KR101726884B1

KR101726884B1 - 변형된 소의 ｇ-ｃｓｆ 폴리펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101726884B1
Application number: KR1020117004053A
Authority: KR
Inventors: 푸트남 안나-마리아 에이 헤이스; 닉 누드슨; 티아 노만; 앨런 코더; 바딤 크라이노브; 릴리안 호; 피터 씨 캐닝
Original assignee: 암브룩스, 인코포레이티드; 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2017-04-26
Also published as: BRPI0916515B1; CO6351745A2; CN106928339A; BRPI0916515A2; AU2009274076A1; AU2009274076B2; PL3225248T3; CN102159230A; US20230348547A1; WO2010011735A2; PE20110426A1; EP2318029A4; IL210265A0; EP2318029B1; JP2011529060A; CL2011000013A1; UA103774C2; EP3225248B1; EA201170242A1; US20100035812A1

Abstract

변형된 소의 G-CSF 폴리펩타이드 및 이의 용도가 제공된다.

Description

변형된 소의 Ｇ-ＣＳＦ 폴리펩타이드 및 이의 용도{MODIFIED BOVINE G-CSF POLYPEPTIDES AND THEIR USES}

본 발명은 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 이용하여 변형될 수 있는 소의 과립구 콜로니 자극 인자 (bG-CSF) 폴리펩타이드에 관한 것이다.

식용 동물 사육에 있어서 전염성 질병의 경제적 파급 효과에 대해서는 문헌에 의해 충분히 입증된 바 있다. 전염성 질병은 수익을 감소시키고, 생산 비용을 증대시키며, 식료품에 유해할 뿐 아니라 동물의 생육 상태, 건강 및 후생 복지에도 영향을 준다. 질병은 우유의 생산량과 품질을 떨어뜨려 낙농업자 및 육우업자에게도 큰 경제적 손실을 가져오는데, 특히 전염성 미생물에 의한 질병이 신생 동물, 어린 동물 (예를 들어, 대체 가축) 또는 성장한 동물의 질병률 및 폐사율을 야기하게 되는 경우에는 더욱 그러하다. 유선염 및 소 호흡기 질환(BRD)의 이 두 질병은 식용 동물 사육에 엄청난 영향을 줄 수 있다.

유선염은 젖샘(유선)에 염증이 생긴 것을 말한다. 이는 예를 들어 소, 암양 및 염소 등 여느 포유류에도 영향을 줄 수 있다. 소의 유선염은 소와 같은 되새김 동물의 유방에 감염되는 것으로, 주로 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아에 의해 발생하게 되며, 특히 우유를 생산하는 집약적 축산 농가에서 그러하다. 이런 박테리아 감염은 유선(즉, 유두와 유방)의 염증을 초래하게 된다. 동물들은 분만 전후 기간(전환기) 동안 호중구의 살균 작용이 손상되기 때문에 유선염에 대해 더욱 취약해 질 수 있다. 이러한 질병은 착유 과정에서 병원균이 한 동물에서 다른 동물로 바로 전이가 되기 때문에 특히 골칫거리이며, 경제적으로도 상당히 중요한 문제이다. 이 질병은 출산이 임박한 첫 몇 주 동안 발생하기 시작하여 각 수유기 때에 재발하는 경우가 많다. 소의 유선염을 일으키는 주된 병원성 미생물의 예로서는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코커스 디스갈락티아에(Streptococcus dysgalactiae), 대장균(Escherichia coli), 에어로박터 에어로게네스(Aerobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 및 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 들 수 있다. 이에 대해서는, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Bovine Mastitis, edited by Glenys Bloomfield, V&O Publications 1987]을 참조할 수도 있다. 이러한 미생물들이 유두관을 따라 유방으로 침범해 우유를 생성하는 조직에 염증을 일으켜 반흔 조직(scar tissue)의 형성을 초래하는데, 이것이 한번 생기게 되면 소의 우유 생산은 감산 상태로 지속될 수 있다. 감염은 또한 우유의 조성, 양, 외관 및 품질에 변화를 줄 수도 있다. 유선염을 유발하는 병원균은 두 개의 범주로 나눌 수가 있는데, 즉 전염성인 것과 환경성인 것이 그것이다. 전염성 박테리아, 예컨대 스트렙토코커스 아갈락티아에 및 스타필로코커스 아우레우스는 주로 유선, 유두관 및 유두 피부 병변과 같은 숙주 조직에 집단 서식하여, 착유 과정 동안 감염된 소로부터 다른 소로 퍼지게 된다. 환경성 박테리아, 흔히 스트렙토코커스, 엔테로코커스 및 대장균류 유기체는 소의 배설물, 토양, 식물체, 깔깃(bedding) 또는 물과 같은 소의 환경 원천 내에 흔히 존재하며, 동물과의 우연한 기회 감염성 접촉으로 인해 감염시키게 된다. 전염성 병원균과 환경성 병원균의 차이는, 대체적으로, 서로 다른 군의 미생물에 대하여 서로 다른 젖소 유지 대책이 필요하기 때문에 실제적으로 중요하다. 모든 소 유선염의 경우에 있어서, 그 우연한 미생물이 무엇이건 간에, 유방의 내분비선으로 침범한 병원균의 이동 경로는 유두 구멍과 유두관을 통해서 이동한다. 유해 미생물의 통상적인 공급원으로서는 비위생적인 착유 장비, 착유기, 유선염에 걸린 다른 동물, 비위생적인 사육장 환경 및 동물의 자체 배설(배변/배뇨) 과정을 포함한다.

그 중증도와 증후가 다양한 여러 가지 형태 또는 유형의 소 유선염이 존재하는데, 하기를 포함한다: (1) 유방 감염: 내선 내부에서 증가하는 미생물에 의한 유방강(udder cavity) 침입과 염증 유발; (2) 비임상적 또는 준임상적 유선염: 구체적인 시험에 의해 감지될 수 있는 우유에서의 변화들이 존재하더라도 내선이 붓거나 우유에 비정상적 소견이 관찰되지 않는 형태의 유선염. 이러한 유형의 유선염은 단연코 가장 횡행하여 대부분의 가축에 있어서 가장 크나큰 총체적 손실을 야기하게 된다. 흔히 "잠재된" 유선염이라고도 함; (3) 임상적 유선염: 유방의 비정상적인 질환과 분비가 관찰되는 형태의 유선염. 가벼운 임상적 유선염은 우유에서 플레이크, 덩어리 및 묽거나 이상한 외관 형태와 같은 변화를 수반한다. 유방의 발열과 예민한 정도는 약하거나 부재하지만, 부어 오르는 징후가 있을 수 있다. 중증의 임상적 유선염은 발열이 있고 단단해지며 예민해진 감염된 부위가 갑작스레 부어 오르는 것을 수반한다. 우유는 비정상적으로 보이며 우유 생산량도 떨어진다. 때로는, 유방 내의 국소적 영향 이외에도, 소 자체가 병에 걸리게 된다. 열, 빠른 맥박, 우울, 나약함 및 식욕 감퇴의 징후가 존재한다. 이러한 상태들이 병합된 것을 흔히 급성 전신성 유선염이라 칭하는데, 이는 유방뿐 아니라 동물 몸 전체가 영향을 받기 때문이다; (4) 만성 유선염: 대부분 비임상적 형태로 존재하지만 경우에 따라 활성 임상형으로 발전할 수 있는 지속적 유방 감염에 의해 야기되는 유선염의 형태. 이렇게 질병이 갑작스레 재발한 후에는 이러한 비임상적 형태가 전과 같이 일시적으로 회복된다 (일반적으로 문헌 [Current Concepts of Bovine Mastitis, published by The National Mastitis Council, Inc., 2nd Ed. 1978]의 5페이지를 참조한다).

유선염은 낙농 산업에 큰 경제적 손실을 지속적으로 초래하게 된다. 유선염은 직접 혹은 간접적으로 다양한 방식(하기를 포함)에 의해 가축의 수익성에 영향을 준다: (1) 우유 생산량 손실; (2) 감염된 소의 높은 도태율; (3) 우유 가격 하락; (4) 항생제 처리에 따라 버려지는 우유; (5) 가축 질병의 치료와 관련된 비용(항생제 및 수의사 방문); 및 (6) 폐사 (문헌 [Bovine Mastitis, Glenys Bloomfield, 상기 참조], 33페이지).

축산업에 영향을 주는 다른 흔한 질병으로는 수송열(shipping fever)(소 호흡기 질환 또는 BRD)이 있다. BRD는 하기에 서술하는 두 가지 이유 때문에 "복합 질환"으로 불리워 왔다: 이는 서로 상호작용하는 다양한 병원균(바이러스성과 박테리아성 모두 해당됨)에 의해 통상적으로 야기되어 완전히 진행된 질병을 일으키며, 병원균의 거동이 단계적으로 동물을 병들게 하는 순차적인 과정을 따를 수 있기 때문이다. 박테리아성 병원균은 급성 증상에 있어서 가장 잘 알려진 원인 중의 하나이다. 이 박테리아성 병원균은 바이러스 감염 및 다른 요인들, 예컨대 젖때기(이유), 운송, 먹이의 변화 및 주위 온도와 습도의 변화에서 오는 스트레스에 의해서 면역 반응이 제대로 기능하지 못하게 된 후에 소의 기도로 침입할 수 있다. 많은 경우, 가축 사육장에 운반된 가축에게 높은 발병률을 초래하는 것으로서 트럭, 가축수용소 및 경매 우사에서와 같이 출신이 다른 가축들과 뒤섞여 수송되는 것도 가축이 병원균에 노출되는 경우로 추가된다.

BRD와 관련이 있는 일부 박테리아 종들이 단리되었으며, 가장 흔한 것들로는 만헤미아 해몰라이티카(Mannhemia haemolytica), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및(또는) 히스토필루스 솜무스(Histophilus somni.)가 있다. 해모필루스 솜무스(Haemophilus somnus)은 소에게 패혈증을 야기하는 악성 병원균으로서, 때로는 이로 인해 나타나는 징후들이 "해모필루스 솜무스 콤플렉스"로 지칭되어 왔는데, 이들 중 한 형태가 호흡기 질환이며, 소의 전염성 코기관염 (IBR), 소의 바이러스성 설사증 (BVD)과 같은 바이러스 및 소의 합포체성 폐렴 바이러스 (BRSV)도 BRD 콤플렉스를 개시하는데 관련되어, 흔히 2차 박테리아 감염을 개시할 수 있게 된다.

이러한 유기체들을 환경에서 제거하기란 사실상 불가하기 때문에, BRD 콤플렉스에 대해서는 이러한 질환을 야기하는 병원체들이 강력해지는 것을 예방하고, 가능한 신속하고 효과적으로 임상 케이스들을 찾아내어 치료하려는 관점에서 접근해 가야 한다. 호흡기 질환은 육우에 있어서 질병으로 인한 손실의 주된 요인이다. 수송열의 대부분의 경우, 폐사의 궁극적 요인은 박테리아성(통상 파스튜렐라) 폐렴인 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 파스튜렐라 해몰라이티카, 특히 1A형은 북아메리카의 호흡기 질환의 경우에서 단리된 가장 흔한 박테리아이다. 수송열에 관련된 일부 병원체에 대한 백신 접종은 때로 도움은 되지만, 백신은 복합 질환에 관련되는 것으로 알려진 수 개의 병원체에 대해서만 효과적으로 이용가능하다.

항생제 치료는 유선염과 BRD를 제어하는 전략에 있어서 주요한 구성 요소였다. 본원에 그 내용 전체가 참고로 포함되는 미국특허 제7,182,948호는 요오드를 함유하는 항균성 유두 침지법(teat dip)이 유선 감염 및 유선염을 발생시키는 박테리아에 효과적인 것으로 나타났음 보여준다(문헌 [Pankey, J. W. et al., (1983) J. Dairy Sci. 66 (1), 161-167]). 이러한 조성물은 보통 착유 이전뿐 아니라 착유컵을 제거한 이후에도 유두를 침지하거나 유두에 분무함으로써 유두에 투여된다. 유선염을 감소시키기 위해서, 시판되는 유두 침지는 다양한 항균성 제제, 예컨대 요오드포, 4급 암모늄 화합물, 염소 방출 화합물 (예를 들어, 알칼리 하이포염소산염), 산화 화합물 (예를 들어, 과산화수소, 과산), 양성자화된 카르복실산 (예를 들어, 헵탄산, 옥탄산, 노나논산, 데칸산, 운데칸산), 산 음이온(예를 들어, 알킬아릴 설폰산), 과산화염(아염소산염 유래) 및 비스비구아니드, 예컨대 클로헥시딘를 포함하도록 개발되어 왔다. 효력의 정도가 다양한 이러한 제제들은 유두 상의 병원균 서식을 감소시켜 유선염의 전염을 제한하게 된다. 그러나, 항균성 제제를 사용함으로써 나타나는 문제점들이 존재한다. 가장 일반적인 것이 유두 염증 및 유두 균열이다. 이러한 문제점들을 완화하기 위해, 연화제, 예컨대 글리세린 및 라놀린을 이러한 조성물에 포함시켰다. 하지만, 이러한 연화제들의 사용에도 불구하고 피부 염증은 여전히 발생할 수 있다.

미국특허 제6,790,867호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)는, 플루닉신과 같은 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)을 플로페니콜과 같은 불소화 클로람페니콜 또는 티암페니콜 유도체 항생제와 혼합해 만든 제형의 피하 주사를 이용해, BRD를 치료할 수 있음을 시사하고 있다. 미국 출원 공보 제20070155799호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)는, 항생제 전구약물로서 사용될 수 있고, NSAID 또는 다른 항생제들과 병용할 수 있는 신규한 페니콜 화합물을 개시하고 있다.

유선염을 감소시키고 우유의 품질을 향상시키는데 헌신하는 비영리 기관인 NMC (국립 유선염 위원회가 전신)는 적절한 유두 위생의 중요성뿐 아니라, 유선염의 예방을 위한 적절한 유두 관리의 중요성을 강조하고 있다. 유선염으로 인한 경제적인 피해로 이를 제어하기 위해 수많은 연구가 이루어지고 있다. 신체적 스트레스뿐 아니라 환경 조건이 유선염 감염에 있어 가장 큰 원인 제공을 했다고 보고된 바 있다. 이에 대해서는, 미국 출원 공보 제20020051789호(본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 준임상적 유선염은 불량한 유두 상태와 직접적으로 관련되는 것으로 문헌으로 입증(문헌 [Neijenhuis, P. et al., (2001) J. Dairy Sci. (84) 2664-2672] 참조)되었기 때문에, 연화제(유연제)를 포함하는 다수의 시판되는 유두 침지 용액이 발달되었다(문헌 [National Mastitis Council, Summary of Peer-Reviewed Publications on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since 1980; January 2002] 참조). 유두 말단의 각질 증식과 거칠어짐은 임상적 유선염과 직접적으로 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Neijenhuis, F. et al., (2001) J. Dairy Sci. (84) 2664-2672] 참조). 유두의 갈라짐과 염증을 줄이는 일뿐 아니라, 유두의 유연성을 유지하는 일은 유선의 감염 질환을 조절하는데 매우 중요하다. 글리세린은 유두 침지 용액 내에서 유두 유연제로서 사용되어 오기도 했다. 그러나, 이에 관한 여러 연구들은, 1%의 요오드 유두 침지 용액 내 중에 글리세린 함량을 2%에서 10%로 증가시켰을 경우, 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 또는 대장균과 같은 유선염 유발 박테리아의 현저한 감소 현상은 나타나지 않는다는 명시하고 있다(문헌 [National Mastitis Council, Summary of Peer-Reviewed Publications on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since 1980; January 2002] 참조). 따라서, 유두 침지 용액과 같은 제품을 이용할 수는 있지만, 유선염의 발생률, 재발 정도 및/또는 중증도를 조절하기에는 아직 역부족이며, 해결해야 할 과제들이 존재한다.

미국특허 제5,849,883호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)는 유선염의 치료에 사용되는 다수의 항생제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, β-락탐계 항생제, 예컨대 페니실린 (암피실린, 클록사실린, 헤타실린, 나프실린, 페니실린 G, (벤질 페닐실린), 프로케인 페니실린) 및 세팔로스포린 (세포페라존, 세푸록심, 세팔로늄, 세파피린, 세폭사졸, 세프라세트릴); 아미노글리코시드계 항생제 (프라마이세틴, 네오마이신, 노보비오신, 스트렙토마이신); 마크롤리드계 항생제 (에리스로마이신); 테트라사이클린계 항생제 (클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린); 및 폴리펩타이드계 항생제 (폴리마익신 B)를 개시하고 있다. 유선염의 항생제 치료는 보통 임상적 유선염이 감지된 수유기의 소들에게, 또는 건유기의 소들에게(건유기 치료) 유선 내 주입에 의해 이루어진다(상기 문헌의 69페이지 "Bovine Mastitis" 참조). 상태가 심각한 임상적 질병이 존재하는 경우에는, 항생제를 비경구적으로 투여해야 하는데, 이는 체내 도관이 막혀 유선 내 주입이 비효율적이기 때문이다.

일찍이 항생제가 질병을 완벽하게 통제해줄 것이라는 희망은 실현되지 못했다. 따라서, 이제껏 사용해왔던 상기 언급한 항생제들 중에서 그 어느 것들도 만족스럽지 못했다. 또한, 하기의 이유들 때문에라도 항생제 치료를 무항생제 화학요법제 화합물로 대체하는 것이 매우 바람직한 것으로 밝혀졌다: (1) 인간의 질병에서 나타나는 박테리아의 균주 내성이 강력해지는 것을 막기 위해, 인간의 의학에서 유효한 항생제는 수의학에서는 사용해서는 안 된다는 점; (2) 항생제의 남용으로 박테리아 균주가 항생제에 대한 내성을 키우는 것으로 판명되었기 때문에, 항생제의 사용은 어떠한 화학요법제 화합물을 사용해도 효과가 없는 질병을 치료할 경우를 위해서만 유보해야 한다는 점; (3) 상기 제시한 병원체들 중 하나인 스타필로코커스 아우레우스는 이미 소의 유선염 치료에 사용되는 대부분의 항생제에 대해 내성을 보유했다는 점.

무항생제 화학요법제 화합물에 의한 치료 중 하나가 미국특허 제4,610,993호(본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는데, 이 특허는 하나 이상의 피리딘-N-옥시드 디설파이드 화합물의 유효량으로 소의 유선염을 치료하는 방법을 권리로서 청구하고 있다. 동일한 발명자들에 의해 연구된 또 다른 방법은 미국특허 제4,401,666호(본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는데, 이 특허는 피리딘 2-티온-N-옥시드의 하나 이상의 금속성 염의 유효량으로 소의 유선염을 치료하는 방법을 권리로서 청구하고 있다. 이러한 공개된 여러 가지 방법에도 불구하고, 이 방법들은 여태껏 사용되어 왔던 항생제들의 단점을 실제적으로 극복하면서도 유선염의 치료 및 예방에도 효과적인 방법으로서 무항생제 화합물을 사용하는 비용 효율적인 방법을 강구해야 하는 점을 중요하게 여기고 있다.

축산업에 영향을 미치는 또 다른 흔한 질병으로는 수송열(소 호흡기 질환)을 들 수 있다. 호흡기 질병은 육우의 질환에 의한 손실을 가져 오는 주된 요인이다. "수송열"이라는 용어는 소들을 운송하여 가축 사육장이나 목장으로 보낸 후, 6개월 혹은 그 이상이 된 소에서 관찰되는 호흡기 복합 질환을 기술하는데 사용된다. 젖떼기, 거세, 단각, 금식, 과잉 수용, 병원체에 대한 노출, 식습관 변화, 운송, 극한의 외부 온도의 스트레스, 그리고 바이러스, 박테리아, 마이코플라스마 및/또는 클라미디아 감염과 결부된 스트레스 요인들에 의한 스트레스가 수송열 복합 질환의 원인이 되고 있다. 서로 다른 농장 및/또는 도매상 우사(salebarn)들의 송아지들을 섞게 되면 병원체에 대한 노출을 크게 촉발시킬 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제6,497,869호는 소에게 영향을 줄 수 있는 초기 병원체들 중 일부를 기술하고 있다. 동물 집단을 혼합하는 것이 어떤 요인보다도 더 중요한 수송열을 일으키기 쉬운 요인일 수 있으나, 질병은 이러한 혼합 없이도 발병하며 스트레스 요인들이 보통 호흡기 질환을 매우 악화시키게 된다. 젖떼기, 거세, 단각 등에 의한 스트레스를 줄이려는 시도와, 수송 수일 전 또는 수주 전에 새로운 식습관에 소들을 적응시키는 훈련들은, 수송열의 발생을 감소시키는데 때로 성공적이었다(그러나, 비용 효율적일 수는 없었다). 수송열에 관계하는 병원체 일부에 대한 백신 접종은 때로 유익하였으나, 백신은 복합 질환에 관련이 있는 것으로 공지된 수 개의 병원체들에만 이용 효험이 있다.

대부분의 수송열의 경우에 있어서 궁극적인 사인은 세균성(보통 파스튜렐라) 폐렴인 것으로 일반적으로 인식되어 있다. 파스튜렐라 해몰라이티카, 특히 1A형은 북아메리카의 호흡기 질환의 경우로부터 분리된 가장 흔한 박테리아이다. 소에서 세균성 폐렴을 실험적으로 재현하는 시도는 소 기도에 심한 스트레스 및 취약성을 주는 손상을 가하지 않고서는 성공할 수 없다. 일반적으로, 스트레스를 받는 동안에 바이러스, 미코플라스마 및/또는 클라미디아가 기도에 먼저 손상을 입히는 경우가 가장 많으며, 이로써 심각한 박테리아 감염 및 질환에 취약하게 된다고 알려져 있다.

전형적인 임상적 호흡기 질환 발병은 보통 가축 사육장에 소들이 도착하고 나서 수 시간 내 또는 수일 내에 시작된다. 최근 운송된 400 내지 500 파운드 중량 범위의 소들은 공히 호흡기 질환에 대해 10% 내지 80%의 발병율 및 1% 내지 10%의 폐사율, 혹은 그 이상의 확률을 가진다. 소의 혈청을 4배의 항체 증가(혈청전환) 및 미생물학적으로 단리된 호흡기와 그 분비물에 대해 분석하면, 수많은 병의 원인이 확인될 수 있다. 많은 동물들, 실제로 아픈 동물 및 겉으로 건강하게 보이는 동물들은 하나 이상의 원인에 의해 감염 질환을 겪고 있는 것으로 나타났다(호흡기 질환은 오직 하나의 병원체가 그 원인이기 때문에 아마도 이렇지 않을 것이다). 소의 호흡기 복합 질환은 동물이 도착한 후에 가축 사육장에서 임상적으로 알게 되는 것이지만, 임상적 질환을 발생시키는 감염은 아마도 소들이 처음 서로 다른 농장들로부터 소집된 도매상 우사에서 시작되었을 것이다. 이에 대해서는, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Bovine Respiratory Disease, Loan, R. W. Texas A & M University Press, 1984]을 참조한다.

소에 있어서 유선염 또는 호흡기 질환의 발생, 재발, 지속 시간 및/또는 중증 상태를 치료하거나 조절하는 화합물을 투여하는 것이나, 또는 인간이 아닌 동물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 소, 가금류, 돼지, 말, 개 및 고양이에 있어서 다른 감염 질환의 발생, 재발, 지속 시간 및/또는 중증 상태를 치료하거나 조절하는 화합물을 투여하는 것은 수의학에서 유용할 수 있다. 이러한 감염의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 말의 신생마 패혈증, 돼지의 늑막 폐렴 및 인간이 아닌 동물의 폐렴을 포함한다. 이러한 화합물은 동물의 호중구 기능을 회복시키거나 조절할 수 있다.

성장 호르몬 (GH) 대가족유전자군 (supergene family) (문헌 [Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991)]; [Mott, H.R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; Silvennoinen, O. and Ihle, J.N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS] 참조)는 유사한 구조적 특징을 갖는 한 단백질 집단을 나타낸다. 이러한 단백질 유전자군의 각 구성원은 4개의 나선 다발을 포함한다. 상기 유전자군의 구성원 중에는 아직 밝혀져야 할 구성원들이 훨씬 더 많지만, 상기 유전자군의 일부 구성원은 하기를 포함한다: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반성 락토겐, 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자 (ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, ω-인터페론, τ-인터페론, ε-인터페론, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀-1 (CT-1) ("GH 대가족유전자군"). GH 대가족유전자군의 구성원들은, 이들이 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 보유한다는 사실에도 불구하고, 유사한 2차 구조 및 3차 구조를 보유한다. 이러한 공통적인 구조적 특징들로 인해, 유전자군의 새로운 일원들도 쉽게 확인될 수 있다. 4개의 나선 다발의 폴리펩타이드는 발명의 명칭이 "Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"인 WO 2005/074650 (본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

GH 대가족유전자군의 일원으로서 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)가 있다. 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)는 이들이 조혈 모세포(haemopoietic progenitor cell)의 증식을 지원하기 때문에, 콜로니 자극 인자(CSF)로서 알려져 있는 수 개의 당단백질 성장 인자 중 하나이다. G-CSF는 특정 골수 세포의 증식 및 이들의 과립구로의 분화를 촉진시킨다. 이것이 다른 CSF와 구별되는 점은, 반고형성 아가 중에서 호중성 과립구 콜로니 형성을 촉진시키고, 시험관 내에서 쥐과의 골수단구성백혈병 세포의 말단 분화를 유도할 수 있는 능력을 모두 가지고 있다는 것이다. 과립구 콜로니 자극 인자는 생체 내 호중구가 증식하고 성숙하기 위한 강력한 자극이 된다(문헌 [Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 2484-2488], [Heidari et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 2001; 81:45-57]을 참조하며, 이들은 모두 본원에 참조로 포함됨). 또한, G-CSF는 생체 내에서 호중구 기능의 활성화 또는 "프라이밍(priming)" 혹은 성숙화를 유도할 수도 있다(문헌 [Weisbart, R. H., Gasson, C. G., and D. W. Golde. Annals of Internal Medicine 1989; 110:297-303] 참조). G-CSF는 인간 과립구를 프라이밍시키고, 주화성 펩타이드인 N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌에 의해 촉진되는 과산화물 방출을 향상시키며(문헌 [S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144:1143-1146] 및 [C. F. Nathan, Blood 1989; 74:301-306] 참조), 인간 호중구 IgA 매개성 식균 작용을 활성화하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Weisbart, R, H., et al., Nature 1988; 332: 647-649] 참조).

호중구는 박테리아 및 진균 감염에 대한 면역 기작에 있어서 중요한 성분이다. G-CSF는 순환하는 호중구의 절대 수를 증가시키고 호중구 기능을 향상을 유도할 수 있다.

재조합 인간 G-CSF (hG-CSF)의 cDNA 클로닝과 발현에 대해서는 기술된 바 있고, 재조합 hG-CSF는 본래 분자의 대부분(전부는 아니더라도)의 생물학적 특징들을 나타내고 있는 것으로 확인된 바 있다(문헌 [Souza, L. et al., Science 232, 61-65 (1986)] 참조). cDNA 및 유전체 DNA의 서열 분석은 아미노산 서열의 추론을 가능하게 하여, 단백질이 30개 아미노산의 신호 서열을 가지는 204개 아미노산인 것을 밝혀냈다. 성숙한 단백질은 174개 아미노산 길이를 가지며, N-결합 글리코실화 부위를 보유하고 있진 않으나 O-결합 글리코실화가 가능한 부위는 수 개 보유하고 있다.

인간 G-CSF를 코딩하는 cDNA의 클로닝 및 발현에 대해서는 두 그룹에 의해 기술된 바 있다(문헌 [Nagata, S. et. al., Nature 319, 415-418 (1986)]; [Souza, L. M. et al., Science 232, 61-65 (1986)] 참조). G-CSF cDNA 클론에 대한 첫 보고 문헌은 성숙한 단백질의 길이가 177개의 아미노산으로 되어 있음을 시사하였다. 이 저자들은 또한 3개의 아미노산을 결여한 단백질을 코딩하는 G-CSF에 대한 cDNA 클론을 동정했다고 기록하였다. 이러한 G-CSF cDNA의 더 짧은 형태가 기대했던 G-CSF 활성을 발현하였다. 두 번째 보고 문헌은 상기 이러한 짧은 형태와 동일한 cDNA를 기술하고 있으면서 다른 변이체들에 대해서는 언급하지 않았다. 이 저자들이 그 짧은 cDNA가 기대했던 생물학적 활성 프로파일을 가지는 G-CSF를 발현한다는 것을 확인했기 때문에, 그 짧은 형태가 G-CSF의 중요한 형태가 되었으며 더 긴 형태는 그저 별로 중요하지 않은 스플라이싱 변이체 또는 클로닝 산물의 결과로 여겨졌을 것이다.

문헌 [Matsumoto et al., in Infection and Immunity, Vol.55, No. 11, p.2715 (1987)]은 호중성 백혈구 감소증에 걸린 마우스의 미생물 감염에 대한 인간 G-CSF의 보호 효과를 논하고 있다.

하기 특허 공보들은 G-CSF에 관련된 것들이다: WO 8703689 (본원에 참조로 포함됨)는 인간 G-CSF에 특이적인 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 및 G-CSF의 정제에 있어서 이들의 용도에 관해 기술하고 있으며; WO 8702060 (본원에 참조로 포함됨)은 인간 G-CSF 유사 폴리펩타이드 및 이의 제조 방법을 개시하고 있으며; 미국특허 제4,810,643호 (본원에 참조로 포함됨)는 인간 G-CSF 유사 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 서열 및 이의 제조 방법에 대해 개시하고 있으며; 그리고 WO 8604605 및 WO 8604506 (본원에 참조로 포함됨)은 인간 G-CSF를 코딩하는 유전자 및 감염 억제자를 함유하는 인간 G-CSF를 개시하고 있다. 대장균과 같은 숙주 세포에서 hG-CSF를 단리하는 것과 G-CSF를 생성하는 내용에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제4,810,643호; 제4,999,291호; 제5,580,755호; 및 제6,716,606호 (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

G-CSF는 호중성 과립구의 증식, 분화 및 활성화를 조절하는 약학적으로 활성인 단백질이다(문헌 [Metcalf, Blood 67:257 (1986)]; [Yan, et al., Blood 84(3): 795-799 (1994)]; [Bensinger, et al., Blood 81(11): 3158-3163 (1993)]; [Roberts, et al., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994)]; [Neben, et al., Blood 81(7): 1960-1967 (1993)]; [Welte et al., PNAS-USA 82: 1526-1530 (1985)]; [Souza et al., Science 232: 61-65 (1986)] 및 [Gabrilove, J. Seminars in Hematology 26:2 1-14 (1989)] 참조). G-CSF는 인간 방광암 세포주 5637의 세포 배양물 상청액으로부터 균질하게 정제되었다(문헌 [Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci (1985) 82:1526-30] 참조). 천연 hG-CSF를 코딩하는 cDNA 서열은 문헌 [Souza et al., Science (1986) 232:61-65]에서 공지되었다. 제2 인트론에서의 선택적 스플라이싱의 결과로, 204개 또는 207개의 아미노산을 가지면서 이중 첫 30개가 신호 펩타이드를 나타내는 2개의 천연 발생 형태의 hG-CSF가 존재하게 되었다(문헌 [Lymphokines, IRL Press, Oxford, Washington D.C., Editors D. Male and C. Rickwood] 참조). 상기 성숙한 단백질은 분자량이 약 19 kDa이며, 분자 간 혹은 분자 내에 이황화 결합을 형성할 수 있는 5개의 시스테인 잔기를 가지는 것으로 밝혀졌다. 결합에 대한 연구는 bG-CSF가 호중성 과립구에 결합하는 것을 밝혀냈다. 적혈구, 림프구, 호산구 세포주뿐 아니라 대식 세포에 대해서는 결합이 거의 없거나 전무한 것으로 관찰되었다.

인간에 있어서, 내인성 G-CSF는 혈장에서 검출될 수 있다(문헌 [Jones et al., Bailliere's Clinical Hematology 2:1 83-111 (1989)] 참조). hG-CSF는 섬유아 세포, 대식 세포, T 세포, 영양막, 내피 세포 및 상피 세포에 의해 생성되며, 염색체 17번에 위치한 4개의 엑손과 5개의 인트론으로 이루어진 단일 카피 유전자의 발현 생성물이다. 이러한 유전자 자리가 전사되면, 별도 처리가 되는 mRNA 종을 만들게 되는데, 이는 두 형태의 hG-CSF mRNA (하나는 177개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 것, 다른 하나는 174개의 아미노산의 단백질을 코딩하는 것)를 생성하게 되는데(문헌 [Nagata et al., EMBO J 5: 575-581 (1986)] 참조), 174개의 아미노산으로 이루어진 형태가 가장 특이적인 생체 내 생물학적 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. hG-CSF는 교차 반응성 종인 까닭에, 인간 G-CSF가 마우스, 개 또는 원숭이와 같은 다른 포유류에게 투여되는 경우, 지속적인 호중성 백혈구 증가를 유도한다(문헌 [Moore et al., PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987)] 참조).

G-CSF는 다수의 공급 원천으로부터 수득되어 정제될 수 있다. 천연의 인간 G-CSF는 배양된 인간 종양 세포주의 상청액으로부터 단리될 수 있다. 재조합 DNA 기술의 발달[예를 들어, 미국특허 제4,810,643호 (Souza) 참조, 이는 본원에 참조로 포함됨]로 인해, 진핵 숙주 세포 발현의 산물로서 글리코실화 형태의 G-CSF, 그리고 원핵 숙주 세포 발현의 산물로서 비글리코실화 형태의 G-CSF를 상업적 규모의 양으로 생산하는 것이 가능해졌다.

G-CSF는 호중구의 증가가 이득을 주는 적응증의 치료에 있어 유용한 것으로 나타났다. G-CSF는 골수의 줄기 세포 및 전구 세포를 동원할 수 있어, 과립구가 화학요법에 의해 소멸된 환자를 치료하거나, 또는 골수 이식 전 치료 방안으로 사용된다. 예를 들어, 암환자의 경우, G-CSF는 화학요법 또는 방사선 치료로 인한 조혈 작용 결손을 보충하기 위해, 호중구 생성을 선택적으로 촉진하는 수단으로서 유용하다. 다른 적응증으로서는 통상 박테리아의 대사 산물에 의해 야기되는 패혈증과 같은 다양한 감염성 질병 및 관련 질환의 치료를 포함한다. 또한, G-CSF는 단독으로, 또는 다른 화합물들(예컨대, 배양물에서 세포의 성장 또는 확장을 위한 사이토카인, 예를 들어 골수 이식을 위한 사이토카인)과 병용하여도 유용하다.

G-CSF 수용체 (G-CSFR)는 조혈/사이토카인/성장 인자 수용체군의 일원으로서, 수 개의 다른 성장 인자 수용체, 예컨대 인터루킨(IL)-3, 인터루킨-4 및 인터루킨-6 수용체, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 수용체, 에리스로포이에틴(EPO) 수용체뿐 아니라, 프로락틴 및 성장 호르몬 수용체를 포함한다. 이와 관련해서는, 문헌 [Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 6934-6938 (1990)]을 참조한다. 사이토카인 수용체군의 구성원들은 막투과 영역의 바로 외부에 위치한 4개의 보존된 시스테인 잔기 및 트립토판-세린-X-트립토판-세핀 모티프를 포함한다. 상기 보존된 서열은 단백질-단백질 상호작용과 연관이 있는 것으로 생각된다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)]을 참조한다. G-CSF 수용체는 약 150 kD의 분자량을 갖는 단일 펩타이드 사슬로 이루어진다(문헌 [Nicola, Immunol. Today 8 (1987), 134] 참조).

글리코실화된 hG-CSF는 탈-글리코실화된 hG-CSF (뉴라미니다아제 및 엔도-α-N-아세틸갈락토사미니다아제를 이용한 시험관 내 효소적 소화에 의해 제조됨)와 pH 및 온도의 함수인 그 안정성에 대하여 비교된 바 있다(문헌 [Oheda et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (20): 11432-35] 참조). 0.2 M의 NaCl 및 0.01% Tween 20을 포함하는 20 mM의 인산염 버퍼 중에 1 ㎍/mL의 농도로 용해된 상기 탈-글리코실화된 hG-CSF는, 37℃에서 2일간 배양 후 약 pH 7 내지 약 pH 8인 pH 범위 내에서 속히 불활성화된다. 이와 대조적으로, 글리코실화된 hG-CSF는 동일한 조건 하에서 그 활성을 80% 이상 보유하였다. 또한, 이러한 두 형태의 hG-CSF의 열 안정성(생물학적 분석 및 열량 측정 분석에 의해 측정함)을 평가해 보면, 탈-글리코실화된 hG-CSF가 천연 형태의 hG-CSF보다 열 안정성이 덜한 것으로 나타났다.

안정하면서도 약학적으로 허용되는 G-CSF 조성물을 제공하기 위해 여러 가지 접근법이 취해졌다. G-CSF의 조성물 안정성을 개선하기 위한 한 접근 방법은 단백질 유도체의 합성을 수반하고 있다. 미국특허 제5,665,863호는 알부민과 커플링된 G-CSF를 포함하여 새로운 약동학적 특성을 보유하는 재조합 키메라 단백질의 형성에 대해 개시하고 있다. 미국특허 제5,824,784호 및 미국특허 제5,320,840호는 단백질 가수 분해에 대한 안정성을 개선하고 그에 대한 보호막을 제공하기 위한 가용성 중합체의 화학적 결합을 개시하고 있는데, 보다 구체적으로 보면, 화학적으로 부착된 중합체(폴리에틸렌 글리콜을 포함)를 수반하는 N-말단이 변형된 G-CSF 분자에 대한 것이다.

다수의 사이토카인들, 예컨대 G-CSF (문헌 [Zink et al., FEBS Lett, 314:435 (1992)]; [Zink et al.; Biochemistry 33:8453 (1994)]; [Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)] 참조), GM-CSF (문헌 [Diederichs, K., et al., Science 154:1779-1782 (1991)]; [Walter et al., J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)] 참조), IL-2 (문헌 [Bazan, J. F. Science 257:410-411 (1992)]; [McKay, D. B. Science 257:412 (1992)] 참조), IL-4 (문헌 [Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991)]; [Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)] 참조) 및 IL-5 (문헌 [Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)] 참조)의 구조가 X선 회절 및 NMR 연구에 의해 측정되는데, 이로써 중요한 1차 서열의 동일성이 부족함에도 불구하고 GH 구조가 현저히 보존되어 있음을 알 수 있었다.

조성물 중에서 G-CSF의 안정성을 증가시키는 대안적인 접근법은 단백질의 아미노산 서열을 변형시키는 것을 수반한다. 미국특허 제5,416,195호는 향상된 조성물 안정성을 가지는 G-CSF의 유전자 조작 유사체를 개시하고 있는데, 여기서는 성숙한 폴리펩타이드 사슬의 17번 위치에서 통상적으로 발견되는 시스테인 잔기, 27번 위치에서 발견되는 아스파르트산 잔기, 그리고 65번 및 66번 위치에서 발견되는 탠덤 프롤린 잔기들 중 하나 이상의 잔기는 모두 세린 잔기로 치환되었다. 미국특허 제5,773,581호는 수용성 중합체에 공유 결합된 G-CSF를 유전자 조작한 G-CSF 유사체를 개시하고 있다.

유선염의 치료 또는 예방법에 유용한 다양한 형태의 인간 G-CSF(이의 제조 및 정제 포함)에 대해서는 미국특허 제4,810,643호(본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기술되어 있다. 미국특허 제4,810,643호는 G-CSF 유전자 또는 G-CSF 유전자의 유전자 조작 변이체를 포함하는 신규한 유전자 단편, 생물학적으로 기능성인 재조합 플라스미드와 바이러스 DNA 벡터, 그리고 원핵 생물 숙주 세포 및 진핵 생물 숙주 세포를 기술하고 이를 권리로서 청구하고 있다. 상기 숙주 세포들은 생물학적으로 활성인 G-CSF 또는 G-CSF의 유전자 조작된 변이체를 발현하였다. 미국특허 제5,849,883호 및 WO 89/10932는 소에 있어서 인간 G-CSF를 이용한 다양한 연구에 대해 기술하고 있다. 이 연구들은 소에 있어서 호흡기 질환(파스튜렐라 헤몰라이티카), 박테리아 면역 유도 반응(클렙시엘라 뉴모니아), 또는 대장균(E. coli) 유선염에 대한 평가를 수행하였다.

미국특허 제5,849,883호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)는 성숙한 소의 G-CSF의 폴리뉴클레오타이드 서열과 폴리펩타이드 서열을 제시하고, 상기 폴리펩타이드 및 이의 유사체를 클로닝하고, 단리하며, 정제하는 방법에 대해 기술하고 있다. 성숙한 bG-CSF는 hG-CSF와 82%의 상동성을 갖는 174개의 길이의 아미노산 (서열번호 1)이다. 메티오닌 개시 아미노산 잔기를 가지는 bG-CSF 폴리펩타이드는 서열번호 2에 나타나 있다. 서열번호 1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 나타나 있다. 서열번호 2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 나타나 있다. 헤이다리 및 그의 공동연구자들 (Heidari et al.)은 문헌 [Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81:45-57]에서 bG-CSF의 발현, 정제 및 생물학적 활성에 대해 기술하고 있다.

친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG로 약칭됨)을 공유 결합시키는 것은 물에 대한 가용성을 증가시키거나, 생체이용률을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나 또는 단백질, 펩타이드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 많은 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 한 방법이다. PEG는 약제, 인공 이식물, 및 생체적합성, 독성 결여 및 면역원성 결여가 중요한 다른 적용분야에 광범위하게 사용되어 왔다. PEG의 원하는 성질을 최대화시키기 위해서는, 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체(들)의 총 분자량 및 수화 상태가, 모 분자의 생체 활성에 악영향을 미치지 않으면서도, 통상 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특징, 예를 들면 물에 대한 가용성 및 순환 반감기 증가와 같은 특징을 제공하도록 충분히 높아야 한다.

흔히, PEG 유도체는 화학적 반응성 작용기, 예를 들면 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기, N-말단 및 탄수화물 부분을 통해 생물학적 활성 분자에 결합된다. 단백질 및 다른 분자는 흔히 중합체 부착에 이용가능한 제한된 수의 반응성 부위를 갖는다. 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 흔히 수용체 결합에 중요한 역할을 수행하고, 분자의 생물학적 활성을 유지하는데 필요하다. 그 결과, 생물학적 활성 분자 상의 이러한 반응성 부위에 대한 중합체 사슬의 무차별적인 부착은 중합체-변형된 분자의 생물학적 활성을 현저하게 감소시키거나 또는 심지어 전체의 손실을 유발시키는 경우가 많다. 문헌 [R. Clark et al., (1996), J. Biol . Chem ., 271: 21969-21977]을 참조할 수 있다. 목적하는 장점들을 표적 분자에 제공하는 충분한 중합체 분자량을 갖는 접합체를 형성하기 위해, 선행 기술의 접근 방법은 전형적으로 다수의 중합체 아암 (arm)을 분자에 무작위적으로 부착시킴으로써 모 분자의 생체 활성이 감소될 위험을 증가시키거나 또는 심지어 모 분자의 생체 활성을 전체적으로 손실시켰다.

단백질에 PEG 유도체 부착을 위한 유전자자리를 형성하는 반응성 부위는 단백질의 구조에 의해 좌우된다. 효소를 비롯한 단백질은 일반적 구조 H₂N--CHR--COOH를 갖는 α-아미노산의 다양한 서열들로 이루어진다. 한 아미노산의 α 아미노 부분 (H₂N--)은 인접 아미노산의 카르복실 부분 (--COOH)에 결합되어 아미드 결합을 형성하고, 이는 -(NH-CHR-CO)_n- (여기서, 아래 첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있음)로 나타낼 수 있다. R에 의해 나타낸 단편은 단백질 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.

예를 들면, 아미노산 리신의 경우, ε(엡실론) 위치뿐 아니라 α 위치에도 --NH₂ 부분이 존재한다. ε--NH₂는 염기성 pH 조건 하에서 자유롭게 반응한다. PEG를 사용한 단백질 유도체화 분야의 여러 연구자들은 단백질 중에 존재하는 리신 잔기의 ε--NH₂ 부분에 부착하기 위한 PEG 유도체를 개발하는 데 주력하였다. 문헌 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조할 수 있다. 그러나, 이러한 PEG 유도체는 모두, 단백질의 표면에 존재하는 수많은 리신 잔기 중에 선택적으로 놓일 수 없다는 공통된 한계를 갖는다. 이러한 점 때문에, 리신 잔기가 예를 들어, 효소 활성 부위에 존재하는 단백질 활성에 중요한 경우이거나, 또는 리신 잔기가 수용체 결합 부위의 경우와 같이 단백질과 다른 생물학적 분자의 상호작용을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 경우 상당한 제약이 될 수 있다.

기존의 단백질 PEG화 방법에 있어서 2차적으로 문제가 되지만 그래도 역시 동일하게 취급되어야 할 문제로서는, PEG 유도체가 바람직하지 않은 잔기들과 원치 않는 부반응을 할 수 있다는 사실이다. 히스티딘은 구조적으로 --N(H)--로 표현되는 반응성 이미노 부분을 함유하지만, ε--NH₂와 반응하는 많은 화학적 반응성 종도 --N(H)--와 반응할 수 있다. 이와 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로 표현되는 유리 설프히드릴 기를 갖는다. 어떤 경우에는, 리신의 ε--NH₂기로 가도록 지시된 PEG 유도체가 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기와 반응하기도 한다. 이러한 점 때문에, PEG-유도체화된 생체 활성 분자로 된 복잡한 이질성 혼합물이 생성되고, 표적화된 생체 활성 분자의 활성이 파괴되는 위험을 초래할 수 있다. 화학적 작용기가 단백질 내 단일 부위에 도입되도록 한 후, 특징이 명확하고도 예측이 가능한 단백질 표면 상의 특이적 부위에서 하나 이상의 PEG 중합체가 생체 활성 분자에 선택적으로 커플링할 수 있게 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.

리신 잔기 외에도, 당업계에서는 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 비롯한 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약을 개발하기 위해서 상당한 노력을 기울여 왔다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,610,281호 및 문헌 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조할 수 있다. 시스테인 잔기는 특정 부위 돌연변이 유발법 및 당업계에 공지된 다른 기법들을 사용하여 단백질의 구조 내에 부위-선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 유리 설프히드릴 부분은 티올-반응성 작용기를 갖는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 유리 설프히드릴 기의 도입으로 인해, 생성되는 단백질의 발현, 접힘(폴딩) 및 안정성에 대한 문제를 복잡하게 할 수 있다는 점에서 쉽지 않다. 따라서, 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 커플링할 수 있음과 동시에, 단백질 중에서 통상 발견되는 설프히드릴 기 및 다른 화학적 작용기들과도 양립이 가능한 (즉, 이들과 원치 않는 부반응을 일으키지 않는) 화학적 작용기를 생체 활성 분자에 도입시키는 수단을 강구하는 것이 바람직할 것이다.

상기 선행 기술의 예로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH₂ 부분 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 부착시키기 위해 개발된 이러한 여러 유도체들은, 그들의 합성과 용도에 문제가 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 중 어떤 것들은 단백질과 불안정한 결합을 형성하는데, 이러한 결합은 가수분해되기 쉬워서 분해되거나, 붕괴되거나, 또는 혈류와 같은 수성 환경에서 불안정하다. 어떤 것들은 보다 안정한 결합을 형성하지만, 이러한 결합들도 결합이 형성되기 전에 가수분해되는데, 이는 PEG 유도체 상의 반응성 기가 단백질이 부착할 수 있기 전에 불활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 또 어떤 것들은 다소 독성을 지니기 때문에 생체 내에서 사용하기에는 적합성이 떨어진다. 어떤 것들은 반응이 느려 사실상 유용하지 못하다. 일부는 단백질의 활성을 담당하는 부위에 부착됨으로써 단백질 활성을 손상시킨다. 일부는 자신들이 부착되는 부위에 특이적이지 않고, 바람직한 활성을 손상시키고 결과의 재현성에 손실을 가져올 수도 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용하여 단백질을 변형시키는 것과 관련한 난제를 극복하기 위해, 보다 안정한 PEG 유도체 (예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제6,602,498호 참조), 또는 분자 및 표면 상의 티올 부분과 선택적으로 반응하는 PEG 유도체 (예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제6,610,281호 참조)가 개발되었다. 당업계에서는, PEG 유도체가 선택적으로 반응하여 안정한 화학적 결합을 형성하는 것이 요구되는 한, 생리학적 환경에서 화학적으로 불활성인 PEG 유도체는 반드시 필요할 것이다.

히드록시알킬 전분 접합체의 사용, 특히 폴리펩타이드에 공유 결합된 히드록시에틸 전분(HES)의 사용에 대한 내용은, 폴리펩타이드의 면역원성 및/또는 알레르기성을 잠재적으로 변화시키기 위해 개시되었다. HES화(HESylation)는 프레세니우스 카비(Fresenius Kabi AB)에게 양도된 시리즈 특허 출원인 미국 특허 공보 제20050063943호, 제 20060121073호, 제20010100163호, 제20050234230호, 제20050238723호, 제 20060019877호, 제20070134197호, 제20070087961호 및 미국특허 제7,285,661호(이들 모두 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 대안 기법이다. HES는 혈장 용적 확장제로서 임상적으로 사용된 바 있는 변형된 천연 중합체이며, HES화라는 것은 약동학적 특성 또는 물에 대한 가용성과 같은 약물의 특성들을 변화시키기 위하여 약제 물질을 HES 유도체로 커플링시키는 기법을 말한다. 또한, 이것은 생물학적 활성 증가의 유도로 이어지는 분자의 증가된 안정성과 감소된 신장 청정율(renal clearance)을 통해 단백질 혈장 순환을 연장시키는 단계를 포함한다. 이외에도, 면역원성 또는 알레르기성이 감소할 수 있을 것이다. HES의 분자량과 같은 다른 매개변수들을 변화시킴으로써, HES 접합체를 광범위하게 맞춤 제작할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 히드록시에틸 전분의 경우에는 현재 이용가능한 모든 다른 중합체들과 공통적으로 가지는 단점인 다분산성을 지닌다. 중합체 접합체는 평균적 수치 부근에 분포하는 분자량을 갖는 분자들의 혼합체이다. 이러한 균질성의 결여로 인해, 화학적 특성 및 생화학적 특성의 수준이 저하되어, 약학적 활성 성분이 그 작용 부위(수용체, 효소 등)로 도달하는 것을 방해할 수 있는 것이다. 이러한 경우, 활성 약물을 원래의 비접합된 형태 내로 전달하는 것이 요구되기 때문에, 이에 따라, 그 약학적 효능을 위하여 대사 반응에 의한 중합체의 분해가 요구된다.

최근, 단백질 과학에서는 단백질의 부위-특이적 변형과 관련된 여러 한계점을 극복할 수 있는 완전히 신규한 기술이 보고된 바 있다. 구체적으로 살펴보면, 원핵 생물인 대장균 (예를 들면, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500] 참조) 및 진핵 생물인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae; S. 세레비시에) (예를 들면, 문헌 [J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)] 참조)의 단백질 생합성 기구에 신규한 성분들을 첨가하였는데, 이러한 방법은 비-유전자적으로 코딩된 아미노산을 생체 내에서 단백질에 도입할 수 있게 해 주었다. 새로운 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 갖는 다수의 신규한 아미노산들, 예컨대, 광친화성 표지 및 광이성질화 가능한 (photoisomerizable) 아미노산, 광가교성 아미노산 (예를 들어, 문헌 [Chin, J.W., et al., (2002), Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99: 11020-11024], [Chin, J.W., et al., (2002), J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027] 참조), 케토 아미노산, 중원자 함유 아미노산 및 글리코실화된 아미노산들이, 이러한 방법론으로 앰버 코돈 (amber codon)인 TAG에 반응하여 대장균과 효모의 단백질 내로 효율적이고도 높은 정확도로 도입되었다. 이와 관련해서는 예를 들어, 문헌[Chin, J.W., et al., (2002), Journal of American Chemical Society 124: 9026-9027]; [J.W. Chin, & P.G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137]; [J.W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024] 및 [L. Wang, & P.G. Schultz, (2002), Chem . Comm ., 1: 1-11]을 참조할 수 있다. 모든 참고 문헌들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다. 이러한 연구들은, 유전자 코딩되는 20개의 공통 아미노산에서 발견되는 모든 작용기에 화학적으로 불활성이며, 효율적이면서도 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 단백질에서는 찾아볼 수 없는 화학적 작용기, 예컨대 케톤기, 알킨기 및 아지드 부분을 선택적으로 그리고 익숙하게 도입하는 것이 가능하다는 사실을 입증하였다.

비-유전자적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 도입시키는 역량은, 예를 들어 리신의 ε-NH₂, 시스테인의 설프히드릴-SH, 히스티딘의 이미노 기 등과 같은 천연 발생 작용기에 가치있는 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있도록 해준다. 어떤 화학적 작용기는 유전자로 코딩되는 20개의 공통 아미노산에서 발견되는 작용기에 불활성인 것으로 공지되어 있지만, 분명히 유효하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 예를 들어, 아지드 및 아세틸렌 기는 수성 조건에서 촉매량의 구리의 존재 하에 휘스겐 (Huisgen) [3 + 2] 시클로 부가 (cycloaddition) 반응을 하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 이에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [Tornoe, et al., (2002) Org . Chem . 67: 3057-3064] 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599]을 참조할 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 아지드 부분을 단백질 구조에 도입함으로써, 단백질 중에서 발견되는 아민, 설프히드릴, 카르복실산, 히드록실 기에는 화학적으로 불활성이지만, 아세틸렌 부분과는 원활하고도 유효하게 반응하여 시클로 부가 생성물을 형성하는 작용기를 통합시킬 수 있다. 중요한 점은, 아세틸렌 부분의 부재 하에, 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 하, 그리고 생리학적 조건 하에서 화학적으로 불활성이며 반응성을 나타내지 않게 잔류한다는 점이다.

