av reagensputen, mens lysreflektans måles fra siden av reagensputen som er motsatt til lokaliseringen hvor prøven påføres.

Fig. 2 viser et system hvor reagensen påføres på siden med hullet i bakgrunns-håndtaket, mens lys reflekteres og måles på den andre side av reagensputen. Andre strukturer enn de beskrevne kan anvendes. Puten kan anta forskjellige former, avhengig av begrensningene som er gitt her. Puten vil være tilgjengelig på minst en overflate og vanligvis to overflater.

Det hydrofile lag (reagenselement) kan være festet til bæreren ved hjelp av en hvilken som helst egnet måte, f.eks. en holder, klemme eller klebemidler; imidlertid i den foretrukne fremgangsmåte er den bundet til bakgrunnen. Bindingen kan gjøres med et hvilket som helst ikke-reaktivt klebemiddel, ved en termisk metode hvor bakgrunns-overflaten smeltes nok til å fange noe av materialet som anvendes i det hydrofile lag, eller ved mikrobølge eller ultrasoniske bindingsmetoder som på samme måte smelter de hydrofile prøveputer til bakgrunnen. Det er viktig at bindingen er slik at den ikke selv interfererer vesentlig med de diffuse reflektansmålinger eller reaksjonen som skal måles, selv om det er usannsynlig at dette forekommer, da ikke noe klebemiddel trenger å være tilstede på stedet hvor avlesningen tas. For eksempel kan et klebemiddel 13 påføres til bakgrunnsstrimmel 12, etterfulgt først av utstikking av hull 14 i den kombinerte strimmel og klebemiddel og så påføring av reagenspute 11 til klebemiddelet i området rundt hull 14, slik at den perifere del av reagensputen fester seg til bakgrunnsstrimmelen.

De kjemiske reagenser

Ethvert signalproduserende system kan anvendes, som er i stand til å reagere med analytten i prøven for å produsere (enten direkte eller indirekte) en forbindelse som karakteristisk er absorberende ved en bølgelengde forskjellig fra bølgelengden hvorved målingsmediet i det vesentlige absorberer.

Polyamidmatriksr er spesielt anvendbare for utførelse av reaksjoner hvor et substrat (en analytt) reagerer med en et oksygen-anvendende oksidaseenzym på en slik måte at det produseres et produkt som videre reagerer med et fargeintermediat for enten direkte eller indirekte å danne en farge som absorberer i et forutbestemt bølgelengdeområde. For eksempel kan et oksidase-enzym oksydere et substrat og produsere hydrogenperoksyd som reaksjonsprodukt. Hydrogenperoksyd kan så reagere med et fargeintermediat eller -forløper i en katalysert eller ukatalysert reaksjon, for å produsere en oksydert form av intermediatet eller forløperen. Dette oksyderte materiale kan produsere det fargede produkt elle reagere med en annen forløper for å danne sluttfargen.

Ikke begrensende eksempler på analyser og typiske reagenser inkluderer de følgende materialer vist i den følgende liste.

Analysemetode

Analysemetoden i denne oppfinnelse avhenger av en forandring i absorbans, som målt ved diffus reflektans, som er avhengig av mengden av analytt tilstede i en prøve som blir testet. Denne forandring kan bestemmes ved måling av forandringen i absorbans i testprøven mellom to eller flere tidspunkter.

Det første trinn av målingen som skal betraktes, vil være påføring av prøven til matriksen. I praksis bør en analyse utføres som følger: Første oppnås en prøve av vandig fluid som inneholder en analytt. Blod kan oppnås ved f.eks. et stikk i finger. Et overskudd over matriksmetning i området hvor reflektans vil bli målt (dvs. 5-10 mikroliter) av denne fluid, påføres til reagenselementet eller elementene av måleutstyret. Samtidig starting av en tidsangiver kreves ikke (som vanligvis krevdes i den tidligere fagkunnskap) som vil bli klart nedenfor. Overskuddsfluid kan fjernes, slik som ved lett avtørking av oppsugingspapir, men slik fjerning er heller ikke påkrevet. Målingsutstyret blir typisk montert i et instrument for avlesning av lysabsorbans; f.eks. fargeintensitet, ved reflektans før påføring av prøven.

Absorbans måles ved visse tidspunkter etter påføring av prøve. Absorbans refererer i denne søknad ikke bare til lys innen det visuelle bølgelengdeområdet, men også utenfor det visuelle bølgelengdeområdet, slik som infrarød og ultraviolett stråling.

Fra disse målinger av absorbans kan en grad av fargeutvikling beregnes, regnet som analyttnivå.

Målingsinstrument

Et egnet instrument, slik som et diffust reflektans-spektrofotometer med passende program, kan lages slik at det automatisk avleser reflektans ved visse tidspunkter, beregner grad av reflektansforandring, og ved å anvende kalibreringsfaktorer, uttaksnivået av analytt i den vandige fluid. En slik anordning er skjematisk vist i fig. 2, hvor et måleutstyr av oppfinnelsen som omfatter bakgrunn 12 borttil reagenspute 11 er festet, er vist. Lyskilde 5, f.eks. en høyintensitetslysenderdiode (LED) sender en lysstråle inn i reagensputen. En vesentlig del (minst 25 %, fortrinnsvis minst 35 % og mer foretrukket minst 50 %, i fråvær av reaksjonsprodukt) av dette lys blir diffust reflektert fra reagensputen og påvises av lysdetektor 6, f.eks. en fototransistor som produserer en utgående strøm proporsjonal med lyset som den mottar. Lyskilde 5 og/eller detektor 6 kan tilpasses til å danne eller svare på en spesiell bølgelengde, om ønsket. Uttaket fra detektor 6 passeres til forsterker 7, f.eks. en lineær integrert krets som omdanner fototransistorstrømmen til en spenning. Uttaket fra forsterker 7 kan føres til oppsporings- og holde-krets 8. Dette er en kombinasjon av lineær/digitalintegrert krets som sporer opp eller følger den analoge spenning fra forsterker 7 og, ved kommando fra mikroprosessor 20 låser eller holder spenningen ved dette nivå på det tidspunktet. Analog-til-digital omformer 19 tar den analoge spenning fra oppsporings- og holde-krets 8 og omformer den til f.eks. et tolv-bit binært digital tall ved kommando fra mikroprosessor 20. Mikroprosessor 20 kan være en digitalintegrert krets. Den tjener de følgende kontrollfunksjoner: 1) tidsangivelse for hele systemet; 2) avlesning av uttaket fra analog/digital omformer 19; 3) sammen med program og datahukommelse 21, lagring av data som tilsvarer reflektansen målt ved spesifiserte tidsintervaller; 4) beregning av analyttnivåer fra de lagrede reflektanser; og 5) uttak av analyttkonsentrasjonsdata til avleser 22. Hukommelse 21 kan være en digitalintegrert krets som lagrer data og det mikroprosessor-opererende program. Rapportutstyr 22 kan anta forskjellige hardkopi og bløtkopiformer. Vanligvis er det en synlig fremvisning, slik som en væskekrystall eller LED fremvisning, men den kan også være en tape-printer, et hørbart signal eller lignende. Instrumentet kan også inkludere en start-stopp bryter og kan gi et hørbart eller synlig tidssignal for å angi tider for

for påføring av prøven, for å ta avlesninger etc, om ønsket.

