ES2246558T3

ES2246558T3 - Tira de analisis para la determinacion de glucosa.

Info

Publication number: ES2246558T3
Application number: ES99202765T
Authority: ES
Inventors: Roger Phillips; Ray Underwood; Geoffrey Mcgarraugh; Frank Jurik
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-07
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2007-08-07
Also published as: DE3752241T2; NO923399D0; US6887426B2; FI951491A; EP0256806A2; CA1301604C; ATE96179T1; US5843692A; JPH0767698A; EP0479394B1; DK419187A; FI95749C; ES2124490T3; DK173265B1; ES2155224T3; DK173388B1; AU603821B2; ES2121766T3; FI93149B; US20030073153A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE UN ANALITO EN UN FLUIDO, JUNTO CON UN APARATO DISEÑADO ESPECIFICAMENTE PARA LLEVAR A CABO DICHO PROCEDIMIENTO. EL CITADO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN TOMAR UNA LECTURA DE REFLECTANCIA PROCEDENTE DE UNA SUPERFICIE (15) DE UNA MATRIZ POROSA INERTE (11) IMPREGNADA CON UN REACTIVO QUE INTERACCIONARA CON EL ANALITO, PARA PRODUCIR UN PRODUCTO DE REACCION ABSORBEDOR DE LUZ, CUANDO EL FLUIDO ANALIZADO SE APLICA A LA MATRIZ. LAS MEDICIONES DE REFLECTANCIA SE REALIZAN A DOS LONGITUDES DE ONDA SEPARADAS, A FIN DE ELIMINAR LA INTERFERENCIA. SE PUEDE DISPARAR UN CIRCUITO TEMPORIZADOR MEDIANTE UNA REDUCCION INICIAL DE REFLECTANCIA, MEDIANTE EL HUMEDECIMIENTO DE LA SUPERFICIE, CUYA REFLECTANCIA SE ESTA MIDIENDO, MEDIANTE EL FLUIDO QUE PASA A TRAVES DE LA MATRIZ INERTE. DICHO PROCEDIMIENTO Y APARATO SON ESPECIALMENTE ADECUADOS PARA LA MEDICION DE LOS NIVELES DE GLUCOSA EN LA SANGRE, SIN REQUERIR LA SEPARACION DE LOS GLOBULOS ROJOS A PARTIR DEL SUERO O EL PLASMA.

Description

Tira de análisis para la determinación de glucosa.

La presente invención se refiere a un dispositivo de ensayo para su uso en un procedimiento para la determinación colorimétrica de componentes químicos y bioquímicos (analitos) en fluidos acuosos, particularmente sangre entera. En una realización preferida se refiere a una tira de ensayo para medir colorimétricamente la concentración de glucosa en sangre entera.

Día a día aumenta la importancia de la cuantificación de componentes químicos y bioquímicos en fluidos acuosos coloreados, en particular fluidos biológicos coloreados tales como la sangre y la orina y los derivados de fluidos biológicos tales como el suero sanguíneo y el plasma sanguíneo. Existen aplicaciones de gran importancia en la diagnosis y el tratamiento médico y en la cuantificación de la exposición a drogas terapéuticas, tóxicos, productos químicos peligrosos y similares. En algunos casos, la cantidad del material a determinar es demasiado minúscula (en un nivel de microgramos o inferior por decilitro) o tan difícil de determinar de forma exacta que el aparato empleado se complica y solamente es útil para personal de laboratorio experto. En este caso los resultados generalmente no están disponibles durante varias horas o días después de la obtención de la muestra. En otros casos, a menudo toma gran importancia la capacidad de operarios poco avezados para realizar los ensayos de forma rutinaria, rápida y fácil de reproducir fuera de un laboratorio contando con un dispositivo de visualización de información rápido o inmediato.

Un análisis médico común es la medición de los niveles de glucosa en sangre por parte de los diabéticos. La experiencia actual aconseja que los pacientes diabéticos midan su nivel de glucosa en sangre entre dos y siete veces por día dependiendo de la naturaleza y severidad de sus casos individuales. Basándose en el modelo observado de los niveles de glucosa obtenidos, el paciente y el médico efectúan juntos ajustes en la dieta, el ejercicio y la administración de insulina para un mejor control de la enfermedad. Manifiestamente, esta información debería estar disponible para el paciente de forma inmediata. Actualmente, un procedimiento ampliamente usado en los Estados Unidos emplea un artículo de ensayo del tipo descrito en la patente de EE.UU. 3.298.789 adjudicada el 17 de enero de 1967 a Mast. En este procedimiento, se coloca una muestra de sangre fresca (típicamente entre 20 y 40 \mul) sobre una almohadilla de reactivo revestida de etilcelulosa que contiene un sistema enzimático que tiene actividad de glucosa oxidasa y peroxidasa. El sistema enzimático reacciona con la glucosa y libera peróxido de hidrógeno. La almohadilla también contiene un indicador que reacciona con el peróxido de hidrógeno en la presencia de peroxidasa para dar un color proporcional en su intensidad al nivel de glucosa de la muestra. Otro procedimiento de ensayo de glucosa en sangre muy popular emplea una química similar pero en lugar de una almohadilla revestida de etilcelulosa emplea una película resistente al agua a través de la cual se dispersan las enzimas y el indicador. Este tipo de sistema se presenta en la patente de EE.UU. 3.630.957 adjudicada el 28 de diciembre de 1971 a Rey y col.

En algunos casos se deja permanecer la muestra en la almohadilla de reactivo durante un tiempo especificado (típicamente un minuto). Entonces en el primer caso se elimina la muestra de sangre con una corriente de agua mientras que en el segundo caso se limpia de la superficie de la película. Entonces, la almohadilla de reactivo o la película se secan y se evalúan. La evaluación se efectúa bien mediante la comparación del color generado con una muestra de colores o colocando la almohadilla o la película en un instrumento de reflectancia difusa para leer un valor de la intensidad del color.

Aunque los procedimientos anteriores se han usado en la monitorización de la glucosa durante años, tienen algunas limitaciones. El tamaño requerido de la muestra es bastante grande para un ensayo de pinchazo en el dedo y es difícil de conseguir para algunas personas cuya sangre capilar no se expresa fácilmente.

Además, estos procedimientos comparten una limitación con otras determinaciones colorimétricas de muestras realizadas por operarios pocos expertos en lo que se refiere a que su resultado se basa sobre una lectura absoluta del color que a su vez está relacionada con la extensión absoluta de la reacción entre la muestra y los reactivos de ensayo. El hecho de que la muestra deba ser lavada o limpiada de la almohadilla de reactivo después de un intervalo de reacción cronometrado necesita que el usuario esté preparado al final del intervalo de tiempo y limpie o aplique una corriente de lavado en el momento requerido. El hecho de que la reacción se detenga eliminando la muestra da como tiende a una falta de certeza en el resultado, especialmente en manos de usuarios domésticos. Un lavado excesivo puede dar lugar a resultados bajos y la falta de lavado puede dar resultados altos.

Otro problema que existe a menudo en las determinaciones colorimétricas de muestras por partes de usuarios poco expertos es la necesidad de iniciar la secuencia de cronometrado cuando la sangre se aplica a una almohadilla de reactivo. El usuario típicamente realizará un pinchazo en el dedo para obtener una muestra de sangre y entonces necesitará aplicar simultáneamente la sangre del dedo a la almohadilla de reactivo mientras inicia el cronometrado con su otra mano, requiriendo de esta forma el uso de ambas manos de forma simultánea. Esto es particularmente difícil ya que a menudo es necesario asegurar que el cronometrado se inicie solamente cuando la sangre se aplique a la almohadilla de reactivo. Todos los procedimientos de la técnica anterior requieren manipulaciones adicionales o circuitería adicional para conseguir este resultado. Consecuentemente, es deseable la simplificación de este aspecto de los instrumentos de lectura por reflectancia. La presencia de glóbulos rojos u otros componentes coloreados a menudo interfiere con la medición de estos valores absolutos necesitándose la exclusión de los glóbulos rojos en estos dos procedimientos anteriores que son los más ampliamente practicados. En el dispositivo de la patente 3.298.789 una membrana de etil celulosa evita que los glóbulos rojos penetren en la almohadilla de reactivo. Similarmente, la película resistente al agua de la patente 3.630.957 evita la penetración de los glóbulos rojos. En ambos casos el enjuagado o la limpieza también se efectúa para eliminar antes de la medición estos glóbulos rojos potencialmente interferentes.

Consecuentemente, existe la necesidad de un sistema para la detección de analitos en líquidos coloreados, tales como la sangre que no necesite la eliminación del exceso de líquido de una tira de reflectancia de la cual se obtiene una lectura de la reflectancia.

Sumario de la invención

Se presentan procedimientos, composiciones y aparatos para ensayos de diagnóstico que comprenden una matriz hidrófila porosa que contiene un sistema productor de señales y un aparato de medición de la reflectancia que se activa después de un cambio en la reflectancia de la matriz cuando un fluido penetra en la matriz. El procedimiento comprende la adición de la muestra, típicamente sangre, a la matriz que filtra las partículas grandes, tales como los glóbulos rojos, típicamente con la matriz presente en el aparato. El sistema productor de señales produce un producto que cambia adicionalmente la reflectancia de la matriz, dicho cambio puede correlacionarse con la presencia de un analito en la muestra.

Un ejemplo de un sistema de ensayo de diagnóstico es la determinación de la glucosa en sangre, en el que la determinación se efectúa sin la interferencia de la sangre y sin un protocolo complicado sujeto a la comisión de errores.

Sin embargo, la presente invención suministra una tira de ensayo que no necesita ser limpiada tal como se define en la reivindicación 1.

La presente invención puede entenderse más fácilmente mediante la referencia a la siguiente descripción detallada cuando se lee en conjunción con dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es una vista en perspectiva de una realización de un dispositivo de ensayo que contiene la almohadilla de reacción a la cual se aplica el fluido que está siendo analizado.

La figura 2 es un diagrama esquemático de bloques de un aparato que puede emplearse cuando se utiliza la tira de ensayo de la invención.