본 발명은 특히 bG-CSF 폴리펩티드의 활성 및 생성에 관련된 문제에 관한 것이며, 또한 향상된 생물학적 또는 약리학적 성질, 예를 들어 향상된 치료 반감기를 가지는 bG-CSF 폴리펩티드의 생성에 관한 것이다.

발명의 개요

본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 이작용성 중합체, 이작용성 링커 또는 하나 이상의 추가의 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 갖는 수용성 중합체에 결합되거나 혹은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 일부 실시 양태에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 제2 폴리펩타이드는 bG-CSF 폴리펩타이드이다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 내의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산의 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산의 3, 7, 62, 133, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 62, 133번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 62번 위치 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에 도입된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 133번 위치 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에 도입된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연 아미노산의 치환, 부가 또는 결실을 하나 이상으로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 서열번호 1, 2 또는 다른 bG-CSF 서열에 대하여 N 말단 또는 C 말단인 리더 서열 또는 신호 서열 내로 도입된다.

일부 실시 양태에서, 하기 위치들(하기에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산).

일부 실시 양태에서, 하기 위치들(하기에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하기 위치들(하기에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하기 위치들(하기에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 3, 7, 62, 133, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하기 위치들(하기에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 62, 133번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 62번 위치(서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 133번 위치(서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 서열번호 1, 2 또는 다른 bG-CSF 서열에 대하여 N 말단 또는 C 말단인 리더 서열 또는 신호 서열 내의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 수용체 또는 결합 동반체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 폴리펩타이드, 소분자 또는 핵산에 대한 bG-CSF 폴리펩타이드의 친화도를 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 안정성과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 안정성 및/또는 가용성은 당업자에게 공지된 여러 가지 다른 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석법으로서는 이에 제한되지는 않지만 SE-HPLC와 RP-HPLC를 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 면역원성과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 면역원성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 혈청 반감기 또는 순환 시간과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 물에 대한 가용성과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 물에 대한 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 가용성과 비교했을 때, 숙주 세포 내에서 생성된 bG-CSF 폴리펩타이드의 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 발현 또는 합성과 비교했을 때, 숙주 세포 내에서의 bG-CSF 폴리펩타이드의 발현을 증가시키거나 시험관 내에서 bG-CSF 폴리펩타이드의 합성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 이러한 치환을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 작용제 활성을 보유하고 숙주 세포 내에서 발현 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 프로테아제 내성과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 프로테아제 내성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드와의 상호작용시 수용체의 활성과 비교했을 때, 수용체의 신호 전달 활성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 결합과 비교했을 때, 수용체와 같은 또다른 분자에 대한 그 결합을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 혈액 생성(조혈)과 비교했을 때, 그의 혈액 생성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 호중구 증식과 비교했을 때, 그의 호중구 증식을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 호중구 성숙과 비교했을 때, 그의 호중구 성숙을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 해당 bG-CSF 폴리펩타이드의 혼화성과 비교했을 때, bG-CSF 폴리펩타이드의 약학 보존제(예를 들어, m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)와의 혼화성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 상기 증가된 혼화성은 보존제가 첨가된 약학 제형의 제제를 저장할 때 단백질의 물리화학적 특성 및 생물학적 활성을 유지하도록 한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 이용하여 하나 이상의 조작된 결합을 생성시킬 수 있다. 이러한 분자 간 결합은, 이에 제한되지는 않지만, 적절한 조건 하에서 단백질 내에 두 아미노산 간의 반응(하나 또는 두 개의 아미노산 모두는 비천연 아미노산일 수 있음); 적절한 조건 하에 링커, 중합체 또는 다른 분자를 이용한 두 아미노산(각각은 천연적으로 코딩되거나 비천연적으로 코딩될 수 있음) 간의 반응 등을 비롯하여 여러 가지 방법으로 생성될 수 있다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 천연 발생 아미노산 또는 비천연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 중의 아미노산 치환은 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있으나, 단, 하나 이상의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 이루어진다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 천연 발생 아미노산을 이용하여 이루어지며, 추가적인 하나 이상의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용하여 이루어진다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기, 아세틸기, 아미노옥시기, 히드라진기, 히드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드기를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다.

일부 실시 양태에서, 폴리펩타이드는 bG-CSF 폴리펩타이드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제이다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제는 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 번역 후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함한다.

또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 3, 4와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산, 또는 서열번호 1, 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 3, 4와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 엄격한 조건 하에서 서열번호 1, 2에 나타난 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 셀렉터 (selector) 코돈을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1과 2에 나타난 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 서열번호 1, 2에 나타난 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 서로 다른 여러 가지 폴리뉴클레오타이드들이 본 발명의 임의의 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다는 사실은 당업자라면 쉽게 알 수 있다.

일부 실시 양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 (ochre) 코돈, 오팔 (opal) 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 수용성 중합체에 결합된 bG-CSF 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 bG-CSF 폴리펩타이드를 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 도입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산 중 어느 것에도 반응하지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산 중 어느 것에도 반응하지 않는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 bG-CSF 폴리펩타이드는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 카르바메이트 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 bG-CSF 폴리펩타이드는 카르보닐기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드와 반응시킴으로써 제조된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 bG-CSF 폴리펩타이드는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 bG-CSF 폴리펩타이드는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지는 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 도입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 히드라진기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 도입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 도입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 도입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.

또한, 본 발명은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.

또한, 본 발명은 셀렉터 코돈을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 세포는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 bG-CSF 폴리펩타이드에 치환시키기 위한 오르소고날 (orthogonal) RNA 합성효소 및/또는 오르소고날 tRNA를 포함한다.

또한, 본 발명은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 bG-CSF 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들), 오르소고날 RNA 합성효소 및/또는 오르소고날 tRNA를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 bG-CSF 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 bG-CSF 폴리펩타이드의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 bG-CSF 폴리펩타이드의 면역원성을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 천연 발생 bG-CSF 폴리펩타이드에서 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계; 및/또는 상기 bG-CSF 폴리펩타이드를 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 bG-CSF 분자를 사용하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 유효량의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 글리코실화된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 글리코실화되지 않는다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고, 서열번호 1과 2에 나타난 서열 또는 임의의 다른 bG-CSF 폴리펩타이드 서열을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1, 2에 나타난 서열을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기, 아미노옥시기, 히드라지드기, 히드라진기, 세미카르바지드기, 아지드기 또는 알킨기를 포함한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 및 서열번호 1, 2에 나타난 서열 또는 임의의 다른 bG-CSF 폴리펩타이드 서열을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된다. 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 및 서열번호 1, 2에 나타난 서열을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩타이드에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자는 사카라이드 부분을 통해 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된다.

또한, 본 발명은 bG-CSF 폴리펩타이드의 단일 아미노산의 공유 결합에 의해 결합된 수용성 중합체를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 공유 결합된 아미노산은 폴리펩타이드 중에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드에 공유 결합된 HES를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 단일 아미노산에서 결합된다. 일부 실시 양태에서, HES에 공유 결합된 단일 아미노산은 폴리펩타이드 내에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 다수의 HES 및/또는 PEG 분자에 결합될 수 있는 다수의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

본 발명은 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공하는데, 여기서 상기 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자는 리보솜에 의해 폴리펩타이드 내에 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩타이드에 부착된다. 일부 실시 양태에서, 폴리펩타이드는 모노PEG화 (monoPEGylation)된다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 제공하는데, 여기서 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 리보솜에 의해 폴리펩타이드의 기선택된 부위에 도입된다.

bG-CSF 코딩 영역에 결합된 bG-CSF 리더 서열 또는 신호 서열뿐 아니라, bG-CSF 코딩 영역에 결합된 이종성 신호 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 이종성 리더 서열 또는 신호 서열은, 예를 들어 숙주 세포 분비 시스템에 의해 인지 및 처리되어 분비되어, 숙주 세포의 신호 펩티다아제에 의해 절단될 수 있는 것이어야 한다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 이용하여 질병 또는 장애를 치료하는 방법은 신호 또는 리더 펩타이드가 존재하거나 존재하지 않는 bG-CSF를 이용한 치료를 의미하는 것이다.

본 발명은 동물의 감염을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 소과(bovine) 동물의 유선염 및 수송열을 치료 및 예방하는 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 박테리아의 균주 내성을 형성하지 않고 동물의 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 부분적으로 혹은 전체적으로 1차적인 구조 형태와 소의 천연 발생 G-CSF의 하나 이상의 생물학적 특성 및 이러한 소의 G-CSF를 코딩하는 DNA 서열을 가지는 정제되고 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 실시 양태에서, G-CSF와 함께 하나 이상의 또 다른 콜로니 자극 인자, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, GM-CSF, M-CSF 및 다중-CSF (IL-3)가 감염된 동물에게 투여된다. CSF들은 함께 또는 개별적으로 투여된다. 추가의 실시 양태에서, 동물의 감염 질환은 인터페론, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 α-인터페론, IL-2 및 TNF 중에서 하나 이상과 함께, 또는 통상적인 항생제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 페니실린, 세팔로스포린 및 아미노글리코시드와 함께 G-CSF를 투여함으로써 치료된다.

또 다른 실시 양태에서, bG-CSF 처치(치료)는 질병의 예방을 위해 사용된다. bG-CSF는 박테리아, 효모 또는 진균성 감염에 걸릴 위험이 있는 동물의 숙주 방어 기작을 증진시키기 위한 예방 치료법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, bG-CSF는 감염, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 폐렴에 걸릴 위험이 있는 정상적인 동물에 있어서 예방 치료법으로서 사용될 수 있다. 본원에서 "정상적인"이라는 용어는 정상적인 면역 기능 및 정상적인 백혈구 세포 수와 그 백분율(감별분류, differential)을 가지는 동물을 의미한다. 가축들에게 감염과 싸워 이길 수 있는 능력을 증진시켜 이를 미리 길러 놓기 위해서, 수송하기 전이나 가축들을 쇠약하게 할 수 있는 일들이 발생하기 전에 예방적으로 가축을 처리한다. bG-CSF의 투여는 가축들을 처리하는 시점, 즉 백신접종, 낙인 찍기 등을 행할 때 할 수 있다. 또한, 산후 자궁내 감염 및 수유 초기 단계에서 유선염의 걸릴 가능성을 감소시키기 위하서는, 건우기 요법(dry cow therapy) 동안 및/또는 소의 출산 직전에 bG-CSF를 이용한 처리를 할 수 있다. 분만 전후 기간 동안 소의 호중구 기능에 대한 상세한 설명은 문헌 [Kehrli et al, Am. J. Vet. Res., 50, No.2, 207 (1989)]; [Oliver et al., J. Dairy Sci. 71:2584-2606 (1988)]; 및 [Kehrli et al., J Dairy Sci. 74:4399-4412 (1991)]을 참조한다. 통상적으로, 출생 직전에는 항생제 처치를 하지 않는데, 이는 사용하기에 부적절한 우유에서 나타날 수 있는 잔기들 때문이다.

또 다른 실시 양태에서, 이에 제한되지는 않지만 PEG를 비롯한 다른 분자에 대한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 접합은 실직적으로 정제된 bG-CSF를 제공하는데, 이는 비천연 아미노산에 대한 접합을 위해 이용되는 독특한 화학 반응 때문이다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF의 다른 분자, 예컨대 PEG에 대한 접합은 실질적으로 순수한 bG-CSF를 제공하기 위해 접합 이전 또는 이후에 수행되는 다른 정제 기법과 함께 수행될 수 있다.

도 1 - bG-CSF의 발현에 사용되는 플라스미드를 나타낸다.
도 2 - bG-CSF를 발현하는데 사용된 숙주 세포주와 관련한 상세한 사항들을 나타낸다.
도 3 - 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드 발현의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 4 - PEG화 이전 bG-CSF에 대한 CM FF 컬럼 피크 분획의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 5 - PEG화된 bG-CSF-T133pAF에 대한 SP HP 컬럼 피크 분획의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 6 - PEG화 전후에 있어서 bG-CSF의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 7a - 야생형 bG-CSF의 트립신/Glu-C 소화 (214nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 7b - bG-CSF T133pAF의 트립신/Glu-C 소화 (214nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 8a - 야생형 bG-CSF의 트립신/Glu-C 소화 (250nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 8b - bG-CSF T133pAF의 트립신/Glu-C 소화 (250nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 9a - 야생형 bG-CSF의 Glu-C 소화 (214nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 9b - bG-CSF T133pAF의 Glu-C 소화 (214nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 10a - 야생형 bG-CSF의 Glu-C 소화 (250nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 10b - bG-CSF T133pAF의 Glu-C 소화 (250nm 검출)에 대해 나타낸 것이다.
도 11 - PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드의 SEC-HPLC 분석을 나타낸다.
도 12 - bG-CSF 폴리펩타이드의 SEC-HPLC 분석을 나타낸다.
도 13 - 2OK PEG화된 소의 G-CSF T133pAF 및 야생형의 M-NFS60 증식 분석의 미가공 EC50 값을 나타낸다.
도 14 - 2OK PEG화된 소의 G-CSF T133pAF 및 야생형의 M-NFS60 증식 분석의 EC50 폴드 디퍼런스(fold difference)를 나타낸다.
도 15 - CD11b 항체로 염색된 소의 호중구를 분석한 실험 결과를 나타낸다.
도 16 - ANC에 대한 PEG화된 bG-CSF 투여의 결과를 나타낸다.
도 17 - 40 ㎍/kg으로 단회 피하 주사 후 PEG화된 bG-CSF 제형 버퍼로 처리된 송아지의 절대 호중구 수(평균 ± 표준편차)를 나타낸 선 그래프.
도 18 - 예로서 40 ㎍/kg을 주입한 소의 평균 일일 우유 생산량을 나타낸 선 그래프.
도 19 - 대조군, PEG화되지 않은 bG-CSF로 매일 처리한 군, 40 ㎍/kg의 PEG화된 bG-CSF를 주사한 군 및 20 ㎍/kg의 PEG화된 bG-CSF를 주사한 군을 포함하는 네 군 사이의 분만 3일째, 5일째, 7일째 및 10일째 되는 날에 체세포 수의 차이를 나타낸 막대 그래프.

정의

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 구조물 및 시약에 한정되지 않으며, 이러한 것들은 여러 가지로 다양하게 변화될 수 있다는 점을 인식해야 할 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 오직 특정 실시 양태를 설명하기 위한 목적이지, 본 발명의 범위를 첨부되는 청구 범위에 의해서만 한정하려는 의도가 아님도 이해하여야 할 것이다.

본 명세서와 청구범위에서 사용된 단수 형태의 표현("a", "an" 및 "the")은 달리 명시하지 않는다면 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "bGCSF" "소의 G-CSF," "b-GCSF," "bG-CSF," "소의 G-CSF 폴리펩타이드" 또는 "bG-CSF 폴리펩타이드" 그리고 하이픈이 있거나 없는 다른 여러 언급은 하나 이상의 이러한 단백질들을 지칭하며, 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함하는 것이다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자에게 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 비록 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법, 장치 및 물질들이라면 그 어느 것이라도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 물질들에 대해서 하기에 기재한다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어, 여기에 개시된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보에 기술된 구조물과 방법론을 기술하여 개시할 목적으로 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다. 본 명세서에서 논의되는 공보는 오직 본 출원의 출원일 전에 개시된 것들만이 제공된다. 본원에 개시된 것들 중 그 어떤 것이라도, 본 발명자들이 선행 발명에 의해서 또는 어떤 다른 이유 때문에 그 개시 내용을 선행할 자격이 되지 않는다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 될 것이다.

"실질적으로 정제된"이라는 용어는 천연 발생 환경, 즉 본래의 세포에서, 또는 재조합으로 생산된 bG-CSF 폴리펩타이드의 경우는 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 정상적으로 동반하거나 또는 그 단백질과 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 기본적으로 함유하지 않을 수 있는 bG-CSF 폴리펩타이드를 지칭한다. 실질적으로 세포성 물질을 함유하지 않을 수 있는 bG-CSF 폴리펩타이드는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만 (건조 중량 기준)의 오염원 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. bG-CSF 폴리펩타이드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의한 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의한 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" bG-CSF 폴리펩타이드는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동과 같은 적절한 방법에 의해 측정시 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상의 순도, 구체적으로 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도, 보다 구체적으로는 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 약 99% 이상의 순도 또는 그 이상의 순도를 가질 수 있다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"라는 용어는 삽입을 위해 사용되는 방법, 예컨대 직접적 섭취, 형질 도입, f-교배, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하는 당업계에 공지된 기타 방법들이 무엇이든지 그에 상관없이 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 지칭하는 말이다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 도입되지 않은 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지되거나, 또는 다르게는, 숙주 유전체 내로 도입될 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "배지(들)"이라는 용어는 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유류 숙주 세포, CHO 세포, 원핵생물 숙주 세포, 대장균 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포 및 세포 함유물을 지지하거나 또는 포함할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 이 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들어 증식 단계 이전 또는 증식 단계 이후 배지를 비롯하여 bG-CSF 폴리펩타이드가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 이 용어는 예를 들어, bG-CSF 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되어 숙주 세포가 용해되거나 또는 붕괴되어 bG-CSF 폴리펩타이드를 방출하는 경우와 같이, 숙주 세포 용해물을 함유하는 버퍼 또는 시약을 포함할 수 있다.

단백질 리폴딩(refolding)과 관련하여 본 명세서에 사용된 "환원제"라는 용어는 환원 상태의 설프히드릴기를 유지시키고, 분자 내 또는 분자 간 이황화 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 환원제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 디티오트레이톨 (DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 광범위하게 다양한 환원제를 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하게 사용할 수 있다는 점은 당업자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

단백질 리폴딩과 관련하여 본 명세서에 사용된 "산화제"라는 용어는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 산화제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 산화 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화 디티오트레이톨, 산화 에리트레이톨 및 산소를 포함한다. 광범위하게 다양한 산화제를 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하게 사용할 수 있다는 점은 당업자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용된 "변성화제 (denaturing agent)" 또는 "변성제 (denaturant)"라는 용어는 단백질의 가역적인 풀림(언폴딩, unfolding)을 야기하는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성화제 또는 변성제의 세기는 특정 변성화제 또는 변성제의 특성과 농도 양자 모두에 의해 결정되게 된다. 적절한 변성화제 또는 변성제로서는 케이오트로프 (chaotrope), 계면활성제, 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질, 또는 이러한 제제를 2개 이상으로 조합한 혼합물일 수 있다. 적합한 케이오트로프로서는, 이에 제한되지는 않지만, 우레아, 구아니딘 및 소듐 티오시아네이트를 포함한다. 유용한 계면활성제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 강성 계면활성제, 예컨대 소듐 도데실 설페이트, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들어, Tween 또는 Triton 계면활성제), 사르코실 (Sarkosyl), 연성인 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 디지토닌 (digitonin)), 연성인 양이온성 계면활성제, 예컨대 N->2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 연성인 이온성 계면활성제 (예를 들어, 소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트) 또는 양성이온성(zwitterionic) 계면활성제, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, 설포베타인 (쯔비터젠트 (Zwittergent)), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트 (CHAPS) 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트 (CHAPSO)를 포함할 수 있다. 유기 수혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 저급 알칸올 (특히 C₂-C₄ 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올 (특히, C₂-C₄ 알칸디올, 예컨대 에틸렌-글리콜)이 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 인지질은 천연 발생 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 이의 변이체, 예를 들어 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "리폴딩"이라는 용어는 이황화 결합을 함유하는 폴리펩타이드가 이황화 결합과 관련해서 부적절하게 접혀(폴딩) 있거나 또는 풀려(언폴딩)있는 상태로부터 본래대로 또는 적절하게 접힌 구조로 변형하게 되는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 기술하는 말이다.

본 명세서에 사용된 "코폴딩 (cofolding)"이라는 용어는 서로 상호작용하는 2 개 이상의 폴리펩타이드를 사용하여 풀려있거나 또는 부적절하게 접혀있는 폴리펩타이드를 본래 적절하게 접힌 폴리펩타이드로 변형시키는 리폴딩 과정, 반응 또는 방법을 특별히 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 "과립구 콜로니 자극 인자" 또는 "G-CSF"라는 용어는 생물학적 활성이 동일한 것과는 상관없이, 그리고 그의 합성 또는 제조 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 재조합 (cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA 또는 다른 형태의 핵산으로부터 제조되었는가의 여부), 합성, 유전자 이식 및 유전자 활성화 방법에 관계없이, G-CSF (예컨대 hG-CSF에 대해 미국특허 제6,716,606호; 제6,689,351호; 제6,565,841호; 제6,162,426호; 제5,811,301호; 제5,776,895호; 제5,718,893호; 제5,580,755호; 제5,536,495호; 제5,202,117호; 제5,043,156호; 제4,999,291호; 제4,810,643호; 및 제4,968,618호에 기재된 것들, 상기 문헌들은 본원에 참조로 포함됨)의 생물학적 활성을 하나 이상 보유하는 폴리펩타이드 및 단백질뿐 아니라, G-CSF 유사체, G-CSF 동형, G-CSF 모방체, G-CSF 단편, 하이브리드 G-CSF 단백질, 융합 단백질 올리고머 및 다량체, 동족체, 글리코실화 패턴 변이체 및 돌연변이 단백질을 망라한다. G-CSF의 구체적인 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 페그필그라스팀(pegfilgrastim) (NEULASTA®), 필그라스팀(filgrastim) (NEUPOGEN®), G-CSF 유사체, G-CSF 돌연변이체, 변형된 글리코실화 G-CSF 및 PEG 접합된 G-CSF 유사체를 포함한다. 내인성 인간 G-CSF의 발현을 위해 변화된 세포주의 구체적인 예들은 문헌 [Devlin et al., J. Leukoc. Biol. 41:306 (1987)]; 미국특허 제6,716,606호; 제6,379,661호; 제6,004,548호; 제5,830,705호; 제5,582,823호; 제4,810,643호; 및 제6,242,218호(이들 특허문헌은 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 "소의 과립구 콜로니 자극 인자", "소의 G-CSF" 또는 "bG-CSF"라는 용어는 생물학적 활성이 동일한 것과는 상관없이, 그리고 그의 합성 또는 제조 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 재조합 (cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA 또는 다른 형태의 핵산으로부터 제조되었는가의 여부), 합성, 유전자 이식 및 유전자 활성화 방법에 관계없이, bG-CSF의 생물학적 활성을 하나 이상 보유하는 폴리펩타이드 및 단백질뿐 아니라, bG-CSF 유사체, bG-CSF 동형, bG-CSF 모방체, bG-CSF 단편, 하이브리드 bG-CSF 단백질, 융합 단백질 올리고머 및 다량체, 동족체, 글리코실화 패턴 변이체 및 돌연변이 단백질을 망라한다. G-CSF의 구체적인 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, bG-CSF 돌연변이체, 변형된 글리코실화 G-CSF 및 PEG 접합된 G-CSF 유사체를 포함한다.

"소의 G-CSF (bG-CSF)" 또는 "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어는 상기 기술된 바와 같은 소의 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)뿐 아니라, 천연 발생 bG-CSF의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. bG-CSF 폴리펩타이드라는 용어는 약학적으로 허용되는 염 및 전구약물 및 이러한 염의 전구약물, 천연 발생 bG-CSF의 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성체뿐 아니라, 천연 발생 bG-CSF의 작용제, 모방체 및 길항제 변이체와 이들의 폴리펩타이드 융합체를 포함한다. bG-CSF 폴리펩타이드 및 모방체의 예로서는 WO 89/10932, 미국특허 제5,849,883호 및 제6,497,869호(이들 특허문헌들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 말단 모두에서 추가의 아미노산을 포함하는 융합체도 "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어에 포함된다. 대표적인 융합체로서는, 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, bG-CSF의 성숙된 형태를 재조합 발현시켜 메티오닌이 bG-CSF의 N-말단에 결합되도록 유도한 것인 메티오닐 bG-CSF (서열번호 2의 폴리펩타이드와 같은 것), 정제용 융합체 (이에 제한되지는 않지만, 폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함함), 혈청 알부민 결합 펩타이드를 갖는 융합체 및 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질을 갖는 융합체를 포함한다. 전장 형태 및 성숙한 형태에 대한 천연 발생 bG-CSF 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 단일 아미노산 변이체 및 스플라이스 변이체와 같은 변이체도 알려져 있다. 성숙한 bG-CSF 아미노산 서열과 메티오닐 bG-CSF 아미노산 서열에 대해서는, 서열번호 1과 서열번호 2를 각각 참조하면 된다. hG-CSF 돌연변이체를 코딩하는 핵산과 돌연변이 hG-CSF 폴리펩타이드도 역시 공지되어 있다.

소의 과립구 콜로니 자극 인자, 즉 bG-CSF는 다양한 생물학적 활성, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 수용체에 대한 결합하는 특성, 수용체에 대해 이량체화를 야기하는 특성, 호중구 생성을 자극하는 특성 및 세포 증식과 분화를 자극하는 특성을 가진다. 과립구 콜로니 자극 인자 및 hG-CSF의 생물학적 활성에 대한 예로서는 상기에 기술되어 있고, 미국특허 제6,676,947호; 제6,579,525호; 제6,531,121호; 제6,521,245호; 제6,489,293호; 제6,368,854호; 제6,316,254호; 제6,268,336호; 제6,239,109호; 제6,165,283호; 제5,986,047호; 제5,830,851호; 제5,043,156호; 및 제5,773,569호(이들 특허문헌은 본원에 참조로 포함됨)에도 기술되어 있다.

본원에서 사용된 "소의 G-CSF 폴리펩타이드", "bG-CSF 폴리펩타이드", "소의 G-CSF" 또는 "bG-CSF", 그리고 하이픈이 있거나 없는 이들을 지칭하는 용어들은 생물학적 활성이 동일한 것과는 상관없이, 그리고 그의 합성 또는 제조 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 재조합 (cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA 또는 다른 형태의 핵산으로부터 제조되었는가의 여부), 시험관 내, 생체 내 핵산 분자의 미량 주사, 합성, 유전자 이식 및 유전자 활성화 방법에 관계없이, bG-CSF의 생물학적 활성을 하나 이상 보유하는 폴리펩타이드 및 단백질뿐 아니라, bG-CSF 유사체, bG-CSF 돌연변이체, 변형된 글리코실화 bG-CSF, PEG 접합된 bG-CSF, bG-CSF 동형, bG-CSF 모방체, bG-CSF 단편, 하이브리드 bG-CSF 단백질, 융합 단백질 올리고머 및 다량체, 동족체, 글리코실화 패턴 변이체 및 이의 돌연변이 단백질을 망라한다. "소의 G-CSF 폴리펩타이드", "bG-CSF 폴리펩타이드", "소의 G-CSF" 또는 "bG-CSF"라는 용어는 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 망라한다. 소의 G-CSF의 유사체에 대해서는 미국특허 제5,849,883호(본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.

매우 다양한 아미노산 위치에서 bG-CSF를 치환하는 것에 대해 기술되어 왔다. 치환은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약학적 안정성을 조절하는 치환, 작용제의 활성을 증가시키는 치환, 프로테아제 내성을 증가시키는 치환, 폴리펩타이드를 길항제로 전환시키는 치환을 포함하며, 이들은 "소의 G-CSF 폴리펩타이드", "bG-CSF 폴리펩타이드", "소의 G-CSF" 또는 "bG-CSF"라는 용어로 포괄된다.

추가의 실시 양태에서, 본 발명은 변이체 단백질을 코딩하는 재조합 핵산, 변이체 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 변이체 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 상기 변이체 단백질의 제조 방법을 제공한다. 추가적인 측면으로, 본 발명은 변이체 단백질을 통상 약학적 담체를 이용하여 치료 유효량으로 환자에게 투여함으로써 감염 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

미국특허 제5,849,883호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)에 거론된 bG-CSF 돌연변이체는 대장균에 대한 코돈 최적화로 고안된 폴리펩타이드 및 소와 인간의 G-CSF 서열로 생성된 하이브리드 단백질을 포함한다. 미국특허 제5,416,195호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)는 하나 이상의 하기의 아미노산 치환(아미노산 번호 매김은 성숙한 단백질을 기준으로 하였으므로, 따라서 N-말단 메티오닌이 존재하는 곳에는 -1번 또는 0번이 할당됨)이 이루어진 hG-CSF를 기술하고 있다: 천연 서열의 Cys17은 Ser17 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Asp27은 Ser27 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Leu15는 Glu15 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Lys23은 Arg23 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Gly28은 Ala28 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Lys40은 Arg40 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Pro44는 Ala44 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Leu49는 Lys49 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Gly55는 Ala55 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Cys60은 Ser60 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Pro111은 Glu111 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Thr115는 Ser115 잔기로 대체되고, 천연 서열의 Tyr165는 Arg165 잔기로 대체됨. 이러한 잔기들의 대다수는 bG-CSF 서열 내에 존재하며, 하나 이상의 이러한 치환들은 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에서 발견할 수 있다. 문헌 [Carter et al. Biologicals (2004) 32:37]은 글리코실화 부위를 결여한 돌연변이된 hG-CSF를 기술하고 있다. 이와 유사한 돌연변이를 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에서도 찾을 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 서열번호 1, 2 또는 bG-CSF 폴리펩타이드의 임의의 다른 서열과 실질적으로 동일하다. 돌연변이체를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자 및 bG-CSF 폴리펩타이드를 발현시켜 정제하는 방법은 잘 알려져 있다.

또한, "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어는 약학적으로 허용되는 염 및 전구약물, 및 이러한 염의 전구약물, 천연 발생 bG-CSF의 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성체뿐 아니라, 천연 발생 bG-CSF의 작용제, 모방체 및 길항제 변이체와 이들의 폴리펩타이드 융합체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 말단 모두에서 추가의 아미노산을 포함하는 융합체도 "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어에 포함된다. 대표적인 융합체로서는, 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, 리더 펩타이드 또는 신호 펩타이드 또는 이의 부분이 부족한 bG-CSF의 성숙된 형태를 재조합 발현시켜 메티오닌이 bG-CSF의 N-말단에 결합되도록 유도한 것인 메티오닐 bG-CSF (재조합 발현의 결과로 메티오닌이 bG-CSF의 N-말단에 결합함), 정제용 융합체 (이에 제한되지는 않지만, 폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함함), 혈청 알부민 결합 펩타이드를 갖는 융합체 및 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질을 갖는 융합체를 포함한다. 미국특허 제5,750,373호(본원에 참조로 포함됨)는 성장 호르몬과 같은 신규한 단백질 및 각 수용체 분자에 대해 변화된 결합 특성을 보유하는 항체 단편 변이체를 선별하는 방법을 기술하고 있다. 상기 방법은 섬유상 파지 M13의 III형 유전자 피막 단백질의 카르복시 말단 도메인에 해당 단백질을 코딩하는 유전자를 융합시키는 단계를 포함한다. 키메라 분자는 bG-CSF와 하나 이상의 다른 분자를 포함한다. 상기 키메라 분자는 bG-CSF와 다른 분자(들) 중 하나 또는 양자 모두의 특정 영역 또는 단편을 포함할 수 있다. 이러한 임의의 단편은 표준 생화학적 방법에 의해 또는 이러한 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질로부터 제조할 수 있다. bG-CSF 또는 이의 단편은 인간 혈청 알부민(HSA), Fc 또는 이의 일부분을 포함하는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 이러한 융합 구조물은 진핵생물 숙주 세포 내에서 bG-CSF 또는 이의 단편의 발현 향상을 위해 적절하다. 대표적인 HSA 부분으로서는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국특허 제5,766,883호와 공보 WO 97/24445에 개시된 바와 같은 N-말단 폴리펩타이드 (아미노산 1-369, 1-419 및 1번 아미노산으로 시작되는 중간 길이의 아미노산)를 포함한다. 다른 키메라 폴리펩타이드로서는 HSA의 C-말단과 N-말단 각각에 bG-CSF 또는 이의 단편이 부착된 HSA 단백질을 포함할 수 있다. bG-CSF와 a) 면역글로불린의 Fc 부분; b) 면역글로불린 Fc 부분의 유사체 및 c) 면역글로불린 Fc 부분의 단편을 융합시킴으로써 다른 기타 융합체도 제조할 수 있다.

다양한 참조 문헌들이 중합체 접합 또는 글리코실화에 의한 폴리펩타이드의 변형을 개시하고 있다. "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어는 PEG와 같은 중합체에 접합되는 폴리펩타이드를 포함하며, 시스테인, 리신 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가적인 유도체화를 포함할 수 있다. 또한, bG-CSF 폴리펩타이드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 링커 또는 중합체가 접합되는 아미노산은, 본 발명에 따른 비천연 아미노산일 수 있고, 또는 상기 링커 또는 중합체는 예를 들어 리신 또는 시스테인에 대한 커플링과 같이 당업계에 공지된 기법을 사용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 접합시킬 수 있다.

폴리펩타이드의 중합체 변형은 보고된 바 있다. IFNβ는 성장 호르몬 상과(superfamily)에 속하는 폴리펩타이드의 한 예로서 언급된다. WO 00/23114는 글리코실화 및 PEG화된 IFNβ를 개시하고 있다. WO 00/23472는 IFNβ 융합 단백질을 개시하고 있다. 미국특허 제4,904,584호는 리신이 결여된 PEG화된 폴리펩타이드를 개시하는데, 여기에서는 하나 이상의 리신 잔기는 결여되거나 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. WO 99/67291은 PEG와 단백질을 접합하는 방법을 개시하는데, 여기에서는 단백질 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여되고 이 단백질은 단백에 대한 접합을 달성하기에 충분한 조건 하에 PEG와 접촉하게 된다. WO 99/03887은 성장 호르몬 상과에 속하는 폴리펩타이드의 PEG화된 변이체를 개시하는데, 여기에서는 시스테인 잔기가 폴리펩타이드의 특정 영역에 위치한 비필수 아미노산 잔기로 치환되었다. WO 00/26354는 알레르기성이 감소된 글리코실화된 폴리펩타이드 변이체의 제조 방법을 개시하는데, 이 폴리펩타이드는 여기에 대응하는 모 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 또다른 글리코실화 부위를 포함하게 된다. 미국특허 제5,218,092호(본원에 참조로 포함됨)는 본래의 폴리펩타이드에 비하여 하나 이상의 또다른 탄수화물 사슬을 더 도입하기 위한 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 다른 폴리펩타이드의 변형에 대해 개시하고 있다.

또한, "bG-CSF 폴리펩타이드"는 글리코실화된 bG-CSF, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩타이드, N-결합 또는 O-결합 글리코실화 형태의 폴리펩타이드를 포함한다. 단일 뉴클레오타이드 변화를 포함하는 변이체가 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체로서 고려되기도 한다. 단일 뉴클레오타이드 변화를 포함하는 변이체가 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체로서 고려되기도 한다. 추가로, 스플라이스 변이체도 포함된다. 또한, "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어는 임의의 하나 이상의 bG-CSF 또는 임의의 다른 폴리펩타이드의 bG-CSF 폴리펩타이드 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체 또는 동종다량체, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 화학적 방법에 의해 결합되거나 또는 융합 단백질로서 발현되는 임의 유형의 기타 생물학적 활성 분자(미국특허 제6,261,550호; 제6,166,183호; 제6,204,247호; 제6,261,550호; 제6,017,876호 참조, 이들 특허문헌은 본원에 참조로 포함됨)뿐 아니라, 예컨대, 특정 결실 또는 다른 변형을 포함하면서도 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩타이드 유사체(미국특허 제6,261,550호; 제6,004,548호; 제6,632,426호 참조, 이들 특허문헌은 본원에 참조로 포함됨)를 포함한다.

달리 특정되지 않는 한(즉, 그 대비가 서열번호 2 또는 다른 bG-CSF 서열을 기초로 한다고 언급되는 경우), 본원에 기술된 bG-CSF의 아미노산 위치에 대한 모든 기준은 서열번호 1의 위치를 기초로 한다. 예를 들어, 서열번호 1에서 1번 위치의 아미노산은 트레오닌이며, 이에 대응하는 트레오닌은 서열번호 2에서는 2번에 위치한다. 당업자라면 서열번호 1에서의 위치에 대응하는 아미노산 위치를 서열번호 2와 같이 임의의 다른 bG-CSF 분자에서 쉽게 확인할 수 있다는 사실을 인지할 것이다. 당업자라면 서열번호 1, 2 또는 임의의 다른 bG-CSF 서열에서의 위치에 대응하는 아미노산 위치를 bG-CSF 융합체, 변이체, 단편 등과 같은 임의의 다른 bG-CSF 분자에서 쉽게 확인할 수 있다는 사실을 알 것이다. 예를 들어, BLAST와 같은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 서열번호 1, 2 또는 임의의 다른 bG-CSF 서열에서의 위치와 대응하는 단백질 내의 특정 위치를 정렬하여 동정할 수 있다. 서열번호 1, 2 또는 임의의 다른 bG-CSF 서열과 관련한 본원에 기술된 아미노산의 치환, 부가 또는 결실은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 bG-CSF 융합체, 변이체, 단편 등에서 대응하는 위치에 대한 치환, 부가 또는 결실을 지칭하는 것이며, 이들도 본 발명에 명백히 포함되는 것이다.

"bG-CSF 폴리펩타이드" 또는 "bG-CSF"라는 용어는 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 망라한다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 하나 이상의 비천연 아미노산 변형물과 하나 이상의 천연 아미노산을 함께 이용한 변형물로 이루어질 수 있다. 천연 발생 bG-CSF 폴리펩타이드에서 광범위하게 다양한 아미노산 위치에서의 대표적인 치환으로서는, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, 약학적 안정성을 조절하는 치환, bG-CSF 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하는 치환, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 작용제의 활성을 증가시키거나, 폴리펩타이드의 가용성을 증가시키거나, 프로테아제 민감도를 감소시키거나, 폴리펩타이드를 길항제로 전환시키는 것 등의 치환을 포함하며, 이들은 "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어에 포함된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 길항제는 bG-CSF 분자의 수용체 결합 부위에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 bG-CSF 폴리펩타이드의 호중구 증식, 기능 및/또는 분화를 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 bG-CSF의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 수용체에 대한 친화도를 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료 반감기를 조절하거나, 폴리펩타이드의 안정성을 조절하거나, 프로테아제에 의한 분해를 조절하거나, 투약량을 조절하거나, 방출 또는 생체 내 이용효율을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시킬 수 있다. 이와 유사하게, bG-CSF 폴리펩타이드는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기반의 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 또는 폴리펩타이드의 검출 (GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 결합 분자 (비오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

또한, "bG-CSF 폴리펩타이드"라는 용어는, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해서 동일하거나 또는 서로 다른 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 또는 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 결합되거나, 또는 링커를 통해 간접적으로 결합된 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 및 이종다량체를 망라한다. 대표적인 링커로서는 소분자 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩타이드를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 공통 아미노산 중 하나의 아미노산 또는 피롤리신 혹은 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. "비천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어와 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비천연 아미노산," "비-천연 아미노산," "비천연 발생 아미노산" 및 이들 용어를 하이픈으로 여러가지 형태로 결합시키거나 그렇지 않은 용어를 들 수 있다. 또한, "비천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어는, 이에 한정되지는 않으나, 천연적으로 코딩된 아미노산 (20개의 일반 아미노산 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 변형 (예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 발생하나, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩타이드 사슬에 천연적으로 통합되지 않는 아미노산을 포함한다. 이러한 비천연 발생 아미노산의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함한다.

"아미노 말단 변형기"는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 이와 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형기는, 이에 제한되지는 않지만, 다양한 수용성 중합체, 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 혹은 펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키는 다른 부분들을 포함한다.

"작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"이라는 용어는 분자에 있어서 서로 뚜렷이 다른 것으로 정의할 수 있는 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 당업계 및 본 명세서에서 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서도 다소 동일한 의미이며, 본 명세서에서는 일부 기능 또는 활동을 수행하고, 다른 분자와 반응성을 갖는 분자의 일부분을 가리키는 것으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 "결합" 또는 "링커"라는 용어는 보통 화학적 반응의 결과로 형성되며, 통상 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭한다. 수분에 대해 안정한 결합이라는 말은 결합이 수중에서 실질적으로 안정하여, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, 장시간 동안, 심지어 무기한의 시간 동안 생리학적 조건 하를 비롯하여 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 수분에 대해 불안정하거나 또는 분해가능한 결합은 이러한 결합이 예컨대, 혈액을 비롯한 물 또는 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 또는 분해가능한 결합은 이러한 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 주지되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 백본 내에, 또는 중합체 백본과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커기 내에 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상에서 알콜 기와 반응시킴으로써 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 이러한 상기 제제를 방출시키는 생리학적 조건 하에서 가수분해된다. 다른 가수분해가능한 결합으로서는 이에 제한되지는 않지만, 카르보네이트 결합, 아민과 알데하이드의 반응으로 생성된 이민 결합, 알콜을 포스페이트기에 반응시켜 형성되는 포스페이트 에스테르 결합, 히드라지드와 알데하이드의 반응 생성물인 히드라존 결합, 알데하이드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 결합, 포르메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르소에스테르 결합, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 펩타이드의 카르복실기에 의해 형성된 펩타이드 결합, 그리고 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 중합체의 말단의 포스포라미다이트 기와 올리고뉴클레오타이드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오타이드 결합을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"라는 용어는, 이에 제한되지는 않지만, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포슨, 프리온, 곤충, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 비롯한 유기체와 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용에 있어서 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에 사용된 생물학적 활성 분자라는 말은, 이에 제한하지는 않지만, 인간 또는 다른 동물의 질병을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하기 위한 임의의 물질 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 행복감을 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예로서는, 이에 한정되지는 않지만, 펩타이드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 백신, 면역원, 중독성이 강한 마약, 중독성이 약한 마약, 탄수화물, 무기 원자 또는 무기 분자, 염료, 지질, 뉴클레오사이드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오타이드, 변성 독소, 독소, 원핵생물 및 진핵생물 세포, 바이러스, 폴리사카라이드, 핵산, 그리고 바이러스, 박테리아, 곤충, 동물 또는 임의의 다른 세포 혹은 세포형으로부터 수득되거나 유래한 이들의 부분, 리포솜, 미세입자 및 미셀을 포함한다. bG-CSF 폴리펩타이드는 미셀계 제형 내에 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 부류의 생물학적 활성제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 약물, 전구 약물, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관 약제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 약제, 미생물 유래 독소 등을 포함한다.

"이작용성 중합체"는 다른 부분 (아미노산 측기를 포함하며 이에 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 별도의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정 생물학적 활성 성분의 기와 반응성인 하나의 작용기, 그리고 제2 생물학적 성분의 기와 반응성인 또 다른 기를 보유하는 이작용성 링커를 사용하여 제1 생물학적 활성 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 펩타이드에 다양한 화합물을 부착시키기 위한 여러 가지 방법과 링커 분자들은 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 유럽 특허 출원 제188,256호, 미국특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호, 제4,680,338호 및 제4,569,789호를 참조할 수 있다. "다작용성 중합체"는 다른 부분 (아미노산 측기를 포함하며 이에 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별도의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있으며, bG-CSF에 결합된 하나 이상의 분자와 그의 수용체 또는 bG-CSF 간에 원하는 특정 이격 거리 또는 배위를 제공하도록 선택될 수 있다.

치환기가 통상적인 화학식에 의해서 좌측으로부터 우측으로 기록한 내용으로 특정되는 경우에, 이러한 치환기는 오른쪽으로부터 왼쪽으로 그 구조를 기록하여 만들어지는 화학적으로 동일한 치환기도 동일하게 포함하는데, 예를 들자면, 구조 -CH₂O-는 구조 -OCH₂-와 동일한 것이 그런 것이다.

"치환기"라는 용어는 이에 제한되지는 않지만, "비간섭 치환기"를 포함한다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적절한 비간섭 치환기 또는 라디칼로서는, 이에 제한되지는 않지만, 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₁-C₁₂ 아랄킬, C₁-C₁₂ 알카릴, C₃-C₁₂ 시클로알킬, C₃-C₁₂ 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₂-C₁₂ 알콕시아릴, C₇-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, --(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀ 알킬) (여기서, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO₂, --CN, --NRC(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C₁-C₁₀ 알킬), --OH, --SO₂, =S, --COOH, --NR₂, 카르보닐, --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, --C(O)-CF₃, --C(O)NR₂, --(C₁-C₁₀ 아릴)-S--(C₆-C₁₀ 아릴), --C(O)--(C₁-C₁₀ 아릴), --(CH₂)_m--O--(--(CH₂)_m--0--(C₁-C₁₀ 알킬) (여기서, 각각의 m은 1 내지 8임), --C(O)NR₂, --C(S)NR₂, --SO₂NR₂, --NRC(O)NR₂, --NRC(S)NR₂, 이의 염 등을 포함한다. 본 명세서에 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아랄킬 또는 알카릴이다.

"할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

"알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로서나 또는 다른 치환기의 일부로서, 완전히 포화되거나, 단일 불포화되거나 또는 다중 불포화될 수 있고, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 2가 및 다가의 라디칼 (즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10 개의 탄소를 의미함)을 포함할 수 있는 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합체를 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸과 같은 기들과, 예컨대 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기의 동족체 및 이성체를 포함한다. 불포화된 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 기이다. 불포화된 알킬 기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 이들의 고급 동족체 및 이성체를 포함한다. "알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, "헤테로알킬"과 같이 하기에서 더욱 상세히 정의되는 알킬의 유도체를 포함하는 것을 의미하기도 한다. 탄화수소 기로 제한된 알킬기는 "호모알킬"이라는 용어로 부른다.

"알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기로 일부로서, 이에 한정하지는 않지만 구조 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-에 의해 예시된 것과 같이 알칸으로부터 유래된 2가의 라디칼을 의미하며, 하기에서 "헤테로알킬렌"으로 기술되는 기들을 추가로 포함한다. 보통, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 1개 내지 24개의 탄소 원자를 가지게 되며, 본원에 기술된 방법과 조성물의 특정 실시 양태에 있어서는 10개 이하의 탄소 원자를 가진다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 더 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.

"알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)라는 용어는 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자를 통해 분자의 잔여부에 부착된 알킬 기를 지칭한다.

"헤테로알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 언급된 수의 탄소 원자 및 0, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼 또는 그들의 조합체를 의미하며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N과 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 잔여부에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 이러한 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃를 포함한다. 2개 이하의 헤테로원자는 -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-0-Si(CH₃)₃과 같이 연속적으로 배치될 수 있다. 이와 유사하게, "헤테로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 이에 한정하는 것은 아니지만, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-로 예시되는 바와 같이, 헤테로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 또는 서로 다른 헤테로원자들은 사슬 말단(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두를 차지할 수도 있다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 화학식이 기록되는 방향이 결합 기의 방향을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂- 양자 모두를 나타낸다.

"시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로서 또는 다른 용어와 함께, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 시클릭 형태를 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화된 고리 결합, 부분 불포화된 고리 결합 및 완전 불포화된 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 잔여부에 부착되는 위치를 점유할 수 있다. 시클로알킬의 예로서는, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예로서는, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로퓨란-2-일, 테트라히드로퓨란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 이 용어는 바이시클릭 및 트리시클릭 고리 구조를 포함한다. 이와 유사하게, "헤테로시클로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미하고, "시클로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 시클로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "수용성 중합체"라는 용어는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. bG-CSF 폴리펩타이드에 수용성 중합체를 결합시킴으로써, 변형되지 않은 형태에 비해 증가되거나 또는 조절된 혈청 반감기 또는 증가되거나 또는 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 응집 및 다량체 형성과 같은 조절된 물리적 회합 특성, 변화된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 동반체에 대한 변화된 결합 및 변화된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 비롯한 변화들(여기에 한정되지 않음)을 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자체에 생물학적 활성을 가질 수도 있고, 가지지 못할 수도 있으며, bG-CSF를 다른 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 bG-CSF 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자에 부착시키기 위한 링커로서 이용될 수 있다. 적합한 중합체로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 이의 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제 5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하며 이에 한정되지 않는 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩타이드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 α-β-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예로서는, 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않는다. WO 03/074087 및 WO 03/074088은 단백질 또는 소분자를 히드록시알킬 전분 (HAS)에 접합시키는 것에 대해 기술하고 있다. 히드록시알킬 전분의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 히드록시에틸 전분을 포함한다. 히드록시알킬 전분과 다른 분자와의 접합은, 예를 들어 HAS의 말단 알데히드기와 다른 분자의 반응성 기 사이에 공유 결합을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"이라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜 (폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이의 유도체를 지칭한다. "폴리알킬렌 글리콜"이라는 용어는 선형 및 분지형 중합체 양자 모두를 포함하며, 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 가진다. 다른 예시적인 실시 양태들은 예를 들어, 쉐어워터 코퍼레이션 (Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]와 같은 제품 공급업체 카탈로그에 나열되어 있다.

"아릴"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 함께 융합되거나 또는 공유 결합되는 단일 고리 또는 다중 고리 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 1개 내지 3개의 고리)일 수 있는 다중 불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O 및 S로부터 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴기(또는 고리)를 일컬으며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 산화될 수 있고, 질소 원자(들)는 4급화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 잔여부에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예로서는, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 각각의 아릴 및 헤테로아릴 고리계에 대한 치환기는 하기 기술되는 허용되는 치환기의 군으로부터 선택된다.

간추려 말하면, "아릴"이라는 용어는 다른 용어들 (아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하며 이에 한정되지 않음)과 함께 사용되는 경우 상기 정의한 아릴 및 헤테로아릴 고리 양자 모두를 포함한다. 따라서, "아릴알킬"이라는 용어는 아릴 기가 알킬기에 부착된 라디칼을 포함하는 것인데, 예를 들어 탄소 원자 (메틸렌기를 포함하며 이에 한정되지 않음)가 예컨대, 산소 원자 (페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의해 치환된 알킬기를 비롯한 알킬기 (벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)등을 포함한다.

상기 용어들 ("알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하며 이에 한정되지 않음) 각각은 지정된 라디칼의 치환된 형태 및 치환되지 않은 형태 양자 모두를 포함하는 것이다. 각 유형의 라디칼에 대한 대표적인 치환기를 하기에 제공한다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (흔히 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m' + 1) (여기서, m'는 이러한 라디칼 중의 총 탄소 원자의 수임) 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'C(O)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂(이에 한정되지 않음)로부터 선택되는 하나 이상의 다양한 기들일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 제한되지는 않지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 논의한 치환기의 내용으로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬 (-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한다는 의미를 알 수 있을 것이다.

알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하며, 이에 제한되지는 않지만, 0 내지 방향족 고리계 상의 총 개방 원자가 범위의 수로, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"'C(O)₂R', -NRC(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬 (여기서, R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택됨)로부터 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다.

본 명세서에 사용된 "조절된 혈청 반감기"라는 용어는 변화되지 않은 bG-CSF의 형태에 비해 변형된 bG-CSF의 순환 반감기에서의 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 bG-CSF의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 각각의 샘플 내의 분자의 농도를 측정함으로써 결정된다. 혈청 농도와 시간의 상관 관계로부터 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2배 이상이지만, 예컨대, 만족스러운 투여 요법을 이끌어내거나 또는 독성 효과를 피하는 경우에는 이보다 적은 증가량도 유용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 그 증가 정도는 약 3배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이다.

본 명세서에 사용된 "조절된 치료 반감기"라는 용어는 변화되지 않은 bG-CSF의 형태에 비하여 치료 유효량의 bG-CSF 반감기에 있어서 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 특성 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 결정된다. 증가된 치료 반감기는 바람직하게는 유익한 특정 투여 요법, 유익한 특정 총 투약량을 가능하게 하거나 또는 원치 않는 효과를 피할 수 있게 해준다. 일부 실시 양태에서, 치료 반감기의 증가는 효능의 증대, 표적에 대한 변형된 분자의 결합 증가 또는 감소, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자 붕괴의 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 다른 매개변수 혹은 작용 기전의 증가 또는 감소, 또는 분자의 수용체 매개성 클리어랜스(clearance)의 증가 또는 감소로부터 비롯된다.

"단리된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 핵산 또는 단백질이 자연 상태에서 회합되는 다른 세포 성분들을 적어도 일부 함유하지 않거나, 또는 핵산 또는 단백질이 생체 내 또는 시험관 내에서 생성되는 농도보다 높은 수준으로 농축되는 것을 의미한다. 이는 균질한 상태에서 이루어질 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 용액, 예컨대 이에 한정하는 것은 아니지만, 수용액 중에 존재할 수 있다. 단리된 물질은 추가의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 성분일 수 있다. 보통, 순도 및 균질도는 분석 화학 기법, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 그 유전자에 측접하여 해당 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상인 것을 의미한다.

"핵산"이라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 달리 한정하지 않는다면, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사 작용을 하는 공지된 천연 뉴클레오타이드의 유사체를 함유하는 핵산을 망라한다. 특별히 달리 한정하지 않는다면, 이 용어는 PNA (펩티도핵산)를 비롯한 올리고뉴클레오타이드 유사체, 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)도 지칭한다. 달리 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 보존적으로 변형된 그의 변이체 (축퇴성 코돈 치환을 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지정된 서열도 내포하여 망라한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al ., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)]; [Ohtsuka et al ., J. Biol . Chem . 260: 2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al ., Mol . Cell . Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).

"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하는 것으로 본 명세서에서 호환되어 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 대한 설명은 펩타이드에 관한 설명 및 단백질에 관한 설명에 대해서도 동일하게 적용되고, 이와 반대의 경우도 성립한다. 이 용어들은 천연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 명세서에 사용된 용어들은 아미노산 잔기들이 공유 펩타이드 결합에 의해 결합되어 있는 전장 단백질을 비롯하여 임의의 길이로 된 아미노산 사슬을 망라한다.

