SK67397A3 - Interferon conjugate, preparation method thereof and pharmaceutical composition containing the same - Google Patents
Interferon conjugate, preparation method thereof and pharmaceutical composition containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- SK67397A3 SK67397A3 SK673-97A SK67397A SK67397A3 SK 67397 A3 SK67397 A3 SK 67397A3 SK 67397 A SK67397 A SK 67397A SK 67397 A3 SK67397 A3 SK 67397A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- ifnα
- peg
- physiologically active
- conjugate according
- active peg
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Oblasť technikyTechnical field
Vynález sa týka fyziologicky aktívneho konjugátu PEG-IFNa. Interferón, najmä interferón a2a je farmaceutický aktívny proteín s antivírusovým a antiproliferatívnym účinkom. Interferón sa napríklad používa na liečbu vlasových buniek leukémie a sarkómu Kaposi a pôsobí tiež proti hepatitíde. Pre zlepšenie stálosti a rozpustnosti a pre zníženie imunogenicity sa farmaceutický aktívne proteíny, ako interferón, môžu konjugovať na polymér polyetylénglykol (PEG).The invention relates to a physiologically active PEG-IFNα conjugate. Interferon, in particular interferon a2a, is a pharmaceutically active protein with antiviral and antiproliferative activity. For example, interferon is used to treat hair cells of leukemia and Kaposi's sarcoma and also acts against hepatitis. To improve stability and solubility and to reduce immunogenicity, pharmaceutically active proteins, such as interferon, can be conjugated to a polyethylene glycol (PEG) polymer.
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Biologická dostupnosť proteínových liečiv je často obmedzovaná ich krátkym polčasom životnosti v plazme, čo bráni dosiahnutiu ich maximálnej klinickej schopnosti. V posledných rokoch sa ukázalo, že biomolekuly konjugované na PEG majú klinicky užitočné vlastnosti [Inada a kol. J. Bioact. and Compatible Polymers 5, str. 343 (1990), Delgado a kol., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, str. 249 (1992), Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, str. 91 (1993)]. Medzi tieto vlastnosti patrí fyzikálna tepelná stálosť, ochrana voči náchylnosti k enzymatickej degradácii, zvýšená rozpustnosť, dlhší cirkulačný polčas životnosti in vivo, znížené vymiznutie a zlepšená potencia. Uvádza sa, že rozvetvené konjugáty PEG vykazujú zväčšenú stálosť k hodnote pH a tepelnú stálosť a väčšiu stabilitu voči proteolytickej digescii ako lineárne PEG konjugáty. [Monfardini a kol., Biočonjugate Chem. 6, str. 62 (1995)]. Inými vlastnosťami proteínov PEG sú znížená imonogenicita a antigenicita aj znížená toxicita. Iným účinkom PEGylácie určitých proteínov môže byť znížená aktivita in vitro, sprevádzaná zlepšenou aktivitou in vivo. To bolo pozorované napríklad v prípade G-CSF [Satake -Ishikawa a kol. , Celí Structure and Function 17, str. 157 až 160 (1992)], IL-2 [Katre a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, str. 1487 (1987)], TNF-aBioavailability of protein drugs is often limited by their short plasma half-life, preventing their maximum clinical ability from being achieved. In recent years, PEG-conjugated biomolecules have been shown to have clinically useful properties [Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers 5, p. 343 (1990), Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, p. 249 (1992), Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, p. 91 (1993)]. These properties include physical thermal stability, protection against susceptibility to enzymatic degradation, increased solubility, longer circulating half-life in vivo, reduced clearance, and improved potency. Branched PEG conjugates are reported to exhibit increased pH and heat stability and greater stability to proteolytic digestion than linear PEG conjugates. [Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6, p. 62 (1995)]. Other properties of PEG proteins are reduced immunogenicity and antigenicity as well as reduced toxicity. Another effect of PEGylation of certain proteins may be decreased in vitro activity, accompanied by improved in vivo activity. This has been observed, for example, in the case of G-CSF [Satake-Ishikawa et al. , Cell Structure and Function 17, p. 157-160 (1992)], IL-2 [Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, p. 1487 (1987)], TNF-α
- 2 [Tsutsumi a kol., Jpn. J. Cancer.2 [Tsutsumi et al., Jpn. J. Cancer.
[Inoue a kol., J. Lab. Clin. Med.[Inoue et al., J. Lab. Clin. Med.
[Chamow a kol., Bioconj. Chem. 5,[Chamow et al., Bioconj. Chem. 5
Res. 85, str. 9, (1994)], IL-6Res. 85, p. 9, (1994)], IL-6
124, str. 52.9 (1994 )] a CD4-IgG124, p. 52.9 (1994)] and CD4-IgG
Str.133 (1994)].P. 133 (1994)].
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Podstatou vynálezu je fyziologicky aktívny konjugát PEG-IFNa všeobecného vzorca IThe present invention provides a physiologically active PEG-IFNα conjugate of Formula I
IIII
ROCH2CH2(OCH2CH2)n—O-C —NH (CH2)4 ROCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n - OC - NH (CH 2 ) 4
LL
R'OCH2CH2(OCH2CH2)n'—0—C—NH —x ,FNa oR'OCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n'— O — C — NH - x, FNa o
kde znamená R a R’ na sebe nezávisle nižšiu alkylovú skupinu, X skupinu NH alebo atóm kyslíka (X je najmenej jedna funkčná skupinu v molekule IFNa zvolenej zo skupiny zahŕňajúcej NH2 alebo OH), n a n' sú čísla, ktorých súčet je 600 až 1500 a priemerná molekulová hmotnosť jednotiek polyetylénglykolu v konjugáte je približne 26000 až približne 66000 Daltonov. Konjugát všeobecného vzorca I má rozvetvenú štruktúru, pričom dva podiely PEG sú viazané na proteín jednoduchou väzbou.where R and R 'are each independently lower alkyl, X is NH or oxygen (X is at least one functional group in an IFNα molecule selected from NH 2 or OH), nan' are numbers with a sum of 600 to 1500 and the average molecular weight of the polyethylene glycol units in the conjugate is about 26,000 to about 66,000 Daltons. The conjugate of formula (I) has a branched structure wherein two PEG moieties are bound to the protein by a single bond.
S prekvapením sa totiž zistilo, že v prípade interferónu znižuje PEGylácia protivírusovú aktivitu in vitro, avšak zvyšuje antiproliferatívnu aktivitu v ľudských nádorových bunkách. Avšak nový konjugát PEG interferónu podľa vynálezu má prekvapivé vlastnosti v tom, že antiproliferatívna aktivita PEG interferónu je značne vyššia ako nielen samotného interferónu, ale aj iných PEG interferónových konjugátov. Napriek tomu, že je antiproliferatívna aktivita konjugátu značne zvýšená v porovnaní s inými PEG interferón-α konjugátmi, je zníženie protivírusovej aktivity podobné. Okrem toho PEG interferón-α konjugát podľa vynálezu je neimunogenický, nevyvoláva domnele žiadne tvorenie protilátok. Na rozdiel od toho iné PEG interferón-α konjugáty vyvolávajú obmedzenú tvorbu protilátok.Surprisingly, it has been found that, in the case of interferon, PEGylation decreases antiviral activity in vitro, but increases antiproliferative activity in human tumor cells. However, the novel PEG interferon conjugate of the invention has surprising properties in that the antiproliferative activity of PEG interferon is considerably higher than not only the interferon itself, but also other PEG interferon conjugates. Although the anti-proliferative activity of the conjugate is greatly increased compared to other PEG interferon-α conjugates, the reduction in antiviral activity is similar. In addition, the PEG interferon-α conjugate of the invention is non-immunogenic, presumably causing no antibody formation. In contrast, other PEG interferon-α conjugates induce limited antibody production.
Vynález sa teda týka novej triedy PEG derivátov interferónu a (IFNa). Konjugát podľa vynálezu má rozvetvenú štruktúru PEG, ako je to ďalej uvedené. Rozvetvený PEG má tú prednosť, že dovoľuje pripojenie dvoch lineárnych molekúl PEG na osamotenom mieste, čím zdvojnásobuje hmotu pripojeného PEG bez niekoľkonásobných miest PEGylácie.The invention thus relates to a new class of PEG derivatives of interferon α (IFNα). The conjugate of the invention has a branched PEG structure as described below. The branched PEG has the advantage of allowing two linear PEG molecules to be attached at an isolated location, thereby doubling the mass of the attached PEG without multiple sites of PEGylation.
V porovnaní s nemodifikovaným IFNa (teda IFNa bez pripojeného PEG) má konjugát zvýšený cirkulačný polčas životnosti a čas zdržania v plazme, zníženú imonogenicitu, znížené vymiznutie a zvýšenú antiproliferatívnu aktivitu so sprievodnou zníženou protivírusovou aktivitou in vitro. V porovnaní s inými konjugátmi PEG-IFNa má konjugát podľa vynálezu značne väčšiu antiproliferatívnu aktivitu, neúmernú so zlepšením alebo znížením, ktoré sa vyskytuje v jeho iných vlastnostiach a domnele žiadnu imunogenicitu.Compared to unmodified IFNα (i.e., IFNα without PEG-attached), the conjugate has increased circulating half-life and plasma residence time, decreased immonogenicity, reduced clearance, and increased antiproliferative activity with concomitant reduced in vitro antiviral activity. Compared to other PEG-IFNα conjugates, the conjugate of the invention has considerably greater antiproliferative activity, disproportionate to the improvement or decrease that occurs in its other properties and is believed to have no immunogenicity.
Druhy fyziologicky aktívneho konjugátu PEG-IFNa podľa vynálezu má hore uvedený všeobecný vzorec.The physiologically active PEG-IFNα conjugate of the invention has the above general formula.
Konjugát podľa vynálezu má rovnaké použitie ako IFNa, napríklad antiproliferatívne využitie. Konjugáty PEG interferón-α podľa vynálezu sa hodia na liečbu imunomodulatorných ochorení, ako sú neoplastické ochorenia, napríklad leukémia vlasových buniek, CML a sarkóm Kaposi a infekčné ochorenia; na liečbu týchto chorôb sa rovnako používa IFNa (osobitne INFa2a). Avšak konjugát podľa vynálezu má zlepšené vlastnosti vrátane vynikajúcej stálosti, väčšej rozpustnosti, zvýšený cirkulačný polčas životnosti a čas rezidencie v plazme. Okrem toho majú tieto konjugáty antiproliferatívnu aktivitu podstatne väčšiu ako IFNa. Tiež, ako to už bolo uvedené, vykazuje konjugát prekvapujúcu disociáciu protivírusových a antiproliferatívnych javov. Táto vlastnosť sa prídavné hodí na zvýšenie žiadúcej aktivity konjugátu pri znižovaní alebo eliminovaní nežiaducej aktivity. Keď je napríklad nežiadúci vedlajsí účinok spojený s protivírusovým pôsobením, eliminácia tohto pôsobenia by eliminovala vedlajší účinok pri zachovaní antiproliferatívnej aktivity. Vynález teda preto zahŕňa tiež farmaceutické prostriedky na báze zlúčenín všeobecného vzorca I alebo ich solí a spôsoby ich výroby.The conjugate of the invention has the same uses as IFNα, for example, antiproliferative uses. The PEG interferon-α conjugates of the invention are useful in the treatment of immunomodulatory diseases such as neoplastic diseases, for example hair cell leukemia, CML and Kaposi's sarcoma and infectious diseases; IFNα (especially INFα2a) is also used to treat these diseases. However, the conjugate of the invention has improved properties including excellent stability, greater solubility, increased circulating half-life and plasma residence time. In addition, these conjugates have antiproliferative activity substantially greater than IFNα. Also, as mentioned above, the conjugate exhibits a surprising dissociation of antiviral and antiproliferative events. This property is additionally suitable for increasing the desired activity of the conjugate while reducing or eliminating the undesired activity. For example, when an undesirable side effect is associated with an antiviral action, the elimination of such action would eliminate the side effect while maintaining antiproliferative activity. Accordingly, the invention also encompasses pharmaceutical compositions based on the compounds of formula (I) or salts thereof, and processes for their preparation.