La figura 3 es un diagrama esquemático de bloques de un aparato alternativo que puede ser empleado.

Descripción detallada El elemento reactivo

El sujeto del descubrimiento suministra un empleo fiable y fácil de una metodología rápida y simple para operar un aparato para la determinación de analitos tales como la glucosa, que comprende particularmente un substrato enzimático que da como resultado la producción de peróxido de hidrógeno como producto enzimático. El procedimiento comprende la aplicación a una matriz porosa de un pequeño volumen de sangre, suficiente para saturar la matriz. Unidos a la matriz se encuentran uno o más reactivos de un sistema productor de señales, que da como resultado la producción de un producto que produce un cambio inicial en la cantidad de reflectancia de la matriz. La matriz está típicamente presente en un aparato medidor de reflectancia cuando se aplica la sangre. La muestra líquida penetra en la matriz, dando como resultado un cambio inicial en la reflectancia en la superficie de medición. Entonces se toma una lectura una o más veces después del cambio inicial en la reflectancia para relacionar el cambio adicional de la reflectancia en la superficie de medición o en la matriz como resultado de la formación del producto de reacción con la cantidad de analito en la muestra.

Para mediciones de la sangre, particularmente mediciones de la glucosa, se utiliza la sangre entera como medio de ensayo. La matriz contiene una enzima oxidasa que produce peróxido de hidrógeno. La matriz también contendrá una segunda enzima, particularmente una peroxidasa, y un sistema colorante que produzca un producto absorbente de la luz en conjunción con la peroxidasa. El producto absorbente de la luz cambia la señal de reflectancia. Con la sangre entera, se toman lecturas en dos longitudes de onda diferentes usándose la lectura a una longitud de onda para eliminar la interferencia de fondo provocada por el hematocrito, la oxigenación de la sangre y otras variables que pueden afectar al resultado.

Se emplea un elemento reactivo que comprende la matriz y los miembros del sistema productor de señales contenidos dentro de la matriz. El elemento reactivo puede incluir otros componentes para aplicaciones particulares. El procedimiento necesita la aplicación a la matriz de un pequeño volumen de sangre, que típicamente no ha sido expuesta a un tratamiento anterior (diferente del tratamiento opcional con un anticoagulante). El aparato activa el cronometrado de la medición de forma automática detectando un cambio en la reflectancia de la matriz cuando el fluido penetra en la matriz. El cambio en la reflectancia a lo largo de un período de tiempo predeterminado como resultado de la formación del producto de reacción se correlaciona entonces con la cantidad de analito en la muestra.

Una realización de la presente invención es el elemento reactivo, convenientemente en forma de almohadilla, que comprende una matriz porosa inerte y el componente o los componentes de un sistema productor de señales, dicho sistema es capaz de reaccionar con un analito para producir un producto de reacción absorbente de la luz, que se impregna dentro de los poros de la matriz porosa. El sistema productor de señales no impide significativamente el flujo de líquido a través de la matriz.

Para facilitar la lectura de la reflectancia, se prefiere que la matriz tenga al menos un lado que sea substancialmente liso y plano. Típicamente la matriz tendrá la forma de una lámina delgada con al menos un lado liso y plano. Durante su uso, la muestra del líquido que está siendo analizada se aplica a un lado de la lámina mediante lo cual cualquier compuesto de ensayo presente pasa a través del elemento reactivo por medio de capilaridad, absorción, flujo por gravedad y/o acciones de difusión. Los componentes del sistema productor de señales presentes en la matriz reaccionarán para dar un producto de reacción absorbente de la luz. La luz incidente incide sobre el elemento reactivo en una posición diferente de la posición en la cual se aplica la muestra. La luz se refleja desde la superficie del elemento en forma de luz reflejada difusa. Esta luz difusa se recoge y se mide, por ejemplo, mediante el detector de un espectrofotómetro de reflectancia. La cantidad de luz reflejada estará relacionada con la cantidad de analito en la muestra, siendo habitualmente una función inversa de la cantidad de analito en la muestra.

La matriz

Ahora se describirá a su vez cada uno de los componentes necesarios para producir el elemento reactivo.

La matriz será una matriz porosa hidrófila a la cual pueden unirse los reactivos de forma covalente o no covalente. La matriz permitirá el flujo de un medio acuoso a través de la matriz. También permitirá la unión de composiciones proteináceas a la matriz sin afectar adversamente de forma significativa la actividad biológica de la proteína, por ejemplo la actividad enzimática de una enzima. En la medida que las proteínas tienen que estar covalentemente enlazadas, la matriz tendrá zonas activas para el enlace covalente o puede activarse por medios ya conocidos en la técnica. La composición de la matriz será reflectante y tendrá un grosor suficiente para permitir la formación de un tinte absorbente de luz en el volumen vacío o sobre la superficie para afectar básicamente a la reflectancia desde la matriz. La matriz puede ser de una composición uniforme o un revestimiento sobre un substrato que suministre la estructura y las propiedades físicas necesarias.

La matriz habitualmente no se deformará cuando se humedezca, reteniendo así su conformación y tamaño originales. La matriz tendrá una absorbencia definida, de forma que el volumen que se absorbe pueda calibrarse dentro de límites razonables, las variaciones habitualmente se mantendrán por debajo de aproximadamente el 50%, preferiblemente no serán superiores al 10%. La matriz tendrá una resistencia suficiente a la humedad como para permitir su fabricación en serie. La matriz permitirá que los reactivos enlazados de forma no covalente se distribuyan de forma relativamente uniforme sobre la superficie de la matriz.

Superficies de matriz ejemplares son las poliamidas, particularmente con muestras que comprendan sangre entera. Las poliamidas son convenientemente polímeros de condensación de monómeros de entre 4 y 8 átomos de carbono, en donde los monómeros son lactamos o combinaciones de diaminos y de ácidos dicarboxílicos. También pueden utilizarse otras composiciones que tengan propiedades comparables. Las composiciones de poliamida pueden modificarse para introducir otros grupos funcionales que suministren estructuras cargadas de forma que las superficies de la matriz puedan ser neutras, positivas o negativas, así como neutras, básicas o acídicas. Las superficies preferidas están positivamente cargadas.

Cuando se utiliza con sangre entera, la matriz porosa tiene preferiblemente poros con un diámetro medio en la banda de entre 0,1 y 2,0 \mum, preferiblemente entre 0,2 y 1,0 y más preferiblemente entre 0,6 y 1,0 \mum.

Una manera preferida de preparar el material poroso es fundir el polímero hidrófilo sobre un núcleo de fibras no entretejidas. Las fibras del núcleo pueden ser cualquier material fibroso que produzca la integridad y resistencia descritas, tal como los poliésteres y las poliamidas. El reactivo que formará el producto de reacción absorbente de la luz, que se tratará posteriormente con mayor detalle, está presente dentro de los poros de la matriz, pero no bloquea la matriz de forma que la parte líquida del medio de ensayo, por ejemplo, la sangre, que está siendo analizado pueda fluir a través de los poros de la matriz, mientras que partículas, tales como los eritrocitos, se mantengan en la superficie.

La matriz es substancialmente reflectante de forma que dé una reflectancia difusa sin el uso de un respaldo reflectante. Preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50% de la luz incidente aplicada a la matriz se refleja y se emite como reflectancia difusa. Habitualmente se emplea una matriz de menos de aproximadamente 0,5 mm de grosor, prefiriéndose entre 0,01 y 0,3 mm. Un grosor de entre 0,1 y 0,2 mm es el más adecuado, particularmente para una matriz de nylon.

Típicamente, la matriz se unirá a un portador para darle forma física y rigidez, aunque esto puede no ser necesario. La figura 1 muestra una realización de la invención en la cual una almohadilla fina 11 de matriz hidrófila se sitúa en un extremo de un portador 12 de plástico por medio de un adhesivo 13 que une directa y firmemente la almohadilla de reactivo al mango. Un orificio 14 está presente en el portador 12 de plástico en el área en la cual se une la almohadilla 11 de reactivo de forma que la muestra pueda aplicarse a un lado de la almohadilla de reactivo y la luz pueda reflejarse desde el otro lado.

Una muestra de líquido a ensayar se aplica a la almohadilla 11. Generalmente, utilizando sangre como ejemplo de una muestra a ser analizada, la almohadilla de reactivo tendrá un área superficial en el orden de aproximadamente entre 10 mm^{2} y 100 mm^{2}, especialmente entre 10 mm^{2} y 50 mm^{2}, que es normalmente un volumen que se saturará con entre 5 y 10 microlitros de muestra.

Las medidas de la reflectancia difusa en la técnica anterior típicamente se tomaban utilizando un respaldo reflectante unido o colocado por detrás de la matriz. No se necesita dicho respaldo o normalmente no estará presente durante la práctica de la invención, ni como parte del elemento reactivo ni del aparato de reflectancia. Como puede verse en la figura 1, el soporte sujeta la almohadilla 11 de reactivo de manera que pueda aplicarse una muestra en un lado de la almohadilla de reactivo mientras que la reflectancia de la luz se mide desde el lado de la almohadilla de reactivo opuesto a la ubicación en la que se aplica la muestra.

La figura 2 muestra un sistema en el cual el reactivo se aplica en el lado con el orificio del el mango de respaldo mientras que la luz se refleja y se mide en el otro lado de la almohadilla de reactivo. Pueden emplearse otras estructuras diferentes a las descritas. La almohadilla puede tomar diferentes formas sujetas a las limitaciones aquí manifestadas. La almohadilla será accesible en al menos una superficie y habitualmente en las dos superficies.