"아미노산"이라는 용어는 천연 발생 및 비천연 발생 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 그리고 피롤리신과 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실기, 아미노기와 R기, 예컨대 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 가지는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르루신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산이라고 언급하는 경우로는, 예를 들어 천연 발생 단백질 생성과 관련된 L-아미노산, D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체와 그 유도체, 천연 발생 단백질 생성과 관련이 없는 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등과, 아미노산의 특정으로 당업계에게 알려진 성질을 보유하는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비천연 발생 아미노산의 예로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, α-메틸 아미노산(예컨대, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(예컨대, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘), 측쇄에 추가의 메틸렌을 가지는 아미노산("호모" 아미노산) 및 측쇄의 카복실산 작용기가 설폰산기로 치환된 아미노산(시스테산)을 포함한다. 합성 비천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 비롯한 비천연 아미노산을 본 발명의 단백질 내로 도입하는 것은 여러 가지로 유리할 수 있다. D-아미노산을 함유하는 펩타이드 등은 L-아미노산을 함유하는 그의 대응물에 비하여 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 도입하는 펩타이드의 구축 작업 등은 세포 내에서 더 큰 안정성이 바람직하거나 요구되는 경우에 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, D-펩타이드 등은 내인성 펩티다아제 및 프로테아제에 대해 내성이 있어, 이러한 특성이 바람직한 경우에 있어서 분자의 향상된 생체 내 이용률과 생체 내 연장된 수명을 제공한다. 추가로, D-펩타이드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 주조직 적합성 복합체 클래스 II로 제한된 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없기 때문에, 전체 유기체 내에서 체액성 면역 반응을 유도하는 경향이 덜하다.

본 명세서에 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회 (Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장된 것으로 흔하게 알려진 세 글자 기호 또는 한 글자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드도 통상적으로 허용되는 한 글자의 암호에 의해 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양자 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 또는 근본적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 근본적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변화시키지 않고 기술된 임의의 대응 코돈으로 변화될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "잠재성 변이 (silent variation)"이다. 본 명세서에서 폴리펩타이드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산에 있어서 가능한 모든 잠재성 변이를 기술하고 있다. 당업자라면 핵산의 각 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 통상 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 잠재성 변이는 각각의 기술되는 서열에 내재하고 있는 것이다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자라면 코딩된 서열 내에 단일 아미노산 또는 소량 퍼센트의 아미노산을 변화시키거나, 첨가하거나 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대하여 이렇게 개별적으로 치환, 결실 또는 첨가하는 것이 결국 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 화학적 유사 아미노산을 이용한 아미노산의 첨가를 가져오는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체로서는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 이외에도 존재하며, 이러한 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지는 않는다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업자에게 공지되어 있다. 하기의 8개 군은 각각 서로 보존적 치환물인 아미노산을 함유한다.

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련한 내용에서 "동일한" 또는 % "동일성"이라는 용어는 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 대상 서열들을 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당업자가 이용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정하여, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 관련성을 비교하여 정렬할 때, 서열들이 동일한 (즉, 특정 영역에 대하여 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 %를 갖는 경우, 그 서열들은 "실질적으로 동일하다"고 말한다. 또한, 이 정의는 시험 서열의 보체를 지칭하기도 한다. 동일성은 길이가 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역, 또는 길이가 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않은 경우에는, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종의 동족체를 비롯한 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 엄격한 하이브리드 조건 하에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 라이브러리를 스크리닝하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전장 cDNA와 유전체 클론을 단리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 수득될 수 있다. 이러한 하이브리드화 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

서열 비교시, 보통 하나의 서열이 기준 서열로서 역할을 하는데, 여기에 시험 서열을 비교하게 된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 부분서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라서는, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용하거나, 또는 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그렇게 되면, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.

본 명세서에 사용된 "비교 창"이라는 용어는 20개 내지 600개, 통상적으로 약 50개 내지 약 200개, 보다 통상적으로는 약 100개 내지 약 150개의 인접 위치 수로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 인접 위치 수를 갖는 한 분절에 대한 기준을 포함하며, 이로부터 서열은 두 개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 인접 위치 수를 갖는 기준 서열과 비교될 수 있는 것이다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv . Appl . Math . 2: 482c]에 기재된 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48: 443]에 기재된 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc . Nat'l. Acad . Sci . USA 85; 2444]에 기재된 유사성 방법 연구, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터 처리 실행 [미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA], 또는 수동 정렬 및 육안 조사 [예를 들어, 문헌 [Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조]에 의해 수행될 수 있다.

% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한 예로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이들은 각각 문헌 [Altschul et al ., (1977) Nuc . Acids Res. 25: 3389-3402] 및 [Altschul et al ., (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 인터넷 주소 www.ncbi.nlm.nih.gov의 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3, 기대값 (E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 10915] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 보통, BLAST 알고리즘은 "단순반복서열을 거르는(low complexity)" 필터를 작동시키지 않고 수행된다.

또한, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성을 측정하는 한 기준은 최소 합계 확률 (P(N))인데, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭 (matching)이 우연으로 발생하는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면, 그 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주한다.

"...에 선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화하다"라는 말은 서열이 복합체 혼합물 (총 세포성 혹은 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중에 존재하는 경우, 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 특정한 뉴클레오타이드 서열에만 분자를 결합시키거나, 이중체를 형성하거나 또는 하이브리드화하는 것을 지칭한다.

"엄격한 하이브리드화 조건"이라는 말은 당업계에 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도 및 고온의 조건 하에서 DNA, RNA, PNA 또는 다른 핵산 모방체 또는 이들의 조합체를 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 보통, 엄격한 조건 하에서, 프로브는 핵산의 복합체 혼합물 (총 세포성 혹은 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중의 그의 표적 부분서열에 하이브리드화하지만, 복합체 혼합물 중의 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다른 환경에서는 상이할 수 있다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대해서는 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]으로부터 전반적인 안내를 받을 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (T_m)보다 약 5-10℃ 낮게끔 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다(표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, T_m에서 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유됨). 엄격한 조건이라는 것은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온 농도, 보통 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브 (10개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (50개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 60℃ 이상인 조건일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성할 수 있다. 선택적 하이브리드화 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 백그라운드 하이브리드화의 2배 이상, 임의로는 10배일 수 있다. 대표적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5X SSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션과 65℃에서 0.2X SSC 및 0.1% SDS 중에서 세척. 이러한 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 이상 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "진핵 생물"이라는 용어는 동물 (포유류, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 섬모충, 식물 (외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등과 같은 진핵생물류 (Eucarya) 계통발생 영역에 속하는 유기체를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "비진핵 생물"이라는 용어는 비진핵 생물 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 비진핵 생물 유기체는 진정세균 [대장균, 써머스 써모필루스(Thermos thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음] 계통발생 영역, 또는 고세균 [메타노코커스 잔나스치(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들어 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로부스 풀지더스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 오로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음] 계통발생 영역에 속할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "피험체"라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭하는 것으로, 일부 실시 양태에서는 포유류, 다른 실시 양태에서는 인간을 지칭한다. 동물이라 하면 애완동물(예컨대, 개, 고양이 등), 가축(예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험용 동물(예컨대, 랫트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료의 대상이 되는 질병, 질환 또는 장애의 증상 중 하나 이상 증상을 어느 정도로 경감시키도록 투여되는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩타이드의 양을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩타이드를 함유하는 조성물은 예방을 위한 치료, 강화를 위한 치료 및/또는 치료를 위한 치료의 목적으로 투여될 수 있다.

"강화(향상)시키다" 또는 "강화(향상)"라는 용어는 원하는 효과의 효능 또는 그 지속시간을 증가시키거나 또는 연장하는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 강화시키는 것과 관련하여, "강화(향상)"이라는 용어는 한 시스템에 대한 다른 치료제의 효능 또는 지속시간을 증가시키거나 또는 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "강화 유효량"이라는 말은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 강화시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 동물에 대해서 사용되는 경우, 이러한 용도로 유효한 양은 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 추이, 이전에 행했던 요법, 동물의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료하는 수의사의 판단에 따라 다를 것이다.

본 명세서에 사용된 "변형된"이라는 용어는 주어진 폴리펩타이드에 행해진 임의의 변화, 예컨대, 폴리펩타이드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 협력 번역(co-translation) 변형물 또는 번역 후 변형물에 대한 변형을 가리킨다. "(변형된)" 형태라는 용어는 여기에 거론되는 폴리펩타이드가 임의로 변형된다는 것, 즉 논의되는 폴리펩타이드가 변형될 수도 있고 또는 변형되지 않을 수도 있다는 것을 의미한다.

"번역 후 변형된"이라는 용어는 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩타이드 사슬에 통합된 후 이러한 아미노산에 발생할 수 있는 임의의 변형을 지칭하는 것이다. 이 용어는 생체 내 협력 번역 변형물, 시험관 내 협력 번역 변형물(예컨대, 세포가 없는 번역 시스템에서와 같은 경우), 생체 내 번역 후 변형물 및 시험관 내 번역 후 변형물을 포함하나, 이들은 예시를 위한 것일 뿐 이들에 한정되지는 않는다.

예방학적 용도에서, bG-CSF 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 특정 질병, 장애 또는 질환에 걸리기 쉽거나 또는 걸릴 위험이 있는 동물에게 투여한다. 이러한 양을 "예방학적 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도에 있어서, 정확한 양도 동물의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 통상적인 실험 (예를 들어, 용량 증가 임상 시험)에 의해서 이러한 예방학적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 숙련자라면 잘 알 수 있다.

"보호된"이라는 용어는 특정한 반응 조건 하에서 화학 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학 반응성 기의 유형에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 화학 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르소피리딜디설피드일 수 있다. 화학 반응성 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다. Nvoc 및 MeNvoc과 같은 광화학변성기(photolabile group)를 비롯한 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본원에 기술된 방법 또는 조성물에 사용될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나 또는 이들과 함께 사용될 수 있다.

이에 제한되는 건 아니지만 예를 들어, 차단기/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다:

다른 보호기들은 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999](본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

치료를 위한 용도에서, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 이미 질병, 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 이러한 질병, 질환 또는 장애의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "치료 유효량"으로 정의되며, 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 추이, 이전에 행했던 요법, 동물의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료하는 수의사의 판단에 따라 좌우되게 된다. 이러한 치료 유효량을 통상적인 실험 (예를 들어, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정하는 것은 당업계의 숙련자라면 잘 알 수 있을 것이다.

"치료(처치)"라는 용어는 예방을 위한 치료 및/또는 치료를 위한 치료를 지칭하는 데 사용된다.

본 명세서에 제시된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩타이드는 하나 이상의 원자가 자연 상에서 흔히 발견되는 원자량 또는 질량수와는 다른 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된 것인 동위원소 표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 포함될 수 있는 동위원소의 예로서는, 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소, 예컨대 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl을 포함한다. 본원에 기술된 특정 동위원소 표지된 화합물, 예를 들어 ³H와 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 포함되는 것들이 약물 및/또는 기질 조적 분포 평가에 있어서 유용할 수 있다. 또한, 중수소, 즉 ²H와 같은 동위원소를 이용한 치환은, 예를 들어 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량 요건과 같이 대사적으로 더 큰 안정성으로 인해 확실한 치료적 장점을 제공할 수 있다.

모든 이성체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 부분입체 이성체, 거울상 이성체 및 이들의 혼합물이 본 명세서에 기술된 조성물의 일부로서 고려된다. 추가의 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩타이드는, 필요시 유기체에 투여하게 되면 이에 대한 물질 대사가 일어나 대사산물을 만들어 내는데, 이는 이후 원하는 치료 효과를 포함하는 목표한 효과를 나타내는데 사용된다. 추가의 실시 양태는 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩타이드의 활성 대사물질이다.

어떤 경우에는, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩타이드는 호변 이성체로서 존재할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩타이드는 용매화되지 않은 형태뿐만 아니라, 물, 에탄올 등과 같이 약학적으로 허용되는 용매와 함께 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 용매화된 형태도 본원에서 개시된 것으로 간주된다. 당업자라면 본 명세서에 기재된 일부 화합물이 수 개의 호면 이성체 형태로 존재할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 이러한 모든 호변 이성체 형태는 본 명세서에 기술된 조성물의 일부로서 간주된다.

달리 언급이 없으면, 당업계의 기법에 속하는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적인 방법이 사용된다.

발명의 상세한 설명

I. 서론

본 발명에서는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 bG-CSF 분자가 제공된다. 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 bG-CSF 폴리펩타이드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 한 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 번역 후 변형은 제2 반응성 기를 포함하는 히드록시알킬 전분(HAS), 히드록시에틸 전분(HES), 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된(photocaged) 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성(photocleavable) 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 비롯한 분자(이들에 한정되지는 않음)를, 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학 방법론을 이용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 부착시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분 (예컨대, 이에 한정하지는 않으나, 비천연 아미노산인 p-프로파르길옥시페닐알라닌 중의 알키닐 부분을 포함하며, 여기서 프로파르길기는 때로는 아세틸렌 부분으로도 지칭됨)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이고, [3 + 2] 시클로 첨가 화학 방법론이 사용된다. 또 다른 예에서는, 제1 반응성 기는 아지도 부분 (비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 중의 아지도 부분을 포함하며 이에 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 bG-CSF 폴리펩타이드의 특정한 실시 양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산 (케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않음)은 하나 이상의 번역 후 변형이 사카라이드 부분을 포함하는 경우에 사용된다. 특정한 실시 양태에서, 번역 후 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포 중에서 생체 내 생성된다. 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 다른 분자는 폴리펩타이드에 분자를 부착시킬 수 있다. 분자는 폴리펩타이드에 직접 결합될 수 있다.

특정한 실시 양태에서, 단백질은 하나의 숙주 세포에 의해 생체 내에서 이루어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 번역 후 변형은 또 다른 종류의 숙주 세포에 의해서는 정상적으로 이루어지지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 단백질은 진핵 세포에 의해 생체 내에서 이루어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 번역 후 변형은 비진핵 세포에 의해서는 정상적으로 이루어지지 않는다. 번역 후 변형의 예로서는 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화 또는 당지질 결합 변형을 위하여 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화 또는 당지질 결합 변형을 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글리코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 글리코실화를 향상시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 서로 다른 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 서로 다른 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 천연적으로 코딩된 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 서로 다른 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 천연적으로 코딩된 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 내의 비천연적으로 코딩된 아미노산 위치에서 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부가 및/또는 치환을 포함한다.

한 실시 양태에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드를 아스파라긴에 부착시키는 단계를 포함한다 (올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등의 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음). 또 다른 실시 양태에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그 (tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 원핵 세포성 분비 신호 서열, 진핵 세포성 분비 신호 서열, 박테리아 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 세포성 분비 신호 서열, 신규한 분비 신호 서열, 펙트산 분해 효소 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열을 포함한다. 분비 신호 서열의 예로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, STII(원핵 세포), Fd GIII와 M13(파지), Bg12(효모) 및 트랜스포존으로부터 유래된 신호 서열 bla를 포함한다. 이러한 서열들은, 예컨대 하나의 신호 서열을 다른 신호 서열로 치환하는 방법, 리더 서열을 다른 리더 서열로 치환하는 방법 등(방법은 이에 한정하지 않음)으로 변형되어 폴리펩타이드에 원하는 결과를 제공할 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 서로 다른 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 서로 다른 부위가 존재할 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 천연적으로 발생된 형태의 단백질로 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상(그러나 전체는 해당 없음)의 특정 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 bG-CSF를 기반으로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 bG-CSF에 도입시킴으로 인해서, 통상적으로 발생하는 20개의 아미노산과 반응하지 않으면서 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산(이에 한정되지는 않음)과의 특이적 화학 반응을 수반하는 콘쥬게이션(접합) 화학의 응용이 가능하다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 수용성 중합체에 결합된다. 본 발명은 PEG 유도체를 이용하여 매우 효율적인 단백질의 선택적인 변형 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 비유전학적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 20개의 천연적으로 도입되는 아미노산 중에서는 나타나지 않는 작용기 또는 치환기를 포함하는 아미노산을 선택적으로 도입(예컨대, 이에 제한하지는 않지만 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질 내로 도입하는 것) 하는 단계 및 차후 적절히 반응성인 PEG 유도체를 이용하여 아미노산을 변형시키는 단계를 수반한다. 일단 아미노산 측쇄가 일단 도입되면, 다음으로 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로서 당업자에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 아미노산 측쇄를 변형할 수 있다. 본 발명에서 수용성 중합체를 단백질에 도입하기 위해 적절한 공지된 화학 방법론들은 매우 다양하게 존재한다. 이러한 방법론으로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 아세틸렌 또는 아지드 유도체(이에 제한되지는 않음) 각각을 이용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응 (예를 들어, 문헌 [Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol.4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109] 및 [Huisgen, R. in 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p.1-176] 참조)을 포함한다.

휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 시클로 첨가 반응을 수반하기 때문에, 매우 높은 선택성으로 단백질을 변형시킬 수 있다. 이러한 반응은 우수한 위치선택성 (regioselectivity) (1,4 > 1,5)의 수성 조건으로 실온에서 촉매량의 Cu (I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tornoe, et al., (2002) J. Org . Chem . 67: 3057-3064], [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599]; 및 WO 03/101972를 참조할 수 있다. [3 + 2] 시클로 첨가를 통해서 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자로서는, 이에 제한되지는 않지만, 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 비롯한 적절한 작용기 또는 치환기를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 아세틸렌기를 갖는 비천연 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함함) 또는 아지도기를 갖는 비천연 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, p-아지도-페닐알라닌)에 첨가될 수 있다.

휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가로부터 유래하는 5원 고리는 환원성 환경에서 일반적으로 가역적이지 않고, 수성 환경에서 가수분해에 대해 장시간 동안 안정하다. 결과적으로, 요구되는 수성 조건에 따라 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용함으로써 여러 가지 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특징을 변형시킬 수 있다. 보다 중요한 사실은, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적 (그리고, 예를 들어, 통상적인 20개의 유전학적으로 코딩된 아미노산 중 그 어느 것과도 반응하지 않음)이기 때문에, 단백질이 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특이적 부위에서 변형될 수 있다는 점이다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 보유하고, 수용성이며 수분에 안정한, PEG 유도체 및 이와 관련된 친수성 중합체의 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응해 단백질 내에 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 대해 매우 특이적이다. 이와 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질 내에 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분과의 커플링에 대해 매우 특이적이다.

보다 구체적으로, 아지드 부분은 이에 제한하지는 않지만, 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이러한 아지드들의 유도체를 포함한다. 알킬과 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬과 아릴 아세틸렌 및 이들 각각의 유도체를 포함한다. 알킬과 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드 특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 보유하는 물질과, 다른 물질, 예컨대 이에 한정하는 것은 아니지만, 히드록시알킬 전분(HAS), 히드록시에틸 전분(HES), 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질과의 접합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과, 이에 대응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체와의 접합체를 포함한다. 예를 들어, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 작용성을 보유하는 비유전학적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단백질 내 한 위치에서 생물학적 활성 분자에 커플링될 수 있다. PEG와 생물학적 활성 분자가 커플링되어 이루어지는 결합은, 이에 제한되지는 않지만, 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 생성물을 포함한다.

PEG가 생체 적합 물질의 표면을 변형시키는 데 사용될 수 있다는 사실은 당업계에 확립되어 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제6,610,281호와 문헌 [Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3(1); 125-136 (2000)]을 참조한다). 또한, 본 발명은 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면과, 상기 표면에 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 결합으로 커플링된 하나 이상의 본 발명의 아지드 함유 또는 아세틸렌 함유 중합체를 포함하는 생체 적합 물질도 포함한다. 또한, 생체 적합 물질 및 다른 물질들도 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들어 카르복실산, 아민, 알콜 또는 티올 부분을 포함하는 결합을 통해서 아지드 활성화 중합체 유도체 또는 아세틸렌 활성화 중합체 유도체에 커플링됨으로써 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남겨 놓을 수 있다.

본 발명은 본원의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접적으로 결합될 수 있다. 다르게는, 아지드 함유 PEG 유도체는 한 말단에서 아지드 부분을 갖는 가교제를 통상적인 활성화 중합체에 부착시킴으로써 결과적으로 생성되는 중합체가 그의 말단에 아지드 부분을 가지도록 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접적으로 결합할 수 있다. 다르게는, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 한 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 가교제를 통상적인 활성화 중합체에 부착시킴으로써 결과적으로 생성되는 중합체가 그의 말단에 아세틸렌 부분을 가지도록 제조될 수 있다.

보다 구체적으로, 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기와 같은 보다 반응성인 부분을 갖는 치환된 중합체를 생성하는 반응을 수행하게 된다. 설포닐산 할라이드, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 결과적으로 생성되는 치환된 중합체는 이후 중합체의 말단의 아지드 부분을 보다 반응성인 부분으로 치환하는 반응을 수행하게 된다. 다르게는, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아지드를 갖는 가교제와 반응을 수행하여, PEG 중합체와 가교제 사이에 공유 결합이 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알콜, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 당업자에게 공지되어 있다.

보다 구체적으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 포함하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기를 분리시키는 반응을 수행하게 된다. 다르게는, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아세틸렌을 갖는 가교제와 반응을 수행하여, PEG 중합체와 가교제 사이에 공유 결합이 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한다. PEG 유도체의 유기 합성과 그의 제조 및 용도와 관련한 할로겐 부분, 활성화 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분도 역시 당업계에 숙련자들에게는 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 변형된 단백질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체와 같은 수용성 중합체에 다른 물질들을 첨가하는 것인 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 아지드 함유 PEG 유도체 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는, 생체적합성, 안정성, 가용성, 및 면역원성 결핍 상태가 중요하며 동시에 종래 당업계에 공지된 것에 비해 PEG 유도체를 단백질에 부착시키는 선택적 방법을 더 많이 제공하는 표면 및 분자의 성질을 변화시키는 데 사용될 수 있다.

II . 소의 GCSF

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 동물의 감염 질환을 완화시키거나 예방하는데 사용될 수 있다. 소 및 인간의 G-CSF의 생물학적 활성뿐 아니라, 이러한 생물학적 활성의 특징을 규명하는 분석법들은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 호중구 수 및 호중구 기능의 평가와 관련된 분석법들도 당업자의 숙련자들에게 공지되어 있다.

III . 본 발명에 사용하기 위한 핵산의 일반적인 재조합 방법

본 발명의 여러 실시 양태에서, 해당 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 재조합 방법을 사용하여 단리되고, 클로닝되어, 변화되는 경우가 많다. 이러한 실시 양태들은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질 발현을 위해서나, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트 또는 bG-CSF 폴리펩타이드 유래의 다른 서열을 생성하는 도중 사용된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 이종성 프로모터에 작동가능하게 결합된다. 숙주 세포에서의 hG-CSF의 단리 및 G-CSF의 생성에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제4,810,643호; 제4,999,291호; 제5,580,755호; 및 제6,716,606호에 기술되어 있으며, 이들 특허문헌은 본원에 참고로 포함된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 모(parent) 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성될 수 있으며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 서열번호 1과 2에 기재된 아미노산 서열을 가지도록 합성될 수 있으며, 그 후 관련 아미노산 잔기(들)의 도입 (즉, 통합 또는 치환) 또는 제거 (즉, 결실 또는 치환)를 유효화하기 위해 뉴클레오타이드 서열을 변화시킨다. 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 방법에 따라 특정 부위 돌연변이 유발법에 의해 알맞게 변형될 수 있다. 다르게는, 뉴클레오타이드 서열은 화학적 합성, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 제조될 수 있으며(여기서 상기 올리고뉴클레오타이드는 원하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기초로 고안됨), 바람직하게는, 재조합 폴리펩타이드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 수개의 작은 올리고뉴클레오타이드는 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되어 조립될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌 [Barany, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . 88: 189-193 (1991)], 미국특허 제6,521,427호를 참조하며, 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 재조합체 유전학 분야의 통상적인 기법을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반적 방법을 개시하고 있는 기본서로는 문헌 [Sambrook et al ., Molecular Cloning , A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)], [Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al ., eds., 1994)]를 포함한다.

분자 생물학 기법을 기술하고 있는 일반적인 서적으로는 문헌 [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)], [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook")] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 문헌들은 돌연변이 유발법, 벡터의 용도, 프로모터에 대해 기술하고 있으며, 비천연 아미노산, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 합성효소 및 이들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드의 생성(이에 한정하지 않음)을 비롯하여 이와 관련된 다양한 다른 관련 주제를 기술하고 있다.

다양한 유형의 돌연변이 유발법이, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드 내에서, 신규한 합성효소 또는 tRNA의 생성, tRNA 분자의 돌연변이 생성, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이 생성, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈 생성, 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입 등의 다양한 목적을 위해 본 발명에서 사용된다. 이들은 이에 제한되지는 않지만, 특정 부위 돌연변이 유발법, 무작위 지점 돌연변이 유발법, 동종성 재조합법, DNA 셔플링 또는 다른 순환성 돌연변이 유발법, 키메라 구축법, 우라실 함유 주형을 이용한 돌연변이 유발법, 특정 올리고뉴클레오타이드 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형된 DNA 돌연변이 유발법, 갭핑된 이중체 DNA를 사용한 돌연변이 유발법, PCT 매개성 돌연변이 유발법 등, 또는 이들을 임의로 조합한 방법을 포함한다. 추가의 적절한 방법으로서는 점 복제실수 복구(point mismatch repair), 복구 결손 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발법, 제한 선택과 제한 정제, 결실 돌연변이 유발법, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 이중 가닥 손상 복구 등을 포함한다. 이에 제한되지는 않지만, 키메라 구축물이 관련되는 돌연변이 유발법도 본 발명에 포함된다. 한 실시 양태에서, 돌연변이 유발은 천연 발생 분자 또는 변형되거나 돌연변이가 나타난 천연 발생 분자의 공지된 정보, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 2차, 3차 또는 4차 구조, 결정 구조 등을 참조하여 행해질 수 있다.

본 명세서에서 제시하는 서적 및 예들은 이러한 절차들을 기술하고 있다. 하기의 간행물 및 거기에 인용된 참조 문헌에서 추가의 정보를 찾을 수 있다: 문헌 [Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis : an overview, Anal Biochem . 254 (2): 157-178 (1997)], [Dale et al., Oligonucleotide - directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol . Biol . 57: 369-374 (1996)], [Smith, In vitro mutagenesis, Ann . Rev . Genet . 19: 423-462 (1985)], [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985)], [Carter, Site - directed mutagenesis, Biochem . J. 237: 1-7 (1986)], [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)], [Kunkel, Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488-492 (1985)], [Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol . 154, 367-382 (1987)], [Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA - binding specificities, Science 242: 240-245 (1988)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis using M13 - derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res . 10: 6487-6500 (1982)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol . 100: 468-500 (1983)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis : a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol . 154: 329-350 (1987)], [Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl . Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)], [Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide - directed mutations at high frequency using phosphorothioate - modified DNA, Nucl . Acids Res . 13: 8765-8787 (1985)], [Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide - directed mutagenesis, Nucl . Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)], [Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate - based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl . Acids Res . 16: 791-802 (1988)], [Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate - containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl . Acids Res . 16: 803-814], [Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed mutation construction, Nucl . Acids Res . 12: 9441-9456 (1984)], [Kramer & Fritz, Oligonucleotide - directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol . 154: 350-367 (1987)], [Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed construction of mutations, Nucl. Acids Res . 16: 7207 (1988)], [Fritz et al., Oligonucleotide - directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl . Acids Res . 16: 6987-6999 (1988)], [Kramer et al., Different base / base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl - directed DNA mismatch - repair system of E. coli, Cell 38: 879-887 (1984)], [Carter, et al., Improved oligonucleotide site - directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res . 13: 4431-4443 (1985)], [Carter, Improved oligotiucleotide - directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol . 154: 382-403 (1987)], [Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl . Acids Res . 14: 5115 (1986)], [Wells et al., Importance of Hydrogen - bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil . Trans. R. Soc . Lond . A 317: 415-423 (1986)], [Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)], [Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α- subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein ( transducin ), Nucl . Acids Res . 14: 6361-6372 (1988)], [Wells et al., Cassette mutagenesis : an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985)], [Grundstrom et al., Oligonucleotide - directed mutagenesis by ' shot - gun ' gene synthesis, Nucl . Acids Res . 13: 3305-3316 (1985)], [Mandecki, Oligonucleotide - directed double -strand break repair in plasmids of Escherichia coli : a method for site - specific mutagenesis, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 83: 7177-7181 (1986)], [Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993)], [Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001)], [W.P.C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)] 및 [I.A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res . 23, 3067-8 (1995)]. 상기한 다양한 방법들에 대한 추가적인 상세한 설명은 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 154]에서도 찾을 수 있으며, 이 문헌은 다양한 돌연변이 생성 방법을 사용할 때 생기는 문제를 해결하는데 유용한 조언들도 기술하고 있다.

예를 들어, 본 발명의 돌연변이 유발법, 예컨대 합성효소 라이브러리의 돌연변이 생성, 또는 tRNA의 변형에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984)]에 기술된 바와 같은 자동 합성기를 이용하여 통상 문헌 [Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981)]에 기술된 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다.

또한, 본 발명은 오르소고날 tRNA/RS 쌍을 통해 비천연 아미노산을 생체 내로 도입하기 위한 진핵 생물 숙주 세포, 비진핵 생물 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 이용하거나, 또는 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 비롯하여(이에 한정되지 않음) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구축물을 사용하여 유전자 조작된다 (형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하며 이에 한정되지 않음). 예를 들어, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 합성효소 및 유도될 단백질을 위한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포 내에서 기능을 하는 유전자 발현 조절 요소들과 작동가능하게 결합된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 네이키드형 폴리뉴클레오타이드 또는 접합된 폴리뉴클레오타이드의 형태일 수 있다. 상기 벡터들은 전기천공법 (문헌 [Fromm et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 혹은 입자의 매트릭스 내, 또는 작은 비드 혹은 입자의 매트릭스 표면의 핵산을 이용하는 작은 입자에 의한 고속 탄두 침투(ballistic penetration) (문헌 [Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조) 등을 포함하는 표준 방법들을 이용하여 세포 및/또는 미생물에 도입된다. 시험관 내 세포 내로 핵산을 이동시키는데 적절한 기법으로서는 리포솜을 이용하는 방법, 미량주사법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체 내 유전자 이동 방법으로서는, 이에 제한하지는 않지만, 바이러스성 (보통 레트로바이러스) 벡터를 이용한 형질감염과 바이러스성 피복 단백질-리포솜 매개성 형질감염 (문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)] 참조)을 포함한다. 어떤 경우에는, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 표적 세포를 표적으로 삼는 제제와 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 리포솜이 사용되는 경우에는, 세포 이물 흡수(엔도사이토시스)와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수 촉진을 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어, 특정 세포 유형의 영양을 위한 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 주기적으로 세포 내 함입을 수행하는 단백질에 대한 항체, 세포 내 국소화를 표적으로 삼아 세포 내 반감기를 향상시키는 단백질이 사용될 수 있다.

유전자 조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터를 활성화하거나 또는 형질전환체를 선택하는 단계와 같은 활동에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 유전자도입 유기체 내로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양 (예를 들어, 후속 핵산 단리)(이에 한정되지 않음)에 대한 다른 유용한 참조 문헌으로서는 문헌 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells , a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York]과 여기에 인용된 참조 문헌 [Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY], [Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell , Tissue and Organ Culture], [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 [Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입시키는 공지된 여러 방법이 이용가능하며, 이들 중 어느 것이라도 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 방법들로서는 DNA를 함유하는 박테리아 원형질체를 수용 세포와 융합시키는 방법, 전기천공법, 발사체 포격 (projectile bombardment) 및 바이러스 벡터를 사용해 감염시키는 방법 (이하에서 추가로 논의됨) 등을 포함한다. 박테리아 세포는 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 플라스미드의 수를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 대수기(log phase)까지 성장하여서 박테리아 내 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 여러 가지 키트들이 시판된다 [예를 들어, 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech)의 이지프렙 (EasyPrep^TM), 플렉시프렙 (FlexiPrep^TM); 스트라타진 (Stratagene)의 스트라타클린 (StrataClean^TM); 및 퀴아겐 (Qiagen)의 퀴아프렙 (QIAprep^TM)을 참고할 수 있음]. 단리되어 정제된 플라스미드는 이후 추가로 조작하여 다른 플라스미드를 생산하거나, 세포를 형질감염시키는 데 사용하거나, 또는 관련 벡터에 도입하여 유기체를 감염시키게 된다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 그리고 특정한 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 독립적인 종결자 서열, 진핵 생물 혹은 원핵 생물 혹은 양자 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 (셔틀 벡터를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 원핵 시스템과 진핵 시스템 양자 모두에 대한 선별 마커를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함할 수 있다. 벡터는 원핵 생물, 진핵 생물 또는 양자 모두에서 복제 및 통합에 적합하다. 문헌 [Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979)], [Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987)], [Schneider, B., et al., Protein Expr . Purif . 6435: 10 (1995)]; [Ausubel, Sambrook, Berger (모두 상기와 동일)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지의 목록은, 예컨대 ATCC에 의해 간행된 문헌 [The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds)]에 제공되어 있다. 또한, 분자 생물학에서 사용하는 시퀀싱, 클로닝 및 다른 측면들에 대한 기본적인 절차와 기초적인 이론적 고려 사항들은 문헌 [Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 임의의 필수 핵산 (및 표준형 또는 비표준형이든 간에 사실상 거의 모두 표지된 핵산)은 다양한 판매처, 예를 들어 미국 텍사스주 미드랜드 소재의 미드랜드 써티파이드 리에이젼트 캄파니 (Midland Certified Reagent Company) (www.mcrc.com), 미국 캘리포니아주 라모나 소재의 더 그레이트 아메리칸 진 캄파니 (The Great American Gene Company) (www.genco.com), 미국 일리노이주 시카고 소재의 익스프레스젠 인코포레이티드 (ExpressGen Inc.) (www.expressgen.com), 미국 캘리포니아주 알라메다 소재의 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드 (Operon Technologies Inc.) 및 이 밖에 다른 판매처들로부터 주문한 맞춤형이거나 표준형일 수 있다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 세포 소기관의 유전자 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은, 이에 한정하지는 않으나, 유니크한 3개의 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예컨대 앰버 코돈 (UAG), 오커 코돈 또는 오팔 코돈 (UGA)(이에 한정되지는 않음)을 비롯한 정지 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 내로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수는, 예를 들어 적어도 일부의 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상(이에 한정되지 않음)과 같이 광범위하다는 사실은 당업자에게 자명하다.

한 실시 양태에서, 본 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 생체 내로 도입시키기 위해 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 정지 코돈, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 UAG를 인지하는 O-tRNA를 생성하고, 원하는 비천연 아미노산을 사용하여 O-RS로 아미노아실화시킨다. 이러한 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인지된다. 해당 폴리펩타이드 소정의 부위에 정지 코돈, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 TAG를 도입시키는데 통상적인 특정 부위 돌연변이 유발법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sayers, J.R., et al., (1988), 5'-3' Exonuclease in a phosphorothioate-based oligonucleotide - directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16: 791-802]을 참조할 수 있다. 상기 O-RS, O-tRNA 및 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이 생체 내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대응해 통합되어 특정한 위치에 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드를 제공하게 된다.

생체 내 비천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주 세포에 큰 변화를 주지 않고 수행될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA (앰버 억제제 tRNA를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 진핵 방출 인자 (eRF를 포함하며 이에 한정되지 않음) (이것은 정지 코돈에 결합하여 리보솜으로부터 성장 펩타이드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 따라 좌우되기 때문에, 상기 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 억제제 tRNA의 발현량을 증가시키는 것 등(이에 한정되지 않음)에 의해 조절될 수 있다.

비천연 아미노산은 희귀 코돈으로도 코딩될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소되는 경우, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993)]을 참조할 수 있다. 이 경우, 상기 합성 tRNA는 대장균 내에서 소수의 종으로 존재하는 천연 발생 tRNAArg와 경쟁한다. 어떤 유기체들은 세글자 코돈 모두를 사용하는 것은 아니다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)의 비지정된 코돈 AGA는 시험관 내 전사/번역 추출물 내의 아미노산 삽입을 위해 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Kowal and Oliver, Nucl . Acid . Res ., 25:4685 (1997)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 성분들이 생체 내에서 이러한 희귀 코돈들을 사용하도록 제조될 수 있다.

또한, 셀렉터 코돈은 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들어, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 염기 코돈(이에 한정되지 않음)을 비롯한 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기 코돈의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다. 5개의 염기 코돈의 예로서는, 이에 한정하지는 않지만, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함한다. 본 발명의 한 특징으로서는 프레임시프트 (frameshift) 억제를 기초로 한 연장된 코돈을 사용한다는 점을 포함한다. 4개 이상의 염기 코돈은 예컨대, 하나 또는 다수의 비천연 아미노산(이에 제한되지 않음)을 동일한 단백질에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발된 O-tRNA(예컨대, 이에 제한되지는 않지만 8-10 nt 이상의 안티코돈 루프를 갖는 특정 프레임시프트 억제자 tRNA를 포함함)의 존재 하에서는, 4개 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로서 판독된다. 다른 실시 양태에서, 안티코돈 루프는 이에 한정되지는 않지만, 4개 이상의 염기 코돈, 5개 이상의 염기 코돈, 또는 6개 이상의 염기 코돈 또는 그 이상의 염기 코돈을 디코딩 (decoding) 할 수 있다. 256 개의 가능한 4-염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포 내에서 코딩될 수 있다. 문헌 [Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244], [Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four - base Codons and Identification of " Shifty " Four -base Codons with a Library Approach in Escherichia coli ., J. Mol . Biol . 307: 755-769]을 참조할 수 있다.

예를 들어, 4-염기 코돈은 시험관 내 생합성 방법을 사용해 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 데 사용되어 왔다. 이것과 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Ma et al., (1993) Biochemistry . 32: 7939] 및 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc . 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는, 2개의 화학적으로 아실화된 프레임시프트 억제자 tRNA와 함께, 시험관 내에서 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 스트렙타비딘에 동시 도입시키는 데 사용되었다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc ., 121: 12194]을 참조할 수 있다. 생체 내 연구에서, 무어 (Moore) 등은 UAGN 코돈 (N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 역량을 조사하여, 4중체 UAGA가 0 또는 -1 골격(frame)에서 거의 디코딩하지 않으면서 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 13% 내지 26%의 효율로 디코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 관련해서는, 문헌 [Moore et al., (2000) J. Mol . Biol ., 298: 195]을 참조할 수 있다. 한 실시 양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 하여 연장된 코돈을 본 발명에서 사용할 수 있는데, 이는 다른 원치 않는 부위에서 착의 통독 (missense readthrough) 및 프레임시프트 억제를 감소시킬 수 있다.

천연 염기 코돈을 사용하지 않는 (또는 드물게 사용하는) 내인성 시스템인 하나의 소정의 시스템에 있어서, 셀렉터 코돈은 3개의 천연 염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 것으로는 3개의 천연 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템 및/또는 3개의 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 비천연 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 더 확장시킨다. 여분의 한 염기쌍은 3중 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 특성으로는 안정하고 선택적인 염기쌍 맞춤, 중합효소에 의해 높은 정확도를 갖는 DNA로의 효율적인 효소적 도입, 그리고 비천연 염기쌍의 신생 합성 후 프라이머 신장의 효과적인 지속성을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 적용할 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 상세한 설명이 기재된 문헌으로서는 예를 들어, 문헌 [Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182]을 포함한다. 또한, 문헌 [Wu, Y., et al., (2002) J. Am . Chem. Soc . 124: 14626-14630]을 참조할 수 있다. 다른 관련 간행물들은 하기에 열거된다.

생체 내 사용에 있어서, 비천연 뉴클레오사이드는 막 투과성이며, 인산화되어 이에 해당하는 3인산염을 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하며 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 종래 베너 (Benner) 및 다른 연구자들은 고전적인 왓슨-크릭의 염기쌍의 경우와는 다른 수소 결합 패턴을 이용하려고 애썼는데, 이들 중 가장 주목할만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 이와 관련해서는 예를 들어, 문헌 [Switzer et al., (1989) J. Am . Chem . Soc ., 111: 8322], [Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33] 및 [Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4: 602]을 참조할 수 있다. 이러한 염기들은 일반적으로 천연 염기와는 다소 쌍맞춤에서 착오가 발생 (mispairing)하여 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨 (Kool) 및 그의 공동연구자들은 염기들 간의 소수성 패킹 (packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 사실을 입증하였다. 이와 관련해서는 문헌 [Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4: 602] 및 [Guckian and Kool, (1998) Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 36, 2825]을 참조할 수 있다. 상기한 요건을 모두 만족하는 비천연 염기쌍을 개발하려는 노력의 일환으로서, 슐츠 (Schultz), 로메스버그 (Romesberg) 및 그들의 공동연구자들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 이를 연구하였다. PICS:PICS 자체 쌍 (self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정하여, 대장균 DNA 중합효소 I (KF)의 클레노우 (Klenow) 단편에 의해 DNA 내로 효과적으로 도입될 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [McMinn et al., (1999) J. Am . Chem . Soc ., 121: 11585-6] 및 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc ., 122: 3274]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자체 쌍은 생물학적 기능에 충분히 효율적이고 선택적으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc . 122: 8803]을 참조할 수 있다. 그러나, 이러한 염기들은 모두 추가의 복제에 대한 사슬 종결자로서 작용한다. 최근에는, PICS 자체 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있도록 하는 DNA 중합효소 돌연변이체가 개발되었다. 또한, 7AI 자체 쌍도 복제될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Tae et al., (2001) J. Am . Chem . Soc ., 123: 7439]을 참조할 수 있다. 또한, 신규한 금속성 염기쌍, Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 이에 대해서는 문헌 [Meggers et al., (2000) J. Am . Chem . Soc ., 122: 10714]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본래 천연 코돈에 직교하기 때문에, 본 발명의 방법은 이러한 특성을 이용해 이들에 대해서 오르소고날 tRNA를 생성할 수 있다.

또한, 우회 번역 (translational bypassing) 시스템을 사용하면 비천연 아미노산을 원하는 폴리펩타이드 내에 도입할 수 있다. 우회 번역 시스템에서, 큰 서열은 유전자로 도입되긴 하지만 단백질로 번역되지 않는다. 여기서 이 서열은 리보솜으로 하여금 그 서열을 건너뛰어서 하류에 삽입된 서열의 번역을 재개하라는 신호로 작용하는 구조를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물 중의 단백질 또는 해당 폴리펩타이드 (또는 이의 일부분)는 핵산에 의하여 코딩된다. 보통, 상기 핵산은 하나 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

해당 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는, 예를 들어 비천연 아미노산의 도입을 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 비롯하여 당업자의 숙련자에게 공지되고 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 해당 단백질에 대한 핵산에 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이를 생성시켜 하나 이상의 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 본 발명은 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 임의의 이러한 변이체(예컨대 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하며 이에 한정되지는 않음)를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 대응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 보유하는 임의의 핵산도 포함한다.

bG-CSF 폴리펩타이드와 같은 해당 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 쉽게 돌연변이 조작하여 폴리펩타이드의 임의의 원하는 위치에 시스테인을 도입할 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 광범위하게 다양한 기타 분자를 해당 단백질에 도입시키는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩타이드의 원하는 위치에 도입시키기에 적절한 방법은 미국특허 제6,608,183호(본원에 참조로 포함됨)에 기술된 방법들 및 표준 돌연변이 유발 기법과 같이 당업계에 공지되어 있다.

IV . 비천연적으로 코딩된 아미노산

본 발명에서 사용하기에 적합한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 매우 광범위하게 다양하다. 비천연적으로 코딩된 아미노산은 임의의 수로 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 유전학적으로 코딩된 20개의 공통 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 사실상 화학적으로 불활성이다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산에서 발견되지 않는 작용기(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들어, 아지도 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 중합체[폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며 이에 한정되지 않음], 또는 다르게는, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩타이드와 반응해서 안정한 접합체를 형성하게 되는데, 이는 아지드 및 알킨 작용기가 선택적으로 반응하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 생성물이 만들어진 결과이다.

α-아미노산의 일반적인 구조는 하기와 같이 표현된다(하기 화학식 I 참조).

[화학식 I]

비천연적으로 코딩된 아미노산은 통상 상기 나열된 화학식을 갖는 임의의 구조인데, 여기서 R 기는 20개의 천연 아미노산에 사용되는 것 이외의 임의의 치환기이며, 이는 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 통상 단지 측쇄의 구조에서만 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다른 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 천연적으로 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산)과 동일한 방식(이들이 천연 발생 폴리펩타이드에서 형성되는 것과 동일한 방식)으로 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과는 구별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들어, R은 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등, 또는 이들의 임의의 조합체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 해당 비천연 발생 아미노산의 다른 종류로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 광활성화 가능한 가교 결합제를 포함하는 아미노산, 스핀 표지화된 아미노산, 형광 아미노산, 금속결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징되고/되거나 광이성질화 가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 예컨대 당 치환된 세린, 탄수화물이 변형된 다른 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 무거운 원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 분절가능하고/하거나 광분절성인 아미노산, 천연 아미노산에 비해 신장된 측쇄(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 약 5개 초과 또는 약 10개를 초과하는 개수의 탄소를 포함하는 장쇄 탄화수소 또는 폴리에테르를 포함함)를 갖는 아미노산, 탄소가 결합된 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 함유하는 아미노산을 포함한다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있으며 수용성 중합체와의 반응에 유용한 대표적인 비천연적으로 코딩된 아미노산으로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 아미노산들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로서는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예로서 아미노산과 사카라이드 간의 천연 발생 N-결합 또는 0-결합이, 자연 상태에서는 흔히 발견되는 것이 아닌 공유 결합, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등의 공유 결합으로 대체되는 아미노산들을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예로서 천연 발생 단백질에서는 통상 발견되는 것이 아닌 사카라이드, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.

본 명세서에 제공된 다수의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐(Novabiochem) [독일 다름슈타트 소재의 이엠디 바이오사이언시즈(EMD Biosciences)의 분사], 또는 펩테크(Peptech) (미국 메사추세츠주 버링톤 소재)에서 시판된다. 시판되지 않은 것들은 본 명세서에 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 유기 합성 기법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)], [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, NewYork)] 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,045,337호와 제7,083,970호를 참조할 수 있다. 또한, 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 이외에, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 이에 한정되지는 않으나 하기 화학식 II 및 화학식 III의 구조와 같이 도시되는 변형된 백본 구조를 포함할 수 있다.

[화학식 II]

[화학식 III]

상기 식 중, Z는 통상 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, X와 Y는 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 보통 S 또는 O를 포함하고, R 및 R'는 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 통상 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해서 상기에서 기술한 R 기에 대한 구성 성분의 동일한 목록뿐만 아니라 수소로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 화학식 II 및 화학식 III으로 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실기에서 치환을 포함한다. 이러한 종류의 비천연 아미노산은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 통상적인 20개의 천연 아미노산에 대응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄(이에 한정되지 않음)를 갖는 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함한다. 또한, α-탄소에서의 치환은 이에 제한되지는 않지만 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예컨대 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함한다. 기타 구조적 대체물로서는 시클릭 아미노산, 예컨대 프롤린 유사체뿐만 아니라 3원, 4원, 6원, 7원, 8원 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예컨대 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

다수의 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들어 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기반으로 하여 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 티로신 유사체는 이에 한정되지는 않지만, 파라 치환된 티로신, 오르소 치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하며, 여기서 상기 치환된 티로신은 이에 한정하지는 않으나 케토기(아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 히드록시아민, 티올기, 카르복시기, 이소프로필기, 메틸기, C₆-C₂₀ 직쇄형 또는 분지쇄형 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기, 니트로기, 알키닐기 등을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 글루타민 유사체로서는, 이에 한정하지는 않으나 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체로서는, 이에 한정하지는 않지만 파라 치환된 페닐알라닌, 오르소 치환된 페닐알라닌 및 메타 치환된 페닐알라닌을 포함하며, 여기서 상기 치환기는 이에 한정되지는 않지만 히드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토기(아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일, 알키닐기 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc-β-세린, L-도파(Dopa), 불소화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조의 예로서는, 예를 들어 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923에 제공되어 있다. 또한, 추가의 메티오닌 유사체들에 대해서는 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24](본원에 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다. 발명의 명칭이 "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides"인 국제특허 PCT/US06/47822(본 발명에 참조로 포함됨)는 방향족 아민 부분, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, p-아미노-페닐알라닌의 환원적 알킬화 및 환원적 아민화를 기술하고 있다.

한 실시 양태에서, 비천연 아미노산 (예를 들어, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 조성물이 제공된다. 또한, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 이에 한정하지는 않으나 단백질 및/또는 세포를 포함하는 다양한 조성물도 제공된다. 한 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르소고날 tRNA를 더 포함한다. 비천연 아미노산은 오르소고날 tRNA에 결합(공유 결합을 포함하며 이에 한정되지 않음)할 수 있는데, 이러한 예로서는 이에 한정하는 것은 아니나, 아미노-아실 결합을 통해 오르소고날 tRNA에 공유 결합하는 예, 오르소고날 tRNA의 말단 리보오스 당의 3' OH 또는 2' OH에 공유 결합하는 예 등을 포함할 수 있다.

비천연 아미노산을 통해 단백질로 통합될 수 있는 화학적 부분은 여러 가지 다양한 단백질의 이점 및 조작 근거를 제공한다. 예를 들어, 케토 작용기의 독특한 반응성은 히드라진 또는 히드록실아민을 함유하는 임의 다수의 시약을 이용하여 단백질을 시험관 내 및 생체 내에서 선택적으로 변형시킬 수 있게 한다. 무거운 원자의 비천연 아미노산은, 예컨대 X선 구조 데이터를 위상 조정하는 데 유용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 사용한 무거운 원자의 부위 특이적 도입은 무거운 원자에 대한 위치를 선택하는 데 있어서 선택성과 유연성을 제공한다. 예를 들어, 광반응성 비천연 아미노산[예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하며 이에 한정되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함함]은 생체 내 및 시험관 내에서 단백질의 효과적인 광가교 결합을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예로서는, 이에 한정하지는 않으나, p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함한다. 상기 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질은 광반응성기를 제공하는 시간 제어(temporal control)의 여기 방식에 의해 원하는 대로 가교 결합시킬 수 있다. 일례로, 비천연 아미노의 메틸기는, 핵자기공명 및 진동 분광학을 포함하며 이에 한정되지 않는 역학을 이용하여, 국소 구조의 프로브로서 동위 원소 표지된, 예컨대 메틸기(이에 한정하지 않음)로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알키닐 또는 아지도 작용기는 분자들의 [3 + 2] 시클로 첨가 반응을 통해 단백질을 선택적으로 변형시킨다.

폴리펩타이드의 아미노 말단에 도입된 비천연 아미노산은 20개의 천연 아미노산에서 사용되는 것 이외의 임의의 치환기인 R기와, α-아미노산 중에 통상적으로 존재하는 NH₂기(화학식 I 참조)와는 다른 제2 반응성기로 이루어질 수 있다. α-아미노산 중에 통상적으로 존재하는 COOH기(화학식 I 참조)와는 다른 제2 반응성기를 갖는 유사한 비천연 아미노산이 카르복실 말단에 도입될 수 있다.

본 발명의 비천연 아미노산은 20개의 천연 아미노산에서는 찾아볼 수 없는 추가적인 특성들을 제공하도록 선택되거나 고안될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 예컨대 그들이 도입되는 단백질의 생물학적 특성들을 변화시키도록 고안되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질 내로 비천연 아미노산을 포함시켜 하기의 특성들을 임의적으로 변화시킬 수 있다: 독성, 생체 편재율, 가용성, 안정성, 예를 들어, 열 안정성, 수분에 대한 안정성, 산화 안정성, 효소적 분해에 대한 내성 등, 정제 및 처리 기능성, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학 및/또는 광화학적 특성, 촉매 활성, 산화환원 전위, 반감기, 다른 분자와의 반응 역량(예를 들어, 공유 또는 비공유적으로 결합하는 능력 등).

비천연 아미노산의 구조 및 합성: 카르보닐기, 유사 카르보닐기, 차폐된 카르보닐기, 보호된 카르보닐기 및 히드록실아민기

일부 실시 양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합된 bG-CSF를 제공한다.

여러 유형의 비천연적으로 코딩된 아미노산들이 옥심 결합을 형성하는데 적합하다. 이러한 것들로서는, 이에 한정되지는 않지만, 카르보닐기, 디카르보닐기 또는 히드록실아민기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산들은 미국특허공보 제2006/0194256호, 제2006/0217532호 및 제2006/0217289호 그리고 발명의 명칭이 "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides"인 WO 2006/069246(본원에 이 내용 전체가 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산들에 대해서는 미국특허 제7,083,970호 및 미국특허 제7,045,337호(이들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에도 기술되어 있다.

본 발명의 일부 실시 양태는 하나 이상의 위치에서 파라-아세틸페닐알라닌 아미노산으로 치환된 bG-CSF 폴리펩타이드를 이용한다. p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌과 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 대해서는 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)](본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 카르보닐 또는 디카르보닐을 함유하는 다른 아미노산은 당업계의 숙련자들에 의해 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 또한, 본원에 포함되는 비천연 아미노산의 비제한적인 대표적 합성효소는 미국특허 제7,083,970호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)의 도면 4, 24-34 및 36-39에 제시되어 있다.

친전자성 반응기를 갖는 아미노산은 여러 반응 중에서도 친핵성 첨가 반응을 통해 다양한 결합을 허용하여 분자들을 결합시킨다. 이러한 친전자성 반응기로서는 카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함), 유사 카르보닐기(카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)와 유사한 반응성을 가지며, 카르보닐기와 구조적으로 유사함), 차폐된 카르보닐기(카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)로 쉽게 전환될 수 있음) 또는 보호된 카르보닐기(탈보호시 카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)와 유사한 반응성을 가짐)를 포함한다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다.

