DK167621B1 - Apparat til maaling af reflektans fra en poroes matrix indeholdende et reagens, der reagerer med en analyt - Google Patents

Description

i DK 167621 B1

Den foreliggende opfindelse angår et testudstyr til kolo-rimetrisk bestemmelse af kemiske og biokemiske komponenter (analytter) i vandige væsker, specielt fuldblod. I en foretrukken udførelsesform angår opfindelsen et testud-5 styr til kolorimetrisk måling af koncentrationen af glucose i fuldblod.

Kvantificeringen af kemiske og biokemiske komponenter i farvede vandige væsker, specielt i farvede biologiske 10 væsker som f.eks. blod og urin og biologiske væskederivater som f.eks. serum og blodplasma er af stadig stigende vigtighed. Det er vigtigt inden for den medicinske diagnose og behandling at kunne anvende sådanne bestemmelser ved en kvantificering, når patienter har været udsat for 15 terapeutiske lægemidler, giftstoffer, farlige kemikalier og lignende. I visse tilfælde er mængderne af de materialer, der skal bestemmes, enten så minimale i området mikrogram eller mindre pr. deciliter, eller så vanskelige præcist at bestemme, at det anvendte apparat er komplice-20 ret og kun kan anvendes af uddannet laboratoriepersonale.

1 dette tilfælde er resultaterne først tilgængelige i løbet af nogle timer eller dage efter prøveudtagningen. I andre tilfælde er det ønskeligt, at man kan anvende ikke-uddannede personer til at udføre undersøgelser rutinemæs- 25 sigt hurtigt og reproducerbart uden for et laboratorie, idet man skal have hurtig information.

En almindelig medicinsk test er målingen af blodglucose-niveauer hos diabetikere. Det anbefales for øjeblikket 30 diabetiske patienter at måle deres blodglucoseniveau fra 2 til 7 gange om dagen afhængig af arten og sværhedsgraden af det enkelte tilfælde. Baseret på det observerede mønster i de målte glucoseniveauer kan patienten og den behandlende læge sammen foretage justering af diæten, af 35 fysiske øvelser og insulindoseringen for bedre at kunne holde sygdommen under kontrol. En sådan information bør naturligvis være til rådighed for patienten straks.

2 UK 1 bl

En metode, der for øjeblikket anvendes i udstrakt grad i USA, anvender en testanordning af den type, der er beskrevet i USA patentskrift nr. 3 298 789. Ved denne fremgangsmåde anbringes en prøve af frisk fuldblod (typisk 5 20-40 ni) på en ethylcellulosebeklædt reagenspude inde holdende et enzymsystem, der udviser glucoseoxidase og peroxidaseaktivitet. Enzymsystemet reagerer med glucose og frigør hydrogenperoxid. Puden indeholder også en indikator, der reagerer med hydrogenperoxidet i nærværelse af 10 peroxidase til opnåelse af en farve, der er proportional i farvestyrke med prøvens glucoseindhold.

En anden populær glucosetestmetode anvender lignende kemi, men anvender i stedet for ethylcellulose-beklædte pu-15 der en vandresistent film, i hvilken enzymerne og indikatorerne er dispergeret. Et sådant system er omhandlet i USA patentskrift nr. 3 630 957.

i I begge tilfælde er prøven i kontakt med reagenspuden i 20 et vist tidsrum (typisk 1 minut). I det første tilfælde vaskes blodprøven herefter af med en vandstrøm, medens den i det andet tilfælde tørres af filmen. Reagenspuden eller filmen trykkes herefter tør og bedømmes. Bedømmelsen foretages enten ved at sammenligne den opståede farve 25 med et farvekort eller ved at anbringe puden eller filmen i et diffust reflektansinstrument til aflæsning af farve-intensitetsværdien.

Selv om de ovennævnte metoder har været anvendt til kon-30 trol af glucose i nogle år, har de dog visse begrænsninger. Den nødvendige prøve er temmelig stor for en test foretaget ved et prik i fingeren og er vanskelig at udføre for visse mennesker, hvis kapillarblod ikke hurtigt kan trykkes ud.

35

Herudover har disse metoder en fælles begrænsning sammen med andre simple kolorimetriske bestemmelser foretaget af DK 167621 B1 3 ikke faguddannet personale, at resultatet er baseret på en absolut farveaflæsning, der for sit vedkommende er relateret med den absolutte reaktionsgrad mellem prøven og forsøgsreagenserne. Den kendsgerning, at prøven skal vas-5 kes eller tørres af reagenspuden efter den målte reaktionstid, kræver, at brugeren er parat efter den nødvendige tid og kan aftøre eller afvaske på det krævede tidspunkt. Den kendsgerning, at reaktionen afbrydes ved at fjerne prøven, giver en vis usikkerhed i resultatet, spe-10 cielt når prøven foretages i hjemmet. Overvask kan give lave resultater, og undervask kan give høje resultater.

Et andet problem, der ofte eksisterer i forbindelse med simple kolorimetriske bestemmelser foretaget af ikke ud-15 dannet personale, er nødvendigheden af, at begynde en tidsbestemmelse, når blodet påføres reagenspuden. En bruger vil typisk have udført et prik i fingeren for at opnå en blodprøve og det vil derefter være nødvendigt samtidigt at påføre blodet fra fingeren på reagenspuden, me-20 dens man begynder tidstagningen med den anden hånd, hvorved det er nødvendigt at anvende begge hænder samtidigt.

Dette er specielt vanskeligt, da det ofte er nødvendigt at sikre, at tidstagningen startes i det øjeblik, blodet påføres reagenspuden. Alle tidligere kendte metoder kræ-25 ver yderligere manipulationer eller yderligere foran staltninger for at opnå dette resultat. Derfor er en simplificering af reflekstansaflæsningsinstrumenter ønskelig.

30 Tilstedeværelsen af røde blodceller eller andre farvede komponenter griber ofte ind i målingerne af disse absolutte værdier, hvilket kræver udelukkelse af røde blodceller i de to tidligere fremgangsmåder, der er mest anvendt. I udstyret i patentskrift nr. 3 298 789 forhindrer 35 en ethylcellulosemembran, at blodcellerne går ind i reagenspuden. På lignende måde forhindrer en vandresistent film i patentskrift nr. 3 630 957, at blodceller går ind.

DK 167621 B1 4 I begge tilfældene virker afrensningen eller aftørringen også for at fjerne disse potentielt interfererende blodceller inden selve målingen.

5 Der er derfor et behov for et system til afsløring af analytter i farvede væsker som f.eks. blod, der ikke kræver fjernelse af overskud af væske fra reflektansstrimme-len, fra hvilken selve reflektansaflæsningen skal foreta ges.

10

Opfindelsen tilvejebringer således et hidtil ukendt udstyr til diagnostisk undersøgelse af den i krav 1' s indledning angivne art, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

15

Ved måling tilsættes prøven, typisk fuldblod, til matrixen, der udfiltrerer store partikler som f.eks. røde blodceller, typisk med matrixen til stede i apparatet. Det signalproducerede system frembringer et produkt, der 20 yderligere forandrer matrixen reflektans, hvilken forandring kan relateres til tilstedeværelsen af en analyt i prøven.

Eksempler på det diagnostiske forsøgssystem er bestemmel-25 sen af glucose i fuldblod, hvor bestemmelsen foretages uden inteferens af blodet og uden en kompliceret forsøgsmetode, der kan påvirkes af brugerfejl.

Den foreliggende opfindelse kan beskrives lettere, når 30 der henvises til de følgende tegninger, hvor fig. 1 er en perspektivisk afbildning af en udførelsesform af testudstyret indeholdende aflæsningspuden, hvorpå den væske, der skal analyseres, påføres; 35 fig. 2 er et.skematisk blokdiagram af et apparat, der kan anvendes ved udførelsen af opfindelsen, og DK 167621 B1 5 fig. 3 er et skematisk blokdiagram af et andet apparat, der kan anvendes ved udførelsen af opfindelsen.

Den foreliggende opfindelsen tilvejebringer en forbedret 5 hurtig og simpel metodologi, der anvender et pålideligt og let anvendeligt apparat til bestemmelse af analytter som f.eks. glucose, der specielt involverer et enzymsubstrat, hvilket resulterer i frembringelsen af hydrogen-peroxid som et enzymprodukt. Målingen indebærer at man på 10 en porøs matrix påfører et ringe rumfang fuldblod, tilstrækkeligt til at mætte matrixen. Bundet til matrixen er en eller flere reagenser af et signalproducerende system, hvilket resulterer i frembringelsen af et produkt, der bevirker en begyndelsesforandring i størrelsen af matrix-15 ens reflektans. Matrixen forefindes typisk i et reflek-tansmålende apparat, når blodet tilføres. Væskeprøven trænger gennem matrixen, hvilket bevirker en begyndelsesforandring i reflektans på måleoverfladen. En aflæsning foretages én eller flere gange efter begyndelsesforan-20 dringen i reflektans for at relatere yderligere forandring i reflektansen på måleoverfladen eller i matrixen, som et resultat af dannelsen af et reaktionsprodukt med mængden af analyt i prøven.

25 Til målinger i blod, specielt glucosemålinger, anvendes typisk fuldblod som et forsøgssubstrat. Matrixen indeholder et oxidaseenzym, der frembringer hydrogenperoxid. I matrixen findes også et andet enzym, specielt en peroxidase, og et farvesystem, der frembringer et lysabsorbe-30 rende produkt sammen med peroxidasen. Det lysabsorberende produkt forandrer reflektanssignalet. Med fuldblod foretages aflæsninger på to forskellige bølgelængder, idet aflæsningen ved den ene bølgelængde anvendes til at fjerne baggrundsinteferensen forårsaget af hematocrit, blod-35 oxygenering og andre variable, der kan påvirke resultatet.