Farmaceutické prostriedky podlá vynálezu, používané na zvládnutie alebo prevenciu chorôb, zahŕňajú interferónový konjugát všeobecného vzorca I a terapeuticky inertný, netoxický a terapeuticky prijateľný nosič. Používané farmaceutické prostriedky môžu byť formulované a dávkované spôsobom konzistentným s dobrou lekárskou praxou pri uvážení liečeného ochorenia, stavu individuálneho pacienta, miesta podania proteínového konjugátu, spôsobu podania a iných činitelov známych z praxe.The pharmaceutical compositions of the invention used to control or prevent diseases include an interferon conjugate of Formula I and a therapeutically inert, non-toxic and therapeutically acceptable carrier. The pharmaceutical compositions used may be formulated and dosed in a manner consistent with good medical practice, taking into account the disease being treated, the condition of the individual patient, the site of administration of the protein conjugate, the route of administration, and other agents known in the art.
Navrhovaným konjugátom je fyziologicky aktívny konjugát PEG IFNa všeobecného vzorca I, hore definovaný.The proposed conjugate is a physiologically active PEG IFNα conjugate of formula I as defined above.
Čísla n a n' sú zvolené tak, že výsledný konjugát všeobecného vzorca I má fyziologickú aktivitu IFNa, ktorá môže predstavovať rovnakú, väčšiu alebo zlomok zodpovedajúcej aktivity nemodifikovaného IFNa. Čísla n a n' môžu byť rovnaké alebo rozdielne a predstavujú počet jednotiek etylénglykolu v PEG. Samotná jednotka PEG OCH2CH2 má molekulovú hmotnosť približne 44 Daltonov. Molekulová hmotnosť konjugátu (s vylúčením molekulovej hmotnosti IFNa) závisí od čísel n a n'. Súčet čísel n a n' pre konjugát všeobecného vzorca I je 600 až 1500, čo produkuje konjugát s celkovou strednou molekulovou hmotnosťou jednotiek PEG 26000 až 66000, s výhodou približne 35000 až 45000 a najmä približne 39000 až 45000 Daltonov, pričom osobitne výhodná je molekulová hmotnosť 40000 Daltonov. Výhodným súčtom čísel n a n' je približne 800 až 1200, pričom stredný súčet je približne 850 až 1000 a výhodným súčtom je 910. Každé z čísel n a n' môže byť jednotlivo 420 alebo 520, alebo môžu byť obidve 420 alebo 520, alebo môžu byť obidve 455. Výhodný pomer čísel n k n' je približne 0,5 až 1,5 a osobitne výhodný je pomer približne 0,8 až 1,2. Molekulová hmotnosť približne určité číslo znamená, že je v rozumnom rozmedzí takého čísla určeného obvyklými analytickými technikami.The numbers n '' are chosen such that the resulting conjugate of formula I has the physiological activity of IFNα, which may represent the same, greater or a fraction of the corresponding activity of unmodified IFNα. The numbers nan 'may be the same or different and represent the number of units of ethylene glycol in PEG. The PEG OCH 2 CH 2 unit itself has a molecular weight of approximately 44 Daltons. The molecular weight of the conjugate (excluding IFNα molecular weight) depends on the numbers at n '. The sum of nan 'numbers for the conjugate of formula I is 600 to 1500, producing a conjugate with a total average molecular weight of PEG units of 26000 to 66000, preferably about 35000 to 45000, and especially about 39000 to 45000 Dalton, with a molecular weight of 40000 Dalton being particularly preferred. . A preferred sum of nan 'numbers is about 800 to 1200, with a mean sum of about 850 to 1000 and a preferred sum is 910. Each of the numbers nan' may be 420 or 520 individually, or both 420 or 520, or both 455 A preferred ratio of numbers nkn 'is about 0.5 to 1.5, and a ratio of about 0.8 to 1.2 is particularly preferred. A molecular weight of approximately a certain number means that it is within a reasonable range of such a number as determined by conventional analytical techniques.
Výhodným konjugátom všeobecného vzorca I, kde IFNa je IFNa2a, je konjugát kde symboly R a R' znamenajú metylovú skupinu, konjugát, kde X je NH a konjugát kde čísla n a n' sú každé samotné alebo obidve buď 4 20 alebo 520. Taký konjugát majúci všetky uvedené vlastnosti je osobitne výhodný.A preferred conjugate of formula I wherein IFNa is IFNa2a is a conjugate wherein R and R 'are methyl, a conjugate wherein X is NH, and a conjugate wherein the numbers nan' are each alone or both of either 20 or 520. Such a conjugate having all said properties being particularly advantageous.
Symboly R a R' môžu znamenať ktorúkoľvek nižšiu alkylovú skupinu, čím sa rozumie alkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka, ako je napríklad skupina metylová, etylová a izopropylová. Zahrnuté sú rozvetvené alkyly. Výhodnou alkylovou skupinou je skupina metylová. Pokiaľ ide o dve skupiny PEG vo vzorci I môžu byť symboly R a R' rovnaké alebo rozdielne.R and R 'may be any lower alkyl group, which means an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl and isopropyl. Branched alkyls are included. A preferred alkyl group is a methyl group. For the two PEG groups in Formula I, R and R 'may be the same or different.
IFNa (interferónom a) a jeho druhom IFNa2a je mienený prírodný rekombinantný proteín, s výhodou ľudský, ktorý je získaný z bežného zdroja ako sú tkanivá, syntézy proteínov, kultivácia buniek s prírodnými alebo rekombinantnými bunkami. Zahrnutý je každý proteín majúci aktivitu IFNa, ako sú muteíny alebo inak modifikované proteíny. Získavanie a izolácia IFNa z prírodných alebo rekombinantných zdrojov sú dobre známe [Pestka, Árch. Biochem. Biophys. 221, str. 1 (1983)]. Výhodným IFNa je IFNa2a, ktorý, ako je to hore uvedené, sa získava známymi spôsobmi [Pestka, Sci. Am. 249, str. 36 (1983), európsky patentový spis číslo 43980)].IFN? (Interferon?) And its second IFN? 2a is meant a natural recombinant protein, preferably human, which is obtained from a common source such as tissues, protein synthesis, cell culture with natural or recombinant cells. Any protein having IFNα activity, such as muteins or otherwise modified proteins, is included. Obtaining and isolating IFNα from natural or recombinant sources are well known [Pestka, Ar. Biochem. Biophys. 221, p. 1 (1983)]. The preferred IFNα is IFNα2a, which, as mentioned above, is obtained by known methods [Pestka, Sci. Am. 249, p. 36 (1983), European Patent Specification No. 43980)].
Fyziologicky aktívny konjugát všeobecného vzorca I má aktivitu IFNa, ktorou sa rozumie zlomok alebo násobok ktorejkoľvek známej aktivity IFNa, tak ako je zistená rôznymi skúškami známymi v odbore. Konjugáty podľa vynálezu majú najmä aktivitu IFNa, ako je ukázaná antiproliferatívnym pôsobením proti nádorovým bunkám a protivírusovým pôsobením proti bunkám, ktoré sú infikované ví rusom. To sú známe aktivity IFNa. Taká aktivita v konjugáte môže byť zistená skúškami dobre v odbore známymi, napríklad ďalej opísanými skúškami [napríklad Rubinstein a kol. J. Virol. 37, str.The physiologically active conjugate of formula I has IFNα activity, which is understood to be a fraction or multiple of any known IFNα activity as determined by various assays known in the art. In particular, the conjugates of the invention have IFNα activity, as shown by antiproliferative activity against tumor cells and antiviral activity against cells infected with Russian. These are known IFNα activities. Such activity in the conjugate may be ascertained by assays well known in the art, for example, by the assays described below [e.g. Rubinstein et al. J. Virol. 37, p.
755 (1981), Borden a kol., Canc. Res. 42, str. 4948 (1982)]. Vynález sa týka konjugátu všeobecného vzorca I, ktorý má väčšie antiproliferatívne pôsobenie a menšie protivírusové pôsobenie ako nemodifikovaný IFNa.755 (1981), Borden et al., Canc. Res. 42, p. 4948 (1982)]. The invention relates to a conjugate of formula I having a greater antiproliferative action and a less antiviral action than unmodified IFNα.
Konjugát všeobecného vzorca I je vytvorený kovalentnou väzbou IFNa na PEG, ktorý bol aktivovaný nahradením hydroxylu PEG väzbovou skupinou, tvoriacou reakčné činidlo, ktorým je derivát PEG esteru N-hydroxysukcínimidu (najmä monometoxy PEG) všeobecného vzorca II. Reakčné činidlo je možné získať bežnými spôsobmi (Montfardini a kol.). Väzbou je amidová alebo esterová väzba. Pri výhodnom konjugáte je väzbou amidová väzba (X je NH). Súčasťou vynálezu je spôsob zvyšovania antiproliferatívnej aktivity IFNa pri znižovaní protivírusovéj aktivity IFNa viazaním IFNa, ako je to hore opísané, na reakčné činidlo všeobecného vzorca II pre vytvorenie konjugátu PEG-IFN.The conjugate of formula I is formed by covalent binding of IFNα to PEG, which has been activated by replacing the hydroxyl with a PEG linking group, which is a PEG derivative of the N-hydroxysuccinimide (especially monomethoxy PEG) of formula II. The reagent can be obtained by conventional methods (Montfardini et al.). The bond is an amide or ester bond. In a preferred conjugate, the bond is an amide bond (X is NH). The invention also provides a method of increasing the anti-proliferative activity of IFNα by decreasing the antiviral activity of IFNα by binding IFNα, as described above, to a reagent of Formula II to form a PEG-IFN conjugate.
X znamená miesto pripojenia na IFNa, v ktorom je reakčné činidlo PEG všeobecného vzorca II kovalentne viazané na IFNa. Reakčné činidlá sa pripojujú k primárnym amínovým skupinám (XH = NH2) napríklad na lyzín alebo na N-zakončenie IFNa. Reakčné činidlá sa môžu pripojovať tiež na hydroxylovú skupinu (XH = OH) napríklad na serín.X is an IFNα attachment site in which the PEG reagent of formula (II) is covalently bound to IFNα. The reagents attach to the primary amine groups (XH = NH 2 ), for example, at the lysine or at the N-terminus of IFNα. The reagents can also be attached to a hydroxyl group (XH = OH), for example to serine.