[화학식 IV]

상기 식 중,

A는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고,

B는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고,

J는

이며,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고,

각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기이거나, 또는 하나 이상의 R"기가 존재하는 경우, 2개의 R"는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있으며,

R₁은 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이고,

R₂는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이며,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, R₃와 R₄ 혹은 2개의 R₃기가 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고,

또는 -A-B-J-R 기들은 함께 하나 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차폐된 카르보닐기, 예컨대 차폐된 디카르보닐기를 포함하는 바이시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며,

또는 -J-R 기는 함께 하나 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차폐된 카르보닐기, 예컨대 차폐된 디카르보닐기를 포함하는 모노시클릭 또는 바이시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하는데;

단, A가 페닐렌이고 R₃이 각각 H인 경우, B가 존재하며; A가 -(CH₂)₄-이고 R₃이 각각 H인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 부재하며 R₃이 각각 H인 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 V]

상기 식 중,

R₂는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드인데,

단, A가 페닐렌인 경우, B가 존재하며; A가 -(CH₂)₄-인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 부재하는 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 VI]

상기 식 중,

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고,

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(0)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다(여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임).

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

여기서, 이러한 화합물들은 아미노 보호, 카르복실 보호될 수 있으며, 이러한 것들의 염일 수 있다. 또한, 하기의 비천연 아미노산들 중 임의의 아미노산이 비천연 아미노산 폴리펩타이드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 VII]

상기 식 중,

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(0)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고(여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임), n은 0 내지 8인데,

단, A가 -(CH₂)₄-인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-는 아니다.

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

여기서, 이러한 화합물들은 아미노 보호, 카르복실 보호, 아미노 및 카르복실 보호될 수 있으며, 이러한 것들의 염일 수 있다. 또한, 이러한 비천연 아미노산들과, 하기의 비천연 아미노산들 중 임의의 아미노산이 비천연 아미노산 폴리펩타이드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식 VIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 VIII]

상기 식 중,

R₂는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.

또한, 하기 화학식 IX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 IX]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

또한, 하기 화학식 X의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 X]

상기 식 중,

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(0)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고(여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임), n은 0 내지 8이다.

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

모노카르보닐 구조 이외에도, 본 명세서에 기술된 비천연 아미노산은 디카르보닐기, 유사 디카르보닐기, 차폐된 디카르보닐기 및 보호된 디카르보닐기와 같은 기들을 포함할 수 있다.

예를 들어, 하기 화학식 XI의 구조를 갖는 하기의 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XI]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XII]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

또한, 하기 화학식 XIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XIII]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다:

또한, 하기 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XIV]

상기 식 중,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며,

X₁은 C, S 또는 S(O)이고, L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이며, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XIV-A의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XIV-A]

상기 식 중,

L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이며, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XIV-B의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XIV-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XV의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XV]

상기 식 중,

X₁은 C, S 또는 S(O)이고, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, CR⁸R⁹기 상의 R⁸과 R⁹는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R⁸과 R⁹는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 R⁸기에 인접한 임의의 기들은 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식 XV-A의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XV-A]

상기 식 중,

n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, CR⁸R⁹기 상의 R⁸과 R⁹는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R⁸과 R⁹는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 R⁸기에 인접한 임의의 기들은 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식 XV-B의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XV-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XVI]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI-A의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XVI-A]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI-B의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XVI-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XVII]

상기 식 중,

M은 -C(R₃)-,

이며,

여기서 (a)는 A기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐기들에 대한 결합을 나타내며, R₃과 R₄는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₃과 R₄ 혹은 2개의 R₃기 혹은 2개의 R₄기는 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며,

T₃은 하나의 결합, C(R)(R), O 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;

또한, 하기 화학식 XVIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XVIII]

상기 식 중,

M은 -C(R₃)-,

이며,

또한, 하기 화학식 XIX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XIX]

상기 식 중,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고,

T₃은 O 또는 S이다.

또한, 하기 화학식 XX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

[화학식 XX]

상기 식 중,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XXI의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다:

일부 실시 양태에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 반응성 카르보닐 또는 디카르보닐 작용기를 만들어 내도록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 콘쥬게이션(접합) 반응에 유용한 알데히드 작용기 특성은 인접하는 아미노 및 히드록실기를 갖는 작용기 특성으로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩타이드인 경우에는, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌(이들은 통상적으로 존재하는 것이거나 화학적 소화 또는 효소적 소화를 통해 노출될 수 있음)은 과요오드를 이용하여 온화한 산화 분절 조건 하에 알데히드 작용기성을 만들어 내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992)], [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994)]를 참조할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 방법들은 펩타이드 또는 단백질의 N-말단의 아미노산에 제한되어 있다.

본 발명에서, 인접하는 히드록실기 및 아미노기를 함유하는 아미노산은 "차폐된" 알데히드 작용기 특성으로서 폴리펩타이드 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 ε-아민에 인접한 히드록실기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건은 통상 온화한 조건 하에서 폴리펩타이드 내의 다른 부위들의 산화를 피하기 위해 몰 초과량으로 메타과요오드산 나트륨을 첨가하는 단계를 수반한다. 산화 반응의 pH는 보통 약 7.0이다. 통상적인 반응은 폴리펩타이드의 완충 용액에 약 1.5 몰 초과량의 메타과요오드산 나트륨을 첨가한 후, 암실에서 약 10분 동안 배양하는 단계를 수반한다. 이와 관련해서는, 예를 들어 미국특허 제6,423,685호를 참조할 수 있다.

카르보닐 또는 디카르보닐 작용기는 수용액 중의 온화한 조건 하에 히드록실아민 함유 시약과 선택적으로 반응하여 생리학적 조건 하에서 안정한 해당 옥심 결합을 형성할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Jencks, W.P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)], [Shao, J. and Tam, J.P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]를 참조할 수 있다. 게다가, 카르보닐 또는 디카르보닐기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄들의 존재 하에서 선택적인 변형이 가능하다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Cornish, V.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996)], [Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Mahal, L.K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.

비천연 아미노산의 구조 및 합성 : 히드록실아민 함유 아미노산

미국 가특허출원 제60/638,418호는 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 따라서, 미국 가특허출원 제60/638,418호의 섹션 V(부제는 "Non-natural Amino Acids"), 파트 B(부제는 "Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids")에 제공된 개시 내용은 그 내용이 마치 본 명세서에도 전부 제시되어 있는 것과 동일한 정도로, 본원에 기술된 방법, 조성물(화학식 I-XXXV 포함), 기법, 그리고 본원에 기술된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩타이드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩타이드의 제조, 정제, 특성화 및 사용 전략에도 전부 적용된다. 미국특허 공보 제2006/0194256호, 제2006/0217532호 및 제2006/0217289호 그리고 발명의 명칭이 "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides"인 WO 2006/069246도 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

본 발명에서 사용하기에 적합한 여러 가지 비천연 아미노산들은 예를 들어, 시그마(미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)에서 시판된다. 시판되지 않는 것들은 본 명세서에 제시된 내용과 같이 합성될 수 있거나, 또는 여러 간행물에 제공된 내용과 같이 합성될 수 있거나, 또는 당업자에게 공지된 표준 방법들을 이용하여 합성될 수 있다. 유기 합성 기법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)], [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)] 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 비천연 아미노산의 합성에 대해 기술하고 있는 추가적인 간행물로서는 예를 들어, 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"인 WO 2002/085923, 문헌 [Matsoukas et al., (1995) J. Med . Chem ., 38, 4660-4669], [King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates, J. Chem. Soc ., 3315-3319], [Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti - Tumor Agents, J. Am . Chem . Soc . 81, 3750-3752], [Craig, J. C. et al., (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7- Chloro -4-[[4-( diethylamino )-1-methylbutyl]amino]quinoline ( Chloroquine ). J. Org . Chem . 53, 1167-1170], [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials,. Eur . J. Med . Chem . 26, 201-5], [Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4- Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org . Chem . 54, 1859-1866], [Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine : Application to the Total Synthesis of (+)- Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem . 50: 1239-1246], [Barton et al., (1987) Synthesis of Novel α- Amino - Acids and Derivatives Using Radical Chemistry : Synthesis of L- and D-α- Amino - Adipic Acids , L-α- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43: 4297-4308] 및 [Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues : synthesis of beta - heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate - sensitized site. J. Med . Chem . 35: 4602-7]을 포함한다. 또한, 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 미국특허 공보 제2004/0198637호(본원에 참조로 포함됨)도 참조할 수 있다.

A. 카르보닐 반응성 기

카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응을 통해, 특히 친핵성 첨가 또는 알돌 축합 반응을 통하여 분자(예컨대, 이에 한정되지는 않지만 PEG 또는 다른 수용성 분자)들을 결합시킨다.

예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며, R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이며, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한다.

p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌과 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 대해서는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기술되어 있다. 카르보닐을 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 유사한 방식으로 제조될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 반응성 카르보닐 작용기를 만들어 내도록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 콘쥬게이션 반응에 유용한 알데히드 작용기 특성은 인접하는 아미노기 및 히드록실기를 갖는 작용기 특성으로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩타이드인 경우에는, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌(이들은 통상적으로 존재하는 것이거나 화학적 소화 또는 효소적 소화를 통해 노출될 수 있음)은 과요오드를 이용하여 온화한 산화 분절 조건 하에 알데히드 작용기 특성을 만들어 내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaertner, et . al ., Bioconjug. Chem . 3: 262-268 (1992)], [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug . Chem . 3: 138-146 (1992)], [Gaertner et al ., J. Biol . Chem. 269: 7224-7230 (1994)]를 참조할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 방법들은 펩타이드 또는 단백질의 N-말단의 아미노산에 한정되어 있다.

본 발명에서, 인접하는 히드록실기 및 아미노기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된" 알데히드 작용기 특성으로서 폴리펩타이드 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 ε-아민에 인접한 히드록실기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건은 통상 온화한 조건 하에서 폴리펩타이드 내의 다른 부위들의 산화를 피하기 위해 몰 초과량으로 메타과요오드산 나트륨을 첨가하는 단계를 수반한다. 산화 반응의 pH는 보통 약 7.0이다. 통상적인 반응은 폴리펩타이드의 완충 용액에 약 1.5 몰 초과량의 메타과요오드산 나트륨을 첨가한 후, 암실에서 약 10분 동안 배양하는 단계를 수반한다. 이와 관련해서는, 예를 들어 미국특허 제6,423,685호를 참조할 수 있다.

카르보닐 작용기는 수용액 중의 온화한 조건 하에 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 히드록실아민 함유 시약 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건 하에서 안정한 해당 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존 결합을 형성할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Jencks, W.P., J. Am . Chem . Soc . 81, 475-481 (1959)], [Shao, J. and Tam, J.P., J. Am . Chem . Soc . 117: 3893-3899 (1995)]를 참조할 수 있다. 게다가, 카르보닐기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄들의 존재 하에서 선택적인 변형이 가능하다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Cornish, V.W., et al., J. Am . Chem . Soc . 118: 8150-8151 (1996)], [Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G., Bioconjug . Chem . 3: 138-146 (1992)], [Mahal, L.K., et al ., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.

B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응성 기

히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드와 같은 친핵성 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (예컨대, 이에 한정되지는 않지만, PEG 또는 다른 수용성 중합체와의) 접합체를 형성하게 한다.

예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다:

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N 또는 S이거나 존재하지 않고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다.

일부 실시 양태에서, n은 4이고, R₁은 존재하지 않으며, X는 N이다. 일부 실시 양태에서, n은 2이고, R₁은 존재하지 않으며, X는 존재하지 않는다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 고리 상의 지방족 기에 대해 파라 자리에 위치한다.

히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 제품 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들어, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 시판되지 않는 다른 아미노산들은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제6,281,211호를 참조할 수 있다.

히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드는 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 여러 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem . Soc . 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 독특한 반응성 때문에, 20개의 공통 아미노산에 존재하는 친핵성 기(세린 또는 트레오닌의 히드록실기, 또는 리신 및 N-말단의 아미노기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 비해 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대하여 보다 현저히 반응하게 된다.

C. 아미노옥시 함유 아미노산

아미노옥시(히드록실아민으로도 불림) 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (예컨대, 이에 한정되지는 않으나, PEG 또는 다른 수용성 중합체와의) 접합체를 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시기의 강화된 친핵성으로 인하여 이들은 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 여러 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am . Chem . Soc. 117: 3893-3899 (1995)], [H. Hang and C. Bertozzi, Acc . Chem . Res . 34: 727-736 (2001)]을 참조할 수 있다. 히드라진기와 반응한 결과로 이에 대응하는 히드라존이 생성되는 한편, 옥심은 일반적으로 아미노옥시기와 카르보닐을 함유하는 기, 예컨대 케톤의 반응으로부터 생성된다.

아미노옥시기를 함유하는 예시적인 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, Y는 =C(O)이거나 존재하지 않으며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, Y는 존재한다. 일부 실시 양태에서, n은 2이고, R₁ 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.

아미노옥시 함유 아미노산은 쉽게 입수가능한 아미노산 전구체(호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [M. Carrasco and R. Brown, J. Org . Chem . 68: 8853-8858 (2003)]을 참조할 수 있다. 특정 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들어 L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원으로부터 단리되었다(문헌 [Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)] 참조). 아미노옥시를 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

D. 아지드 및 알킨 반응성 기

아지드 및 알킨 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 폴리펩타이드 및 다른 생물학적 분자의 선택적인 변형에 있어 매우 유용하다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 그리고 알킨은 통상적인 화학 반응 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 작용기는 양자 모두 천연 발생 폴리펩타이드에서 발견되는 20개의 공통 아미노산의 측쇄(즉, R기)에 대해 불활성이다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩(spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응을 통해 선택적이며 효율적으로 반응하여 해당 트리아졸을 생성하게 된다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Chin J., et al ., Science 301: 964-7 (2003)], [Wang, Q., et al ., J. Am . Chem . Soc . 125, 3192-3193 (2003)], [Chin, J. W., et al ., J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027 (2002)]을 참조할 수 있다.

휘스겐 시클로 첨가 반응은 친핵성 치환이라기보다는 선택적인 시클로 첨가 반응을 수반하기 때문에(예를 들어, 문헌 [Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B.M., 1991), p.1069-1109], [Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p.1-176] 참조), 아지드 및 알킨 함유 측쇄를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입으로 인하여, 결과적으로 생성된 폴리펩타이드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되는 것이다. 아지드 또는 알킨 함유 bG-CSF 폴리펩타이드에 관련된 시클로 첨가 반응은, 수성 조건 하의 실온에서 동일 반응계의 촉매량으로 Cu(II)를 Cu(I)으로 환원시키기 위한 환원제의 존재 하에, Cu(II)(촉매량의 CuSO₄의 형태를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Wang, Q., et al ., J. Am . Chem . Soc . 125, 3192-3193 (2003)], [Tornoe, C. W., et al ., J. Org . Chem . 67: 3057-3064 (2002)], [Rostovtsev, et al ., Angew . Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599 (2002)]을 참조할 수 있다. 대표적인 환원제로서는, 이에 제한되지는 않지만 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe² ⁺, Co² ⁺ 및 인가된 전위를 포함한다.

아지드와 알킨 간에 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응이 바람직한 경우에는, bG-CSF 폴리펩타이드는 알킨 부분을 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 다르게는, 반대의 반응 (즉, 아미노산 상의 아지드 부분 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 부분과의 반응)도 수행할 수 있다.

또한, 아지드 작용기는 아릴 에스테르를 함유하여 아릴 포스핀 부분으로 적절하게 작용기화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 상기 아릴 포스핀기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시키며, 이렇게 해서 생성되는 아민은 이후 근접한 에스테르 결합과 유효하게 반응하여 해당 아미드를 생성시키게 된다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)]을 참조할 수 있다. 아지드를 함유하는 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥산산을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 아릴 아지드(p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.

아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 포함하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 대표적인 R기로서는, 이에 한정되지는 않지만, -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함한다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상이 존재하는 경우의 각 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 한정하는 것은 아니나, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 비롯한 기, 예를 들어 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함한다는 점을 이해할 수 있을 것이다.

또한, 아지드 작용기는 티오에스테르를 함유하며 아릴 포스핀 부분으로 적절히 작용기화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 상기 아릴 포스핀기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시키며, 이렇게 해서 생성되는 아민은 이후 티오에스테르 결합과 유효하게 반응하여 해당 아미드를 생성시키게 된다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 포함하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 1-10이고, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

예시적인 알킨 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치된다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, 프로파르길옥시기는 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치된다(즉, O-프로파르길-티로신). 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R¹ 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이다(즉, 프로파르길글리신).

알킨 함유 아미노산은 시판된다. 예를 들어, 프로파르길글리신은 펩테크(메사추세츠주 버링톤 소재)에서 시판된다. 다르게는, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들어, 문헌 [Deiters, A., et al ., J. Acid . Chem . Soc . 125: 11782-11783 (2003)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌 [Kayser, B., et al ., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 알킨을 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 아지드 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 카르복시 말단 변형기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시 양태에서, n은 0-4이고, R₁ 및 X는 존재하지 않으며, m = 0이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁는 페닐이며, X는 O이고, m은 2이며, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다.

아지드 함유 아미노산은 제품 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들어, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔널 인코포레이티드(Chem-Impex International, Inc.)(미국 일리노이주 우드 대일 소재)로부터 입수할 수 있다. 시판되지 않는 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드기는 이에 한정되지는 않으나 적절한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 치환을 통하거나 또는 적절히 보호된 락톤의 개방을 통하는 방법을 비롯한 당업자에게 공지된 표준 방법들을 사용하여 비교적 쉽게 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조할 수 있다.

E. 아미노티올 반응성 기

β-치환된 아미노티올 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩타이드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 있어서 매우 유용하다. 예를 들어, 문헌 [J. Shao and J. Tam, J. Am . Chem . Soc . 1995, 117 (14) 3893-3899]을 참조할 수 있다. 일부 실시 양태에서, β-치환된 아미노티올 아미노산은 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입된 후, 알데히드 작용기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 탑재물질(payload)을, 티아졸리딘의 형성을 통하여 β-치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드에 커플링시킬 수 있다.

F. 추가의 반응성 기

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입될 수 있는 추가의 반응성 기 및 비천연적으로 코딩된 아미노산(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 파라-아미노-페닐알라닌을 포함함)에 대해서는 하기의 특허 출원 문건들(이들 모두는 그 내용 전체가 본원 명세서에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다: 미국특허 공보 제2006/0194256호, 미국특허 공보 제2006/0217532호, 미국특허 공보 제2006/0217289호, 미국 가특허출원 제60/755,338호, 미국 가특허출원 제60/755,711호, 미국 가특허출원 제60/755,018호, 국제 특허 출원 PCT/US06/49397, WO 2006/069246, 미국 가특허출원 제60/743,041호, 미국 가특허출원 제60/743,040호, 국제 특허 출원 PCT/US06/47822, 미국 가특허출원 제60/882,819호, 미국 가특허출원 제60/882,500호 및 미국 가특허출원 제60/870,594호. 이러한 출원 문건들은 콘쥬게이션(접합)을 위한 PEG 또는 다른 중합체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록실아민(아미노옥시) 기 상에 존재할 수 있는 반응성 기들에 대해 논의하고 있기도 하다.

비천연 아미노산의 세포 흡수

세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키기 위한 경우를 포함하여, 비천연 아미노산을 고안하고 선택하는 경우에 통상적으로 고려되는 문제이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포 투과성이기가 쉽지 않다는 사실을 시사하고 있다. 천연 아미노산은 단백질 기반의 수송 시스템의 결집을 통해 진핵 세포 내로 흡수된다. 여기서 신속한 스크리닝을 수행하여 비천연 아미노산이 존재한다면 어떤 종류의 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 미국특허 공보 제2004/0198637호(본원에 참조로 포함됨) 및 문헌 [Liu, D. R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에 기재된 독성 분석시험에 관한 내용을 참조할 수 있다. 흡수에 대해서는 다양한 분석시험들을 이용하여 쉽게 분석할 수 있다 하더라도, 세포 흡수 경로를 따르는 비천연 아미노산을 고안하는 것에 대한 대안은 생합성 경로를 제공하여 생체 내에서 아미노산을 생성하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

세포에 있어서 아미노산 및 다른 화합물을 생산하는 여러 가지 생합성 경로들은 이미 존재한다. 어떤 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 세포를 비롯하여 자연계에 존재하지 않을 수 있는데, 본 발명은 이러한 방법을 제공하게 된다. 예를 들어, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 새로운 효소를 첨가하거나 또는 이미 존재하는 숙주 세포 경로를 변화시킴으로써 숙주 세포 내에서 선택적으로 만들어 지게 된다. 추가적인 새로운 효소로서는 천연 발생 효소 또는 인공적으로 발현된 효소들을 들 수가 있다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성(발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923에서 실시예로서 제시됨)은 공지된 다른 유기체 효소의 조합체를 첨가하는 단계를 필요로 한다. 이러한 효소들에 대한 유전자는 그 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용한 세포의 형질전환에 의해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자가 세포에서 발현되면, 효소적 경로를 제공하여 원하는 화합물을 합성하게 된다. 첨가될 수 있는 효소 종류의 예들은 하기 실시예에 제공된다. 추가적인 효소 서열은 예를 들어, 진뱅크 (Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 발현된 효소도 동일한 방식으로 세포에 첨가될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 소기관 및 세포의 재원들을 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.

생합성 경로에서 사용하기 위한 신규한 효소를 생산하거나, 또는 현존하는 경로를 진전시키기 위해서 여러 가지 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 멕시겐 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(www.maxygen.com 상에서 이용가능)에 의해 개발된 재조합법을 비롯한 반복적 재조합이 신규한 효소 및 경로를 개발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4): 389-391] 및 [Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly : In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad. Sci . USA ., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 이와 유사하게, 제넨코어(Genencor)(www.genencor.com 상에서 이용가능)에 의해 개발된 디자인패쓰 (DesignPath^TM)는, 이에 한정되지는 않지만 세포 내에서 0-메틸-L-티로신을 생성하기 위해 경로를 조작하는 것을 포함하는 대사 경로 조작을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 기능 유전체학과 분자 진화학 및 분자 고안을 통해 동정된 것들을 비롯한 신규한 유전자들의 조합을 이용하여 숙주 유기체 중에 현존하는 경로를 재구성하게 된다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(www.diversa.com 상에서 이용가능)도 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하는 기법(예컨대, 이에 제한되지는 않지만 새로운 경로를 개척하는 것을 포함함)을 제공한다.

통상적으로, 본 발명의 조작된 생합성 경로로 생산된 비천연 아미노산은 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 재원을 고갈시키는 정도는 아닌 천연 세포의 양으로 생산된다. 이러한 방식으로 생체 내에서 생산되는 통상적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포를 특정 경로에 필요한 효소를 생산하는데 쓰이는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 비천연 아미노산이 생성되면, 생체 내 선별을 이용해 리보솜의 단백질 합성 및 세포 성장 양자 모두를 위한 비천연 아미노산의 생성을 추가로 최적화할 수 있다.

비천연 아미노산을 갖는 폴리펩타이드

비천연 아미노산의 도입은 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니나, 단백질 구조 및/또는 기능에 생기는 변화를 조정하거나, 프로테아제 표적 부위의 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 접근성을 변화시키거나, 부분(기)에 대한 표적화를 수행(예컨대, 단백질 어레이에 대한 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나, 생물학적 활성 분자를 첨가하거나, 중합체를 부착시키거나, 방사성 핵종을 부착시키거나, 혈청 반감기를 조절하거나, 조직 투과성을 조절하거나(예컨대, 종양), 능동 수송을 조절하거나, 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 그 편재를 조절하거나, 면역원성을 조절하거나, 프로테아제 내성을 조절하는 등의 여러 가지 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 강화되거나 또는 심지어는 완전히 새로운 촉매 특성 또는 생물리학적 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 도입하여 하기의 성질들을 변형시킬 수 있다: 독성, 생체 편재율, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 특성 및/또는 광화학적 성질, 촉매 작용 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 다른 분자와 반응할 수 있는 능력, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 공유 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 포함하는 조성물은 예컨대 이에 한정되지는 않지만 신규한 치료제, 진단제, 촉매 작용 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 그리고 이에 한정되지는 않지만 단백질의 구조 및 기능의 연구 등을 비롯한 작업에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본 조성물은 1개 이상, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 갖는 적어도 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 서로 다를 수 있는데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 10 개 이상의 서로 다른 비천연 아미노산들을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 10개 이상의 서로 다른 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상(전체 아미노산들의 경우는 제외)의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환되는 단백질을 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 특정 단백질에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 서로 다를 수 있다(예컨대, 이에 한정되지는 않으나, 상기 단백질은 2개 이상의 서로 다른 유형의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 2가지의 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 특정 단백질에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나, 서로 다르거나, 또는 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산과 하나 이상의 서로 다른 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.

하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 해당 단백질 또는 폴리펩타이드는 본 발명의 특징을 이룬다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 부형제(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함함)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.

진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 해당 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산함으로 인하여, 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드는 일반적으로 번역 후 진핵 세포 변형물을 포함하게 될 것이다. 특정 실시 양태에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산과, 진핵 세포에 의해 생체 내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 상기 번역 후 변형은 원핵 세포에 의해서는 생성되지는 않는다. 예를 들어, 상기 번역 후 변형은, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함한다. 한 측면에서, 상기 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc)를 포함함)를 아스파라긴에 부착시키는 단계를 포함한다. 표 1에 진핵 세포 단백질의 N-결합된 올리고사카라이드의 일부 예들을 나열하였으니 이를 참고할 수 있다(추가적인 잔기들도 존재할 수 있으며, 이들은 나타내지 않았음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함함)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 연관 펩타이드 전구체, 프리프로(prepro)-부갑상선 호르몬, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 프리프로-오피오멜라노코르틴(opiomelanocortin), 프로-오피오멜라코르틴 등을 포함함)의 단백질 가수분해성 처리, 다중 서브유닛 단백질 또는 거대분자 조립체 내로의 조립, 세포 내의 또 다른 부위로(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 세포 소기관, 예컨대 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로, 또는 분비성 경로를 통하는 것을 포함함) 번역시키는 것을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화된 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합체 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 한 장점은 추가의 분자를 첨가하는데 쓰일 수 있는 화학적 부분을 추가로 제공한다는 점이다. 이러한 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포의 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해서 이루어진다. 예를 들어, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 단백질의 선택적 변형에서 현재 사용되는 대부분의 반응들은, 이에 한정되지는 않지만, α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 비롯하여 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 간에 공유 결합이 형성되는 반응을 포함한다. 이러한 경우들에 있어서, 선택성은 단백질 중의 친핵성 잔기의 수와 이에 대한 접근성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서는, 보다 선택적인 다른 반응들, 예를 들어 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 시험관 내 또는 생체 내 반응을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Cornish, et al., (1996) Am . Chem . Soc ., 118: 8150-8151], [Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128], [Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500], [Chin, et al., (2002) J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027], [Chin, et al., (2002) Proc . Natl . Acad . Sci ., 99: 11020-11024], [Wang, et al., (2003) Proc . Natl . Acad . Sci ., 100: 56-61], [Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746] 및 [Chin, et al., (2003) Science, 301: 964-7]을 참조할 수 있다. 이로써 형광단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약으로 된 숙주를 사용하면 사실상 모든 단백질의 선택적인 표지가 가능하다. 또한, 발명의 명칭이 "Glycoprotein synthesis"인 미국특허 출원 제6,927,042호(본원에 참조로 포함됨)도 참조할 수 있다. 또한, 번역 후 변형(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형 포함)은 스타우딩거 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해서도 이루어질 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.

본 발명은 단백질의 선택적 변형에 있어서 매우 효과적인 또 다른 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 셀렉터 코돈에 대한 대응으로 비천연 아미노산의 유전적 도입(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 아지드 또는 알키닐 부분을 함유하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입) 단계를 수반한다. 이러한 아미노산 측쇄는 이후 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 알키닐 또는 아지드 유도체(이에 제한되지는 않음) 각각을 이용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응(예를 들어, 문헌 [Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol.4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109] 및 [Huisgen, R. in 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p.1-176] 참조)을 포함하는 반응에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 친핵성 치환이라기보다는 시클로 첨가를 수반하기 때문에, 단백질은 매우 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이러한 반응은 우수한 위치선택성(regioselectivity)(1,4 > 1,5)의 수성 조건으로 실온에서 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Tornoe, et al., (2002) J. Org . Chem . 67: 3057-3064] 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599]를 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법으로서는 테트라시스테인 모티프를 이용한 비스비소(bisarsenic) 화합물 상에서 리간드 교환을 하는 것이 있다(예를 들어, 문헌 [Griffin, et al., (1998) Science 281: 269-272] 참조).

[3 + 2] 시클로 첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자는 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자로서는, 이에 제한되지는 않지만, 염료, 형광단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴의 유도체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오타이드(들)(DNA, RNA 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등을 포함한다. 이러한 분자들은 각각 알키닐기를 갖는 비천연 아미노산(p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 아지도기를 갖는 비천연 아미노산(p-아지도-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 첨가될 수 있다.

V. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG - CSF 폴리펩타이드의 생체 내 생성

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 천연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 첨가하거나 또는 이로 치환하기 위한 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체 내에서 제조될 수 있다.

천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법들은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. 이러한 방법들은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA와는 독립적으로 기능(따라서, "오르소고날"이라고도 지칭됨)하는 번역 소기관을 생성하는 단계를 수반한다. 통상, 번역 시스템은 오르소고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 통상적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, O-tRNA는 이 시스템 중에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 못하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 상기 시스템 중에서 생산된 단백질에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 삽입함으로써 코딩된 폴리펩타이드 중의 한 위치에 하나의 아미노산을 "치환"시켜 넣게 된다.

특정 합성 아미노산을 폴리펩타이드에 삽입하기 위해서 광범위하게 다양한 오르소고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소들이 당업계에서 사용되어 왔으며, 이들은 일반적으로 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소는 문헌 [Wang, L., et al ., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 100: 56-61 (2003)] 및 [Zhang, Z. et al ., Biochem . 42(22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적인 O-RS 또는 이의 일부분은 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되며, 미국특허 제7,045,337호와 제7,083,970호(본원에 참조로 포함됨)에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용하기 위한 이의 대응 O-tRNA 분자들도 본 명세서에 참고로 포함되는 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 추가의 예들은 WO 2005/007870, WO 2005/007624 및 WO 2005/0191415에 기술되어 있다.

아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 예는 문헌 [Chin, J. W., et al ., J. Am. Chem . Soc . 124: 9026-9027 (2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,083,970호에 개시된 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 14-16 및 29-32와 아미노산 서열인 서열번호 46-48 및 61-64를 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합한 예시적인 O-tRNA 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,083,970호에 개시된 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 1-3을 포함한다. 비천연적으로 코딩된 특정 아미노산에 대해 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 다른 예로서는, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. S. 세레비시아 내에 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산을 모두를 도입시키는 O-RS와 O-tRNA는 문헌 [Chin, J. W., et al ., Science 301: 964-967 (2003)]에 기술되어 있다.

수개의 다른 오르소고날 쌍이 보고된 바 있다. S. 세레비시아 tRNA의 시스템으로부터 유래한 글루타미닐(예를 들어, 문헌 [Liu, D.R., and Schultz, P.G. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 96: 4780-4785] 참조), 아스파르틸(예를 들어, 문헌 [Pastrnak, M., et al., (2000) Helv . Chim . Acta 83: 2277-2286] 참조) 및 티로실(예를 들어, 문헌 [Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem . ( Tokyo , Jpn .) 124: 1065-1068] 및 [Kowal, A.K., et al., (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98: 2268-2273] 참조) 시스템과 합성효소들에 있어서 대장균 내에서의 비천연 아미노산의 도입 가능성에 대하여 기술되어 왔다. 대장균 글루타미닐(예를 들어, 문헌 [Kowal, A.K., et al., (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98: 2268-2273] 참조) 및 티로실(예를 들어, 문헌 [Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol . Cell . Biol . 10: 1633-1641] 참조) 합성효소들은 S. 세레비시아에서 사용하는 것으로 기술되어 왔다. 대장균 티로실 시스템은 포유류 세포에 3-요오드-L-티로신을 생체 내 도입을 위해 사용되어 왔다. 이에 대해서는, 문헌 [Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res . 30: 4692-4699]을 참조할 수 있다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특정 코돈을 선택하는 단계를 수반한다. 어느 코돈이라도 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 드물게 사용되거나 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 코돈으로는, 넌센스 코돈, 예컨대 정지 코돈(앰버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 된 코돈 및 드물게 사용되거나 또는 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3-염기 코돈을 포함한다.

특정 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이 유발법(부위 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 사용하여 bG-CSF 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입될 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 소기관의 구성 요소들, 예컨대 O-RS, O-tRNA 및 오르소고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 제조하는 방법은 문헌 [Wang, L., et al ., Science 292: 498-500 (2001)], [Chin, J.W., et al ., J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027 (2002)], [Zhang, Z. et al ., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 생체 내 도입을 위한 방법 및 이를 위한 조성물은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용하기 위해 오르소고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법도 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. 발명의 명칭이 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins"인 PCT 공보 WO 04/035743(본원에 참조로 포함됨)은 케토 아미노산의 도입을 위한 오르소고날 RS 및 tRNA 쌍에 대해 기술하고 있다. 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공보 WO 04/094593(본원에 참조로 포함됨)은 진핵 숙주 세포 내에 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르소고날 RS 및 tRNA 쌍에 대해 기술하고 있다.

하나 이상의 재조합 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 제1 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코커스 잔나스치(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 대장균, A. 풀지더스(fulgidus), P. 푸리오수스(furiosus), P. 호리코시(horikoshii), A. 페르닉스(pernix), T. 써모필루스(thermophilus) 등과 같은 원핵 생물 유기체 또는 진핵 생물 유기체의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유래한 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에, 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원을 위한 RS(돌연변이체 RS일 수 있음)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하여, 활성인 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체(pool)를 제공하는 단계, 및/또는 (c) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 집합체를 선별(음성 선별을 이용할 수 있음)하여, 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함).

한 실시 양태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS에 돌연변이를 유발시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 비활성 RS는, 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상의 아미노산을 이와는 다른 아미노산(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 알라닌을 포함함)으로 변형으로써 생성될 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 기법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질 3차원 RS 구조에 기초한 합리적 디자인 기법, 또는 무작위 혹은 합리적 디자인 기법에서의 RS 뉴클레오타이드의 돌연변이를 유발하는 것등을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성 생성 재조합 돌연변이, 키메라 구조체, 합리적 디자인 및 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 다른 방법들에 의해 생성될 수 있다.

한 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에, 활성인 구성원, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원을 위한 RS(돌연변이체 RS일 수 있음)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 마커 또는 스크리닝 마커, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제 내성 유전자 등(여기서, 양성 선별 마커 및/또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 앰버, 오커, 또는 오팔 코돈을 포함함)과 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 다수의 세포에 도입시키는 단계; 선별 시약의 존재 하에 상기 다수의 세포를 성장시키는 단계; 및 양성 선별 또는 스크리닝 마커 중 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하는 방법을 이용해 선별 시약 및/또는 스크리닝 시약의 존재 하에서 생존(또는 특이적 반응을 나타내는)하는 세포를 동정함으로써, 활성인 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 포함하는 양성 선별된 세포로 된 하위군을 제공하는 단계. 임의로, 선별 시약 및/또는 스크리닝 시약의 농도를 변화시킬 수 있다.

한 측면에서, 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 중의 앰버 정지 코돈이다. 임의로, 양성 선별 마커는 β-락타마아제 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마아제 유전자 중의 앰버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 세포 표면 마커를 포함함)를 포함한다.

한 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(돌연변이체일 수 있음)에 대한 집합체를 음성적으로 선별하거나 또는 스크리닝하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 또는 스크리닝의 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 사용하여 음성 선별 마커 또는 스크리닝 마커[여기서, 음성 선별 마커 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제 내성 유전자, 예컨대 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 포함함)]를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산과 스크리닝 시약 또는 선별 시약이 보충된 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 보이지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 스크리닝 시약 또는 선별 시약이 보충되지 않은 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 보이지 않는 세포를 동정하여, 생존하는 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계. 예를 들어, CAT 동정 프로토콜은 적절한 O-RS 재조합물의 결정에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 클론의 집합체는 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 함유하거나 또는 함유하지 않는 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)을 포함하는 성장 플레이트 상에서 복제될 수 있다. 따라서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 플레이트에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로 간주된다. 한 측면에서, 선별 시약(및/또는 스크리닝 시약)의 농도는 변화한다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 서로 다르다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 대장균, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생 생물 등을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커를 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS에 대한 집합체를 스크리닝하거나 또는 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 단계 (b)의 활성 돌연변이체 RS의 집합체를 단리시키는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커[여기서, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 독성 마커 유전자, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제(ribonuclease barnase) 유전자를 포함함)]와 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 동정하여, 생존하거나 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS(상기 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적임)를 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 이러한 실시 양태는 임의로 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 경우와, 제1 유기체와 제2 유기체가 서로 다른(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 각 유기체는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 대장균, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생 생물 등을 포함할 수 있음) 경우를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면들로서는 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면들로는, 스크리닝 마커가 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시 양태에서, 상기 스크리닝 및/또는 선별은 스크리닝 및/또는 선별의 엄격성을 변화시키는 경우도 포함할 수 있다.

한 실시 양태에서, 하나 이상의 재조합 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(돌연변이 시킬 수 있음)의 제2 집합체를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 능력을 포함하는 변형 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (d)-(f)는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 약 2회 이상 반복할 수 있다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 변형된 O-RS의 제2 집합체는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 무작위 돌연변이 유발법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 재조합법 또는 이들을 조합한 방법에 의해 생성될 수 있다.

상기에서 기술한 방법들에 있어서, 선별/스크리닝 단계들, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b)와 (c) 양자 단계의 엄격성은 선택/스크리닝의 엄격성의 변화도 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b)와 (c) 양자 모두는 리포터를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 리포터는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 리포터는 세포 표면, 파지 디스플레이 등에서 발현되고, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체와 관련된 친화성 또는 촉매 활성을 기초로 선택된다. 한 실시 양태에서, 돌연변이화된 합성효소는 세포 표면, 파지 디스플레이 등에서 발현된다.

재조합 오르소고날 tRNA (O-tRNA)를 생산하는 방법은 (a) 하나 이상의 tRNA, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 제1 유기체의 억제제 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체의 RS 부재 하에, 제2 유기체의 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하여 tRNA(돌연변이체일 수 있음)의 집합체를 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르소고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(돌연변이체일 수 있음)의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA(여기서, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체의 RS에 의해서는 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 tRNA는 억제제 tRNA이고/이거나, 천연 및/또는 비천연 염기로 된 독특한 3-염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 혹은 오팔 정지 코돈이다. 한 실시 양태에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 직교성을 보유한다. 일부 실시 양태에서, O-tRNA는 변형될 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 도입될 수 있다는 사실이 명확이 이해될 것이다. 다양한 실시 양태에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 서로 다르며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 원핵 생물(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 메타노코커스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 대장균, 할로박테리움 등을 포함함), 진핵 생물, 포유류, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등으로부터 선택될 수 있다. 또한, 재조합 tRNA는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화될 수 있으며, 여기서 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체 내에서 생합성된다. 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체를 위한 성장 배지에 첨가될 수 있다.

한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선별하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하는 단계(단계 (b))는, 독성 마커 유전자[여기서, 독성 마커 유전자는 하나 이상의 셀렉터 코돈(혹은 독성 제제 또는 항균제 생산을 유도하는 유전자, 또는 마커 유전자가 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 유기체에 필수적인 유전자)을 포함함] 및 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 라이브러리를 다수의 제2 유기체 세포에 도입시키는 단계; 및 하나 이상의 오르소고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 함유하는 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 포함하는 생존 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생존 세포는 비교 율 세포 밀도 분석시험을 사용함으로써 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시 양태에서, 상기 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 여기서 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 임의로는, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

한 실시 양태에서, 도입된 오르소고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대하여 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝하는 것은 하기의 단계를 포함할 수 있다: 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자[여기서, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들어 하나 이상의 앰버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 제제 해독을 유도하는 유전자를 포함함] 및 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 선택제 또는 스크리닝 제제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제의 존재 하에 성장한 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 동정함으로써, 하나 이상의 재조합 tRNA(여기서, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되어, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 대응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물에 아미노산을 삽입하게 됨)를 보유하는 세포의 집합체를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 선택제 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양하게 할 수 있다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체의 RS 부재 하에 제2 유기체의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝하여, (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 제공하는 단계; (c) 도입된 오르소고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하며, 제2 유기체의 RS에 의해서는 효율적으로 인식되지 않고, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선택하거나 또는 스크리닝하여, 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 제공하는 단계; 및 (f) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS에 대한 집합체를 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(여기서, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 의해 생산된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들어, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은, 이에 제한되지는 않지만, mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예컨대 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한 경우(메타노코커스 잔나스치를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함한다.

또한, 제2 유기체의 생체 내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르소고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법도 본 발명에 포함된다. 상기 방법은 마커 유전자, tRNA 및 제1 유기체로부터 단리되거나 또는 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체의 제1 세포 집합체로 도입시키는 단계, 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체의 복제품 세포 집합체에 도입시키는 단계, 복제품 세포 집합체에서는 생존하지 못하는 제1 집합체 내의 생존 세포를 선택하거나, 또는 복제품 세포 집합체에서는 이러한 반응을 나타내지 못하는 특이적인 스크리닝 반응을 보이는 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 집합체 및 복제품 세포 집합체는 선택제 또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 성장하고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체 내 번역 시스템에서 사용되는 오르소고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 한 실시 양태에서, 비교 및 선택 또는 스크리닝하는 단계는 세포 내 상보성 분석시험을 포함한다. 선택제 또는 스크리닝 제제의 농도는 변화할 수 있다.

본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합체들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 서로 다를 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 유기체는 원핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코커스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, A. 풀지더스, P. 푸리오수스, P. 호리코시, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등을 포함할 수 있다. 다르게는, 이러한 유기체는 진핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 식물(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 복합체 식물, 예컨대 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함함), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 동물(포유류, 곤충, 절지 동물 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 제2 유기체는 원핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코커스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, A. 풀지더스, 할로박테리움, P. 푸리오수스, P. 호리코시, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등일 수 있다. 다르게는, 제2 유기체는 진핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유류 세포 등일 수 있다. 다양한 실시 양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 서로 다르다.

VI . bG - CSF 폴리펩타이드 내의 비천연 발생 아미노산의 위치

본 발명은 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입시키는 것을 고려한다. 하나 이상의 비천연 발생 아미노산은 폴리펩타이드의 활성에 지장을 주지 않는 특정한 위치에 도입될 수 있다. 이는 "보존적" 치환의 수행, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로, 벌키 아미노산의 경우 벌키 아미노산으로, 친수성 아미노산의 경우 친수성 아미노산으로 치환하고/하거나 활성이 요구되지 않는 위치에 비천연 발생 아미노산을 삽입시킴으로써 수행될 수 있다.

다양한 생화학적 및 구조적 접근 방법들을 사용하여, bG-CSF 폴리펩타이드 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고자 하는 부위를 선택할 수 있다. 폴리펩타이드 사슬 중 어느 위치를 선택하는 것이 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키기에 적합한지에 대해서는 당업자에게는 자명한 것이며, 이러한 선택은 합리적인 디자인에 기초할 수 있거나, 또는 임의의 원하는 특정 목적을 가지거나 혹은 이러한 원하는 특정 목적 없이도 무작위 선택에 기초할 수 있다. 원하는 부위의 선택은, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 작용제, 초작용제(super-agonist), 역작용제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 비롯한 임의의 원하는 특성 또는 활성을 갖는 bG-CSF 분자를 생성하기 위한 것이거나, 본래의 분자에 비해 활성 또는 특성에 있어서 변화를 주지 않기 위한 것이거나, 또는 폴리펩타이드의 물리적 또는 화학적 특성, 예컨대 가용성, 응집성 또는 안정성을 조작하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 요구되는 폴리펩타이드 내의 위치는 당업계에 공지된 점 돌연변이 분석법, 알라닌 스캐닝, 포화 돌연변이 유발법 및 생물학적 활성 스크리닝, 또는 동족체 스캐닝 방법을 사용하여 확인될 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드가 변형이 되었는지에 대하여 잔기들을 확인하는 다른 방법로서는, 이에 제한되지는 않지만, 서열 프로파일링, 로타머 라이브러리 선별, 잔기 쌍 전위 및 프로틴 디자인 오토메이션(Protein Design Automation®) 기법을 사용할 수 있다(본원에 참조로 포함되는 미국특허 제6,188,965호; 제6,269,312호; 제6,403,312호; WO 98/47089를 참조). bG-CSF 생물활성에 중요한 잔기들, 약학적 안정성과 관련이 있는 잔기들, 항체 에피토프 또는 수용체 결합 잔기들은 변형될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제5,580,723호; 제5,834,250호; 제6,013,478호; 제6,428,954호 및 제6,451,561호는 표적 물질을 이용하여 폴리펩타이드의 활성에 영향을 주는 활성 도메인을 확인함으로써, bG-CSF와 같은 폴리펩타이드의 구조와 기능에 대해 총체적으로 분석하는 방법을 기술하고 있다. G-CSF 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법 연구에 대해서는 문헌 [Reidhaar-Olson JF et al., Biochemistry (1996) Jul 16: 35(28): 9034-41], [Young DC et al., Protein Sci. (1997) Jun: 6(6): 1228-36] 및 [Layton et al., (1997) JBC 272(47): 29735-29741]에 기술되어 있다. 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 동정된 것 이외의 잔기들은 폴리펩타이드에 얻고자 하는 목적 활성에 따른 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 있어서 우수한 후보 부위일 수 있다. 다르게는, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 역시 폴리펩타이드에 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 있어서 우수한 후보 부위일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩타이드 사슬 상의 각각의 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 간단히 연속 치환하여, 폴리펩타이드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 임의의 폴리펩타이드 내에 비천연 아미노산을 사용한 치환을 위해 그 위치를 선택하는 데 있어서는, 어떠한 수단, 기술 또는 방법이라도 본 발명에 사용하기 적합하다는 사실은 당업자에게는 명백할 것이다.

또한, 결실된 부분을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 이와 유사한 방식으로, 프로테아제 소화 및 단일클론 항체를 사용하여 bG-CSF 수용체의 결합을 담당하는 bG-CSF의 영역을 확인할 수 있다. 문헌 [Layton et al., (2001) JBC 276 (39) 36779-36787]은 hG-CSF와 그 수용체를 이용한 항체 연구를 기술하고 있다. 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 갖지 않을 것으로 보이는 잔기를 제거한 후, 각각의 잔류 위치에서 계획한 치환의 영향을 조사할 수 있다. 모델은 다른 bG-CSF 부류의 구성원들 및 CSF 수용체들의 3차원 결정 구조로부터 만들 수 있다. 프로틴 데이터 뱅크(Protein Data Bank, www.rcsb.org 상에서 이용가능)는 단백질 및 핵산의 거대 분자의 3차원 구조 데이터를 포함하는 중앙 데이터베이스이다. 만일 3차원 구조 데이터가 없을 경우에는, 폴리펩타이드의 2차 구조 및 3차 구조를 조사하여 모델을 구성할 수 있다. hG-CSF의 X-선 결정학 및 NMR 구조에 대해서는 프로틴 데이터 뱅크(PDB ID's: 1CD9, 1PGR, 1RHG, 1GNC)뿐 아니라 미국특허 제5,581,476호 및 제5,790,421호(이들은 본원에 참조로 포함됨)에서 그 내용을 알아볼 수 있다. 따라서, 당업자라면 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 구조를 붕괴시키지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입을 위한 예시적인 잔기는, 가능한 수용체 결합 영역으로부터 제외된 것들일 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있으며, 이웃 잔기와 수소 결합 상호작용을 최소한으로 가지거나 가지지 않을 수 있고, 이웃하는 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있으며, 하나 이상의 상기 노출된 면 상에 존재할 수 있고, 제2 bG-CSF, 또는 다른 분자 또는 이의 단편에 병치된 부위(들)일 수 있으며, 수용체에 결합되거나 혹은 결합되지 않거나, 또는 다른 생물학적 활성 분자에 커플링되거나 혹은 커플링되지 않은 bG-CSF의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해 예측된 바와 같이 매우 유동적이거나 구조적으로 강성한 영역 내에 있을 수 있거나, 또는 완전한 구조의 유동성 또는 강성을 원하는 대로 변화시킴으로써 bG-CSF 자체 혹은 하나 이상의 bG-CSF를 포함하는 이량체 또는 다량체의 형태를 조절할 수 있다.

당업자라면 이러한 bG-CSF의 분석을 통해 단백질의 3차 구조 내에 매립되어 있는 아미노산 잔기들에 대하여 어느 아미노산 잔기가 표면 노출되어 있는지를 결정할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 실시 양태로서, 표면 노출된 잔기인 아미노산으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 대체하는 것도 해당된다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산의 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산의 3, 7, 62, 133, 166번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 62, 133번 잔기 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 62번 위치 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에 도입된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF의 133번 위치 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산)에 도입된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연 아미노산의 치환, 부가 또는 결실을 하나 이상으로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 서열번호 1, 2 또는 다른 bG-CSF 서열에 대하여 N 말단 또는 C 말단인 리더 서열 또는 신호 서열 내로 도입된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 1)에 도입되며, 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등을 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 2)에 도입되며, 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등을 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 서열번호 1의 133번 위치 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 위치에 도입되는 아미노산은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등 이외의 아미노산이다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 리보솜에 의해 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 1)에 도입되며, 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등을 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 리보솜에 의해 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 2)에 도입되며, 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등을 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 서열번호 1의 133번 위치 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 위치에 리보솜에 의해 도입되는 아미노산은 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 페닐알라닌, 루신, 트립토판, 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 발린, 글리신, 세린, 글루타민, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 또는 단백질을 생성하지 않는 천연 발생 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등 이외의 아미노산이다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 1)에 도입되는데, 여기서 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 내인성 RS에 의해 인식되지 않는 작용기(들)을 가진다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 중의 하나 이상의 위치(서열번호 2)에 도입되는데, 여기서 상기 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 내인성 RS에 의해 인식되지 않는 작용기(들)을 가진다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 서열번호 133번 위치 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 위치에 도입되는 아미노산을 가지는데, 여기서 상기 아미노산은 내인성 RS에 의해 인식되지 않는 작용기(들)을 가진다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 서열번호 133번 위치 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 위치에 도입되는 파라-아세틸페닐알라닌을 가진다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 서열번호 133번 위치 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 위치에 도입되는 파라-아미노페닐알라닌을 가진다.

일부 실시 양태에서, 하기 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치에서의 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체와 결합된다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산).

bG-CSF 또는 bG-CSF 부류 구성원의 결정 구조 및 bG-CSF 수용체와의 상호작용을 조사해보면 어떤 특정 아미노산이 용매에 대해 완전하게 또는 부분적으로 이용가능한 측쇄를 가지고 있는지를 알 수 있다. 이러한 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄는 단백질 표면에서부터 용매로 향할 수 있다.

광범위하게 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 bG-CSF 폴리펩타이드 내에서 정해진 위치를 치환하거나 또는 이러한 위치로 도입될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드에 도입하기 위한 비천연적으로 코딩된 특정 아미노산은, bG-CSF 폴리펩타이드 혹은 다른 bG-CSF 부류 구성원의 그 수용체와의 3차원 결정 구조, 보존적 치환에 대한 선호도(즉, Phe, Tyr 또는 Trp을 아릴을 기반으로 한 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 그리고 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입시키고자 하는 특이적 콘쥬게이션 화학론(예를 들어, 알킨 부분을 보유하는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가를 실시하고자 하는 경우, 또는 아릴 에스테르를 보유하여 결과적으로 포스핀 부분을 도입하게 되는 수용성 중합체를 사용한 아미드 결합 형성을 실시하고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)에 대해 조사한 사항을 기반으로 선택된다.

한 실시 양태에서, 본 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 단계; 및 이러한 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자[예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록시알킬 전분(HAS), 히드록시에틸 전분(HES), 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 포함함]와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 [3 + 2] 시클로 첨가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 부착시킨다. 한 실시 양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응성 기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분(예컨대, 이에 한정하지는 않으나, 비천연 아미노산인 p-프로파르길옥시페닐알라닌 중의 알키닐 부분을 포함함)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 중의 아지도 부분을 포함함)이며, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다.

일부의 경우에 있어서는, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 bG-CSF 폴리펩타이드 내에서의 다른 부가, 치환 또는 결실과 병용하여 bG-CSF 폴리펩타이드의 다른 생물학적 특질에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 일부 경우에서는, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 bG-CSF 폴리펩타이드의 안정성(단백질 분해성 분해에 대한 내성을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 증가시키거나 또는 bG-CSF 폴리펩타이드의 그 수용체에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 bG-CSF 폴리펩타이드의 약학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 bG-CSF 폴리펩타이드의 가용성(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 부가, 치환 또는 결실은 대장균 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩타이드 가용성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대장균 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩타이드의 가용성 증대를 유도하는 비천연 아미노산의 도입을 위한 또 다른 부위 이외에도, 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 치환하는 부위도 선택된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 수용체, 결합 단백질 또는 관련 리간드에 대한 친화도를 조절하거나, 수용체에 결합한 후 신호 전달을 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체 이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시키는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 bG-CSF 변이체의 그 수용체와의 친화도를 증가시키는 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 이와 유사하게, bG-CSF 폴리펩타이드는 화학적 또는 효소 분절 서열, 프로테아제 분절 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성을 기반으로 한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩타이드의 검출(GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 프로드러그 방출 또는 활성화, bG-CSF 크기 감소, 또는 폴리펩타이드의 다른 특질을 개선시키는 결합 분자(비오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 bG-CSF 길항제를 생성한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용체 결합과 관련된 영역에서 치환되거나 추가된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 길항제는 bG-CSF가 길항제로서 작용하도록 유도하는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 길항제는 bG-CSF 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 상기 치환은 bG-CSF 길항제를 생성한다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 길항제는 bG-CSF 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 천연 발생 아미노산에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, bG-CSF 내의 하나 이상의 잔기는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부의 경우에는, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 저분자량인 하나 이상의 선형 또는 분지형 PEG에 결합되어, 고분자량의 단일 PEG에 부착된 화학종에 비하여 결합 친화도를 향상시키고 그에 상당하는 혈청 반감기를 가지도록 해준다.