DK 167621 B1 6

Et reagenselement anvendes, der omfatter matrixen og dele af det signalproducerende system indeholdt i matrixen. Reagenselementet kan omfatte andre komponenter til specielle formål. Målingen kræver, at man tilfører et lille 5 rumfang blod, der typisk ikke er underkastet forudgående behandling (bortset fra en eventuel behandling med et an-tikoagulerende middel) til matrixen. Tidstagning af målingen aktiveres automatisk af apparatet ved at afsløre en forandring i reflektans af matrixen, når væsken træn-10 ger gennem matrixen. Forandringen i reflektans over en forud bestemt tidsperiode som et resultat af dannelsen af reaktionsprodukt relateres herefter med mængden af analyt i en prøve.

15 Den første komponent af den omhandlede opfindelse, der skal beskrives, er et reagenselement, bekvemt i form af en pude, der omfatter en inert porøs matrix og komponenten eller komponenter af et signalproducerende system, hvilket system er i stand til at reagere med en analyt 20 til frembringelse af et lysabsorberende reaktionsprodukt, der trænger ind i den porøse matrix via porer. Det signalproducerende system påvirker ikke signifikant væskestrømmen gennem matrixen.

25 For at hjælpe med aflæsningen af reflektansen foretrækkes det, at matrixen har mindst én side, der er i det væsentlige glat og flad. Typisk er matrixen udformet i en tynd folie med mindst en glat flad side. Under brugen påføres væskeprøven, der skal analyseres, på den ene side af fo-30 lien, hvorved eventuelt tilstedeværende forsøgsforbindelse går gennem reagenselementet ved hjælp af kapillar virkning, vægevirkning, strømning på grund af tyngdepåvirkningen og/eller diffusionsindvirkning. Komponenterne i det signalproducerende system til stede i matrixen vil 35 reagere til opnåelse af et lysabsorberende reaktionsprodukt. Indfaldende lys støder imod reagenselementet på et sted, der er forskellig fra det sted, hvor prøven er på- DK 167621 B1 7 ført. Lys reflekteres fra elementets overflade som diffust reflekteret lys. Dette diffuse lys opsamles og måles f.eks. ved hjælp af detektoren fra et reflektansspektro-fotometer. Mængden af reflekteret lys vil være relateret 5 med mængden af analyt i prøven, idet den sædvanligvis er en omvendt funktion af mængden af analyt i prøven.

Hver af de nødvendige bestanddele til frembringelse af reagenselementet beskrives nedenfor. Den første komponent 10 er selve matrixen.

Matrixen vil være en hydrofil porøs matrix, hvortil reagenser kan bindes kovalent eller ikke-kovalent. Matrixen vil muliggøre strømning af det vandige medium gennem ma-15 trixen. Det vil også muliggøre binding af proteinforbindelser til matrixen uden signifikant at have uheldig indvirkning på den biologiske aktivitet af proteinet f.eks. den enzymatiske aktivitet af et enzym. I den udstrækning at proteiner skal bindes kovalent, vil matrixen indeholde 20 aktive pladser til kovalent binding eller være aktiveret på kendt måde. Matrixens sammensætning vil være reflekterende og vil være af tilstrækkelig tykkelse til at muliggøre dannelsen af en lysabsorberende farve i det tomme rumfang eller på overfladen for i det væsentlige at på-25 virke matrixens reflektans. Matrixen kan være en ensartet komposition eller et overtræk på et substrat, der giver den nødvendige struktur og de nødvendige fysiske egenskaber.

30 Matrixen deformerer sædvanligvis ikke ved opfugtning, i-det den bibeholder sin oprindelige form og størrelse. Matrixen har en defineret absorptionsevne, således at det rumfang, der absorberes, kan kalibreres inden for passende grænser, idet variationer sædvanligvis holdes under 35 ca. 50%, fortrinsvis på ikke mere end 10%. Matrixen vil have en tilstrækkelig vådstyrke til at muliggøre rutinemæssig fremstilling. Matrixen vil muliggøre at ikke-kova- DK 167621 B1 8 lent bundne reagenser er forholdsvis ensartet fordelt på matrixens overflade.

Som eksempler på matrixoverflader kan nævnes polyamider, 5 specielt til prøver, der omfatter fuldblod. Polyamiderne er sædvanligvis kondensationspolymere af monomere med fra 4 til 8 carbonatomer, hvor de monomere er lactamer eller kombinationer af diaminer og di-carboxylsyrer. Andre polymerforbindelser med lignende egenskaber kan også anven-10 des. De polymere materialer kan modificeres til indførsel af andre funktionelle grupper, der tilvejebringer ladede strukturer, således at overfladen af matrixen kan være neutral, positiv eller negativ såvel som neutral, basisk eller sur. Foretrukne overflader er positivt ladede. Når 15 de anvendes med fuldblod har den porøse matrix fortrinsvis porer med en gennemsnitsdiameter i området fra ca.

0,1 til 2,0 >im, mere foretrukkent fra ca. 0,6 til 1,0 um.

En foretrukken metode ti1 at fremstille den porøse matrix 20 på er at støbe den hydrofile polymer på en kerne af ikke-vævede fibre. Kernefibrene kan være et hvilket som helst fibrøst materiale, der -cilvejebringer den beskrevne udformning og styrke som f.eks. polyesterepolyamider. Reagenset, der danner det lysabsorberende reaktionsprodukt, 25 der omtales nærmere nedenfor, findes i matrixens porer, men blokerer ikke matrixen, således at væskedelen af forsøgssubstratet som f.eks. det blod, der skal analyseres, kan flyde gennem porerene på matrixen, medens partikler som f.eks. erythrocyter fastholdes på overfladen.

30

Matrixen er i det væsentlige reflekterende, således at den giver en diffus reflektans uden anvendelse af en reflekterende baggrund. Fortrinsvis reflekteres mindst 25%, mere foretrukken mindst 50% af det indfaldne lys påført 35 matrixen og udsendes som diffus reflektans. En matrix på mindre end ca. 0,5 mm tykkelse anvendes sædvanligvis, idet fra 0,01 til 0,3 mm er det foretrukne. En tykkelse DK 167621 B1 9 på fra 0,1 til 0,2 mm er det mest foretrukne, specielt for en nylonmatrix.

Typisk vil matrixen være knyttet til en holder for at gi-5 ve den fysisk form og stivhed, skønt dette ikke er nødvendigt. Fig. 1 viser en udførelsesform af opfindelsen, hvor en tynd hydrofil matrixpude 11 er anbragt ved den ene ende af en plastholder 12 ved hjælp af et klæbemiddel 13, der direkte og kraftigt fastholder reagenspuden til 10 håndtaget. Et hul 14 findes i plastholderen 12 i det område, hvortil reagenspuden 11 er fastgjort, således at prøven kan påføres på den ene side af reagenspuden og lys reflekteres fra den anden side.

15 En væskeprøve, der skal undersøges, påføres puden 11.

Hvis det f.eks. er blod, der skal undersøges, vil rea- 2 genspuden være af størrelsesordenen ca. 10 mm til 100 2 2 2 mm i overfladeareal, specielt 10 mm til 50 mm i areal, hvilket normalt er et rumfang, som 5-10 mikroliter af 20 prøven vil mere end mætte.

Diffuse reflektansmålinger af kendt art er typisk blevet foretaget under anvendelse af en reflekterende belægning knyttet til eller anbragt bag matrixen. En sådan belæg-25 ning er ikke nødvendig og vil normalt ikke forefindes i forbindelse med den omhandlede opfindelse, enten som en del af reagenselementet eller reflektansapparatet.

Som det vil fremgå af fig. 1 fastholder understøttelsen 30 reagenspuden 11, således at en prøve kan påføres den ene side af reagenspuden, medens lysreflektansen måles fra den anden side af reagenspuden modsat det sted, hvor prøven er påført.

35 Fig. 2 viser et system, hvori reagenset er påført siden med hullet i støttehåndtaget, medens lys reflekteres og måles på den anden side af reagenspuden. Andre udformnin- 10 DK Ί67621 Bl ger end den afbillede kan anvendes. Puden kan have forskellig udformning afhængig af de definerede grænser. Puden vil være tilgængelig på mindst én overflade og sædvanligvis to overflader.

5

Det hydrofile lag (reagenselementet) kan være knyttet til understøttelsen på almindelig måde f.eks. ved hjælp af en holder, klemme eller klæbemidler; imidlertid er en fore-trukken fremgangsmåde, at det er bundet af støtten. Bin-10 dingen kan foretages med et hvilket som helst ikke reaktivt klæbemiddel, ved termisk behandling, hvor støttens overflade smeltes tilstrækkeligt til at indeslutte noget af det materiale, der anvendes som det hydrofile lag eller ved hjælp af mikrobølge- eller ultralydsbindingsmeto-15 der, der ligeledes sammenkobler den hydrofile prøvepude med støtten. Det er vigtigt, at bindingen er således, at den ikke i det væsentlige griber ind i de diffuse reflek-tansmålinger eller den reaktion, der skal måles, skønt dette sandsynligvis ikke forekommer, da der ikke behøver 20 være noget klæbemiddel til stede på det sted, hvor aflæsningen foregår. F.eks. kan klæbestoffet 13 påføres støttestrimmelen 12 først efterfulgt af udstandsning af hullet 14 i den kombinerede strimmel og klæbemiddel og herefter påføre reagenspuden 11 til klæbestoffet i nærheden 25 af hullet 14, således at omkredsen af reagenspuden knyttes til støttestrimmelen.

Et hvilket som helst signalproducerende system kan anvendes, der er i stand til at reagere med analytten i prøven 30 til frembringelse (enten direkte eller indirekte) af en forbindelse, der er karakteristisk absorptiv ved en bølgelængde forskellig fra den bølgelængde, ved hvilket forsøgssubstratet i det væsentlige absorberer.

