CZ292775B6 - Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje - Google Patents

Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje Download PDF

Info

Publication number
CZ292775B6
CZ292775B6 CZ19971679A CZ167997A CZ292775B6 CZ 292775 B6 CZ292775 B6 CZ 292775B6 CZ 19971679 A CZ19971679 A CZ 19971679A CZ 167997 A CZ167997 A CZ 167997A CZ 292775 B6 CZ292775 B6 CZ 292775B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
interferon
conjugate
physiologically active
polyethylene glycol
peg
Prior art date
Application number
CZ19971679A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ167997A3 (en
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Alicia Vallejo Palleroni
Original Assignee
F. Hoffmann - La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21790006&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ292775(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F. Hoffmann - La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann - La Roche Ag
Publication of CZ167997A3 publication Critical patent/CZ167997A3/cs
Publication of CZ292775B6 publication Critical patent/CZ292775B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon .alfa. obecného vzorce I, kde znamená IFN-.alfa. interferon alfa, R a R' na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, X skupinu NH nebo atom kyslíku, n a n' celá čísla, jejichž součet je 600 až 1500 a průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v konjugátu je 26 000 až 66 000, je farmaceuticky aktivní protein s antivirovým a antiproliferativním účinkem a je vhodný pro výrobu farmaceutických prostředků. Způsob jeho přípravy.ŕ

Description

Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon a, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
Oblast techniky
Vynález se týká fyziologicky aktivního konjugátu polyethylenglykol-interferon a (PEG-IFNa). Interferon, zejména interferon a2a je farmaceuticky aktivní protein s antivirovým a antiproliferativním účinkem. Interferonu se například používá k léčení leukemie vlasových buněk a sarkomu Kaposi a působí také proti hepatitidě. Ke zlepšení stálosti a rozpustnosti a ke snížení imunogenicity se farmaceuticky aktivní proteiny, jako interferon, mohou konjugovat na polymer polyethylenglykol (PEG).
Dosavadní stav techniky
Biologická dostupnost proteinových léčiv je často omezována jejich krátkým poločasem životnosti v plazmě, což brání dosažení jejich maximální klinické potence. V posledních letech se ukázalo, že biomolekuly, konjugované na PEG, mají klinicky užitečné vlastnosti (Inada a kol., J. Bioact. and Compatible Polymers 5, str. 343, 1990; Delgado a kol., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, str. 249,1992; Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, str. 91, 1993). Jako tyto vlastnosti se uvádějí fyzikální tepelná stálost, ochrana proti náchylnosti k enzymatické degradaci, zvýšená rozpustnost, delší cirkulační poločas životnosti in vivo, snížené vymizení a zlepšená potence. Uvádí se, že rozvětvené konjugáty PEG vykazují zvětšenou stálost k hodnotě pH a tepelnou stálost a větší stabilitu vůči proteolytické digesci než lineární PEG konjugáty (evropský patentový spis číslo EP-A 0 400472 a Monfardini a kol., Bioconjugate Chem. 6, str. 62, 1995). Jinými vlastnostmi proteinů PEG jsou snížená imunogenicita a antigenicita i snížená toxicita. Jiným účinkem PEGylace určitých proteinů může být snížena aktivita in vitro, doprovázená zlepšenou aktivitou in vivo. To bylo pozorováno například v případě G-CSF (Satake-Ishikawa a kol., Cell Structure and Function 17, str. 157 až 160, 1992), IL-2 (Katre a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, str. 1487, 1987), TNF-α (Tsutsumi a kol., Jpn. J. Cancer. Res 85, str. 9, 1994), IL-6 (Inoue a kol., J. Lab. Clin. Med. 124, str. 529, 1994) a CD4-IgG (Chamow a kol., Bioconj. Chem. 5, str. 133,1994).
Kromě toho se řada publikací týká různých typů konjugátů interferonu: například americký patentový spis číslo US 5 281 698 popisuje způsob přípravy aktivovaných esterů polyethylenglykolu nebo polyoxyethylovaného polyolu pro reakci s proteinem; evropský patentový spis číslo EP A 0 593868 popisuje konjugát polyethylenglykol-interferon a, který obsahuje interferon pegylovaný lineárním polyethylenglykolem; evropský patentový spis číslo EP 510356 popisuje konjugáty polyethylenglykolproteinu obsahující protein pegylovaný lineárním polyethylenglykolem; světový patentový spis číslo WO 95/13090 je zaměřen na konjugáty polyethylenglykol-interferon a, kde je polyethylenglykolový podíl vázán prostřednictvím urethanu na interferon; a světový patentový spis číslo WO 95/21629 popisuje lineární pegylované konjugáty PEG-G-CSF a PEG-INF con 1.
Americký patentový spis číslo US 5 281698 popisuje způsob přípravy aktivovaných esterů polyethylenglykolu nebo polyethylovaného polyolu. Popisuje dále reakci takových esterů s proteinem. Avšak na rozdíl od tohoto vynálezu jsou proteiny konjugované s lineárními zbytky polyethylenglykolu nebo polyethylovaného polyolu. Není nikde zmínka o rozvětvených konjugátech polyethylenglykolu jako podle vynálezu.
Evropský patentový spis číslo EP 0 593868 popisuje konjugát polyethylenglykol-interferon a, obsahující interferon pegylovaný s lineárním polyethylenglykolem. Kromě toho se tento dokument týká lineárních polyethylenglykolových reakčních činidel, polyethylenglykolaminu nebo
-1 CZ 292775 B6 polyethylenglykolalkoholu, získaných několika způsoby (str. 7 a 8), kterých může být použito k přípravě konjugátu polyethylenglykol-interferon a (str. 2 řádky 45 až 47). Polyethylenglykolové reakční činidlo se kondenzuje s jednou nebo s několika volnými aminoskupinami proteinu za získání konjugátů. V závislosti na počtu volných aminoskupin, obsažených v interferonu, může být výsledkem směs konjugátů majících různou molekulovou hmotnost (str. 5, řádka 33 až 35, str. 8 až 9 a str. 10 řádky 7 až 8). Jak je zřejmé z níže uvedené tabulky I v příkladu 3, poskytuje konjugát monopolyethylenglykol-interferon a lepší výsledky protivirového působení než konjugát polyethylenglykol-interferon a, který obsahuje dvě molekuly polyethylenglykolu.
Evropský patentový spis číslo EP 400472 popisuje způsob přípravy polyethylenglykolových reakčních činidel vysoce čistých. Uvádí, že se mohou zavádět dva polyethylenglykolové řetězce do jedné aminoskupiny proteinu jejich vázáním s disubstituovaným kyanurchloridem. Avšak polyethylenglykolové řetězce, popisované v tomto dokumentu, se používají k modifikaci velmi široké palety proteinů (viz str. 6, řádka 1 až 18), tedy také interferonů.
Evropský patentový spis číslo EP 510356 popisuje konjugáty polyethylenglykol-protein, obsahující protein pegylovaný s lineárním polyethylenglykolem.
Světový patentový spis číslo WO 96/13090 se týká konjugátů polyethylenglykol-interferon a, kde se polyethylenglykolová skupina váže na interferon prostřednictvím urethanového spojovníku. Konjugát polyethylenglykol-interferon podle vynálezu má spojovníkovou skupinu s rozvětveným řetězcem, jako je lysin. Proto jsou konjugáty podle tohoto dokumentu odlišné od konjugátů interferonu podle vynálezu.
Světový patentový spis číslo WO 95/21629 popisuje konjugáty PEG-G-CSF a PEG-IFN con 1. Opět se týká pouze lineární pegylace.