일부 실시 양태에서, 하기의 bG-CSF 잔기들 중 2개까지의 잔기가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다.

VII . 비진핵 생물 및 진핵 생물에서의 발현

클로닝된 bG-CSF 폴리뉴클레오타이드의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서는, 통상 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를, 전사를 지시하는 강성 프로모터, 전사/번역 종결자, 그리고 (단백질을 코딩하는 핵산의 경우라면) 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적절한 박테리아 프로모터는 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.]에 기재되어 있다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 대장균, 바실러스 균속(Bacillus sp .), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 살모넬라(Salmonella)에서 이용가능하다(문헌 [Palva et al ., Gene 22: 229-235 (1983)], [Mosbach et al ., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 시판된다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 역시 시판된다. 오르소고날 tRNA와 아미노아실 tRNA 합성효소(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르소고날 성분을 이용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포로서는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아[B. 브레비스(B. brevis), B. 서브틸리스(B. subtilis) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하며 이에 한정되지 않음] 및 그람-음성 박테리아(대장균, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다)뿐만 아니라 효모와 다른 진핵 세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 유용한 양으로 많이 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 100 ㎎ 이상, 1 g 이상 또는 그 이상의 단백질(비천연 아미노산을 포함하는 단백질)을 포함할 수 있거나, 또는 생체 내 단백질 생산 방법(재조합 단백질 생산 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공됨)을 사용하여 얻어질 수 있는 양을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 단백질은 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액 또는 다른 액체 현탁액(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 1 nl 내지 약 100 L 범위 중 임의의 수치를 포함하는 부피) 중에서, 1 리터당 10 ㎍ 이상의 단백질, 50 ㎍ 이상의 단백질, 75 ㎍ 이상의 단백질, 100 ㎍ 이상의 단백질, 200 ㎍ 이상의 단백질, 250 ㎍ 이상의 단백질, 500 ㎍ 이상의 단백질, 1 ㎎ 이상의 단백질 또는 10 ㎎ 이상 또는 그 이상의 단백질 농도로 조성물 내에 존재할 수 있다. 진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량(예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, 통상 시험관 내 번역을 포함하는 다른 방법을 사용하여 가능한 것보다 더욱 양이 많음) 생산하는 것은 본 발명의 한 특징이다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 유용한 양으로 많이 포함하는 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충액 등 중에서, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, 10 ㎍/ℓ 이상, 50 ㎍/ℓ 이상, 75 ㎍/ℓ 이상, 100 ㎍/ℓ 이상, 200 ㎍/ℓ 이상, 250 ㎍/ℓ 이상, 또는 500 ㎍/ℓ 이상, 1 mg/ℓ 이상, 2 mg/ℓ 이상, 3 mg/ℓ 이상, 4 mg/ℓ 이상, 5 mg/ℓ 이상, 6 mg/ℓ 이상, 7 mg/ℓ 이상, 8 mg/ℓ 이상, 9 mg/ℓ 이상, 10 mg/ℓ 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ℓ 이상, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 이상 또는 그 이상의 단백질 농도로 생산될 수 있다.

bG-CSF의 발현에 적합한 다수의 벡터들은 시판되고 있다. 유용한 진핵 세포 숙주용 발현 벡터로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 이러한 벡터로서는 pCDNA3.1(+)＼Hyg(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 및 pCI-neo(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야 소재)를 포함한다. 박테리아 플라스미드, 예컨대 pBR322, pET3a 및 pET12a를 비롯한 대장균의 플라스미드, RP4와 같은 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 파지 DNA, 예를 들어, 파지 λ의 다양한 유도체, 예를 들어 NM989, 그리고 M13과 같은 다른 DNA 파지와 섬사상 단일 가닥 DNA 파지가 사용될 수 있다. 2μ 플라스미드와 이의 유도체, POT1 벡터(본원에 참조로 포함되는 미국특허 제4,931,373호 참조), 문헌 [Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202-207, 1996]에 기술된 pJSO37 벡터 및 pPICZ A, B 또는 C(인비트로겐)가 효모 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 곤충 세포에 있어서, 벡터는 이에 제한되지는 않지만, pVL941, pBG311(문헌 [Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp.685-698 (1986) 참조], pBluebac 4.5 및 pMelbac(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 포함한다.

bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단일 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드는 폴리펩타이드가 그것이 발현되는 세포로부터 방출되는 경우에 존재한다. 이러한 신호 펩타이드는 임의의 서열일 수 있다. 신호 펩타이드는 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있다. 문헌 [Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104]은 포유류 세포에서 사용되는 신호 펩타이드에 대해 기술하고 있다(쥐과의 Ig κ 경쇄 신호 펩타이드). 다른 신호 펩타이드로서는, 이에 제한되지는 않으나, S. 세레비시아의 α-인자 신호 펩타이드(본원에 참조로 포함되는 미국특허 제4,870,008호 참조), 마우스 타액 아밀라아제의 신호 펩타이드(문헌 [O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp.643-646] 참조), 변형된 카르복시펩티다아제 신호 펩타이드(문헌 [L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897] 참조), 효모 BAR1 신호 펩타이드(본원에 참조로 포함되는 WO 87/02670) 및 효모 아스파르트산 프로테아제 3(YAP3) 신호 펩타이드(문헌 [M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137] 비교)를 포함한다.

적절한 포유류 숙주 세포의 예들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, CHO-K1; ATCC CCL-61), 사바나 원숭이 세포(COS)(예를 들어, COS 1(ATCC CRL-1650), COS 7(ATCC CRL-1651)), 마우스 세포(예를 들어, NS/O), 어린 햄스터 신장(BHK) 세포주(예를 들어 ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-IO) 및 인간 세포(예를 들어 HEK 293(ATCC CRL-1573))뿐만 아니라, 조직 배양 중의 식물 세포일 수 있다. 이러한 세포주 및 기타 세포들은 미국 메릴랜드주 락빌에 소재한 미국 미생물 보존센터(ATCC)와 같은 국립 보관소에서 이용가능하게 되어 있다. bG-CSF 폴리펩타이드의 향상된 글리코실화를 제공하기 위해, 포유류 숙주 세포는 예컨대, 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제5,047,335호에 기술된 바와 같은 시알릴트랜스퍼라아제, 예를 들어 1,6-시알릴트랜스퍼라아제를 발현하도록 변형될 수 있다.

포유류 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 인산칼슘 매개성 형질감염, 전기천공법, DEAE-덱스트란 매개성 형질감염, 리포솜 매개성 형질감염, 바이러스 벡터 및 형질 감염법[Lipofectamin 2000을 이용하는 라이프 테크놀로지스 리미티드(Life Technologies Ltd, 영국 페이즐리 소재)에 의해 기술된 형질 감염법, FuGENE 6을 이용하는 로슈 다이어그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation, 미국 인디애나폴리스 소재)에 의해 기술된 형질 감염법]을 포함한다. 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌 [Ausbel et al., (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA]에 기술되어 있다. 포유류 세포의 배양은, 예를 들어 문헌 [Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA] 및 [Harrison Mass. and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997]에 개시된 바와 같이 확립된 방법에 따라 수행될 수 있다.

I. 발현 시스템, 배양 및 단리

bG-CSF 폴리펩타이드는 임의 다수의 적절한 발현 시스템, 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포 및 박테리아에서 발현될 수 있다. 대표적인 발현 시스템에 대해서 하기에 설명한다.

효모 본 명세서에 사용된 "효모"라는 용어는 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 이에 제한되지는 않지만, 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함한다. 상기 자낭포자형성 효모는 2개의 과(family), 스퍼모프토라세에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세에(Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4개의 아과, 스키조사카로마이코이데에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데에(Nadsonioideae), 리포마이코이데에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에(Saccharomycoideae)(예를 들어, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 상기 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

본 발명에서 사용하는데 있어서 특히 중요한 것으로는, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스 (Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종으로서, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, P. 파스토리스(P. pastoris), P. 귈러리몬디(P. guillerimondii), S. 세레비시에(S. cerevisiae), S. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), S. 더글라시(S. douglasii), S. 클루이베리(S. kluyveri), S. 노르벤시스(S. norbensis), S. 오비포르미스(S. oviformis), K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis), C. 알비칸스(C. albicans), C. 말토사(C. maltosa) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 들 수 있다.

bG-CSF 폴리펩타이드의 발현을 위한 적합한 효모의 선택은 당업계의 숙련자라면 누구나 할 수 있다. 발현용 효모 숙주의 선택에 있어서, 적절한 숙주는 예를 들어, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질 분해 활성, 우수한 가용성 단백질 생산성 및 전체적인 강인성을 보유하는 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다. 효모는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 미국 캘리포니아 대학(University of California)(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics)의 효모 유전자 저장 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다.

"효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 효모를 망라한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 본래의 효모 숙주 세포의 후대의 자손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 존재와 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손이 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다.

다양한 효모 숙주로의 형질 전환을 위하여 염색체 외 레플리콘(extrachromosomal replicon) 또는 통합 벡터를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환 벡터들이 개발되었다. 예를 들어, S. 세레비시에(문헌 [Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19], [Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163], [Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75: 1929] 참조), C. 알비칸스(문헌 [Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조), C. 말토사(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조), H. 폴리모르파(문헌 [Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459], [Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202: 302] 참조)], K. 프라길리스(문헌 [Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조), K. 락티스(문헌 [De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737], [Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY(NY) (1990) 8: 135] 참조), P. 귈러리몬디(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조), P. 파스토리스 (미국특허 제 5,324,639호, 제 4,929,555호 및 제 4,837,148호, 문헌 [Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조), 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌 [Beach et al., NATURE (1982) 300: 706] 참조), Y. 리폴리티카(lipolytica), A. 니둘란스(nidulans)(문헌 [Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89], [Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221] 및 [Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81: 1470-74] 참조); A. 나이거(A. niger)(문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479] 참조); T. 레시아(T. reesia)(EP 0 244 234 참조); 그리고 섬사상 진균류, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357 참조)(상기 각각의 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)에 대하여 발현 벡터들이 개발되었다.

효모 벡터에 대한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 알콜 디히드로게나제(ADH)(EP 0 284 044 참조); 에놀라아제; 글루코키나아제; 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-디히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나아제; 포스포프럭토키나아제; 3-포스포글리세레이트 뮤타아제; 및 피루베이트 키나아제(PyK)(EP 0 329 203 참조)와 같은 유전자의 프로모터 영역을 포함한다. 또한, 산 포스파타아제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌 [Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80: 1] 참조). 기타 효모 숙주와 함께 적절히 사용될 수 있는 프로모터 서열로서는, 3-포스포글리세레이트 키나아제(문헌 [Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 2073] 참조) 및 다른 해당 효소, 예컨대 피루베이트 디카르복실라아제, 트리오스포스페이트 아이소머라제 및 포스포글루코스 아이소머라제(문헌 [Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900], [Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7: 149] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 장점을 갖는 유도성 효모 프로모터로서는, 알콜 디히드로게나제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타아제; 메탈로티오네인(metallothionein); 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제; 질소 대사와 관련이 있는 분해성 효소; 및 말토스와 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.

효모 인핸서(enhancer)도 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류부 활성화 서열(UAS)은 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합하여 합성된 혼성 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 혼성 프로모터의 예로서는 GAP 전사 활성화 영역에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제 4,880,734호 및 제 4,876,197호를 참조할 수 있다. 혼성 프로모터의 다른 예로서는 해당 효소 유전자의 전사 활성화 영역, 예컨대 GAP 또는 PyK와 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. 이에 대해서는 EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 게다가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하여 전사를 개시할 수 있는 능력을 가진, 효모가 아닌 것으로부터 유래한 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라아제 유전자의 종결자를 포함한다(문헌 [Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2μ 플라스미드 기원의 복제 원점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 이에 대해서는, 문헌 [Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157], [Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 대한 선별 마커를 제공한다. 이와 유사하게, Leu2가 결핍된 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.

외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 통상적으로 스페로플라스트(spheroplast)의 형질 전환법 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질 전환법을 포함한다. 예를 들어, 효모의 형질 전환은 문헌 [Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76: 3829] 및 [Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 핵 주사, 전기천공법 또는 원형질체 융합과 같은 방법에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 기타의 방법도 일반적으로 문헌 [SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 이후, 효모 숙주 세포는 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종성 단백질을 발현시키는 다른 방법들이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 미국특허 공보 제20020055169호, 미국특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 제5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국특허 RE37,343 및 RE35,749; PCT 공개 특허 출원 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 또한, 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2): 79-93], [Romanos et al., YEAST (1992) 8(6): 423-488], [Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.

효모 숙주 균주는 당업자에게 공지되어 있는 표준 공급물 배치 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 고려하여 조정할 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합 질소 공급원(예를 들어, 카세인 가수분해물) 및 복합 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 이와는 대조적으로, 메탄영양 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장과 발현을 위해서는 단순히 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제5,324,639호, 문헌 [Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌 [Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다.

그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적으로 특정한 공통 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 통상 성장 제한 영양분인 탄소를 증폭 기간 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 발효 방법은 일반적으로 적절한 양의 탄소, 질소, 기본 염, 인 및 다른 부영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 고안된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는데 적합한 발효 배지의 예들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기술되어 있다.

바큘로바이러스 ( Baculovirus )-감염 곤충 세포 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질 감염된 본래의 곤충 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드가 존재하는 것과 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손이 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다.

bG-CSF 폴리펩타이드의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택에 대해서는 당업자에게 공지되어 있다. 수개의 곤충 종들이 당업계에서는 잘 기술되어 있으며, 에데스 에깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 것들이 시판되고 있다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질 분해 활성 및 전체적인 강인성을 가지는 것으로 확인된 것들을 포함할 수 있다. 곤충은 미국 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부의 효모 유전자 저장 센터 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다.

일반적으로, 바큘로바이러스로 감염된 곤충 발현 시스템의 성분은 전이 벡터(보통 바큘로바이러스 유전체의 단편과 발현될 이종성 유전자의 삽입을 위한 적당한 제한 부위 양자 모두를 포함하는 박테리아 플라스미드임); 상기 전이 벡터 중에서 바큘로바이러스 특이적 단편에 대하여 동종성인 서열을 갖는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 유전체 내로 이종성 유전자의 동종성 재조합을 가능케 함); 및 적절한 곤충 숙주 세포와 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구축하고, 세포를 형질 감염시키고, 플라크(plaque)를 선별하고, 배양물 중에서 세포를 성장시키는 등의 작업에 사용되는 물질, 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 기술들을 기술하고 있는 매뉴얼도 입수가능하다.

이종성 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터와 야생형 바이러스 유전체를 곤충 숙주 세포로 형질 감염시키면, 이곳에서 벡터와 바이러스 유전체가 재조합하게 된다. 패키징된 재조합 바이러스가 발현되면, 재조합 플라크를 동정하여 정제한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료와 방법들은 예를 들어, 인비트로겐 코퍼레이션(캘리포니아주 칼스바드 소재)이 만든 키트가 시판되고 있다. 이러한 기법들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 모두 기재되어 있다. 또한, 문헌 [RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)], [AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)], [KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)] 및 [O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 다양한 이종성 단백질을 생산하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; WO 02/06305, WO 01/90390, WO 01/27301, WO 01/05956, WO 00/55345, WO 00/20032 WO 99/51721, WO 99/45130, WO 99/31257, WO 99/10515, WO 99/09193, WO 97/26332, WO 96/29400, WO 96/25496, WO 96/06161, WO 95/20672, WO 93/03173, WO 92/16619, WO 92/02628, WO 92/01801, WO 90/14428, WO 90/10078, WO 90/02566, WO 90/02186, WO 90/01556, WO 89/01038, WO 89/01037, WO 88/07082를 참조할 수 있다.

바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 헬퍼에 의존하지 않는 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)로부터 유래한 곤충 발현 벡터 및 전이 벡터를 포함한다. 이러한 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 통상 강한 바이러스 다각체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자 발현을 유발시킨다. 일반적으로, 문헌 [O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

외래 유전자를 바큘로바이러스 유전체에 삽입하기 이전에, 통상적으로 프로모터, 리더(leader)(필요한 경우), 해당 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 비롯한 상기 성분들을 중간 전환 구축물(intermediate transplacement construct)(전이 벡터)에 조립시킨다. 중간 전환 구축물은 흔히 박테리아과 같은 숙주에서 안정되게 유지될 수 있는 레플리콘, 예컨대 염색체 외 성분(예를 들어, 플라스미드) 내에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 보유하기 때문에, 이를 클로닝과 증폭을 위한 적합한 숙주에서 유지되도록 한다. 보다 구체적으로, 플라스미드는 다각체 폴리아데닐화 신호(문헌 [Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조) 및 원핵 세포성 암피실린 내성(amp) 유전자, 그리고 대장균 중에서의 선택과 증식을 위한 복제 원점을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV로 도입시키는데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들, 예를 들어, 다각체 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT의 하류부에 BamHI 클로닝 부위 32 염기쌍을 도입시키는 pVL985를 비롯한 여러 가지 벡터들이 고안되었다. 문헌 [Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)]을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 다른 벡터로서는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His, pBlueBacHis2, pMelBac, pBlueBac4.5(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.

이종성 유전자의 삽입 후, 전이 벡터와 야생형 바큘로바이러스 유전체는 곤충 세포 숙주 내로 함께 형질 감염된다. 이종성 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이에 대해서는, 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)], [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156], [Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들어, 동종성 이중 교차 재조합에 의해 다각체 유전자와 유전자 내로 삽입이 이루어질 수 있고, 또한 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 조작된 제한 효소 부위로도 삽입이 이루어질 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4): 91]을 참조할 수 있다.

형질 감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌 [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)], [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다. 다르게는, 재조합 발현 벡터와 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키는데 리포솜을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1): 36], [Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050], [Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570], [Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323], [Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45], [TILICNS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)], [Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263], [Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491], [Kost et al., GENE (1997) 190: 139], [Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203], [Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376], [Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39): 23607-10], [Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121], [Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2): 766] 및 [Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 리포솜으로는 예를 들어, 셀펙틴(Cellfectin®) 및 리포펙틴(Lipofectin®)(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질 감염도 사용할 수 있다. 문헌 [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)], [Kitts, NAR (1990) 18(19): 5667] 및 [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.

바큘로바이러스 발현 벡터는 통상 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있으며, mRNA 내로 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 하류부(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가지게 된다. 이러한 전사 개시 영역은 보통 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는 보통 구조 유전자와 원거리에 위치한(존재하는 경우) 인핸서라 불리는 제2 도메인을 가질 수도 있다. 또한, 발현은 조절될 수 있거나 또는 필수적일 수 있다.

감염 주기의 후기에서 다량으로 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 이러한 예로서는 바이러스 다각체 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839와 0 155 476 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열을 포함한다.

새로 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스에 패키징시키고, 이후 성장한 플라크는 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 정제될 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4): 91], [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조할 수 있다.

재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 수개의 곤충 세포 내로 감염시키기 위해 개발되었다. 예를 들어, 재조합 바큘로바이러스는, 특히, 에데스 에깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니(Trichopulsia ni)에 대하여 개발되었다. 문헌 [Wright, NATURE (1986) 321: 718], [Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153], [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로는, 문헌 [Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 보다 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 이에 제한하지는 않지만, 흔히 Sf9(스포돕테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포돕테라 프루기페르다)(인비트로겐 코퍼레이션, 분류 번호 11497-013(캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368 (트리초풀시아 니) 및 하이-파이브(High-Five^TM) BTI-TN-5B1-4 (트리초풀시아 니)를 포함한다.

바큘로바이러스/발현에 있어서 이종성 폴리펩타이드의 직접 발현 및 융합 발현 양자 모두를 위한 세포와 배양 배지가 시판되고 있으며, 세포 배양 기법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

대장균, 슈도모나스 종 및 기타 원핵 생물 박테리아 발현 기법은 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들도 입수가능하다. 벡터는 단일 복제 또는 다중(낮거나 높은) 복제 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 쓰일 수 있다. 벡터와 관련된 충분한 문헌들, 다양한 벡터들의 상업적 이용가능성, 그리고 심지어는 벡터 및 이들의 제한 지도와 특성들을 기술하고 있는 매뉴얼이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 이에 대한 광범위한 논의는 필요 없을 것으로 생각된다. 잘 알려진 바와 같이, 벡터는 통상적으로 선별을 가능케 하는 마커를 포함하는데, 여기서 마커는 세포 독성제에 대한 내성, 독립영양성 또는 면역성을 제공할 수 있다. 흔히, 다양한 특징들을 제공하는 다수의 마커들이 존재한다.

박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있으며, mRNA 내로 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 하류부(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가지게 된다. 이러한 전사 개시 영역은 보통 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 박테리아 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접한 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 작동자(operator)라 불리는 제2 도메인을 가질 수도 있다. 유전자 억제제 단백질이 작동자에 결합하여 특정 유전자의 전사를 억제하기 때문에, 작동자는 음성적으로 조절된 (유도성) 전사를 야기하게 된다. 구조적 발현은 음성적 조절 성분, 예컨대 작동자의 부재 하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성적 조절은 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접(5')한(존재하는 경우) 유전자 활성제 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성제 단백질의 예로서는 대장균에서 lac 오페론의 전사 개시를 도와주는 이화 생성물 활성제 단백질(CAP)을 들 수 있다(문헌 [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성적으로 조절되는 것이므로 전사를 강화시키거나 또는 감소시킨다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로서는 당 대사 효소, 예컨대 갈락토스, 락토스(lac)(문헌 [Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예로서는 생합성 효소, 예컨대 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057], [Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731], 미국특허 제 4,738,921호, EP 공보 036 776 및 121 775 참조). 또한, β-갈락토시다아제(bla) 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 λ PL 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 제 4,689,406호 참조)도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강성 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 사용하여 bG-CSF 폴리펩타이드를 높은 수준으로 유도한다. 이러한 벡터의 예들은 당업계에 공지되어 있으며, 노바겐(Novagen)의 pET29 계열과, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 WO 99/05297에 기술되어 있는 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 생존 능력 또는 성장 매개변수를 약화시키지 않으면서 숙주에서 bG-CSF 폴리펩타이드를 높은 수준으로 생산한다. pET19(노바겐)은 당업계에 공지된 또 다른 벡터이다.

또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 기능을 한다. 예를 들어, 하나의 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜 합성한 혼성 프로모터를 생성할 수 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제 4,551,433호 참조). 예를 들어, tac 프로모터는 trp 프로모터와 lac 억제제에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 양자 모두로 이루어지는 혼성 trp-lac 프로모터이다(문헌 [Amann et al., GENE (1983) 25: 167], [de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80: 21] 참조). 더욱이, 박테리아 프로모터는 세균 RNA 중합효소와 결합하여 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비박테리아 기원의 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비박테리아 기원의 천연 발생 프로모터는 양립가능한 RNA 중합효소와 커플링되어 원핵 생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌 [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113], [Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 혼성 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 대장균 작동자 영역으로 이루어질 수 있다(유럽 특허 공보 제267 851호 참조).

또한, 프로모터 서열로 기능하는 것 이외에도, 유효한 리보솜 결합 부위는 원핵 생물에서 외래 유전자의 발현에도 유용하다. 대장균에 있어서, 리보솜 결합 부위는 소위 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열로 지칭되며, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈의 3-11번 뉴클레오타이드 상류부에 위치한 길이가 3-9개의 뉴클레오타이드인 서열을 포함한다(문헌 [Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 이러한 SD 서열은 대장균 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 짝지움에 의해 mRNA의 리보솜에 대한 결합을 촉진시키는 것으로 보인다(문헌 [Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R.F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보솜 결합 부위를 사용하여 진핵 세포성 유전자 및 원핵 세포성 유전자를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.

"박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 박테리아를 지칭한다. 이 용어는 형질 감염된 본래의 박테리아 숙주 세포의 후대의 자손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드가 존재하는 것과 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손이 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다.

bG-CSF 폴리펩타이드의 발현을 위한 적합한 숙주 세균의 선택은 당업계의 숙련자라면 누구나 할 수 있다. 발현용 박테리아 숙주의 선택에 있어서, 적절한 숙주는 특히, 우수한 내포체 형성 능력, 낮은 단백질 분해 활성 및 전체적인 강인성을 보유하는 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다. 박테리아 숙주는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 미국 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부의 세균 유전자 저장 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다. 산업적/제약학적 발효는 K 균주(예를 들어, W3110)로부터 유도된 세균 또는 B 균주(예를 들어, BL21)로부터 유도된 세균을 일반적으로 사용한다. 이러한 균주들은 그들의 성장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강인하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 안정성 및 환경상의 이유로 상업상 중요한 비병원성이다. 적절한 대장균 숙주의 다른 예로서, 이에 제한되지는 않지만, BL21, DH10B 또는 이의 유도체의 균주를 포함한다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시 양태에서, 대장균 숙주는 프로테아제 마이너스 균주, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, OMP- 및 LON- 이다. 숙주 세포 균주는 슈도모나스의 종, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사 및 슈도모나스 푸티다일 수 있다. 균주 MB101로 지정된 슈도모나스 플루오레센스 바이오바(fluorescens biovar) 1은 재조합 생산을 위해 유용한 것으로 알려져 있으며, 치료적 단백질 생산 공정용으로 이용가능하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예로서는, 숙주 균주로서 다우 케미칼 캄파니(Dow Chemical Company)(미국 미시간주 미드랜드 소재, www.dow.com 상에서 이용가능)로부터 이용가능한 시스템을 포함한다.

일단 재조합 숙주 세포 균주를 확립(즉, 발현 구축물이 숙주 세포로 도입되고, 적절한 발현 구축물을 갖는 숙주 세포가 단리됨)한 후에는, 재조합 숙주 세포 균주를 bG-CSF 폴리펩타이드 생산에 적합한 조건 하에서 배양한다. 당업자라면 명백히 알 수 있듯이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구축물의 특성 및 숙주 세포의 동일성에 따라 좌우될 것이다. 재조합 숙주 균주는 통상 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 배양된다. 재조합 숙주 세포는 보통 흡수가능한 탄소, 질소 및 무기 염 공급원을 포함하며, 임의로는, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 공지된 다른 단백질 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 숙주 세포 배양용 액체 배지는 임의로 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 위한 항생제(이에 한정되지는 않음)를 비롯한 화합물을 포함할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 배치 형식 또는 연속 형식으로 배양될 수 있으며, 배치 형식 또는 연속 형식으로 세포를 수확하거나(bG-CSF 폴리펩타이드가 세포 내 축적되는 경우) 또는 배양 상청액을 수확한다. 원핵 숙주 세포에서 생산하는 경우, 배치 배양 및 세포 수확이 바람직하다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 보통 재조합 시스템에서 발현 후 정제된다. bG-CSF 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 본원에 참고로 그 내용 전체가 포함되는 미국특허 제5,849,883호 및 WO 89/10932는 숙주 세포 내로 bG-CSF 및 이의 유사체를 클로닝하는 내용과, 단리 및 정제 방법에 대해 기술하고 있다. 박테리아 숙주 세포에서 생산된 bG-CSF 폴리펩타이드는 가용성이 불량하거나 또는 불용성(내포체의 형태의 경우)일 수 있다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 아미노산 치환은, 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 방법들을 사용해 재조합 생산된 단백질의 가용성을 증가시킬 목적으로 선택된 bG-CSF 폴리펩타이드 중에서는 용이하게 행해질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심분리에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있고, 이후 세포의 균질화를 더 수행할 수 있다. 가용성이 불량한 단백질의 경우, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 비롯한 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성인 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 이후, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 손쉽게 수거할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여 붕괴시키거나 또는 균질화하여, 세포 내부에서 내포체를 유리시킬 수 있다. 숙주 세포 붕괴 또는 균질화는 효소 처리에 의한 세포 붕괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 붕괴(이에 한정되지는 않음)를 비롯하여 잘 알려진 기법들을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시 양태에서, 고압 방출 기법은 대장균 숙주 세포를 붕괴시킴으로써 bG-CSF 폴리펩타이드의 내포체를 방출시키는 데 사용된다. bG-CSF 폴리펩타이드의 내포체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질 분해와 같은 요인으로 인한 손실 없이 내포체의 수율을 최대화시키기 위해서는 반복 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리할 수 있다.

이후, 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 bG-CSF 폴리펩타이드를 용해시킬 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드는 우레아 또는 염산 구아니딘으로 용해될 수 있다. 상기 가용화된 bG-CSF 폴리펩타이드의 부피는 편리하게 다룰 수 있는 배치 크기를 사용하여 대량의 배치를 생산할 수 있도록 최소화되어야 한다. 이러한 인자는 재조합 숙주가 수천 리터의 부피를 갖는 배치에서 성장할 수 있는 대규모 상업적 환경에서 중요할 수 있다. 또한, 대규모 상업적 환경에서 bG-CSF 폴리펩타이드를 제조하는 경우, 특히나 인간을 위한 약학적 용도의 경우, 기계와 용기 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학 물질은 가능하면 반드시 피해야 한다. 본 발명의 방법에서, 더욱 강력한 변성제인 염산 구아니딘 대신에 보다 순한 변성제인 우레아를 사용하여 bG-CSF 폴리펩타이드 내포체를 가용화시킬 수 있다는 점이 밝혀졌다. 우레아의 사용은 bG-CSF 폴리펩타이드 내포체를 유효하게 용해시키면서도, bG-CSF 폴리펩타이드를 제조하고 정제하는 공정에서 사용되는 스테인레스강 장비에 대한 손상 위험을 현저하게 감소시킨다.

가용성 bG-CSF 단백질의 경우, bG-CSF는 세포질주변 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 단백질은 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 이전에 가용성 단백질을 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여, 예컨대 세포 용해물 또는 배양 배지의 가용성 bG-CSF를 농축시킬 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여 숙주 세포를 붕괴시켜서, 숙주 세포의 세포질 또는 세포질주변 공간으로부터 가용성 bG-CSF를 방출시킬 수 있다.

bG-CSF 폴리펩타이드가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 분해 또는 화학적 분해에 의해 수행될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 동일성에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정될 것이다. 화학적 분해는 당업자에게 공지된 시약, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 브롬화 시아노겐, TEV 프로테아제 및 기타 시약들을 이용하여 수행될 수 있다. 분해된 bG-CSF 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 분해된 융합 서열로부터 정제된다. 당업자에게 자명하듯이, 이러한 방법은 융합 서열과 bG-CSF 폴리펩타이드의 동일성과 특성에 의해 결정되게 된다. 정제 방법은 이에 제한되지는 않지만, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 이들 방법을 임의로 조합한 방법을 포함할 수 있다.

또한, bG-CSF 폴리펩타이드를 정제하여 단백질 용액으로부터 DNA를 제거할 수 있다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으나, 핵산 침전제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 프로타민 설페이트를 사용한 침전에 의해 제거될 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드는 잘 알려진 표준 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 원심분리 또는 여과를 사용하여 침전된 DNA로부터 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 bG-CSF 폴리펩타이드가 동물 또는 인간을 치료하는 데 사용되는 환경에서 중요한 한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.

또한, 소규모 발효 또는 대규모 발효을 위한 방법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 각각 배치식, 공급-배치식 또는 연속식 모드 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명의 인간 bG-CSF 폴리펩타이드는 일반적으로 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 또는 여과하여 세포 잔해물을 제거할 수 있다. 상청액은 원하는 부피로 농축 또는 희석시키거나, 또는 적절한 완충액 내로 정용여과시켜 추가의 정제를 위해 상기 제제를 컨디셔닝할 수 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드의 추가 정제는 본연 그대로의 형태로부터 탈아미드화 및 단축된 형태의 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 정제하는데 있어서 하기의 예시적인 절차들 중 임의의 절차를 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스(SEPHAROSE)를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등전점 집초법(isoelectric focusing)을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도(가용성) 차이를 이용한 방법(differential solubility)(황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출.

본 발명의 단백질, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 펩타이드, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등은, 당업자에게 공지되어 사용되고 있는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 임의 다수의 방법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등의 방법에 의해 회수되어 정제될 수 있다. 필요에 따라, 올바르게 접혀 성숙된 단백질을 제조하고자 하는 경우에는 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 높은 순도가 요구되는 최종 정제 단계에서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 기타 적절한 방법을 사용할 수 있다. 한 실시 양태에서, 비천연 아미노산에 대항하여 생성된 항체(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩타이드)는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 친화성 기반 정제를 위한 시약으로 사용된다. 일단 폴리펩타이드를 필요에 따라 부분적으로 또는 균질하게 정제하면, 상기 폴리펩타이드는 광범위하게 다양한 용도, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 분석시험 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 생산용 면역원으로 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에 대항하여 생성된 항체는 통상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 비인간인 동물에게 폴리펩타이드 또는 에피토프 함유 단편 또는 세포를 투여함으로써 수득될 수 있다. 당업자라면 공지된 다양한 기법들을 이용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 유전자 이식된 마우스 또는 다른 유기체(다른 포유류 포함함)는 인간화 항체를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 상기 기술된 항체들은 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 단리하거나 또는 동정하거나, 또는 폴리펩타이드를 정제하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대항하는 항체는 질병을 치료하는데에도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 백신으로 사용될 수도 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 사이토카인을 생성하는 항체 면역 반응 및/또는 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 비롯한 T 세포 면역 반응을 유발하기에 적절하도록 포유류에 본 발명의 폴리펩타이드를 접종하는 단계를 포함하여, 질병(이러한 질병은 개체 내에 이미 발생했거나 혹은 존재하는지의 여부에 관계 없음)으로부터 상기 동물을 보호하기 위해 포유류의 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 포유류에서의 면역학적 반응은, 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 본 발명의 폴리펩타이드를 전달하는 단계 및 본 발명의 질병들로부터 상기 동물을 보호하기 위한 항체를 생성하는 면역학적 반응을 유도하기 위해서 생체 내에서 상기 폴레펩타이드를 코딩하는 단계를 포함하는 방법에 의해 유도될 수도 있다. 벡터를 투여하는 하나의 방법으로서는 입자상으로 코팅하여 원하는 세포 내로 가속시키는 것을 들 수 있다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 변형된 핵산 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함할 수 있다. 백신으로 사용을 위해서는, 폴리펩타이드 또는 핵산 벡터는 보통 백신 제형(조성물)로서 제공된다. 상기 제형은 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 폴리펩타이드가 위장에서 붕괴될 수 있기 때문에, 비경구적으로 투여할 수 있다(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥 내 또는 피부내 주사). 비경구 투여로 적절한 제형으로서는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 상기 제형을 수용자의 혈액과 등장성으로 해주는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 또한, 백신 제형은 제형의 면역원성을 강화하기 위하여 당업자에게 잘 알려진 아주반트 시스템을 포함할 수 있다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 좌우되는 것으로, 통상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 명세서에 나타낸 기타 참고 문헌 이외에도, 다양한 정제/단백질 접힘 방법들이 당업자에게 공지되어 있는데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)], [Deutscher, Methods in Enzymology Vol .182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)], [Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.], [Bollag et al., (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY], [Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ], [Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications : A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England], [Harris and Angal, Protein Purification Methods : A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England], [Scopes, (1993) Protein Purification : Principles and Practice, 3rd Edition Springer Verlag, NY], [Janson and Ryden, (1998) Protein Purification : Principles , High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY] 및 [Walker (1998), Protein Protocols on CD - ROM, Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에 인용된 참고 문헌에 기재된 방법들을 들 수 있다.

진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 사용하여 해당 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 것의 한 장점은, 단백질 또는 폴리펩타이드가 그들의 본래의 형태로 접힌다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 당업자라면 합성, 발현 및/또는 정제 후에, 단백질 또는 펩타이드가 관련 폴리펩타이드의 원하는 형태와는 다른 형태를 가질 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 발현된 단백질은 변성된 후, 복원될 수 있다. 이는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 해당 단백질 또는 폴리펩타이드에 샤페로닌을 첨가하는 방법, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예컨대 염산 구아니딘에 용해시키는 방법, 단백질 이황화 아이소머라제를 사용하는 방법 등을 이용하여 수행된다.

일반적으로, 발현된 폴리펩타이드를 변성 및 환원시킨 후, 폴리펩타이드를 바람직한 형태로 리폴딩시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 해당 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 공지되어 있다(상기 참고 문헌들과 문헌 [Debinski, et al., (1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070], [Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug . Chem ., 4: 581-585] 및 [Buchner, et al., (1992) Anal . Biochem ., 205: 263-270] 참조). 예를 들어, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서 내포체 단백질의 변성 및 환원에 대해 기술하고 있다. 단백질은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 포함하는 산화환원 완충액 내에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 계속적으로 공급하거나, 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 이동시킬 수 있으며, 또는 이와 반대의 경우도 가능하다.

bG-CSF 폴리펩타이드의 원핵 세포 생산의 경우에는, 이렇게 생산된 bG-CSF 폴리펩타이드가 잘못 접혀질(misfolding) 수 있기 때문에, 생물학적 활성이 결핍되거나 감소될 수 있다. 단백질의 생체 활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 잘못 접혀진 bG-CSF 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들어, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩타이드 사슬을 가용화시켜(여기서, bG-CSF 폴리펩타이드 역시 불용성임), 풀어 헤치고, 환원시켜 리폴딩(다시 접혀지게)하게 된다. 이후, 중간 농도의 무질서 유발제의 농도에서, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하여 이황화 결합을 재형성시킨다. bG-CSF 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법들을 사용하여 리폴딩될 수 있다. 또한, bG-CSF 폴리펩타이드는 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수도 있다.

리폴딩 후, bG-CSF는 추가로 정제될 수 있다. bG-CSF의 정제는 당업자에게 공지된 다양한 기법들, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들을 임의로 조합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 추가의 정제는 정제된 단백질의 건조 또는 침전 단계를 포함할 수도 있다.

정제 후, bG-CSF는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 정용여과 및 투석에 의해 다른 완충액 내로 교환되고/되거나 농축될 수 있다. 한번 정제된 단백질로서 제공된 bG-CSF는 응집과 침전 과정을 거칠 수 있다.

상기 정제된 bG-CSF는 그 순도가 90% 이상(역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 또는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정시) 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상일 수 있다. bG-CSF 순도의 정확한 수치 값에 관계없이, bG-CSF는 약학 제품으로 사용하기에 또는 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합과 같이 추가의 가공을 위해 사용하기에 충분히 순수하다.

어떤 bG-CSF 분자는 다른 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 안정제, 혈청 알부민 등 이외의 것)의 부재 하에 치료제로서 사용될 수 있거나, 또는 이들은 다른 단백질 또는 중합체와 복합체화될 수 있다.

일반적인 정제 방법 다양한 단리 단계 중 어느 단계라도, bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 세포 용해물, 추출물, 배양 배지, 내포체, 숙주 세포의 세포질주변 공간, 숙주 세포의 세포질 또는 다른 물질 상에서 수행하거나, 또는 임의의 단리 단계로부터 생성된 임의의 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물 상에서 수행할 수 있다.(상기 임의의 단리 단계는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 팽창층(expanded bed) 흡착 혹은 이들을 임의로 조합 및/또는 반복한 방법 및 이들을 임의의 적절한 순서로 한 방법을 포함한다).

본 명세서에 기술된 기법들을 수행하는 데 사용되는 장비와 기타 필요한 물질들은 시판되고 있다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록기 및 전반적인 시스템들은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 래보러토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재) 및 아머샴 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 크로마토그래피 재료, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충제들도 이러한 공급업체들로부터 입수가능하다.

평형 단계 및 본원에 기술된 컬럼 크로마토그래피 공정에서의 기타 단계, 예컨대 세척과 용출 단계는 펌프와 같은 특수화된 장치를 사용하여 보다 신속하게 수행될 수 있다. 시판되고 있는 펌프로서는 이에 제한되지는 않지만, 하이로드(HILOAD®) 펌프 P-50, 연동 펌프 P-1, 펌프 P-901 및 펌프 P-903(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다.

분획 수집기의 예로서는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기, FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 SUPERFRACS® 분획 수집기(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하기 위해 혼합기도 이용가능하다. 시판되고 있는 혼합기로서는 그래디언트(Gradient) 혼합기 GM-1 및 인-라인(In-Line) 혼합기(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.

시판되고 있는 임의의 모니터를 사용하여 크로마토그래피 공정을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도율과 같은 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로서는 모니터 UV-1, 유비코드(UVICORD® S II), 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 전도율 모니터(Conductivity Monitor)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전반적인 시스템들이 시판되고 있다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 예를 들어, bG-CSF 폴리펩타이드는 먼저 우레아 중에서 생성된 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드를 변성시킨 후, 적절한 pH에서 환원제(예컨대, DTT)를 함유하는 TRIS 완충액으로 희석시킴으로써 환원 및 변성될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 약 2M 내지 약 9M의 농도 범위의 우레아 중에서 변성된 후, 약 5.0 내지 약 8.0의 범위의 pH에서 TRIS 버퍼 중에서 희석된다. 다음으로, 이 실시 양태의 리폴딩 혼합물을 배양할 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 리폴딩 혼합물은 실온에서 4시간 내지 24시간 동안 배양된다. 이후, 상기 환원 및 변성된 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물은 추가로 단리되거나 또는 정제될 수 있다.

본 명세서에 언급된 바와 같이, 제1 bG-CSF 폴리펩타이드의 pH는 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 조절될 수 있다. 또한, 제1 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물은 당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 제1 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용출 완충액은 당업자에게 공지되어 있는 기법들을 사용하여 다음 단리 단계에 적절한 완충액으로 교환될 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피 한 실시 양태에서, 그리고 하나의 임의적인 추가 단계로서, 이온 교환 크로마토그래피가 제1 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물에 대해 수행될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 이온 교환 컬럼으로서는 하이트랩(HITRAP®), 하이프랩(HIPREP®) 및 하이로드® 컬럼(뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼들은 강한 음이온 교환기, 예컨대 Q 세파로스® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스® XL; 강한 양이온 교환기, 예컨대 SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스® 패스트 플로우 및 SP 세파로스® XL; 약한 음이온 교환기, 예컨대 DEAE 세파로스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예컨대 CM 세파로스® 패스트 플로우(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 공정 중 임의의 단계의 bG-CSF 폴리펩타이드 상에서 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드를 단리시킬 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적절한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스로서는, 이에 제한되지는 않지만, 섬유상, 다공성, 비다공성, 미세과립상, 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함한다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질은 이에 제한되지는 않지만, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 상기 임의의 것들로 이루어진 복합체를 포함한다.

양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기와 약한 양이온 교환기를 포함하는 임의의 적절한 양이온 교환기일 수 있다. 강한 양이온 교환기는 광범위한 pH 범위에 걸쳐 이온 상태로 잔류할 수 있기 때문에, 광범위한 pH 범위에 걸쳐 bG-CSF와 결합할 수 있게 된다. 그러나, 약한 양이온 교환기는 pH의 함수로서 이온화 상태 잃어버릴 수 있다. 예를 들어, 약한 양이온 교환기는 pH가 약 pH 4 또는 pH 5 미만으로 떨어지는 경우 전하를 잃어버릴 수 있다. 강한 양이온 교환기로 적절한 것으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 설포프로필(SP), 메틸 설포네이트(S) 또는 설포에틸(SE)와 같이 하전된 작용기들을 포함한다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하기로는 약 2.5 내지 약 6.0의 bG-CSF 결합 pH 범위를 갖는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 강한 양이온 교환기는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 bG-CSF 결합 pH 범위를 가질 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 약 3.0의 bG-CSF 결합 pH를 가지는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 양이온 교환 매트릭스는 바람직하기로는 약 6.0 내지 약 8.0의 bG-CSF 결합 pH 범위를 갖는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.5의 bG-CSF 결합 pH 범위를 가지는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 강한 양이온 교환기는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0의 bG-CSF 결합 pH 범위를 가질 수 있다.

bG-CSF를 로딩하기 전에, 양이온 교환 매트릭스는 예를 들어 수 컬럼 부피의 희석물인 약산, 예컨대 4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 이용하여 평형 상태에 이를 수 있다. 평형에 도달한 후, 약한 아세트산 또는 인산 용액과 같은 약산 용액을 사용하여 실질적으로 정제된 bG-CSF가 용출되기 전에, bG-CSF가 첨가될 수 있으며, 컬럼은 1회 내지 수회 세척될 수 있다. 예를 들어, 약 2-4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)이 컬럼을 세척하는데 사용될 수 있다. 2-4 컬럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.1 M 염화나트륨과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 이용한 추가의 세척도 사용될 수 있다. 다르게는, 당업계에 공지된 방법들을 사용한 양이온 교환 매트릭스는 수 컬럼 부피의 희석물인 약염기를 이용하여 평형에 다다를 수 있다.

다르게는, 실질적으로 정제된 bG-CSF는 양이온 교환기 매트릭스를 충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 갖는 버퍼와 접촉시켜 매트릭스로부터 bG-CSF를 방출시킴으로써 용출될 수 있다. 용출 버퍼의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 6.0의 범위일 수 있다. 보다 구체적으로는, 용출 버퍼의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.0의 범위일 수 있다. 용출 버퍼는 약 3.0의 pH를 가질 수 있다. 또한, 용출 버퍼의 양은 광범위하게 다양할 수 있으며, 일반적으로는 약 2 내지 약 10 컬럼 부피 범위이다.

양이온 교환기 매트릭스에 bG-CSF 폴리펩타이드가 흡착된 후, 실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드는 매트릭스를 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 버퍼와 접촉시켜 매트릭스로부터 bG-CSF 폴리펩타이드를 방출시킴으로써 용출될 수 있다. 실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드의 높은 pH 용출에서 사용하기 적절한 버퍼로서는, 이에 제한되지는 않으나, 약 5 mM 이상 내지 적어도 약 100 mM 농도 범위의 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 버퍼를 포함한다.

역상 크로마토그래피 당업자에게 공지되어 있는 적합한 프로토콜에 따라 RP-HPLC를 수행하여 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982)], [Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119], [Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 bG-CSF 폴리펩타이드 상에서 수행하여 실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₃₀, 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₂₀, 또는 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₁₈을 비롯한 매우 다양한 길이의 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도체화 수지를 사용할 수 있다. 다르게는, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 사슬 길이의 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, RP-HPLC 컬럼을 에탄올과 같은 용매로 세척할 수 있다. 소스(Source) RP 컬럼은 RP-HPLC 컬럼의 또 다른 예이다.

이온쌍 시약(ion pairing agent) 및 유기 변형제, 예컨대 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 포함하는 적절한 용출 버퍼를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 bG-CSF 폴리펩타이드를 용출시킬 수 있다. 가장 흔히 사용되는 이온쌍 시약으로서는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함한다. 용출은 하나 이상의 구배(변화도) 또는 등용매 조건을 사용하여 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간을 줄이고 피크 폭을 감소시키는 것이 바람직하다. 또 다른 방법은 서로 다른 용매 농도 범위를 갖는 2개의 구배를 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용하기 적절한 용출 버퍼의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 bG-CSF 폴리펩타이드 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 매트릭스로는, 이에 제한되지는 않지만, 알킬 또는 아릴 치환된 매트릭스, 예컨대 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환된 매트릭스(예컨대, 아가로스, 가교 결합된 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스 포함), 그리고 혼합형 수지, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환된 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함할 수 있다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피를 위한 시판되는 공급 제품으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 하이트랩®, 하이프랩® 및 하이로드® 컬럼(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다.

간략히 기술하면, 로딩하기 전에 당업자에게 공지된 표준 버퍼, 예컨대 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 HIC 컬럼을 평형 상태로 만들 수 있다. 황산암모늄은 HIC 컬럼에 로딩하기 위한 버퍼로서 사용될 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 버퍼 및 조건들을 사용하여 세척하여 HIC 컬럼 상의 bG-CSF 폴리펩타이드는 보유하면서 불필요한 물질들을 제거할 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드는 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 버퍼, 예컨대 특히 EDTA 및 평형 버퍼보다 낮은 황산암모늄 농도를 함유하는 HEPES 버퍼, 또는 아세트산/염화나트륨 버퍼 등을 사용하여 용출시킬 수 있다. 또한, bG-CSF 분자를 용출하는데 있어서 예를 들어, 인산칼륨의 구배를 사용하는 감소성 선형 염 구배를 이용할 수도 있다. 다음으로, 용출물은 예를 들어, 정용여과 또는 한외여과와 같은 여과에 의해 농축시킬 수 있다. 정용여과를 사용하여 bG-CSF 폴리펩타이드를 용출시키는데 사용되는 염을 제거할 수 있다.

기타 정제 기법 예를 들어, 겔 여과(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1022-18, 미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), 히드록시아파타이트 크로마토그래피(적절한 매트릭스로서는 이에 제한되지는 않지만, HA-울트로겔(Ultrogel), 하이 레졸루션(High Resolution, Calbiochem), CHT 세라믹 히드록시 아파타이트(BioRad), 바이오-겔(Bio-Gel) HTP 히드록시아파타이트(BioRad)를 포함함), HPLC, 팽창층 흡착, 한외여과, 정용여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 bG-CSF 폴리펩타이드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물 상에서 수행함으로써, 임의의 초과량의 염을 제거하고, 버퍼를 차후 단리 단계 또는 심지어 최종 약물 제품의 제조에 적절한 버퍼로 대체시킬 수 있다.

실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 수율은 본원에 기술된 각 단계에서 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 이러한 기법들은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 bG-CSF 폴리펩타이드의 수율을 평가하는 데에도 사용할 수 있다. 예를 들어, bG-CSF 폴리펩타이드의 수율은, 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 수개의 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 시아노 RP-HPLC, C₁₈RP-HPLC 뿐만 아니라 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 칼럼을 사용하여 모니터링될 수 있다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 각 정제 단계 후의 bG-CSF 수율은 각 정제 단계에 있어서 출발 물질 중 bG-CSF가 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9%, 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.

표준 기법, 예컨대 SDS-PAGE를 사용하거나, 또는 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석시험을 사용하여 bG-CSF 폴리펩타이드를 측정함으로써 순도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 음성적 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대항하여 생성될 수 있다. 또한, 항체는 오염되는 숙주 세포 단백질의 존재에 대한 프로브로서 사용될 수 있다.

RP-HPLC 재료인 비다크(Vydac) C4(비다크)는 실리카 겔 입자로 이루어져 있는데, 그 표면은 C4-알킬 사슬을 수반하고 있다. 단백질 불순물로부터 bG-CSF 폴리펩타이드를 분리시키는 일은 소수성 상호작용에 있어서 그 강도의 차이를 기초로 한다. 용출은 희석된 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 수행한다. 분취 HPLC는 스테인레스강 컬럼(2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전시킴)을 사용하여 수행한다. 히드록시아파타이트 울트로겔 용출액은 트리플루오로아세트산을 첨가하여 산성화하고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해, 희석된 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획물들을 수거하고, 즉시 포스페이트 버퍼로 중화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 bG-CSF 폴리펩타이드 분획물을 집합적으로 수거한다.

DEAE 세파로스(Pharmacia) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE) 기로 이루어져 있다. DEAE 기에 대한 bG-CSF 폴리펩타이드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 남아 있지 않게 컬럼을 통과시킨다. 이러한 물질들을 세척하여 제거한 후, 미량의 불순물은 낮은 pH에서 아세테이트 버퍼를 사용해 컬럼을 세척함으로써 제거한다. 다음으로, 컬럼을 중성 포스페이트 버퍼로 세척하고, bG-CSF 폴리펩타이드를 증가된 이온 강도를 갖는 버퍼로 용출시킨다. 컬럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 패킹시킨다. 컬럼 부피를 겔 1 ㎖ 당 bG-CSF 폴리펩타이드 3-10 mg의 범위로 bG-CSF 폴리펩타이드 로딩이 이루어지도록 조절한다. 컬럼을 물과 평형 버퍼(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용출물의 수집된 분획물을 로딩하고, 컬럼을 평형 버퍼로 세척한다. 이후, 컬럼을 세척 버퍼(아세트산나트륨 버퍼)로 세척한 후, 평형 버퍼로 세척한다. 추후, bG-CSF 폴리펩타이드를 용출 버퍼(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 컬럼으로부터 용출시켜, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획물로 수거한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용출물을 특정한 전도율을 가지도록 조절한다. 생성되는 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70℃에서 저장한다.

추가로 사용될 수 있는 방법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 내독소를 제거하는 단계를 포함한다. 내독소는 예컨대 대장균과 같은 그람 음성 숙주 세포의 외막 상에 위치하는 리포폴리-사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 히드록시아파타이트, 역상, 친화성, 크기 배제, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제 기법들, 이러한 방법들을 조합한 방법 등을 포함한다. 변형 및 추가의 방법들은 해당 폴리펩타이드로부터 공동 이송(co-migrating) 단백질과 같은 오염원을 제거하는 것을 필요로 할 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 투구게 혈구 추출액(Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 분석시험을 포함한다. 엔도세이프(Endosafe™)-PTS 분석시험은 포켓용 분광 광도계와 마찬가지로 LAL 시약, 색원체 기질 및 대조군 표준 내독소를 미리 로딩시킨 카트리지를 이용하는 색체계 단일 튜브 시스템이다. 대안적인 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, 탁도계로서 96 웰 포맷을 사용하는 키네틱(Kinetic) LAL 방법을 포함한다.

광범위하게 다양한 방법들과 절차들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 브래드포드(Bradford) 분석시험, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분석법(MALDI-TOF를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 당업자에게 공지되어 있는 단백질의 특성을 규명하는 기타의 방법들이, 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 bG-CSF 단백질의 수율과 순도를 평가하는 데 사용될 수 있다.