35 Polyamidmatrixer er specielt værdifulde til at udføre reaktioner, hvor et substrat (analytten) reagerer med et oxygenforbrugende oxidaseenzym på en sådan måde, at der 11 DK 167621 B1 frembringes et produkt, der yderligere reagerer med et farvestofmellemprodukt til dannelse enten direkte eller indirekte af en farve, der absorberer i et forud bestemt bølgelængdeområde. F.eks. kan et oxidaseenzym oxidere et 5 substrat og frembringe hydrogenperoxid som reaktionsprodukt. Hydroperoxidet kan herefter reagere med et farvestofmellemprodukt eller precursor ved en katalyseret eller ikke-katalyseret reaktion til frembringelse af en oxideret form af mellemproduktet eller præcursoren. Dette 10 oxiderede materiale kan frembringe det farvede produkt eller reagere med en anden præcursor til dannelse af den endelige farve.

Ikke-begrænsende eksempler på analyser og typiske reagen-15 ser omfatter følgende materialer angivet nedenfor.

20 25 30 35 12 DK 16762Ί B1

Analytter og prøvetyper Reagenser

Glucose i blod, serum, Glucoseoxidase, urin eller andre biolo- peroxidase og en oxygen- 5 giske væsker, vin, frugt- acceptor safter eller andre farvede vandige væsker. Fuldblod Oxygenacceptorer omfatter: er en særlig foretrukken O-dianisidin (1) prøvetype. O-toluidin 10 0-tolidin (1)

Benzidin (1) 2,2'-azinodi-(3-ethylbenz-thiazolinsulfonsyre-(6)) (1) 15 3-methyl-2-benzothiazoli- nonhydrazon plus N,N-di-methylanilin (1)

Phenol plus 4-aminophena-zon (1) 20 Sulfoneret 2,4-dichlor- phenol plus 4-amino-phena-zon (2) 3- methyl-2-benzothiazoli-nonhydazon plus 3-(dime- 25 thylamino)benzoesyre (3) 2-methoxy-4-allylphenol (4) 4- aminoantipyrindimethyl-anilin (5) 30 35 DK 167621 B1 13 (1) Som angivet i Clinical Chemistry, Richterich og Co-lumbo, p. 367 og referencer omtalt deri (2) Analyst, 97, (1972) 142-5 5 (3) Anal. Biochem. 105, (1980) 389-397 (4) Anal. Biochem, 79, (1977) 597-601 10 (5) Clinica Chemica Acta, 75, (1977) 387-391. Der henvises herved til alle ovenstående referencer.

Analysemetoden hviler på en forandring i absorbans, en måling af diffus reflektans, der er afhængig af mængden 15 af tilstedeværende analyt i den prøve, der skal undersø ges. Denne forandring kan bestemmes ved at måle forandringen i absorbans af forsøgsprøven mellem to eller flere tidspunkter.

20 Det første trin i undersøgelsen er påførsel af prøven til matrixen. I praksis udføres en analyse på følgende måde: Først opnås en prøve af vandig væske indeholdende en ana lyt. Blod kan f.eks. opnås ved prik i en finger. Et overskud over mætning af matrix i det område, hvor reflektan-25 sen skal måles (dvs. 5-10 microliter) af denne væske påføres reagenselementet eller elementerne i testudstyret. Samtidig start af tidstagning er ikke nødvendigt (hvad der er almindeligt i de tidligere kendte metoder), hvilket vil blive nærmere beskrevet nedenunder. Overskud af 30 væske kan fjernes f.eks. ved let aftrykning, men en sådan fjernelse er heller ikke nødvendig. Testudstyret er typisk anbragt i et instrument til aflæsning af lysabsor-bans dvs. farveintensitet ved hjælp af reflektans inden påførsel af prøven. Absorbansen måles på visse tidspunk-35 ter efter påførsel af prøven. Absorbans i nærværende beskrivelse er ikke alene lys inden for det synlige bølgelængdeområde men også uden for det synlige bølgelængdeom- 14

Ulv Ib/bZ I b l råde som f.eks. infrarød og ultraviolet stråling. Fra disse målinger af absorbans kan en bedømmelse af farveud-vikling kalibreres udtrykt som analytmængde.

5 Et passende instrument som f.eks. et diffust reflektans-spektrofotometer med passende soft ware kan indstilles til automatisk at aflæse reflektansen på visse tidspunkter, beregne forandring i reflektans og under anvendelse af kalibreringsfaktorer beregne mængden af analyt i den 10 vandige væske. En sådan anordning er skematisk vist i fig. 2, hvor et omhandlet forsøgsudstyr består af en støtte 12, hvortil reagenspuden 11 er fastgjort som vist. Lyskilden 5, f.eks. en højintensitetslysemitterende diode (LED) kaster en lysstråle på reagenspuden. En væsentlig 15 del ((mindst 25%, fortrinsvis mindst 35% og foretrukkent mindst 50%, uden reaktionsprodukt) af dette lys reflekteres diffust fra reagenspuden og afsløres af lysdetektoren 15 f.eks. en fototransistor, der frembringer en effektstrøm, der er proportional med det modtagende lys.

20 Lyskilden 14 og 14' og/eller detektoren 15 kan eventuelt tilpasses til at frembringe eller svare på en speciel bølgelængde. Udladningen fra detektoren 15 går gennem forstærkeren 16 f.eks. et lineært integreret kredsløb, der omdanner fototransistorstrømmen til en spænding.

25 Outputet af forstærkeren 16 kan føres til "track and hold circuit" 17. Dette er en kombination af et linært/digi-talt integreret kredsløb, der sporer eller følger den analoge sending fra forstærkeren 16 og efter befaling fra mikroprocessoren 20 låser eller fastholder spændingen på 30 niveauet på det pågældende tidspunkt. Analog-til-digital konverteren 19 tager den analoge spænding fra "track and hold circuit" 17 og omdanner det f.eks. til 12-bit binære digitaltal efter styring af en mikroprocessor 20. Mikroprocessoren 20 kan være et digitalt integreret kredsløb.

35 Det tjener følgende kontrolfunktioner: 1) timing af hele systemet; 2) aflæsning af outputet af analog/digitalkonverteren 19; 3) sammen med program og datahukommelse 21 DK 167621 B1 15 lagring af resultater svarende til den målte reflektans til forudfastlagte tider; 4) beregning af analytniveauer ud fra de lagrede reflektanser og 5) angivelse af analyt-koncentrationsdata til displayet 22. Hukommelsen 21 kan 5 være et digitalt integreret kredsløb, der lagrer data og mikroprocessoroperationsprogrammet. Rapporteringsanord ningen 22 kan have forskellige hard copy eller soft copy-former. Sædvanligvis er det et visuelt display som f.eks. et flydende krystal eller LED display, men det kan også 10 være en printer eller et hørligt signal eller lignende. Instrumentet kan omfatte en start-stop kontakt og kan tilvejebringe et høreligt eller synligt tidssignal for at indikere tider til påførsel af prøve, udførsel af aflæsninger og lignende, dersom dette ønskes.

15 I det omhandlede apparat kan selve reflektanskredsløbet anvendes til at påbegynde tidstagning ved at måle fald i den reflektans, der forekommer, når den vandige del af suspensionsopløsningen påføres reagenspuden (f.eks. blod) 20 og vandrer til den overflade, ved hvilken reflektansen måles. Typisk er måleanordningen indstillet på "parat", ved hvilken reflektansaflæsninger automatisk foretages med tætte intervaller (typisk ca. 0,2 sekunder) fra den typisk off-white, i det væsentlige tørre, uomsatte rea-25 gensstrimmel. Den første måling foretages typisk inden gennemtrængning af matrix med væsken, der skal analyseres, men kan foretages efter væsken er blevet påført på et sted på reagenselementet, hvor der ikke måles reflektans. Reflektansværdien bedømmes af mikroprocessoren, ty-30 pisk ved at lagre efter hinanden følgende værdier i hukommelsen og herefter sammenligne hver værdi med den oprindelige uomsatte værdi. Når den vandige opløsning trænger gennem reagensmatrixet, signalerer faldet i reflektans starten af måletidsperioderne. Fald i reflektansen 35 på 5-50% kan anvendes til at begynde tidstagning, typisk et fald på ca. 10%. På denne enkle måde er der en nøjagtig synkronisering af forsøgssubstratet, der når overfla- UK ib/bZI ΒΊ 16 den, hvorfra målingen tages, og begyndelsen af rækken af aflæsninger, uden at der skal foretages noget af brugeren.

5 Skønt hele det beskrevne system specielt er rettet på anvendelsen af polyamidmatrixer og specielt på anvendelsen af sådanne matrixer til at bestemme koncentrationen af forskellige sukkerater, som f.eks. glucose og andre materialer af biologisk oprindelse, er der intet behov for at 10 begrænse det reflektansregistrerende aspekt af opfindelsen til disse matrixer. F.eks. kan den anvendte matrix med reflektansregistrering består af et hvilket som helst vanduopløseligt hydrofilt materiale og en hvilken som helst anden type reflektanstest.

15

Et særligt eksempel med hensyn til at afsløre glucose i nærvær af røde blodceller vil nu blive beskrevet for at større detaljer og særlige fordele kan påpeges. Skønt dette repræsenterer en foretrukken udførelsesform for den 20 omhandlede opfindelse er opfindelsen ikke begrænset til afsløring af glucose i blod.

Anvendelsen af polyamidoverflader til dannelse af reagenselementet giver en række ønskelige egenskaber. Disse 25 er, at reagenselementet er hydrofilt (dvs. optager reagenset og prøven let), ikke deformeres under befugtning (således at der tilvejebringes en flad overflade til re-flektansaflæsning), er forenelig med enzymer (for at opnå god lagerstabilitet), optager et begrænset prøverumfang 30 pr. enhed rumfang af membranen (nødvendigt for at vise en forøget dynamisk række målinger), og at det viser tilstrækkelig vådstyrke, der muliggør rutinemæssig fremstilling.

35 I en typisk udformning udføres målingen under anvendelse af et apparat, der består af en plastholder og reagenselementet (matrixen indeholdende det signalproducerende DK 167621 B1 17 system imprægneret heri). Den foretrukne matrix til fremstilling af reagenselementet er en nylonmikrofiltrerings-membran, specielt membraner fremstillet ud fra nylon-66 støbt på en kerne af ikke-vævede polyesterfibre. Adskil-5 lige nylonmikrofiltreringsmembraner af denne art frem bringes kommercielt af Pall Ultrafine Filtration Corporation med en gennemsnitsporestørrelse på fra 0,1 til 3,0 mikron. Disse materialer udviser mekanisk styrke, fleksibilitet og dimensionsstabilitet, når de udsættes for vand 10 og hurtig opfugtning.