La capa hidrófila (elemento reactivo) puede estar unida al soporte mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, un soporte, un dispositivo de fijación o un adhesivo; sin embargo, en el procedimiento preferido se une al respaldo. La unión puede hacerse con cualquier adhesivo no reactivo, mediante un procedimiento térmico en el cual la superficie del respaldo se funda lo suficientemente para atrapar algo del material utilizado para la capa hidrófila o mediante procedimientos de unión por microondas o ultrasónicos que igualmente funden las almohadillas hidrófilas con el respaldo. Es importante que la unión sea tal que no interfiera en si misma básicamente con las mediciones de reflectancia difusa o con la reacción que se mide, aunque esto es improbable que ocurra ya que no se necesita que el adhesivo esté presente en la posición en la que se toma la lectura. Por ejemplo, puede aplicarse un adhesivo 13 a la tira 12 de respaldo y después primero se perfora el orificio 14 dentro de la tira y del adhesivo combinados y luego se aplica la almohadilla 11 de reactivo al adhesivo en la proximidad del orificio 14 de forma que la parte periférica de la almohadilla de reactivo se una a la tira de respaldo.

Los reactivos químicos

Puede emplearse cualquier sistema productor de señales que sea capaz de reaccionar con el analito de la muestra para producir (directa o indirectamente) un compuesto que sea característicamente absorbente a una longitud de onda diferente de la longitud de onda que básicamente absorbe el medio de ensayo.

Las matrices de poliamida son particularmente útiles para llevar a cabo reacciones en las cuales un substrato (analito) reacciona con una enzima oxidasa utilizadora de oxígeno de forma tal que se produzca un producto que reaccione adicionalmente con un tinte intermedio para formar bien directa o indirectamente un tinte que absorba una banda predeterminada de longitud de onda. Por ejemplo, una enzima oxidasa puede oxidar un substrato y producir peróxido de hidrógeno como producto de reacción. El peróxido de hidrógeno puede entonces reaccionar con un intermediario o precursor de un tinte, en una reacción catalizada o no catalizada, para producir una forma oxidada del intermediario o precursor. Este material oxidado puede producir el producto coloreado o reaccionar con un segundo precursor para formar el tinte final.

Ejemplos no limitativos de análisis y de reactivos típicos incluyen los siguientes materiales mostrados en la siguiente lista.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

Tipo de analito y muestra	Reactivos

\begin{minipage}[t]{60mm}Glucosa en sangre, suero, orina y otros fluidos biológicos, vino, zumos de frutas u otros fluidos acuosos coloreados. La sangre entera es un tipo de muestra particularmente preferido.\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{60mm} Glucosa oxidasa, peroxidasa y un receptor de oxígeno \end{minipage}
	Los receptores de oxígeno incluyen:
	O-dianisidina (1)
	O-toluidina
	O-tolidina (1)
	Benzicidina (1)
	\begin{minipage}[t]{60mm} 2,2'-acinodi-(ácido-(6)3-etilenzotiazolina sulfónico) \end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{60mm} 3-metil-2-benzotiazolinona hidrozona más N,N-diametillanilina (1) \end{minipage}
	Fenol más 4-aminofenazona (1)
	\begin{minipage}[t]{60mm} 2,4-diclorofenol sulfonado más 4-amino- fenazona (2) \end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{60mm} 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona más 3-ácido (dimetilamino)benzoico \end{minipage}
	2-metoxi-4-alil fenol (4)
	4-aminoantipirina-dimetilanilina (5)

(1) Tal como se publica en "Clinical Chemistry", Richterich y Columbo, pág. 367 y referencias aquí citadas.
(2) "Analist", 97, (1972) 142-5.
(3) "Anal. Biochem.", 105, (1980) 389-397.
(4) "Anal. Biochem.", 79, (1977) 597-601.
(5) "Clinica Chemica Acta", 75, (1977) 387-391 todos incorporados aquí por referencia.

Sin embargo, la presente invención requiere que el reactivo comprenda 4-aminoantipireno y ácido cromotrópico ó ácido 3-dimetilaminobenzóico y hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidracina.

El procedimiento de análisis

El procedimiento de análisis se apoya sobre un cambio en la absorbancia, tal como se mide mediante reflectancia difusa, que depende de la cantidad de analito presente en la muestra que está siendo analizada. Este cambio puede determinarse midiendo el cambio en la absorbancia de la muestra de ensayo entre dos o más momentos puntuales de un periodo de tiempo.

El primer paso del ensayo a considerar será la aplicación de la muestra a la matriz. En la práctica, un análisis podría llevarse a cabo tal como sigue: Primero se obtiene una muestra de fluido acuoso que contenga un analito. La sangre puede obtenerse, por ejemplo, pinchando un dedo. Una cantidad que exceda la saturación de la matriz en el área en el que se medirá la reflectancia (es decir, aproximadamente entre 5 y 10 microlitros) de este fluido se aplica al elemento o elementos reactivos del dispositivo de ensayo. No se necesita el inicio simultáneo cronometraje del tiempo (como habitualmente se requiere en la técnica anterior), tal como quedará claro más adelante. Puede eliminarse el exceso de fluido por ejemplo mediante un secante suave, pero dicha eliminación tampoco es necesaria. El dispositivo de ensayo se monta típicamente en un instrumento para la lectura de la absorbancia de la luz; por ejemplo, la intensidad de color, mediante reflectancia, antes de la aplicación de la muestra. Se mide la absorbancia en ciertos momentos a lo largo del tiempo después de la aplicación de la muestra. En esta aplicación la absorbancia se refiere no solamente a la luz dentro de la banda de la longitud de onda visible sino también fuera de la banda de la longitud de onda visible, tal como la radiación infrarroja y ultravioleta.

A partir de estas mediciones de la absorbancia puede calibrarse una tasa de desarrollo de color en términos de nivel de analito.

El instrumento de medición

Puede conseguirse que un instrumento adecuado, tal como un espectrofotómetro de reflectancia difusa con software adecuado, lea automáticamente la reflectancia en ciertos momentos a lo largo de un período de tiempo, calcule la tasa de cambio de la reflectancia y, utilizando factores de calibración, emita el nivel de analito en el fluido acuoso. Dicho dispositivo se muestra esquemáticamente en la figura 2 en la que se presenta un dispositivo de ensayo de la invención que comprende un respaldo 12 al cual se fija la almohadilla 11 de reactivo. Una fuente 5 de luz, por ejemplo un diodo emisor de luz (LED) de alta intensidad, proyecta un rayo de luz sobre la almohadilla de reactivo. Una parte substancial (al menos el 25%, preferiblemente al menos el 35% y más preferiblemente al menos el 50% en ausencia de producto de reacción) de esta luz, que se refleja de forma difusa desde la almohadilla de reactivo, es detectada por un detector 6 de luz, por ejemplo un fototransistor que produce una corriente de salida proporcional a la luz que recibe. La fuente 5 de luz y / o el detector 6 de luz pueden adaptarse para generar o responder a una longitud de onda en particular, si se desea. La salida del detector 6 se pasa al amplificador 7, por ejemplo, un circuito integrado lineal que convierte la corriente del fototransistor en una tensión. La salida del amplificador 7 puede suministrarse a un circuito 8 de muestreo y almacenaje. Esto es una combinación de un circuito integrado lineal / digital que muestrea o efectúa el seguimiento de la tensión analógica del amplificador 7 y, cuando recibe un comando del microprocesador 20, bloquea y mantiene la tensión en su nivel en ese momento. Un convertidor 19 analógico - digital toma la tensión analógica del circuito 8 de muestreo y almacenaje y la convierte, por ejemplo, en un número binario de 12 bits cuando recibe un comando del microprocesador 20. El microprocesador 20 puede ser un circuito integrado digital. Sirve para las siguientes funciones de control: 1) la sincronización del sistema completo; 2) la lectura de la salida del convertidor 19 analógico - digital; 3) junto con la memoria 21 de programa y de datos, almacena los datos que se corresponden con la reflectancia medida a intervalos de tiempo especificados; 4) calcula los niveles de analito a partir de las reflectancias almacenadas y 5) envía los datos de concentración del analito a un dispositivo 22 de visualización. La memoria 21 puede ser un circuito integrado digital que almacena los datos y el programa operativo del procesador. Un dispositivo 22 de notificación puede tomar la forma tanto de un soporte permanente como de un soporte temporal. Habitualmente es una pantalla de visualización, tal como una pantalla de cristal líquido o una pantalla de LED, pero también puede ser una impresora de cinta, una señal audible o formas similares. El instrumento también puede incluir un conmutador de inicio - detención y puede suministrar una indicación de tiempo audible o visible para indicar los momentos para la aplicación de las muestras, la toma de lecturas, etc, si se desea.

Conmutador de reflectancia

El circuito de reflectancia mismo puede utilizarse para iniciar el cronometraje midiendo la caída en la reflectancia que se produce cuando la parte acuosa de la solución en suspensión aplicada a la almohadilla de reactivo (por ejemplo, sangre) migra hacia la superficie en la cual se está midiendo la reflectancia. Típicamente, el dispositivo de medición se activa en un modo "preparado" en el cual las lecturas de reflectancia se efectúan automáticamente a intervalos de tiempo separados y cercanos entre sí (típicamente aproximadamente 0,2 segundos) a partir la tira de reactivo sin reaccionar, básicamente seca, de un blanco poco intenso. La medición inicial se efectúa típicamente antes de que el fluido que está siendo analizado penetre en la matriz pero puede efectuarse después de que se haya aplicado el fluido en una posición sobre el elemento reactivo diferente de la posición desde la cual se está midiendo la reflectancia. El microprocesador evalúa el valor de reflectancia, típicamente almacenando valores sucesivos en la memoria y luego comparando cada valor con el valor inicial sin reaccionar. Cuando la solución acuosa penetra en la matriz de reactivo, la caída de la reflectancia señala el inicio del intervalo de tiempo de medición. Pueden utilizarse caídas de reflectancia de entre un 5% y un 50% para iniciar el cronometraje, típicamente una caída de aproximadamente el 10%. De esta forma simple se efectúa una sincronización exacta del medio de ensayo que alcanza la superficie desde la cual se toman las mediciones y la iniciación de la secuencia de lecturas, sin necesidad de intervención del usuario.

Aunque los sistemas totales descritos en esta solicitud se dirigen particularmente al uso de matrices de poliamida y particularmente al uso de dichas matrices en la determinación de la concentración de diferentes azúcares, tales como la glucosa y otros materiales de origen biológico, no se necesita limitar el aspecto de conmutación de reflectancia de la invención a dichas matrices. Por ejemplo, la matriz utilizada con conmutación de reflectancia puede estar formada de cualquier material hidrófilo insoluble en agua y con cualquier otro tipo de ensayo de reflectancia.