추가의 방법들로는 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함한다: 단백질 염색 방법과 짝지워진 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전점 집초법, 음이온 교환 분석법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성 분광 분석법.

VIII . 대체 시스템에서의 발현

비재조합 숙주 세포, 돌연변이 유발된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에 있어서 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는데 여러 가지 전략들이 사용되어 왔다. 또한, 이러한 시스템은 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 제조하는데에도 사용하기 적합하다. 반응성 측쇄, 예컨대 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 리신을 N²-아세틸-리신으로 전환시키게 된다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법도 제공한다. 펩타이드 단편을 효소적으로 결찰시키는 것과 본래의 화학적 결찰 방법에 대해서 최근 개발이 이루어져서, 보다 큰 단백질을 제조하는 것이 가능해졌다. 예를 들어, 문헌 [P.E. Dawson and S.B.H. Kent, Annu . Rev . Biochem ., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 화학적 펩타이드 결찰 및 본래의 화학적 결찰에 대해서는 미국 특허 제6,184,344호, 미국 특허 공보 제2004/0138412호, 미국 특허 공보 제2003/0208046호, WO 02/098902 및 WO 03/042235(이들 문헌은 모두 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 일반적인 시험관 내 생합성 방법(원하는 비천연 아미노산에 의해 화학적으로 아실화된 억제제 tRNA가 단백질 생합성을 지원할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가됨)을 사용하여, 100개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들어, 문헌 [V.W. Cornish, D. Mendel and P.G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 1995, 34: 621 (1995)], [C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989)] 및 [J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 매우 다양한 작용기들이 단백질 안정성, 단백질 접힘, 효소 기작 및 신호 전달의 연구를 위하여 단백질에 도입되었다.

선택적 압력 도입이라고 불리는 생체 내 기법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별적인 난잡함을 이용하게 되었다. 예를 들어, 문헌 [N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F.M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 영양요구성 균주는, 세포에게 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않아, 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하는 한편, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 성장 정지기가 개시되면, 천연 아미노산은 고갈되어 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질 발현이 유도되어 비천연 유사체를 함유하는 단백질의 축적이 이루어진다. 예를 들어, 이러한 전략을 사용해 o, m 및 p-플루오로페닐알라닌을 단백질에 도입시켰더니, 용이하게 확인가능한 UV 스펙트럼 중에서 2개의 특징적인 숄더(shoulder)가 나타나며(예를 들어, 문헌 [C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem ., 284:29 (2000)] 참조), 박테리오파지 T4 리소자임(lysozyme)에서 메티오닌을 대체하는데 사용된 트리플루오로메티오닌을 ¹⁹F NMR에 의해 키토올리고사카라이드 리간드와의 상호작용을 연구하였고(예를 들어, 문헌 [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J.F. Honek, Biochemistry. 36:3404 (1997)] 참조), 루신 대신에 트리플루오로루신을 도입한 결과, 루신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들어, 문헌 [Y. Tang, G. Ghirlanda, W.A. Petka, T. Nakajima, W.F. DeGrado and D.A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 40:1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 셀레노메티오닌(selenomethionine)과 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석에 진전을 가져왔다. 예를 들어, 문헌 [W.A. Hendrickson, J.R. Horton and D.M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990)], [J.O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J.D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol., 1:283 (1994)], [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem ., 230:788 (1995)] 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol . 270:616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의한 단백질의 추가적인 변형을 가능케 하였다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [J.C. van Hest and D.A. Tirrell, FEBS Lett ., 428:68 (1998)], [J.C. van Hest, K.L. Kiick and D.A. Tirrell, J. Am . Chem . Soc., 122:1282 (2000)] 및 [K.L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000)]; 미국특허 제 6,586,207호; 미국특허 공보 제2002/0042097호를 참조할 수 있다.

이러한 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소가 비천연 아미노산 유사체를 인지하느냐의 여부에 따라 좌우되는 것으로, 이는 보통 단백질 번역의 충실도를 보장하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이러한 방법의 범위를 확장시키는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것인데, 이는 제한된 경우의 수로 달성되었다. 예를 들어, 대장균 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala²⁹⁴의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜, p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 야기하게 된다. 문헌 [M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이러한 돌연변이체 PheRS가 번식하고 있는 대장균 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌의 도입을 허용한다. 예를 들어, 문헌 [M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett ., 364:272 (1995)] 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D.A. Tirrell, FEBS Lett ., 467:37 (2000)]을 참조할 수 있다. 이와 유사하게, 대장균 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근방의 점 돌연변이 Phe130Ser는 티로신보다 아자티로신을 더욱 효율적으로 도입시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol . Chem., 275:40324 (2000)]을 참조할 수 있다.

비천연 아미노산을 생체 내 단백질에 도입하는 또 다른 전략은 교정 기전을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별 능력이 없기 때문에 동족성 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 별도의 한 부위에서 수정되는데, 여기서 tRNA의 충전이 잘못된(mischarged) 아미노산을 탈아실화시켜 단백질 번역의 충실도를 유지하게 된다. 상기 합성효소의 교정 활성이 망가진 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing)되는 기능을 피해서 도입될 수 있다. 이러한 접근 방법은 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 사용하여 최근에 입증되었다. 문헌 [V. Doring, H.D. Mootz, L.A. Nangle, T.L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 사용하여 tRNAVal에 대한 아미노아실화를 잘못 수행할 수 있고, 이러한 비동족성 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 대장균 염색체의 무작위 돌연변이 유발 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 대장균 균주를 선택하였다. 이러한 수정 과정이 결손된 ValRS는 tRNAVal을 Cys로 올바르지 않게 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH₃로 대체됨), 이러한 돌연변이체 대장균 균주가 Abu의 존재 하에서 성장하는 경우에 돌연변이체 ValRS도 Abu를 단백질에 도입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린 중 약 24%가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법으로도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있다. 예를 들어, 하기와 같은 간행물 및 이러한 간행물에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌 [Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961)], [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am . Chem ., 88(24):5914-5919 (1966)], [Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc . Chem . Res ., 47-54 (1989)], [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J. Am . Chem . Soc ., 109:3808-3810 (1987)], [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone - engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992)], [Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem ., 11(3):255-301 (1981)], [Offord, R.E. Protein engineering by chemical means ? Protein Eng ., 1(3):151-157 (1987)] 및 [Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)].

화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오타이드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관 내의 단백질에 도입시키는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence - specific single - stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987)], [Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985)], [Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)], [Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol - subtilisin, J. Biol . Chem ., 243(24):6392-6401 (1968)], [Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site . Thiol - subtilisin. J. Am. Chem . Soc ., 88:3153-3154 (1966)] 및 [Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.

다르게는, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법이 수개의 생체물리적 프로브를 시험관 내 합성된 단백질에 도입시키기 위해 사용되어 왔다. 하기와 같은 간행물 및 이 간행물에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌 [Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993)] 및 [Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22):8604-8608 (1986)].

종래에, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자가 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 첨가함으로써, 비천연 아미노산이 시험관 내의 단백질에 부위 특이적으로 도입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근 방법을 이용한다면, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용해 일반적인 20개의 아미노산을 다수를 구조적으로 근접한 동족체로 치환할 수 있는데, 예를 들어 페닐알라닌의 경우에는 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244:182-188 (1989)], [M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)], [Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site - specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)], [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)], [Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site - specifically into proteins, Methods in Enz ., vol.202, 301-336 (1992)] 및 [Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.

예를 들어, 억제제 tRNA는 정지 코돈 UAG를 인식하도록 제조하여, 비천연 아미노산을 사용하여 화학적으로 아미노아실화하였다. 통상적인 특정 부위 돌연변이 유발법을 사용하여 단백질 유전자의 해당 부위에 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, 문헌 [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate - based olignoucleotide - directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제제 tRNA와 돌연변이체 유전자가 시험관 내 전사/번역 시스템에서 결합된 경우, 특정 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대응하여 비천연 아미노산을 도입하였다. [³H]-Phe를 사용한 실험과 α-히드록시산을 사용한 실험으로, 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에 도입되며, 단백질 내에 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 점이 입증되었다. 예를 들어, 문헌 [Noren, et al., 상기와 동일], [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432] 및 [Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site - specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.

tRNA는 이에 제한되지는 않지만, 화학적 아미노아실화 또는 효소적 아미노아실화를 비롯한 임의의 방법 또는 기법들을 사용하여 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.

아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해, 또는 다른 효소 분자, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 리보자임에 의해 수행될 수 있다. "리보자임"이라는 용어는 "촉매 RNA"와 상호교환되어 사용된다. 체크(Cech)와 그의 공동 연구자들(문헌 [Cech, 1987, Science, 236:1532-1539], [McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226])은 촉매로 작용할 수 있는 천연 발생 RNA(리보자임)의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매가 분해 및 스플라이싱을 위해 리보핵산 기질에 작용한다는 사실만이 입증되었음에도 불구하고, 최근 리보자임의 인공적 개발의 진전은 다양한 화학 반응에 대한 촉매 작용의 범위를 확장시켰다. 많은 연구들은 자신의 (2')3'-말단 상에 아미노아실-RNA 결합을 촉진시킬 수 있는 RNA 분자(문헌 [Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647] 참조)와 하나의 RNA 분자로부터 또 다른 RNA 분자로 아미노산을 이동시킬 수 있는 RNA 분자를 동정하였다(문헌 [Lohse et al, 1996, Nature 381:442-444] 참조).

미국특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참조로 포함됨)는 리보자임을 구축하는 방법 및 천연적으로 코딩된 아미노산과 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서 이들의 용도에 대해 기술하고 있다. 이에 제한되지는 않으나, 리보자임을 비롯하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있는 기질 고정형 효소 분자들은 아미노아실화 생성물의 효율적인 친화성 정제를 가능케 할 수 있다. 기질의 적절한 예로서는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 기질 고정형 리보자임의 제조와 그 사용에 대해서는 문헌 [Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

화학적 아미노아실화 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 아미노아실화에서 합성효소의 사용을 피하기 위하여, 헤흐트(Hecht)와 그의 공동 연구자들에 의해 소개된 방법들(문헌 [Hecht, S.M, Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545], [Heckler, T.G.; Roesser, J.R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7254], [Hecht, S.M.; Alford, B.L.; Kuroda, Y.; Kitano, S.J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517] 참조)과 슐츠(Schultz), 챔버린(Chamberlin), 도허티(Dougherty) 등에 의해 소개된 방법들(문헌 [Cornish, V.W.; Mendel, D.; Schultz, P.G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621], [Robertson, S.A.; Ellman, J.A.; Schultz, P.G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722], [Noren, C.J.; Anthony-Cahill, S.J.; Griffith, M.C; Schultz, P.G. Science 1989, 244, 182], [Bain, J.D.; Glabe, C.G.; Dix, T.A.; Chamberlin, A.R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013], [Bain, J.D. et al., Nature 1992, 356, 537], [Gallivan, J.P.; Lester, H.A.; Dougherty, D.A. Chem. Biol. 1997, 4, 740], [Turcatti, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991], [Nowak, M.W. et al., Science, 1995, 268, 439], [Saks, M.E. et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169], [Hohsaka, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34] 참조)(이들 문헌은 본원에 참조로 포함됨)을 포함한다. 이러한 방법들 또는 다른 화학적 아미노아실화 방법들은 tRNA 분자를 아미노아실화하는데 사용될 수 있다.

촉매 RNA를 제조하는 방법은 무작위로 뽑은 리보자임 서열들의 별도 집합체를 만드는 단계, 상기 집합체에 대해 방향적 진화(directed evolution)를 수행하는 단계, 바람직한 아미노아실화 활성에 대해 상기 집합체를 스크리닝하는 단계 및 바람직한 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선별하는 단계를 수반할 수 있다.

리보자임은 아실화 작용을 촉진하는 모티프 및/또는 영역, 예컨대 GGU 모티프 및 U-풍부 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, U-풍부 영역이 아미노산 기질의 인지를 촉진할 수 있고, GGU 모티프가 tRNA의 3' 말단에 염기쌍을 형성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 복합적으로, GGU 모티프와 U-풍부 영역은 아미노산과 tRNA 양자 모두의 동시적 인지를 용이하게 하여, tRNA 3' 말단의 아미노아실화를 촉진시킨다.

리보자임은 tRNA^Asn _CCCG와 접합된 부분 무작위 추출된 r24mini를 사용하여 시험관 내에서 선별한 후, 활성 클론에서 발견되는 공통 서열을 전반적으로 조작함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법으로 수득되는 예시적인 리보자임은 "Fx3 리보자임"이라 지칭하며, 이는 본원에 참고로 포함되는 미국특허 출원 공보 제2003/0228593호에 기술되어 있으며, 이 리보자임은 동족체 비천연 아미노산으로 충전된 다양한 아미노아실-tRNA의 합성을 위한 다용도의 촉매로서 작용한다.

기질 상 고정화를 통해 아미노아실화된 tRNA의 친화성 정제를 효율적으로 수행할 수 있다. 적절한 기질의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용하여 수지 상에 고정될 수 있는데, 예컨대 RNA의 리보스 상에 3'-cis-디올은 과요오드로 산화되어 해당 디알데히드를 만들어 내기 때문에 수지 상에 RNA의 고정화를 용이하게 할 수 있는 것이다. 환원성 아민화가 수지와 리보자임 간의 상호작용을 비가역적 결합으로 만드는 저가의 히드라지드 수지를 비롯해서, 다양한 유형의 수지들을 사용할 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 이러한 컬럼 상 아미노아실화 기법에 의해 현저하게 촉진될 수 있다. 문헌 [Kourouklis et al., Methods 2005; 36:239-4]은 컬럼 기반의 아미노아실화 시스템에 대해 기술하고 있다.

아미노아실화 tRNA의 단리는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 적절한 한 방법은 10 mM EDTA가 포함된 아세트산나트륨 용액, 50 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl, 10 mM EDTA (pH 7.0)을 포함하는 완충액, 또는 단순한 EDTA 완충수(pH 7.0)와 같은 버퍼를 이용하여 컬럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용출시키는 것이다.

번역 반응에 의해 만들어진 폴리펩타이드 내에 선택된 위치에 tRNA를 아미노아실화시킨 아미노산을 도입하기 위해서, 아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 세포 용해물을 포함한다. 세포 용출물은 투입한 mRNA의 폴리펩타이드의 시험관 내 번역을 위해 필요한 반응 성분들을 제공한다. 이러한 반응 성분들의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 리보솜 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 인자와 신장 인자 그리고 번역과 관련된 추가적인 인자들을 포함한다. 추가로, 번역 시스템은 일괄 번역 시스템 또는 구분된 번역 시스템일 수 있다. 일괄 번역 시스템은 하나의 구획에서 반응 성분들을 혼합하는 반면, 구분된 번역 시스템은 번역 효율성에 방해가 될 수 있는 반응 생성물의 번역 반응 성분들을 분리해 낸다. 이러한 번역 시스템들은 시판되고 있다.

또한, 전사/번역이 커플링된 시스템도 사용될 수 있다. 전사/번역 커플링 시스템은 투입된 DNA가 해당 mRNA로 전사되어, 이것이 결과적으로 반응 성분들에 의해 번역되도록 해준다. 시판되고 있는 전사/번역 커플링된 시스템의 예로서는 래피드 트랜스레이션 시스템(Rapid Translation System, RTS)(로슈 인코포레이티드)을 들 수 있다. 상기 시스템은 리보솜 및 번역 인자들과 같은 번역 성분을 제공하기 위한 대장균 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 덧붙여, 투입된 DNA를 번역에쓰이는 mRNA 주형으로 전사시키기 위해서 RNA 중합효소가 포함된다. RTS는 반응 구획들, 예컨대 공급/배출 구획 및 전사/번역 구획 간에 게재된 막을 이용하여 반응 성분들을 구분할 수 있다.

tRNA의 아미노아실화는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 전이효소, 중합효소, 촉매 항체, 다작용성 단백질 등을 비롯한 기타의 제제에 의해 수행될 수 있다.

문헌 [Stephan in Scientist 2005 Oct 10;pages 30-33]은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 도입하는 추가적인 방법들에 대해 기술하고 있다. 문헌 [Lu et al., in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]은 단백질이 비천연 아미노산을 포함하는 합성 펩타이드에 화학적으로 결찰되는 방법(단백질 결찰로 표현됨)에 대해 기술하고 있다.

또한, 미량 주사 기법이 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는데 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [M.W. Nowak, P.C. Kearney, J.R. Sampson, M.E. Saks, C.G. Labarca, S.K. Silverman, W.G. Zhong, J. Thorson, J.N. Abelson, N. Davidson, P.G. Schultz, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Science, 268:439 (1995)] 및 [D.A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:645 (2000)]을 참조할 수 있다. 시험관 내 제조된 2개의 RNA 종(해당 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제제 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 함께 주사하였다. 이렇게 하면, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에 비천연 아미노산을 삽입시키게 된다. 이러한 방법으로 인해, 일반적으로 시험관 내 발현 시스템을 따르지 않는 내재성 막 단백질의 생체 내 구조-기능 연구 수행이 가능하게 되었다. 이러한 연구 수행의 예로서는, 형광 공명 에너지 전이에 의한 거리를 측정하기 위해 형광 아미노산을 타치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체에 도입한 것(예를 들어, 문헌 [G. Turcatti, K. Nemeth, M.D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol . Chem ., 271:19991 (1996)] 참조), 이온 채널 내에 표면 노출된 잔기들을 확인하기 위해 비오틴이 부착된 아미노산을 도입한 것(예를 들어, 문헌 [J.P. Gallivan, H.A. Lester and D.A. Dougherty, Chem . Biol ., 4:739 (1997)] 참조); 이온 채널에서 실시간으로 형태 변화를 모니터링하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용한 것(예를 들어, 문헌 [J.C. Miller, S.K. Silverman, P.M. England, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Neuron, 20:619 (1998)] 참조)과 통문(gating) 기작 탐침을 위한 이온 채널 백본을 변화시키는데 α-히드록시 아미노산을 사용한 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [P.M. England, Y. Zhang, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Cell, 96:89 (1999)], [T. Lu, A.Y. Ting, J. Mainland, L.Y. Jan, P.G. Schultz and J. Yang, Nat . Neurosci ., 4:239 (2001)]을 참조할 수 있다.

생체 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 직접 도입시킬 수 있다면, 광범위하게 다양한 이점들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 높은 수율의 돌연변이체 단백질, 기술적 용이성, 세포 또는 살아있는 유기체에서 돌연변이체 단백질 연구를 할 수 있는 잠재성 및 이러한 돌연변이체 단백질의 치료용 및 진단용으로의 사용의 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킬 수 있다면, 단백질의 구조를 합리적이고 체계적으로 조작할 수 있는 역량을 크게 확장시킬 수 있어, 단백질 기능을 살펴서 새로운 특성을 갖는 신규한 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있게 된다.

파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하려는 한 시도로서, 효모 앰버 억제제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성인 Phe 영양요구성 대장균 균주에서 사용하였다. 예를 들어, 문헌 [R. Furter, Protein Sci . 7:419 (1998)]을 참조할 수 있다.

또한, 무세포(시험관 내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 bG-CSF 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 것도 가능하다. 번역 시스템은 세포성 또는 무세포성일 수 있으며, 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있다. 세포성 번역 시스템은, 이에 제한되지는 않지만, 원하는 핵산 서열이 mRNA로 전사되어 mRNA가 번역할 수 있는 것인 전세포 조제용 물질, 예컨대 투과가능하게 처리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 무세포 번역 시스템은 시판되고 있으며 다양한 서로 다른 유형의 시스템들이 잘 알려져 있다. 무세포 시스템의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 원핵 세포 용해물, 예컨대 대장균 용해물, 그리고 진핵 세포 용해물, 예컨대 맥아 추출물, 곤충 세포 용해물, 래빗 망상 적혈구 용해물, 래빗 난모세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함한다. 진핵 세포 추출물 또는 용해물은 생성되는 단백질이 글리코실화, 인산화 또는 다르게 변형되는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 다양한 이런 변형들은 진핵 세포 시스템에서만 가능하기 때문이다. 일부 이러한 추출물과 용해물들은 시판된다[미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega); 미국 캘리포니아주 라호야 소재의 스트라타진; 미국 일리노이주 알링톤 하이츠 소재의 아머샴(Amersham); 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 GIBCO/BRL]. 분비 단백질의 번역을 위해 유용한 막 추출물, 예컨대 마이크로솜 막을 함유하는 개의 췌장 추출물도 시판되고 있다. 주형으로서 mRNA(시험관 내 번역) 또는 주형으로서 DNA(시험관 내 전사 및 번역이 결합됨)를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관 내 합성은 리보솜에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechraology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)], [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)], [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)], [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999)] 및 [Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)], 미국특허 제6,337,191호; 미국특허 공보 제2002/0081660호; WO 00/55353, WO 90/05785를 참조할 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 접근 방법으로서는 mRNA-펩타이드 융합 기법을 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [R. Roberts and J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci . (USA) 94:12297-12302 (1997)], [A. Frankel, et al ., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이러한 접근 방법에서는, 퓨로마이신(puromycin)에 결합된 mRNA 주형이 리보솜 상에서 펩타이드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자들이 변형된 경우, 비천연 아미노산도 역시 펩타이드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후에는, 퓨로마이신이 펩타이드의 C-말단을 포획하게 된다. 생성되는 mRNA-펩타이드 접합체가 시험관 내 분석시험에서 흥미있는 성질을 갖는 것으로 발견되는 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이러한 방식으로, 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩타이드를 동정할 수 있다. 보다 최근에는, 정제된 성분들을 사용한 시험관 내 리보솜 번역이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩타이드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [A. Forster et al ., Proc . Natl Acad . Sci . (USA) 100:6353 (2003)]을 참조할 수 있다.

재구성된 번역 시스템도 사용될 수 있다. 정제된 번역 인자들의 혼합물도 mRNA를 단백질로 번역하는데 있어서 성공적으로 사용되어 왔으며, 용해물의 혼합물 또는 정제된 번역 인자들, 예컨대 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자로 보충된 용해물도 그러하다. 무세포 시스템도 전자/번역 시스템에 커플링될 수 있어, 여기서 DNA가 시스템에 도입되고, mRNA로 전사되며 이 mRNA는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., editors, Wiley interscience, 1993)](본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이 번역된다. 진핵 세포 전사 시스템에서 전사된 RNA는, 이핵성 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리의 성숙한 mRNA의 형태일 수 있으며, 이는 특정 번역 시스템에서 장점이 될 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA들은 망상 적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.

IX . bG - CSF 폴리펩타이드에 커플링된 거대분자 중합체

본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략들을 사용하여 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩타이드에 대해 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 폴리펩타이드의 비천연 아미노산 성분에 추가의 작용기를 도입하는 단계를 포함하는데, 여기서 추가의 작용기로서는, 이에 제한되지는 않지만, 히드록시알킬 전분(HAS), 히드록시에틸 전분(HES), 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 들 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략의 실례가 되는 비제한적인 예로서, 하기의 상세한 설명은 비천연 아미노산 폴리펩타이드에 거대분자 중합체를 첨가하는 것에 초점을 맞출 것이지만, 거기에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략 또한 앞서 나열한 것들을 비롯한 다른 작용기들을 첨가하는 데에도 적용될 수 있다(필요에 따라, 당업자가 본 명세서의 개시내용을 이용하여 실시할 수 있는 적절한 변형 사용을 의미함).

매우 다양한 거대분자 중합체와 다른 분자들이 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합하여 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 성질을 조절하고/조절하거나 bG-CSF 분자에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산으로 된 임의의 작용성 치환체, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환체 또는 작용기를 통해 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 중합체의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

본 발명은 중합체:단백질 접합체로 된 실질적으로 균질한 조제용 물질을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 균질한"이라는 용어는 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질 중 절반 이상으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본원에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드 조제물이란 것은, 균질한 조제용 물질의 이점, 예를 들어, 로트 간(lot to lot) 약동학 예측성에 대해 임상적으로 적용하기 용이한 특성을 나타내기에 충분히 균질한 것들을 말한다.

또한, 중합체:단백질 접합체 분자들의 혼합물을 제조하는 것도 선택할 수 있으며, 본 명세서에 제공되는 이점으로서는 혼합물 중에 포함되는 단일중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 점이다. 따라서, 필요하다면, 다양한 수로 부착된 중합체 부분(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)을 갖는 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있으며, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 단일중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 혼합할 수 있고, 미리 결정된 비율의 단일중합체:단백질 접합체와 혼합물을 형성할 수도 있다.

선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 조제물의 치료적 용도를 위해서는, 중합체는 약학적으로 허용되는 것이어야 할 것이다.

중합체의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시 캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 이의 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 폴리에틸렌글리콜 즉 PEG로도 알려짐); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩타이드 서열; 폴리사카라이드 및 이들의 유도체, 예컨대 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알긴산 염류; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 이의 공중합체; 이의 삼량체; 이의 혼합물; 히드록시알킬 전분(HAS), 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록시에틸 전분(HES) 및 상기한 것들의 유도체를 포함한다.

단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그들의 농도에 따라 변하게 될 것이다. 일반적으로, 최적 비율(미반응 단백질 또는 중합체가 최소의 초과량으로 존재하여, 반응 효율의 관점에서 최적의 비율이라고 칭함)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 따라 결정될 수 있다. 분자량에 있어서, 보통 중합체의 분자량이 크면 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적어진다. 이와 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우에는 중합체의 분지화 상태를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 크면 클수록(또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비율이 높아진다.

본 명세서에서 PEG:bG-CSF 폴리펩타이드 접합체를 고려하는 경우, "치료 유효량"이라는 용어는 환자에게 바람직한 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 이러한 양은 개인에 따라 달라지며, 환자의 전반적인 신체 조건 및 치료될 질환의 근본적인 원인을 비롯한 다수의 요인들에 좌우될 것이다. 치료를 위해 사용되는 bG-CSF 폴리펩타이드의 양은 허용되는 변화 비율을 제공하여, 이익이 되는 수준에서 원하는 반응을 유지하게 된다. 본 발명의 조성물의 치료 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질과 절차를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.

수용성 중합체는 이에 제한되지는 않지만, 선형, 포크형 또는 분지형을 비롯한 임의의 구조 형태일 수 있다. 보통, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예로써, PEG가 본 발명의 특정한 실시 양태를 기술하는 데 사용한다.

PEG는 시판되거나, 또는 당업자에게 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 잘 알려진 수용성 중합체이다(문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol.3, pages 138-161] 참조). "PEG"라는 용어는 크기 또는 PEG 말단의 변형과는 상관없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 망라하는 것으로 광범위하게 사용되며, bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된 것으로서는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

상기 식 중,

n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 말단 변형물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, C₁ _-4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기이다.

어떤 경우에는, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH₃임)를 갖는 한 말단으로 종결된다("메톡시 PEG"). 다르게는, PEG는 반응성 기로 종결되어 이작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기로서는, 20개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 흔히 사용되는 반응성 기[예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함함] 뿐만 아니라 20개의 일반 아미노산에 대해서는 불활성이지만 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적인 작용기(아지드기, 알킨기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식 중에서 Y로 도시되는 PEG의 나머지 한 말단이 천연 발생 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 bG-CSF 폴리펩타이드에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 사실은 주목할 만하다. 예를 들어, Y는 폴리펩타이드의 아민기(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 리신의 ε-아민 또는 N-말단을 포함함)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 다르게는, Y는 티올기(시스테인의 티올 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 다르게는, Y는 20개의 일반 아미노산을 통해 통상적으로 접근가능하지 않은 잔기에 대한 결합일 수 있다. 예를 들어, PEG 상의 아지드기는 bG-CSF 폴리펩타이드 상의 알킨기와 반응하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가 생성물을 형성할 수 있다. 다르게는, PEG 상의 알킨기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하며 이에 한정되지 않음)은 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 일부 가능한 경우에는 적절한 환원제의 처리에 의해 추가로 환원될 수 있다. 다르게는, 강한 친핵성 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 bG-CSF 폴리펩타이드로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다.

PEG의 분자 질량은 실제 바람직한 대로 임의의 질량, 약 100 달톤 (Da) 내지 100,000 Da 또는 그 이상 바람직한 질량대로(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 때로 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함함) 사용될 수 있다. PEG의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 분지형 사슬 PEG, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 각각의 사슬이 1-100 kDa(1-50 kDa 또는 5-20 kDa을 포함하며 이에 한정되지 않음) 범위의 MW를 갖는 PEG 분자도 사용할 수 있다. 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 광범위한 범위의 PEG 분자는 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers, Inc.)의 카달로그, 넥타 써레퓨틱스(Nektar Therapeutics)의 카달로그(본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응을 위해서 이용가능하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 PEG를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시키는데 사용될 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 통상적으로 알킨 부분을 포함하여 [3 + 2] 시클로 부가 생성물을 형성하거나, 또는 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 포함하여 아미드 결합을 형성하게 될 것이다. 다르게는, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 통상적으로 아지드 부분을 포함하여 [3 + 2] 휘스겐 시클로 부가 생성물을 형성하게 될 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 하기 친핵성 물질에 대응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성시키기 위하여 통상적으로 강력한 친핵성 물질(히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 작용가를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함할 것이다. 기타의 대안으로, 상기 기술한 반응성 기의 역방향을 사용할 수 있는데, 즉 비천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 포함하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체를 갖는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 작용기와 반응성을 갖는 화학적 작용기를 함유한다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 백본을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 백본은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 광범위하게 다양한 수용성 중합체들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리(에틸렌) 글리콜 및 기타 관련 중합체, 예컨대 폴리(덱스트란)과 폴리(프로필렌 글리콜)도 본 발명의 실시에 있어 사용하기에 적합하고, PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)이라는 용어의 사용은 이러한 모든 분자를 망라하여 포함하려는 의도라는 점에 대한 이해가 있어야 한다. PEG라는 용어는 이에 제한되지는 않지만, 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜), 예컨대 이작용성 PEG, 다중 아암형(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG(즉, 중합체 백본에 펜던트된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 분해가능한 결합을 안에 포함하고 있는 PEG를 포함한다.

PEG는 보통 투명하고, 무색이며, 무취이고, 수용성이며, 열에 안정하고, 여러 화학적 제제에 대해 불활성이며, 가수분해가 된다거나 또는 약화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체 적합성이 있는 것으로 간주되는데, 이는 즉 PEG가 유해를 가하지 않으면서 생체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다는 말이다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성인데, 이는 즉 PEG가 체내에서 면역 반응을 일으키는 경향이 없다는 것을 의미한다. PEG가 체내에서 바람직한 기능을 갖는 어떤 분자, 예컨대 생물학적 활성제에 부착된 경우에는, 이러한 제제를 차폐시키는 경향이 있어, 유기체가 이러한 제제의 존재를 견뎌낼 수 있도록 임의로 면역 반응을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 또는 응고되거나 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 야기하는 경향을 없다. 화학식 --CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--(여기서, n은 약 3 내지 약 4000, 통상 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 분자량을 갖는 PEG가 본 발명의 일부 실시 양태에 있어서 중합체 백본으로서 특히 유용하다. PEG의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

중합체 백본은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 백본은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 보통, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 이러한 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 사슬을 가진다. PEG는 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥사이드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로서 흔히 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 수개의 아미노산들, 예컨대 리신으로부터 유도될 수도 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)_m [여기서, R은 코어 부분, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유도되며, m은 다수의 암(arm)을 나타냄]과 같은 일반적인 형태로 나타낼 수 있다. 다중 아암형 PEG 분자, 예컨대 미국특허 제5,932,462호 제5,643,575호, 제5,229,490호, 제4,289,872호; 미국특허 출원 제2003/0143596호; WO 96/21469 및 WO 93/21259(이들 문헌은 각각 그 내용 전체가 본원 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 것들도 중합체 백본으로서 사용될 수 있다.

분지형 PEG는 PEG(--YCHZ₂)_n (여기서, Y는 결합기이고, Z는 정해진 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화 말단기임)으로 표현되는 포크형 PEG의 형태로도 존재할 수 있다.

또 다른 분지형 형태인 펜던트 PEG는 PEG 사슬의 말단이 아닌 PEG 백본을 따라서 카르복실기와 같은 반응성 기를 가진다.

이러한 형태의 PEG 이외에도, 중합체는 백본 내에 약한 결합 또는 분해가능한 결합을 사용하여 제조될 수도 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되기 쉬운 중합체 백본 중의 에스테르 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 하기에서 나타낸 것과 같이, 이러한 가수분해는 중합체의 분해를 야기하여 저분자량의 단편들로 분절시킨다.

-PEG-CO₂-PEG- + H₂O → PEG-CO₂H + HO-PEG-

당업자라면 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG라는 용어가 당업계에 공지된 모든 형태, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 본원에 개시된 것들을 포함하는 모든 형태를 나타낸다는 점을 알 수 있을 것이다.

다른 여러 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시 양태에서, 2개 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성인 중합체 백본은 본 발명에서 특히 유용하다. 적절한 중합체의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 이들의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 그들의 삼량체, 이들의 혼합물 등을 포함한다. 중합체 백본의 각 사슬 분자량이 변할 수 있다 하더라도, 이는 보통 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 흔히는 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위이다. 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

당업자라면 수용성 백본에 대해 상기에 열거한 것들이 모든 경우의 수를 기재하고 있는 것은 전혀 아니며 오직 예시를 위한 것이라는 점과, 상기 기술한 특성을 갖는 모든 중합체 물질들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 중합체 유도체는 "다작용성"인데, 이는 중합체 백본이 작용기로 기능화되거나 활성화되는 2개 이상의 말단, 많게는 약 300개의 말단을 가진다는 것을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는, 이에 제한되지는 않지만, 각각의 말단이 동일하거나 서로 다를 수 있는 작용기에 결합되는 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함한다.

한 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기의 구조를 가진다.

X-A-POLY-B-N=N=N

상기 식 중,

N=N=N은 아지드 부분이고,

B는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며,

POLY는 수용성인 비항원성 중합체이고,

A는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, B와 동일하거나 서로 다를 수 있으며,

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 결합 부분의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 18개 이하의 탄소 원자, 1-10개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 알킬기를 포함한다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 알킬 사슬은 헤테로원자 위치에서 분지형이 될 수도 있다. A 및 B에 대한 결합 부분의 다른 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 10개 이하의 탄소 원자, 5-6개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 아릴기를 포함한다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적절한 결합 기의 다른 예로서는 미국특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국특허 출원 공보 제2003/0143596호(이들 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 결합 기를 포함한다. 당업자라면 결합 부분에 대해 상기에 열거한 것들이 모든 경우의 수를 기재하고 있는 것은 전혀 아니며 오직 예시를 위한 것이라는 점과, 상기 기술한 특성을 가지는 모든 결합 부분들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 알 수 있을 것이다.

X로 사용하기 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 포함한다. 당업자라면 알 수 있는 것과 같이, 선택된 X 부분은 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 아지드 기와 양립가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 단일이작용성(제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미함)이거나, 이종이작용성(제2 작용기는 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.

"보호된"이라는 용어는 특정한 반응 조건 하에서 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 부분의 존재를 일컫는다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르소피리딜디설파이드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산이거나, 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본 발명에서 사용될 수 있다.

문헌 중에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로서는, N-숙신이미딜 카르보네이트(예를 들어, 미국특허 제5,281,698호, 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들어, 문헌 [Buckmann et al., Makromol. Chem. 182:1379 (1981)], [Zaplipsky et al., Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)] 참조), 히드라지드(예를 들어, 문헌 [Andresz et al., Makromol. Chem. 179:301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어, 문헌 [Olson et al., in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997] 참조; 또한, 미국특허 제5,672,662호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들어, 문헌 [Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)] 및 [Joppich et al., Makromol. Chem. 180:1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, 미국특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들어, 미국특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들어, 문헌 [Pitha et al., Eur. J Biochem. 94:11 (1979)], [Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들어, 문헌 [Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983)], [Tondelli et al., J. Controlled Release 1:251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들어, 문헌 [Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985)] 및 [Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들어, 문헌 [Harris et al., J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)], 미국특허 제5,824,784호, 미국특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들어, 문헌 [Goodson et al., BioTechnology 8:343 (1990)], [Romani et al., in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)] 및 [Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)] 참조), 오르소피리딜-디설파이드(예를 들어, 문헌 [Woghiren, et al., Bioconj. Chem. 4:314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들어, 문헌 [Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들어, 미국특허 제5,900,461호 참조)을 포함한다. 상기 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 가지는 중합체 백본을 포함한다.

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-N=N=N

상기 식 중,

X는 상기한 바와 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 백본을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

상기 식 중,

W는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고,

n은 약 20 내지 약 4000이며,

X는 상기한 바와 같은 작용기이다. m은 1 내지 10이다.

본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/공지되거나 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적절한 이탈기에 결합된 제2 말단을 가지며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 백본은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 비롯한 임의의 다수의 적절한 상대 이온과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 거쳐 아지드 부분으로 치환되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공하게 된다.

X-PEG-L + N₃ ^- → X-PEG-N₃

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용하기에 적합한 중합체 백본은 화학식 X-PEG-L(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L는 적절한 이탈기임)의 구조를 가진다. 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한하지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 비닐피리딘 및 케톤을 포함한다. 적절한 이탈기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 메실레이트, 트레실레이트 및 토실레이트를 포함한다.

본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 아지드 작용기를 갖는 결합제(여기서, 결합제는 PEG 중합체 상의 화학 작용기와 선택적으로 반응하게 될 화학 작용기를 보유함)를 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 백본과 접촉시켜, 아지드 함유 중합체 유도체 생성물(여기서, 아지드는 결합기에 의해 중합체 백본으로부터 분리됨)을 형성하게 된다.

예시적인 반응식은 다음과 같이 도시된다.

X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 기, 예컨대 알콕시 또는 상기에 기술한 것과 같은 작용기이고,

M은 아지드 작용기와 반응하지는 않지만 N 작용기와는 유효하게 선택적으로 반응하는 작용기이다.

적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, N이 아민인 경우 M은 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르이고; N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우 M은 케톤이며; N이 친핵성 물질인 경우 M은 이탈기인 예들을 포함한다.

미정제 생성물의 정제는 공지된 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피를 수행하는 방법 등으로 수행될 수 있다.

보다 구체적인 예로서는 하기에 PEG 디아민의 경우에 나타내었는데, 여기서 아민들 중 하나는 보호기 부분, 예컨대 tert-부틸-Boc에 의해 보호되며, 생성되는 단일-보호된 PEG 디아민은 아지드 작용기를 보유하는 결합 부분과 반응한다.

BocHN-PEG-NH₂ + H0₂C-(CH₂)₃-N=N=N

이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예컨대 염화티오닐 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어, 모노아민 PEG 유도체와 아지드 함유 링커 부분 사이에 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아미드 결합이 성공적으로 형성된 후, 생성되는 N-tert-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체는 생체 활성 분자를 변형시키는데 직접사용될 수 있고, 또는 다른 유용한 작용기가 자리를 잡도록 추가로 정교하게 가공될 수 있다. 예를 들어, N-t-Boc 기는 강산 처리로 가수분해되어 ω-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성되는 아민은 중요한 이종이작용성 시약의 생성을 위한 다른 유용한 작용기, 예컨대 말레이미드기, 활성화된 디설파이드, 활성화된 에스테르 등이 자리를 잡도록 해주는 합성 핸들(synthetic handle)로서 사용될 수 있다.

중합체 각 말단에 서로 다른 분자들을 부착시키는 것이 바람직한 경우, 이종이작용성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들어, ω-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자가 PEG의 한 말단에 부착되는 것을 가능하게 하며, 아세틸렌기를 갖는 분자가 PEG의 나머지 다른 말단에 부착되는 것을 가능케 한다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 가진다.

X-A-POLY-B-C≡C-R

상기 식 중,

R은 H이거나 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시이거나, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고,

B는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며,

POLY는 수용성인 비항원성 중합체이고,

A는 결합 부분으로서, 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, B와 동일하거나 서로 다를 수 있으며,

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 결합 부분의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 18개 이하의 탄소 원자, 1-10개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 알킬기를 포함한다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 알킬 사슬은 헤테로원자 위치에서 분지형이 될 수도 있다. A 및 B에 대한 결합 부분의 다른 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 10개 이하의 탄소 원자, 5-6개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 아릴기를 포함한다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적절한 결합 기의 다른 예로서는 미국특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국특허 출원 공보 제2003/0143596호(이들 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 결합 기를 포함한다. 당업자라면 결합 부분에 대해 상기에 열거한 것들이 모든 경우의 수를 기재하고 있는 것은 결코 아니며 오직 예시를 위한 것이라는 점과, 상기 기술한 특성을 갖는 모든 결합 부분들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 알 수 있을 것이다.

X로 사용하기 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아세틸렌을 포함한다. 당업자라면 알 수 있는 것과 같이, 선택된 X 부분은 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 아세틸렌 기와 양립가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 단일이작용성(제2 작용기(즉, X)도 아세틸렌 부분인 것을 의미함)이거나, 이종이작용성(제2 작용기는 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 백본을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-0-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식 중,

X는 상기 기술된 것과 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이며,

m은 1 내지 10이다.

각각의 이종이작용성 PEG 중합체의 구체적인 예는 하기에 나타내는 바와 같다.

본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/공지되거나 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적절한 친핵성 기에 결합된 제2 말단을 가지며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 백본은 아세틸렌 작용기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기에 적합한 이탈기 양자 모두를 보유하는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 보유하는 PEG 중합체 및 이탈기를 보유하는 분자가 혼합되는 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 거쳐 친핵성 부분으로 치환되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공하게 된다.

X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'

상기에 나타낸 바와 같이, 반응에 사용하기 바람직한 중합체 백본은 화학식 X-PEG-Nu[여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이며, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 작용기와 반응하지 않는 작용기임]를 가진다.

Nu의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 주로 SN2 유형의 기작에 의해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 설프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기들을 포함한다. Nu 기의 추가적인 예로서는 주로 친핵성 부가 반응을 통해 반응하는 작용기들을 포함한다. L 기의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 및 친핵성 치환을 거칠 것으로 예상되는 기타의 기들뿐만 아니라 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, α-β 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 첨가를 거칠 것으로 예상되는 기타의 친전자성 기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, A는 1-10 개 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14 개 탄소 원자의 치환된 아릴 고리이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L은 적절한 이탈기이다.

본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 한 말단에는 보호된 작용기 또는 캡핑제를 보유하고, 나머지 다른 한 말단에는 적절한 이탈기를 보유하며, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체를 아세틸렌 음이온과 접촉시킨다.

예시적인 반응식은 다음과 같이 도시된다.

X-PEG-L + -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 기, 예컨대 알콕시 또는 상기 기술한 것과 같은 작용기이며,

R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시기 또는 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시기이다.

상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우 SN2 유형의 치환을 거치도록 충분히 반응성이 있어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는 데 필요로 하는 반응 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

수용성 중합체는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 수용성 중합체는 bG-CSF 폴리펩타이드에 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환체, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환체를 통해 결합될 수 있다. 다르게는, 수용성 중합체는 천연 발생 아미노산(시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민기를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하려는 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된다. 일부의 경우, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 비천연 아미노산을 포함하는데, 여기서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)이 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 올리고사카라이드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 결합된다. 일부의 경우, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 수용성 중합체에 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 더 포함한다. 일부의 경우, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 접합되지 않은 형태에 비하여 bG-CSF 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 향상시킨다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화의 정도)는 변화된(증가되거나 또는 감소되는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예컨대 생체 내 반감기를 제공기 위해 조절될 수 있다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF의 반감기는 변형되지 않은 폴리펩타이드에 비하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11 배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 약 100배 이상 증가된다.

강한 친핵성 기(즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 )를 함유하는 PEG 유도체

본 발명의 한 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 PEG 백본에 직접 결합된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

일부 실시 양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.

일부 실시 양태에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 아미드 결합에 의해 PEG 백본에 결합되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-CO-(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 사슬은 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있는 MW를 가진다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 히드라진-말단 PEG 유도체 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

일부 실시 양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 NH, 0, S, C(O)일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있으며, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.

일부 실시 양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

수용성 중합체(들)이 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합되는 정도와 부위로 bG-CSF 폴리펩타이드 수용체에 대한 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 결합은 bG-CSF 폴리펩타이드가 문헌 [Spencer et al ., J. Biol . Chem ., 263:7862-7867 (1988)]에 기술된 바와 같이 평형 결합 분석시험으로 측정시, 약 400 nM 이하의 K_d, 150 nM 이하의 K_d, 그리고 일부의 경우 100 nM 이하의 K_d로 bG-CSF 폴리펩타이드 수용체와 결합하도록 배열된다.

중합체의 활성화뿐만 아니라 펩타이드의 접합 방법과 화학 작용에 대해서는 문헌에 기술되어 있으며, 당업계에도 공지되어 있다. 흔히 사용되는 중합체의 활성화 방법으로서는, 이에 제한되지는 않으나, 브롬화 시아노겐, 과요오드, 글루타르알데히드, 바이에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐설폰, 카르보디이미드, 설포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 방법을 포함한다(문헌 [R.F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.], [S.S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton], [G.T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.], [Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991] 참조).

PEG의 작용화 및 콘쥬게이션(접합)에 대한 수개의 리뷰와 논문들을 참조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harris, Macromol . Chem . Phys . C25:325-373 (1985)], [Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987)], [Wong et al ., Enzyme Microb . Technol . 14:866-874 (1992)], [Delgado et al ., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992)], [Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.

중합체의 활성화 방법에 대해서는 WO 94/17039, 미국특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국특허 제5,219,564호, 미국특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국특허 제5,281,698호, 및 WO 93/15189를 참조할 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 간의 접합의 경우에는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 응집 인자(Coagulation Factor) VIII(WO 94/15625 참조), 헤모글로빈(WO 94/09027 참조), 산소 운반 분자(미국특허 제4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제(ribonuclease) 및 초과산화물(superoxide) 디스뮤타아제(문헌 [Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)] 참조)의 내용에 대해서는 각각의 참조 문헌을 참조한다. 인용된 모든 참고 문헌들과 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 적절한 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, bG-CSF 폴리펩타이드는 알킨-말단 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략하게는, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를, 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 bG-CSF 폴리펩타이드의 수용액에 첨가한다. 통상, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로, 약 pH 4-10) 근방의 pK_a를 갖는 버퍼로 완충된다. pH 7.5에서 PEG화하기에 적절한 버퍼의 예로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, HEPES, 포스페이트, 보레이트, TRIS-HCl, EPPS 및 TES를 포함한다. pH를 연속적으로 모니터링하여 필요에 따라 조절한다. 반응은 보통 약 1-48 시간 동안 지속한다.

이어서, 반응 생성물에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여, PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드의 임의의 고분자량 복합체(차단되지 않은 PEG가 분자의 양 말단에서 활성화되는 경우에 형성될 수 있음) 및 유리된 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH로부터 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 분리시켜, bG-CSF 폴리펩타이드 변이체 분자들을 가교 결합시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 수행시 환경 조건은, 유리된 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를 컬럼을 통해 흘러보내면서, 임의의 가교 결합된 PEG화 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체 복합체를 원하는 형태(하나 이상의 PEG 기에 접합된 하나의 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체 분자를 포함하는 형태)를 따라 용출시키는 것이다. 적절한 환경 조건은 가교 결합된 복합체:원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 다르며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용출액을 한외여과에 의해 농축시키고, 정용여과에 의해 탈염시킨다.

필요하다면, 소수성 크로마토그래피로부터 수득한 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드를 당업자에게 공지된 하나 이상의 절차, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등점 집초법을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도(가용성) 차이를 이용한 방법(황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), 또는 추출을 비롯한 절차를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 표준과의 비교에 의한 GPC를 이용해 추정할 수 있다(문헌 [Prenta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). bG-CSF-PEG 접합체의 순도는 단백질 분해성 분해(트립신 분해를 포함하며 이에 한정되지 않음) 후, 질량 분석법을 이용한 분석시험에 의해 평가될 수 있다. 문헌 [Pepinsky RB., et al ., J. Pharmacol . & Exp . Ther . 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있으며, 이에 제한은 없다.

아지드 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하게 될 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 평균 분자량이 1-100 kDa 범위, 일부 실시 양태에서는 10-40 kDa 범위이다.

일부 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

상기 식 중,

또 다른 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 여기서 이러한 분지형 PEG의 각 사슬의 MW는 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)일 수 있고, 각각의 경우 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

알킨 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 알킬 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

일부 실시 양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식 중,

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 알킨 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는, 아미드 결합에 의해 PEG 백본에 결합된 말단 아지드 부분 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 사슬의 MW는 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_p-C≡CH

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

포스핀 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 될 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 일부 실시 양태에서는, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 가진다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

n은 1-10이고, X는 O, N, S일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

X는 O, N, S일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로서는, 이에 제한되지는 않으나, -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함한다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 제한되지는 않지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 논의한 치환기의 내용으로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한다는 의미를 알 수 있을 것이다.

기타 PEG 유도체 및 일반적인 PEG 화 기법

bG-CSF 폴리펩타이드에 결합될 수 있는 기타 예시적인 PEG 분자들뿐만 아니라 PEG화 방법에 대해서는, 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 공보 2004/0001838: 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; 미국특허 제6,646,110호, 제5,824,778호, 제5,476,653호, 제5,219,564호, 제5,629,384호, 제5,736,625호, 제4,902,502호, 제5,281,698호, 제5,122,614호, 제5,473,034호, 제5,516,673호, 제5,382,657호, 제6,552,167호, 제6,610,281호, 제6,515,100호, 제6,461,603호, 제6,436,386호, 제6,214,966호, 제5,990,237호, 제5,900,461호, 제5,739,208호, 제5,672,662호, 제5,446,090호, 제5,808,096호, 제5,612,460호, 제5,324,844호, 제5,252,714호, 제6,420,339호, 제6,201,072호, 제6,451,346호, 제6,306,821호, 제5,559,213호, 제5,747,646호, 제5,834,594호, 제5,849,860호, 제5,980,948호, 제6,004,573호, 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것들을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 PEG 분자는 임의의 형태, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단일 사슬, 분지형 사슬, 다중 아암형 사슬, 단일작용성, 이작용성, 다작용성 형태 또는 이들을 임의의 조합한 형태로 사용할 수 있다.

추가의 중합체 및 PEG 유도체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록실아민 (아미노옥시) PEG 유도체들은 본원에 그 내용 전체가 참고로 포함되는 하기의 특허 출원들에 기술되어 있다: 미국특허 공보 제2006/0194256호, 미국특허 공보 제2006/0217532호, 미국특허 공보 제2006/0217289호, 미국 가특허출원 제60/755,338호; 미국 가특허출원 제60/755,711호; 미국 가특허출원 제60/755,018호; 국제 특허 출원 PCT/US06/49397; WO 2006/069246; 미국 가특허출원 제60/743,041호; 미국 가특허출원 제60/743,040호; 국제 특허 출원 PCT/US06/47822; 미국 가특허출원 제60/882,819호; 미국 가특허출원 제60/882,500호; 및 미국 가특허출원 제60/870,594호.

이종성 Fc 융합 단백질

상기 기술된 bG-CSF 화합물은 면역글로불린의 Fc 부분에 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해서 융합될 수 있다. 면역글로불린은 보통 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 가지며, 이황화 결합에 의해 함께 뭉친 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 분자이다. 각 사슬에서, 하나의 도메인(V)은 분자의 항체 특이성에 의존하는 가변 아미노산 서열을 가진다. 나머지 하나의 도메인(C)은 동일한 부류의 분자에 공통적인 불변 서열을 가진다.

본원에서, 면역글로불린의 Fc 부분은 면역학 분야의 용어에 통상적으로 주어진 의미를 지닌다. 특히, 이 용어는 항체로부터 2개의 항원 결합 영역(Fab 단편)을 제거하여 수득되는 항체 단편을 지칭한다. Fab 단편을 제거하는 한 방법은 파파인 프로테아제로 면역글로불린을 소화시키는 것이다. 따라서, Fc 부분은 두 중쇄로부터 불변 영역의 단편과 대략 동일한 크기로 형성되며, 이는 비공유 상호작용과 이황화 결합을 통해 결합된다. Fc 부분은 경첩 영역을 포함하여 CH₂ 및 CH₃ 도메인을 통해 항체의 C-말단까지 신장될 수 있다. 인간과 마우스 면역글로불린에 대한 예시적인 경첩 영역에 대해서는 그 교시가 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman and Co., 1992]을 참고할 수 있다. Fc 부분은 하나 이상의 글리코실화 부위를 더 포함할 수 있다. 경첩 영역, CH₂ 및 CH₃ 도메인 및 하나의 N-글리코실화 부위를 포함하는 다양한 예시적인 Fc 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.

서로 다른 효과기 기능과 약동학적 특성을 갖는 5가지 유형의 인간 면역글로불린 Fc 영역이 존재한다: IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE. IgG는 혈청 중에 가장 풍부하게 존재하는 면역글로불린이다. IgG도 임의의 면역글로불린 혈청 중에서 가장 긴 반감기(23일)를 가진다. 다른 면역글로불린과는 달리, IgG는 Fc 수용체에 결합한 후 효율적으로 재순환된다. 서로 다른 효과기 기능을 보유하는 4개의 IgG 하위 부류인 G1, G2, G3 및 G4가 존재한다. G1, G2 및 G3은 Clq에 결합하여 보체를 고정시킬 수 있지만, G4는 그럴 수 없다. G3이 G1보다 더 효율적으로 Clq에 결합할 수 있지만, G1은 보체 주재의 세포 용해를 매개하는데에는 더 효율적이다. G2는 매우 비효율적으로 보체를 고정시킨다. IgG 내의 Clq 결합 부위는 CH₂ 도메인의 카르복시 말단 영역에 위치한다.

모든 IgG 하위 부류는 Fc 수용체(CD 16, CD32, CD64)에 결합할 수 있으며, 그 중 G1과 G3이 G2와 G4 보다 더 효율적이다. IgG의 Fc 수용체 결합 영역은 CH₂ 도메인의 경첩 영역과 카르복시 말단 영역 양자 모두에 위치한 잔기들로 형성된다.