Mange variationer i den særlige kemiske opbygning af nylon er mulig. Disse omfatter ufunktionaliseret nylon-66 med ladede endegrupper (solgt under handelsnavnet "Ulti-15 pore" af Pali Ultrafine Filtration Corporation; (Pali®). Positive ladninger dominerer under pH 6, medens negative ladninger dominerer over pH 6. I andre membraner er nylonen funktionaliseret, inden membranen er dannet til opnåelse af membraner med forskellige egenskaber. Nylon funk-20 tionaliseret med carboxygrupper er negativt ladede over et bredt pH område (forhandlet som "Carboxydyn" af Pali®). Nylon kan også være funktionaliseret med en stor tæthed af positivt ladede grupper på dens overflade, typisk kvaternære amingrupper, således at nylonen udviser 25 lille variation i ladning over et bredt pH område (solgt som Posidyn® af Pali). Sådanne materialer er specielt velegnede til udførsel af fremgangsmåden ved målingen.

Det er også muligt at anvende membraner, der indeholder reaktive funktionelle grupper beregnet til kovalent immo-30 bilisering af proteiner (solgt som Biodyne Immuno Affi-nity-membraner af Pali). Disse materialer kan anvendes til kovalent at binde proteiner f.eks. enzymer anvendt som reagenser. Skønt alle disse materialer er anvendelige giver nylon med stor tæthed af positivt ladede grupper på 35 overfladen heraf den bedste stabilitet af reagenser, dersom der formuleres til en tør reagenspude. Ufunktionaliseret nylon giver den næstbedste stabilitet med carboxy- DK ib/bZi Bl 18 lerede nylonarter som de bedste herefter.

Ønskede resultater kan fås med porestørrelser, der ligger fra ca. 0,2-2,0 am, fortrinsvis ca. 0,5-1,2 um og mere 5 foretrukkent ca. 0,8 am, dersom der anvendes fuldblod.

Udformningen af håndtaget, på hvilket reagenselementet er samlet, er forholdsvis uden betydning, så længe som håndtaget muliggør tilgang til den ene side af reagenselemen-10 tet for prøven og til den anden side af reagenselementet for det indfaldende lys, hvis reflektans skal måles. Håndtaget hjælper også til at indføre reagenselementet i det absorbansmålende udstyr, således at det passer med det optiske system. Et eksempel på et passende håndtag er 15 en mylar- eller anden plaststrimmel, hvortil et overfør-selsklæbemiddel som 3M 365 eller Y9460 overførselsklæbemiddel er påført. Et hul udstandses i plasten gennem overførselsklæbemidlet. Et reagenselement, typisk i form af en tynd pude, der enten indeholder reagenser eller 20 hvortil reagenser senere skal sættes, påføres herefter håndtaget ved hjælp af overførselsklæbemiddel, således at det er fast knyttet til håndtaget i det område, der omgiver hullet, der er udstandset gennem håndtaget og overførselsklæbemidlet. En sådan anordning er vist i fig. 1, 25 der viser reagenspuden 11 fastgjort til et mylarhåndtag 12 ved hjælp af klæbemidlet 13. Hullet 14 muliggør tilførsel af prøven eller det indfaldende lys til den ene side af reagenspuden 11, medens adgang til den anden side af reagenspuden er ubegrænset. Alle dimensioner af rea-30 genspuden og håndtaget kan udvælges, således at reagens-puden passer snævert i det reflektansaflæsende instrument tæt ved en lyskilde og en detektor for reflekteret lys.

Dersom en nylonmatrix vælges til dannelse af reagenspu-35 den, når den angivne tykkelse anvendes, foretrækkes det, at reagenspuden er understøttet af en holder på en sådan måde, at ikke mere end 6 mm målt i en hvilken som helst DK 167621 B1 19 retning er uunderstøttet af holderen på det sted, hvor prøven påføres og lysreflektansen måles. Større ikke understøttede arealer har en tendens til at give utilstrækkelig dimensionsstabilitet til membranen, således at må-5 linger af reflektansen fra overfladen påvirkes i uheldig retning. Et 5 mm diameter hul 14 i reagenstrimmelen vist i fig. 1 virker udemærket.

Der er ingen speciel begrænsning med hensyn til minimum-10 diameteren af et sådant hul, skønt diametre på mindst 2 mm foretrækkes af hensyn til fremstillingen, prøvetilførslen og aflæsningen af lysreflektansen.

Skønt en række farvestoffer kan anvendes som indikatorer, 15 vil valget afhænge af prøvens art. Det er nødvendigt at udvælge en farve, der har en absorbans ved en bølgelængde, der er forskellig fra bølgelængden, ved hvilken røde blodceller absorberer lys, med fuldblod som prøvemediet, eller andre forurenende bestanddele i den opløsning, der 20 skal analyseres, med andre forsøgmedier. MBTH-DMAB farvestofkoblingen (3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydro-chlorid og 3-dimethylaminobenzoesyre), har, skønt den tidligere er beskrevét som velegnet til farvefrembring-ning for peroxidasermærker i enzymimmunoforsøg, aldrig 25 været anvendt i et kommercielt glucosemålende reagens.

Denne farvekobling giver større dynamisk område og viser forbedret enzymatisk stabilitet i forhold til traditionelle farver, dér anvendes til glucosemåling som f.eks. benzidinderivater. Yderligere er MBTH-DMAB farvekoblingen 30 ikke carcinogen, en egenskab ved de fleste af benzidinderi va terne.

En anden farvekobling, der kan anvendes til måling af glucose, er AAP-CTA (4-aminoantipyren og kromotropsyre) 35 koblingen. Skønt denne kobling ikke giver så bredt et dynamisk område som MBTH-DMAB, er den stabil og velegnet til anvendelse ved udførsel af den omhandlede opfindelse, 20 DK Ί6762Ί ΒΊ når der måles glucose. Atter giver AAP-CTA farvekoblingen et udvidet dynamisk område og et større enzymatisk aktivitetsstabilitet end de mere almindeligt anvendte benzi-dinfarver.

5

Anvendelsen af MBTH-DMAB koblingen muliggør korrektion af hematocrit og graden af oxygenering af blodet med en enkel korrektionsfaktor. De mere typisk anvendte benzidin-farver muliggør ikke en sådan korrektion. Farven danner 10 en chromophor, der absorberer ved omtrent 635 nm, men ikke i nogen betydelig grad ved 700 nm. Små variationer i målebølgelængder (+ ca. 10 nm) er mulige. Ved 700 nm kan både hematocrit og oxygeneringsgraden måles ved at måle blodfarven. Yderligere er lysemitterende dioder (LED) 15 kommercielt tilgængelige for både 635 nm og 700 nm målinger, hvorved masseproduktion af udstyret simplificeres.

Ved at anvende den foretrukne membranporestørrelse beskrevet ovenfor og den omhandlede reagensformulering kan både hematocrit og oxygeneringstilstanden korrigeres ved 20 at måle ved den enkelte 700 nm bølgelængde.

To yderligere betingelser viste sig at give speciel stabilitet og lang lagerbestandighed for et glucoseoxidase/-peroxidasepræparat på en polyamidmatrix. Anvendelsen af 25 et pH i området 3,8 til 5,0, fortrinsvis ca. 3,8 til 4,3, foretrukkent ca. 4,0, og anvendelsen af et koncentreret puffersystem for at påføre reagenserne^ på matrixen. Den mest effektive puffer viste sig at være 10 vægt-% citratpuffer med koncentrationer på fra 5 til 15% som værende 30 effektive. Disse er vægt/rumfang-% af opløsningen, hvori reagenserne påføres matrixen. Andre puffere kan anvendes på samme molære basis. Størst stabilitet opnåedes under anvendelse af et lavt pH, fortrinsvis ca. pH 4, et MBTH-DMAB farvesystem og en høj enzymkoncentration på omtrent 35 500-1000 enheder/ml påført opløsning.

21 DK 167621 B1 Når man skal fremstille MBTH-DMAB regenset og enzymsystemet, der udgør resten af det signalproducerende system, er det ikke nødvendigt at opretholde nøjagtige rumfang og forhold, skønt de nedenfor antydede værdier giver gode 5 resultater. Reagenser absorberes let af matrixpuden, dersom glucoseoxidase forefindes i en opløsning på ca. 27-54 rumfang-%, peroxidasen forefindes i en koncentration på ca. 2,7-5,4 mg/ml, MBTH findes i en koncentration på ca.

2-8 mg/ml og DMAB findes i en koncentration på ca. 8-16 * 10 mg/ml. DMAB-MBTH vægtforholdet holdes fortrinsvis i området (1-4):1, fortrinsvis ca. (1,5-2,5):1 og foretrukkent ca. 2:1.

Den grundliggende fremstillingsmetode for reagenselemen-15 tet er, når først den er fastlagt, ligetil. Membranen selv er stærk og stabil, specielt dersom en nylonmembran af den foretrukne udførelse vælges. Kun to opløsninger er nødvendige for at påføre reagenset, og disse opløsninger kan let fremstilles og er stabile. Den første indeholder 20 generelt farvekomponenterne og den anden generelt enzymerne. Når man anvender MBTH-DMAB farvekoblingen f.eks. opløses de enkelte farver i et vandigt organisk opløsningsmiddel, typisk en 1:1 blanding af acetonitril og vand. Matrixen dyppes i opløsningen, overskud af væske 25 fjernes ved aftryk på filtrerpapir, og matrixen tørres herefter, typisk ved 50-60 °C i 10-20 minutter. Matrixen indeholdende farverne dyppes derefter i en vandig opløsning indeholdende enzymerne. Et typisk præparat indeholder peroxidase og glucoseoxidaseenzymerne såvel som en 30 eventuelt udvalgt puffer, konserveringsmidler, stabilisator og lignende. Matrixen aftrykkes herefter for at fjerne overskud af væske og tørres som beskrevet tidligere.