Aplicación particular al análisis de la glucosa

Ahora se dará un ejemplo particular con respecto a la detección de la glucosa en la presencia de glóbulos rojos para destacar ventajas particulares con mayor detalle.

El uso de superficies de poliamida para formar el elemento reactivo suministra un número de características deseables en la presente invención. Estas son que el elemento reactivo es hidrófilo (es decir, recoge fácilmente el reactivo y la muestra), no se deforma cuando se humedece (de manera que suministre una superficie plana para la lectura de la reflectancia), es compatible con enzimas (para impartir una buena autoestabilidad), recoge un volumen limitado de muestra por unidad de volumen de membrana (lo que es necesario para dejar constancia de una banda dinámica extensa de mediciones) y muestra una resistencia suficiente en estado húmedo como para permitir su fabricación en serie.

En una configuración típica, el procedimiento se lleva a cabo utilizando un aparato que consta de un soporte de plástico y del elemento reactivo (la matriz tiene un sistema productor de señales impregnado en la misma). La matriz preferida para su uso en la preparación del elemento reactivo es una membrana de microfiltrado de nylon, preferiblemente las membranas hechas a partir de nylon-66 fundidas sobre un núcleo de fibras de poliéster no entretejidas. Numerosas membranas de microfiltrado de nylon de este tipo se producen comercialmente por Pall Ultrafine Filtration Corporation y tienen un tamaño medio de poro de entre 0,1 y 0,3 micrones. Estos materiales muestran resistencia mecánica y flexibilidad, estabilidad dimensional después de su exposición al agua y un rápido humedecimiento.

Son posibles muchas variaciones de la estructura química específica del nylon. Estas incluyen el nylon-66 no funcionarizado con grupos terminales cargados (que se vende bajo la marca comercial "Ultipore" por Pall Ultrafine Filtration Corporation; "Pall"). Las cargas positivas predominan por debajo de un pH 6 mientras que por encima del pH 6 predominan las cargas negativas. En otras membranas el nylon se funcionaliza antes de que se forme la membrana para dar como resultado membranas con diferentes propiedades. Los nylon funcionarizados con grupos carbóxidos están negativamente cargados a lo largo de una amplia gama de pH (se venden como "Carboxidyne" por Pall). Los nylon también pueden funcionalizarse con una alta densidad de grupos positivamente cargados sobre su superficie, típicamente grupos aminos cuaternarios, de manera que muestren poca variación en la carga a lo largo de una amplia banda de pH (se venden como "Posidyne" por Pall). Dichos materiales son particularmente adecuados para la práctica de la presente invención. También es posible utilizar membranas que tengan grupos funcionales reactivos diseñados para la inmovilización covalente de proteínas (vendidas como membranas "Biodyne Immuno Affinity" por Pall). Dichos materiales pueden utilizarse para unir covalentemente las proteínas, por ejemplo enzimas, utilizadas como reactivos. Aunque todos estos materiales pueden utilizarse, un nylon que tenga una alta densidad de grupos positivamente cargados sobre su superficie suministra la mejor estabilidad de los reactivos cuando se formula en una almohadilla de reactivo seca. El nylon no funcionalizado otorga la siguiente mejor estabilidad y los nylon carboxilados la siguiente mejor estabilidad.

Pueden obtenerse resultados deseables con tamaño de poro que oscile entre aproximadamente 0,2 y 2,0 \mum, preferiblemente entre 0,5 y 1,2 \mum y más preferiblemente aproximadamente 0,8 \mum, cuando las membranas se utilizan con sangre entera.

La forma del mango sobre el cual se monta el elemento reactivo tiene relativamente poca importancia siempre y cuando permita el acceso de la muestra a un lado del elemento reactivo y de la luz incidente al lado del elemento reactivo cuya reflectancia se está midiendo. El mango también ayuda a insertar el elemento reactivo dentro del dispositivo de medición de absorbancia de forma que esté alineado con el sistema óptico. Un ejemplo de un mango adecuado es una tira de mylar u otro plástico a la cual se ha aplicado un adhesivo de transferencia tal como 3M 465 ó Y9460. Se perfora un orificio en el plástico a través del adhesivo de transferencia. Un elemento reactivo, típicamente en forma de una almohadilla fina, que bien contiene los reactivos o al cual se añaden los reactivos posteriormente, se aplica al mango por medio del adhesivo de transferencia de forma que se una firmemente al mango en la zona que rodea el orificio que ha sido perforada a través del mango y del adhesivo de transferencia. Dicho dispositivo se ilustra en la figura 1, que muestra una almohadilla 11 de reactivo unida a un mango 12 de mylar por medio de un adhesivo 13. El orificio 14 permite el acceso de la muestra o de la luz incidente a un lado 15 de la almohadilla 12 de reactivo mientras que el acceso al otro lado 16 de la almohadilla de reactivo queda sin restricción. Todas las dimensiones de la almohadilla de reactivo y del mango pueden seleccionarse de forma que la almohadilla de reactivo se acople de forma exacta en el interior del instrumento de lectura de la reflectancia en una posición próxima a una fuente de luz y a un detector de la luz reflejada.

Si se selecciona una matriz de nylon para formar la almohadilla de reactivo, cuando se emplean los grosores indicados, es preferible que la almohadilla de reactivo sea soportada por el soporte de manera que no más de 6mm, medidos en cualquier dirección, queden sin estar soportados por el soporte en la posición en la que se aplica la muestra y se mide la reflectancia de la luz. Mayores áreas no soportadas tienden a proporcionar una estabilidad dimensional inadecuada a la membrana de forma que la medición de la reflectancia de la superficie queda adversamente afectada. Un orificio 14 de 5 mm de en la tira de reactivo mostrada en la figura 1 funciona de manera bastante satisfactoria.

No hay límite particular sobre el diámetro mínimo de dicho orificio, aunque se prefieren diámetros de al menos 2 mm para facilitar la fabricación, la aplicación de la muestra y la lectura de la reflectancia de la luz.

Aunque un gran número de tintes pueden utilizarse como indicadores, la elección dependerá de la naturaleza de la muestra. Es necesario seleccionar un tinte que tenga una absorbancia a una longitud de onda diferente de la longitud de onda en la cual los glóbulos rojos absorben la luz, con sangre entera como medio de ensayo, u otros contaminantes en la solución que está siendo analizada con otro medio de ensayo. La pareja de tintes MBTH - DMAB (3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona hidrocloruro y ácido 3-diametilaminobenzoico), aunque se ha descrito previamente como adecuada para el desarrollo de color para etiquetas de peroxidasa en inmunoensayos enzimáticos, nunca se habían usado en un reactivo comercial para la medición de glucosa. Esta pareja de tintes da una mayor banda dinámica que muestra una estabilidad enzimática mejorada en comparación con los tintes tradicionales utilizados para la medición de la glucosa, tales como los derivados de la benzidina. Además, la pareja de tintes MBTH - DMAB no es cancerígena, una característica de la mayoría de los derivados de la benzidina.

Otra pareja de tintes que pueden utilizarse en la medición de la glucosa es la pareja AAP - CTA (4-amionoantipireno y ácido cromotrópico). Aunque esta pareja no suministra una banda dinámica tan amplia como la pareja MBTH - DMAB, es estable y adecuada para su uso en la práctica de la presente invención cuando se mide la glucosa. De nuevo la pareja de tintes AAP - CTA suministra una banda dinámica extendida y una estabilidad de la actividad enzimática mayor que la mayoría de los tintes de benzidina ampliamente utilizados.

El uso de la pareja MBTH - DMAB permite la corrección del hematocrito y del grado de oxigenación de la sangre con un factor de corrección simple. Los tintes de benzidina más típicamente utilizados no permiten dicha corrección. El tinte forma un cromóforo que absorbe a aproximadamente 635 nm pero no significativamente a 700 nm. Se permiten leves variaciones en las longitudes de onda de medición (aproximadamente \pm10 nm). A 700 nm puede medirse tanto el hematocrito como el grado de oxigenación midiendo el color de la sangre, además, los diodos emisores de luz (LED) están comercialmente disponibles para las mediciones tanto de 635 nm como de 700 nm, simplificando de esta manera la producción en masa del dispositivo. Utilizando el tamaño preferido de poro de la membrana descrito anteriormente y la formulación de reactivos expuesta puede corregirse el comportamiento tanto del hematocrito como de la oxigenación efectuando la medición a una longitud de onda simple de 700 nm.

Se han encontrado dos condiciones adicionales para proporcionar una estabilidad particular y una larga vida de uso a una formulación de glucosa oxidasa / peroxidasa sobre una matriz de poliamida, estas son el uso de un pH en la banda de entre 3,8 y 5,0, preferiblemente aproximadamente de entre 3,8 y 4,3, más preferiblemente de aproximadamente 4,0, y el uso de un sistema neutralizador concentrado para aplicar los reactivos a la matriz. El neutralizador más efectivo ha demostrado ser un neutralizador de citrato a un 10% del peso, con concentraciones efectivas de entre un 5% y un 15%. Estos son porcentajes de peso / volumen de la solución en la cual los reactivos se aplican a la matriz. Pueden utilizarse otros neutralizadores sobre la misma base molar. La mejor estabilidad se consiguió utilizando un pH bajo, de forma preferida aproximadamente un pH 4, un sistema de tintes MBTH - DMAB y una alta concentración enzimática de aproximadamente 500 - 1000 U/ml de solución de aplicación.

En la preparación del reactivo MBTH - DMAB y del sistema enzimático que forma el resto del sistema productor de señales, no es necesario mantener volúmenes y proporciones exactas aunque los valores sugeridos más adelante dan buenos resultados. Los reactivos son fácilmente absorbidos por la almohadilla de la matriz cuando la glucosa oxidasa está presente en una selección en aproximadamente un 27 - 54% por volumen, la peroxidasa está presente en una concentración de aproximadamente 2,7 - 5,4 mg/ml, el MBTH está presente en una concentración de aproximadamente 4 - 8 mg/ml, y el DMAB está presente en una concentración de aproximadamente 8 - 16 mg/ml. La proporción de peso de DMAB - MBTH se mantiene preferiblemente en la banda de (1 - 4) : 1, preferiblemente aproximadamente (1,5 - 2,5) : 1, más preferiblemente aproximadamente 2 : 1.