IgA는 J-사슬에 의해 함께 뭉쳐 단량체 또는 이량체 형태 양자 모두의 형태로 존재할 수 있다. IgA는 혈청 중에 두 번째로 풍부한 Ig이긴 하나, 그 반감기는 단 6일밖에 되지 않는다. IgA는 3가지의 효과기 기능을 가지고 있다. 이것은 대식 세포 및 호산구 상의 IgA 특이적 수용체에 결합하여, 각각 식세포 작용과 탈과립화를 유발한다. 이것은 또한 알려지지 않은 대체 경로를 통해 보체를 고정시킬 수도 있다.

IgM은 오량체 또는 육량체로 발현되며, 양자 모두 J-사슬에 의해 결합된다. IgM은 5일의 혈청 반감기를 가진다. 이것은 그의 CH₃ 도메인에 위치한 결합 부위를 통해 Clq에 약하게 결합한다. IgD는 3일의 혈청 반감기를 가진다. 어떤 효과기 기능이 이러한 Ig에 기인하는지는 불분명하다. IgE는 단량체성 Ig이며 2.5일의 혈청 반감기를 가진다. IgE는 탈과립화를 유발하는 2개의 Fc 수용체에 결합하여 염증 유발 인자들의 방출을 야기시킨다.

원하는 생체 내 효과에 따라, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 상기 기술된 임의의 동형을 포함할 수 있거나, 또는 보체 및/또는 Fc 수용체 결합 기능이 변형된 돌연변이화된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 부분 전체, 면역글로불린의 Fc 부분의 단편, 또는 bG-CSF 화합물에 융합된 이의 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 단일 사슬 단백질 또는 다중 사슬 폴리펩타이드로서 이루어질 수 있다. 2개 이상의 Fc 융합 단백질은 이들이 Fc 영역들 간에 자연스레 형성되는 이황화 결합을 통해 상호작용하도록 생성될 수 있다. 이러한 다량체들은 bG-CSF 화합물과 동질한 것일 수 있고, 또는 이들은 융합 단백질의 Fc 부분의 N-말단에서 융합된 서로 다른 bG-CSF 화합물을 포함할 수 있다.

융합 단백질의 최종 구조와는 관계없이, Fc 또는 Fc 유사 영역은 N-말단에서 융합된 bG-CSF 화합물의 생체 내 혈장 반감기를 연장하는데 일조할 수 있다. 또한, 융합 단백질 화합물의 bG-CSF 성분은 bG-CSF의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유해야 한다. 치료 반감기 또는 순환 반감기의 증가는 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 입증될 수 있는데, 여기서 융합 단백질의 반감기는 bG-CSF 화합물의 반감기와 단독으로 비교된다. 생물학적 활성은 당업계에 공지된 시험관 내 방법과 생체 내 방법으로 측정될 수 있다.

단백질 분해에 의해 생성된 IgG의 Fc 영역은, 온전한 IgG 분자와 생체 내 반감기가 동일하고 Fab 단편이 신속하게 분해되기 때문에, 반감기 연장에 관련된 서열은 CH₂ 및/또는 CH₃ 도메인 내에 주재하고 있는 것으로 생각된다. 또한, 문헌에서는 높은 친화성을 갖는 Fc 수용체 또는 Clq와 결합하지 않는 IgG 변이체의 이화 속도가 야생형인 모 항체의 클리어랜스 속도와 별다르지 않다고 밝혀졌는데, 이는 그 이화 부위가 Fc 수용체 또는 Clq 결합과 관련된 부위와는 다르다는 사실을 말해준다(문헌 [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221] 참조). 쥐과의 IgG1 Fc 영역을 이용한 특정 부위 돌연변이 유발 연구는 이화 속도를 조절하는 IgG1 Fc 영역의 부위가 CH₂-CH₃ 도메인 계면에 위치하고 있음을 시사하고 있다. Fc 영역은 융합 단백질의 반감기를 최적화하기 위해 이화 부위에서 변형될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 위해 사용되는 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역으로부터 유도될 수 있으며, 경첩 영역을 포함하는 CH₂ 영역과 CH₃ 영역 모두를 포함할 수 있다.

이종성 알부민 융합 단백질

본 명세서에 기술된 bG-CSF는 직접적으로 또는 펩타이드 링커, 수용성 중합체 또는 프로드러그 링커를 통해 알부민 또는 이의 유사체, 이의 단편 또는 이의 유도체에 융합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 일부분인 알부민 단백질은 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 클로닝된 알부민으로부터 유도될 수 있다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 585개의 아미노산으로 된 단일 비글리코실화 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, 그 구조식 분자량은 66,500이다. 인간 HSA의 아미노산 서열은 공지되어 있다(본원에 참고로 포함되는 문헌 [Meloun, et al., (1975) FEBS Letters 58:136], [Behrens, et al., (1975) Fed. Proc. 34:591], [Lawn, et al., (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114], [Minghetti, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6747] 참조). 알부민의 다양한 다형성 변이체뿐만 아니라 그의 유사체 및 단편들도 기술된 바 있다(문헌 [Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219] 참조). 예를 들어, EP 322,094에서는, 더 짧은 형태의 다양한 HSA가 개시되었다. 이러한 HSA 단편들의 일부, 예컨대 HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369) 및 HSA(1-419) 그리고 1-369 내지 1-419 사이의 단편들이 개시되었다. EP 399,666은 HSA(1-177) 및 HSA(1-200)를 포함하는 알부민 단편들, 그리고 HSA(1-177) 내지 HSA(1-200) 사이의 단편들을 개시하고 있다.

본 발명의 이종성 융합 단백질은 임의의 알부민 단백질(단편, 유사체 및 유도체 포함)에 커플링된 bG-CSF 화합물을 포함하는 것으로 이해해야 하며, 여기서 이러한 융합 단백질은 생물학적으로 활성이고, bG-CSF 화합물 단독일 때보다 혈장 반감기가 더 길다. 따라서, 융합 단백질의 알부민 부분의 혈장 반감기는 반드시 본래 인간 알부민의 혈장 반감기와 동일할 필요는 없다. 단편, 유사체 및 유도체들은 공지되어 있거나, 또는 본래 인간 알부민 및 해당 bG-CSF 화합물의 반감기보다 길게끔 또는 그것의 절반 정도가 되게끔 생성될 수 있다.

본 발명의 이종성 융합 단백질은 bG-CSF 화합물 및/또는 융합 단백질의 Fc 부분 또는 알부민 부분에 보존적 아미노산 치환물을 갖는 단백질을 포함한다. "보존적 치환"이라는 것은 하나의 아미노산을 동일한 알짜 전하 및 대략 동일한 크기와 형태를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 가지는 아미노산은 측쇄에 탄소와 헤테로원자의 총수가 약 4개 정도 밖에 차이가 나지 않는 경우에 대략적으로 동일한 크기를 가진다. 이들은 측쇄에 분지 수가 1개 정도 밖에 차이가 나지 않는 경우에 대략적으로 동일한 형태를 가진다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐기를 갖는 아미노산은 대략 동일한 크기와 형태를 가지는 것으로 간주된다. 본원에 특별하게 달리 제시되지 않는 경우를 제외하고는, 보존적 치환은 천연 발생 아미노산으로 행해지는 것이 바람직하다.

야생형 알부민 및 면역글로불린 단백질은 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질들은 해당 mRNA를 검출가능한 수준으로 발현하는 조직 또는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 라이브러리는 특정 해당 단백질에 대하여 공개된 DNA 또는 단백질 서열을 사용하여 고안된 프로브로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역에 대해서는 문헌 [Adams, et al., (1980) Biochemistry 19: 2711-2719], [Goughet, et al., (1980) Biochemistry 19: 2702-2710], [Dolby, et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031], [Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7862], [Falkner, et al., (1982) Nature 298: 286-288] 및 [Morrison, et al., (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256]에서 기술하고 있다. 알부민 단백질과 DNA 서열을 개시하고 있는 일부 참조 문헌으로는, 문헌 [Meloun, et al., (1975) FEBS Letters 58: 136], [Behrens, et al., (1975) Fed. Proc. 34: 591], [Lawn, et al., (1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114] 및 [Minghetti, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]을 포함한다.

본 발명의 이종성 융합 단백질의 특성 규명

본 발명의 융합 단백질의 특성을 규명하기 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 이러한 방법들 중 일부로서, 이에 제한되지는 않지만, 단백질 염색법과 커플링된 SDS-PAGE 또는 항-IgG 또는 항-HSA 항체를 이용한 면역블롯팅을 포함한다. 기타 방법으로서는, 예를 들어, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전점 집초법, 음이온 교환 분석법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성 분광 분석법을 포함한다.

혈청 알부민에 대한 친화성 강화

다양한 분자들을 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 융합시켜 혈청 중에서 bG-CSF 폴리펩타이드의 반감기를 조절할 수도 있다. 일부 실시 양태에서, 분자들을 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 결합시키거나 융합시켜 동물의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 향상시킨다.

일부의 경우를 예를 들면, bG-CSF 폴리펩타이드와 알부민 결합 서열로 된 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G의 알부민 결합 도메인(예를 들어, 문헌 [Makrides et al ., J. Pharmacol . Exp . Ther . 277:534-542 (1996)] 및 [Sjolander et al ., J, Immunol . Methods 201:115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩타이드(예컨대, 문헌 [Dennis, et al ., J. Biol . Chem . 277:35035-35043 (2002)]에 기재된 것들)를 포함한다.

다른 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 지방산으로 아실화된다. 일부의 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들어, 문헌 [Kurtzhals, et al ., Biochem . J. 312: 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.

다른 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 직접적으로 융합된다. 당업자라면 광범위하게 다양한 다른 분자들 또한 본 발명의 bG-CSF에 결합시켜 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.

X. bG - CSF 폴리펩타이드의 글리코실화

본 발명은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연 물질(N-아세틸글루코사민을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 물질(3-플루오로갈락토스를 포함하며 이에 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-결합 또는 O-결합 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토오스-L-세린을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 결합(옥심 또는 이에 대응하는 C-결합 또는 S-결합 글리코시드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의하여 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합될 수 있다.

사카라이드(글리코실을 포함하며 이에 한정되지 않음) 부분은 생체 내 또는 시험관 내에서 bG-CSF 폴리펩타이드에 부가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 아미노옥시기로 유도체화된 사카라이드를 이용해 변형되어 옥심 결합을 통해 결합된 해당 글리코실화 폴리펩타이드를 생성한다. 사카라이드가 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되면, 당전이효소 및 기타 효소에 의해 추가로 정교하게 처리하여 bG-CSF에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [H. Liu, et al ., J. Am . Chem . Soc . 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는 아미노옥시 유도체로 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸을 사용하여 직접적으로 변형된다. 당업자라면 기타의 작용기, 예컨대 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 사용하여 사카라이드를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킬 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알키닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 각각 알키닐 또는 아지드 유도체와의 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가 반응(이에 제한되지는 않음)에 의해 변형될 수 있다. 이 방법으로 단백질을 매우 높은 선택성을 갖게끔 변형할 수 있다.

XI . bG - CSF 이량체 및 다량체

또한, 본 발명은 bG-CSF 및 bG-CSF 유사체의 조합물, 예컨대 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등)를 제공하는데, 여기서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 bG-CSF는, 직접적으로 폴리펩타이드 백본으로 또는 링커를 통해서, 또 다른 bG-CSF 또는 이의 bG-CSF 변이체, 혹은 bG-CSF 또는 이의 bG-CSF 변이체가 아닌 임의의 다른 폴리펩타이드에 결합된다. bG-CSF 이량체 또는 다량체 접합체는, 단량체에 비해 증가된 분자량 때문에, 단량체성 bG-CSF에 비하여 신규한 또는 바람직한 특성들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 상이한 약리학적 특성, 약동학적 특성, 약력학적 특성, 조절된 치료 반감기, 또는 조절된 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 이량체는 bG-CSF 수용체의 신호 전달을 조절하게 될 것이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 이량체 또는 다량체는 수용체 길항제, 작용제 또는 조절제로서 작용할 것이다.

일부 실시 양태에서, 이량체 또는 다량체를 포함하는 bG-CSF 내에 존재하는 하나 이상의 bG-CSF 분자는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드는 예컨대 이에 제한되지는 않으나, Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 이황화 결합을 통해 직접 결합된다. 일부 실시 양태에서, bG-CSF 폴리펩타이드 및/또는 결합된 bG-CSF 이외의 분자는, 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하여 이합체화를 용이하게 할 것이다(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 제1 bG-CSF 폴리펩타이드 중 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 알킨 및 제2 분자의 제2의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 아지드가 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가를 통해 접합됨). 다르게는, 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 및/또는 결합된 bG-CSF 이외의 분자는, 히드록실아민 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩타이드에 접합될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 이에 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.

다르게는, 2개의 bG-CSF 폴리펩타이드 및/또는 결합된 bG-CSF 이외의 분자는 링커를 통해 결합된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커는, 동일하거나 서로 다른 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 분자 및/또는 결합된 bG-CSF 이외의 분자를 결합시키는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, bG-CSF 및/또는 결합된 bG-CSF 이외의 분자를 함께 구속하는데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다. 링커는 광범위한 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. bG-CSF와 결합된 물질 사이, 또는 bG-CSF와 그의 수용체 사이, 또는 결합된 물질과 그의 결합 파트너 사이(존재하는 경우)에 바람직한 공간 관계 또는 형태를 제공하기 위해서는 분자량이 더 크거나 작은 링커를 사용할 수 있다. 또한, bG-CSF와 결합된 물질 사이, 또는 결합된 물질과 그의 결합 파트너 사이(존재하는 경우)에 바람직한 공간 또는 융통성을 제공하기 위해서 분자 길이가 더 길거나 짧은 링커도 사용할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 아령 구조를 갖는 수용성인 이작용성 링커를 제공한다: a) 중합체 백본의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 적어도 중합체 백본의 제2 말단 상의 제2 작용기. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 서로 다를 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 아암(arm)을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 수용성인 활성화된 중합체와의 반응으로 형성된 하나 이상의 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는 다량체를 제공한다.

R-(CH₂CH₂O)_n-0-(CH₂)_m-X

상기 식 중,

n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2-10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 서로 다를 수 있는 캡핑기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들어, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기일 수 있다.

XII . 수용체에 대한 bG-CSF의 친화성 및 bG - CSF 폴리펩타이드 활성 측정

bG-CSF 폴리펩타이드 활성은 공지되거나 표준인 시험관 내 또는 생체 내 분석시험을 사용하여 측정할 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 적절한 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석시험으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [Hedari et al., Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81: 45-57]에 기술된 것들과 hG-CSF의 생물학적 활성을 평가하는 분석법들을 포함한다.

bG-CSF 폴리펩타이드는 호중구 내에서 CD11a, CD11b, CD11c 및/또는 CD18을 상향조절(수용체의 수를 증가)하는 그 능력에 대해 분석될 수 있다. 이러한 활성의 측정은 문헌[Hedari et al. (상기 참조)]에 기술된 FACS로 측정될 수 있다. 호중구의 활성 정도를 측정하는 것으로서 당업계의 숙련자들에게 공지된 추가의 분석법으로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, L-셀렉틴을 측정하는 분석법을 포함한다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드에 의한 세포 증식 및/또는 분화를 평가하는 다른 분석법들도 수행할 수 있다.

bG-CSF 폴리펩타이드의 수용체에 결합하는 능력에 대해서도 분석할 수 있다. G-CSF 수용체는 당업계의 숙련자들에게 공지된 기법 및 방법들을 이용해 제조될 수 있다. hG-CSF 수용체는 본원에 참고로 포함되는 미국특허 제5,574,136호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, G-CSF에 반응하여 작용하거나 G-CSF와 결합하는 세포 혹은 세포주(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 활성 G-CSF 수용체를 함유하는 세포, 예컨대 재조합체인 G-CSF 수용체 생성 세포)는 bG-CSF 수용체 결합을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 비-PEG화 또는 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드에 대해서는, 바이아코어(BIAcore™) 바이오센서(파마시아)를 이용하여 bG-CSF의 그 수용체에 대한 친화도 또는 다른 G-CSF에 대한 친화도를 측정할 수 있다. 적절한 결합 분석법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 바이아코어 분석법 (문헌 [Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)]) 및 알파스크린(AlphaScreen™) 분석법(퍼킨엘머)을 포함한다. 알파스크린은 680nm 레이저에 의해 공여체 비드(bead)를 여기시켜 단일분자 산소를 방출해내는 비드(bead) 기반의 비방사성 발광 근접 측정법(luminescent proximity assay)이다. 이러한 단일분자 산소가 확산되어 수용체 비드 표면 상의 티옥센 유도체와 반응해 ~600nm의 형광 방출이 이루어지게 된다. 이러한 형광 방출은 공여체 비드와 수용체 비드가 각각 리간드와 수용체에 결합될 때 발생하는 분자 상호작용에 의해 매우 근접하게 되었을 때에만 일어난다. 이러한 리간드-수용체 상호작용은 수용체 결합 변이체를 이용하여 그 작용에 대해 겨룰 수는 있으나 비결합 변이체로는 겨룰 수 없다.

bG-CSF 폴리펩타이드 활성은 공지되거나 표준인 시험관 내 또는 생체 내 분석법들을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, hG-CSF의 존재 하에 증식하거나 hG-CSF와 결합하는 세포 또는 세포주(예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 활성 G-CSF 수용체를 함유하는 세포들, 예로서 마우스 골수 세포, WEHI-3B(D⁺), AML-193(ATCC) 또는 재조합된 G-CSF 수용체 생성 세포)를 사용하여 bG-CSF 수용체 결합을 모니터링할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [King et al., Exp. Hematol. 20: 223 (1992)]; 미국특허 제6,385,505호를 참조한다. hG-CSF 활성을 시험하기 위한 생체 내 동물 모델과 인간 임상 시험은, 예를 들어 미국특허 제6,166,183호; 제6,565,841호; 제6,162,426호; 제5,718,893호(본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 이러한 모델들을 사용하여 bG-CSF 활성을 평가할 수 있다.

본 발명의 bG-CSF 유사체를 생성하는데 어떤 방법을 사용했는지와는 관계없이, 유사체들의 생물학적 활성 분석시험을 행한다. 세포 분열의 정도를 확인하기 위해 삼중 수소화 티미딘 분석시험을 수행할 수 있다. 그러나, 다른 생물학적 분석시험도 원하는 활성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 마우스 WEHI-3B(D⁺) 백혈병 세포주의 말단 분화를 유도하는 능력에 대해 검정하는 것과 같은 생물학적 분석법도 G-CSF 활성에 대한 지시자 역할을 제공할 수 있다. 이에 대해서는 문헌 [Nicola, et al., Blood 54: 614-27 (1979)]을 참조한다. 기타의 다른 시험관 내 분석법도 생물학적 활성을 확인하는데 사용될 수 있다. 이에 대해서는 문헌 [Nicola, Ann. Rev. Biochem. 58: 45-77 (1989)]을 참조한다. 일반적으로, 생물학적 활성 시험은, (변형되지 않은 G-CSF와 비교한) 생물학적 활성의 증가 혹은 감소, (변형되지 않은 G-CSF와) 다른 생물학적 활성, 수용체 또는 결합 파트너 친화도 분석, (변형된 bG-CSF와 비교한) bG-CSF 자체 또는 그 수용체의 형태 혹은 구조적 변화, 또는 혈청 반감기 분석과 같이 원하는 분석 결과를 제공해야 한다.

이제 막 백혈병으로 진단된 WEHI-3BD⁺ 세포 및 인간 백혈구 세포가 ¹²⁵I로 표지된 쥐의 G-CSF에 결합한다는 사실과, 비표지된 G-CSF 또는 인간 CSF-β를 첨가하여 이러한 결합에 대해 경쟁시킬 수 있다는 점은 이미 보고된 바 있다. 인간 및 쥐의 백혈구 세포에 대한 ¹²⁵I-G-CSF의 결합과 겨룰 수 있는 천연 G-CSF 및 bG-CSF의 능력을 검정한다. 고도로 정제된 천연 G-CSF (>95% 순도; 1 ㎍)를 옥소 처리하고(문헌 [Tejedor, et al., Anal. Biochem., 127, 143 (1982)]), 겔 여과 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용해 반응물로부터 분리시킨다. 천연 ¹²⁵I-G-CSF의 특이적 활성은 약 100 μCi/㎍ 단백질이다.

분석 방법론에 대해 상기와 같이 참고문헌을 기록하였지만 이것이 모든 것을 다 기재한 것은 아니며, 당업계의 숙련자라면 목적하는 궁극적인 결과를 시험하는데 유용한 다른 분석법들을 알고 있을 것이다. 이러한 분석법들에 대한 변형은 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다.

XIII . 생체 내 반감기의 효능과 기능 및 약동학적 매개변수 측정

본 발명의 중요한 한 측면은, 수용성 중합체 부분과의 접합 또는 비접합에 의 의한 bG-CSF 폴리펩타이드의 구축으로 생물학적 반감기가 연장된다는 점에 있다. bG-CSF 폴리펩타이드 혈청 농도가 투여 후 급격히 감소하기 때문에, 접합 또는 비접합 bG-CSF 폴리펩타이드 및 이의 변이체 처리에 대한 그 생물학적 반응을 평가하는 것이 중요하다. 본 발명의 접합 또는 비접합 bG-CSF 폴리펩타이드 및 이의 변이체는, 예컨대 피하 투여 또는 i.v. 투여를 통해서 투여된 이후에도 연장된 혈청 반감기를 가지기 때문에, 예를 들어, ELISA 또는 1차 스크리닝 분석법에 의한 측정이 가능하다. 시판되는 ELISA 또는 RIA 키트를 사용할 수 있다. hG-CSF 또는 이의 변형체의 생체 내 반감기 측정을 위한 분석법의 다른 예들은, 본원에 참고로 포함되는 미국특허 제5,824,778호 기술되어 있다. 생체 내 생물학적 반감기의 측정은 본원에 기술된 바와 같이 수행된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hG-CSF 폴리펩타이드의 생체 내 반감기 효능과 기능은 본원에 참고로 포함되는 미국특허 제6,646,110호; 제6,555,660호; 제6,166,183호; 제5,985,265호; 제5,824,778호; 제5,773,581호에 기술된 프로토콜에 따라 측정할 수 있다. 이러한 프로토콜들은 bG-CSF에 대해서도 사용할 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드에 대한 약동학적 매개변수는 정상적인 수컷 랫트(Sprague-Dawley)(N = 5마리의 동물/처리군)에서 평가될 수 있다. 랫트 한 마리당 i.v.로 25 ㎍을 단일 투여하거나, 피하 주사로 50 ㎍을 투여하고, 약 5-7개의 혈액 샘플을 미리 예측하여 정해놓은 시간 경과(일반적으로, 수용성 중합체에 접합되지 않은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 경우 약 6시간, 수용성 중합체에 접합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 경우 약 4일)에 따라 채취할 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하지 않은 bG-CSF에 대한 약동학적 데이터는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드에 대해 얻어진 데이터와 직접 비교할 수 있다.

bG-CSF 폴리펩타이드에 대한 약동학적 연구는 마우스, 랫트 또는 영장류(예컨대, 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey))를 가지고 수행할 수 있다. 통상, 단일 주사는 피하 또는 정맥 내로 투여하며, 혈청 bG-CSF 농도는 시간의 경과에 따라 모니터링한다.

미국특허 제5,849,883호 및 WO 89/10932(이들은 본원에 참조로 포함됨)는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 평가하는데 사용할 수 있는 여러 가지의 동물 모델들을 기술하고 있다. 수행가능한 동물 연구로서는 파스튜렐라 해몰라이티카로 면역 반응을 유도시킨 가축들, 유선의 박테리아 면역 반응/유선염 면역 반응(클렙시엘라 뉴모니아)을 유도한 가축들을 포함한다. 수행가능한 다른 연구로서는 소의 호흡기 질환의 조절, 발병 및 지속 시간을 평가하거나, 대장균 유선염의 예방을 평가하는 것이 있다. 동물의 건강, 우유 생산량, 호중구 수 및 다른 매개변수들을 평가하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 평가하는데 사용될 수 있는 다른 모델로는, 이에 제한되지는 않으나, 슈도모나스 에어루기노사(녹농균) 폐렴의 햄스터 모델과 같은 감염 또는 감염에 대한 노출에 대한 동물 모델, 칸디다 알비칸스 신우신염의 랫트 모델, 신생 망아지를 수반하는 모델 및 성숙한 돼지를 수반하는 모델을 포함한다. 이러한 모델들은 미국특허 제5,849,883호 및 WO 89/10932에 일부 기술되어 있다. 이와 같은 모델들은 당업자에게 공지되어 있다.

hG-CSF의 생체 내 생물학적 활성 측정을 위한 분석법의 추가적인 예는 미국특허 제5,681,720호; 제5,795,968호; 제5,824,778호; 제5,985,265호; 및 문헌 [Bowen et al., Experimental Hematology 27: 425-432 (1999)](이들은 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

XIV . 투여 및 약학 조성물

본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, bG-CSF, 합성효소, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함함)을 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 적절한 약학적 담체와 조합하여 치료 용도로 사용할 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 치료 유효량의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다. 제형은 투여 방식에 맞춰 제조된다. 일반적으로, 단백질 투여 방법은 당업계 숙련자들에게 공지되어 있어, 이를 본 발명의 폴리펩타이드 투여에도 적용할 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용되는 염으로 존재하는 것과 같은 수용성 형태로 존재할 수 있는데, 이는 산 및 염기 부가염을 모두 포함한다는 의미이다. 미국특허 제6,497,869호(본원에 참조로 포함됨)는, 예컨대 이에 제한하진 않지만, hG-CSF 및 bG-CSF를 포함하는 G-CSF 폴리펩타이드의 제형 및 투여에 대해 기술하고 있다. 황산 이온, 예컨대 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물뿐 아니라, 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, HEPES, BES, TAPS, EPPS, TES 및 이들의 혼합물을 포함하는 염들이 기술되었다.

하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 치료 조성물은, 효능, 조직의 물질대사를 확인하기 위해, 그리고 투여량을 평가하기 위하여 당업자에게 공지된 방법에 따라, 하나 이상의 적합한 시험관 내 및/또는 생체 내 질환의 동물 모델에서 시험할 수 있다. 특히, 투여량은 활성, 안정성 또는 천연 아미노산 동족체에 대한 비천연 물질의 다른 적절한 조치(즉, 적절한 분석법에서) (예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 천연 아미노산 bG-CSF 폴리펩타이드와 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 bG-CSF 폴리펩타이드의 비교; 및 현재 이용하고 있는 bG-CSF 처리와 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 bG-CSF 폴리펩타이드의 비교)에 따라 초기에 결정될 수 있다.

투여는 궁극적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉하도록 분자를 도입하는데 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩타이드는 적절한 임의 방식으로 투여되는데, 선택적으로는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 사용할 수 있다. 본 발명의 내용상 이러한 폴리펩타이드를 환자에게 투여하는 적절한 방법을 이용할 수 있지만, 특정 조성물을 투여하는데 하나 이상의 투여 경로를 사용할 수도 있으며, 간혹 어떤 특정 투여 경로를 이용하는 것이 다른 투여 경로를 이용하는 것에 비해 보다 즉각적이고 보다 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수도 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐 아니라, 그 조성물을 투여하는데 사용된 특정 방법에 의해 어느 정도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물에 있어서 그 적절한 제형은 광범위하게 다양하게 존재할 수 있다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 단백질 또는 펩타이드에 적합한 임의의 통상적인 경로, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 비경구적으로, 예를 들어, 주사(이에 제한되지는 않지만, 피하 주사 또는 정맥 내 주사를 포함함) 또는 다른 형태의 주사 또는 주입을 통해 투여될 수 있다. 폴리펩타이드 조성물은 다양한 경로, 예컨대 이에 제한하는 것은 아니나, 경구, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 피하, 국소 부위, 설하, 혈관 내, 유선 내 또는 직장 투여 경로로 투여될 수 있다. 변형 또는 비변형된 비천연 아미노산 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 또한 리포솜을 통해 투여될 수도 있다. 이러한 투여 경로 및 적절한 제형들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. bG-CSF 폴리펩타이드는 단독으로 사용되거나, 또는 약학적 담체와 같은 다른 적절한 성분들과 조합하여 사용될 수 있다. bG-CSF 폴리펩타이드는 다른 제제 또는 치료 물질과 조합하여 사용될 수 있다.

또한, 비천연 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드는, 단독으로 혹은 다른 적절한 성분들과 조합하여, 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제형(즉, 이들은 분무될 수 있음)으로 제조될 수 있다. 에어로졸 제형은 가압이 가능한 압축가스, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 넣어 제조될 수 있다.

비경구 투여, 예를 들어 관절 내(연결 부위), 정맥 내, 근육 내, 피부 내, 복강 내 및 피하 경로 투여를 위해 적절한 제형으로서는, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 상기 제형을 수용자의 혈액과 등장성으로 만들어 주는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. bG-CSF 제형은 앰플과 바이알과 같은 단위 투여 용량 또는 다회 투여 용량의 밀봉된 용기로 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히, 천연 아미노산 동족체 치료 물질(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체, FGF 및/또는 임의의 다른 약학 수송 단백질에 대해 통상 사용되는 것들)에 대해 이미 사용 중인 투여 경로, 그리고 이와 함께 현재 사용 중인 제형으로부터, 본 발명의 폴리펩타이드를 위해 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공받을 수 있다.

본 발명의 내용에 의하면, 동물에게 투여된 용량은 시간의 경과에 따라 그 동물에게 유익한 치료적 반응을 나타내거나, 혹은 그 적용에 따라 다른 적절한 활성을 가지기에 충분하다. 상기 용량은 특정 벡터 또는 제형의 효능, 사용된 비천연 아미노산 폴리펩타이드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 동물의 질환뿐 아니라, 치료할 동물의 체중 또는 표면적에 따라 결정된다. 투여량의 크기 또한 특정 동물 내에 특정 벡터, 제형 등을 투여함에 따라 수반될 수 있는 좋지 않은 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정된다.

질환의 치료 또는 예방 차원에서 투여되는 벡터 또는 제형의 유효량을 결정하기 위해, 수의사는 순환 혈장 수준, 제형의 독성, 질환의 경과 및/또는 항-비천연 아미노산 폴리펩타이드 항체의 생성과의 관련점을 평가한다.

투여 용량은 보통 현재 사용되는 치료 단백질의 투여량과 동일한 범위 내로 하며, 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 맞춰 조절된다. 본 발명의 벡터 또는 약학적 제형은 임의의 공지된 통상적인 요법, 예컨대 항체 투여, 백신 투여, 세포 독성 제제, 천연 아미노산, 핵산, 뉴클레오타이드 유사체, 생물학적 반응 보완제 등의 투여에 의해 치료 조건을 보강할 수 있다.

투여에 있어서, 본 발명의 제형은, 이에 제한되지는 않으나 동물의 통합적이고 전반적인 의료 건강에 적용되는 경우, 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50 및/또는 다양한 농도에서 비천연 아미노산 폴리펩타이드에 대한 임의의 부작용 관찰에 의해 결정된 정도로 투여된다. 투여는 단일 투여량 또는 다회 투여량으로 이루어질 수 있다.

제형이 주입되는 동물에게서 열, 한기 또는 근육 통증이 발생하는 경우에는, 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 동물에 적절한 다른 통증/열 조절 약물을 적절히 투여할 수 있다. 열, 근육 통증 및 한기와 같이 제형 주입에 대한 반응들을 겪는 동물들은 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 이에 제한되지는 않지만 디펜히드라민, 또는 동물에 적합한 다른 약물로 차후 제형을 주입하기 30분 전에 예방 치료를 한다. 해열제 및 항히스타민제에 신속하게 반응하지 않는 더욱 심한 한기 및 근육 통증에는 메페리딘을 사용할 수 있다. 세포 주입은 이상 반응의 중증도에 따라 서서히 또는 불연속적으로 한다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 피험 동물에게 직접 투여될 수 있다. 투여는 피험체에 bG-CSF 폴리펩타이드를 도입하는데 통상 사용되는 임의의 경로에 의한다. 본 발명의 실시 양태에 따른 bG-CSF 폴리펩타이드 조성물은, 경구, 직장 내, 국소 부위, 흡입(예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 에어로졸을 통한 방법), 구강(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 설하), 질, 비경구(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 피하, 근육 내, 경피, 관절 내, 흉막 내, 복강 내, 뇌 내, 동맥 내 또는 정맥 내), 국소 부위(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 모두 해당), 폐, 안구 내, 비강 내 및 경피 투여에 적절한 것들을 포함하나, 어느 경우라도 가장 적절한 경로는 치료할 질환의 특성과 중증도에 따라 결정될 것이다. 투여는 국소 투여 또는 전신 투여로 할 수 있다. 화합물의 제형은 앰플과 바이알과 같은 단위 투여 용량 또는 다회 투여 용량으로 밀봉된 용기로 제공될 수 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 사용되어 단위 용량의 주사가능한 형태(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 용액, 현탁액 또는 에멀전) 내에 혼합물로서 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 연속 주입(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 삼투 펌프와 같은 미니펌프), 단회 투여 또는 서방형 디포(depot) 제제에 의해 투여될 수 있다.

투여를 위해 적절한 제형으로서는, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 상기 제형을 수용자의 혈액과 등장성으로 만들어 주는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액; 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 이미 기술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

동결 건조는 단백질을 제공하는데 흔히 사용되는 기법으로서, 이는 해당 단백질 제제로부터 물을 제거하는 역할을 하게 된다. 동결 건조, 즉 냉동 건조는 먼저 건조할 물질을 얼린 후, 얼음 또는 언 용매를 진공 환경 하에 승화에 의해 제거하는 방법이다. 동결 건조 과정 동안에 안정성을 향상시키고/시키거나 저장 시 동결 건조 산물의 안정성을 개선하기 위해 미리 냉동 건조된 제형 내에 부형제를 포함시킬 수 있다. 이에 대해서는, 문헌 [Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)] 및 [Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)]을 참조한다.

또한, 약제의 분무 건조에 대해서도 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조한다. 소분자 약제 이외에도, 다양한 생물학적 재료가 분무 건조되어 왔으며, 이러한 것들로는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모를 포함한다. 분무 건조는 액상 약학 제제를 단회 공정에 의해 미세하고, 먼지가 일지 않거나 응집된 분말로 바꿀 수 있기 때문에 유용한 기법이다. 기본적인 기법으로는 하기의 네 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 스프레이 내로 미립자화하는 단계; b) 스프레이 에어와 접촉하는 단계; c) 스프레이를 건조하는 단계; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 생성물을 분리하는 단계. 미국특허 제6,235,710호 및 제6,001,800호(본원에 참조로 포함됨)는 분무 건조에 의해 재조합 에리스로포이에틴을 제조하는 것에 대해 기술하고 있다.

본 발명의 약학 조성물 및 제형은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물뿐 아니라, 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 어느 정도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물(예컨대, 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 포함)의 적절한 제형은 매우 다양하게 존재한다(예를 들어, 문헌 [Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed. 1985]를 참조한다).

적절한 담체로는, 이에 제한되지는 않지만, 숙신산염, 인산염, 붕산염, HEPES, 시트르산염, 히스티딘, 이미다졸, 아세트산염, 중탄산 및 다른 유기산을 포함하는 버퍼; 항산화제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 아스코르빈산; 저분자량 폴리펩타이드, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 10개 이하의 잔기를 갖는 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, EDTA 및 에데트산 이나트륨; 2가 금속 이온, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 아연, 코발트 또는 구리; 당알콜, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 만니톨 또는 소르비톨; 염형성 반대 이온, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 나트륨 및 염화나트륨; 충진제, 예컨대 미세결정 셀룰로오스, 락토오스, 옥수수 전분 및 기타 전분; 결합제; 감미제 및 다른 향미제; 착색제; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, Tween™ (예컨대 이에 제한되지는 않지만, Tween 80 (폴리소르베이트 80) 및 Tween 20 (폴리소르베이트 20), Pluronics™ 및 다른 플루론산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 플루론산 F68 (폴록사머 188), 또는 PEG를 포함한다. 적절한 계면활성제로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드), 즉 (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 즉 (PPO-PEO-PPO), 또는 이들의 조합체를 기초로한 폴리에테르를 포함한다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ 및 R-Tetronics™[바스프 와이언도트 코포레이션(BASF Wyandotte Corp.), 미국 미시간주 와이언도트 소재]라는 상표명으로 시판되며, 본원에 참고로 그 내용 전체가 포함되는 미국특허 제4,820,352호에도 추가로 기술되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 적절한 계면활성제가 될 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제들을 조합한 혼합물은 하나 이상의 응력(예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 교반에서 오는 응력)에 대해 PEG화된 bG-CSF를 안정화하는데 사용될 수 있다. 상기 중 일부는 "벌크화제"라고도 지칭된다. 또한 어떤 것들은 "탄력성 보완제(tonicity modifier)"라고도 불린다. 또한, 항균성 보존제는 생성물의 안정성 및 항균물질의 효능을 위해 사용될 수 있는데, 적절한 보존제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 벤질 알콜, 염화벤잘코늄, 메타크레솔, 메틸/프로필 파라벤, 크레솔 및 페놀, 또는 이들을 조합한 물질을 포함한다. 본원에 참고로 포함되는 미국특허 제7,144,574호는 본 발명의 약학 조성물과 제형 및 다른 전달 제제에 적절히 사용할 수 있는 추가의 물질들에 대해 기술하고 있다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드(PEG와 같은 수용성 중합체에 결합된 경우를 포함)는 서방형 시스템으로, 또는 서방형 시스템의 한 부분으로서 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 성형 물품(예로, 막 또는 마이크로캡슐을 포함하며 이제 한정되지는 않음)의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스는 생체 적합성 물질, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트) (문헌 [Langer et al ., J. Biomed . Mater . Res., 15: 267-277 (1981)]; [Langer, Chem , Tech ., 12: 98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트 (문헌 [Langer et al., 상기와 동일]) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988), 폴리락타이드(폴리락트산) (미국특허 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락타이드 코글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al ., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)]), 폴리(오르소)에스테르, 폴리펩타이드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소루신, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 물질로부터 유래한 것들을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포솜에 의해 포집된 화합물을 포함한다. 상기 화합물을 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다: DE 3,218,121; 문헌 [Eppstein et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)]; [Hwang et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; EP 52,322; EP 36,676; 미국특허 제4,619,794호; EP 143,949; 미국특허 제5,021,234호; 일본 공개 특허 제83-118008호; 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324. 여기에 인용된 모든 참고문헌 및 특허들은 본원에 참고로 포함된다.

리포솜으로 포집된 bG-CSF 폴리펩타이드는, 예를 들어 DE 3,218,121; 문헌 [Eppstein et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)]; [Hwang et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; EP 52,322; EP 36,676; 미국특허 제4,619,794호; EP 143,949; 미국특허 제5,021,234호; 일본 공개 특허 제83-118008호; 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포솜의 조성 및 크기는 잘 알려져 있거나, 당업계의 숙련자들에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 리포솜의 일부 예들은 예컨대, 문헌 [Park JW, et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 92: 1327-1331 (1995)]; [Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)]; [Drummond DC, et al ., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)]; [Park JW, et al ., Clin . Cancer Res . 8: 1172-1181 (2002)]; [Nielsen UB, et al ., Biochim . Biophys . Acta 1591(1-3): 109-118 (2002)]; [Mamot C, et al ., Cancer Res . 63: 3154-3161 (2003)]에 기술되어 있다. 여기에 인용된 참고문헌 및 특허들은 본원에 참고로 포함된다. 다수의 hG-CSF 제형들이 기술된 바 있으며, 이들은 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.

본 발명에서 동물에게 투여되는 용량이라 하는 것은 시간의 경과에 따라 피험체에 유익한 반응을 이끌어 내기에 충분해야 한다. 일반적으로, 한 회 투여량 당 비경구적으로 투여되는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드의 약학적 유효량의 총량은, 동물의 체중(kg)에 대해 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이나, 이는 치료적 재량에 속하는 것으로 조절할 수 있다. 투여 빈도 역시 치료적 재량에 속하는 것으로, 동물에서 사용토록 승인된 시판되는 bG-CSF 폴리펩타이드보다 더 자주 투여하거나 더 드물게 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 상기 기술된 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

XV . 본 발명의 bG - CSF 폴리펩타이드의 치료 용도

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 광범위하게 다양한 장애들을 치료하는데 유용하다. hG-CSF 산물을 인간에게 투여하면 백혈구가 형성되는 결과를 가져온다. 따라서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 투여하면 감염의 위험에 있는 동물들을 감염으로부터 예방하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 감염 질환을 가지는 동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드로 치료될 수 있는 감염 질환으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 유선염 및 수송열을 포함한다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 2주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 2주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 2주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 2주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전 내지 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다.

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 수송 2주 전 내지 수송 당일 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 수송 1주 전 내지 수송 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여된다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 수송 1주 전 내지 수송 하루 전 사이의 기간에 동물에게 투여되며, 추가로는 수송 당일 또는 수송 후 1주 동안 투여된다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 7일 전에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 7일 전에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 7일 전에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일에 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 7일 전에 동물에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일 또는 분만 후 1주 동안 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 분만 1주 전에 동물에게 투여되며, 추가로는 분만 당일에 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 송아지의 질병을 예방하기 위해 분만 전이나 분만 당일에 소에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 송아지의 질병을 예방하기 위해 분만 전이나 분만 당일에 소에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 송아지의 질병을 예방하기 위해 분만일 전에 소에게 투여된다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 송아지의 질병을 예방하기 위해 분만일 전에 소에게 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.06; 0.07; 0.08; 0.09; 0.10; 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17; 0.18; 0.19; 0.20; 0.21; 0.22; 0.23; 0.24; 0.25; 0.26; 0.27; 0.28; 0.29; 0.30; 0.31; 0.32; 0.33; 0.34; 0.35; 0.36; 0.37; 0.38; 0.39; 0.40; 0.41; 0.42; 0.43; 0.44; 0.45; 0.46; 0.47; 0.48; 0.49; 또는 0.50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.06; 0.07; 0.08; 0.09; 0.10; 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17; 0.18; 0.19; 0.20; 0.21; 0.22; 0.23; 0.24; 0.25; 0.26; 0.27; 0.28; 0.29; 0.30; 0.31; 0.32; 0.33; 0.34; 0.35; 0.36; 0.37; 0.38; 0.39; 0.40; 0.41; 0.42; 0.43; 0.44; 0.45; 0.46; 0.47; 0.48; 0.49; 또는 0.50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 PEG화되어, 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.06; 0.07; 0.08; 0.09; 0.10; 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17; 0.18; 0.19; 0.20; 0.21; 0.22; 0.23; 0.24; 0.25; 0.26; 0.27; 0.28; 0.29; 0.30; 0.31; 0.32; 0.33; 0.34; 0.35; 0.36; 0.37; 0.38; 0.39; 0.40; 0.41; 0.42; 0.43; 0.44; 0.45; 0.46; 0.47; 0.48; 0.49; 또는 0.50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 PEG화되어, 0,01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05; 0.06; 0.07; 0.08; 0.09; 0.10; 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17; 0.18; 0.19; 0.20; 0.21; 0.22; 0.23; 0.24; 0.25; 0.26; 0.27; 0.28; 0.29; 0.30; 0.31; 0.32; 0.33; 0.34; 0.35; 0.36; 0.37; 0.38; 0.39; 0.40; 0.41; 0.42; 0.43; 0.44; 0.45; 0.46; 0.47; 0.48; 0.49; 또는 0.50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.01 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.01 ㎍/kg의 용량으로 투여된다.

한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 또는 1.0 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 또는 1.0 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 PEG화되어, 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 또는 1.0 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 PEG화되어, 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 또는 1.0 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.1 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.1 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.2 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.2 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.3 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.3 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.4 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.4 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.5 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.5 ㎍/kg의 용량으로 투여된다.

한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 10 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 10 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 20 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 20 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 30 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 30 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 40 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 40 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 50 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.5 ㎍/kg 초과의 용량으로 투여된다. 한 실시 양태에서, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF 폴리펩타이드는 0.5 ㎍/kg 초과의 용량으로 투여된다.

bG-CSF를 함유하는 약학 조성물은 다양한 수단으로 동물(단독으로, 혹은 질병 또는 질환의 일부로서, 백혈구 생성 저하 또는 결손이 특징인 장애를 겪는 동물)에게 투여하기에 효과적인 세기를 갖도록 제형화될 수 있다. bG-CSF의 평균적인 양은 다양할 수 있으며, 특히 자격이 있는 전문의사의 권고 및 처방에 따라야 할 것이다. bG-CSF의 정확한 양은 치료할 질환의 정확한 유형뿐 아니라, 조성물 내의 다른 성분들과 같은 요인들에 따른 선호도의 문제이다. 또한, 본 발명은 또 다른 활성제의 치료 유효량을 투여하는 것에 대한 내용을 제공한다. 투여될 양은 bG-CSF를 사용한 요법을 기초로 하여 당업자에 이해 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 bG-CSF는 백혈구 생성을 촉진하고 위축된 적혈구 수준을 바로잡는데 사용될 수 있다. 백혈구 세포 수준의 감소는 통상 암, 감염 또는 화학요법으로 인한 경우가 많다. 항암제를 이용한 계획된 치료에서와 같이, 건강한 것으로 보이는 동물에서 호중구감소증을 초래할 수 있는 질환들도 치료가능하다. 일반적으로, hG-CSF를 이용해 치료 가능한 질환이라면 역시 본 발명의 bG-CSF 및/또는 PEG:bG-CSF 접합체로도 치료될 수 있다. 또한, 본 발명은 항암 화학요법제와 같은 다른 활성제를 치료 유효량으로 투여하는 것에 대한 내용을 제공한다. 투여될 양은 bG-CSF를 사용한 요법을 기초로 하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상적인 방식으로 제조될 수 있다.

실시예

하기 실시예들은 예시를 위해 제공되는 것이지, 청구된 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

비천연적으로 코딩된 아미노산을 bG - CSF 내로 도입하기 위한 부위 선별

본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 bG-CSF 내로 도입되는 부위를 선별하는데 있어서 그 기준이 되는 것들 중에서 가능한 일부들을 기술하고 있다.

소의 G-CSF의 이론적 모델은 수용체에 결합된 인간 G-CSF (PDB ID No. 2D9Q)의 결정 구조를 이용하여 제작하였다. 이러한 인간 G-CSF 구조에 대한 자리표(좌표)는 프로틴 데이터 뱅크(PDB) (문헌 [Bernstein et al., J. Mol . Biol . 1997, 112, pp 535])에서 이용할 수 있다. 치환이 가능한 잔기들은, 이에 제한되지는 않지만, Cx 프로그램을 이용해 보았을 때 가장 큰 용매 접근성을 나타낸 보존적 치환 부위 및 잔기들을 포함한다(문헌 [Pintar et al., (2002) Bioinformatics, 18(7): 980-4] 참조). 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환하기 위해 동정된 보존적 치환 부위는, 이에 제한되지는 않지만, 전하를 띄거나 띄지 않는 소수성 코어를 함유하는 티로신, 페닐알라닌 및 아르기닌 잔기들을 포함한다. 구조적으로 관련이 될 수 있는 잔기들, 예컨대 글리신, 프롤린 및 나선형 말단 캡핑에 관련된 잔기들은 치환을 위해 선택되지 않았다. 또한, 공지된 수용체 결합 영역 내의 잔기도 치환을 위해 선택되지 않았다. 서열번호 1의 123번 위치 (Asp) 및 141번 위치 (Thr)는 수용체와의 상호작용을 위해 중요할 수 있다. 7번 위치 (Arg)는 폴리펩타이드의 접힘을 위해 중요할 수 있다. 133번 위치 (Thr)는 인간 G-CSF 내의 O-결합된 글리코실화 부위이다.

실시예 2

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하며 대장균 내에서 생성된 bG-CSF 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현

본 실시예는 대장균 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 클로닝과 발현, 그리고 변형된 bG-CSF 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는 방법에 대해서 상술한다.

bG-CSF를 클로닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. bG-CSF에 대한 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열, 숙주 세포로의 bG-CSF 클로닝, 그리고 bG-CSF의 정제에 대한 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제5,849,883호 및 문헌 [Heidari et al., Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81: 45-57]에 상세히 기술되어 있다.

성숙한 bG-CSF를 코딩하는 cDNA는 서열번호 3에 나타나 있다. 이 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드가 서열번호 1에 나타나 있다.

N 말단에 메티오닌을 가지는 성숙한 bG-CSF를 코딩하는 cDNA는 서열번호 4에 나타내었다. 이 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드가 서열번호 2에 나타나있다.

도입된 번역 시스템[오르소고날 tRNA (O-tRNA)와 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소 (O-RS)를 포함함]은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 bG-CSF를 발현하는데 사용하였다. O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 그 결과, 상기 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 bG-CSF 내로 삽입시키게 된다. 적절한 O-RS 및 O-tRNA 서열은, 발명의 명칭이 "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof"인 WO 2006/068802 (상기 출원에서 E9--서열번호 22 & E9의 D286R 돌연변이체--서열번호 24) 및 발명의 명칭이 "Compositions of tRNA and Uses Thereof"인 WO 2007/021297 (상기 출원에서 F13--서열번호 23)(이들 문헌은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

O-RS 및 O-tRNA 서열
서열번호 5	M. 잔나스치 mtRNA_CUA ^Tyr	tRNA
서열번호 6	HLAD03; 최적화된 앰버 억제제 tRNA	tRNA
서열번호 7	HL325A; 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 억제제 tRNA	tRNA
서열번호 8	p-아지도-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(6)	RS
서열번호 9	p-벤조일-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-BpaRS(1)	RS
서열번호 10	프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길-PheRS	RS
서열번호 11	프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길-PheRS	RS
서열번호 12	프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파르길-PheRS	RS
서열번호 13	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS (1)	RS
서열번호 14	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS (3)	RS
서열번호 15	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS (4)	RS
서열번호 16	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS (2)	RS
서열번호 17	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW1)	RS
서열번호 18	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW5)	RS
서열번호 19	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW6)	RS
서열번호 20	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-5)	RS
서열번호 21	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-6)	RS

변형된 bG-CSF 폴리펩타이드 서열 및 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(목적하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드를 사용한 대장균의 형질전환으로 인하여, bG-CSF 폴리펩타이드 내에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 부위 특이적으로 도입하는 것이 가능해졌다. bG-CSF의 발현을 위해 사용된 플라스미드를 도 1에 나타냈다. 한 예로서 나타낸 해당 유전자는 T133을 코딩하는 코돈을 대체하는 셀렉터 코돈(앰버 코돈)을 가지는 bG-CSF이다. 133번 위치에 파라-아세틸페닐알라닌을 가지는 폴리펩타이드는 bG-CSF T133pAF로 지칭하였다. Plpp - 대장균 구성상 프로모터; Pro 클러스터 - 대장균 프롤린 tRNA의 탠덤 카피; F13 클러스터 - 변형된 메타노코커스 잔나스치 티로신 tRNA의 탠덤 카피(WO 2007/021297); E9 RS (D286R) - 메타노코커스 잔나스치 티로실 tRNA 합성효소(WO 2006/068802); T7 pro - T7 프로모터; T7 종결자; ori - 복제원점; bla (ap) 서열 - 암피실린 내성 유전자.

야생형 bG-CSF를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 15개의 돌연변이체 폴리펩타이드 중 하나를 클로닝한 후, pVK6 벡터[코돈 디바이스 인코포레이티드(Codon Devices, Inc.)] 내로 서브클로닝하였다. 생성된 각 구축물은 서로 다른 위치에 셀렉터 코돈, 앰버 코돈을 보유하였다. 이렇게 생성된 bG-CSF 폴리펩타이드는 하기 위치들 중 하나 이상의 위치의 천연적으로 코딩된 아미노산을 치환한 것으로서, 비천연적으로 코딩된 아미노산인 파라-아세틸페닐알라닌(pAF; pAcF)을 보유하게 되었다: L3, R7, E33, H43, Q58, S62, Q67, L69, L99, D123, L124, T133, Q134, T141 및 R166 (서열번호 1을 참조한 위치번호). 생성된 각각의 돌연변이체 bG-CSF 폴리펩타이드가 N-말단에 메티오닌을 가지기 때문에(N-말단에 메티오닌을 가지는 소의 G-CSF의 야생형 서열에 대해서는 서열번호 2를 참조), 발현된 bG-CSF 폴리펩타이드는 +1번 위치에서 비천연 아미노산 치환물을 보유하였다(예를 들어, 한 돌연변이체는 서열번호 2에서 4번 위치의 루신이 pAF로 치환됨). 서열을 확인한 후, 플라스미드를 W3110 B2 세포 내로 형질 변환시키고, 암피실린 플레이트 상에서 콜로니를 성장시켰다. 대장균 세포주에 관한 정보는 도 2에 나타내었다. 이 콜로니들을 1:1000으로 희석한 암피실린 배양물로 5 mL의 LB에 접종하는데 사용하였더니, 37℃에서 O.D.600 = 0.8까지 성장하였다. 다음으로, pAF (파라-아세틸페닐알라닌)을 15개의 서로 다른 배양물에 최종 농도가 4 mM이 될 때까지 첨가하였다. 약 30분 후, 상기 배양물들을 L-아라비노스를 사용해 감응시켜 0.2%의 최종 농도가 되게 하고, 이 배양물들을 37℃에서 다시 5시간 동안 배양하였다. 이때, 각 배양물에서 500 μL의 샘플을 취해 13,000 rpm에서 4분 동안 스핀 다운하였다. 상청액을 버리고 펠렛을 1 μL의 DNAse가 있는 150 μL의 B-PER 중에서 재현탁시키고 실온에서 밤새 배양하였다. 다음 날 아침, 4X LDS 샘플 버퍼 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 첨가해 상기 샘플을 95℃까지 5분간 가열하고, 1OX 샘플 환원제 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 첨가하였다. 이후, 상기 샘플들을 MES 버퍼 중의 4-12% 그래디언트 겔(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 상에서 SDS-PAGE를 이용해 분석한 후, 심플리 블루 세이프스테인(Simply Blue SafeStain) (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 시각화하였다. 도 3은 야생형 및 bG-CSF 돌연변이체 배양물에서 생성된 샘플을, 4-12% 그래디언트 겔 상에서의 분석하고 쿠마시로 염색한 것을 나타낸 것이다.