En typisk formulering for glucosereagenset er følgende: 35 22

UIV ΙΟ/ΟΖ I D I

Farveopløsning

Bland:

40 rag MBTH 80 mg DMAB

5 5 ml acetonitril og 5 ml vand

Omrør alle faste bestanddele indtil de er opløst, og udhæld på en glasplade eller anden plan overflade. Dyp et 10 stykke posidynmembran (Pall Co.), aftryk overskydende væske og tør ved 56 °C i 15 minutter.

Enzymopløsning

Bland: 15 6 ml vand 10 mg EDTA, dinatriumsalt, 200 mg Poly Pep, lav viskositet (Sigma) 0,668 g natriumcitrat 0,523 g citronsyre 20 2,0 ml 6 vægt-% Gantrez AN-139 opløst i vand (GAF) 30 mg pebberrodsperoxidase, 100 enheder/mg og 3,0 ml glucoseoxidase, 2000 enheder/ml.

25 Der omrøres indtil alt fast materiale er opløst og udhældes på en glasplade eller anden plan overflade. Dyp et stykke af membranen, der forud er imprægneret med farvestof, aftryk overskydende væske og tør ved 56 °C i 15 minutter .

30

Det elektroniske apparat, der anvendes til at foretage reflektansaflæsninger, indeholder mindst en lyskilde, en reflekterende lysdetektor, en forstærker, en analog til digitalkonverter, en mikroprocessor med hukommelse og 35 program og et display.

DK 167621 B1 23

Lyskilden består typisk af en lysemitterende diode (LED).

Skønt det er muligt at anvende en polychrom lyskilde og en lysdetektor, der er i stand til at måle ved to forskellige bølgelængder, vil et foretrukkent apparat inde-5 holde 2 LED kilder eller en enkelt diode, der er i stand til at udsende to distinkte bølgelængder af lys. Kommercielt tilgængelige LED-kilder, der frembringer bølgelængder af lys som beskrevet, og som foretrækkes i forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter en Hewlett 10 Packard HLMP-1340 med et emissionsmaksimum ved 635 nm og Hewlett Packard QEMT-1045 med en snævert emissionsmaksimum ved 700 nm. Kommercielt tilgængelige passende lysdetektorer omfatter en Hammamatsu 5874-18K og Litronix BPX-65.

15

Skønt andre metoder til optagelse af målinger er mulige, giver følgende metode de ønskede resultater. Aflæsninger optages med fotodetektoren på særlige tidspunkter efter at tidsmålingen er begyndt. 635nm LED er kun tilsluttet 20 under en kort måletid, der begynder omtrent 20 sekunder efter starttiden, som registreres ved reflektansændring.

Hvis denne aflæsning indikerer, at et højt glucoseniveau forefindes i prøven, foretages en 30 sekunders aflæsning og anvendes til slutberegning for at forbedre nøj-25 agtigheden.

Typisk høje niveauer antages at begynde ved ca. 250 mg/dl. Baggrunden korrigeres med en 700 nm aflæsning optaget ca. 15 sekunder efter start af måleperioden. Aflæs-30 ningen fra fotodetektoren integreres over tidsrummet, hvor den pågældende LED er aktiveret, hvilket typisk er mindre end 1 sekund. De ukorrigerede reflektansaflæsninger anvendes herefter til beregninger udført af mikroprocessoren efter at signalet er forstærket og omdannet til 35 et digitalsignal. Adskillige mikroprocessorer kan anven des til at udføre denne beregning. En AIM65 enkeltkort mikrocomputer fremstillet af Rockwell International har vist sig at være tilfredsstillende.

24 UK 1b/bZ1 bl

Den omhandlede fremgangsmåde og apparat muliggør en særdeles simpel målemetode med minimum arbejdstrin for bru-5 geren. Når man bruger opfindelsen anbringes reagensstrimmelen i detektoren, således at hullet i strimmelen passer nøjagtigt med de optiske dele af detektionssystemet. Aftageligt lukke eller andet låg anbringes over de optiske dele og strimmelen for at beskytte apparatet mod det om-10 givende lys. Målingerne begyndes herefter ved at trykke på en knap på måleapparatet, der aktiverer mikrocomputeren til at tage en måling af reflekteret lys fra den uomsatte reagenspude, betegnet en aflæsning. Herefter fjernes beskyttelsen og en dråbe blod påføres reagenspu-15 den, typisk mens reagenspuden er nøjagtig ud for de optiske dele og aflæsningsanordning. Det foretrækkes, at reagenstrimmelen efterlades tæt ved de optiske dele for at formindske håndtering. Instrumentet er i stand til at føle tilførslen af blod eller anden prøve ved hjælp af en 20 nedgang i reflektansen, når prøven går gennem matrixen og det reflekterede lys måles på den modsatte side. Nedgang i reflektansen starter en tidsinddeling, der er beskrevet detaljeret andet sted i beskrivelsen. Dækket bør genanbringes i løbet af 15 sekunder for samme prøve, skønt 25 denne tid kan variere afhængig af den type prøve, der må les. Resultater kan typisk aflæses omtrent 30 sekunder efter blodtilførsel, dersom en blodglucoseprøve skal måles, skønt 20 sekunders reaktionstid er mulig for gluco-seprøver, der indeholder koncentrationer af glucose på 30 mindre end 250 mg/dl. Dersom andre prøver skal måles, kan passende tider til aflæsning af resultatet variere og kan let bestemmes ud fra egenskaberne af det udvalgte rea-gens/prøve.

35 En særlig nøjagtig bedømmelse af glucosemængden (eller en hvilken som helst anden analyt, der skal måles) kan foretages under anvendelse af baggrundsstrømmen, dvs. strøm- DK 167621 B1 25 men fra fotodetektoren tilsluttet, men med intet lys reflekteret fra reagenspuden, for at foretage en baggrundskorrektion. Det har vist sig, at over en 2-3 måneders periode forandrer denne værdi sig ikke for et specielt in-5 strument fremstillet ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen, og det er muligt at programmere denne baggrundsaflæsning ind i computerhukommelsen som en konstant. Med en lille modifikation af fremgangsmåden kan denne værdi imidlertid måles ved hver analyse for at opnå 10 mere akkurate resultater. Ved den modificerede metode er måleapparatet slået til med låget lukket, inden reagensstrimmelen er på plads, og baggrundsstrømmen kan måles. Herefter indføres forsøgsstrimmelen i måleapparatet med låget lukket, og R^ målingen foretages, og proceduren 15 fortsætter som beskrevet tidligere. Med den modificerede fremgangsmåde behøver baggrundsstrømmen ikke at være stabil gennem hele måleapparatets levetid, hvorved der fås mere nøjagtige resultater.

20 De ubehandlede data nødvendige for at beregne et resultat ved en glucosetest er en baggrundsstrøm angivet som bag-grundsreflektans, R^ som beskrevet ovenfor; en aflæsning for den uomsatte forsøgsstrøm, , også som beskrevet ovenfor og en slutmåling. I en foretrukken udførelsesform 25 beskrevet nærmere er slutpunktet ikke specielt stabilt og må præcist tidsbestemmes ud fra den første tilførsel af blod. Imidlertid udfører måleanordningen som beskrevet tidligere denne tidsbestemmelse automatisk. For glucose-koncentrationer under 250 mg/dl opnås et passende stabilt 30 slutpunkt i løbet af 20 sekunder, og en slutreflektans R20 0P^a9es· For glucosekoncentrationer indtil 450 mg/dl er en 30 sekunds reflektansaflæsning, R^q passende. Skønt systemet beskrevet heri udviser god differentiering indtil 800 mg/dl glucose, er målingen noget støjende og uak-35 kurat over 450 mg/dl, imidlertid ikke så stor at det forårsager et alvorligt problem. Længere reaktionstider skulle give mere velegnede aflæsninger for højere koncen- DK 167621 B1 26 trationer af glucose.

700 nm reflektansaflæsningen for den dobbelte bølgelængdemåling tager typisk 15 sekunder ). På dette tids-5 punkt vil blodet fuldstændigt være trukket ind i reagenspuden. Efter 15 sekunders forløb fortsætter farvestofreaktionen med at foregå og registreres for en lille del ved en 700 nm aflæsning. Da farveabsorption ved 700 nm signalet imidlertid er en ulempe, ignoreres aflæsninger 10 efter 15 sekunder i beregningerne.

De ukorrigerede data beskrevet ovenfor anvendes til at beregne parametere proportionale med glucosekoncentratio-nen, der lettere kan visualiseres end reflektansmålinger.

15 En logaritmisk transformation af reflektans analog med forholdet mellem absorptionsgraden og analytkoncentrationen observeret ved transmissionsspektroskopi (Beer's Law) kan eventuelt anvendes. En simplificering af Kubelka-Monks ligninger, der specielt af afledt for reflektans-20 spektroskop!, har vist sig af værdi. I denne udledning er K/S relateret med analy tkoncentrat ionen, idet K/S er defineret af ligning 1.

K/S-t = (1 - R*t)2/(2 k R*t) (1) 25 * / R t er reflektansen optaget på et specielt sluttidspunkt / t og den absorberede fraktion af den indfaldende lysstråle beskrevet af ligning 2, hvor R^ er slutpunktsre-flektansen, R2Q eller R^q.

30 R*t - <Rt - Rb)/(Rary - Rfc) (2) * R t varierer fra 0 for intet reflekteret lys (R^) til 1 for totalt reflekteret lys (κ^Γϊ-)· Anvendelsen af reflek-35 tionsevnen i kalkulationerne simplificerer i høj grad udformningen af måleanordningen som en særdeles stabil kilde, og et detekteringskredsløb bliver unødvendigt, da DK 167621 B1 27 disse komponenter er kontrolleret ved hver °9 må ling.