ROCH2CH2(OCH2CH2)n —O-C—IjlH (CH2)4 (II)ROCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2) n —OC — I 1 H (CH 2 ) 4 (II)
ROCH2CH2(OCH2CH2)n--ROCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n--
+ XH-IFNcc o+ XH-IFNcc
Ο IIΟ II
ROCH2CH2(OCH2CH2)n—O-C-NH (CH2)4 ROCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n —OC-NH (CH 2 ) 4
(I)(I)
ROCH2CH2(OCH2CH2)n.ROCH 2 CH 2 (OCH 2 CH 2 ) n .
—X— IFNa—X— IFNa
Reakčné činidlo všeobecného vzorca II (PEG2-NHS), kde celkom dva reťazce monometoxy PEG (m-PEG) sú viazané na lyzín, jeden na α-aminoskupinu a druhý na epsilon-aminoskupinu karbamátovými (uretanovými) väzbami a majúce lyzínkarboxylovú skupinu aktivovanú na sukcinimidylester, je možné získať bežnými spôsobmi, podľa známych postupov (Montfardini a kol.) aplikovateľnými na reakčné činidlo s R ako nižšou alkylovou skupinou a s požadovaným číslom n. Reakčné činidlo je obchodným produktom spoločnosti Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama). Získaná výhodná stredná molekulová hmotnosť PEG je približne 40000 Daltonov v PEG2-NHS (iné molekulové hmotnosti je možné získať menením čísla n pri východiskových materiáloch PEG-alkoholu pre reakčné činidlo všeobecného vzorca II, bežnými spôsobmi).Reagent of Formula II (PEG2-NHS) wherein a total of two monomethoxy PEG (m-PEG) chains are bound to lysine, one to the α-amino group and the other to the epsilon-amino group by carbamate (urethane) bonds and having a lysine carboxyl group activated to succinimidyl ester can be obtained by conventional methods according to known procedures (Montfardini et al.) applicable to a reagent with R as lower alkyl and with the desired number n. The reagent is a commercial product of Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama). The preferred average molecular weight of PEG obtained is about 40,000 Daltons in PEG2-NHS (other molecular weights can be obtained by varying the number n for the PEG-alcohol starting materials for the reagent of Formula II, by conventional methods).
Reakčné činidlo všeobecného vzorca II môže byť konjugované na IFNa bežnými spôsobmi. Špecificky reaguje reakčné činidlo všeobecného vzorca II prednostne s aspoň jednou primárnou aminoskupinou IFNa (napríklad N-zakončenie a lyzínové postranné reťazce) (napríklad IFNa2a) pre vytvorenie amidovej väzby medzi IFNa a polymérovou kostrou PEG. PEGylačná reakcia môže tiež prebehnúť medzi PEG2-NHS a prípadnými voľnými hydroxylovými skupinami (napríklad serínom) IFNa pre vytvorenie esterovej väzby. Reakčný mechanizmus je uvedený hore. Podmienky reakcie sú pre pracovníka v odbore bežné a podrobne sú opísané ďalej. Reakčné činidlo PEG sa kombinuje s IFNa za mierne zásaditých podmienok pri nízkej teplote za podmienok vhodných k nukleofilnej substitúcii, ktorá vytvorí konjugát všeobecného vzorca I, ako to objasňuje hore uvedený reakčný mechanizmus.The reagent of formula (II) may be conjugated to IFNα by conventional methods. Specifically, the reagent of Formula II preferably reacts with at least one primary amino group of IFNα (e.g., N-terminus and lysine side chains) (e.g., IFNα2a) to form an amide bond between IFNα and the PEG polymer backbone. The PEGylation reaction may also be carried out between PEG2-NHS and optional free hydroxyl groups (e.g., serine) of IFNα to form an ester bond. The reaction mechanism is shown above. Reaction conditions are conventional to those skilled in the art and are described in detail below. The PEG reagent is combined with IFNα under mildly basic conditions at low temperature under conditions suitable for nucleophilic substitution to form the conjugate of Formula I, as illustrated by the above reaction mechanism.
Pripojovanie reakčných činidiel k IFNa je možné vykonávať obvyklými spôsobmi. Použiť je možné PEG akejkoľvek zvolenej molekulovej hmotnosti podľa vynálezu. Podmienky reakcie je možné voliť pre zaistenie navrhovaného konjugátu s jedným pripojeným reakčným činidlom. Konjugát všeobecného vzorca I, ktorý má pripojené jedno reakčné činidlo všeobecného vzorca II, sa oddelí od nemodifikovaného IFNa a konjugáty majúce pripojenú viacej ako jednu molekulu reakčného činidla sa oddelia bežnými spôsobmi. Na oddeľovanie konjugátov rozdielom nábojov sa dajú použiť čistiace metódy, ako je katexová chromatografia, ktorá účinne oddeľuje konjugáty na základe ich rôznej molekulovej hmotnosti. Obsah frakcií, získaných katexovou chromatografiou, môže byť identifikovaný molekulovou hmotnosťou pomocou obvyklých metód, napríklad hmotovou spektroskopiou, SDS-PAGE, alebo inými známymi metódami oddeľovania molekulových entít podľa molekulovej hmotnosti. Podľa toho je potom identifikovaná frakcia, ktorá obsahuje konjugát všeobecného vzorca I vyčistený od nemodifikovaného IFNa a od konjugátov majúcich pripojených viacej ako jedno reakčné činidlo. Okrem toho reakčné činidlá všeobecného vzorca II uvoľňujú jeden lyzín na reakčné činidlo pri kyselinovej hydrolýze, takže počet lyzínov v hydrolýze indikuje počet PEG pripojených k proteínu, a preto je možné overiť počet molekúl reakčného činidla pripojených ku konjugátu.Coupling of reagents to IFNα can be accomplished by conventional methods. PEG of any selected molecular weight of the invention may be used. Reaction conditions can be selected to provide the proposed conjugate with one attached reagent. A conjugate of formula I having one reagent of formula II attached thereto is separated from unmodified IFNα and the conjugates having more than one reagent molecule attached are separated by conventional methods. Purification methods such as cation exchange chromatography can be used to separate conjugates by charge difference, which effectively separates the conjugates based on their different molecular weight. The content of the fractions obtained by cation exchange chromatography can be identified by molecular weight by conventional methods, for example by mass spectroscopy, SDS-PAGE, or other known methods of separating molecular entities by molecular weight. Accordingly, a fraction that contains a conjugate of Formula I purified from unmodified IFNα and from conjugates having more than one reagent attached is identified accordingly. In addition, the reagents of formula II release one lysine per reagent in acid hydrolysis, so that the number of lysines in hydrolysis indicates the number of PEG attached to the protein, and it is therefore possible to verify the number of reagent molecules attached to the conjugate.
Vynález bližšie objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú, nasledujúce príklady praktického rozpracovania pomocou priložených obrázkov.The following examples illustrate the invention in more detail with reference to the accompanying drawings.
Prehľad obrázkovImage overview
Na obr. 1 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky A498.In FIG. 1 shows the anti-tumor activity of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney cells A498.
Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek A498 v štúdijnom dni -33. V štúdijnom dni 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (30, 60, 120 alebo 300 pg) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru raz týždne počas 4 týždňov.All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human A498 kidney cells on study day -33. On Study Day 0 PEG-IFNα2a treatment was initiated. The indicated amount (30, 60, 120 or 300 µg) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite side of the tumor once a week for 4 weeks.
Na ose x je počet dni a na ose y objem nádoru v cm .The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm.
Na obr. 2 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky A498. Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek A498 v štúdijnom dni -33. V štúdijnom dni 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (10, 20, 40 alebo 100 pg) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru trikrát týždne počas 4 týždňov.In FIG. 2 shows the anti-tumor activity of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney cells A498. All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human A498 kidney cells on study day -33. On Study Day 0 PEG-IFNα2a treatment was initiated. The indicated amount (10, 20, 40 or 100 µg) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite flank of the tumor three times a week for 4 weeks.
Na ose x je počet dni a na ose y objem nádoru v cm .The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm.
Na obr. 3 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky ACHN. Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek ACHN v štúdijnom dni -25. V štúdijnom dni 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (30, 60, 120 alebo 300 pg) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru raz týždne počas 5 týždňov.In FIG. 3 shows the anti-tumor activity of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney ACHN cells. All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human kidney ACHN cells on study day -25. On Study Day 0 PEG-IFNα2a treatment was initiated. The indicated amount (30, 60, 120 or 300 µg) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite flank of the tumor once a week for 5 weeks.
Na ose x je počet dní a na ose y objem nádoru v cm3.The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm 3 .
A neošetrená kontrolaAnd untreated control
B ošetrenie 30 μg PEG-IFNa2aB treatment with 30 µg PEG-IFNα2a
C ošetrenie 60 μg PEG-IFNa2aC treatment with 60 µg PEG-IFNα2a
D ošetrenie 120 μ9 PEG-IFNa2aD treatment with 120 μ9 PEG-IFNα2a
E ošetrenie 300 μρ PEG-IFNa2aE treatment with 300 μρ PEG-IFNα2a
Na obr. 4 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky ACHN. Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek ACHN v štúdijnom dni -25. V študijnom dni 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (10, 20, 40 alebo 100 μ9) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru trikrát týždne počas 5 týždňov.In FIG. 4 shows the anti-tumor activity of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney ACHN cells. All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human kidney ACHN cells on study day -25. On Study Day 0, PEG-IFNα2a treatment was initiated. The indicated amount (10, 20, 40 or 100 µ9) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite flank of the tumor three times a week for 5 weeks.
Na ose x je počet dní a na ose y objem nádoru v cm3.The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm 3 .
Na obr. 5 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky G402. Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek G402 v štúdijnom dni -45. V štúdijnom dni 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (30, 60, 120 alebo 300 μ9) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru raz týždne počas 5 týždňov.In FIG. 5 shows the anti-tumor effect of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney G402 cells. All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human kidney G402 cells on study day -45. On Study Day 0 PEG-IFNα2a treatment was initiated. The indicated amount (30, 60, 120 or 300 μ9) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite flank of the tumor once a week for 5 weeks.
Na ose x je počet dní a na ose y objem nádoru v cm3.The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm 3 .
Na obr. 6 je znázornené protinádorové pôsobenie PEG-IFNa2a u myší, ktorým boli implantované subkutánne ľudské obličkové bunky G402.In FIG. 6 shows the anti-tumor effect of PEG-IFNα2a in mice implanted with subcutaneous human kidney G402 cells.
Všetky zvieratá dostali subkutánny implant 2xl06 ľudských obličkových buniek G402 v štúdijnom dni -45. V štúdijnom dnu 0 sa začalo s ošetrovaním PEG-IFNa2a. Vyznačené množstvo (10, 20, 40 alebo 100 pg) PEG-IFNa2a sa aplikovalo subkutánne pod protiľahlý bok nádoru trikrát týždne počas 5 týždňov.All animals received a subcutaneous implant of 2x10 6 human kidney G402 cells on study day -45. PEG-IFNα2a treatment was started on Study Day 0. The indicated amount (10, 20, 40 or 100 µg) of PEG-IFNα2a was administered subcutaneously under the opposite flank of the tumor three times a week for 5 weeks.