Reflektansbytte

I den foreliggende oppfinnelse kan selve reflektanskretsen anvendes til å starte tidsangivelse til å måle et fall i reflektans som forekommer når den vandige del av suspensjonsløsningen som påføres til reagensputen (f.eks. blod) vandrer til overflaten hvorved reflektans blir målt. Typisk blir målingsutstyret satt på en "klar" innstilling hvor reflektansavlesningen gjøres automatisk ved nærtliggende intervaller (typisk omtrent 0,2 sek.) fra den typisk ubleket hvite, i det vesentlige tørre, ureagerte reagensstrimmel. Startmålingen blir typisk laget før gjennomtrengning av matriksen av fluid som blir analysert, men kan gjøres etter at fluidet er blitt påført på et sted på reagenselementet forskjellig fra der hvor reflektansen måles. Reflektansverdien evalueres av mikroprosessoren, typisk ved å lagre påfølgende verdier i hukommelsen og så sammenligne hver verdi med den første, ureagerte verdi. Når den vandige løsning trenger gjennom reagensmatriksen, signaliserer fallet i reflektans starten på målingstidsintervallet. Fall i reflektans på 5 - 50 % kan anvendes til å starte en tidsmåling, typisk et fall på omtrent 10 %. På denne enkle måte er det en nøyaktig synkronisering av målingsmedium som når overflaten hvor fra målinger blir tatt, og start av sekvensen av avlesninger, uten noe krav til aktivitet av brukeren.

Selv om de totale systemer som er beskrevet i denne søknad, er spesielt rettet mot anvendelse av polyamidmatriks, og spesielt mot anvendelse av slike matrikser i bestemmelse av konsentrasjonen av forskjellige sukkere, slik som glukose, og andre materialer av biologisk opprinnelse, er det ikke noe behov for å begrense reflektansbytte aspektet av oppfinnelsen til slike matrikser. For eksempel kan matriksen anvendt med reflektansbytte dannes fra et hvilket som helst vannuløselig hydrofilt materiale og en hvilken som helst annen type reflektansmåling.

Spesiell anvendelse til glukosemåling

Et spesielt eksempel med henblikk på påvisning av glukose i nærvær av røde blodceller vil nå bli gitt slik at større detaljer og spesielt fordeler kan pekes ut. Selv om dette representerer en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, er oppfinnelsen ikke begrenset til påvisning av glukose i blod.

Anvendelse av polyamid overflater for å danne reagenselementet, gir en rekke ønskede karakteristika i den foreliggende oppfinnelse. Disse er at reagenselementet er hydrofilt (dvs. tar lett opp reagens og prøve), ikke deformeres når det blir vått (slik at det gir en flat overflate for reflektansavlesning), er forenelig med enzymer (for å gi god lagringsstabilitet), tar opp et begrenset prøvevolum pr. enhet membranvolum (nødvendig for å vise et utvidet dynamisk område for målinger) og viser tilstrekkelig våt styrke til å tillate rutinefremstilling.

I en typisk utforming blir fremgangsmåten utført ved å anvende et apparat som består av en plastholder og reagenselementet (idet matriksen har det signalproduserende system impregnert i seg). Den foretrukne matriks for anvendelse i fremstilling av reagenselementet er en nylon mikrofiltreirngsmembran, spesielt membraner laget av nylon-66 støpt på en kjerne av ikke-vevde polyesterfibere. Tallrike nylon mikrofiltreirngsmembraner av denne klasse blir produsert kommersielt av Pall Ultrafine Filtration Corporation som har gjennomsnitts porestørrelse på fra 0,1 til 3,0 mikron. Disse materialer viser mekanisk styrke og fleksibilitet, dimensjonsstabilitet ved utsettelse for vann og hurtig væting.

Mange variasjoner i spesifikk kjemisk struktur av nylon er mulig. Disse inkluderer ufunksjonalisert nylon-66 med ladede endegrupper (solgt under handelsmerket Ultipore av Pall Ultra-fine Filtration Corparation; "Pall"). Positive ladninger er fremherskende under pH 6, men negative ladninger er fremherskende ved pH over 6. I andre membraner blir nylon funksjonalisert før membranen blir utformet for å gi membraner med forskjellige egenskaper. Nyloner funksjonalisert med karboksy-grupper, er negativt ladet over et vidt pH-område (solgt som Carboxydyn av Pall). Nyloner kan også være funksjonalisert med en høy tetthet av positivt ladede grupper på overflaten, typisk kvartemære amin-grupper, slik at de viser liten variasjon i ladning over et vidt pH-område (solgt som Posidyne av Pall). Slike materialer er spesielt vel egnet for utførelsen av foreligeende oppfinnelse. Det er også mulig å anvende membraner som har reaktive funksjonelle grupper utformet til kovalent immobilisering av proteiner (solgt som Biodyne Immuno Afflnity membraner av Pall). Slike materialer kan anvendes til kovalent og festeproteiner f.eks. enzymer, anvendt som reagenser. Selvom alle disse materialer er anvendbare, gir nylon som har en høy tetthet av positivt ladede grupper på overflaten, den beste stabilitet av reagenser når den formes til en tørr reagenspute. Ufunksjonalisert nylon gir den nest beste stabilitet med de karboksylerte nyloner nest best.

Ønskelige resultater kan oppnås med porestørrelser som varierer fra omtrent 0,2 - 2,0 fim, fortrinnsvis omtrent 0,5 -1,2 jun, og mest foretrukket omtrent 0,8 firn, når anvendt med fullblod.