Úkolem vynálezu je vyvinout konjugáty polyethylenglykol-interferon a s vyšší účinností a s lepší využitelností, než mají konjugáty známé ze stavu techniky.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je fyziologicky aktivní konjugát PEG-IFNa obecného vzorce I,
O II ROCH2CH2(OCH2CH2)n—O-C —NH (C ^ΟΟΗ2ΟΗ2(ΟΟΗ2ΟΗ2)η’
(I), kde znamená IFN-α interferon alfa, R a R' na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, X skupinu NH nebo atom kyslíku, n a n' celá čísla, jejichž součet je 600 až 1500 a průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v konjugátu je 26 000 až 66 000. Konjugát obecného vzorce I má rozvětvenou strukturu, přičemž dva podíly polyethylenglykol (PEG) jsou vázány na protein jednoduchou vazbou.
-2CZ 292775 B6
S překvapením se totiž zjistilo, že v případě interferonu snižuje PEGylace protivirovou aktivitu in vitro, avšak zvyšuje antiproliferativní aktivitu v lidských tumorových buňkách. Avšak nový konjugát PEG interferonu podle vynálezu má překvapivé vlastnosti v tom, že antiproliferativní aktivita PEG interferonu je značně vyšší než nejenom samotného interferonu, ale i jiných PEG interferonových konjugátů. Ačkoli je antiproliferativní aktivita konjugátu značně zvýšená oproti jiným PEG interferon-α konjugátům, je přesto snížení protivirové aktivity podobné. Kromě toho PEG interferon-α konjugát podle vynálezu je neimunogenický, nevyvolává domněle žádné tvoření protilátek. Na rozdíl od toho jiné PEG interferon-α konjugáty vyvolávají omezené tvoření protilátek.
Vynález se tedy týká nové třídy PEG derivátů interferonu a (IFNa). Konjugát podle vynálezu má rozvětvenou strukturu PEG, jak dále uvedeno. Rozvětvený PEG má tu přednost, že dovoluje připojení dvou lineárních molekul PEG na osamoceném místě, čímž zdvojnásobuje hmotu připojeného PEG bez několikanásobných míst PEGylace.
Ve srovnání s nemodifikovaným IFNa (tedy IFNa bez připojeného PEG) má konjugát zvýšený cirkulační poločas životnosti a dobu prodlevy v plazmě, sníženou imunogenicitu, snížené vymizení a zvýšenou antiproliferativní aktivitu s průvodní sníženou protivirovou aktivitou in vitro. Ve srovnání s jinými konjugáty PEG-IFNa má konjugát podle vynálezu značně větší antiproliferativní aktivitu, neúměrnou se zlepšením nebo snížením, které se vyskytuje v jeho jiných vlastnostech a domněle žádnou imunogenicitu.
Druh fyziologicky aktivního konjugátu PEG-IFNa podle vynálezu má shora uvedený obecný vzorec.
Konjugát podle vynálezu má stejné použití jako IFNa, například antiproliferativní užití. Konjugáty PEG interferon-α podle vynálezu se hodí k léčení imunomodulatomích onemocnění, jako jsou neoplastická onemocnění, například leukemie vlasových buněk, CML a sarkom Kaposi a infekční onemocnění; stejně se používá IFNa (obzvláště IFNa2a) k léčení těchto nemocí. Avšak konjugát podle vynálezu má zlepšené vlastnosti včetně vynikající stálosti, větší rozpustnosti, zvýšený cirkulační poločas životnosti a dobu rezidence v plazmě. Kromě toho mají tyto konjugáty antiproliferativní aktivitu daleko větší než IFNa. Také jak už bylo uvedeno, vykazuje konjugát překvapující disociaci protivirových a antiproliferativních jevů. Tato vlastnost se přídavně hodí ke zvýšení žádoucí aktivity konjugátu při snižování nebo eliminování nežádoucí aktivity. Je-li například nežádoucí vedlejší účinek spojen s protivirovým působením, eliminace tohoto působení by eliminovala vedlejší účinek při zachování antiproliferativní aktivity. Vynález tedy proto zahrnuje také farmaceutické prostředky na bázi sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí a způsoby jejich výroby.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu, používané ke zvládnutí nebo prevenci nemocí, zahrnují interferonový konjugát obecného vzorce I a terapeuticky inertní, netoxický a terapeuticky přijatelný nosič. Používané farmaceutické prostředky mohou být formulovány a dávkovány způsobem konzistentním s dobrou lékařskou prací při uvážení léčeného onemocnění, stavu individuálního pacienta, místa podání proteinového konjugátu, způsobu podání a jiných činitelů známých z praxe.
Navrhovaným konjugátem je fyziologicky aktivní konjugát PEG IFNa obecného vzorce I, shora definovaný.
Čísla n a n' jsou volena tak, že výsledný konjugát obecného vzorce I má fyziologickou aktivitu IFNa, která může představovat stejnou, větší nebo zlomek odpovídající aktivity nemodifikovaného IFNa. Čísla n a n' mohou být stejná nebo rozdílná a představují počet jednotek ethylenglykolu v PEG. Samotná jednotka PEG OCH2CH2 má molekulovou hmotnost přibližně 44. Molekulová
-3CZ 292775 B6 hmotnost konjugátu (s vyloučením molekulové hmotnosti IFNa) závisí na číslech n a n'. Součet čísel n a n' pro konjugát obecného vzorce I je 600 až 1500, což produkuje konjugát s celkovou střední molekulovou hmotností jednotek PEG 26 000 až 66 000, s výhodou přibližně 35 000 až 45 000 a obzvláště přibližně 39 000 až 45 000, přičemž obzvlášť výhodná je molekulová hmotnost 40 000. Výhodným součtem čísel n a n'je přibližně 800 až 1200, přičemž střední součet je přibližně 850 až 1000 a výhodným součtem je 910. Každé z čísel n a n' může být jednotlivě 420 nebo 520, nebo mohou být obě 420 nebo 520, nebo mohou být obě 455. Výhodný poměr čísel n ku n' je přibližně 0,5 až 1,5 a obzvlášť výhodný je poměr přibližně 0,8 až 1,2. Molekulární hmotnost „přibližně“ určité číslo znamená, že je v rozumném rozmezí takového čísla určeného obvyklými analytickými technikami.
Výhodným konjugátem obecného vzorce I, kde IFNa je IFNa2a, je konjugát, kde symboly R a R' znamenají methylovou skupinu, konjugát, kde X je NH a konjugát kde čísla n a n' jsou každé zvlášť nebo obě buď 420 nebo 520. Takový konjugát mající všechny uvedené vlastnosti je obzvlášť výhodný.
Symboly R a R' mohou znamenat kteroukoli nižší alkylovou skupinu, čímž se míní alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je například skupina methylová, ethylová a izopropylová. Zahrnuty jsou rozvětvené alkyly. Výhodnou alkylovou skupinou je skupina methylová. Pokud jde o dvě skupiny PEG ve vzorci I, mohou být symboly R a R' stejné nebo rozdílné.
IFNa (interferonem a) a jeho druhem IFNa2a je míněn přírodní rekombinantní protein, s výhodou lidský, jak je získán z běžného zdroje jako jsou tkáně, syntézy proteinů, kultivace buněk s přírodními nebo rekombinantními buňkami. Zahrnut je každý protein mající aktivitu IFNa, jako jsou muteiny nebo jinak modifikované proteiny. Získávání a izolování IFNa z přírodních nebo rekombinantních zdrojů je dobře známo (Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221, str. 1 (1983)). Výhodným IFNa je IFNa2a, který, jak shora uvedeno, se získává známými způsoby (Pestka, Sci. Am. 249, str. 36 (1983), evropský patentový spis číslo 43980).
Fyziologicky aktivní konjugát obecného vzorce I má aktivitu IFNa, kterou se míní zlomek nebo násobek kterékoli známé aktivity IFNa, jak je zjištěna různými zkouškami známými v oboru. Zejména mají konjugáty podle vynálezu aktivitu IFNa, jak je ukázána antiproliferativním působením proti tumorovým buňkám a protivirovým působením proti buňkám infikovaným virem. To jsou známé aktivity IFNa. Taková aktivita v konjugátu může být zjištěna zkouškami dobře v oboru známými, například dále popsanými zkouškami (například Rubinstein a kol. J. Virol. 37, str. 755 (1981), Borden a kol., Canc. Res. 42, str. 4948 (1982)). Vynález se týká konjugátu obecného vzorce I, který má větší antiproliferativní působení a menší protivirové působení než nemodifikovaný IFNa.