Na ose x je počet dní a na ose y objem nádoru v cm3.The x-axis shows the number of days and the y-axis the tumor volume in cm 3 .
Príklady rozpracovania vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Príklad 1Example 1
Príprava konjugátu všeobecného vzorca IPreparation of Conjugate of Formula I
MateriályMaterials
Interferón-a2a sa pripraví známymi spôsobmi (Pestka). Polyetylénglykol (PEG) reakčné činidlo II je obchodný produkt spoločnosti Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala). Živica Fractogel^ EMD CM 650 (S) s časticami s veľkosťou 25 až 40 pm je obchodný produkt spoločnosti EM Separations (Gibbstown, MA). Solanka (PBS) tlmená koncentrovaným fosfátom (10X), pH 7,3 je obchodný produkt spoločnosti BioWhittaker (Walkersville, MD). Vopred naliate elektroforézne sodnododecyl(lauryl)sulfátpolyakrylové gély (SDS-PAGE) a elektroforézne jednotky sú obchodné produkty spoločnosti NOVEX (San Diego, CA). Koncentrované rýchle farbivo (Fast Stain) na proteínové farbenie konjugátov PEG na SDS-PAGE je obchodný produkt spoločnosti Zoion Research, Inc. (Newton, MA). Testovací súbor endotoxínu LAL je obchodný produkt spoločnosti Associates of Cápe Cod, Inc. (Woods Hole, MA). Všetky ostatné použité reakčné činidlá majú najvyššiu dosiahnuteľnú kvalitu. Hrdelne kanylované potkany a myši BDF-1 dodávajú Charles River Laboratories (Wilmington, MA).Interferon-α2a was prepared by known methods (Pestka). Polyethylene glycol (PEG) reagent II is a commercial product of Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala). Fractogel® EMD CM 650 (S) with 25-40 µm particles is a commercial product of EM Separations (Gibbstown, MA). Brine (PBS) buffered with concentrated phosphate (10X), pH 7.3 is a commercial product of BioWhittaker (Walkersville, MD). Pre-poured electrophoretic sodium sodium dodecyl (lauryl) sulfate polyacrylic gels (SDS-PAGE) and electrophoretic units are commercial products of NOVEX (San Diego, CA). Concentrated Fast Stain for protein staining of PEG conjugates on SDS-PAGE is a commercial product of Zoion Research, Inc. (Newton, Mass.). The LAL endotoxin assay is a commercial product of Associates of Cape Cod, Inc. (Woods Hole, MA). All other reagents used are of the highest achievable quality. Throat cannulated rats and BDF-1 mice are supplied by Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
Experimentálne postupyExperimental procedures
A. Príprava konjugátu všeobecného vzorca I v malom meradleA. Small-scale preparation of the conjugate of formula (I)
Do 50 mg (2,6 pmol) IFNa v 10 ml 100 mM borátu s hodnotou pH 8,0 sa pridá 208 mg (5,2 pmol) reakčného činidla všeobecného vzorca II (so strednou molekulovou hmotnosťou 40000 Daltonov). Konečný pomer proteínu k reakčnému činidlu je 1:2. Reakčná zmes sa mieša počas dvoch hodín pri teplote 4°C. Reakcia sa ukončí nastavením hodnoty pH na 4,5 ladovou kyselinou octovou.To 50 mg (2.6 pmol) of IFNα in 10 ml of 100 mM borate, pH 8.0, 208 mg (5.2 pmol) of reagent of formula II (average molecular weight 40000 Daltons) are added. The final ratio of protein to reagent is 1: 2. The reaction mixture was stirred at 4 ° C for two hours. The reaction is terminated by adjusting the pH to 4.5 with glacial acetic acid.
Reakčná zmes sa zriedi 50-násobne vodou, sfiltruje sa cez filter 0,2 pm a aplikuje sa na stĺpec Amicon naplnený 100 ml (3,2x13 cm) Fractogelu EMD CM 650(S) nízkou prietočnou rýchlosťou 20 ml/min. Stĺpec sa vopred uvedie do rovnovážneho stavu 10 mM amóniumacetátom s hodnotou pH 4,5. Výtok stĺpca sa monitoruje absorpciou ultrafialového svetla pri 280 nm. Stĺpec sa potom premýva vyvažovacím tlmivým roztokom, kým sa absorbancia ultrafialového svetla nevráti na základnú úroveň. Konjugáty PEG-IFN majúce pripojené viacej ako jedno reakčné činidlo všeobecného vzorca II (oligoméry PEG-IFN) sa zriedia 40 mM amóniumacetátom s hodnotou pH 4,5 a konjugát všeobecného vzorca I sa eluuje roztokom 0,12 M chloridu sodného v 40 mM amóniumacetátovom tlmivom roztoku. Nemodifikovaný IFN zvyšný v stĺpci sa eluuje roztokom 0,5 M chloridu sodného v rovnakom tlmivom roztoku. Stĺpec sa regeneruje prepláchnutím 1,0 M NaCI s následným premytím vyvažovacím tlmivým roztokom. Frakcie konjugátu všeobecného vzorca I sa skoncentrujú y koncentrátore miešaných buniek Amicon opatreným membránou YM10 na koncentráciu približne 1 mg/ml.The reaction mixture was diluted 50-fold with water, filtered through a 0.2 µm filter and applied to an Amicon column packed with 100 mL (3.2x13 cm) of Fractogel EMD CM 650 (S) at a low flow rate of 20 mL / min. The column is pre-equilibrated with 10 mM ammonium acetate at pH 4.5. The column effluent is monitored by absorbing ultraviolet light at 280 nm. The column is then washed with the equilibration buffer until the absorbance of ultraviolet light returns to baseline. PEG-IFN conjugates having attached more than one reagent of formula II (PEG-IFN oligomers) are diluted with 40 mM ammonium acetate at pH 4.5 and the conjugate of formula I is eluted with a solution of 0.12 M sodium chloride in 40 mM ammonium acetate buffer solution. The unmodified IFN remaining in the column was eluted with a 0.5 M sodium chloride solution in the same buffer. The column is regenerated by rinsing with 1.0 M NaCl followed by washing with the equilibration buffer. The conjugate fractions of formula (I) are concentrated to a concentration of approximately 1 mg / ml with Amicon stirred cell concentrator equipped with a YM10 membrane.
Katexová živica Fractogel CM 650(S) použitá na čistenie účinne adsorbuje PEG a nemodifikovaný IFN. Adsorpčná schopnosť závisí od stupňa PEGylácie. Konjugáty sú viazané menej pevne ako nemodifikovaný IFN. Oligoméry PEG-IFN sa eluujú 40 mM amóniumacetátom, zatial čo konjugát všeobecného vzorca I sa eluuje roztokom 0,12 M chloridu sodného. Nemodifikovaný IFN sa eluuje roztokomThe cation exchange resin Fractogel CM 650 (S) used for purification effectively adsorbs PEG and unmodified IFN. The adsorption capacity depends on the degree of PEGylation. Conjugates are bound less tightly than unmodified IFN. PEG-IFN oligomers are eluted with 40 mM ammonium acetate, while the conjugate of Formula I is eluted with 0.12 M sodium chloride solution. Unmodified IFN is eluted with the solution
0,5 M chloridu sodného. Všetky prípravky obsahujú < 5 EU/mg endotoxínov. Výsledný prípravok obsahuje > 99 % konjugátu všeobecného vzorce I a neobsahuje nemodifikovaný IFN.0.5 M sodium chloride. All preparations contain <5 EU / mg endotoxins. The resulting formulation contains > 99% of the conjugate of Formula I and does not contain unmodified IFN.
B. Príprava konjugátu všeobecného vzorca I vo velkom meradleB. Large-scale preparation of the conjugate of formula (I)
V 63 ml 1 mM HC1 pri teplote 4°C sa rozpustí 6240 miligramov (156 μιηοΐ) reakčného činidla všeobecného vzorca II (stredná molekulová hmotnost 40000 Daltonov) a rýchlo sa pridá do 125 ml roztoku obsahujúceho 1000 mg (52 μιηοΐ) interferónu v 50 mM borátovom tlmivom roztoku, pH 9,0. Konečný pomer proteínu k reakčnému činidlu je 1:3 a konečná koncentrácia proteínu v reakčnej zmesi je 5,3 mg/ml. Reakčná zmes sa mieša počas dvoch hodín pri teplote 4°C. Reakcia sa ukončí nastavením hodnoty pH na 4,5 ľadovou kyselinou octovou.Dissolve 6240 milligrams (156 μιηοΐ) of reagent of formula II (mean molecular weight 40000 Daltons) in 63 ml of 1 mM HCl at 4 ° C and quickly add to 125 ml of a solution containing 1000 mg (52 μιηοΐ) of interferon in 50 mM borate buffer, pH 9.0. The final ratio of protein to reagent is 1: 3 and the final protein concentration in the reaction mixture is 5.3 mg / ml. The reaction mixture was stirred at 4 ° C for two hours. The reaction is terminated by adjusting the pH to 4.5 with glacial acetic acid.
Reakčná zmes sa zriedi 10-násobne vodou a aplikuje sa na stĺpec naplnený 600 ml Fractogelu EMD CM 650(M) vopred uvedeným do rovnovážneho stavu 20 mM acetátom sodným s hodnotou pH 4,5 s lineárnou prietočnou rýchlostou 1,3 cm/min. Stĺpec sa premyje vyvažovacím tlmivým roztokom nasledovaným 10 mM NaCI na odstránenie nadbytku reakčného činidla, vedľajších produktov reakcie a oligomérov PEG-IFN. Konjugát všeobecného vzorca I sa eluuje vyvažovacím tlmivým roztokom obsahujúcim 200 mM NaCI. Nemodifikovaný interferón ešte adsorbovaný v stĺpci sa odstráni premytím 0,75 M NaCI vo vyvažovacom tlmivom roztoku. Konjugát všeobecného vzorca I, ktorý bol eluovaný pri 0,3-0,5 mg/ml sa ďalej koncentruje a diafiltruje do tlmivého roztoku konečného prostriedku, 20 mM acetátu sodného, pH 5,0, obsahujúceho 150 mM NaCI. Celkový výťažok konjugátu všeobecného vzorca I je 40 až 45 %.The reaction mixture is diluted 10-fold with water and applied to a column packed with 600 ml of Fractogel EMD CM 650 (M) pre-equilibrated with 20 mM sodium acetate, pH 4.5, with a linear flow rate of 1.3 cm / min. The column is washed with equilibration buffer followed by 10 mM NaCl to remove excess reagent, reaction by-products and PEG-IFN oligomers. The conjugate of formula I is eluted with a balancing buffer containing 200 mM NaCl. The unmodified interferon still adsorbed in the column is removed by washing with 0.75 M NaCl in equilibration buffer. The conjugate of formula I, which was eluted at 0.3-0.5 mg / mL, was further concentrated and diafiltered into the final formulation buffer, 20 mM sodium acetate, pH 5.0, containing 150 mM NaCl. The overall yield of the conjugate of formula I is 40 to 45%.