Formen av håndtaket hvorpå reagenselementet blir oppsamlet, er relativt lite viktig så lenge som håndtaket tillater avgang til en side av reagenselementet av prøven og til den andre side av reagenselementet av innfallende lys viss reflektans blir målt. Håndtaket hjelper også til å innføre reagenselementet inn i det absorbansmålende utstyr slik at det registrerer med det optiske system. Ett eksempel på et egnet håndtak er en mylar eller annen plaststrimmel hvortil et overføringsklebestoff slik som 3M 465 eller Y9460 overføringsklebemiddel er blitt påført. Et hull blir stukket inn i plasten gjennom overføringsklebemiddelet. Et reagenselement, typisk i form av en tynn pute, enten som inneholder reagenser eller hvortil reagenser senere vil bli tilsatt, blir så påført til håndtaket ved hjelp av overføringsklebemidler, slik at det blir fast festet til håndtaket i området som omgir hullet som er blitt stukket gjennom håndtaket og overføringsklebemiddelet. En slik anordning er illustrert i fig. 1, som viser reagenspute 11 festet til et Mylart håndtak 12 ved hjelp av klebemiddel 13. Hull 14 gir tilgang av prøve eller innfallende lys til en side av reagenspute 11, mens adgang til den andre side av reagensputen er ubegrenset. Alle dimensjoner av reagensputen og håndtaket kan selekteres, slik at reagensputen passer sikkert inn i et reflektansavlesningsinstrument i nær beliggenhet med en lyskilde og en reflektert lysdetektor.

Hvis en nylon matriks velges til å danne reagensputen når de angitte tykkelser blir anvendt, er det foretrukket å ha reagensputen båret av holderen på en slik måte at ikke mer enn 6 mm, målt i alle retninger, er uten støtte av holderen ved lokaliseringen hvor prøven påføres og lysreflektans måles. Større områder uten støtte har tendens til å gi utilstrekkelig dimensjonsstabilitet til membranen, slik at måling av reflektans fra overflaten blir ugunstig påvirket. Et hull 14 på 5 mm i diameter i reagensstrimmelen vist i fig. 1, virker nokså tilfredsstillende.

Det er ingen spesiell grense når det gjelder minimumsdiameteren av et slikt hull, selv om diametre på minst 2 mm er foretrukne for lett fremstilling, påføring av prøve, og avlesning av lysreflektans.

Selv om en rekke farger kunne anvendes som indikatorer, vil valget avhenge av prøvens natur. Det er nødvendig å velge en farge som har en absorbans ved en bølgelengde som er forskjellig fra bølgelengden hvorved røde blodceller absorberer lys, med fullblod som målingsmedium, eller hvor andre forurensede stoffer i løsningen blir analysert med andre målingsmedier. MBTH-DMAB fargeparet (3-metyl-2-benzotiazolinon hydrazon hydroklorid og 3-dimetylaminobenzosyre), selvom det tidligere er blitt beskrevet som egnet for fargeutvikling for peroksidase-markører i enzym immunologiske målinger, er aldri blitt anvendt i kommersiell glukosemålingsreagens. Dette fargepar gir et større dynamisk område og viser forbedret enzymatisk stabilitet sammenlignet med tradisjonelle farger anvendt til glukosemåling, slik som benzidinderivater. Videre er MBTH-DMAB fargeparet ikke karsinogent, et karakteristika for de fleste benzidinderivater.

Et annet fargepar som kan anvendes i måling av glukose, er AAP-CTA (4-amino-antipyren og kromotropisk syre) paret. Selv om dette par ikke gir så bredt dynamiske områder som MBTH-DMAB, er det stabilt og egnet til anvendelse i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse når man måler glukose. Igjen gir AAP-CTA fargeparet et utvidet dynamisk område og større enzymatisk aktivitetsstabilitet enn de mere vidt anvendte benzidinfarger.

Anvendelse av MBTH-DMAB paret tillater korreksjon av hematokritt og grad av oksygenering av blod med en enkel korreksjonsfaktor. De mer typiske anvendte benzidinfarger tillater ikke en slik korreksjon. Fargen danner en kromofor som absorberer ved omtrent 635 nm men ikke i noen signifikant grad ved 700 nm. Små variasjoner i måling av bølgelengder (± omtrent 10 nm) er tillatt. Ved 700 nm kan både hematokritt og grad av oksygenering måles ved å måle blodfarge. Videre er lys-sender-dioder (LED) tilgjengelige i handelen for både 635 nm og 700 nm målinger, og forenkler derved masseproduksjon av et utstyr. Ved å anvende den foretrukne membranporestørrelse beskrevet ovenfor og den tilgrunnliggende reagensutforming kan både hematokritt og oksygenerings oppførsel korrigeres ved å måle ved bare 700 nm bølgelengde.

To tilleggsbetingelser ble funnet å gi spesiell stabilitet og lang lagringstid for en glukoseoksydase/peroksidaseutforming på en polyamidmatriks. Disse anvender en pH på 3,8 til 5,0, fortrinnsvis omtrent 3,8 til 4,3, mest foretrukket omtrent 4,0, og anvendelse av et konsentrert buffersystem for påføring av reagensene til matriksen. Den mest effektive buffer ble funnet å være 10 vekt% citratbuffer, med konsentrasjoner på fra 5 -15 % som effektive. Dette er vekt/volum prosenter av løsningen hvori reagensene påføres til matriksen. Andre buffere kan anvendes på det samme molare grunnlag. Størst stabilitet ble oppnådd ved å anvende en lav pH, fortrinnsvis omtrent pH 4, et MBTH-DMAB fargesystem, og en høy enzymkonsentrasjon på omtrent 500-1000 U/ml av påføringsløsning.

I fremstilling av MBTH-DMAB reagenser og enzymsystemet som danner resten av det signalproduserende system, er det ikke nødvendig å opprettholde nøyaktige volumer og forholder, selv om de foreslåtte verdier nedenfor gir gode resultater. Reagenser blir lett absorbert av matriksputen når glukoseoksydase er tilstede i en løsning ved omtrent 27 - 54 vol%, peroksydasen er tilstede ved en konsentrasjon på omtrent 2,7 - 5,4 mg/ml MBTH er tilstede ved en konsentrasjon på omtrent 4-8 mg/ml, og DMAB er tilstede ved en konsentrasjon på omtrent 8-16 mg/ml. DMAB-MBTH vektforholdet blir fortrinnsvis opprettholdt i området på (1-4):1, fortrinnsvis omtrent (1,5-2,5):1, mest foretrukket omtrent 2:1.