Konjugát obecného vzorce I je vytvořen kovalentní vazbou IFNa na PEG, kteiý byl aktivován nahražením hydroxylu PEG vazební skupinou, tvořící reakční činidlo, kterým je derivát PEG esteru N-hydroxysukcinimidu (zejména monomethoxy PEG) obecného vzorce II. Reakční činidlo lze získat běžnými způsoby (Montfardini a kol.). Vazbou je amidová nebo esterová vazba. U výhodného konjugátu je vazbou amidová vazba (X je NH). Součástí vynálezu je způsob zvyšování antiproliferativní aktivity IFNa při snižování protivirové aktivity IFNa vázáním IFNa, jak shora popsáno, na reakční činidlo obecného vzorce II k vytvoření konjugátu PEG-IFN.
X znamená místo připojení na IFNa, ve kterém je reakční činidlo PEG obecného vzorce II kovalentně vázáno na IFNa. Reakční činidla se připojují k primárním aminovým skupinám (XH = NH2) například na lysin nebo na N-zakončení IFNa. Reakční činidla se mohou připojovat také na hydroxylovou skupinu (XH = OH) například na serin.
-4CZ 292775 B6
O
II
ROCH^CH^OCHzCHán —O-C—IMH
ROCHaCHgCOCHgCHa),!— o—C—NH
O
O II ROCH2CH2(OCH2CH2)n —O -C ~NH (CHjk
(I)
R'OCH2CH2(OCH2CH2)n·—O~Ο“^
O
Reakční činidlo obecného vzorce II (PEG2-NHS), kde celkem dva řetězce monomethoxy PEG (m-PEG) jsou vázány na lysin, jeden na α-aminoskupinu a druhý na epsilon-aminoskupinu karbamátovými (urethanovými) vazbami a mající lysinkarboxylovou skupinu aktivovanou na sukcinimidylester, lze získat běžnými způsoby, podle známých postupů (Montfardini a kol.) aplikovatelnými na reakční činidlo s R jako nižší alkylovou skupinou a s požadovaným číslem n. Reakční činidlo je obchodním produktem společnosti Shearwater Polymers, lne. (Huntsville, Alabama). Získaná výhodná střední molekulová hmotnost PEG je přibližně 40 000 v PEG2-NHS (jiné molekulové hmotnosti lze získat měněním čísla n u výchozích materiálů PEG-alkoholu pro reakční činidlo obecného vzorce II, běžnými způsoby).
Reakční činidlo obecného vzorce II může být konjugováno na IFNa běžnými způsoby. Specificky reaguje reakční činidlo obecného vzorce II předně s alespoň jednou primární aminoskupinou IFNa (například N-zakončení a lysinové postranní řetězce) (například IFNa2a) k vytvoření amidové vazby mezi IFNa a polymerovou kostrou PEG. PEGylační reakce může také proběhnout mezi PEG2-NHS a případnými volnými hydroxylovými skupinami (například serinem) IFNa k vytvoření esterové vazby. Reakční mechanismus je uveden shora. Podmínky reakce jsou pro pracovníka v oboru běžné a podrobně jsou vypsány dále. Reakční činidlo PEG se kombinuje s IFNa za mírně zásaditých podmínek při nízké teplotě za podmínek vhodných knukleofilní substituci, která vytvoří konjugát obecného vzorce I, jak objasňuje shora uvedený reakční mechanizmus.
Připojování reakčních činidel k IFNa lze provádět obvyklými způsoby. Použít lze PEG jakékoli zvolené molekulové hmotnosti podle vynálezu. Podmínky reakce je možno volit k zajištění navrhovaného konjugátu s jedním připojeným reakčním činidlem. Konjugát obecného vzorce I, který má připojeno jedno reakční činidlo obecného vzorce II, se oddělí od nemodifikovaného IFNa akonjugáty mající připojenu více než jednu molekulu reakčního činidla, se oddělí běžnými způsoby. K oddělování konjugátů rozdílem nábojů lze použít čisticích metod, jako je katexová chromatografie, která účinně odděluje konjugáty na základě jejich různé molekulové hmotnosti.
-5CZ 292775 B6
Obsah frakcí, získaných katexovou chromatografíí, může být identifikován molekulovou hmotností pomocí obvyklých metod, například hmotovou spektroskopií, SDS-PAGE, nebo jinými známými metodami k oddělování molekulových entit podle molekulové hmotnosti. Podle toho je pak identifikována frakce, která obsahuje konjugát obecného vzorce I vyčištěný od nemodifikovaného IFNa a od konjugátů majících připojeno více než jedno reakční činidlo. Kromě toho reakční činidla obecného vzorce II uvolňují jeden lysin na reakční činidlo při kyselinové hydrolýze, takže počet lysinů v hydrolýze indikuje počet PEG připojených k proteinu, takže lze ověřit počet molekul reakčního činidla připojených ke konjugátu.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení pomocí přiložených obrázků.
Přehled obrázků
Na obr. 1 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky A498. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2x106 lidských ledvinových buněk A498 ve studijním dnu -33. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (30, 60, 120 nebo 300 pg) PEGIFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru jednou týdně po dobu 4 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
A neošetřená kontrola
B ošetření 30 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 60 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 120 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 300 pg PEG-IFNa2a
Na obr. 2 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky A498. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2x106 lidských ledvinových buněk A498 ve studijním dnu -33. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (10, 20, 40 nebo 100 pg) PEG-IFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru třikrát týdně po dobu 4 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
A neošetřená kontrola
B ošetření 10 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 20 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 40 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 100 pg PEG-IFNa2a
Na obr. 3 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky ACHN. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2x106 lidských ledvinových buněk ACHN ve studijním dnu -25. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (30, 60, 120 nebo 300 pg) PEG-IFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru jednou týdně po dobu 5 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
-6CZ 292775 B6
A neošetřená kontrola
B ošetření 30 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 60 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 120 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 300 pg PEG-IFNa2a
Na obr. 4 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky ACHN. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2x106 lidských ledvinových buněk ACHN ve studijním dnu -25. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (10, 20, 40 nebo 100 pg) PEGIFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru třikrát týdně po dobu 5 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
A neošetřená kontrola
B ošetření 10 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 20 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 40 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 100 pg PEG-IFNa2a
Na obr. 5 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky G402. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2xl06 lidských ledvinových buněk G402 ve studijním dnu -45. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (30, 60, 120 nebo 300 pg) PEGIFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru jednou týdně po dobu 5 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
A neošetřená kontrola
B ošetření 30 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 60 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 120 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 300 pg PEG-IFNa2a
Na obr. 6 je znázorněno protitumorové působení PEG-IFNa2a u myší, kterým byly implantovány subkutánně lidské ledvinové buňky G402. Všechna zvířata dostala subkutánní implantát 2xl06 lidských ledvinových buněk G402 ve studijním dnu -45. Ve studijním dnu 0 se započalo s ošetřováním PEG-IFNa2a. Vyznačené množství (10, 20, 40 nebo 100 pg) PEG-IFNa2a se aplikovalo subkutánně pod protilehlý bok tumoru třikrát týdně po dobu 5 týdnů.
Na ose x je počet dní a na ose y objem tumoru v cm3.