For en enkelt bølgelængdeaflæsning kan K/S være beregnet 5 ved 20 sekunder (K/S-20) eller 30 sekunder (K/S-30). Kalibreringskurverne, der relaterer disse parametre med YSI (Yellow Springs Instruments) glucosemålinger kan præcist beskrives af trediegradsligningen angivet i ligning 3.

10 YSI = aQ + ax (K/S) + a2 (K/S)2 + a3 (K/S)3 (3)

Koefficienterne for disse polynomier er angivet i tabel 1.

15 TABEL 1

Koefficienter for trediegradspolynomiers tilpasning til enkelt bølgelængde kalibreringskurver 20 K/S-20 K/S-30 aQ -55,75 -55,25 ax 0,1632 0,1334 a2 -5,765 x 10-5 -2,241 x 10'5 25 a3 2,58 x 10"8 1,20 x 10-8

Det specielle kemiske stof, der skal måles i de foretrukne udførelsesformer, er MBTH-DMBA indaminfarven, og den komplekse matrix, der skal analyseres, er fuldblod dis-30 tribueret på en 0,8 u Posidynmembran. En oversigtsartikel betegnet "Application of Near Infra Red Spectrophotometry to the Nondestructive Analysis of Foods: A Review of

Experimental Results", CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 18(3) 203-30 (1983), beskriver an-35 vendeisen af instrumenter baseret på målingen af en optisk densitetsforskel aOD (λ -λ, ) hvor ODA er den op-

a b a F

tiske densitet af bølgelængden svarende til absorptions- 28 DK 167621 B1 maksimet af en komponent, der skal bestemmes, og ODAb er den optiske densitet ved en bølgelængde, hvor samme komponent ikke absorberes signifikant.

5 Algoritmen for dobbeltbølgelængdemåling er naturnødvendig mere kompleks end for enkeltbølgelængdemåling, men er meget mere effektfuld. Den første grads korrektion anvendt på 700 nm aflæsningen er en simpelt subtraktion af baggrundsfarven på grund af blod. For at foretage denne ko-10 rrektion kan et forhold mellem absorbans ved 635 nm og 700 nm på grund af blodfarven bestemmes og blev fastlagt ved at måle blodprøven med 0 mg/dl glucose over et bredt område af blodfarve. Farveforandringen opbyggedes ved at variere hematocrit, og der observeredes forholdsvis line-15 ære sammenhænge. Ud fra disse linier normaliseredes K/S-15 ved 700 nm til opnåelse af ækvivalens med K/S-30 ved 635 nm. Dette forhold er angivet i ligning 4, hvor K/S-15n er den normaliserede K/S-15 ved 700 nm.

20 K/S-15n = (K/S-15 x 1,54) - 0,133 (4)

Bemærk at ækvivalens af det normaliserede 700 nm signal og 635 nm signal kun er sandt ved 0 glucose. Udtrykkene, hvorfra kalibreringskurverne afledtes, er definerede af 25 ligningerne 5 og 6.

K/S-20/15 = (K/S-20) - (K/S-15n) (5) K/S-30/15 = (K/S-30) - (K/S-15n) (6) 30

Disse kurver er bedst udtrykt ved hjælp af fjerdegradsligninger lig med ligning 3, hvor et fjerdegradsudtryk i K/S er tilsat. Computertilpasningskoefficienterne for disse ligninger er angivet i tabel 2.

35 DK 167621 Bl 29 TABEL 2

Koefficienter for fjerdegradspolynomiers tilpasning til dobbelt bølgelængde kalibreringskurver 5 K/S-20/15 K/S-30/15 aQ -0,1388 1,099 0,1064 0,05235 10 a2 6,259 x 10-5 1,229 x 10~4 a3 -6,12 x 10"8 -5,83 x 10"8 a4 3,21 x 10"11 1,30 x 10"11

En andengrads korrektion for at fjerne fejl på grund af 15 kromatografivirkninger er også blevet udviklet. Lave he- matocritprøver har karakteristiske lave 700 nm aflæsninger i forhold til højere hematocritprøver med den samme 635 nm aflæsning. Dersom forholdet (K/S-30)/(K/S-15) afsættes mod K/S-30 over et bredt område af hematocriter og 20 glucosekoncentrationer, viser den fremkomne linie på kurven grænsen mellem prøver, der udviser kromatografiske virkninger (over kurven) og de der ikke gør dette (under kurven). K/S-30 for prøverne over kurven er korrigeret ved at hæve aflæsningen svarende til et punkt på kurven 25 med den samme (K/S-30)/(K/S-15).

De ovenfor nævnte korrektionsfaktorer blev skræddersyet til at passe til et enkelt instrument og et begrænset antal reagenspræparater. Alogeritmen kan optimeres for et 30 enkelt instrument og reagens på samme måde som beskrevet ovenfor.

Det omhandlede system formindsker således kort sagt operationerne og tilvejebringer adskillige fordele i forhold 35 til tidligere kendte reflektansaflæsningsmetoder. Når der sammenlignes med tidligere metoder til bestemmelse af glucose i blod, er der f.eks. adskillige i øjenfaldende DK 167621 B1 30 fordele. For det første er den mængde prøve, der er nødvendig for at mætte den tynde reagenspude, ringe (typisk 5-10 ni). For det andet er den nødvendige operations tid, der kræves for at påføre prøven på det tynde hydrofile 5 lag og lukke låget (typisk 4-7 sekunder), kort. For det tredie er der ikke nogen samtidig tidsstart nødvendig.

For det fjerde kan fuldblod anvendes. Fremgangsmåden kræver ikke nogen adskillelse eller anvendelse af prøver, der ikke indeholder røde blodlegemer, og kan ligeledes 10 anvendes med andre dybtfarvede prøver.

Adskillige ikke nærliggende fordele fremkommer som et resultat ved udførsel af den omhandlede opfindelse på fuldblod. Normale vandige opløsninger (som blod) vil trænge 15 igennem en hydrofil membran til opnåelse af et væskelag på den modsatte side af membranen, en overflade der derfor ikke er velegnet til reflektansmålinger. Det har imidlertid vist sig, at blod, tilsyneladende på grund af den gensidige indvirkning mellem røde blodlegemer og pro-20 teiner i blodet med matrixen vil befugte polyamidmatrixen uden at have et overskud af væske, der trænger gennem den porøse matrix og griber ind i reflektansmålingen på den modsatte side af matrixen.

25 Yderligere ville man antage, at de tynde membraner anvendt i forbindelse med den foreliggende opfindelse, når de var våde, ville transmittere lys og kun tilbagegive et svagt signal til reflektansmåleanordningen. Tidligere litteratur har generelt angivet, at reflekterende lag er 30 nødvendige bagved matrixen for at reflektere tilstrækkeligt lys. I andre tilfælde er en hvid pude blevet anbragt bag reagenspuden inden farvemålingen. I det foreliggende tilfælde er hverken et reflekterende lag eller en hvid pude nødvendig. Faktisk udføres den omhandlede opfindelse 35 typisk med en lysabsorberende overflade bag reagenselementet, hvor indfaldende lys rammer matrixen. Under anvendelse af en lysabsorberende overflade bag reagensele- DK 167621 B1 31 mentet, koblet med måling af reflektans ved to forskellige bølgelængder, muliggøres at acceptable reflektans-målinger kan udføres uden at fjerne overskud af væske fra matrixen, hvorved man fjerner et særlig trin, der typisk 5 er nødvendig i tidligere omtalte metoder.

Opfindelsen er nu beskrevet generelt, men den beskrives nærmere i efterfølgende eksempler.

10 EKSEMPEL I

Reproducerbarhed

Blodprøve fra en mand (mærke JG, hematocrit = 45) anvend-15 tes til optagelse af reproducerbarhedsdata som angivet i tabel 3-5.

TABEL 3 20 Reproducerbarhed af enkeltbølgelængde MPX system

Gennemsnit Standardaf- Variations- * YSI (mg/dl) vigelse (mg/dl) koefficient % (mg/dl) 20 sek. 30 sek. 20 sek. 30 sek. 20 sek. 30 sek.

25 25 23,1 23,0 2,1 2,04 9,1 9,0 55 53,3 53,2 3,19 3,32 6,0 6,3 101 101 101 3,0 3,3 3,0 3,0 326 326,6 327 13,3 9,8 4,1 3,0 30 501 503 17,1 3,4 690 . 675 28 4,15 810 813 37 4,5 1

Yellow Springs Instruments; beskrivelsen af kalibre-35 ringskurver og sammenhæng med bølgelængde parametre ved YSI-glucosemålinger er omtalt tidligere.

32 DK Ίό762ί ΒΊ TABEL 4

Reproducerbarhed af dobbeltbølgelængde MPX system 5 Gennemsnit Standardaf- Variations- * YSI (mg/dl) vigelse (mg/dl) koefficient % (mg/dl) 20 sek. 30 sek. 20 sek. 30 sek. 20 sek. 30 sek.

25 25 27 1,34 1,55 5,4 5,7 10 55 55 57,4 2,58 2,62 4,7 4,6 101 101 101,5 2,55 2,18 2,5 2,1 326 332 330 15,0 7,1 4,5 2,1 501 505 21,3 4,2 690 687 22,8 3,3 15 810 817 30,4 3,7 * Yellow Springs Instruments; beskrivelsen af kalibreringskurver og sammenhæng med bølgelængde parametre ved YSI-glucosemålinger er omtalt tidligere.

20 TABEL 5

Reproducerbarhed af en 3,0 mm diameter åbning 25 variationskoefficient % YSI1 (mg/dl) 4,7 mm 3,0 mm 55-100 4,8 4,9 300 3,0 5,0 30 600 3,8 5,5

Gennemsnit 3,9 5,1 2 2

Yellow Springs Instruments; beskrivelsen af kalibreringskurver og sammenhæng med bølgelængde parametre 35 ved YSI-glucosemålinger er omtalt tidligere.