Vyčistený PEG-IFN z prípravy vo veľkom meradle sa skladá z >99 % konjugátu všeobecného vzorca I. Priemerná molekulová hmotnosť konjugátu všeobecného vzorca I v tomto príklade je 62000 Daltonov vrátane molekulovej hmotnosti IFNa2a, ktorá jePurified PEG-IFN from large-scale preparation consists of> 99% conjugate of Formula I. The average molecular weight of the conjugate of Formula I in this example is 62,000 Daltons including the molecular weight of IFNa2a which is
19241 Daltonov a priemernej molekulovej hmotnosti reakčného činidla, ktorá je 40000 až 45000, približne 43000 Daltonov.19241 Daltons and an average molecular weight of the reagent that is 40,000 to 45,000, about 43,000 Daltons.
Príklad 2Example 2
Charakterizácia konjugátu všeobecného vzorca ICharacterization of the conjugate of formula I
Stanovenie proteínuProtein determination
Koncentrácie proteínu sa zisťujú pomocou hodnoty A280 1,0 pre roztok 1 mg/ml IFNa a2a.Protein concentrations were determined using an A 280 value of 1.0 for a 1 mg / mL IFNα α2α solution.
Analýza ADS-PAGEADS-PAGE analysis
Konjugát sa analyzuje gélovou elektroforézou pri použití systému nátriumdodecyl (lauryl )sulfát/polyakrylamid (8 až 16 %) za redukčných podmienok spôsobom, ktorý opísal Laemmli (Náture 227, str. 680 (1970)). SDS-PAGE obsahujúci konjugáty PEG sa vyfarbia na proteín farbivom Fast Stain (Zoion Research, Inc.) podľa inštrukcií výrobca.The conjugate was analyzed by gel electrophoresis using sodium dodecyl (lauryl) sulfate / polyacrylamide (8-16%) under reducing conditions as described by Laemmli (Nature 227, 680 (1970)). SDS-PAGE containing PEG conjugates are stained for protein with Fast Stain (Zoion Research, Inc.) according to the manufacturer's instructions.
Stanovenie endotoxínových hladínDetermination of endotoxin levels
Endotoxínové hladiny sa stanovia metódou LAL podía inštrukcií výrobca. Všetky prostriedky obsahujú <5 EU/mg endotoxínov.Endotoxin levels are determined by the LAL method according to the manufacturer's instructions. All formulations contain <5 EU / mg endotoxins.
Príklad 3Example 3
Biologické aktivity konjugátu všeobecného vzorca I in vitroBiological activities of the conjugate of formula I in vitro
Protivírusové pôsobenie v bunkách hovädzích obličiekAntiviral activity in bovine kidney cells
Protivírusové pôsobenie IFNa2a a konjugátu všeobecného vzorca I pripraveného podía príkladu 1A in vitro sa určuje biotestom v bunečnej kultúre, ktorá používa bunky Madin-Darby hovädzích obličiek (MDBK) vyvolávajúcich reakciu vezikulárnym víThe in vitro antiviral activity of IFNa2a and the conjugate of Formula I prepared according to Example 1A is determined by a cell culture bioassay using Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells inducing a vesicular virus response
- 15 rusom stomatitis (Rubinstein a kol). Protivírusové pôsobenie je uvedené v tabuľke I spolu so zodpovedajúcimi zvyškovými aktivitami ako percento východiskového IFN.- 15 Russian stomatitis (Rubinstein et al). The antiviral activity is shown in Table I together with the corresponding residual activities as a percentage of the starting IFN.
Tabuľka ITable I
Protivírusové pôsobenieAntiviral effects
In vitro antiproliferatívne pôsobenie v ľudských nádorových bunkáchIn vitro antiproliferative action in human tumor cells
Antiproliferatívne pôsobenie in vitro sa testuje v ľudských bunkách Daudi (Burkittova Lymphoma), ako ich opísal Borden a kol. Budské bunky Daudi sa získajú v podobe kultúry stacionárnej suspenzie v RPMI 1540 doplnenom 10 % teľacieho zárodočného séra a 2 mM glutamínu (Grand Island Biologicals, Grand Island, NY). Bunky sa testujú a zistí sa, že sú prosté mycoplazmy. Do jamiek mikrotitrových doštičiek sa pridajú bunky (2xl04) (Costar, MA) v 100 μΐ média. Do jamiek sa pridajú rôzne koncentrácie IFN a konjugátu všeobecného vzorca I pripraveného podľa príkladu 1A v objeme 100 μΐ. Doštičky sa inkubujú 72 hodín pri teplote 37’C v 5% oxide uhličitom. Pred zberom buniek sa bunky 16 hodín pulzujú s 0,25 μΟί/^ιιϋο 3H-tymidínu (New England Nuclear, Boston, MA). Bunky sa zoberú na sklenených filtroch a sčítajú sa v kvapalinovom scintilačnom počítači. Výsledky sa vyjadria ako percento inhibície vypočítané zo vzorca:In vitro anti-proliferative activity is tested in human Daudi cells (Burkitt's Lymphoma) as described by Borden et al. Daudi bud cells are obtained as a stationary suspension culture in RPMI 1540 supplemented with 10% calf germ serum and 2 mM glutamine (Grand Island Biologicals, Grand Island, NY). The cells are tested and found to be free of mycoplasmas. Cells (2x10 4 ) (Costar, MA) in 100 μΐ medium are added to the wells of the microtiter plates. Different concentrations of IFN and conjugate of Formula I prepared according to Example 1A in a volume of 100 μΐ are added to the wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 ° C in 5% carbon dioxide. Before harvesting the cells, the cells are pulsed with 0.25 µL / µL of 3 H-thymidine for 16 hours (New England Nuclear, Boston, MA). Cells are harvested on glass filters and counted in a liquid scintillation counter. Results are expressed as percent inhibition calculated from the formula:
% inhibície = [(A-B)/A] x 100, kde% inhibition = [(A-B) / A] x 100 where
A = cpm v kontrolnej kultúre (bunky inkubované v samotnom médie) B = cpm v experimentálnej kultúre ^-16Priebeh vzoriek je štvornásobný a stredná smerodajná odchýlka je vo všetkých prípadoch menej ako 20 % priemeru. Pokusy prebiehajú najmenej dvakrát s porovnateľnými výsledkami.A = cpm in control culture (cells incubated in medium alone) B = cpm in experimental culture? -16 The sample run is quadrupled and the mean standard deviation is in all cases less than 20% of the mean. The experiments are performed at least twice with comparable results.
Antiproliferatívne pôsobenie (IC50) a IFN konjugátu je uvedené v tabuľke II. Údaje ukazujú, že antiproliferatívne pôsobenie konjugátu všeobecného vzorca I vykazuje 28-násobné zvýšenie v porovnaní s IFN.The antiproliferative action (IC 50 ) and IFN conjugate are shown in Table II. The data show that the antiproliferative action of the conjugate of formula I shows a 28-fold increase over IFN.
Tabuľka IITable II
In vitro antiproliferatívne pôsobenie v ľudských bunečných radáchIn vitro antiproliferative activity in human cell lines
Daudi (Burkittova Lymphoma)Daudi (Burkitt's Lymphoma)
Príklad 4 FarmakokinetikaExample 4 Pharmacokinetics
Samice potkanov Sprague Dawley, chirurgicky opatrené hrdelnou kanylou s priemernou hmotnosťou 240 až 260 g sa chovajú voľne jednotlivo v klietkach s neobmedzeným prístupom k vode a potrave pri 12-hodinovom cykle svetla a tmy. V priebehu 4 až 6 hodín po nástupe sa hrdelné kanyly vypláchnu PBS. Nasledujúci deň po vypláchnutí 0,15 až 0,2 ml PBS, sa injektuje 2xl06 jednotiek IFNa v 0,2 až 0,4 ml PBS, s následnou injekciou 0,15 až 0,2 ml PBS pre zaistenie, že sa všetka droga dostala do zvieraťa. Týmto spôsobom dostalo každé zviera dávku 8χ10θ jednotiek IFNa na kg telesnej hmotnosti.Sprague Dawley female rats, surgically fitted with a throat cannula of an average weight of 240-260 g, are housed individually in cages with unrestricted access to water and food for a 12-hour light / dark cycle. Within 4-6 hours after onset, the throat cannula is rinsed with PBS. The next day after rinsing with 0.15 to 0.2 ml PBS, 2x10 6 IFNα units are injected in 0.2 to 0.4 ml PBS, followed by injection of 0.15 to 0.2 ml PBS to ensure that all drug got into the animal. In this way, each animal received a dose of 8 x 10θ IFNα units per kg body weight.
Vzorky krvi sa odoberú po 5, 15 a 30 minútach a 1, 3, 5, 12 a 24 hodinách po injekcii IFN a konjugátu všeobecného vzorcaBlood samples are taken at 5, 15 and 30 minutes and 1, 3, 5, 12 and 24 hours after injection of IFN and the conjugate of formula
I. V každom časovom okamihu, po odobraní prvých 0,15 až 0,2 ml krvi sa odoberie kanylou 0,5 ml krvi pomocou čerstvej injekčnej striekačky. Vzorky sa vyprázdnia, do sérum separujúcich skúmaviek pri teplote miestnosti. Len čo sa zhromaždia všetky vzorky zo všetkých časových okamihov, skúmavky sa odstred’u j ú 10 minút pri 14000 x g v chladenej odstredivke Eppendorf. Separované sérum sa premiestni do 1,5 ml mikroskúmaviek a zmrazí sa na -80°C než sa pripraví k biotestu. Vzorky séra sa príslušne zriedia a hore opísaným spôsobom sa stanoví protivírusové pôsobení v každom časovom okamihu. Z vynesenej závislosti aktivity na čase sa stanoví konečný polčas konjugátu všeobecného vzorca I a IFNa a výsledky sú zostavené do tabuľky III, ktorá obsahuje tiež rezidenčné časy v plazme.I. At each time point, after withdrawing the first 0.15 to 0.2 ml of blood, 0.5 ml of blood is cannulated with a fresh syringe. The samples are emptied into serum separating tubes at room temperature. Once all samples were collected at all times, the tubes were centrifuged at 14,000 x g for 10 minutes in an Eppendorf refrigerated centrifuge. The separated serum is transferred to 1.5 ml microtubes and frozen at -80 ° C before being prepared for the bioassay. Serum samples are appropriately diluted and the antiviral activity determined at each time point as described above. From the plotted activity versus time, the terminal half-life of the conjugate of formula I and IFNα is determined and the results are tabulated in Table III, which also contains plasma residence times.
Tabuľka IIITable III
Konečné polčasy (t]y2) a stredný rezidenčný čas v plazmeThe terminal half-lives (t γ 2 ) and mean plasma residence time
Konečný sa určí log lineárnou regresiou.The final is determined by log linear regression.