A neošetřená kontrola
B ošetření 10 pg PEG-IFNa2a
C ošetření 20 pg PEG-IFNa2a
D ošetření 40 pg PEG-IFNa2a
E ošetření 100 pg PEG-IFNa2a
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konjugátu obecného vzorce I
Materiály
Interferon-a2a se připraví známými způsoby (Pestka). Polyethylenglykol (PEG) reakční činidlo II je obchodní produkt společnosti Shearwater Polymers, lne. (Huntsville, Ala). Pryskyřice Fractogel® EMD CM 650(S) s částicemi o velikosti 25 až 40 pm je obchodní produkt společnosti EM Separations (Gibbstown, MA). Solanka (PBS) pufrovaná koncentrovaným fosfátem (10X), pH 7,3 je obchodní produkt společnosti BioWittaker (Walkersville, MD). Předlité elektroforezní gely natriumdodecyl(lauryl)sulfát polyakrylamidového gelu (SDS-PAGE) a elektroforezní jednotky jsou obchodní produkty společnosti NOVEX (San Diego, CA). Koncentrované rychlé barvivo (Fast Stain) k proteinovému barvení konjugátu PEG na SDSPAGE je obchodní produkt společnosti Zoion Research, lne. (Newton, MA). Testovací soubor endotoxinu LAL je obchodní produkt společnosti Associates of Cápe Cod, lne. (Woods, Hole, MA). Všechna ostatní použitá reakční činidla mají nejvyšší dosažitelnou kvalitu. Hrdelně kanylované krysy a myši BDF-1 dodávají Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
Experimentální postupy
A. Příprava konjugátu obecného vzorce I v malém měřítku
Do 50 mg (2,6 pmol) IFNa v 10 ml lOOmM borátu s hodnotou pH 8,0 se přidá 208 mg (5,2 pmol) reakčního činidla obecného vzorce II (se střední molekulovou hmotností 40 000). Konečný poměr proteinu k reakčními činidlu je 1:2. Reakční směs se míchá po dobu dvou hodin při teplotě 4 °C. Reakce se ukončí nastavením hodnoty pH na 4,5 ledovou kyselinou octovou.
Reakční směs se zředí 50-násobně vodou, zfiltruje se přes filtr 0,2 pm a aplikuje se na sloupec Amicon naplněný 100 ml (3,2x13 cm) Fractogelu EMD CM 650(S) nízkou průtočnou rychlostí 20 ml/min. Sloupec se napřed uvede do rovnovážného stavu lOmM amoniumacetátem s hodnotou pH 4,5. Výtok sloupce se monitoruje absorpcí ultrafialového světla při 280 nm. Sloupec se pak promývá vyvažovacím pufrem dokud se absorbance ultrafialového světla nevrátí na základní úroveň. Konjugáty PEG-IFN mající připojeno více než jedno reakční činidlo obecného vzorce II (oligomery PEG-IFN) se zředí 40mM amoniumacetátem s hodnotou pH 4,5 a konjugát obecného vzorce I se eluuje roztokem 0,12M chloridu sodného ve 40mM amoniumacetátovém pufru. Nemodifikovaný IFN zbylý ve sloupci se eluuje roztokem 0,5M chloridu sodného ve stejném pufru. Sloupec se regeneruje proplachem l,0M NaCl s následným promytím vyvažovacím pufrem. Frakce konjugátu obecného vzorce I se zkoncentrují v koncentrátoru míchaných buněk Amicon opatřeným membránou YM10 na koncentraci přibližně 1 mg/ml.
Katexová pryskyřice Fractogel CM 650(S) použitá k čištění účinně adsorbuje PEG a nemodifikovaný IFN. Adsorpční schopnost závisí na stupni PEGylace. Konjugáty jsou vázány méně pevné než nemodifikovaný IFN. Oligomery PEG-IFN se eluují 40mM amoniumacetátem, zatímco konjugát obecného vzorce I se eluuje roztokem 0,12M chloridu sodného. Nemodifikovaný IFN se eluuje roztokem 0,5M chloridu sodného. Všechny přípravky obsahují <5EU/mg endotoxinů. Výsledný přípravek obsahuje > 99 % konjugátu obecného vzorce I a je prost nemodifikovaného IFN.
-8CZ 292775 B6
B. Příprava konjugátu obecného vzorce I ve velkém měřítku
V 63 ml lmM HC1 při teplotě 4 °C se rozpustí 6240 miligramů (156 μιηοΐ) reakčního činidla obecného vzorce II (střední molekulová hmotnost 40 000) a ry chle se přidá do 125 ml roztoku obsahujícího 1000 mg (52 pmol) interferonu v 50 mM borátovém pufru, pH 9,0. Konečný poměr proteinu k reakčnímu činidlu je 1:3 a konečná koncentrace proteinu v reakční směsi je 5,3 mg/ml. Reakční směs se míchá po dobu dvou hodin při teplotě 4 °C. Reakce se ukončí nastavením hodnoty pH na 4,5 ledovou kyselinou octovou.
Reakční směs se zředí 10-násobně vodou a aplikuje se na sloupec naplněný 600 ml Fractogelu EMD CM 650(M), napřed uvedený do rovnovážného stavu 20mM acetátem sodným s hodnotou pH 4,5 s lineární průtočnou rychlostí 1,3 cm/min. Sloupec se promyje vyvažovacím pufrem následovaným 10 mM NaCl k odstranění nadbytku reakčního činidla, vedlejších produktů reakce a oligomerů PEG-IFN. Konjugát obecného vzorce I se eluuje vyvažovacím pufrem obsahujícím 200mM NaCl. Nemodifikovaný interferon ještě adsorbovaný ve sloupci se odstraní promytím 0,75 M NaCl ve vyvažovacím pufru. Konjugát obecného vzorce I, který byl eluován při 0,30,5 mg/ml se dále koncentruje a diafiltruje do pufru konečného prostředku, 20 mM acetátu sodného, pH 5,0, obsahujícího 150mM NaCl. Celkový výtěžek konjugátu obecného vzorce I je 40 až 45%.
Vyčištěný PEG-IFN z přípravy ve velkém měřítku sestává z >99 % konjugátu obecného vzorce I. Průměrná molekulová hmotnost konjugátu obecného vzorce I v tomto příkladě je 62 000 včetně molekulové hmotnosti IFNa2a, která je 19241 a průměrné molekulové hmotnosti reakčního činidla, která je 40 000 až 45 000, přibližně 43 000.
Příklad 2
Charakterizace konjugátu obecného vzorce I
Stanovení proteinu
Koncentrace proteinu se zjišťují pomocí hodnoty A2801,0 pro roztok 1 mg/ml IFNa a2a.
Analýza ADS-PAGE
Konjugát se analyzuje gelovou elektroforézou za použití systému natriumdodecyl(lauryl)sulfát/polyakrylamid (8 až 16 %) za redukčních podmínek způsobem, který popsal Laemmli (Nátuře 227, str. 680 (1970)). SDS-PAGE obsahující konjugáty PEG se vybarví na protein barvivém Fast Stain (Zoion Research, lne.) podle výrobcových instrukcí.
Stanovení endotoxinových hladin
Endotoxinové hladiny se stanoví metodou LAL podle výrobcových instrukcí. Všechny prostředky obsahují <5 EU/mg endotoxinů.
-9CZ 292775 B6
Příklad 3
Biologické aktivity konjugátu obecného vzorce I in vitro
Protivirové působení v buňkách hovězích ledvin
Protivirové působení IFNa2a a konjugátu obecného vzorce I připraveného podle příkladu 1A in vitro se určuje biotestem v buněčné kultuře používajícím buněk Madin-Darby hovězích ledvin (MDBK) vyvolávajících reakci vesikulámím virem stomatitis (Rubinstein a kol.). Protivirové působeni je uvedeno v tabulce I spolu s odpovídajícími zbytkovými aktivitami jako procento výchozího IFN.