Las técnicas de fabricación básicas para el elemento reactivo, una vez establecidas, son directas. La membrana misma es fuerte y estable, particularmente cuando se selecciona una membrana de nylon de la realización preferida. Solamente son necesarias dos soluciones para aplicar el reactivo y estas soluciones se formulan fácilmente y son estables. La primera generalmente contiene los componentes del tinte y la segunda generalmente contiene las enzimas. Cuando se utiliza la pareja de tintes MBTH - DMAB, por ejemplo, los tintes individuales se disuelven en un solvente orgánico acuoso, típicamente una mezcla de 1:1 de acetonitrilo y agua. La matriz se sumerge dentro de la solución, se elimina el exceso de líquido mediante un secante y la matriz se deja secar, típicamente a 50º - 60ºC durante 10 - 20 minutos. La matriz que contiene los tintes se sumerge entonces en una solución acuosa que contiene las enzimas. Una formulación típica contendría las enzimas peroxidasa y glucosa oxidasa así como cualquier neutralizador, conservante, estabilizante o sustancia similar deseada. Entonces la matriz se trata con un secante para eliminar el exceso de líquido y se seca como en el caso anterior. Una formulación típica para el reactivo de glucosa es como sigue:

Baño de tintes

Combinar:

: 40 mg de MBATH,

: 80 mg de DMAB,

: 5 ml de acetonitrilo, y

: 5 ml de agua.

Agitar hasta que se disuelvan todos los sólidos y verter sobre una placa de vidrio u otra superficie plana. Remojar un trozo de membrana Posidyne (Pall Co.), aplicar un secante para eliminar el exceso de líquido y secar a 56ºC durante 15 minutos.

Baño de enzimas

Combinar:

: 6 ml de agua,

: 10 mg de EDTA, sal de disodio,

: 20 mg de Poly Pep, baja viscosidad, (Sigma),

: 0,668 g de citrato de sodio,

: 0,523 g de ácido cítrico,

: 2,0 ml 6% del peso de Gantrez AN 139 disuelto en agua (GAF),

: 30 mg de peroxidasa de rábano, 100 unidades/ml y

: 3,0 ml de glucosa oxidasa, 2000 unidades/ml.

Agitar hasta que se disuelvan todos los sólidos y verter sobre una placa de vidrio u otra superficie plana. Remojar un trozo de membrana previamente impregnada con los tintes, eliminar mediante secante el exceso de líquido y secar a 56ºC durante 15 minutos.

El aparato electrónico utilizado para efectuar las lecturas de reflectancia contiene, como mínimo, una fuente de luz, un detector de luz reflejada, un amplificador, un convertidor analógico-digital, un microprocesador con memoria y programa y un dispositivo de visualización.

La fuente de luz consta típicamente de un diodo emisor de luz (LED). Aunque es posible utilizar una fuente de luz policrómica y un detector de luz capaz de medir en dos longitudes de onda diferentes, un aparato preferido contendría dos fuentes LED o un diodo simple capaz de emitir luz de dos longitudes de onda distintas. Los LED comercialmente disponibles que producen las longitudes de onda de la luz descritas como preferidas en la presente memoria técnica incluyen el HLMP-1340 de Hewlett Packard con un máximo de emisión a 635 nm y el QEMT-1045 de Hewlett Packard con un máximo de emisión de banda estrecha a 700 nm. Detectores de luz adecuados comercialmente disponibles incluyen el 5874-18 K de Hammamatsu y el BPX-65 de Litronix.

Aunque son posibles otros procedimientos para la obtención de mediciones, el siguiente procedimiento ha proporcionado los resultados deseados. Las lecturas son tomadas por el fotodetector a intervalos de tiempo específicos después de que se inicie la secuencia de tiempo. El LED de 635 nm se activa solamente durante un breve espacio de tiempo de medición que se inicia aproximadamente 20 segundos después del inicio que se indica mediante el conmutador de reflectancia. Si esta lectura indica que en la muestra está presente un alto nivel de glucosa, se toma una segunda lectura a los 30 segundos y se utiliza en el cálculo final para mejorar la exactitud. Típicamente, se consideran niveles altos los que empiezan a aproximadamente 250 mg/dl. La luminosidad de fondo se corrige con una lectura de 700 nm tomada aproximadamente 15 segundos después del inicio del período de medición. La lectura del fotodetector se integra a lo largo del intervalo mientras que se activa el LED apropiado, típicamente un período inferior a 1 segundo. Las lecturas de reflectancia en bruto se utilizan entonces para los cálculos que realiza el microprocesador después de que la señal haya sido amplificada y convertida a una señal digital. Pueden utilizarse numerosos microprocesadores para llevar a cabo el cálculo. Un microordenador de tarjeta simple AIM65 fabricado por Rockwell International ha demostrado ser satisfactorio.

Los procedimientos y aparatos presentados permiten un procedimiento muy simple con un mínimo de pasos operativos a efectuar por el usuario. Durante su uso, la tira de reactivo se coloca en el detector de manera que el orificio de la tira esté alineado con la óptica del sistema detector. Un tapón separable u otro tipo de cubierta se coloca sobre la óptica y la tira para proteger el dispositivo de la luz ambiente. Entonces se inicia la secuencia de medición presionando un botón sobre el aparato medidor que activa el microordenador para tomar una medida de la luz reflejada desde la almohadilla de reactivo sin reaccionar, denominada lectura R_{dry}. Entonces se quita el tapón y se aplica una gota de sangre a la almohadilla de reactivo, típicamente mientras que la almohadilla de reactivo está alineada con la óptica y el dispositivo de lectura. Se prefiere que la tira de reactivo se esté alineada con la óptica para minimizar su manipulación. El instrumento es capaz de detectar la aplicación de la sangre o de otra muestra mediante un descenso en la reflectancia cuando la muestra pasa a través de la matriz y se mide la luz reflejada sobre el lado opuesto. El descenso en la reflectancia inicia la secuencia de tiempo que se describe en detalle en otro lugar de este memoria técnica. La cubierta debe ser colocada de nuevo dentro de los 15 segundos después de la aplicación de la muestra, aunque este tiempo puede variar dependiendo del tipo de muestra que se está midiendo. Los resultados se presentan típicamente aproximadamente 30 segundos después de la aplicación de la sangre cuando se está midiendo una muestra de glucosa en sangre, aunque puede permitirse una reacción de 20 segundos para muestras de glucosa que tengan una concentración de glucosa inferior a 250 mg/dl. Si se están midiendo otras muestras, los tiempos adecuados para la presentación de los resultados pueden diferir y pueden determinarse fácilmente a partir de las características de los reactivos y muestras seleccionados.

Puede efectuarse una evaluación particularmente exacta del nivel de glucosa (o de cualquier otro analito que esté siendo medido) utilizando la corriente de fondo, es decir, la corriente del fotodetector activado pero sin luz reflejada desde la almohadilla de reactivo, para efectuar una corrección de la luminosidad de fondo. Se ha demostrado que a lo largo de un período de 2 - 3 meses este valor no cambia para un instrumento en particular, preparado de acuerdo con las realizaciones preferidas de esta memoria técnica, y es posible programar como una constante esta lectura de fondo en la memoria del ordenador. Sin embargo, con una leve modificación del procedimiento puede medirse este valor en cada análisis para obtener resultados más exactos. En el procedimiento modificado el medidor se encendería cuando se cerrase la tapa antes de que la tira de reactivo esté en su sitio y se mediría la corriente de fondo. Entonces se insertaría la tira de ensayo dentro del medidor y con la tapa cerrada, se tomaría una medición R_{dry} y el procedimiento continuaría tal como se describió anteriormente. Con este procedimiento modificado la corriente de fondo no necesita ser estable a lo largo de la vida del medidor, suministrando de esta forma resultados más exactos. Los datos en bruto necesarios para calcular un resultado en un análisis de glucosa son la corriente de fondo denominada reflectancia de fondo, R_{b} tal como se describió anteriormente, una lectura de la tira de ensayo sin reaccionar, R_{dry}, también descrita anteriormente y una medición de punto final. Utilizando las realizaciones preferidas aquí descritas, el punto final no es particularmente estable y debe cronometrarse de forma precisa a partir de la aplicación inicial de la sangre. Sin embargo, el medidor aquí descrito realiza este cronometraje de forma automática. Para concentraciones de glucosa por debajo de 250 mg/dl, se alcanza un punto final adecuado a los 20 segundos y se toma una reflectancia final, R_{20}. Para concentraciones de glucosa de hasta 450 mg/dl, es adecuada una lectura de reflectancia de 30 segundos, R_{30}. Aunque el sistema aquí descrito muestra una buena diferenciación hasta los 800 mg/dl de glucosa, la medición es de alguna forma ruidosa e inexacta por encima de los 450 mg/dl, aunque no tanto como para provocar problemas significativos. Tiempos de reacción más largos suministrarían lecturas más adecuadas para niveles mayores de concentración de glucosa.

La lectura de la reflectancia de 700 nm para la medición de doble longitud de onda se toma típicamente a los 15 segundos (R_{15}). En este punto la sangre habrá saturado completamente la almohadilla de reactivo. Más allá de los 15 segundos la reacción del tinte continúa efectuándose y es detectada, en una pequeña parte, mediante una lectura de 700 nm. Consecuentemente, ya que la absorción del tinte por la señal de 700 nm es una desventaja, en los cálculos se ignoran las lecturas más allá de los 15 segundos.