De grunnleggende fremstillingsteknikker for reagenselementet er, så snart de er opprettet, enkle. Selve membranen er sterk og stabil, spesielt når en nylonmembran av den foretrukne utførelsesforrn velges. Bare to løsninge er nødvendige for å påføre reagens, og disse løsninger blir både lette utformet og er stabile. Den første inneholder hovedsakelig fargekomponentene og den andre inneholder hovedsakelig enzymene. Når man anvender f.eks. MBTH-DMAB fargeparet, blir de indivi-duelle farger løst i et vandig organisk løsningsmiddel, typisk en 1:1 blanding av acetonitril og vann. Matriksen dyppes inn i løsningen, overskuddsvæske fjernes ved avtørking og matriksen blir så tørket, typisk ved 50 - 60°C i 10-20 minutter. Matriksen som inneholder fargene, blir så dyppet i en vandig løsning som inneholder enzymene. En typisk utforming ville inneholde peroksydasen og glukoseoksydase-enzymene så vel som hvilken som helst ønsket buffer, konserverings-middel, stabilisator, eller lignende. Matriksen blir så avtørket for å fjerne overskuddsvæske og tørket som foran. En typisk utforming for glukosereagenset er som følger:

Farged<y>pp

Bland: 40 mg MBTH,

80 mg DMAB,

5 ml acetonitril, og

5 ml vann.

Rør til alle faste stoffer er oppløst og hell på en glass-plate eller annen flat overflate. Dypp et stykke Posidyne membran (Pall Co.), tørk av overskuddsvæske og tørk ved 56 °C i 15 min.

Enzymdypp

Bland: 6 ml vann,

10 mg EDTA, dinatriumsalt,

200 mg Poly Pep, lav viskositet, <Sigma'

0,668 g natriumcitrat

0,523 g sitronsyre

2,0 ml 6 vekt% Gantrez AN-139 løst i vann <GAF

30 mg pepperrotperoksydase, 100 enheter/mg, og

2,0 ml glukoseoksydase, 2000 enheter/ml.

Rør inntil alle faste stoffer er løst og hell på en glassplate eller annen flat overflate. Dypp et stykke membran tidligere impregnert med farge, tørk av overskuddsvæske og tørk ved 56 °C i 15 minutter.

Det elektroniske apparat som blir anvendt til å gjøre reflektansavlesninger, inneholder minimalt en lyskilde, en reflektrert lysdetektor, en forsterker, en analog til digital omformer, en mikroprosessor med hukommelse og program og en avlesningsanordning.

Lyskilden består typisk av en lysutsendingsdiode (LED). Selv om det er mulig å anvende en polykrom lyskilde og en lysdetektor som er i stand til å måle ved to forskjellige bølgelengder, ville et foretrukket apparat inneholde to LED kilder eller en enkelt diode i stand til å sende to forskjellige lysbølgelengder. Kommersielt tilgjengelige LEDer som produserer lysbølgelengdene som er beskrevet som foretrukne i den foreliggende spesifisering, inkluderer Hewlett Packard HLMP-1340 med et emisjonsmaksimum ved 635 nm og en Hewlett Packard QEMT-1045 med smalbåndsemisjonsmaksimum ved 700 nm. Egnede kommersielt tilgjengelige lysdetektorer inkluderer en Hammamatsu 5874-18K og en Litronix BPX-65.

Selv om andre fremgangsmåter for å ta målinger, er mulige, har den følgende fremgangsmåte gitt de ønskede resultater. Avlesninger blir tatt av fotodetektoren ved spesifiserte intervaller etter at tidsmåling er startet. 635 nm LED blir skrudd på bare i løpet av et kort målingstidsområde som begynner omtrent 20 sek. etter starttidspunktet som angitt ved reflektansbyttet. Hvis denne avlesning indikerer at et høyt glukosenivå er tilstede i prøven, blir en 30 - sekunders avlesning foretatt og anvendt i sluttberegningen for å forbedre nøyaktighet. Typisk er høye nivåer betraktet å begynne ved omtrent 250 mg/dl. Bakgrunnen korrigeres med en 700 nm avlesning tatt omtrent 15 sek. etter starten av målingsperioden. Avlesningen fra fotodetektoren integreres over intervallet, mens den passende LED blir aktivert, som typisk er mindre enn ett sekund. Rå-reflektans-avlesningene blir så anvendt til beregninger som utføres av mikroprosessoren etter at signalet er blitt forsterket og omdannet til et digitalsignal. Tallrike mikroprosessorer kan anvendes til å utføre beregningen. En AIM65 enkelt-tavle mikrokomputer produsert av Rockwell International har vist seg å være tilfredsstillende.

De foreliggende fremgangsmåter og apparater tillater en veldig enkel prosedyre med minimums operasjonstrinn for anvenderen. I anvendelse blir reagensstrimmelen plassert i detektoren slik at hullet i strimmelen samsvarer med optikken av påvisningssystemet. En fjembar hette eller annet dekke blir plassert over optikken og strimmelen for å beskytte det hele fra omgivende lys. Målingsekvensen blir så startet ved å trykke ned en knapp på måleapparatet som aktiverer mikrokomputeren til å ta en måling av reflektert lys den ureagerte reagenspute, kalt en Rtørr avlesning. Hetten blir så fjernet og en bloddråpe blir påført på reagensputen, typisk mens reagensputen registreres med optikken og avlesnings-anordningen. Det er foretrukket at reagensstrimmelen blir etterlatt på plass med optikken for å minimalisere håndtering. Instrumentet er i stand til å føle påføring av blod eller annen prøve ved en nedgang i reflektans når prøven passerer gjennom matriksen og reflektert lys blir målt på den motsatte side. Nedgang i reflektans starter en tidsmålingssekvens som er beskrevet i detalj på andre steder i denne spesifikasjon. Dekket bør erstattes innen 15 minutter av prøvepåføring, selvom dette tidsrom kan variere avhengig av typen av prøve som blir målt. Resultater blir typisk vist ved omtrent 30 sek. etter påføring av blod, når en blodglukoseprøve blir målt, selvom en 20 sek. reaksjon er tillatelig for glukoseprøver som har en glukosekonsentrasjon på mindre enn 250 mm/dl. Hvis andre prøver blir målt, kan egnede tider for fremvisning av resultatet være forskjellig, og kan lett bestemmes fra karakteristika av det/den valgte reagens/prøve.