Tabulka I
Protivirové působení
Vzorky Typ PEG Celková PEG # Lys hmotnost modifík. ____________________________(kDa)________________ IFNa2a _ _ _
Konjugát rozvětvený 40 1 ob. vz. I
Specifické Zbytková působení aktivita (J/mg) (%)
2,00x108 100
1,40x107 7
In vitro antiproliferativní působení v lidských tumorových buňkách
Antiproliferativní působení in vitro se testuje v lidských buňkách Daudi (Burkittova Lymphoma), jak je popsal Borden a kol. Lidské buňky Daudi se získají v podobě kultury stacionární suspenze vRPMI 1540 doplněným 10 % telecího zárodečného séra a 2 mM glutaminu (Grand Island Biologicals, Grand Island, NY). Buňky se skrínují a zjistí se, že jsou prosté mykoplazmy. Do důlků mikrotitrových destiček se přidají buňky (2x104) (Costar, MA) ve 100 μΐ média. Do důlků se přidají různé koncentrace IFN a konjugátu obecného vzorce I připraveného podle příkladu 1A v objemu 100 μΐ. Destičky se inkubují 72 hodin při teplotě 37 °C v 5% oxidu uhličitém. Před sklizením buněk se buňky 16 hodin pulzují s 0,25 pCi/důlek 3H-thymidinu (New England Nuclear, Boston, MA). Buňky se sklidí na skleněných filtrech a sečtou se v kapalinovém scintilačním čítači. Výsledky se vyjádří jako procento inhibice vypočtené ze vzorce:
% inhibice = [(A-B)/A) x 100, kde
A = cpm v kontrolní kultuře (buňky inkubované v samotném médiu),
B = cpm v experimentální kultuře.
Průběh vzorků je čtyřnásobný a střední směrodatná odchylka je ve všech případech méně než 20 % průměru. Pokusy probíhají nejméně dvakrát s porovnatelnými výsledky.
Antiproliferativní působení (IC50) IFN a konjugátu je uvedeno v tabulce II. Data ukazují, že antiproliferativní působení konjugátu obecného vzorce I vykazuje 28-násobné zvýšení oproti IFN.
-10CZ 292775 B6
Tabulka II
In vitro antiproliferativní působení v lidských buněčných řadách Daudi (Burkitova lymphona)
Vzorek_________________________Antiproliferativní IC5q (ng/ml) Zvýšení aktivity_______________
IFNa2a 0,56 lx
Konjugát obec. vz. I 0,02 28x
Příklad 4
Farmakokinetika
Samice krys Sprague Dawley, chirurgicky opatřené hrdelní kanylou, o průměrné hmotnosti 240 až 260 g se chovají volně jednotlivě v klecích s neomezeným přístupem k vodě a potravě při 12hodinovém cyklu světla a tmy. V průběhu 4 až 6 hodin po nástupu se hrdelní kanyly vypláchnou PBS. Následujícího dne po vypláchnutí 0,15 až 0,2 ml PBS, se injektuje 2x106 jednotek IFNa v 0,2 až 0,4 ml PBS, s následnou injekcí 0,15 až 0,2 ml PBS k zajištění, že veškerá droga se dostala do zvířete. Tak dostalo každé zvíře dávku 8x106 jednotek IFNa na kg tělesné hmotnosti.
Vzorky krve se odeberou po 5, 15 a 30 minutách a 1, 3, 5, 12 a 24 hodinách po injekci IFN akonjugátu obecného vzorce I. V každém časovém okamžiku, po odebrání prvních 0,15 až 0,2 ml krve se odebere kanylou 0,5 ml krve pomocí čerstvé injekční stříkačky. Vzorky se vyprázdní do sérum separujících zkumavek při teplotě místnosti. Jakmile se shromáždí všechny vzorky ze všech časových okamžiků, zkumavky se odstřeďují 10 minut při 14 000 x g ve chlazené odstředivce Eppendorf. Separované sérum se převede do 1,5 ml mikrozkumavek a zmrazí se na -80 °C než se připraví k biotestu. Vzorky séra se příslušně zředí a shora popsaným způsobem se stanoví protivirové působení v každém časovém okamžiku. Z vynesené závislosti aktivity na čase se stanoví konečný poločas konjugátu obecného vzorce I a IRNa a jsou sestaveny do tabulky III, která obsahuje také rezidenční doby v plazmě.
Tabulka III
Konečné poločasy (t1/2) a střední rezidenční doba v plazmě
Vzorek_______________________t1/2 (hodin)_______________Rezidenční doba v plazmě (hodin)
IFNa2a 2,1 1,0
Konjugát obec. vz. I 15,0 20,0
Konečný tj/a se určí log lineární regresí.
Příklad 5
Imunogenicita
Normálním myším BDF-1 (deseti na skupinu) se injektují intraperitoneálně jednou denně pětkrát týdně různé interferonové prostředky mající 300 000 jednotek protivirové aktivity. Některým myším se injektuje agregovaná forma IFNa2a, která je více imunogenická než monomemí forma. Krevní vzorky se odeberou 19 dní po poslední injekci a sérum se vyhodnotí na neutralizující protilátku.
-11 CZ 292775 B6
Jak vyplývá z tabulky IV, produkovaly myši s injekcí IFNa2a neutralizující protilátky a tato odezva je silně zvýrazněna u myší s injekcí interferonových agregátů. U většiny zvířat s injekcí konjugátu podle vynálezu nejsou zjistitelné žádné protilátky.
Tabulka IV
Imunogenicita
Ošetření______________________průměr
IFNa2a 2400
Agregáty IFNa2a 42 667
Konjugát obecného vzorce I 0
Protilátky (INU/ml)* * __________rozsah_________
217 až 8533 8000 až 768 000 0ažll33 * Počet jednotek neutralizujících interferon na ml
Příklad 6
Protitumorové působení in vivo
Protitumorové působení konjugátu obecného vzorce I (PEG2-IFNa2a) a nemodifikovaného IFNa2a in vivo se vyhodnocuje stanovením jejich schopnosti zmenšovat rozměry různých lidských tumorových buněk implantovaných do myší. Výsledky jsou patrné z obr. 1 až 6.
Postup: Athymickým myším (Harlan) se do levého zadního boku implantuje 2x106 lidských ledvinových buněk A498 (obr. 1 a 2), lidských ledvinových buněk ACHN (obr. 3 a 4) nebo lidských ledvinových buněk G402 (obr. 5 a 6). K vyvinutí tumorů jak vyznačeno, se ponechá 3 až 6 týdnů. Kritérium pro převzetí do studie je velikost 0,05 až 0,50 cm3. Myším se dostalo celkových týdenních dávek PEG2-IFNa2a nebo nemodifikovaného IFNa2a 30, 60, 120 nebo 300 pg. V případě PEG2-IFNa2a se myši ošetřovaly jednou týdně (v pondělí) 30, 60, 120 nebo 300 pg PEG2-IFNa2a na jedno ošetření. V případě nemodifikovaného IFNa2a se myši ošetřovaly třikrát týdně (v pondělí, ve středu a v pátek) 10,20,40 nebo 100 pg PEG2-IFNa2a na jedno ošetření. Ošetřování trvalo 4 až 5 týdnů v závislosti na agresivitě tumoru. Každé pondělí se před ošetřením měřily objemy tumorů.
Výsledky: PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšování velikosti tumoru A498 ve srovnání s nemodifikovaným IFNa2a u všech týdenních testovaných dávek po 7, 14, 21 a 28 dnech od zahájení testu (obr. 1 a 2). Test trval čtyři týdny. 7 dní po ošetření se test přerušil a 3 myši z každé skupiny byly usmrceny. U tří myší, ošetřených PEG2-IFNa2a, nebyl pozorován zbylý tumor. U myší, ošetřených nemodifikovaným IFNa2a, vážily tumory A498 1,28 g, 0,662 g a 1,60 g u každé ze tří myší. Hmotnost tumorů A498 tří kontrolních myší byla 2,32 g, 2,37 a 1,94 g. Po 80 dnech na konci čtyřtýdenní periody ošetřování se existence tumorů zjišťovala palpací u sedmi myší. Všech sedm myší bylo prosto tumorové tkáně.
PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšování velikosti tumoru ACHN ve srovnání s nemodifikovaným IFNa2a u všech týdenních testovaných dávek 60, 120 a 300 pg po 14, 21 a 28 a 35 dnech od zahájení testu (obr. 3 a 4).
PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšování velikosti tumoru G402 ve srovnání s nemodifikovaným IFNa2a u týdenních testovaných dávek 60 a 120 pg po 14,21 a 28 a 35 dnech od zahájení testu (obr. 5 a 6).
-12CZ 292775 B6
Průmyslová využitelnost
Fyziologicky aktivní konjugát PEG-IFNa2a má výhodnou kombinaci vlastností, z nichž vyniká potlačování růstu lidských tumorových buněk in vivo a hodí se proto k výrobě farmaceutických prostředků.

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1.
    Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon a obecného vzorce I, o II
    ROCH2CH2(OCH2CH2)n—O—C —NH (CH2)4
    R'OCH2CH2(OCH2CH2)n'—O—C—l^f X ,FNa
    II II
    O O (I)y kde znamená IFN-α interferon alfa, R a R' na sobě nezávisle alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, X skupinu NH nebo atom kyslíku, n a n' celá čísla, jejichž součet je 600 až 1500 a průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v konjugátu je 26 000 až 66 000.
  2. 2. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I s molekulovou hmotností polyethylenglykolových jednotek 35 000 až 45 000.
  3. 3. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 2 obecného vzorce I s molekulovou hmotností polyethylenglykolových jednotek 40 000.
  4. 4. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, kde znamená R a R' skupinu methylovou.
  5. 5. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, kde znamená X skupinu NH.
  6. 6. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, přičemž interferonem a je interferon a2a.
  7. 7. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, kde součet čísel n a n' je 850 až 1000.
  8. 8. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, kde znamená R a R' skupinu methylovou, X NH- skupinu, interferonem a je interferon a2a a jedno nebo obě čísla n a n'jsou 420.
    -13CZ 292775 B6
  9. 9. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I, kde znamená R a R' skupinu methylovou, X NH- skupinu, interferonem a je interferon a2a a jedno nebo obě čísla n a n'jsou 520.
  10. 10. Fyziologicky aktivní konjugát podle nároku 1 obecného vzorce I mající větší antiproliferativní účinek než interferon a a menší antivirové působení než interferon a.
  11. 11. Způsob přípravy fyziologicky aktivního konjugátu podle nároku 1 obecného vzorce I, majícího větší antiproliferativní účinek než interferon a a menší antivirové působení než interferon a, vyznačující se tím, že se kovalentně váže reakční činidlo obecného vzorce II
    ROCH^H2<OCH2CH2)n —O—C—NH (CH2)4 <u>( kde R, R', n a n' mají význam uvedený v nároku 1, na interferon a k vytvoření konjugátu polyethylenglykol-interferon a.
  12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon a podle nároků 1 až 10 obecného vzorce I a terapeuticky inertní nosič.
  13. 13. Farmaceutický prostředek k ošetřování nebo profylaxi imunomodulatomích onemocnění, jako jsou neoplastické nemoci nebo infekční nemoci, vyznačující se tím, že obsahuje fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon a podle nároků 1 až 10 obecného vzorce I a terapeuticky inertní nosič.
  14. 14. Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon a podle nároků 1 až 10 obecného vzorce I pro výrobu léčiv k ošetřování a profylaxi nemocí.
CZ19971679A 1996-05-31 1997-05-30 Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje CZ292775B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1883496P 1996-05-31 1996-05-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ167997A3 CZ167997A3 (en) 1997-12-17
CZ292775B6 true CZ292775B6 (cs) 2003-12-17

Family

ID=21790006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19971679A CZ292775B6 (cs) 1996-05-31 1997-05-30 Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Country Status (47)

Country Link
US (1) US7201897B2 (cs)
EP (1) EP0809996B1 (cs)
JP (1) JP2980569B2 (cs)
KR (1) KR100254097B1 (cs)
CN (1) CN1088721C (cs)
AR (1) AR008378A1 (cs)
AT (1) ATE235920T1 (cs)
AU (1) AU725195B2 (cs)
BG (1) BG62273B1 (cs)
BR (1) BR9703421A (cs)
CA (1) CA2203480C (cs)
CO (1) CO4950528A1 (cs)
CY (2) CY2433B1 (cs)
CZ (1) CZ292775B6 (cs)
DE (3) DE809996T1 (cs)
DK (1) DK0809996T3 (cs)
EG (1) EG24292A (cs)
ES (1) ES2110386T3 (cs)
GR (1) GR970300063T1 (cs)
HR (1) HRP970298B1 (cs)
HU (1) HU227992B1 (cs)
IL (1) IL120902A (cs)
IS (1) IS1988B (cs)
LU (1) LU91029I2 (cs)
MA (1) MA24193A1 (cs)
MY (1) MY117909A (cs)
NL (1) NL300127I2 (cs)
NO (1) NO322964B1 (cs)
NZ (1) NZ314903A (cs)
OA (1) OA10488A (cs)
PA (1) PA8431001A1 (cs)
PL (1) PL186949B1 (cs)
PT (1) PT809996E (cs)
RS (1) RS49533B (cs)
RU (1) RU2180595C2 (cs)
SA (1) SA97180030B1 (cs)
SG (1) SG55314A1 (cs)
SI (1) SI0809996T1 (cs)
SK (1) SK284458B6 (cs)
SV (1) SV1997000049A (cs)
TJ (1) TJ328B (cs)
TN (1) TNSN97091A1 (cs)
TR (1) TR199700358A3 (cs)
TW (1) TW517067B (cs)
UA (1) UA56989C2 (cs)
UY (1) UY24572A1 (cs)
ZA (1) ZA974583B (cs)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5908621A (en) * 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
CA2236591C (en) 1995-11-02 2012-01-03 Schering Corporation Continuous low-dose cytokine infusion therapy
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6180096B1 (en) 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
PL193286B1 (pl) * 1998-03-26 2007-01-31 Schering Corp Liofilizowany proszek koniugatów glikol polietylenowy - interferon-alfa i zawierające go wyroby
SI1075281T1 (en) * 1998-04-28 2005-02-28 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
TWI277424B (en) 1998-05-15 2007-04-01 Schering Corp Combination therapy for eradicating detectable NCV-RNA in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection
IL139786A0 (en) * 1998-06-08 2002-02-10 Hoffmann La Roche Use of peg-ifn-alpha and ribavirin for the treatment of chronic hepatitis c
US6277830B1 (en) * 1998-10-16 2001-08-21 Schering Corporation 5′-amino acid esters of ribavirin and the use of same to treat hepatitis C with interferon
IL129299A0 (en) * 1999-03-31 2000-02-17 Mor Research Applic Ltd Monoclonal antibodies antigens and diagnosis of malignant diseases
CO5170404A1 (es) 1999-04-08 2002-06-27 Schering Corp Terapia para melanomas
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
NZ514417A (en) * 1999-04-08 2003-10-31 Schering Corp Use of pegylated interferon alpha in chronic myeloid leukemia (CML) therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6313143B1 (en) * 1999-12-16 2001-11-06 Hoffmann-La Roche Inc. Substituted pyrroles
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
EP1908477A3 (en) * 2000-01-24 2008-06-11 Schering Corporation Combination of temozolomide and pegylated interferon-alpha for treating cancer
EP1251866A1 (en) * 2000-01-24 2002-10-30 Schering Corporation Combination of temozolomide and pegylated interferon-alpha for treating cancer
WO2001058935A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
US6476062B2 (en) 2000-03-30 2002-11-05 Schering Corporation Chemokine receptor antagonists
US6777387B2 (en) 2000-03-31 2004-08-17 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
US6756037B2 (en) 2000-03-31 2004-06-29 Enzon, Inc. Polymer conjugates of biologically active agents and extension moieties for facilitating conjugation of biologically active agents to polymeric terminal groups
US6924270B2 (en) 2000-04-20 2005-08-02 Schering Corporation Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection
DE60128093T2 (de) 2000-06-30 2007-12-27 Zymogenetics, Inc., Seattle Interferon-ähnliches protein zcyto21
CA2436623C (en) * 2001-01-30 2011-08-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
ES2291613T3 (es) 2002-01-16 2008-03-01 Biocompatibles Uk Limited Conjugados de polimeros.