DK 167621 B1 33

Blodet opdeltes i prøver og tilsattes glucose over et område på 25-800 mg/dl. 20 bestemmelser blev optaget for hvert glucoseforsøgsniveau med strimler udtaget randomi-seret fra en 500 strimmelprøve (fabrikationsnummer FJ4-5 49B). Resultaterne af denne undersøgelse gav følgende konklusioner: 1. Enkelt mod dobbelt bølgelængde: 10 Den gennemsnitlige variationskoefficient for det 30 sekunders dobbelte resultat var 3,7% mod 4,8% for det 30 sekunders enkelte bølgelængderesultat, en forbedring på 23% over et glucoseområdet på 25-810 mg/dl.

Der fandtes en 33% forbedring i variationskoefficient 15 i 25-326 mg/dl området. Her aftog variationskoeffici enten fra 5,4% til 3,6%, en signifikant forbedring inden for det mest anvendte område. Den 20 sekunders dobbelte bølgelængdemåling gav lignende forbedring i variationskoefficient i forhold til den enkelte bølge-20 længdemåling i 25-325 mg/dl området (tabel 3 og 4).

2. Dobbelt bølgelængde, 20 i forhold til 30 sekund resultater; 25 Den gennemsnitlige variationskoefficient for et 20 se kunders resultat var i 25-100 mg/dl området næsten identisk med 30 sekundersaflæsningen, 4,2% i forhold til 4,1%. Imidlertid har ved 326 mg/dl 30 sekundsaflæsningen en variationskoefficient på 2,1% og 20 se-30 kunders resultatet en variationskoefficient på 4,5%.

Som det fremgår af K/S-20 responskurven begynder kurven at aftage skarpt over 250 mg/dl. Dette fører til dårlig reproducerbarhed ved glucoseniveauer på mere end 300 for 20 sekunders resultatet. Ud fra denne re-35 producerbarhed er resultatafskæringen for 20 sekunders resultatet et eller andet sted mellem 100 og 326 mg/-dl. En afskæring på 250 mg/dl bestemtes senere ud fra DK 167621 B1 34 resultater af genfindelsesundersøgelsen angivet i eksempel II.

3. Åbningens størrelse: 5

En mindre blændeåbningsstørrelse 3,0 mm undersøgtes.

Det indledende forsøg under anvendelse af en 10-gange hånddyppet skiveprøve viste ikke forbedrede variationskoefficienter med 3,0 mm åbning, tilsyneladen-10 de på grund af lettere registrering med de optiske de le i systemet. Dersom imidlertid maskinfremstillede valsemembraner anvendtes, var den gennemsnitlige variationskoefficient (tabel 5) af den større åbning på 4,7 mm 3,9% mod en gennemsnitlig variationskoe-15 fficient for 3,0 mm åbningen på 5,1%. Denne 30% for øgelse i variationskoefficient skyldtes sandsynligvis den uens overflade af valsemembranprøven som nærmere omtalt nedenfor.

20 EKSEMPEL II

Genfindelse:

For at sammeligne den omhandlede fremgangsmåde (MPX) i 25 forhold til en typisk tidligere metode, der anvender et Yellow Springs Instrument Model 23A glucose analysator fremstillet af Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, Ohio (YSI), undersøgtes blod fra 36 donorer. Donorerne opdeltes ligeligt mellem kvinder og mænd og lå 30 med hematocritter fra 35 til 55%. Blodprøverne anvendtes i løbet af 30 timer efter opsamling, idet der var tilsat lithiumheparin som antikoagulant. Hver blodprøve opdeltes i prøver og tilsattes glucose til opnåelse af 152 prøver i området 0-700 mg/dl glucose. Hver prøve undersøgtes 2 35 gange for ialt 304 datapunkter.

DK 167621 B1 35

Responskurver blev optegnet ud fra disse data, og herefter beregnedes glucoseværdier ud fra den korrekte ligning (tabel 1 og 2). Disse MPX glucoseværdier blev herefter afsat mod YSI værdierne til opnåelse af spredningsdia-5 grammer.

Sammenligning af MPX systemer: For både 20 sekunders og 30 sekunders målingstiderne er der visuelt mere spredning i de enkelte-bølgelængdespredningsdiagrammer end de dob-10 belt-bølgelængdespredningsdiagrammer, 20 sekunders aflæs ningen bliver meget spredt over 250 mg/dl, men 30 sekunders målingen har ikke bred spredning, indtil glucoseni-veauet er ^500 mg/dl.

15 Disse spredningsdiagrammer kvantificeredes ved at bestem me afvigelserne fra YSI inden for forskellige glucoseom-råder. Der opnåedes følgende resultater: TABEL 6 20 Nøjagtighed af MPX på grundlag af genfindelsesresultater MPX S.A. Variationskoefficient bølge- Måletid (mg/dl) for området* 25 længde (sek) 0-50 50-250 250-450 450-70 enkelt 20 +5,6 7,2 14,5 enkelt 30 +6,9 7,1 8,8 10,2 30 dobbelt 20 +2,3 5,3 12,8 dobbelt 30 +2,19 5,5 5,8 8,4 •k

Bemærkning : 35 Disse er inter-metode variationskoefficienter 36 DK 167621 B1 a. Det dobbelt bølgelængdesystem gav variationskoefficienter, der lå 30% lavere end det enkelte bølgelængdesystem.

5 b. Det enkelte bølgelængdesystem viste fra 0-50 mg/dl en standardafvigelse på +6-7 mg/dl, medens standardafvigelsen for en dobbeltbølgelængdemåling kun var +2,2 mg/dl.

10 c. Afskæringen for en 30-sekunders MPX måling er 250 mg/dl. For 50-250 mg/dl området gav både 20- og 30-sekunders målingerne lignende inter-metode variationskoefficienter (omtrent 7% for enkeltbølgelængde, 5,5% for dobbeltbølgelængde). Imidlertid mere end fordobles 15 inter-metode variationskoefficienterne i 250-450 mg/dl området for 20-sekunders aflæsningen til 14,5% for den enkelte og 12,8% for den dobbelte bølgelængde.

d. 30-sekunders aflæsningen var ikke anvendelig over 450 20 mg/dl både for den enkelte og den dobbelte bølgelæng demåling (variationskoefficienter på 10,2 og 8,4%).

Som konklusion gav to MPX systemer optimal kvantificering inden for 0-450 mg/dl området.

25 1. MPX 30 dobbelt:

Dette dobbelte bølgelængdesystem gav en 30-sekunders målingstid med en 95% konfidensgrænse (defineret som 30 sandsynligheden for en måling er inden for 2 standard afvigelser af YSI) på 11,3% (variationskoefficient) for området fra 50-450 mg/dl (tabel 7) og +4,4 mg/dl (standardafvigelse) for 0-50 mg/dl.

35 37 DK 167621 B1 2. MPX 30/20 dobbelt:

Dette dobbelte bølgelængdesystem gav en 20-sekunders målingstid i 0-250 mg/dl området og en 30-sekunders 5 målingstid for 250-450 området. 95% konfidensgrænserne var næsten identiske med MPX 30 dobbeltsystemet (tabel 7), 11,1% (variationskoefficient) for 50-450 mg/dl og +4,6 mg/dl (standardafvigelse for 0-50 mg/dl).

10 TABEL 7

Sammenligning af 95% konfidensgrænser for MPX, GlucoScan Plus og Accu-Chek bG1 reagensstrimler 15 Målings- MPX enkelt MPX dobbelt område bølgelængde bølgelængde mg/dl 20 sek. 30 sek. 20 sek. 30 sek.

0-50 11,2 mg/dl 13,8 mg/dl 4,6 mg/dl 4,4 mg/dl 20 50-250 14,4 % 14,2 % 10,6 % 11,0 % 250-450 - 17,6 % - 11,6 % 77-405 GlucoScan Plus (Drexler Clinical) 15,9 % 77-405 Accu-Chek bG (Drexler Clinical) 10,7 % 25 50-450 MPX 20/30 Dual Hybrid 11,1 % 50-450 MPX 30 Dual 11,3 % 35

Konf idensgrænserne for MPX var fra YSI. Konf idensgrænserne for GlucoScan Plus og Accu-Chek bG var fra re-30 gressionsligningen i forhold til YSI, der eliminerer skævheder på grund af små forskelle i kalibrering.

DK 167621 Bl 38 EKSEMPEL III Stabilitet; 5 Det meste af laboratoriearbejdet udført for at optimere stabiliteten blev afsluttet under anvendelse af hånddyp-pede 0,8 n Posidyn® membranskiver. Det særlige farvestof /enzympræparat var fremstillet forud.

10 1. Stabilitet ved stuetemperatur:

Denne undersøgelse blev udført for at kortlægge eventuel forandring i respons af det 0,8 μ Posidyn membranreagenset lagret ved 18-20 °C over silicageltørre-15 middel. Efter 2,5 måneders forløb kunne der ikke måles registrerbar forandring af responset af en stuetemperaturprøve i forhold til responset af en prøve, der var lagret ved 5 °C. Hvert spredningsdiagram repræsenterede et glucoseområde på 0-450 mg/dl.

20 2. Stabilitet ved 37 °C:

En 37 °C stabilitetsundersøgelse under anvendelse af samme reagens som for stuetemperatursundersøgelsen ud-25 førtes. Forskellene i glucoseværdier af reagenset lag ret ved 37 “C i forhold til stuetemperatur for strimler anbragt med og uden klæbemiddel afsattes i forhold til tiden. Skønt resultaterne var usikre på grund af den dårlige reproducerbarhed af de håndfremstillede 30 strimler var stabiliteten glimrende for strimlerne, hvad enten de var med eller uden klæbestof.

3. Stabilitet ved 56 °C; 35 Otte 5- til 6-dage stabilitetsundersøgelse udførtes under anvendelse af forskellige præparationer af et lignende præparat på skivemembran (tabel 8). For det 39 DK 167621 B1 lave glucoseforsøgsniveau (80-100 mg/dl) faldt gennem-snitsglucoseværdien ved belastning med 3,4%, idet det højeste fald var 9,55%. Ved høje forsøgsniveauer (280-320 mg/dl) aftog glucoseaflæsningen med et gennemsnit 5 på 3,4%, idet det største fald var 10,0%.