En spesielt nøyaktig evaluering av glukosenivå (eller annen analytt som blir målt), kan gjøres ved å anvende bakgrunnsstrøm, dvs. strømmen fra fotodetektoren med strøm på men uten lys reflektert fra reagensputen, for å gjøre en bakgrunnskorrigering. Det er blitt demonstrert av over en 2 - 3 måneders periode forandrer denne verdi seg ikke for et spesielt instrument som er fremstilt i henhold til de foretrukne utførelsesformer av denne spesifikasjon, og det er mulig å programmere denne bakgrunnsavlesning inn i komputer-hukommelsen som en konstant. Med en svak modifisering av prosedyren kan imidlertid denne verdi måles ved hver analyse for mere nøyaktige resul-tater. I den modifiserte prosedyre bør måleren skrus på med lukket åpning før reagensstrimmelen er på plass, og bakgrunnsstrømmen ville bli målt. Teststrimmelen ville så bli innført inn i måleren med lokket lukket, og en Rtørr måling blir tatt, og prosedyren fortsatt som beskrevet ovenfor. Med denne modi-fiserte prosedyre trenger ikke bakgrunnstrømmen å være stabil i løpet av målerens brukstid, og gir derved mere nøyaktige resultater. Rådata nødvendig for beregning av et resultat i en glukosemåling er en bakgrunnstrøm rapportert som bakgrunnsreflektans, Rb, som beskrevet ovenfor; en avlesning av den ureagerte teststrimmel, R^rr, også beskrevet ovenfor; og en sluttpunktmåling. Når man anvender de foretrukne utførelsesformer beskrevet her, er sluttpunktet ikke spesielt stabilt og må nøyaktig tidsbestemmes fra den initielle påføring av blod. Imidlertid utfører måleren som beskrevet her denne tidsmåling automatisk. For glukosekonsentrasjoner under 250 mg/dl blir et egnet stabilt sluttpunkt nådd på 20 sek., og en slutt reflektans, R20, blir tatt. For glukosekonsentrasjoner opp til 400 mg/dl er en 30-sekunders reflektansavlesning, R30, adekvat. Selvom systemet beskrevet her, viser god difrensiering opp til 800 mg/dl glukose, er målingen i noen grad forstyrret og unøyaktig over 450 mg/dl, selvom den ikke er så stor at den forårsaker et signifikant problem. Lengre reaksjonstider bør gi mere egnede avlesninger for de høyere nivåer av glukosekonsentrasjon.

700 nm reflektansavlesningen for den dobbelte bølgelengdemåling blir typisk tatt ved 15 sek. (R15). Ved dette tidspunkt vil blod fullstendig ha mettet reagensputen. Etter 15 sek. fortsetter fargereaksjonen å finne sted, og føles i liten grad av en 700 nm avlesning. Følgelig, siden fargeabsorbsjon ved 700 nm signalet er en ulempe, blir avlesninger etter 15 sek. ignorert i beregningene. Rådata beskrevet ovenfor anvendes til å beregne parametre som er proporsjonale med glukosekonsen-trasjon, som lettere kan visualiseres enn reflektansmålinger. En logaritmisk transformasjon av reflektans analog med forholdet mellom absorberingsevne og analyttkonsentrasjon observert i transmisjonsspektroskopi (Beer's Law) kan anvendes om ønsket. En forenkling av Kubelka-Monk ligningene, utledet spesifikt for reflektansspektroskopi, har vist seg spesielt anvendbar. I denne utledning er K/S relatert til analyttkosentrasjon med K/S definert ved ligning 1.

R<*>t er reflektiviteten tatt ved et spesielt slutt-tidspunkt, t, og er den absorberte fraksjon av den innfallende lysstråle beskrevet ved ligning 2, hvor Rt er sluttpunkt-reflektans, R20 eller R30. ;R<*>t varierer fra 0 for ikke noe reflektert lys (Rb) til 1 for totalt reflektert lys (Rum)-Anvendelse av reflek-tivitet i beregningene forenkler i stor grad målingsutformingen som en meget stabil kilde, og en påvisningskrets blir unødvendig siden disse komponenter måles med hver R,ørT og Rb måling.

For en enkelt bølgelengdeavlesning kan K/S beregnes ved 20 sekunder (K/S-20) eller 30 sekunder (K/S-30). Kalibrerings-kurvene som relaterer disse parametere til YSI (Yellow Springs Instruments) glukosemålinger, kan beskrives nøyaktig ved den tredje ordens polynome ligning gjengitt i ligning 3.

Koeffisientene for disse polynomer er satt opp i tabell 1.

De enkle kjemiske stoffer som blir målt i de foretrukne utførelsesformer, er MBTH-DMAB indaminfarge, og den komplekse matriks som blir analysert, er fullblod fordelt på en 0,8 fi Posidyne membran. Et tilbakeblikk med tittel "Application of Near Infra Red Spectrophotometry to the Nondestructive Analysis of Foods: A Review of Experimental Results", CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 18(3) 203-30 (1983), beskriver anvendelse av instrumenter på måling av en forskjell i optisk tetthet OD (a - b) hvor OD a er den optiske tetthet ved en bølgelengde som tilsvarer absorbsjonsmaksimum av en komponent som skal bestemmes, og OD b er den optiske tetthet ved en bølgelengde hvor den samme komponent ikke absorberer signifikant.

Algoritmen for dobbelt bølgelengdemåling er nødvendigvis mer kompleks enn for

enkelt bølgelengdemåling men er mye sterkere. Den første ordenskorreksjon, anvendt ved 700 nm avlesningen, er en enkelt substraksjon av bakgrunnsfargen p.g.a. blod. For å gjøre denne korreksjon kan det bestemmes og ble bestemt en relasjon mellom absorbans ved 635 nm og 700 nm p.g.a. blodfarge ved å måle blodprøver med 0 mg/dl glukose over et vidt

blodfargeområde. Fargeområdet ble konstruert ved å variere hematokritt, og nokså lineære forhold ble observert. Fra disse linjer ble K/S-15 ved 700 nm normalisert til å gi ekvivalens til K/S-30 ved 635 nm. Dette forhold er gjengitt i ligning 4, hvor K/S-15n er den normaliserte K/S-15 ved 700 nm.

Legg merke til at ekvivalensen av det normaliserte 700 nm signal og 635 nm signalet bare er sann ved null glukose. Uttrykkene hvorfra kalibreringskurvene ble utledet, er definert ved ligninger 5 og 6.

Disse kurver tilpasses best ved fjerde-ordens polynome ligninger lik ligning 3 hvortil et fjerde-ordens ledd i K/S blir lagt til. De komputertilpassede koeffisienter for disse ligninger er satt opp i tabell 2.

En annen ordenskorreksjon for å eliminere feil p.g.a. kromtaograferingsvirkninger er også blitt utviklet. Lav-hematokrittprøver har karakteristisk lave 700 nm avlesninger sammenlignet med høyere hematokritt-prøver med den samme 635 nm avlesning. Når forholdet (K/S-30)/(K/S-15) blir plottet i forhold til K/S-30 over et vidt området av hematokritter og glukosekonsentrasjoner, indikerer den resulterende linje på den grafiske fremstilling grensen mellom prøvene som viser kromatografeirngsvirkninger (over kurven) og de som ikke gjøre det (under kurven). K/S-30 for prøvene over kurven blir korrigert ved å forhøye avlesningen til å tilsvare et punkt på kurven med den samme (K/S-30)/(K/S-15).