Los datos en bruto descritos anteriormente se utilizan para calcular parámetros proporcionales a la concentración de glucosa que pueden visualizarse más fácilmente que las mediciones de reflectancia. Puede usarse una transformación logarítmica de la reflectancia análoga a la relación entre la absorcividad y la concentración de analito que se observa en la espectroscopia de transmisión (Ley de Beer), si es que así se desea. Una simplificación de las ecuaciones Kubelka-Monk, derivada específicamente para la espectroscopia de reflectancia, ha demostrado ser particularmente útil. En esta deducción K / S se relaciona con la concentración de analito definiéndose K / S por la ecuación 1.

(1)K / S \ - \ t \ - \ (1 \ - R \text{*} t)^{2} / \ (2 \ x \ R \text{*} t)

R*t es la reflectividad tomada en un momento de punto final, t, en particular y es la fracción absorbida del rayo de luz incidente descrita por la ecuación 2, en donde R_{t} es la reflectancia de punto final, R_{20} o R_{30}.

(2)R \text{*} t \ - \ (R_{t} \ - \ R_{b}) / (R_{dry} \ - R_{b})

R*t varía desde 0 para ausencia de luz reflejada (R_{b}) hasta 1 para la luz totalmente reflejada (R_{dry}). El uso de la reflectividad en los cálculos simplifica gratamente el diseño del medidor ya que una fuente altamente estable y un circuito de detección se tornan innecesarios desde el momento que estos componentes son monitorizados con cada medición de R_{dry} y R_{b}.

Para una lectura de longitud de onda simple K / S puede calcularse a los 20 segundos (K / S - 20) o a los 30 segundos (K / S - 30). Las curvas de calibración que relacionan estos parámetros con las mediciones de glucosa de YSI ("Yellow Springs Instruments") pueden describirse de forma precisa mediante la ecuación polinómica de tercer orden esbozada en la ecuación 3.

(3)YSI = a_{O} + a_{1} (K / S) + a_{2} (K / S)^{2} + a_{3} (K / S)^{3}

Los coeficientes para estos polinomios se listan en la Tabla 1.

TABLA 1 Coeficientes para el ajuste polinómico de tercer orden de las curvas de calibración de longitud de onda simple

	K / S – 20	K / S – 30

a_{0}	-55,75	-55,25
a_{1}	0,1632	0,1334
a_{2}	-5,765 x 10^{-5}	-2,241 x 10^{-5}
a_{3}	2,58 x 10^{-8}	1,20 x 10^{-8}

La especie química simple que se mide en las realizaciones preferidas es el tinte de indamina MBTH - DMAB y la matriz compleja que está siendo analizada es sangre entera distribuida sobre una membrana de Posidina 0,8 \mu. Una reseña titulada "Application of Near Infra Red Spectrophotometry to the Non-destructive Analysis of Foods: A Review of Experimental Results" (La aplicación de la espectrofotometría cercana al infrarrojo al análisis no destructivo de alimentos: una reseña de los resultados experimentales, "CRC Critical Reviews in Food Sciencie and Nutrition", 18(3) 203 - 30 (1983), describe el uso de instrumentos basados en la medición de una diferencia de densidad óptica \DeltaOD (\gamma_{a} - \gamma_{b}) en donde OD\gamma_{a} es la densidad óptica de la longitud de onda que se corresponde con la absorción máxima de un componente a determinar y OD\gamma_{b} es la densidad óptica a la longitud de onda en la que el mismo componente no absorbe de forma significativa.

El algoritmo para la medición de la longitud de onda doble es por necesidad más complejo que para la medición de longitud de onda simple pero es mucho más potente. La corrección de primer orden aplicada a la lectura de 700 nm es una substracción simple del color de fondo debido a la sangre. Para efectuar esta corrección, puede determinarse una relación entre la absorbancia a 635 nm y a 700 nm debido al color de la sangre y se determinó midiendo muestras de sangre con 0 mg/dl de glucosa a lo largo de una amplia banda de color de la sangre. La banda de color se construyó variando el hematocrito y se observaron de forma clara relaciones lineales. A partir de estas líneas se normalizó K / S - 15 a 700 nm para dar equivalencia a K / S - 30 a 635 nm. Esta relación pone de manifiesto en la ecuación 4, en la que K / S - 15n es K / S - 15 normalizada a 700 nm.

(4)K / S - 15n = (K / S - 15 x 1,54) - 0,133

Debe observarse que la equivalencia de la señal de 700 nm normalizada y la señal de 335 nm es solamente verdadera con un nivel de glucosa igual a 0. Las expresiones a partir de las cuales se derivaron las curvas de calibración vienen definidas por las ecuaciones 5 y 6.

(5)K / S - 20 / 15 = (K / S - 20) - (K / S - 15n)

(6)K / S - 30/15 = (K / S - 30) - (K / S - 15n)

Estas curvas como mejor se conforman es mediante ecuaciones polinómicas de cuarto orden similares a la ecuación 3, a la cual se añade un término de cuarto orden en K / S. Los coeficientes de adaptación para el ordenador para estas ecuaciones se relacionan en la tabla 2.

TABLA 2 Coeficientes para la adaptación polinómica de cuarto orden de curvas de calibración de longitud de onda doble

	K / S – 20/15	K / S – 30/15

a_{0}	-0,1388	-1,099
a_{1}	0,1064	0,05235
a_{2}	6,259 x 10^{-5}	1,229 x 10^{-4}
a_{3}	6,12 x 10^{-8}	-5,83 x 10^{-8}
a_{4}	3,21 x 10^{-11}	1,30 x 10^{-11}

También se ha desarrollado una corrección de segundo orden para eliminar los errores debidos a los efectos de la cromatografía. Las muestras de bajo contenido de hematocrito tienen de forma característica lecturas de 700 nm bajas en comparación con muestras con un mayor contenido de hematocrito con la misma lectura de 635 nm. Cuando se traza la relación (K / S - 30) / (K / S - 15) frente a K / S - 30 a lo largo de una amplia banda de hematocritos y concentraciones de glucosa, la línea resultante sobre el gráfico indica el límite entre las muestras que presentan efectos de cromatografía (por encima de la curva) y aquellas que no (por debajo de la curva). Los K / S - 30 para las muestras por encima de la curva se corrigen elevando la lectura para corresponderse con un punto sobre la curva con la misma (K / S - 30) / (K / S -15).

Los factores de corrección indicados anteriormente se adaptaron para ajustarse a un instrumento simple y a un número limitado de preparaciones de reactivo. El algoritmo puede optimizarse para un instrumento y un reactivo individuales de la misma forma que se describió anteriormente.

En resumen, usando la presente invención, el sistema antes descrito minimiza las acciones del operador y suministra numerosas ventajas frente a los procedimientos de lectura de la reflectancia de la técnica anterior. Cuando se compara con los procedimientos anteriores para la determinación de la glucosa en sangre, por ejemplo, existen varias ventajas evidentes. Primero, la cantidad de muestra que se requiere para saturar la almohadilla fina de reactivo es pequeña (típicamente entre 5 y 10 microlitros). Segundo, el tiempo que necesita el operador es solamente el necesario para aplicar la muestra en la capa hidrófila fina y cerrar la tapa (típicamente entre 4 y 7 segundos). Tercero no se necesita un inicio simultáneo de cronometraje. Cuarto, puede utilizarse sangre entera. El procedimiento no necesita ninguna separación o utilización de muestras libres de glóbulos rojos y de forma similar puede utilizarse con otras muestras profundamente coloreadas.

Algunas ventajas poco obvias se desprenden como resultado del uso de la presente invención con sangre entera. Normalmente, las soluciones acuosas (como la sangre) penetrarán en una membrana hidrófila para dar como resultado una capa de líquido sobre el lado opuesto de la membrana, una superficie que entonces no es adecuada para la medición de la reflectancia. Sin embargo, se ha descubierto que la sangre, aparentemente a causa de las interacciones de los glóbulos rojos y las proteínas de la sangre con la matriz, humedecerá la matriz de poliamida sin que un exceso de líquido penetre en la matriz porosa hasta el grado de interferir con la lectura de la reflectancia sobre el lado opuesto de la matriz.

Además, se esperaría que las membranas finas utilizadas en la presente invención, cuando se humedeciesen, transmitiesen luz y devolviesen solamente una señal débil al dispositivo de medición de la reflectancia. Los conocimientos anteriores generalmente indicaban que era necesaria una capa reflectante detrás de la matriz para reflejar suficiente luz. En otros casos se ha colocado una almohadilla blanca detrás de la almohadilla de reactivo antes de la medición del color. En el caso actual, no se necesitan ni una capa reflectante ni una almohadilla blanca. De hecho, la invención se desarrolla típicamente con una superficie absorbente de luz detrás del elemento reactivo cuando la luz incidente se hace incidir sobre la matriz. Utilizando una superficie absorbente de luz detrás del elemento reactivo, acoplada con la medición de la reflectancia en dos longitudes de onda diferentes, se permite la obtención de mediciones aceptables de la reflectancia sin la eliminación del exceso de líquido de la matriz, eliminando de esta forma un paso que era típicamente necesario en los procedimientos anteriores.

La invención se describirá ahora de forma general, la misma se entenderá mejor mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos que se presentan solamente con propósitos ilustrativos y no deben considerarse limitativos de la invención a menos que así se especifique.

Ejemplo I Reproducibilidad

Se utilizó una muestra de sangre de un varón (JG, hematrocrito - 45) para recoger los datos de reproducibilidad que se ponen de manifiesto en las tablas 3 - 5.

TABLA 3 Reproducibilidad de un sistema MPX de longitud de onda simple

	Promedio (mg/dl)	S.D. (mg/dl)	%C.V.
YSI (mg/dl)	20 seg.	30 seg.	20 seg.	30 seg.	20 seg.	30 seg.

25	23,1	23,0	2,1	2,04	9,1	9,0
55	53,3	53,2	3,19	3,32	6,0	6,3
101	101	101	3,0	3,3	3,0	3,3
326	326,6	327	13,3	9,8	4,1	3,0
501		503		17,1		3,4
690		675		28		4,15
810		813		37		4,5

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Reproducibilidad de un sistema MPX de longitud de onda doble

	Promedio (mg/dl)	S.D. (mg/dl)	%C.V.
YSI (mg/dl)	20 seg.	30 seg.	20 seg.	30 seg.	20 seg.	30 seg.