Príklad 5Example 5
ImunogenicitaImmunogenicity
Normálnym myšiam BDF-1 (desiatim na skupinu) sa injektujú intraperitoneálne raz denne päťkrát týždne rôzne interferónové prostriedky majúce 300000 jednotiek protivírusovéj aktivity. Niektorým myšiam sa injektuje agregovaná forma IFNa2a, ktorá je viacej imunogenická ako monomérna forma. Krvné vzorky sa odoberú 19 dní po poslednej injekcii a sérum sa vyhodnotí na neutralizujúce protilátky.Normal BDF-1 mice (ten per group) are injected intraperitoneally once daily five times a week with various interferon compositions having 300,000 units of antiviral activity. Some mice are injected with an aggregated form of IFNα2a, which is more immunogenic than the monomeric form. Blood samples are taken 19 days after the last injection and the serum is evaluated for neutralizing antibodies.
Ako vyplýva z tabuľky IV, produkovali myši s injekciouAs shown in Table IV, mice produced injected mice
IFNa2a neutralizujúce protilátky a táto odozva je silne zvýraznená u myší s injekciou interferónových agregátov. U väčšiny zvierat s injekciou konjugátu podľa vynálezu nie sú zistiteľné žiadne protilátky.IFNα2a neutralizing antibodies and this response is strongly enhanced in mice injected with interferon aggregates. No antibodies are detectable in most animals injected with the conjugate of the invention.
Tabuľka IVTable IV
ImunogenicitaImmunogenicity
* Počet jednotiek neutralizujúcich interferón na ml* Number of interferon neutralizing units per ml
Príklad 6Example 6
Protinádorové pôsobení in vivoIn vivo antitumor activity
Protinádorové pôsobenie konjugátu všeobecného vzorca I (PEG2-IFNa2a) a nemodifikovaného IFNa2a in vivo sa vyhodnocuje stanovením ich schopnosti zmenšovať, rozmery rôznych ľudských nádorových buniek implantovaných do myší. Výsledky sú patrné z obr. 1 až 6.The in vivo anti-tumor activity of the conjugate of formula I (PEG2-IFNα2a) and unmodified IFNα2a is assessed by determining their ability to diminish the dimensions of various human tumor cells implanted in mice. The results are shown in FIG. 1 to 6.
Postup: Atymickým myšiam (Harlan) sa do ľavého zadného boku implantuje 2xl06 ľudských obličkových buniek A498 (obr. 1 a 2), ľudských obličkových buniek ACHN (obr. 3 a 4) alebo ľudských obličkových buniek G402 (obr. 5 a 6). Na vyvinutie nádorov ako je to vyznačené, sa myši ponechajú 3 až 6 týždňov. Kritérium pre prevzatie do štúdie je veľkosť 0,05 až 0,50 cm3. Myši dostanú celkové týždenné dávky PEG2-IFNa2a alebo nemodifikovaného IFNa2a v rozsahu 30, 60, 120 alebo 300 μg. V prípade PEG2-IFNa2a sa myši ošetrovali raz týždne (v pondelok) 30, 60, 120 alebo 300 μ9 PEG2IFNa2a na jedno ošetrenie. V prípade nemodifikovaného IFNa2a sa myši ošetrovali trikrát týždne (v pondelok, v stredu a v piatok) 10, 20, 40 alebo 100 μ9 PEG2-IFNa2a na jedno ošetrenie. Ošetrovanie trvalo 4 až 5 týždňov v závislosti od agresivity nádoru. Každý pondelok sa pred ošetrením merali objemy nádorov.Procedure: Athymic mice (Harlan) are implanted 2x10 6 human kidney cells A498 (Figures 1 and 2), human kidney cells ACHN (Figures 3 and 4) or human kidney cells G402 (Figures 5 and 6) into the left posterior flank. . Mice are allowed to develop for 3 to 6 weeks to develop tumors as indicated. The acceptance criterion is 0.05 to 0.50 cm 3 . Mice receive total weekly doses of PEG2-IFNα2a or unmodified IFNα2a in the range of 30, 60, 120 or 300 μg. For PEG2-IFNα2a, mice were treated once a week (Monday) with 30, 60, 120 or 300 μ9 PEG2IFNα2a per treatment. For unmodified IFNα2a, mice were treated three times a week (Monday, Wednesday and Friday) with 10, 20, 40 or 100 µ9 PEG2-IFNα2a per treatment. Treatment lasted 4 to 5 weeks depending on tumor aggressiveness. Tumor volumes were measured every Monday prior to treatment.
Výsledky: PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšovanie veľkosti nádoru A498 v porovnaní s nemodifikovaným IFNa2a pri všetkých týždenných testovaných dávkach po 7, 14, 21 a 28 dňoch od zahájenie testu (obr. 1 a 2). Test trval štyri týždne. 7 dní po ošetrení sa test prerušil a 3 myši z každej skupiny boli usmrtené. U troch myší, ošetrených PEG2-IFNa2a, nebol pozorovaný zvyšný nádor. U myší, ošetrených nemodifikovaným IFNa2a, vážili nádory A498 1,28 g, 0,62 g a 1,60 g u každé z troch myší. Hmotnosť nádorov A498 troch kontrolných myší bola 2,32 g, 2,37 a 1,94 g. Po 80 dňoch na konci štvortýždennej periódy ošetrovania sa existencia nádorov zisťovala palpáciou u siedmich myší. Všetkých sedem myší bolo bez nádorového tkaniva.Results: PEG2-IFNα2a shows a significant reduction in A498 tumor size compared to unmodified IFNα2a at all weekly doses tested at 7, 14, 21 and 28 days after the start of the assay (Figs. 1 and 2). The test lasted four weeks. 7 days after treatment, the test was discontinued and 3 mice from each group were sacrificed. No residual tumor was observed in three PEG2-IFNα2a-treated mice. In mice treated with unmodified IFNα2a, A498 tumors weighed 1.28 g, 0.62 g and 1.60 g in each of the three mice. The A498 tumor weights of the three control mice were 2.32 g, 2.37 and 1.94 g, respectively. After 80 days at the end of the four-week treatment period, the existence of tumors was detected by palpation in seven mice. All seven mice were free of tumor tissue.
PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšovanie veľkosti nádoru ACHN v porovnaní s nemodifikovaným IFNa2a pri všetkých týždenných testovaných dávkach 60, 120 a 300 μg po 14, 21 a 28 a 35 dňoch od zahájenia testu (obr. 3 a 4).PEG2-IFNα2a shows a significant reduction in ACHN tumor size compared to unmodified IFNα2a at all weekly doses of 60, 120 and 300 µg tested at 14, 21 and 28 and 35 days after initiation of the assay (Figures 3 and 4).
PEG2-IFNa2a vykazuje výrazné zmenšovanie veľkosti nádoru G402 v porovnaní s nemodifikovaným IFNa2a pri týždenných testovaných dávkach 60 a 120 μg po 14, 21 a 28 a 35 dňoch od zahájenia testu (obr. 5 a 6).PEG2-IFNα2a shows a significant reduction in G402 tumor size compared to unmodified IFNα2a at weekly test doses of 60 and 120 µg at 14, 21 and 28 and 35 days after the start of the assay (Figures 5 and 6).
Priemyslová využiteľnosťIndustrial usability
Fyziologicky aktívny konjugát PEG-IFNa2a má výhodnú kombináciu vlastností, z ktorých vyniká potlačovanie rastu ľudských nádorových buniek in vivo a hodí sa preto na výrobu farmaceutických prostriedkov.The physiologically active PEG-IFNα2a conjugate has an advantageous combination of properties that excel in inhibiting the growth of human tumor cells in vivo and is therefore suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions.
Claims (18)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1883496P | 1996-05-31 | 1996-05-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK67397A3 true SK67397A3 (en) | 1997-12-10 |
| SK284458B6 SK284458B6 (en) | 2005-04-01 |
Family
ID=21790006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK673-97A SK284458B6 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-28 | Physiologically active pegylated interferon alpha conjugates, its use, method for its preparation and pharmaceutical composition |
Country Status (48)
Families Citing this family (134)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| JP2000507917A (en) | 1995-11-02 | 2000-06-27 | シェーリング コーポレイション | Continuous low-dose cytokine infusion therapy |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| US5985263A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
| US5981709A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
| HU228877B1 (en) * | 1998-03-26 | 2013-06-28 | Merck Sharp & Dohme | Formulations for stabilization of peg-interferon alpha conjugates and method for preparation such formulations |
| US6180096B1 (en) | 1998-03-26 | 2001-01-30 | Schering Corporation | Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates |
| DK1421956T3 (en) * | 1998-04-28 | 2007-10-01 | Applied Research Systems | Polyol-IFN- beta conjugates |
| TWI277424B (en) | 1998-05-15 | 2007-04-01 | Schering Corp | Combination therapy for eradicating detectable NCV-RNA in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection |
| AU767131B2 (en) * | 1998-06-08 | 2003-10-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of PEG-IFN-alpha and ribavirin for the treatment of chronic hepatitis C |
| US6277830B1 (en) * | 1998-10-16 | 2001-08-21 | Schering Corporation | 5′-amino acid esters of ribavirin and the use of same to treat hepatitis C with interferon |
| IL129299A0 (en) * | 1999-03-31 | 2000-02-17 | Mor Research Applic Ltd | Monoclonal antibodies antigens and diagnosis of malignant diseases |
| PE20010027A1 (en) | 1999-04-08 | 2001-02-05 | Schering Corp | USE OF STICKED ALPHA INTERFERON IN PATIENTS WITH MELANOMA |
| US6362162B1 (en) | 1999-04-08 | 2002-03-26 | Schering Corporation | CML Therapy |
| US6923966B2 (en) | 1999-04-08 | 2005-08-02 | Schering Corporation | Melanoma therapy |
| BR0009642A (en) * | 1999-04-08 | 2002-01-08 | Schering Corp | Chronic myelocytic leukemia therapy |
| US6605273B2 (en) | 1999-04-08 | 2003-08-12 | Schering Corporation | Renal cell carcinoma treatment |
| CZ299516B6 (en) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Erythropoietin glycoprotein conjugate, process for its preparation and use and pharmaceutical composition containing thereof |
| US6313143B1 (en) * | 1999-12-16 | 2001-11-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Substituted pyrroles |
| ATE435033T1 (en) | 2000-01-10 | 2009-07-15 | Maxygen Holdings Ltd | G-CSF CONJUGATES |
| EP1908477A3 (en) * | 2000-01-24 | 2008-06-11 | Schering Corporation | Combination of temozolomide and pegylated interferon-alpha for treating cancer |
| EP1251866A1 (en) * | 2000-01-24 | 2002-10-30 | Schering Corporation | Combination of temozolomide and pegylated interferon-alpha for treating cancer |
| RU2278123C2 (en) | 2000-02-11 | 2006-06-20 | Максиджен Холдингз Лтд. | Molecules similar to factor vii or viia |
| US6476062B2 (en) | 2000-03-30 | 2002-11-05 | Schering Corporation | Chemokine receptor antagonists |
| US6777387B2 (en) | 2000-03-31 | 2004-08-17 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same |
| US6756037B2 (en) | 2000-03-31 | 2004-06-29 | Enzon, Inc. | Polymer conjugates of biologically active agents and extension moieties for facilitating conjugation of biologically active agents to polymeric terminal groups |
| US6924270B2 (en) | 2000-04-20 | 2005-08-02 | Schering Corporation | Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection |
| WO2002002627A2 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Zymogenetics, Inc. | Interferon-like protein zcyto21 |
| WO2002060978A1 (en) | 2001-01-30 | 2002-08-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Branched polyalkylene glycols |