Korreksjonsfakt orene gjengitt ovenfor, ble utformet til å passe til et enkelt instrument og et begrenset antall reagens-preparater. Algoritmen kan optimaliseres for et enkelt instrument og reagens på samme måte som beskrevet ovenfor.

I sammendrag minimaliserer systemet av den foreliggende oppfinnelse operator-virkninger og gjr tallrike fordeler i forhold til de tidligere reflektansavlesningsmetodene på fagområdet. Når sammenlignet med tidligere fremgangsmåter for f.eks. bestemmelse av

glukose i blod, er det flere synlige fordeler. For det første er mengden av prøve som kreves for å mette den tynne reagenspute, liten (typisk 5-10 mikroliter). For det andre er operator-tiden som kreves, bare den som er nødvendig for å påføre prøven på det tynne hydrofile lag og stenge lokket (typisk 4-7 sekunder). For det tredje kreves ingen samtidig tids-

avlesningsstart. For det fjerde kan fullblod anvendes. Denne fremgangsmåte krever ingen separasjon eller anvendelse av røde cellefrie prøver og kan likeledes anvendes med andre dypt fargede prøver.

Flere ikke åpenbare fordeler fremkommer som et resultat av utførelsen av den foreliggende oppfinnelse med fullstendig blod. Normalt vil vandige løsninger (som blod) trenge gjennom en hydrofil membran for å gi et væskelag på den motsatte side av membranen, en overflate som så ikke er egnet til reflektansmåling.

Det er imidlertid blitt oppdaget at blod, tilsynelatende p.g.a. vekselvirkninger mellom røde blodceller og proteiner i blodet med matriksen, vil væte polyamidmatriksn uten at en overskuddsvæske trenger gjennom den porøse matriks for å interferere med reflektansavlesningen på den motsatte side av matriksen.

Videre, ville de tynne membraner anvendt i den foreliggende oppfinnelse, når de er våte, forventes å transmittere lys og returnere bare et svakt signal til det reflektansmålende utstyr. Tidligere undervisning har hovedsakelig angitt at et reflekterende lag er nødvendig bak matriksen for å reflektere tilstrekkelig lys. I andre tilfeller er en hvit pute blitt plassert bak reagensputen før fargemåling. I det foreliggende tilfelle kreves hverken et reflekterende lag eller en hvit pute. Faktisk blir oppfinnelsen typisk utført med en lysabsorberende overflate bak reagenselementet når innfallende lys blir rettet mot matriksen. Ved å anvende en lysabsorberende overflate bak reagenselementet, koblet til målingsreflektans ved to forskjellige bølgelengder, tillates akseptable reflektansmålinger å oppnås uten fjerning av overskuddsvæske fra matriksen, for derved å eliminere ett trinn som typisk krevdes ved tidligere underviste metoder.

Oppfinnelsen som nå blir generelt beskrevet, vil forstås bedre ved referanse til de følgende spesifikke eksempler som er presentert bare for illustrative formål og ikke må betraktes som begrensende for oppfinnelsen med mindre noe slikt er spesifisert.

EKSEMPEL 1

Reproduserbarhet:

En mannlig blodprøve (JG, hematokritt = 45) ble anvendt til å samle reproduserbarhetsdata fremsatt i tabell 3-5.

Blodet ble delt i alikvote mengder og tilsatt glukose over et område på 25 - 800 mg/dl. Tjue bestemmelser ble gjort ved hvert glukoseprøvenivå fra strimler tatt tilfeldig fra en 500 strimmelprøve (porsjon FJ4-49B). Resultatene fra dette studium førte til de følgende konklusjoner:

1. Enkel vs. dobbeltbølgelengde:

Gjennomsnitts CV. for det 30-sekunders dobbelte resultat var 3,7 % vs. 4,8 % for det 30-sekunders enkeltbølgelengderesultat, en forbedring på 23 % over et glukoseområde på 25-810 mg/dl.

Det var en 33 % forbedring i CV. i det 25 - 326 mg/dl glukoseområdet. Her minket CV. fra 5,4 % til 3,6 %, en signifikant forbedring i det mest anvendte området. Den 20-sekunders dobbelt bølgelengdemåling ga lignende forbedringer i CV., sammenlignet med enkelt bølgelengdemålingen i 25 - 326 mg/dl området (tabell 3 og 4).

2. Dobbelt bølgelengde, 20 vs. 30-sekunders resultat:

Gjennomsnitts CV. for et 20-sekunders resultat i 25 -100 mg/dl området er nesten identisk med 30-sekunders avlesningen, 4,2 % vs. 4,1 %. Imidlertid har ved 326 mg/dl 30-sekunders avlesningen en CV. på 2,1 % og 20-sekunders avlesningen en CV. på 4,5 %. Som det ble sett i K/S-20 responskurven begynner hellingen å avta skarpt over 250 mg/dl. Dette fører til dårlig reproduserbarhet ved glukosenivåer større enn 300 for 20 sekunders resultatet. Fra disse reproduserbarhetsdata er avskjæringen for 20 sekunders resultatet et sted mellom 100 og 326 mg/dl. En avskjæring på 250 mg/dl ble senere bestemt fra resultatene fra utbyttestudiet fremsatt i eksempel II.

3. Størrelse av åpning:

En mindre størrelse av optikkåpning, 3,0 mm vs. 5 - 0 min., ble undersøkt. Start-eksperimentering ved å anvende et 10- replika, hånddyppet plateprøve viste forbedrete CV. verdier med 3,0 mm åpningen, tilsynelatende p.g.a. lettere registrering med system-optikken. Imidlertid, når maskin-laget rullemembran ble anvendt, var gjennomsnitts CV. (tabell 5) av den større åpning, 4,7 mm, 3,9 % vs. en gjennomsnitts CV. for 3,0 mm åpningen på 5,1 %. Denne 30 % økning i CV. var sannsynligvis forårsaket av den ujevne overflate av rullemembranporsjonen som diskutert nedenfor.

EKSEMPEL II

Utbytte:

For sammenligning av den foreliggende fremgangsmåte (MPX) mot en typisk fremgangsmåte innen den tidligere fagkunnskap som anvender en Yellow Springs Instrument Model 23A glukose analysator fabrikkert av Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, Ohio (YSI), ble blod fra 36 donorer testet. Donorene ble delt likt mellom menn og kvinner og rangerte i hematokritt fra 35 til 55 %. Blodprøvene ble anvendt innen 30 timers oppsamling, med litium heparin som anti-koagulat. Hver blodprøve ble delt i aliquote mengder og tilsatt glukose for å gj 152 prøver i området på fra 0 - 700 mg/dl glukose. Hver prøve ble testet i duplikat for en total mengde på 304 datapunkter.