25	25	27	1,34	1,55	5,4	5,7
55	55	57,4	2,58	2,62	4,7	4,6
101	101	101,5	2,55	2,18	2,5	2,1
326	332	330	15,0	7,1	4,5	2,1
501		505		21,3		4,2
690		687		22,8		3,3
810		817		30,4		3,7

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Reproducibilidad de una abertura de diámetro de 3,0 mm

	%C.V.
YSI (mg/dl)	47 mm	3,0 mm

55 – 100	4,8	4,9
300	3,0	5,0
600	3,8	5,5
Promedio	\overline{3,9}	\overline{5,1}

La sangre se dividió en partes alícuotas y se cargó con glucosa a lo largo de una banda de 25 - 800 mg/dl. Se efectuaron 20 determinaciones en cada nivel de ensayo de glucosa a partir de tiras tomadas al azar entre una muestra de 500 tiras (lote FJ4 - 49B). Los resultados de este estudio tienden hacia las siguientes conclusiones:

1.: Longitud de onda simple frente a doble: El C.V. promedio para el resultado para longitud de onda doble a 30 segundos fue 3,7% frente a 4,8% para el resultado de longitud de onda simple a los 30 segundos, una mejora de un 23% a lo largo de la banda de glucosa de 25 - 810 mg/dl. Hubo una mejora del 33% en el C.V. en la banda de glucosa de 25 - 326 mg/dl. Aquí el C.V descendió del 5,4% al 3,6%, una mejora significativa en la banda más utilizada. La medición de la longitud de onda doble a los 20 segundos dio mejoras similares en el C.V en comparación con la medida de la longitud de onda simple en la banda de 25 - 325 mg/dl (tablas 3 y 4).

2.: Longitud de onda doble, resultado a los 20 segundos frente a los 30 segundos: El C.V promedio para un resultado a los 20 segundos en la banda 25 - 100 mg/dl es casi idéntico a la lectura a los 30 segundos, 4,2% frente a 4,1%. Sin embargo, con 326 mg/dl la lectura a los 30 segundos tiene un C.V de 2,1% y a los 20 segundos se obtuvo un C.V de 4,5%. Como se vio en la curva de respuesta de K / S - 20, la pendiente comienza a disminuir de forma aguda por encima de 250 mg/dl. Esto tiende a una reproducibilidad pobre a niveles de glucosa superiores a 300 para el resultado a los 20 segundos. A partir de estos datos de producibilidad el corte para el resultado a los 20 segundos está en algún lugar entre 100 y 326 mg/dl. Posteriormente se determinó un corte de 250 mg/dl a partir de los resultados del estudio de recuperación puestos de manifiesto en el ejemplo II.

3.: Tamaño de abertura: Se investigó un menor tamaño de abertura de la óptica 3,0 mm a 5,0 minutos. Una experimentación inicial utilizando una muestra de disco empapado a mano de replicación 10 mostró C.V mejorados con la abertura de 3,0 mm, aparentemente a causa de una confrontación más fácil con la óptica del sistema. Sin embargo, cuando se utilizó una membrana de rollo hecha a máquina, el C.V promedio (tabla 5) de la abertura más grande, 4,7 mm, fue de 3,9% frente a un C.V promedio para la abertura de 3,0 mm de 5,1%. Este incremento del 30% del C.V probablemente se debió a la superficie desigual del lote de membrana en rollo tal como se discutirá más adelante.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo II Recuperación

Para la comparación del presente procedimiento (MPX) con un procedimiento típico de la técnica anterior utilizando un analizador de glucosa modelo 23A de "Yellow Springs Instruments" fabricado por "Yellow Springs Instruments Co.", Yellow Springs, Ohio (YSI), se analizó la sangre de 36 donantes. Los donantes se dividieron por igual entre hombres y mujeres y se clasificaron por hematocrito entre el 30% y el 55%. Las muestras de sangre se utilizaron dentro de las 30 horas siguientes a su recogida con heparina de litio como anticoagulante. Cada muestra de sangre se dividió en partes alícuotas y se cargo con glucosa para dar como resultado 152 muestras en la banda de entre 0 - 700 mg/dl de glucosa. Cada muestra se analizó por duplicado hasta un total de 304 puntos de
datos.

Se construyeron curvas de respuesta a partir de estos datos y entonces se calcularon los valores de glucosa utilizando la ecuación apropiada (tablas 1 y 2). Entonces se trazaron estos valores de glucosa MPX frente a los valores YSI para obtener diagramas de dispersión.

Comparación de sistemas MPX: Para tiempos de medición tanto de 20 segundos como de 30 segundos visualmente hay más dispersión en los diagramas de dispersión de longitud de onda simple que en los diagramas de dispersión de longitud de onda doble. La lectura a los 20 segundos se vuelve muy dispersa por encima de 250 mg/dl, pero la medida a los 30 segundos no tiene una dispersión amplia hasta que el nivel de glucosa es >= 500 mg/dl.

Estos diagramas de dispersión se cuantificaron determinando la desviación de YSI a diferentes bandas de glucosa. Se obtuvieron los siguientes resultados.

TABLA 6 Exactitud del MPX a partir de los datos recuperados

Longitud de	Tiempo de	S.D. (mg/dl)	C.V. para la banda*
onda MPX	medición (seg.)	0-50	50-250	250-450	450-7

Simple	20	\pm 5,6	7,2	14,5	-
Simple	30	\pm 6,9	7,1	8,8	10,2

Doble	20	\pm 2,3	5,3	12,8	-
Doble	30	\pm 2,19	5,5	5,8	8,4

Nota: Estos son los C.V. de procedimientos intermedios.
a. \begin{minipage}[t]{140mm}El sistema de longitud de onda doble dio C.V. que oscilaron un 30% menos que el sistema de longitud de onda simple.\end{minipage}
b. \begin{minipage}[t]{140mm}El sistema de longitud de onda simple, desde 0 - 50 mg/dl, mostró un S.D. de \pm 6 - 7 mg/dl mientras que el S.D. para una medición de longitud de onda doble fue solamente \pm 2,2 mg/dl.\end{minipage}
c. \begin{minipage}[t]{140mm}El corte para una medición MPX de 30 segundos es 250 mg/dl. Para la banda de 50 - 250 mg/dl las mediciones tanto de 20 como de 30 segundos dieron C.V. de procedimientos intermedios similares (aproximadamente un 7% para longitud de onda simple, 5,5% para longitud de onda doble). Sin embargo, en la banda de 250 - 450 mg/dl el C.V. de procedimientos intermedios fue mayor del doble para la lectura de 20 segundos hasta un 14,5% para longitud de onda simple y un 12,8% para la longitud de onda doble.\end{minipage}
d. \begin{minipage}[t]{140mm}La lectura de 30 segundos fue inutilizable por encima de 450 mg/dl para la medición de longitud de onda tanto simple como doble (C.V. de 10,2 y un 8,4%).\end{minipage}

En conclusión, los dos sistemas MPX dieron una cuantificación óptima en la banda de 0 - 450 mg/dl.

1.: MPX 30 doble: Este sistema de longitud de onda doble dio un tiempo de medición de 30 segundos con un 95% de límite de certeza (definida como la probabilidad de que una medición esté dentro de 2 S.D. del YSI) del 11,3% (C.V.) para la banda entre 50 - 450 mg/dl (tabla 7) y \pm 4,4 mg/dl (S.D.) para hacer 0 - 50 mg/dl.

2.: MPX 30/20 doble: Este sistema de longitud de onda doble dio un tiempo de medición de 20 segundos en la banda de 0 - 250 mg/dl y un tiempo de 30 segundos en la banda de 250 - 450. Los límites del 95% de certeza son casi idénticos a los del sistema MPX 30 doble (tabla 7), 11,1% (C.V.) para 50 - 450 mg/dl (tabla 7) y \pm 4,6 mg/dl (S.D.) para 0 - 50 mg/dl.

TABLA 7 Comparación de los límites del 95% de certeza para MPX, Glucoscan Plus y tiras de reactivo Accu-Cjek bG*

	Longitud de onda simple MPX	Longitud de onda doble MPX
Banda de Medición mg/dl	20 seg.	30 seg.	20 seg.	30 seg.

0 - 50	11,2 mg/dl	13,8 mg/dl	4,6 mg/dl	4,4 mg/dl
50 - 250	14,4%	14,2%	10,6%	11,0%
250 - 450		17,6%		11,6%
77 - 405	\hskip0.5cm GlucoScan Plus (Drexler Clinical)	11,9%
77 - 405	\hskip0.5cm Accu-Chek bG (Drexler Clinical)	10,7%
50 - 450	\hskip0.5cm MPX 20/30 Dual Hybrid	11,1%
50 - 450	\hskip0.5cm MPX 30 Dual	11,3%

* \begin{minipage}[t]{140mm}los límites de certeza para MPX fueron de YSI. Los límites de certeza para GlucoScan Plus y Accu-Chek bG fueron de la ecuación de regresión frente a YSI que elimina la desviación debida a las pequeñas diferencias de calibración. \end{minipage}

Ejemplo III Estabilidad

La mayoría del trabajo a escala de banco efectuado para optimizar la estabilidad se completó utilizando discos de membrana de Posidyne de 0,8 \mu empapados a mano. La formulación de específica de tinte/enzima fue previamente explicada.

1.: Estabilidad a temperatura ambiente: Este estudio intentó reflejar cualquier cambio en la respuesta del reactivo de la membrana de Posidyne de 0,8 \mu almacenado a 18º - 20ºC sobre desecante de gel de sílice. Pasados 2,5 meses no hubo ningún cambio notable en la medición de la respuesta de la muestra a temperatura ambiente frente a la respuesta de una muestra almacenada a 5ºC. Cada diagrama de dispersión representaba una banda de glucosa de 0 - 450 mg/dl.