| BR0207576A (en) | 2001-02-27 | 2004-04-27 | Maxygen Aps | Glycosylated variant of an interferon beta precursor (ifnb) polypeptide, processes for increasing the in vivo glycosylation of a precursor ifnb molecule, producing a glycosylated ifnb molecule, preparing a conjugated variant, and treating a mammal with multiple sclerosis pharmaceutical composition , variant ifnb molecule, nucleotide sequence, expression vector, conjugated glycosylation host cell, and use of a conjugate |
| DE10112825A1 (en) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylation of active ingredients in aqueous solution |
| WO2003062290A1 (en) | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Biocompatibles Uk Limited | Polymer conjugates |
| KR100888371B1 (en) * | 2002-01-17 | 2009-03-13 | 동아제약주식회사 | Antivirus agent comprising bridged co-polymer derivatives and interferon complexes |
| DE10209821A1 (en) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Coupling of proteins to a modified polysaccharide |
| DE10209822A1 (en) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Coupling of low molecular weight substances to a modified polysaccharide |
| UA86744C2 (en) | 2002-06-21 | 2009-05-25 | Ново Нордиск Хэлс Кеа Аг | Pegylated factor vii glycoforms |
| AU2003258518B2 (en) | 2002-07-24 | 2007-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polyalkylene glycol acid additives |
| IL166506A0 (en) * | 2002-09-11 | 2006-01-15 | Fresenius Kabi De Gmbh | Hasylated polypeptides especially hasylated erythropoietin |
| EP1681303B1 (en) * | 2002-09-11 | 2013-09-04 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| EP1400533A1 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-24 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| ES2314238T3 (en) | 2002-10-08 | 2009-03-16 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | CONJUGATES OF PHARMACEUTICALLY ACTIVE OLIGOSACARIDS. |
| US7314613B2 (en) | 2002-11-18 | 2008-01-01 | Maxygen, Inc. | Interferon-alpha polypeptides and conjugates |
| BR0316324A (en) * | 2002-11-18 | 2005-09-27 | Maxygen Inc | Interferon-alpha polypeptides and conjugates |
| GB0301014D0 (en) * | 2003-01-16 | 2003-02-19 | Biocompatibles Ltd | Conjugation reactions |
| CA2458085A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-09-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Transcriptional activity assay |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| DE602004029173D1 (en) | 2003-10-10 | 2010-10-28 | Novo Nordisk As | IL-21 DERIVATIVES |
| EP2641611A3 (en) | 2003-10-17 | 2013-12-18 | Novo Nordisk A/S | Combination therapy |
| JP2007519422A (en) | 2004-02-02 | 2007-07-19 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | Modified human four helix bundle polypeptides and their use |
| CN100355784C (en) * | 2004-02-12 | 2007-12-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Method for preparing polyethylene glycol-modified alpha-interferon 1b |
| CN101659704A (en) | 2004-03-11 | 2010-03-03 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination |
| MXPA06013412A (en) | 2004-05-19 | 2007-01-23 | Maxygen Inc | Interferon-alpha polypeptides and conjugates. |
| MXPA06014684A (en) | 2004-06-18 | 2007-02-12 | Ambrx Inc | Novel antigen-binding polypeptides and their uses. |
| US20060029573A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-02-09 | Chun Shen | Pegylated interferon alpha-1b |
| JP4971160B2 (en) | 2004-08-12 | 2012-07-11 | シェーリング コーポレイション | Stable PEGylated interferon formulation |
| BRPI0519430A2 (en) | 2004-12-22 | 2009-02-10 | Ambrx Inc | modified human growth hormone |
| EP1861125A2 (en) * | 2005-03-23 | 2007-12-05 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an hgh moiety and peg derivatives |
| AU2006299901A1 (en) | 2005-05-18 | 2007-04-19 | Maxygen, Inc. | Evolved interferon-alpha polypeptides |
| EP2360170A3 (en) | 2005-06-17 | 2012-03-28 | Novo Nordisk Health Care AG | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine |
| WO2007002233A2 (en) * | 2005-06-20 | 2007-01-04 | Pepgen Corporation | Low-toxicity, long-circulating chimeras of human interferon- alpha analogs and interferon tau |
| JP4261531B2 (en) | 2005-09-06 | 2009-04-30 | 株式会社Ｎｒｌファーマ | Lactoferrin complex and method for producing the same |
| EP2339014B1 (en) | 2005-11-16 | 2015-05-27 | Ambrx, Inc. | Methods and compositions comprising non-natural amino acids |
| CN101002944B (en) * | 2006-01-17 | 2012-07-25 | 中国科学院过程工程研究所 | Conjugate of branched chair polymacrogol-interferon, and its preparing method |
| CN101002945B (en) | 2006-01-20 | 2012-09-05 | 清华大学 | Novel complex used for treating tumor |
| CN100475270C (en) | 2006-01-20 | 2009-04-08 | 清华大学 | Medicine for treating tumor, and application thereof |
| AU2007250739A1 (en) | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition for treating or preventing HCV infection |
| US20090252720A1 (en) | 2006-05-24 | 2009-10-08 | Novo Nordisk Health Care Ag | Prolonged FIX Analogues and Derivatives |
| NZ574721A (en) | 2006-09-08 | 2012-02-24 | Ambrx Inc | Hybrid suppressor trna for vertebrate cells |
| EP2069396B1 (en) | 2006-09-08 | 2015-10-21 | Ambrx, Inc. | Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses |
| CN1966547B (en) * | 2006-11-06 | 2011-11-09 | 中国药科大学 | Double-chain structured polyethylene glycol derivative preparation and its combination with pharmaceutical molecule |
| ATE459659T1 (en) * | 2006-11-07 | 2010-03-15 | Dsm Ip Assets Bv | CARBAMAT, THIOCARBAMAT OR CARBAMIDE WITH A BIOMOLECULAR GROUP |
| KR101079993B1 (en) | 2006-11-17 | 2011-11-04 | 동아제약주식회사 | Polyethylene glycol-G-CSF conjugate |
| CN101219219B (en) | 2007-01-10 | 2013-02-13 | 北京普罗吉生物科技发展有限公司 | Complex containing vascellum chalone or fragment, preparation method and application thereof |
| JP5515224B2 (en) | 2007-02-28 | 2014-06-11 | 日油株式会社 | Multi-branched polyoxyalkylene derivatives |
| BRPI0809583B1 (en) | 2007-03-30 | 2022-02-22 | Ambrx, Inc | Modified fgf-21 polypeptide, composition comprising the same, method for producing said fgf-21 polypeptide, and cell comprising a polynucleotide |
| CL2008002399A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-01-02 | Pharmaessentia Corp | Substantially pure conjugate having a polymeric portion, a protein portion (interferon alpha 2b) and an aliphatic binder of 1 to 10 carbon atoms, useful in the treatment of hepatitis b or c. |
| PL2186830T3 (en) | 2007-09-04 | 2012-09-28 | Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd | Polyethylene glycol modified interferon alpha 2b and preparation method and applicatioins thereof |
| EP2196475B1 (en) | 2007-09-04 | 2012-06-06 | Biosteed Gene Expression Tech. CO., LTD. | INTERFERON ALPHA 2a MODIFIED BY POLYETHYLENE GLYCOL, ITS SYNTHESIS PROCESS AND APPLICATION |
| NZ603812A (en) | 2007-11-20 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their uses |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| CN107033233A (en) * | 2008-01-18 | 2017-08-11 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | Purification of not-glycosylated polypeptides |
| US8906847B2 (en) * | 2008-02-01 | 2014-12-09 | Ascendis Pharma A/S | Prodrug comprising a drug linker conjugate |
| SG188143A1 (en) | 2008-02-08 | 2013-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| WO2009121210A1 (en) | 2008-04-03 | 2009-10-08 | 厦门伯赛基因转录技术有限公司 | Double-stranded polyethylene glycol modified growth hormone, preparation method and application thereof |
| JP6112766B2 (en) * | 2008-04-29 | 2017-04-12 | アセンディス ファーマ グロウス ディスオーダーズ ディヴィジョン エー／エス | PEGylated recombinant human growth hormone compound |
| TW201010692A (en) | 2008-06-19 | 2010-03-16 | Public Univ Corp Nagoya City Univ | Pharmaceutical composition for treatment or prevention of hbv infection |
| EA020766B1 (en) | 2008-07-08 | 2015-01-30 | Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем | Inhibitors of proliferation and activation of signal transducer and activator of transcription (stats) |
| NZ591235A (en) | 2008-07-23 | 2012-07-27 | Ambrx Inc | Modified bovine g-csf polypeptides comprising non natural amino acid and their uses treating infections such as mastitis |
| PL2342223T3 (en) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses |
| TR201802361T4 (en) | 2008-09-26 | 2018-03-21 | Ambrx Inc | Microorganisms and vaccines dependent on unnatural amino acid replication. |
| IT1399351B1 (en) | 2009-06-16 | 2013-04-16 | Fidia Farmaceutici | PROCEDURE FOR THE SYNTHESIS OF GLYCOSAMINOGLICAN CONJUGATES (GAG) WITH BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES, POLYMERIC CONJUGATES AND RELATIVE USES |
| WO2011014882A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Medtronic, Inc. | CONTINUOUS SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF INTERFERON-α TO HEPATITIS C INFECTED PATIENTS |
| EA201200650A1 (en) | 2009-10-30 | 2012-12-28 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | COMBINED TREATMENTS OF HEPATITIS C VIRUS, INCLUDING BI201335, INTERFERON-ALPHA AND RIBAVIRIN COURSES |
| CN104017063A (en) | 2009-12-21 | 2014-09-03 | Ambrx公司 | Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses |
| NZ600361A (en) | 2009-12-21 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses |
| JP6148013B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-06-14 | リグショスピタレト | Chimera inhibitor molecule of complement activation |
| EP2569331A1 (en) | 2010-05-10 | 2013-03-20 | Perseid Therapeutics LLC | Polypeptide inhibitors of vla4 |
| EP2585065A1 (en) | 2010-06-24 | 2013-05-01 | Panmed Ltd. | Treatment of hepatitis c virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent |
| RU2447083C1 (en) * | 2010-07-20 | 2012-04-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | NOVEL FUNCTIONALLY ACTIVE, HIGHLY PURE, STABLE CONJUGATE OF INTERFERON α WITH POLYETHYLENE GLYCOL, REPRESENTED BY ONE PEG- NαH-IFN POSITIONAL ISOMER, WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY, WITH PROLONGED BIOLOGICAL ACTION, SUITABLE FOR MEDICAL APPLICATION, AND IMMUNOLOGICAL AGENT BASED THEREON |
| CA2805564A1 (en) | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Stefan Jenewein | Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| MY162837A (en) | 2010-08-17 | 2017-07-31 | Ambrx Inc | Modified relaxin polypeptides and their uses |
| AR083006A1 (en) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | FORMULATIONS FOR THE STIMULATING FACTOR OF COLONIES OF GRANULOCITS (G-CSF) BOVINE AND VARIANTS OF THE SAME |
| WO2012146630A1 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof |
| CN102229667A (en) * | 2011-06-03 | 2011-11-02 | 北京伟嘉人生物技术有限公司 | Polyethylene glycol modified porcine alpha-interferon, preparation method and application thereof |