KR100888371B1 (ko) * 2002-01-17 2009-03-13 동아제약주식회사 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DK1517710T3 (da) 2002-06-21 2011-07-18 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylerede faktor VII-glycoformer
JP4451308B2 (ja) 2002-07-24 2010-04-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ポリアルキレングリコール酸添加剤
US7087229B2 (en) * 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
WO2004024761A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
EP1681303B1 (en) * 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
AR041350A1 (es) * 2002-09-20 2005-05-11 Pharmacia Corp Proceso para reducir los niveles de agregados de proteinas tratadas con peg
ES2314238T3 (es) 2002-10-08 2009-03-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de oligosacaridos farmaceuticamente activos.
US7314613B2 (en) * 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
AU2003297285A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-15 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
GB0301014D0 (en) * 2003-01-16 2003-02-19 Biocompatibles Ltd Conjugation reactions
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
CA2458085A1 (en) 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1673387B1 (en) 2003-10-10 2010-09-15 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
AU2005211385B2 (en) 2004-02-02 2008-12-11 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
CN100355784C (zh) * 2004-02-12 2007-12-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法
AR048035A1 (es) 2004-03-11 2006-03-22 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina, preparados por aminacion reductora
AU2005245918A1 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon-alpha polypeptides and conjugates
BRPI0512235A (pt) 2004-06-18 2008-02-19 Ambrx Inc polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos
CA2572751A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
MX2007000728A (es) 2004-07-21 2007-03-15 Ambrx Inc Polipeptidos biosinteticos que utilizan amino acidos no naturalmente codificados.
BRPI0513332A (pt) 2004-08-12 2008-05-06 Schering Corp formulação de interferon peguilado estável
KR20070090023A (ko) 2004-12-22 2007-09-04 암브룩스, 인코포레이티드 변형 인간 성장 호르몬
US20060233740A1 (en) * 2005-03-23 2006-10-19 Bossard Mary J Conjugates of an hGH moiety and a polymer
US7619067B2 (en) 2005-05-18 2009-11-17 Maxygen, Inc. Evolved interferon-alpha polypeptides
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
TW200722104A (en) * 2005-06-20 2007-06-16 Pepgen Corp Low-toxicity, long-circulating human interferon-α analogs
EP1937824B1 (en) 2005-08-18 2013-03-13 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF tRNA AND USES THEREOF
JP4261531B2 (ja) 2005-09-06 2009-04-30 株式会社Ｎｒｌファーマ ラクトフェリン複合体及びその製造方法
US20090018029A1 (en) 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
CN101002944B (zh) * 2006-01-17 2012-07-25 中国科学院过程工程研究所 支链聚乙二醇-干扰素结合物及其制备方法
CN100475270C (zh) 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
CN101002945B (zh) 2006-01-20 2012-09-05 清华大学 一种用于肿瘤治疗的新型复合物
CA2652333A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Pharmaceutical composition for treating or preventing hcv infection
MX2008014685A (es) 2006-05-24 2008-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag Analogos de factor ix con semivida prolongada in vivo.
US9133495B2 (en) 2006-09-08 2015-09-15 Ambrx, Inc. Hybrid suppressor tRNA for vertebrate cells
CA2663083A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses
CN1966547B (zh) * 2006-11-06 2011-11-09 中国药科大学 双链结构的聚乙二醇衍生物的制备及其与药物分子的结合
CN101583637B (zh) * 2006-11-07 2012-08-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含生物分子片段的氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯或尿素
KR101079993B1 (ko) 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
CN101219219B (zh) 2007-01-10 2013-02-13 北京普罗吉生物科技发展有限公司 包含血管抑素或其片段的复合物、其制备方法及应用
JP5515224B2 (ja) 2007-02-28 2014-06-11 日油株式会社 多分岐鎖ポリオキシアルキレン誘導体
ES2385114T3 (es) 2007-03-30 2012-07-18 Ambrx, Inc. Polipéptidos de FGF-21 modificados y sus usos
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
PL2196475T3 (pl) 2007-09-04 2012-10-31 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferon alfa 2a zmodyfikowany rozgałęzioną cząsteczką glikolu polietylenowego, sposób jego syntezy i zastosowanie
BRPI0721984B8 (pt) 2007-09-04 2021-05-25 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos
ES2632504T3 (es) 2007-11-20 2017-09-13 Ambrx, Inc. Polipéptidos de insulina modificados y sus usos
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
CN107033233A (zh) * 2008-01-18 2017-08-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 非糖基化蛋白质的纯化
EP3981761A3 (en) * 2008-02-01 2022-08-24 Ascendis Pharma A/S Intermediates for prodrugs
US9938333B2 (en) 2008-02-08 2018-04-10 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
PL2272875T3 (pl) 2008-04-03 2014-06-30 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Hormon wzrostu modyfikowany dwuniciowym glikolem polietylenowym, sposoby otrzymywania i stosowania
DK2279007T3 (en) * 2008-04-29 2016-08-22 Ascendis Pharma Growth Disorders Div As Pegylated recombinant relations of human growth hormone
TW201010692A (en) 2008-06-19 2010-03-16 Public Univ Corp Nagoya City Univ Pharmaceutical composition for treatment or prevention of hbv infection
PL2307367T3 (pl) 2008-07-08 2015-03-31 Univ Texas Nowe inhibitory proliferacji i aktywacji białek przekazujących sygnał i aktywujących transkrypcję (STAT)
EP2318029B1 (en) 2008-07-23 2017-11-01 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
MX357314B (es) 2008-09-26 2018-07-04 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
NZ592250A (en) 2008-09-26 2012-11-30 Lilly Co Eli Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
IT1399351B1 (it) 2009-06-16 2013-04-16 Fidia Farmaceutici Procedimento per la sintesi di coniugati di glicosamminoglicani (gag) con molecole biologicamente attive, coniugati polimerici e usi relativi
WO2011014882A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Medtronic, Inc. CONTINUOUS SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF INTERFERON-α TO HEPATITIS C INFECTED PATIENTS
KR20120106942A (ko) 2009-10-30 2012-09-27 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 Ｂｉ２０１３３５, 인터페론 알파 및 리바비린을 포함하는 ｈｃｖ 병용 치료요법을 위한 투여 용법
RU2012129674A (ru) 2009-12-15 2014-01-27 Аспендис Фарма Ас Композиция гормона роста
US20120283172A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
US20120283171A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011107591A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
WO2011161644A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Panmed Ltd. Treatment of hepatitis c virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent
RU2447083C1 (ru) * 2010-07-20 2012-04-10 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ
CA2805564A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stefan Jenewein Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein
HUE045845T2 (hu) 2010-08-17 2021-12-28 Ambrx Inc Módosított relaxin polipeptidek és felhasználásuk
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
CN102229667A (zh) * 2011-06-03 2011-11-02 北京伟嘉人生物技术有限公司 一种聚乙二醇修饰的猪α-干扰素及其制备方法和应用
KR20140054009A (ko) 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
EP2739301B1 (en) 2011-08-03 2016-01-20 Cytheris Hcv immunotherapy
JP2015509980A (ja) 2012-03-14 2015-04-02 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｈｃｖ−ｈｉｖ同時感染患者集団のｈｃｖ感染症を治療するための併用療法
JP2015512900A (ja) 2012-03-28 2015-04-30 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 特別な患者の遺伝子亜型分集団のｈｃｖ感染症を治療するための併用療法
KR102172897B1 (ko) 2012-06-08 2020-11-02 서트로 바이오파마, 인크. 부위-특이적 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 그의 제조 방법 및 그의 사용 방법
EP3135690A1 (en) 2012-06-26 2017-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
DK3584255T3 (da) 2012-08-31 2022-04-04 Sutro Biopharma Inc Modificerede aminosyrer omfattende en azidogruppe
EA022617B1 (ru) * 2013-03-28 2016-02-29 Илья Александрович МАРКОВ Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA021610B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Жидкое противовирусное лекарственное средство
EA023323B1 (ru) * 2013-03-28 2016-05-31 Илья Александрович МАРКОВ Разветвленный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3055298B1 (en) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP2907512A1 (en) 2014-02-14 2015-08-19 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Inhibitors of MMP-12 as antiviral Agents
RU2554761C1 (ru) * 2014-05-13 2015-06-27 Закрытое акционерное общество "Сибирский центр фармакологии и биотехнологии" Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство
PE20170950A1 (es) 2014-10-24 2017-07-13 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (fgf-21) modificados y usos de los mismos
TWI737583B (zh) 2014-11-06 2021-09-01 藥華醫藥股份有限公司 用於長效型干擾素之劑量方案
JP6783782B2 (ja) 2014-11-18 2020-11-11 アセンディス ファーマ エンドクライノロジー ディヴィジョン エー／エス 新規ｈＧＨポリマープロドラッグ
PT3220892T (pt) 2014-11-21 2021-11-05 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Formas de dosagem de hormona do crescimento de longa ação
MX377531B (es) 2015-11-03 2025-03-10 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de un inhibidor del ensamble de la cápside del hbv y un interferón.