Responskurve ble konstruert fra disse data, og glukoseverdier så beregnet fra den passende ligning (tabell 1 og 2). Disse MPX glukoseverdier ble så plottet vs. YSI verdiene for å gi spredningsdiagrammer.

Sammenligning av MPX-systemer: For både 20 sekunders og 30 sekunders målingstidene er mer spredning synlig i enkeltbølgelengde spredningsdiagrammene enn i dobbeltbølgelengde spredningsdiagrammene. 20 sekunders avlesningen blir veldig spredt over 250 mg/dl, men 30 sekunders målingen har ikke vist spredning før glukosenivået er ^500 mg/dl.

Disse spredningsdiagrammer ble kvantisert ved å bestemme avvikene fra YSI ved forskjellige glukoseområder. De følgende resultater ble oppnådd.

Bemerk: Disse er intermetode C.V.-verdier.

a) Dobbelt bølgelengde systemet ga C.V.-verdier som rangerte 30 % lavere enn enkelt bølgelengde systemet. b) Enkelt bølgelengde systemet, fra 0-50 mg/dl, viste et S.A. på ± 6-7 mg/dl, mens et

S.A. for en dobbelt bølgelengde måling var bare ±2,2 mg/dl.

c) Avskjæringen for en 30-sekunders MPX måling er 250 mg/dl. For 50 - 250 mg/dl området ga både 20- og 30-sekunders målingene lignende intermetode C.V.-verdier (omtrent 7 % for enkelt bølgelengde, 5,5 % for dobbelt bølgelengde). Imidlertid, i 250 - 450 mg/dl området mer enn fordobler intermetode C.V.-verdiene seg for 20 sekunders avlesningen til 14,5 % for den enkle og 12,8 % for

den dobbelte bølgelengde.

d) 30 sekunders avlesningen var ubrukelig over 450 mg/dl for både den enkle og dobbelte bølgelengemåling (C.V.-verdier på 10,2 og 8,4 %).

Som konklusjon ga to MPX systemer optimumskvantisering i 0 - 450 mg/dl området.

1. MPX 30 dobbel:

Dette dobbelt bølgelengdesystem ga en 30-sekunders målingstid med en 95 % konfidensgrense (definert som sannsynligheten for at en måling er innen 2 S.A. av YSI) på 11,3 % (CV.) for området fra 50 - 450 mg/dl (tabell 7) og ±4,4 mg/dl (S.A.) for 0,50 mg/dl.

2. MPX 30/20 dobbel:

Dette dobbelt bølgelengdesystem ga en 20-sekunders målingstid i 0 - 250 mg/dl området og en 30-sekunders tid for 250 - 450 området. 95 % konfidensgrensene er nesten identiske med MPX 30 dobbeltsystemet (tabell 7), 11,1 % (CV.) for 50 - 450 mg/dl og ±4,6 mg/dl (S.A. for 0 - 50 mg/dl).

EKSEMPEL III

Stabilitet:

Det meste av benkeskalaarbeidet som ble utført for å optimalisere stabilitet, ble fullført ved å anvende hånddyppede 0,8 /i Posidyne membran plater. Den spesifikke farge/enzymutforming ble fremsatt tidligere.

1. Romtemperatur stabilitet:

Dette studium forsøkte å kartlegge enhver forandring i respons i 0,8 u- Posidyne membran reagenset lagret ved 18 - 20 °C over tørkemiddel av silisiumdioksydgel. Etter 2,5 mnd. var det ingen merkbar forandring som målt ved responsen for en romtemperatur-prøve vs. responsen for en prøve lagret ved 5 °C. Hvert spredningsdiagram representerte et glukoseområde på 0 - 450 mg/dl.

2. Stabilitet ved 37°C:

Et 37°C stabilitetsstudium ved å anvende det samme reagens som ved RT studiet ble utført. Forskjellene i glukoseverdier for reagens under betingelsen 37°C vs. RT reagens, for strimler under betingelser med og uten klebemiddel, ble plottet over tid. Selv om data var uklare, p.g.a. den dårlige reproduserbarhet av håndlagede strimler, var stabiliteten utmerket for strimler enten de var under betingelsen med eller uten klebemiddel.

3. Stabilitet ved 56°C:

Åtte 5- til 6-dagers stabilitet ble utført ved å anvende forskjellige preparater med lik utforming på platemembran (tabell 8). For lavglukosetestnivået (80 -100 mg/dl) falt gjennomsnitts glukoseverdien under betingelsen ved 3,4 %, med det høyeste fall på 9,55 %. Ved det høye testnivå (280 - 320 mg/dl) sank glukoseavlesningen med et gjennomsnitt på 3,4 %, idet den største nedgang var 10,0 %.

Et studium av denne membran under 56°C betingelse over en 19 dagers periode viste ingen hovedforskjell for strimler under betingelser med eller uten klebemiddel. I begge tilfeller var 19-dagers nedgangen i glukoseverdi <15 % ved lave testnivåer (80 -100) og 300 mg/dl.

Et annet 56°C stuidium hvor man anvendte hånddyppet 0,8 fi Posidyne membran med to ganger det normale konsentrasjon av enzym og farge, ble fullført. To separate preparater med den samme utforming ble laget, og stabiliteten målt over en 14-dagers periode. Gjennomsnittsresultatene fra de to studier ble plottet. Forandringer var inne ± 10 % over 14-dagers perioden ved både det høye og lave glukose testnivå. Disse data viser at denne utforming er spesielt stabil.

EKSEMPEL IV

Prøvestørrelse:

Krav til prøvestørrelse for MPX er vist i tabell 9.

Volumene gjengitt i tabellen ble overført til reagensputen vist i fig. 1 ved å anvende en mikropipette. Når blod fra et stikk i finger blir påført en strimmel, kan den totale prøven ikke overføres, derfor representerer volumene som er gjengitt her, ikke den totale prøvestørrelse som trengs å klemmes ut fra fingeren for analysen. En 3- fi\ prøve er minimum som er nødvendig for fullstendig å dekke reagensputesirkelen. Dette gir ikke nok prøve til fullstendig å mette reagensputen og MPX gir lave resultater. En 4- fil prøve metter knapt reagensputen, mens en 5- fi\ prøve er klart tilstrekkelig. En 10-pd prøve er en stor, skinnende dråpe og en 20-/zl prøve er veldig stor dråpe og det er bare sannsynlig at denne kan brukes når blod fra en pipette anvendes til prøvetaking.

Ved lav glukosekonsentrasjon er enkelt bølgelengde resultatet i noen grad avhengig av prøvestørrelsen, som blir fullstendig eliminert når man anvender dobbelt bølgelengde målingen. Selv om denne avhengighet med enkelt bølgelengden kunne betraktes som akseptabel, er den klart uønsket.