TABEL 8

Stabilitet ved pH = 4,0, 0,8 Posidyn® skivereagensformu-10 lering belastet 5-6 dage ved 56 °C.

% forskel (56 °C i forhold Prøve til stuetemperaturprøver) nr. YSI (80-100 mg/dl) YSI (280-320 mg/dl) 15 FJ22B -6,25 +5,4 FJ27A -4,0 - 5,14 FJ28B -2,4 - 5,3 FJ30H -9,55 -10,0 20 FJ31C +4,43 - 1,24 FJ36 -3,2 - 8,5 FJ48B* -3,0 0,0 GM48A* -3,0 - 2,5 25 Gennemsnit af 8 -3,4 - 3,4 * Disse to prøver indeholdt to gange den normale koncentration af enzym og farvestof.

30 En undersøgelse af 56 °C belastningen af denne membran over en 19 dages periode viste ingen afgørende forskel for strimler med eller uden klæbestof. I begge tilfælde var 19 dages nedgangen i glucoseværdien <15% for de laveste forsøgsniveauer (80-100) og 300 mg/dl.

En anden 56 °C undersøgelse under anvendelse af hånddyp-pede 0,8 μ Posidyn membraner med to gange den normale 35 DK 167621 B1 40 koncentration af enzym og farvestof udførtes. To adskilte præparationer med samme formulering blev foretaget, og stabiliteten måltes over en 14 dages periode. Gennemsnitsresultaterne af de to undersøgelser blev nedtegnet.

5 Forandringer fandtes inden for +10% over 14 dages perioden for både det høje og det lave glucoseforsøgsni-veau. Disse resultater viser, at denne formulering er særlig stabil.

10 EKSEMPEL IV

Prøvestørrelse:

Kravene til prøvestørrelse for MPX er angivet i tabel 9.

15 TABEL 9

Virkning af prøvestørrelse for MPX målinger 20 Prøve Dobbeltbølgelængde Enkeltbølgelængde størrelse gennemsnit gennemsnit (ni) _Lavglucose YSI = 56_ 1 2 41 50 39 31 40 31 42 30 19 30 25 4 44 49 49 49 48 41 45 44 45 44 5 54 48 49 51 50 50 49 458 49 49 10 48 50 47 48 54 53 56 55 54 54 20 49 49 49 50 49 55 57 58 60 58 30 _Højglucose YSI = 360_ 3 301 260 276 286 280 274 232 244 260 252 2 383 378 367 341 367 361 356 342 318 344 3 398 402 382 370 388 378 387 366 351 370 35 10 364 362 378 368 368 356 358 379 369 366 20 375 370 380 378 376 380 382 389 385 384 DK 167621 B1 41

Rumfangene angivet i tabellen overførtes til reagenspuden angivet på fig. 1 under anvendelse af en mikropipette.

Når blod fra et fingerprik overføres til en strimmel, kan hele prøve ikke overføres, hvorfor de angivne rumfang ik-5 ke repræsenterer hele prøvestørrelsen, det er nødvendigt at trykke ud af fingeren til analyse. En 3 μΐ prøve er det minimale, der er nødvendig for fuldstændigt at dække reagenspudecirklen. Dette giver ikke nok prøve til fuldstændigt at mætte reagenspuden, og MPX giver lave resul-10 tater. En 4 ul prøve mætter knapt nok reagenspuden, medens en 5 ul klart er tilstrækkelig. En 10 ul prøve er en stor skinnende dråbe og en 20 ul prøve er en meget stor dråbe og skal sandsynligvis kun anvendes, dersom blod fra en pipette anvendes til prøveudtagning.

15

Ved lave glucosekoncentrationer er det enkelte bølgelængderesultat noget afhængigt af prøvestørrelsen, der er fuldstændig fjernet under anvendelse af den dobbelt bølgelængdemåling. Skønt denne afhængighed af enkeltbølge-20 længden kan betragtes som acceptabel, er den klart utilfredsstillende .

EKSEMPEL V

25 Reproducerbarhed:

Forsøgsmålinger beskrevet oven for blev altid udført flere gange, sædvanligvis 2, 3 eller 4 bestemmelser pr. datapunkt. Disse sæt har altid vist klar overensstemmelse 30 selv for prøver med ekstreme hematocriter eller ekstreme oxygenniveauer. Variationskoefficienterne var godt og vel under 5%. Det ses derfor, at reproducerbarheden er særdeles god til glimrende.

35 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer mange fordele i forhold til de systemer, der hidtil har været kommercielt tilgængelige, eller som er blevet beskrevet i litte- DK 167621 Bl 42 raturen. Forsøgsmetoderne er enkle og kræver kun ringe teknisk erfaring og er forholdsvis uden operatørfejl. Forsøgene kan udføres hurtigt og under anvendelsen af billige og forholdsvis harmløse reagenser, hvilket er 5 vigtige betingelser for materialer, der skal anvendes i hjemmet. Brugeren opnår resultater, der kan forstås og anvendes i forbindelse med vedligeholdelsesterapi. Herudover har reagenserne lang levetid, således at de opnåede resultater er pålidelige inden for lange tidsperioder.

10 Udstyret er enkelt og pålideligt og i det væsentlige automatisk.

Alle patenter og andre artikler nævnt specielt i foreliggende beskrivelse angiver niveauet for fagmanden, og der 15 henvises herved til disse.

Det er klart for fagmanden, at der kan foretages forandringer uden at gå uden for den foreliggende opfindelses rammer.

20 25 30 35

Claims (7)

43 Patentkrav :

1. Apparat til at måle reflektans fra en porøs matrix 5 (11) indeholdende et reagens, der reagerer med en analyt, der mistænkes for at forefindes i en væskeprøve, der er anbragt på en overflade af den porøse matrix, hvor prøven kan vandre gennem den porøse matrix og reagere med reagenset, dersom analytten forefindes i prøven, hvilken ap-10 parat omfatter et hus? et indre kammer i huset; midler for adgang til det indre kammer, ad hvilke det porøse materiale kan indføres i eller fjernes fra det indre 15 kammer gennem adgangsmidlerne; midler til at udelukke lys fra at komme ind i det indre kammer gennem adgangsmidlerne; midler til at fastholde den porøse matrix i det indre kammer, hvor den porøse matrix fastholdes med en første 20 overflade tilgængelig for tilførsel af væskeprøven gennem adgangsmidlerne; midler til at belyse (fig. 1, 14 og 14') en anden overflade af den porøse matrix, når den porøse matrix fastholdes i det indre kammer, hvorhos den anden overflade er 25 forskellig fra den første overflade? midler til at detektere intensiteten af lys (fig. 2, 15) reflekteret fra den porøse matrix's anden overflade, når den porøse matrix fastholdes i det indre kammer og belyses med midler til belysning, idet detekteringsmidlerne 30 frembringer et output, der står i relation til intensiteten, kendetegnet ved, at detekteringsmidlerne for intensiteten er tilpasset til at give en række outputs, og at apparatet indeholder kontrolmidler til bearbejdning af de nævnte outputs, idet kontrolmidlerne om-35 fatter midler til at sammenligne rækken af outputs og fastlægge, om disse outputs aftager med en forud fastlagt forskel, der er tilstrækkelig til at angive, at legems- DK 167621 B1 44 væskeprøven har nået den anden overflade, hvorhos den forud fastlagte nedgang i outputs bevirker, at kontrolmidlerne påbegynder en tidstagningsperiode, der resulterer i, at en målingsaflæsning foretages fra overfladen 5 til et forud fastlagt tidspunkt efter at den anden tidstagningsperiode er påbegyndt, uden at have bestemt det tidspunkt, på hvilket legemsvæskeprøven oprindeligt blev påført den porøse matrix, og midler til at angive målingsværdien. 10

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at apparatet yderligere omfatter en selvstændig elektronisk krafttilførsel, der operationelt er forbundet med belysningsmidlerne, detekteringsmidlerne, kontrolmidlerne og 15 rapporteringsmidlerne.

3. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at belysningsmidlerne (fig. 2, 14 og 14' og fig. 2, 14) og detekteringsmidlerne (fig. 2, 15 og fig. 3, 15 og 15') 20 for lys sammen omfatter: 1. to lyskilder af forskellige bølgelængder og en enkelt lysdetektor, eller 25 2) en polykromatisk lyskilde og to detektorer begrænset til at detektere forskellige bølgelængder af lys, idet en af bølgelængderne måler en produktionsabsorbans, mens den anden bølgelængde måler en baggrundsabsor-bans. 30

4. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den første lysbølgelængde er fra 590 til 710 nm, og den anden bølgelængde er fra 625 til 645 nm.

5. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kontrolmidlerne yderligere er i stand til at indsamle og lagre en baggrundsdetektorstrømaflæsning uden lys reflek- 45 DK 167621 B1 teret fra den porøse matrix.

6. Apparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en strømforsyning, idet kontrol- 5 midlerne yderligere omfatter midler til automatisk at indsamle og sammenligne efter hinanden følgende reflek-tansmålinger fra detektormidlerne, når strøm tilføres kontrolmidlerne på en analytdetekterende måde; midler til at påbegynde et tidstagningskredsløb ved detektion af 10 nedgangen i reflektans; midler til at opsamle en reak-tionsreflektansaflæsning på et forudbestemt tidspunkt efter faldet i reflektans; midler til at beregne en værdi for koncentrationen af analyt i den væske, der analyseres ud fra reaktionsreflektansaflæsningen, og midler til at 15 overføre denne værdi til rapporteringsmidlerne.

7. Apparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at kontrolmidlerne yderligere omfatter midler til at opsamle og lagre en basisreflektansmåling fra matrixen, når strøm 20 tilføres kontrolmidlerne på en basisreflektansgivende måde inden den analytdetekteringsgivende måde og midler til at trække basisreflektansaflæsningen fra reaktionsreflek-tansaflæsningen inden beregning af denne værdi ved hjælp af kontrolmidlerne. 25 30 35