CN106749608B (zh) * 2015-11-18 2021-10-15 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 干扰素α缀合物
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
CA3052639A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
RU2678332C1 (ru) 2017-09-08 2019-01-28 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения
EP3849614B1 (en) 2018-09-11 2023-12-20 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
US20220009986A1 (en) 2018-10-19 2022-01-13 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CN119455004A (zh) 2019-02-12 2025-02-18 Ambrx公司 包含抗体-tlr激动剂缀合物的组合物、方法和用途
JP7524206B2 (ja) 2019-03-04 2024-07-29 アセンディス ファーマ エンドクライノロジー ディヴィジョン エー／エス １日ごとのソマトロピンよりも優れた効力を有する長時間作用性成長ホルモン剤形
EP4117732A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof
TW202227449A (zh) 2020-08-20 2022-07-16 美商Ａｍｂｒｘ 公司 抗體－ｔｌｒ促效劑偶聯物、其方法及用途
EP4267592A1 (en) * 2020-12-23 2023-11-01 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Methods of purifying charge-shielded fusion proteins
AU2022249223A1 (en) 2021-04-03 2023-10-12 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0098110B1 (en) * 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4681848A (en) 1982-09-22 1987-07-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel peptide and use thereof
WO1984004745A1 (en) 1983-05-31 1984-12-06 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptides and their use
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3719046A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Basf Ag Verwendung von salzen von sulfonamidcarbonsaeuren als korrosionsinhibitoren in waessrigen systemen
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5145773A (en) * 1989-05-25 1992-09-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method to detect sensitivity to alpha-interferon therapy
EP0400472B1 (en) * 1989-05-27 1996-04-03 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Process for preparing polyethylene glycol derivatives and modified protein.
US5238915A (en) * 1991-02-08 1993-08-24 Wakunaga Seiyaku K.K. Aromatic composition and method for controlling aroma
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
GB9111967D0 (en) 1991-06-04 1991-07-24 Erba Carlo Spa 2,5'-nucleotide analogs as antiviral agents
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
RU2006036C1 (ru) * 1991-12-27 1994-01-15 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН Способ определения антигенов
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
WO1995013090A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
WO1995021629A1 (en) * 1994-02-08 1995-08-17 Amgen Inc. Oral delivery of chemically modified proteins
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
CA2458085A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay

Also Published As

Publication number Publication date
HU9700959D0 (en) 1997-07-28
JP2980569B2 (ja) 1999-11-22
HUP9700959A3 (en) 1998-03-30
US7201897B2 (en) 2007-04-10
IL120902A (en) 2004-06-20
RU2180595C2 (ru) 2002-03-20
TR199700358A2 (xx) 1997-12-21
EG24292A (en) 2009-01-08
IL120902A0 (en) 1997-09-30
AR008378A1 (es) 2000-01-19
TNSN97091A1 (fr) 2005-03-15
NO972480L (no) 1997-12-01
DE10399018I1 (de) 2003-10-23
CA2203480A1 (en) 1997-11-30
US20040030101A1 (en) 2004-02-12
EP0809996A3 (en) 1999-04-14
CY2005006I2 (el) 2009-11-04
BR9703421A (pt) 1998-09-15
TR199700358A3 (tr) 1997-12-21
TJ328B (en) 2001-12-24
HUP9700959A2 (hu) 1998-03-02
TW517067B (en) 2003-01-11
SK67397A3 (en) 1997-12-10
BG62273B1 (bg) 1999-07-30
EP0809996A2 (en) 1997-12-03
HRP970298A2 (en) 1998-04-30
UY24572A1 (es) 2000-12-29
CY2433B1 (en) 2004-11-12
EP0809996B1 (en) 2003-04-02
CA2203480C (en) 2009-06-30
MY117909A (en) 2004-08-30
CN1167777A (zh) 1997-12-17
CZ167997A3 (en) 1997-12-17
AU725195B2 (en) 2000-10-05
SG55314A1 (en) 1998-12-21
CY2005006I1 (el) 2009-11-04
BG101540A (en) 1998-02-27
PL186949B1 (pl) 2004-04-30
SK284458B6 (sk) 2005-04-01
AU2372397A (en) 1997-12-04
JPH1067800A (ja) 1998-03-10
NO322964B1 (no) 2006-12-18
ATE235920T1 (de) 2003-04-15
HK1005225A1 (en) 1998-12-31
HU227992B1 (en) 2012-08-28
MX9704012A (es) 1997-11-29
TJ97000465A (en) 1998-12-25
NL300127I2 (nl) 2003-09-01
DE809996T1 (de) 1998-04-09
SA97180030B1 (ar) 2005-11-12
ES2110386T3 (es) 2003-10-01
DE69720320D1 (de) 2003-05-08
GR970300063T1 (en) 1998-01-30
PA8431001A1 (es) 2000-05-24
UA56989C2 (uk) 2003-06-16
CO4950528A1 (es) 2000-09-01
KR100254097B1 (ko) 2000-05-01
SI0809996T1 (en) 2003-08-31
PT809996E (pt) 2003-06-30
NO972480D0 (no) 1997-05-30
NL300127I1 (cs) 2003-07-01
SV1997000049A (es) 1998-07-09
PL320251A1 (en) 1997-12-08
OA10488A (fr) 2002-04-11
YU17597A (sh) 1999-07-28
CN1088721C (zh) 2002-08-07
MA24193A1 (fr) 1997-12-31
IS1988B (is) 2005-02-15
KR970074791A (ko) 1997-12-10
RS49533B (sr) 2006-12-15
ES2110386T1 (es) 1998-02-16
NZ314903A (en) 1998-10-28
DE69720320T2 (de) 2004-06-03
HRP970298B1 (en) 2003-08-31
LU91029I2 (fr) 2004-01-23
ZA974583B (en) 1998-11-17
IS4491A (is) 1997-12-01
DK0809996T3 (da) 2003-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ292775B6 (cs) Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
JP5334347B2 (ja) 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法
JP2989002B2 (ja) 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
KR100689212B1 (ko) Ｇｃｓｆ 결합체
TWI232882B (en) Poly-IFN-beta conjugates
JP3747070B2 (ja) 改良型インターフェロン−ポリマーコンジュゲート
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
AU2001255256A1 (en) Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP5458416B2 (ja) 二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモン、その製造方法およびその使用
CN101448525A (zh) 聚乙二醇-干扰素α缀合物
KR100888371B1 (ko) 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
RU2298560C2 (ru) Конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля, фармацевтическая композиция, способ борьбы с вирусной инфекцией
HK1005225B (en) Interferon conjugates
MXPA97004012A (en) Conjugados de interfe
KR100761652B1 (ko) 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자유도체와 접합체
HK1131345A (en) Polyethylene glycol-interferon alpha conjugate

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170530