EKSEMPEL V

Reproduserbarhet:

Eksperimentelle målinger beskrevet ovenfor, ble alltid kjørt i replikat, vanligvis 2, 3 eller 4 bestemmelser pr. datapunkt. Disse sett har alltid vist nært samsvar selv for prøver med ekstreme hematokritter eller ekstreme oksygennivåer. C.V.-verdier var godt under 5 %. Det viser seg derfor at reproduserbarhet er veldig god til utmerket.

Den tilgrunnliggende oppfinnelse gir mange fordeler i forhold til systemer som for øyeblikket kommersielt eller blitt beskrevet i litteraturen. Fremgangsmåtene er enkle og krever liten teknisk fagkunnskap og er relativt frie for operatorfeil. Målingene kan utføres hurtig og anvende billige og relativt uskadelige reagenser, viktige betraktninger for materialer anvendt i hjemmet. Brukeren oppnår resultater som kan forstås og anvendes sammen med opprettholdelsesterapi. I tillegg har reagensene lange stabilitetstider, slik at resultatene som oppnås vil være pålitelige i lange tidsperioder. Utstyret er enkelt og pålitelig og i det vesentlige automatisk.

Claims

1. Måleapparat for måling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod, som er tilpasset for på fjernbar måte å motta en porøs, hydrofil matriks som inneholder et signalproduserende system som har evne til å reagere med nevnte analytt for å produsere et lysabsorberende fargeprodukt, idet nevnte matriks har en første overflate, for mottagelse av en ikke-målt prøve av nevnte fullblod, og en andre overflate, motsatt nevnte første overflate, hvortil minst en del av nevnte prøve kan vandre igjennom nevnte matriks, karakterisert ved at nevnte måleapparat omfatter: anordninger for belysning av nevnte andre overflate av nevnte matriks med lys av en første bølgelengde, som kan bli absorbert av nevnte lysabsorberende fargeprodukt, og lys av en andre, forskjellig bølgelengde, som kan bli absorbert av fullblod; anordninger for detektering og kvantifisering av lys reflektert fra nevnte andre overflate til nevnte matriks ved nevnte første og andre bølgelengder; anordninger for beregning av konsentrasjonen til nevnte analytt i nevnte prøve basert på en avlesning av reflektert lys av nevnte første bølgelengde, korrigert for absorbansen til fullblod basert på en avlesning av reflektert lys av nevnte andre bølge-lengde; og anordninger for rapportering av den beregnede konsentrasjon av nevnte analytt.

2. Måleapparat ifølge til krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter en selvstendig elektronisk energikilde operativt forbundet med nevnte belysningsanordning, anordning for detektering, anordning for beregning og rapporteringsanordning.

3. Måleapparat i henhold til krav 1 eller 2, for måling av konsentrasjon av glukose i nevnte prøve, karakterisert ved at nevnte første bølgelengde er fra 625 til 645 nm, som kan bli absorbert av et fargeprodukt produsert av reaksjonen til glukose med det signalproduserende system, og nevnte andre bølgelengde er fra 690 til 710 nm, som kan bli absorbert av fullblod.

4. Måleapparat ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte første bølgelengde er omtrent 635 nm og nevnte andre bølgelengde er omtrent 700 nm.

5. Måleapparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det videre omfatter en kontrollanordning som forårsaker at en tidsmålerkrets blir initiert ved deteksjon av en reduksjon i mengden lys av hver av bølgelengdene reflektert fra nevnte andre overflate etter applikasjon av nevnte prøve til nevnte første overflate av nevnte matriks.

6. Måleapparat ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte kontrollanordning forårsaker at en eller flere avlesninger av reflektert lys blir tatt ved forutbestemte intervaller etter deteksjon av nevnte reduksjon.

7. Måleapparat ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at nevnte kontrollanordning er i stand til å forårsake at nevnte deteksjonsanordninger tar en avlesning av lys reflektert fra nevnte andre overflate av nevnte matriks før applikasjon av nevnte prøve på nevnte første overflate av nevnte matriks.

8. Måleapparat ifølge hvilket som helst av kravene 5-7, karakterisert ved at nevnte kontrollanordning videre har evne til å forårsake at nevnte deteksjonsanordning oppsamler og lagrer en bakgrunnsdetektorstrømavlesning i fravær av lys reflektert fra nevnte belysningsanordning.

9. Måleapparat ifølge hvilket som helst av kravene 5-8, karakterisert ved at når strømmen tilføres til nevnte kontrollanordning i en analyttpåvisningsmodus, forårsaker nevnte kontrollanordning automatisk at nevnte deteksjonsanordning avleser reflektert lys, for å initiere en tidsavlesningskrets ved deteksjon av nevnte reduksjon, for å samle avlesninger ved forutbestemte intervaller etter deteksjon av nevnte reduksjon, for å beregne en verdi for konsentrasjonen av analytt i nevnte prøve fra nevnte avlesninger, og å overføre nevnte verdi til nevnte rapporteringsanordning.

10. Målelapparat ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 9, karakterisert ved at når strømmen tilføres til nevnte kontrollanordning i en base-linjereflektansmodus før en analyttdeteksjonsmodus, forårsaker nevnte kontrollanordning at nevnte anordninger for deteksjon tar en grunnlinjeavlesning av det reflekterte lyset før applikasjon av nevnte prøve på nevnte matriks, og når nevnte kontrollanordninger er i nevnte analyttdeteksjonsmodus blir nevnte grunnlinjeavlesning også anvendt av nevnte kalkuleringsanordning for kalkulering av nevnte verdi.

11. System for måling av konsentrasjonen av en analytt i fullblod, karakterisert ved at det omfatter: måleapparatet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10; og en porøs hydrofil matriks som inneholder et signalproduserende system som har evne til å reagere med nevnte analytt for å produsere et lysabsorberende fargeprodukt, idet nevnte matriks har en første overflate, for mottagelse av en ikke-målt prøve av nevnte fullblod, og en andre overflate, motsatt nevnte første overflate, hvortil minst en del av nevnte prøve kan vandre gjennom nevnte matriks.

12. System ifølge krav 11, karakterisert ved at hver matriks omfatter et polyamid.

13. System ifølge krav 11 eller krav 12, karakterisert ved at den nominelle porestørrelsen til nevnte matriks er fra 0,2 til 1,0 pm.

14. System ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 13 for måling av konsentrasjonen av glukose i nevnte fullblod, karakterisert ved at det signalproduserende systemet omfatter 3-metyl-2-benzotiazolinonhydrazonhydroklorid og 3-dimetylaminobenzosyre.

15. System ifølge krav 14, karakterisert ved at det signalproduserende systemet har en pH på 3,8 til 5.