| CN103930440A (en) | 2011-07-01 | 2014-07-16 | 拜耳知识产权有限责任公司 | Relaxin fusion polypeptides and uses thereof |
| EA201490399A1 (en) | 2011-08-03 | 2014-06-30 | Ситерис | HCV Immunotherapy (Hepatitis C Virus) |
| WO2013137869A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population |
| JP2015512900A (en) | 2012-03-28 | 2015-04-30 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Combination therapy to treat HCV infection in a special patient genotype subpopulation |
| EP2859017B1 (en) | 2012-06-08 | 2019-02-20 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
| DK2863955T3 (en) | 2012-06-26 | 2017-01-23 | Sutro Biopharma Inc | MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF |
| EP3584255B1 (en) | 2012-08-31 | 2022-02-16 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising an azido group |
| EA022617B1 (en) * | 2013-03-28 | 2016-02-29 | Илья Александрович МАРКОВ | Monopegylated interferon-alpha of branched structure and a pharmaceutical composition for preparing a medicament having interferon-alpha activity |
| EA023323B1 (en) * | 2013-03-28 | 2016-05-31 | Илья Александрович МАРКОВ | Branched acyl azide pegylating agent, method for preparing the same and method for preparing pegylated interferon |
| EA021610B1 (en) * | 2013-03-28 | 2015-07-30 | Илья Александрович МАРКОВ | Liquid antiviral formulation |
| US9764039B2 (en) | 2013-07-10 | 2017-09-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
| US9840493B2 (en) | 2013-10-11 | 2017-12-12 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
| EP2907512A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-19 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Inhibitors of MMP-12 as antiviral Agents |
| RU2554761C1 (en) * | 2014-05-13 | 2015-06-27 | Закрытое акционерное общество "Сибирский центр фармакологии и биотехнологии" | Anti-enteroviral and immunostimulating agent |
| UY36370A (en) | 2014-10-24 | 2016-04-29 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware | MODIFIED FGF-21 POLIPEPTIDES AND ITS USES |
| HRP20231732T1 (en) | 2014-11-06 | 2024-03-15 | Pharmaessentia Corporation | Dosage regimen for pegylated interferon |
| HRP20211734T8 (en) | 2014-11-21 | 2022-03-04 | Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S | Long-acting growth hormone dosage forms |
| BR112018009009A8 (en) | 2015-11-03 | 2019-02-26 | Hoffmann La Roche | combined therapy of an hbv capsid formation inhibitor and an interferon |
| CN106749608B (en) * | 2015-11-18 | 2021-10-15 | 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 | Interferon alpha conjugates |
| WO2018087345A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON |
| ES2963839T3 (en) | 2017-02-08 | 2024-04-02 | Bristol Myers Squibb Co | Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof |
| RU2678332C1 (en) | 2017-09-08 | 2019-01-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") | Pegylated interferon lambda with high bioaccessability in oral use and method for production thereof |
| HRP20240016T1 (en) | 2018-09-11 | 2024-03-29 | Ambrx, Inc. | Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses |
| CN113366015A (en) | 2018-10-19 | 2021-09-07 | Ambrx公司 | Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof and uses thereof |
| BR112021015832A2 (en) | 2019-02-12 | 2022-01-18 | Ambrx Inc | Compositions containing antibody-tlr agonist conjugates, methods and uses thereof |
| WO2021183832A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Ambrx, Inc. | Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof |
| AU2021327396A1 (en) | 2020-08-20 | 2023-03-23 | Ambrx, Inc. | Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof |
| AU2022249223A1 (en) | 2021-04-03 | 2023-10-12 | Ambrx, Inc. | Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4609546A (en) | 1982-06-24 | 1986-09-02 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Long-acting composition |
| WO1984004745A1 (en) | 1983-05-31 | 1984-12-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel polypeptides and their use |
| US4681848A (en) | 1982-09-22 | 1987-07-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel peptide and use thereof |
| GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| JP2524586B2 (en) | 1985-06-26 | 1996-08-14 | シタス コーポレイション | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions utilizing polymer conjugation |
| DE3719046A1 (en) | 1987-06-06 | 1988-12-15 | Basf Ag | USE OF SALTS OF SULFONAMIDE CARBONIC ACIDS AS CORROSION INHIBITORS IN AQUEOUS SYSTEMS |
| US5122614A (en) | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| US5145773A (en) * | 1989-05-25 | 1992-09-08 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method to detect sensitivity to alpha-interferon therapy |
| ATE136315T1 (en) * | 1989-05-27 | 1996-04-15 | Sumitomo Pharma | METHOD FOR THE PRODUCTION OF POLYETHYLENE GLYCOL DERIVATIVES AND MODIFIED PROTEINS. |
| US5238915A (en) | 1991-02-08 | 1993-08-24 | Wakunaga Seiyaku K.K. | Aromatic composition and method for controlling aroma |
| US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| GB9111967D0 (en) | 1991-06-04 | 1991-07-24 | Erba Carlo Spa | 2,5'-nucleotide analogs as antiviral agents |
| US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
| ZA933926B (en) | 1992-06-17 | 1994-01-03 | Amgen Inc | Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| DK0730470T3 (en) * | 1993-11-10 | 2002-06-03 | Enzon Inc | Improved interferon polymer conjugates |
| AU1916295A (en) * | 1994-02-08 | 1995-08-29 | Amgen, Inc. | Oral delivery of chemically modified proteins |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5738846A (en) * | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| TW426523B (en) | 1995-04-06 | 2001-03-21 | Hoffmann La Roche | Interferon solution |
| CA2458085A1 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Transcriptional activity assay |
-
1997
- 1997-04-19 TW TW086105104A patent/TW517067B/en not_active IP Right Cessation
- 1997-04-23 CA CA002203480A patent/CA2203480C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-07 RS YU17597A patent/RS49533B/en unknown
- 1997-05-09 TR TR97/00358A patent/TR199700358A3/en unknown
- 1997-05-12 SG SG1997001485A patent/SG55314A1/en unknown
- 1997-05-14 SA SA97180030A patent/SA97180030B1/en unknown
- 1997-05-22 DE DE69720320T patent/DE69720320T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-22 ES ES97108261T patent/ES2110386T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-22 SI SI9730506T patent/SI0809996T1/en unknown
- 1997-05-22 DE DE0809996T patent/DE809996T1/en active Pending
- 1997-05-22 AT AT97108261T patent/ATE235920T1/en active
- 1997-05-22 EP EP97108261A patent/EP0809996B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-22 PT PT97108261T patent/PT809996E/en unknown
- 1997-05-22 DE DE2003199018 patent/DE10399018I1/en active Pending
- 1997-05-22 DK DK97108261T patent/DK0809996T3/en active
- 1997-05-23 IL IL12090297A patent/IL120902A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-26 NZ NZ314903A patent/NZ314903A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-26 ZA ZA974583A patent/ZA974583B/en unknown
- 1997-05-27 PA PA19978431001A patent/PA8431001A1/en unknown
- 1997-05-27 EG EG46597A patent/EG24292A/en active
- 1997-05-27 TN TNTNSN97091A patent/TNSN97091A1/en unknown
- 1997-05-28 SK SK673-97A patent/SK284458B6/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-28 HR HR970298A patent/HRP970298B1/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-28 HU HU9700959A patent/HU227992B1/en unknown
- 1997-05-28 PL PL97320251A patent/PL186949B1/en unknown
- 1997-05-29 CN CN97113049A patent/CN1088721C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-29 MY MYPI97002342A patent/MY117909A/en unknown
- 1997-05-29 AR ARP970102305A patent/AR008378A1/en active IP Right Grant
- 1997-05-29 JP JP9139807A patent/JP2980569B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-29 CO CO97029836A patent/CO4950528A1/en unknown
- 1997-05-30 OA OA70015A patent/OA10488A/en unknown
- 1997-05-30 MA MA24641A patent/MA24193A1/en unknown
- 1997-05-30 BG BG101540A patent/BG62273B1/en unknown
- 1997-05-30 UA UA97052543A patent/UA56989C2/en unknown
- 1997-05-30 RU RU97108698/14A patent/RU2180595C2/en active
- 1997-05-30 KR KR1019970022223A patent/KR100254097B1/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 TJ TJ97000465A patent/TJ328B/en unknown
- 1997-05-30 AU AU23723/97A patent/AU725195B2/en not_active Expired
- 1997-05-30 UY UY24572A patent/UY24572A1/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 IS IS4491A patent/IS1988B/en unknown
- 1997-05-30 NO NO19972480A patent/NO322964B1/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 SV SV1997000049A patent/SV1997000049A/en not_active Application Discontinuation
- 1997-05-30 CZ CZ19971679A patent/CZ292775B6/en not_active IP Right Cessation
- 1997-06-02 BR BR9703421A patent/BR9703421A/en not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-01-30 GR GR970300063T patent/GR970300063T1/en unknown
- 1998-05-21 HK HK98104388A patent/HK1005225A1/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-27 US US10/377,892 patent/US7201897B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-08 NL NL300127C patent/NL300127I2/en unknown
- 2003-06-25 LU LU91029C patent/LU91029I2/en unknown
-
2004
- 2004-03-19 CY CY0400021A patent/CY2433B1/en unknown
-
2005
- 2005-04-05 CY CY200500006C patent/CY2005006I1/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0809996B1 (en) | Interferon conjugates | |
| TWI232882B (en) | Poly-IFN-beta conjugates | |
| JP3747070B2 (en) | Improved interferon-polymer conjugate | |
| KR100689212B1 (en) | Gcsf conjugates | |
| JP2989002B2 (en) | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor | |
| US20060029573A1 (en) | Pegylated interferon alpha-1b | |
| HUT75533A (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
| RU2447083C1 (en) | NOVEL FUNCTIONALLY ACTIVE, HIGHLY PURE, STABLE CONJUGATE OF INTERFERON α WITH POLYETHYLENE GLYCOL, REPRESENTED BY ONE PEG- NαH-IFN POSITIONAL ISOMER, WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY, WITH PROLONGED BIOLOGICAL ACTION, SUITABLE FOR MEDICAL APPLICATION, AND IMMUNOLOGICAL AGENT BASED THEREON | |
| US8454947B1 (en) | PEG-interferon lambda 1 conjugates | |
| US20100239532A1 (en) | Interferon alpha2a modified by polyethylene glycol, the preparation and use thereof | |
| JP2009536963A (en) | Polyethylene glycol-interferon α conjugate | |
| MXPA97004012A (en) | Conjugados de interfe | |
| KR100888371B1 (en) | Antivirus agent comprising bridged co-polymer derivatives and interferon complexes | |
| EP1369429A1 (en) | GCSF conjugates | |
| KR20070110162A (en) | Polyethylene glycol-interferon alpha conjugate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20170528 |