2.: Estabilidad a 37ºC: Se efectuó un estudio de estabilidad a 37ºC utilizando el mismo reactivo que en el estudio a temperatura ambiente. Se representaron las diferencias en los valores de glucosa del reactivo a 37ºC frente al reactivo a temperatura ambiente, con y sin adhesivo, a lo largo de un período de tiempo. Aunque los datos fueron ruidosos, debido a la pobre reproducibilidad de las tiras hechas a mano, la estabilidad fue excelente para las tiras sometidas o no a la acción de adhesivo.

3.: Estabilidad a 56ºC: Se efectuaron ocho estudios de estabilidad de entre 5 y 6 días utilizando diferentes preparaciones de una formulación similar sobre una membrana de disco (tabla 8). Para un nivel bajo de glucosa (80 - 100 mg/dl) el valor medio de glucosa cayó un 3,4% después de la exposición a esta temperatura, siendo la mayor caída del 9,55%. A un nivel de ensayo alto (280 - 320 mg/dl) la lectura de la glucosa disminuyó una medida del 3,4%, la mayor disminución fue del 10,0%.

TABLA 8 Estabilidad de pH = 4,0,8 Formulación de reactivo de disco de Posidyna sometida durante entre 5 y 6 días a 56ºC.

	% de diferencia (56^{o}C frente a muestra a temperatura ambiente
N^{o} de muestra	YSI (80 - 100 mg/dl)	YSI (280 - 320 mg/dl)

FJ22B	-6,25	+5,4
FJ27A	-4,0	-5,14
FJ28B	-2,4	-5,3
FJ30H	-9,55	-10,0
FJ31C	+4,43	-1,24
FJ36	-3,2	-8,5
FJ48B*	-3,0	0.0
GM48A*	\underline{\text{-}3,0}	\underline{\text{-}2,5}
Promedio de 8	-3,4	-3,4

* Estas dos muestras contenían el doble de la concentración normal de enzima y tinte.

Un estudio de la exposición a 56ºC de esta membrana a lo largo de un período de 19 días no mostró diferencias superiores para tiras con o sin adhesivo. En ambos casos la disminución a los 19 días del valor de la glucosa fue < 15% a niveles de ensayo bajos (80 - 100) y 300 mg/dl. Se completó otro estudio a 56ºC utilizando una membrana de Posidyna de 0,8 \mu empapada a mano con el doble de la concentración normal de enzima y tinte. Se constituyeron dos formulaciones separadas de la misma formulación y se midió la estabilidad a lo largo de un período de 14 días. Se representaron gráficamente el promedio de los resultados de los dos estudios. Los cambios estuvieron dentro de \pm 10% a lo largo de un período de 14 días en niveles de ensayo de glucosa tanto altos como bajos. Estos datos muestran que esta formulación es particularmente estable.

Ejemplo IV

Tamaño de la muestra:

Los requisitos de tamaño de la muestra para MPX se representaron en la Tabla 9.

TABLA 9 Efecto de tamaño de la muestra sobre las mediciones MPX

Tamaño de	Longitud de onda doble	Longitud de onda simple
la muestra
(ul)	Promedio	Promedio

YSI bajo de glucosa = 56
3	41	50	39	31	40	31	42	30	19	30
4	44	49	49	49	48	41	45	44	45	44
5	54	48	49	51	50	50	49	48	49	49
10	48	48	50	47	48	54	53	56	55	54
20	49	49	49	50	49	55	57	58	60	58

YSI alto de glucosa = 360
3	301	260	276	286	280	274	232	244	260	252
4	383	378	367	341	367	361	356	342	318	344
5	398	402	382	370	388	378	387	366	351	370
10	364	362	378	368	368	356	358	379	369	366
20	375	370	380	378	376	380	382	389	385	384

Los volúmenes mostrados en la tabla fueron transferidos a la almohadilla de reactivo mostrado en la figura 1 utilizando una micro pipeta. Cuando se aplica sangre de un pinchazo en el dedo a una tira no puede transferirse el total de la muestra, por lo tanto los volúmenes aquí mostrados no representan el tamaño total de la muestra que se necesita sacar del dedo para el análisis. Una muestra de 3 \mul es la cantidad mínima necesaria para cubrir completamente el circulo de la almohadilla de reactivo. Esto no proporciona una cantidad suficiente de muestra para saturar completamente la almohadilla de reactivo y el MPX da resultados bajos. Una muestra de 4 \mul satura escasamente la almohadilla de reactivo, mientras que una muestra de 5 \mul es claramente adecuada. Una muestra de 10 \mul es una gota grande y brillante y una muestra de 20 \mul es una gota muy grande y probablemente sólo se usará cuando se utilice sangre de una pipeta para la toma de muestras.

A una concentración baja de glucosa el resultado de longitud de onda simple es más dependiente del tamaño de la muestra lo que se elimina completamente utilizando la medición de longitud de onda doble. Aunque esta dependencia de la longitud de onda simple podría considerarse aceptable, es claramente indeseable.

Ejemplo V Reproducibilidad

Las mediciones experimentales anteriormente descritas se efectuaron siempre de forma múltiple, habitualmente 2, 3 ó 4 determinaciones por punto de entrada de datos. Estos conjuntos han mostrado siempre una concordancia minuciosa incluso para muestras con hematocritos extremos o niveles de oxígeno extremos. Los C.V. fueron adecuados por debajo del 5%. Por lo tanto, parece que la reproducibilidad es entre buena y excelente.

El sujeto de la invención suministra muchas ventajas sobre los sistemas que actualmente están comercialmente disponibles o que se han descrito en la literatura. Los protocolos son simples y necesitan pocos conocimientos técnicos y están relativamente libres de errores del operador. Los ensayos pueden llevarse a cabo rápidamente y utilizan reactivos baratos y relativamente inofensivos, consideraciones importantes para los materiales empleados en utilizaciones domésticas. El usuario obtiene resultados que son inteligibles y pueden usarse en conjunción con la terapia de mantenimiento. Además, los reactivos tienen un tiempo de vida largo, de manera que los resultados obtenidos serán fiables durante largos períodos de tiempo. El equipo es simple y fiable y substancialmente automático.

Todas las patentes y otras publicaciones específicamente identificadas con esta memoria técnica son indicativas del nivel de conocimiento práctico de aquellos con un conocimiento normal de la técnica a los cuales concierne esta invención.

Claims

1. Una tira de ensayo que no necesita ser limpiada, para medir la glucosa en una muestra de sangre entera, dicha tira de ensayo está adaptada para su uso en un aparato de medición de la reflectancia capaz de leer la reflectancia a una primera y a una segunda longitudes de onda, dicha tira de ensayo comprende:

a) una matriz porosa, hidrófila, de poliamida que tiene, sobre un lado, una superficie de recepción de la muestra adaptada para recibir dicha muestra de sangre entera y, sobre el otro lado, una superficie de medición desde la cual puede medirse la luz difusa reflejada, en la que:

: dicha superficie de medición es opuesta a dicha superficie de recepción de la muestra;

: dicha matriz es substancialmente reflectante en ausencia de muestra aplicada;

: dicha matriz contiene poros de un tamaño suficiente para permitir el flujo de una parte del líquido de dicha muestra de sangre entera al interior de la matriz desde dicha superficie de recepción de la muestra y a través de la matriz desde dicha superficie de recepción de la muestra hasta dicha superficie de medición, y

b) un medio reactivo en dicha matriz para reaccionar químicamente con la glucosa para crear un cambio en la reflectancia que puede ser observado desde la superficie de medición, dicho cambio está relacionado con la concentración de glucosa presente en dicha muestra de sangre entera, en donde:

: dicho medio reactivo comprende bien 4-aminoantipireno y ácido cromotrópico o bien ácido 3-dimetilaminobenzoico e hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona, ambos capaces de producir un producto coloreado que absorbe la luz para cambiar la reflectancia a dicha primera longitud de onda, estando dicho cambio relacionado con la concentración de glucosa y no absorbiendo la luz en la mencionada segunda longitud de onda, la segunda longitud de onda es en la que la sangre entera absorbe luz, una glucosa oxidasa y una peroxidasa.

2. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la que dicha matriz contiene poros de un tamaño suficiente para filtrar los glóbulos rojos de forma que un número significativo de glóbulos rojos no alcance dicha superficie de medición.

3. La tira de ensayo de la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en la que dicha matriz tiene un tamaño medio de poro de entre 0,2 y 2,0 \mum, preferiblemente entre 0,5 y 1,2 \mum y más preferiblemente de aproximadamente 0,8 \mum.

4. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho medio reactivo ha sido aplicado a dicha matriz en una solución que tiene un pH de entre 3,8 y 5, preferiblemente entre 3,8 y 4,3, más preferiblemente de aproximadamente 4.

5. La tira de ensayo de la reivindicación 4, en la que dicho medio reactivo comprende además un neutralizador que comprende entre un 5% y un 15% de su peso, más preferiblemente aproximadamente un 10% de su peso, de neutralizador de citrato para mantener dicho pH.

6. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la matriz comprende un nylon.

7. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha matriz comprende nylon fundido sobre un núcleo de fibras no entretejidas.

8. La tira de ensayo de la reivindicación 7, en la que dichas fibras del núcleo son fibras de poliéster.

9. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha matriz comprende una membrana.

10. La tira de ensayo de la reivindicación 9, en la que dicha membrana comprende una membrana de microfiltrado.

11. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la superficie de dicha matriz está positivamente cargada.

12. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la superficie de dicha matriz está funcionalizada con grupos aminos cuaternarios.

13. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la reflectancia de dicha matriz es tal que al menos el 50% de la luz incidente se refleja en la ausencia de muestra aplicada.

14. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha matriz tiene un grosor de entre 0,01 mm y 0,3 mm.

15. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicha primera longitud de onda es de aproximadamente 635 nm.

16. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha segunda longitud de onda es de aproximadamente de 700 nm.

17. La tira de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende además un mango unido a dicha matriz porosa para manejar dicha tira de ensayo, en donde dicho mango permite que la muestra acceda a un lado de la matriz y la luz incidente al otro lado de la matriz cuya reflectancia se está midiendo, dicho mango comprende además un orificio para aplicar dicha muestra de sangre entera a dicha superficie de recepción de la muestra.