봉입체 프렙 가용화

상기 세포 페이스트를 4℃ 봉입체(IB) 버퍼 I (5OmM Tris, pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4℃) 중에서 혼합하여 최종적으로 10%의 고형분이 될 때까지 재현탁시켰다. 상기 재현탁된 물질을 고압균질기(microfluidizer)에 총 2회 통과시켜 상기 세포들을 분리하였다. 상기 샘플들을 4℃, 10,000xg에서 15분간 원심분리하여, 상청액을 옮겨 담았다. 상기 봉입체(IB) 펠렛을 추가로 용적을 늘린 IB 버퍼 I (5OmM Tris, pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4℃) 중에서 재현탁시켜 세척하고, 상기 재현탁된 물질을 고압균질기에 총 2회 통과시켰다. 이후, 상기 샘플들을 4℃, 10,000xg에서 15분간 원심분리하여, 상청액을 옮겨 담았다. 상기 IB 펠렛을 1 부피의 버퍼 II (5OmM Tris, pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4℃) 중에서 재현탁시켰다. 재현탁 후, 상기 샘플들을 4℃, 10,000xg에서 15분간 원심분리하여, 상청액을 옮겨 담았다. 다음으로, 상기 IB 펠렛을 1/2 부피의 버퍼 II (5OmM Tris, pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4℃) 중에서 재현탁시켰다. 이후, IB를 적절한 용기에 나누어 담았다. 상기 샘플들을 4℃, 10,000xg에서 15분간 원심분리하여, 상청액을 옮겨 담았다. 다음으로, 봉입체를 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 가용화하거나 저장하였다.

봉입체 가용화

봉입체를 가용화 버퍼 (2O mM Tris, pH 8.0; 8M 구아니딘; 1O mM β-ME) 중에서 최종 농도를 10-15 mg/mL 사이로 하여 가용화하였다. 상기 가용화시킨 IB를 1시간 동안 계속 혼합해주면서 실온에서 배양하거나 혹은 완전히 가용화될 때까지 실온에서 배양하였다. 단백질 농도가 너무 높을 경우에는 추가의 가용화 버퍼로 희석하여 농도를 조절하였다.

리폴딩

0.5M 아르기닌(pH 8.0, 4℃) 중에서 상기 샘플들을 희석하여 단백질 최종 농도가 0.5 mg/mL로 되게 함으로써 리폴딩을 수행하였다. 상기 샘플들을 4℃에서 48-72 시간 동안 리폴딩하도록 하였다.

정제

고형상의 (NH₄)₂SO₄를 샘플에 첨가하여 서서히 섞어주면서 20%의 최종 농도가 되도록 하였다. 상기 샘플을 4℃에서 30분간 서서히 혼합하였다. 침전된 단백질(bG-CSF를 포함함)를 12,000xg에서 15분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고, 상기 펠렛을 1/2 리폴딩 부피의 2O mM NaAc(pH 4.5) 중에서 재현탁시켰다. 모든 펠렛이 용액 상태로 되돌아간 건 아니었다. bG-CSF만이 용액 상태로 돌아갔다. 가용화되지 못한 물질은 12,000xg에서 15분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 상기 샘플들을 옮겨 담고, 상청액을 모아두었다. bG-CSF 물질을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 다음으로, 상기 물질을 버퍼 A (2O mM NaAc, pH 4.5) 중에서 평형화된 CM FF 컬럼 (GE 헬스케어)에 로딩하였다. 상기 물질은 컬럼에 로딩하기 전에는 <10m/S 이었다. bG-CSF를 100%의 버퍼 B (2O mM NaAc, pH 4.5; 50O mM NaCl)에 대한 10 컬럼 부피에 걸쳐 선형 그래디언트를 사용해 컬럼으로부터 용리시켰다. 도 4는 bG-CSF-T133pAF로 러닝한 CM FF 컬럼 피크 분획의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다.

PEG 화 및 정제

CM 풀(pool)의 pH를 50% 빙초산를 사용해 pH 4.0으로 조절하였다. 다음으로, 상기 풀을 약 4.0 mg/mL 단백질로 농축시켰다. 12:1 또는 8:1 몰 초과량의 히드록실아민 PEG:bG-CSF를 상기 풀에 첨가하였다. 상기 혼합물을 28℃에서 48-72시간 동안 배양하였다. 다음으로, 상기 혼합물을 물로 8-10배 희석한 후(< 8 m/S), 버퍼 A (2O mM NaAc, pH 4.5) 중에서 평형화된 SP HP 컬럼 (GE 헬스케어)에 로딩하였다. PEG화된 bG-CSF를 100%의 버퍼 B (2O mM NaAc, pH 4.5; 50O mM NaCl)에 대한 40 컬럼 부피에 걸쳐 선형 그래디언트를 사용해 용리시켰다. 도 5는 PEG화된 bG-CSF-T133pAF에 대한 SP HP 컬럼 피크 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 예를 들어, 5% 에틸렌 클리콜 역시 용리 버퍼에 사용될 수 있다.

PEG화된 bG-CSF 분획들을 모아서 bG-CSF 제형 버퍼 (4.26 mM NaAc, pH 4.0; 0.565 mM NaCl; 0.0033% Tween 20; 5% 소르비톨)에 대해 투석하였다. 상기 PEG 물질을 6-8 mg/mL의 단백질로 농축시키고 0.22㎛ PES 필터로 멸균 여과하였다. 상기 단백질을 4℃에 저장하거나 또는 저장 기간 연장을 위해 급속 냉동시켜 -80℃에서 저장하였다. 도 6은 PEG화 전과 후에 있어 bG-CSF의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다. 레인 1: bG-CSF-T133pAF; 레인 2: bG-CSF-T133pAF-20KPEG; 레인 3: 시블루 플러스(SeeBlue Plus) 2 분자량 마커.

bG - CSF 의 펩타이드 맵핑 (트립신/ 엔도프로티나아제 Glu -C)

bG-CSF 폴리펩타이드에 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)이 도입되었는지를 확인하기 위해 펩타이드 맵핑을 수행하였다. PEG화 이전의 정제된 bG-CSF T133pAF와 야생형 bG-CSF를 최종 농도 6M 구아닌딘-HCl(50 mM Tris, pH 7.8)로 희석시키고, 37℃에서 10 mM의 DTT로 1시간 동안 환원시켰다. 상기 샘플을 실온인 암실에서 20 mM의 IAA로 40분간 알킬화하고, 최종 농도 20 mM의 DTT를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 상기 물질을 100 mM의 중탄산암모늄(pH 7.7) 내로 투석하고 트립신 1:50 (단백질:효소)로 37℃에서 4시간 동안 처리하였다. 이어서, 25℃에서 Glu-C 1:20를 첨가하여 밤새 반응시켰다. TFA를 최종 농도 0.1%로 첨가하여 소화를 중지시켰다. 상기 샘플을 써모피니건(ThermoFinnigan) LCQ 데카(Deca) 이온 트랩형 질량 분석계를 구비한 그레이스 비닥(Grace Vydac) C8 역상 컬럼에 적용하였다. 그래디언트(구배)는 98% 이동상 A (물 중에 0.05% TFA)에서 8분 동안 등용매성 방식으로 시작한 후, 60% 이동상 B (아세토니트릴 중에 0.05% TFA)로 격상시켜 90분간에 걸쳐 수행하고, 214 nm 및 250 nm에서 이를 검출하였다. 0.2 mL/분의 유속과 40℃의 온도를 적용하였다. 모세관 전압을 전장 스캔 범위가 100-2000 m/z인 15 V로 설정하였다. MS/MS에 대한 충돌 전압은 평상시의 42%로 하였다.

도 7a는 야생형 bG-CSF의 트립신/Glu-C 소화를 나타낸 것이다(214 nm 검출). 도 7b는 bG-CSF T133pAF의 트립신/Glu-C 소화를 나타낸 것이다(214 nm 검출). 트레오닌을 pAF(파라-아세틸페닐알라닌)로 치환하면서 증가된 소수성을 나타내었다. 야생형 bG-CSF에 있어서, T133 함유 펩타이드의 체류 시간은 42.79분이었고, bG-CSF T133pAF에 있어서, T133pAF 함유 펩타이드는 시프트되어 46.89분의 체류 시간을 가졌다.

도 8a는 야생형 bG-CSF의 트립신/Glu-C 소화를 나타낸 것이다(250 nm 검출). 도 8b는 bG-CSF T133pAF의 트립신/Glu-C 소화를 나타낸 것이다(250 nm 검출). 250 nm에서 분석에 의하면, 단백질/펩타이드 신호는 낮았으나, pAF로 인한 신호는 강했다. T133pAF 함유 펩타이드는 46.89분의 체류 시간을 갖는 것으로서 도 8b에 표시되어 있다.

bG - CSF 의 펩타이드 맵핑 ( 엔도프로티나아제 Glu -C)

PEG화 이전의 정제된 bG-CSF T133pAF를 최종 농도가 6M인 구아닌딘-HCl(50 mM Tris, pH 7.8)로 희석시키고, 37℃에서 1O mM의 DTT로 1시간 동안 환원시켰다. 상기 샘플을 실온인 암실에서 20 mM의 IAA로 40분간 알킬화하고, 최종 농도 20 mM의 DTT를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 상기 물질을 100 mM의 중탄산암모늄(pH 7.7) 내로 투석하고 Glu-C 1:20 (단백질:효소)로 25℃에서 밤새 처리하였다. TFA를 최종 농도 0.1%로 첨가하여 소화를 중지시켰다. 상기 샘플을 써모피니건(ThermoFinnigan) LCQ 데카(Deca) 이온 트랩형 질량 분석계를 구비한 그레이스 비닥(Grace Vydac) C8 역상 컬럼에 적용하였다. 그래디언트(구배)는 98% 이동상 A (물 중에 0.05% TFA)에서 8분 동안 등용매성 방식으로 시작한 후, 60% 이동상 B (아세토니트릴 중에 0.05% TFA)로 격상시켜 90분간에 걸쳐 수행하고, 214 nm 및 250 nm에서 이를 검출하였다. 0.2 mL/분의 유속과 40℃의 컬럼 온도를 적용하였다. 모세관 전압을 전장 스캔 범위가 100-2000 m/z인 15 V로 설정하였다. MS/MS에 대한 충돌 전압은 평상시의 42%로 하였다.

도 9a는 야생형 bG-CSF의 Glu-C 소화를 나타낸 것이다(214 nm 검출). 도 9b는 bG-CSF T133pAF의 Glu-C 소화를 나타낸 것이다(214 nm 검출). 야생형 bG-CSF에 있어서, T133 함유 펩타이드의 체류 시간은 52.04분이었고, bG-CSF T133pAF에 있어서, T133pAF 함유 펩타이드는 53.95분의 체류 시간을 가졌다.

도 10a는 야생형 bG-CSF의 Glu-C 소화를 나타낸 것이다(250 nm 검출). 도 10b는 bG-CSF T133pAF의 Glu-C 소화를 나타낸 것이다(250 nm 검출). 250 nm에서 분석에 의하면, 단백질/펩타이드 신호는 낮았으나, pAF로 인한 신호는 강했다. T133pAF 함유 펩타이드는 53.95분의 체류 시간을 갖는 것으로서 도 10b에 표시되어 있다.

bG - CSF 폴리펩타이드의 RP - HPLC 및 SEC - HPLC 분석

정제 후 샘플의 순도를 분석하고 동일성을 검사하기 위해 RP-HPLC 및 SEC-HPLC를 사용하였다. 정제된 2OK PEG-bG-CSF T133pAF를 제형 버퍼 (4.26 mM 아세트산나트륨, pH 4.0, 0.565 mM 염화나트륨, 0.0033% Tween-20 및 5% 소르비톨)를 사용해 1 mg/mL로 희석하고, 10μL를 J.T. Baker 와이드 포어(wide pore) Octyl (C8) 역상 컬럼 (4.6 × 100 mm, 5㎛) 상에 주입하였다. 그래디언트(구배)는 50% 이동상 A (물 중에 0.1% TFA)에서 시작한 후, 70% 이동상 B (아세토니트릴 중에 0.1% TFA)로 격상시켜 26분간에 걸쳐 수행하였다. 상기 컬럼을 90% 이동상 B로 4분간 재충전하고 50% 이동상 A로 5분간 다시 평형화를 실시하였다. 1.5 mL/분의 유속과 60℃의 컬럼 온도를 적용하여 214 nm에서 검출하였다. 분석은 애질런트 켐스테이션 소프트웨어(Agilent Chemstation software)로 수행하였다. 표 3은 8.50 분의 체류 시간을 가지는 주요 피크(2OK PEG-bG-CSF T133pAF)를 나타내고 있다. 면적% 계산에 의하면, 91.2%의 샘플이 PEG화된 bG-CSF였다.

시간(분)	면적	면적%
4.2	50.6	0.6
5.0	20.0	0.3
6.8	155.2	2.0
7.3	99.7	1.3
8.0	121.2	1.5
8.5	7245.0	91.2
9.3	87.9	1.1
9.7	31.9	0.4
10.1	135.5	1.7

PEG화되지 않은 bG-CSF도 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 표 4는 8.893 분의 체류 시간을 가지는 주요 피크(bG-CSF T133pAF)를 나타내고 있다. 면적% 계산에 의하면, 64.3%의 샘플이 bG-CSF T133pAF였다.

시간(분)	면적	면적%
5.6	114.3	1.6
7.4	17.4	0.2
8.1	12.2	0.2
8.2	13.6	0.2
8.3	13.7	0.2
8.9	4622.1	64.3
9.3	930.8	13.0
10.2	13.9	0.2
10.3	12.9	0.2
10.8	1151.5	16.0
11.1	273.9	3.8
11.8	10.0	0.1

정제된 2OK PEG-bG-CSF T133pAF도 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 25분 등용매 구배를 사용하여 샘플만을 토소하스(Tosohaas) TSK 수퍼(Super) SW3000 (4.6 × 300 mm, 4㎛ 250Å) 사이징 컬럼 상에 주입하였다(2μL). 이동상은 97%의 63 mM 인산나트륨(pH 7.0)과 3%의 2-프로판올을 포함한다. 0.3 mL/분의 유속과 25℃의 컬럼 온도를 적용하여 214 nm에서 검출하였다. 분석은 애질런트 켐스테이션 소프트웨어(Agilent Chemstation software)로 수행하였다. 표 5는 9.157 분의 체류 시간을 가지는 주요 피크를 나타내고 있다. 면적% 계산에 의하면, 98.3%의 샘플이 단량체성 PEG-bG-CSF였다. PEG화된 폴리펩타이드의 SEC-HPLC 분석에 대해서는 도 11을 참조한다.

시간(분)	면적	면적%
7.0	50.3	0.1
8.2	228.0	0.6
9.2	36454.5	98.3
10.1	361.4	1.0

PEG화되지 않은 bG-CSF도 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 표 6은 13.125분의 체류 시간을 가지는 주요 피크를 나타내고 있다. 면적% 계산에 의하면, 99.0%의 샘플이 단량체성 bG-CSF T133pAF였다. 폴리펩타이드의 SEC-HPLC 분석에 대해서는 도 12를 참조한다.

시간(분)	면적	면적%
10.4	10.0	0.0
11.1	6.8	0.0
11.7	178.2	0.5
12.6	129.5	0.4
13.1	33514.3	99.0

또한, bG-CSF 폴리펩타이드의 ESI-TOF 고정밀형 분석 (애질런트 테크놀로지)을 수행하여 bG-CSF 폴리펩타이드의 동일성을 확인하였다. 정제된 bG-CSF T133pAF를 0.1%의 포름산에 투석하였다. 상기 샘플을 물을 사용해 C-18 카트리지 상에서 1분간 적용시킨 후, 물에서 50% 아세토니트릴로 용리하였다. 총 러닝 타임은 0.3 mL/분의 유속으로 3분이었다. ESI 모세관 전압을 4 kV로 설정하고, MSTOF 프레그멘터(fragmentor) 전압은 300V로 설정하였다. 스캐닝된 전하 상태에 대한 엔벨로프(envelope)에서 컨벌루션(convolution)을 제거해 MH+ 값을 제공하였다. 예상한 MH+ MW는 19145이었다. 관찰된 MH+ MW는 19146였다.

M- NFS60 증식 분석

bG-CSF 분자의 효능을 평가하기 위해, M-NFS60 세포주를 이용하여 증식 분석을 수행하였다. 상기 세포주는 ATCC (카달로그 # CRL-1838)로부터 구매하였다. 상기 세포를 해동하여 RPMI 1640 + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신 + 50μM의 2-머캅토에탄올 + 20 ng/mL의 mIL-3 [인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재; BD 파미젠(Pharmingen) cat.# 554579의 mIL-3] 내에서 유지시켰다. 상기 세포들을 격일마다 갈라서 0.02×10⁶ 개의 세포/mL로 씨딩하였다.

분석 전날, 상기 세포들을 0.1×10⁶ 개의 세포/mL로 쪼개놓았다. 16-24 시간 후, 분석 배지 중에서 상기 세포들을 흑색의 편평 바닥 96 웰 플레이트 내로 웰당 10,000 개의 세포로 씨딩하고, bG-CSF 화합물의 연속 희석물을 2배로 첨가하였다. 웰당 총 부피는 10O μL였고, 분석 배지는 RPMI 1640 + 10% FBS + P/S를 사용하였다. 뉴포젠(Neupogen®)과 같은 표준 물질과 WT bG-CSF를 모든 플레이트에 대해 역시 쌍으로 첨가하였다. 다음으로, 상기 플레이트들을 37℃, 5% CO₂ 환경에서 42시간 동안 배양하였다. 상기 42시간의 배양 후에, 10 μL/웰의 알라마 블루(Alamar Blue) [바이오소스(Biosource) cat.#: DAL11OO)를 첨가하고, 상기 플레이트들을 37℃, 5% CO₂ 환경에서 6시간 동안 한차례 더 배양하였다. 상기 플레이트들을 실온에서 2분간 4000 rpm에서 스핀 다운시켜 공기 기포를 제거하였다. 플레이트들을 테칸(Tecan) 형광 강도 측정기(535 nm에서 여기, 590 nm에서 방출되도록 설정) 상에서 판독하였다. 감광성인 알라마 블루 염료가 빛에 노출되는 것을 피하기 위해 플레이트들을 호일로 감쌌다.

데이터 분석을 위해, 각 화합물에 대한 한 쌍의 연속 희석물에 대해 평균을 내었으며, EC50 값은 시그마플롯(SigmaPlot)에서 계산하였다. 미가공의 EC50 값을 모든 화합물에 대해 열거하고, 폴드 디퍼런스(fold difference)를 계산하였다(PEG화된 소의 G-CSF 화합물을 WT bG-CSF와 비교함). 실험을 수회 러닝하여 시험 내 분석(intra-assay) CV를 <20%로, 그리고 시험 간 분석(inter-assay)의 CV를 <30%로 하였다. 도 13/표 7 = M-NFS60 증식 분석 - 2OK PEG화된 소의 G-CSF T133pAF와 야생형의 미가공 EC50 값. 도 14/표 8 = M-NFS60 증식 분석 - 2OK PEG화된 소의 G-CSF T133pAF와 야생형의 EC50 폴드 디퍼런스.

비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함하는 다른 bG-CSF 분자들도 분석하였다. 표 9는 수득된 EC50 값의 평균을 나타내고 있다.

		뉴포젠	뉴라스타	WT bG-CSF	20K PEG-bT133 [배치 NK2]
요약	평균 EC50 [ng/㎖]	0.025	0.077	0.053	0.270
	SD	0.005	0.004	0.005	0.042
	CV	18%	5%	9%	16%
	N	14	5	16	2

		뉴포젠	뉴라스타	WT bG-CSF	20K PEG-bT133 [배치 NK2]
요약	차이 배수 EC50 [X]	1.0	3.2	1	5.1
	SD	0.0	0.7	0	0.5
	CV	0%	23%	0%	9%
	N	14	5	12	2

	평균 EC50 값	SD	CV
뉴포젠	0.025	0.005	18%
WT bG-CSF	0.053	0.005	9%
뉴라스타	0.077	0.004	5%
20k PEG-bS62	0.150	0.008	5%
20k PEG-bT133 [NK1]	0.258	0.045	17%
20k PEG-bT133 [NK2]	0.270	0.042	16%
20k PEG-bR7	0.348	0.073	21%
20k PEG-bR166	0.363	0.033	9%
20k PEG-bL3	0.477	0.081	17%

소의 호중구의 CD11b 염색

50 ㎕의 소 혈액을 아무 처리도 하지 않은 폴리스티렌 96-웰 플레이트[칼 폴리 포모나(Cal Poly Pomona)]에 첨가하였다. PBS (200 ng/㎖ 내지 O.OO1 ng/㎖(최종 농도)) 중에서 희석된 50 ㎕의 뉴포젠(Neupogen®), 뉴라스타(Neulasta®) 또는 bG-CSF-T133pAcF-20K PEG를 첨가하여 세포들을 자극시켰다. 용액을 서서히 혼합시켜 37℃, CO₂ 배양기 중에서 30분간 배양하였다. 20 ㎍/㎖의 1차 항체를 세포(마우스 항-소의 CD11b: MM12A, VMRD)에 첨가하였다. 세포들을 4℃에서 30분간 배양하였다. 분석 플레이트를 800xg에서 2분간 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 적혈구를 150 ㎕의 차가운 용해액(0.15M 인산염, pH 7.2)을 첨가하여 1분간 용해시키고, 50 ㎕의 복원 용액(restoring solution) (0.15M 인산염, 0.5 M NaCl, pH 7.4)을 첨가하여 등장성을 회복하였다. 플레이트를 다시 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 눈에 보이는 모든 적혈구들이 제거될 때까지 용해 절차를 반복하였다. 상기 세포들을 200 ㎕의 FACS 버퍼 (1×PBS, 2.5 mM HEPES, 0.1% 아지드나트륨, 2.0% FBS)로 2회 세척하고, 100 ㎕의 FACS 버퍼 중에 재현탁시켰다. 20 ㎍/㎖의 2차 항체 (염소 항-마우스의 IgG1, 인간 ads-PE)를 첨가하고 4℃, 암실에서 30분간 배양하였다. 상기 세포들을 펠렛화하고 2회 세척한 후, 200 ㎕의 FACS 버퍼 중에서 재현탁시켰다. BD FACS 분석 장비를 사용해 50,000개의 이벤트를 얻어 CD11b+ 세포의 수를 셈하였다.

도 15는 CD11b 항체로 소의 호중구를 염색하여 다양한 분자에 대한 이들의 반응성을 평가하기 위한 실험의 결과를 나타낸 것이다. 세포 표면 상에 CD11b가 제공되는 수준을 측정하기 위해 과립성 백혈구에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 사용하였다. % MFI는 자극을 주지 않은 대조군에 대한 정규값이다. 4-맞춤 매개변수(4-parameter fit)를 기반으로 하여, 뉴포젠, 뉴라스타 및 bG-CSF T133pAF-20K PEG에 대한 용량 반응 곡선과 EC50 값을 생성하였다. 뉴포젠(Neupogen®)에 대한 EC50 값은 3.18 ng/㎖였다. 뉴라스타(Neulasta®)의 경우에는 EC50 값이 2.84 ng/㎖였고, bG-CSF T133pAF-20K PEG의 경우에는 EC50 값이 6.23 ng/㎖였다.

실시예 3

카르보닐 함유 아미노산의 도입 및 아미노옥시 함유 PEG 와의 후속 반응

본 실시예는 약 5,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 생성 방법을 설명한다. 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산) 각각은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아세틸-페닐알라닌을 bG-CSF에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 상기 실시예 2에 기술된 서열번호 3 또는 4 (bG-CSF) 및 서열번호 23 또는 5 (muttRNA, M. 잔나스치)와 서열번호 22, 24, 17, 18, 19 (TyrRS LW1, 5 또는 6)이다.

일단 변형이 되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체는 하기의 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시킨다:

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 5,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼(Sigma Chemical), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 bG-CSF를 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am . Chem . Soc . 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-bG-CSF를 적절한 버퍼 내로 희석시켰다.

실시예 4

아미드 결합을 통해 PEG 에 결합된 히드록실아민기로 이루어진 PEG 와의 접합

하기 구조를 갖는 PEG 시약을, 실시예 3에 기재된 절차를 사용하여 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시켰다.

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R = 메틸이고, n = 4이며, N은 대략 20,000 MW이다. 반응, 정제, 및 분석 조건은 실시예 3에 기재된 바와 같다.

실시예 5

2개의 서로 다른 비천연적으로 코딩된 아미노산의 bG - CSF 폴리펩타이드로의 도입

본 실시예는 케톤 작용기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 하기 잔기들 중 두 위치에 도입하여 bG-CSF 폴리펩타이드를 생성하는 방법에 대해 설명한다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산). bG-CSF 폴리펩타이드는 셀렉터 코돈을 핵산 내 2개의 별도의 부위에 도입하는 것을 제외하고는 실시예 1과 2에 기술된 바와 같이 제조하였다.

실시예 6

히드라지드 함유 PEG 와 bG - CSF 폴리펩타이드의 접합 및 후속 원위치 환원

카르보닐 함유 아미노산을 도입한 bG-CSF 폴리펩타이드를 실시예 2와 3에 기술된 절차에 따라 제조하였다. 일단 하기 구조를 갖는 히드라지드 함유 PEG를 변형시킨 후, 이를 bG-CSF 폴리펩타이드에 접합시켰다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R = 메틸이고, n = 2이며, N = 10,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O) 기이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 bG-CSF를 25 mM MES(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5) 중에 0.1-10 mg/mL로 용해시키고, 1배 내지 100 배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시킨 후, H₂O 중에 용해된 저장액 1M NaCNBH₃(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 최종 농도 10-50 mM이 되도록 첨가함으로써 해당 히드라존을 원위치 환원시켰다. 반응은 4℃ 내지 RT의 암실에서 18-24시간 동안 수행하였다. 반응을 약 pH 7.6에서 최종 Tris 농도가 50 mM이 되도록 1M Tris(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 첨가함으로써 반응을 중지시키거나 또는 즉각적인 정제를 위해 적절한 버퍼 내로 희석시켰다.

실시예 7

알킨 함유 아미노산의 bG - CSF 폴리펩타이드로의 도입 및 mPEG - 아지드를 이용한 유도체화

하기의 잔기들, 즉 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산)를 각각 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다.

p-프로파르길-티로신을 bG-CSF 내로 부위 특이적으로 도입하는데 이용된 서열은 상기 실시예 2에 기술된 서열번호 3 또는 4, 서열번호 5 (muttRNA, M. 잔나스치, mtRNA_CUA ^Tyr) 및 10, 11 및 12이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 bG-CSF 폴리펩타이드를 대장균에서 발현시키고, 실시예 3에 기술된 조건들을 사용하여 정제하였다.

PB 버퍼(100 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH = 8)중에 0.1-10 mg/mL로 용해된 프로파르길-티로신을 함유하는 정제된 bG-CSF 및 10배 내지 1000배 과량의 아지드 함유 PEG를 반응 혼합물에 첨가하였다. 다음으로, 촉매량의 CuSO₄ 및 Cu 선을 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 배양(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 실온 또는 37℃에서 약 4시간, 또는 4℃에서 밤새 배양)한 후, H₂O를 첨가하고, 혼합물을 투석막을 통해 여과하였다. 상기 샘플을 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 실시예 3에 기술된 것과 유사한 절차에 의해 분석할 수 있다.

본 실시예에서, PEG는 하기 구조를 갖는다.

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 4이며, N은 10,000 MW이다.

실시예 8

bG - CSF 폴리펩타이드 내의 거대한 소수성 아미노산의 프로파르길 티로신으로 의 치환

bG-CSF의 하기 영역들: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산) 중 한 영역 내에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기를 실시예 7에 기술된 바와 같이 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다:

일단 PEG를 변형시킨 후, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체에 부착시켰다. PEG는 하기 구조를 가지며, 커플링 절차는 실시예 7에 기재된 절차를 따른다:

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

이로써 천연 발생의 거대한 소수성 아미노산 중 하나와 대략적으로 등전자성이고, 폴리펩타이드 내 별도의 부위에서 PEG 유도체에 의해 변형된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 생성하게 될 것이다.

실시예 9

하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 bG - CSF 폴리펩타이드 동종이량체 , 이종이량체 , 동종다량체 또는 이종다량체의 생성

실시예 7에서 생성된 알킨 함유 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 하기 형태의 이작용성 PEG 유도체와 반응시켜, 두 bG-CSF 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 해당 bG-CSF 폴리펩타이드 동종이량체를 생성하였다:

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

상기 식 중,

n은 4이고, PEG는 대략 5,000의 평균 MW를 갖는다.

이와 유사한 방식으로, bG-CSF 폴리펩타이드를 하나 이상의 다른 폴리펩타이드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석은 상기 실시예 7과 3에서와 같이 수행하였다.

실시예 10

bG - CSF 폴리펩타이드에 대한 사카라이드 부분의 커플링

실시예 3에서 기술한 바와 같이, 하기 중 하나의 잔기를 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다: 1번 잔기 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175번 잔기 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의 조합 잔기 (서열번호 1, 또는 서열번호 2에서 이에 대응하는 아미노산, 또는 다른 bG-CSF 폴리펩타이드에서 이에 대응하는 아미노산).

일단 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 변형시킨 후, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-결합된 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. bG-CSF 폴리펩타이드 변이체(10 mg/mL) 및 아미노옥시 사카라이드(21 mM)를 100 mM 수성 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.5) 중에서 혼합하고, 37℃에서 7시간 내지 26시간 동안 배양하였다. 사카라이드-접합된 bG-CSF 폴리펩타이드(5 mg/mL)를, 150 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 중의 UDP-갈락토오스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제(0.4 유닛/mL)를 이용하여 주위 온도에서 48시간 동안 배양시킴으로써, 제2 사카라이드를 먼저 효소적으로 커플링시켰다(문헌 [Schanbacher et al., J. Biol . Chem. 1970, 245, 5057-5061] 참조).

실시예 11

PEG화된 bG - CSF 폴리펩타이드 길항제의 생성

잔기, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, bG-CSF 수용체 결합과 관련이 있는 잔기들을 실시예 3에 기술된 바와 같이 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다.

일단 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 변형시킨 후, 하기 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시키면 폴리펩타이드 내 단일 부위에서 PEG 유도체에 의해 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 길항제를 생성시키게 될 것이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 4이며, N은 20,000 MW이다. 커플링, 정제 및 분석은 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다.

실시예 12

bG - CSF 분자가 직접 결합된 bG - CSF 폴리펩타이드 동종이량체 , 이종이량체 , 동종다량체 또는 이종다량체의 생성

알킨 함유 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체를 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또 다른 bG-CSF 폴리펩타이드 변이체에 직접 커플링시킬 수 있다. 이와 유사한 방식으로, bG-CSF 폴리펩타이드를 하나 이상의 다른 폴리펩타이드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석은 실시예 3, 6 및 7에 기술된 바와 같이 수행한다.

실시예 13

폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응하여 에테르(B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄형 사슬 또는 분지형 사슬, 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₂₀ 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C₃ 내지 C₇ 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 또는 시클릭 헤테로알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기, 또는 치환되거나 또는 비치환된 알카릴(알킬은 C₁ 내지 C₂₀ 포화 또는 불포화 알킬임) 또는 헤테로알카릴 기일 수 있다. 통상, PEG-OH는 800 달톤 내지 40,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.

실시예 14

mPEG - OH + Br - CH ₂ -C≡ CH → mPEG -O- CH ₂ -C≡ CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오(Sunbio))를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 다음으로, 크실렌 중의 80 중량% 용액(0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, 알드리치)으로 용해된 브롬화 프로파르길 및 촉매량의 KI의 용액을 상기 용액에 첨가하고, 생성되는 혼합물을 2시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수거하고, 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 수득하였다.

실시예 15

mPEG - OH + Br -( CH ₂ ) ₃ -C≡ CH → mPEG -O-( CH ₂ ) ₃ -C≡ CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오(Sunbio))를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 다음으로, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴(0.53 mL, 5 mmol, 알드리치) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 16시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수거하고, 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 대응하는 알킬을 수득하였다. 5-클로로-1-펜틴을 유사한 반응에서 사용할 수 있다.

실시예 16

mPEG -O- CH ₂ - C ₆ H ₄ O - CH ₂ -C≡ CH 의 제조

THF(50 mL) 및 물(2.5 mL) 중의 3-히드록시벤질알콜(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨(1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 후, 크실렌(3.36 mL, 30 mmol) 중의 80 중량% 용액으로서 용해된 브롬화 프로파르길 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 6시간 동안 가열 환류하였다. 상기 혼합물에 10 % 시트르산(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 3-프로파르길옥시벤질 알콜을 수득하였다.

염화메탄설포닐(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 화합물 3(2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 상기 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓아두었다. 통상적인 후처리로 담황색 오일의 메실레이트를 수득하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 후, 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 원하는 브롬화물을 수득하였다.

mPEG-OH 20 kDa(1.0 g, 0.05 mmol, 썬바이오)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0.25 mmol)를 격렬하게 교반하면서 수분에 걸쳐 첨가한 후, 상기로부터 얻어진 브롬화물(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성되는 혼합물을 12시간 동안 가열 환류하였다. 물(1.0 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 백색 침전물을 얻었으며, 이것이 모아져서 PEG 유도체를 생성하였다.

실시예 17

mPEG - NH ₂ + X-C(O)-( CH ₂ ) _n -C≡ CR' → mPEG - NH -C(O)-( CH ₂ ) _n -C≡ CR'

또한, 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체는, 상기에서 나타낸 바와 같이, 말단 작용기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 작용기를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 수득될 수도 있다. 상기 식 중, n은 1 내지 10이다. 상기 식 중, R'는 H 또는 C₁ 내지 C₄의 작은 알킬기일 수 있다.

실시예 18

mPEG - NH -C(O)-( CH ₂ ) ₂ -C≡ CH 의 제조

4-펜탄산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH₂Cl₂(25 mL) 중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성되는 미정제 NHS 에스테르 7을 추가의 정제없이 하기 반응에서 사용하였다.

5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH₂(mPEG-NH₂, 1 g, 썬바이오)를 THF(50 mL) 중에 용해시키고, 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르 7(400 mg, 0.4 mmol)을 격렬하게 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온으로 가온시키면서 3시간 동안 교반하였다. 이후, 물(2 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(50 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수집하여 진공에서 건조시켰다.

실시예 19

폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로 제조

본 실시예는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로도 지칭되는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 설포닐 에스테르의 제조에 대한 것이다. 대응하는 토실레이트 및 할라이드는 유사한 절차에 의해 제조될 수 있다.

150 mL의 톨루엔 중의 mPEG-OH(MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 질소 하에서 2시간 동안 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 무수 CH₂Cl₂ 및 2.1 mL의 무수 트리에틸아민(15 mmol)을 이 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 얼음조 중에서 냉각시키고, 1.2 mL의 증류된 염화메탄설포닐(15 mmol)을 적가하였다. 이 용액을 질소 하 실온에서 밤새 교반하고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 상기 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공 하에서 다시 농축시킨 후, 100 mL의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여과액을 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 수득하였다.

메실레이트 (20 g, 8 mmol)를 75 mL의 THF 중에 용해시키고, 이 용액을 4℃로 냉각시켰다. 상기 냉각된 용액에 아지드 나트륨(1.56 g, 24 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 질소 하에서 2시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 용매를 증발시키고, 잔여물을 CH₂Cl₂(50 mL)로 희석시켰다. 유기 분획물을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ml로 감소시키고, 150 mL의 냉각된 무수 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.

실시예 20

mPEG -O- CH ₂ - C ₆ H ₄ - N ₃ 의 제조

4-아지도벤질 알콜은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,998,595호에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 염화메탄설포닐(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 4-아지도벤질 알콜(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓아두었다. 통상적인 후처리로 담황색 오일의 메실레이트를 수득하였다. 이 오일(9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 물(2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 원하는 브롬화물을 수득하였다.

mPEG-OH 20 kDa(2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF(35 mL) 중의 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브롬화물(3.32 g, 15 mmol)을 촉매량의 KI와 함께 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 12시간 동안 가열 환류시켰다. 물(1.0 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 침전물을 생성하고, 이를 수거하여 mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃을 얻었다.

실시예 21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC0₃(10 mL)의 포화 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-히드록시숙신이미도 프로피오네이트(5 당량)를 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 추가로 45분 동안 교반하였다. pH를 0.5N H₂SO₄를 사용하여 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mL × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 ω-카르복시-아지드 PEG 유도체를 수득하였다.

실시예 22

THF 중에서 -78℃로 냉각된, 당업계에 공지된 바와 같이 제조된 리튬 아세틸라이드(4 당량)의 용액에, THF 중에 용해된 mPEG-OMs의 용액을 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 3시간 후, 상기 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가하여 중지시켰다. 이후, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 상기 혼합물을 추가로 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5N H₂SO₄를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mL × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 1-(부트-3-일옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 수득하였다.

실시예 23

아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산의 도입

아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산은, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500], [J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)], [J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027], [J.W. Chin, & P.G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11:1135-1137], [J.W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024] 및 [L. Wang, & P.G. Schultz, (2002), Chem . Comm ., 1:1-11]에 기재된 방법을 사용하여 단백질 내로 부위 특이적으로 도입될 수 있다. 일단 아미노산을 도입시킨 후, 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO₄ 및 ~1 mg Cu 선의 존재 하에, 포스페이트 버퍼(PB)(pH 8) 중에서, 0.01 mM 단백질을 사용하여 37℃에서 4시간 동안 시클로 부가 반응을 수행하였다.

실시예 24

p-아세틸-D,L-페닐알라닌( pAF ) 및 m- PEG - 히드록실아민 유도체의 합성

문헌 [Zhang, Z., Smith, B.A.C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P.G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746]에 종래 기재된 절차를 사용하여 라세미 pAF를 합성하였다.

m-PEG-히드록실아민 유도체를 합성하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 실온에서(RT) 1시간 동안 교반된 디클로로메탄(DCM, 70 mL) 중의 (N-t-Boc-아미노옥시)아세트산(0.382 g, 2.0 mmol) 및 1,3-디이소프로필카르보디이미드(0.16 mL, 1.0 mmol)의 용액에, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 아민(m-PEG-NH₂, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt. 30 K, 바이오벡트라(BioVectra)로부터 입수) 및 디이소프로필에틸아민(0.1 mL, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 RT에서 48시간 동안 교반한 후, 약 100 mL가 되도록 농축시켰다. 상기 혼합물을 냉각된 에테르(800 mL)에 적가하였다. t-Boc-보호된 생성물을 침전시키고, 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3회 세척하였다. 이를 DCM(100 mL) 중에 재용해시키고, 에테르(800 mL) 중에서 2회 침전시킴으로써 추가로 정제하였다. 생성물을 진공에서 건조시켜 7.2 g(96 %)을 수득하고, 이를 NMR 및 니히드린(Nihydrin) 시험에 의해 확인하였다.

상기와 같이 수득된 보호된 생성물(7.0 g)의 deBoc을 50% TFA/DCM(40 mL) 중에서 0℃로 1시간 동안 수행한 후, RT에서 1.5시간 동안 수행하였다. 대부분의 TFA를 진공에서 제거한 후, 디옥산(1 mL) 중의 4N HCl을 잔류물에 첨가함으로써 히드록실아민 유도체의 TFA 염을 HCl 염으로 전환시켰다. 상기 침전물을 DCM(50 mL) 중에 용해시키고, 에테르(800 mL) 중에서 재침전시켰다. 최종 생성물(6.8 g, 97 %)을 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3회 세척하고, 진공에서 건조시키고, 질소 하에서 저장하였다. 다른 PEG(5K, 20K) 히드록실아민 유도체를 동일한 절차를 사용하여 합성하였다.

실시예 25

PEG화된 bG - CSF 의 시험관 내 활성 및 생체 내 활성

PEG-bG-CSF, 변형되지 않은 bG-CSF 및 완충 용액을 마우스 또는 랫트에 투여하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG화된 bG-CSF는, 마우스마다 동일한 투여량을 사용하여 호중구의 양이 현저하게 증가된 것과 최대 백혈구 수가 변화된 것에서 볼 수 있는 바와 같이, 변형되지 않은 bG-CSF보다 월등한 활성 및 연장된 반감기를 나타낼 것이다.

약동학적 분석

본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 정맥 내 또는 피하 경로로 마우스에 투여하였다. 상기 동물을 투여 전과 투여 후 시점에 채혈하였다. 각 샘플에서 혈장을 수거하여 방사선 면역분석방법에 의해 분석하였다. 제거 반감기를 계산할 수 있으므로, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드와 야생형 bG-CSF 또는 본 발명의 다양한 bG-CSF 유사체 폴리펩타이드 간에 이를 비교하였다. 이와 유사하게, 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 필리핀 원숭이에 투여할 수 있다. 상기 동물을 투여 전과 투여 후 시점에 채혈하였다. 각 샘플에서 혈장을 수거하여 방사선 면역분석방법에 의해 분석하였다.

본 발명의 폴리펩타이드는 질환의 동물 모델에게 투여될 수 있다. 수행가능한 동물 연구로서는 파스튜렐라 해몰라이티카로 면역 반응을 유도시킨 가축들, 유선의 박테리아 면역 반응/유선염 면역 반응(클렙시엘라 뉴모니아)을 유도한 가축들을 포함한다. 수행가능한 다른 연구로서는 소의 호흡기 질환의 조절, 발병 및 지속 시간을 평가하거나, 대장균 유선염의 예방을 평가하는 것이 있다. 동물의 건강, 우유 생산량, 호중구 수 및 다른 매개변수들을 평가하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 평가하는데 사용될 수 있는 다른 모델로는, 이에 제한되지는 않으나, 슈도모나스 에어루기노사(녹농균) 폐렴의 햄스터 모델과 같은 감염 또는 감염에 대한 노출에 대한 동물 모델, 칸디다 알비칸스 신우신염의 랫트 모델, 신생 망아지와 관련된 모델 및 성숙한 돼지와 관련된 모델을 포함한다. 이러한 모델들은 미국특허 제5,849,883호 및 WO 89/10932에 일부 기술되어 있다. 이와 같은 모델들은 당업자에게 공지되어 있다.

³ H- 티미딘 분석 표준 방법을 사용하여 ³H-티미딘 분석을 수행하였다. 희생시킨 암컷 Balb C 마우스 또는 다른 동물들로부터 골수를 수득하였다. 골수 세포는 성장 배지 중에서 잠시 동안 현탁, 원심분리 및 재현탁시켰다. 약 10,000개의 세포를 포함하는 160 ㎕의 분취량을 96 웰 미량적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 담았다. 정제된 G-CSF 유사체(상기 제조된 바와 같음)의 샘플을 각 웰에 첨가하고 68시간 동안 배양하였다. 삼중 수소화 티미딘을 웰에 첨가하고 추가로 5시간 동안 더 배양하였다. 5시간의 배양 시간 후에, 상기 세포들을 수거하고 여과해 완전히 세정하였다. 섬광 유체를 포함하는 바이알에 필터를 첨가하였다. 베타 방출 수를 계산하였다(LKB 베타플레이트 신틸레이션 카운터). 표준 물질과 유사체를 세 차례 분석하고, 실질적으로 표준 곡선을 초과하거나, 미달하는 샘플들은 적절히 희석해 재분석하였다. 비변형된 bG-CSF 표준 물질의 결과에 대해 세 차례 수행한 유사체 데이터의 평균을 내어 결과를 기록하였다.

인간 골수 세포의 증식을 유도하는가에 대해서는 ³H-티미딘 도입이 증가되었는가를 기초로 분석하였다. 건강한 기증자의 인간 골수를 Ficoll-Hypaque (1.077 g/㎖, 파마시아)를 이용한 밀도 차이 유도를 통해, 낮은 밀도를 갖는 세포들은 10% 소태아혈청 및 글루타민 펜-스트렙(pen-strep)을 함유하는 이스코브 배지(Iscove's medium) (GIBCO) 중에 현탁시켰다. 이어서, 2×10⁴ 개의 인간 골수 세포들은, 37℃, 공기 중 5% CO₂ 조건 하에 96 편평 바닥 웰 플레이트 중에 대조군 배지 또는 재조합 대장균 유래의 bG-CSF 물질을 사용하여 2일간 배양하였다. 상기 샘플들을 두 차례 분석하되, 농도를 10,000배 범위에 걸쳐 다양하게 하였다. 이후, 배양물들을 0.5μCi/웰의 ³H-티미딘 [뉴잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear), 미국 메사추세츠주 보스턴 소재]을 이용하여 4시간 동안 펄스화하였다. ³H-티미딘 흡수를 문헌 [Venuta, et al., Blood, 61, 781 (1983)]에 기술된 바와 같이 측정하였다.

WEHI -3B D ⁺ 분화 유도 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드가 쥐과의 골수단구성 백혈병 세포주 WEHI-3B D⁺의 분화를 유도하는 역량에 대해서는, 문헌 [Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980)]에 기술된 바와 같이 반고형성 아가 배지 중에서 분석하였다. 재조합 bG-CSF 생성물과 배지 대조군을 약 60개의 WEHI-3B D⁺세포/웰을 이용하여 37℃, 공기 중 5% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 샘플들을 24개의 편평 바닥 웰 플레이트에서 배양하되, 농도는 2000배 범위에 걸쳐서 다양하게 하였다. 콜로니들을 미분화, 부분 분화 또는 전부 분화로 분류하고, 현미경으로 콜로니 세포수를 계수하였다.

CFU - GM , BFU -E 및 CFU - GEMM 분석 인간 G-CSF 및 hG-CSF의 천연 분리물은 인간 골수 세포의 증식 및 분화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 활성은 건강한 인간 기증자의 저밀도, 비고착성(부유 상태) 골수 세포를 사용하는 CFU-GM (문헌 [Broxmeyer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)], BFU-E 및 CFU-GEMM 분석 (문헌 [Lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)]으로 측정된다. 다른 공급원의 세포를 사용할 수도 있다. 500 유닛의 G-CSF 또는 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드를 사용하여, CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 생물학적 활성의 비교를 수행하였다.

저밀도 비고착성 골수 세포를 사용하여 콜로니 분석을 수행하였다. 인간 골수 세포를 Ficoll-Hypaque (1.077 g/㎤, 파마시아)를 이용하여 밀도 차이를 유도하였다. 이후, 밀도가 낮은 세포들을 소태아혈청을 함유하는 이스코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium) 중에 재현탁시키고, 팰컨(Falcon) 조직 배양 접시 [No.3003, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 미국 매릴랜드주 코키스빌 소재)] 상에 부착을 위해 37℃에서 1/2시간 동안 놓아두었다.

배지 대조군은 이스코브의 변형된 둘베코 배지에 10% FCS, 0.2 mM의 헤민 및 1 유닛의 재조합 에리스로포이에틴으로 이루어진다. CFU-GM 분석을 위해, 맥코이(McCoy)의 5A 배지 및 10%의 열 불활성화된 소태아혈청을 보충하여 포함시킨 0.3% 아가 배지 1 ㎖에 표적 세포를 1×10⁵ 개의 세포로 플레이팅하였다. 배양물들을 콜로니에 대해 스코어링하였고(응집체 당 40개 초과의 세포), 그 형태는 배양 7일째에 평가하였다. 콜로니의 수는 네 차례의 플레이팅으로부터 계산된 평균값 ± 표준편차로 나타내었다.

BFU-E 및 CFU-GEMM 분석을 위해, 이스코브의 변형된 둘베코 배지(Gibco), 0.8% 메틸셀룰로스, 30% 소태아혈청, 0.05 nM 2-머캅토에탄올, 0.2 mM 헤민 및 1 유닛의 재조합 에리스로포이에틴의 혼합물 1 ㎖에 세포들(1×10⁵ 개)을 첨가하였다. 각 접시들을 5% CO₂ 및 5% O₂의 습한 대기 중에서 배양하였다. 낮은 산소 분압은 레밍 바이오인스트루먼트(Reming Bioinstrument)(미국 뉴욕주 시러큐스 소재)의 산소환원기(oxyreducer)를 이용하여 수득하였다. 배양 14일째에 콜로니들에 대해 스코어링하였다. 콜로니의 수는 두 차례의 플레이팅으로부터 계산된 평균값 ± 표준편차로 나타내었다.

CFU-GM 분석에서 형성된 콜로니들은 모두 유형상 과립성 백혈구인 콜로니와 같이, 클로르아세테이트 에스테라아제 양성이며 비특이적 에스테라아제(α-나프틸 아세테이트 에스테라아제) 음성인 것으로 예측되었다. 천연 G-CSF와 본 발명의 bG-CSF 폴리펩타이드 양자 모두는, CFU-GM 분석에서 연속 희석법에 의해 분석했을 때, 약 1×10⁸ U/mg 순도 단백질의 특이적 활성을 가지는 것으로 예측되었다. 본 발명의 bG-CSF는 대장균 내에서 생성될 수 있는 덕택에, 매우 순도가 높아 다른 잠재적인 포유류 성장 인자들이 없을 수 있다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, bG-CSF는 재조합 에리스로포이에틴의 존재 하에 추가될 시, 혼성 콜로니 형성(CFU-GEMM) 및 BFU-E를 지원할 수 있다.

접합 및 비접합 bG - CSF 와 이의 변이체에 있어서 생체 내 반감기의 측정

수컷 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 랫트(약 7주령)를 사용하였다. 투여 당일에, 각 동물의 체중을 측정하였다. 동물 체중 1 kg당 100 ㎍의 비접합 및 접합 bG-CSF 샘플을 세 마리의 랫트에 꼬리 정맥 내로 각각 정맥 내 주사하였다. 주사 후 1분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간 되는 시점에, 랫트를 CO₂-마취하고 500 ㎕의 혈액을 각 랫트로부터 채혈하였다. 상기 혈액 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 저장한 후, 원심분리(4℃, 18000xg로 5분간)에 의해 혈청을 분리시켰다. 상기 혈청 샘플은 분석 당일까지 -80℃에서 저장하였다. 혈청 샘플 내에 활성 bG-CSF의 양은 샘플을 해동한 후 bG-CSF의 시험관 내 활성 분석을 통해 정량하였다.

건강한 랫트 내에서 접합 및 비접합 bG-CSF와 이의 변이체 의 생체 내 생물학적 활성 측정

SPF 스프라그 다우리 랫트에서 bG-CSF의 생체 내 생물학적 효과를 측정하여 접합 및 비접합 bG-CSF와 이의 변이체의 생물학적 효능을 평가하였다. 랫트가 도착하는 즉시 무작위적으로 6개의 군으로 할당하였다. 상기 동물들을 7일간 쉬도록 하고, 여기서 좋지 않은 질환이 생긴 개체나 체중이 과도하게 나가는 것들은 불합격 처리하였다. 휴식기 개시일에 랫트의 체중 범위는 250-270 g이다.

투여 당일, 랫트들을 16시간 동안 금식시킨 후, 체중 1 kg당 100 ㎍의 bG-CSF 또는 이의 변이체를 피하 주사하였다. 각 bG-CSF 샘플을 6 마리가 무작위로 추출된 랫트의 군에 주사하였다. 투여 전, 그리고 주사 후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 및 144시간이 되는 시점에, 300 ㎍의 EDTA로 안정화된 혈액 샘플을 랫트의 꼬리 정맥에서 채혈하였다. 상기 혈액 샘플을 하기 혈액학적 매개변수에 대하여 분석하였다: 헤모글로빈, 적혈구 수, 적혈구 용적률, 평균 혈구 용적, 평균 혈구 헤모글로빈 농도, 평균 혈구 헤모글로빈, 백혈구 수, 백혈구 성분 백분율(호중구, 림프구, 호산구, 호염기구, 단핵 백혈구). 이들의 측정값을 기초로 하여, 접합 및 비접합 bG-CSF와 이의 변이체의 생물학적 효능을 평가하였다.

화학요법으로 호중구감소증을 유발시킨 랫트 내에서 접합 및 비접합 bG-CSF와 이의 변이체 의 생체 내 생물학적 활성 측정

상기 분석을 위해 SPF 스프라그 다우리 랫트를 사용하였다. 랫트가 도착하는 즉시 무작위적으로 6개의 군으로 할당하였다. 상기 동물들을 7일간 쉬도록 하고, 여기서 좋지 않은 질환이 생긴 개체나 체중이 과도하게 나가는 것들은 불합격 처리하였다. 휴식기 개시일에 랫트의 체중 범위는 250-270 g이다.

bG-CSF 샘플 투여 24시간 전, 항암 화학요법으로 초래되는 호중구감소증을 모의한 호중구감소증을 유발시키기 위해, 랫트 체중 1 kg당 50 mg의 시클로포스파미드(CPA)를 사용하여 랫트에 복강 내 주사하였다. 0일째 되는 날, 체중 1 kg당 100 ㎍의 bG-CSF 또는 이의 변이체를 피하 주사하였다. 각 bG-CSF 샘플을 6 마리가 무작위로 추출된 랫트의 군에 주사하였다. 투여 전, 그리고 주사 후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 및 144시간이 되는 시점에, 300 ㎕의 EDTA로 안정화된 혈액 샘플을 랫트의 꼬리 정맥에서 채혈하였다. 상기 혈액 샘플을 하기 혈액학적 매개변수에 대하여 분석하였다: 헤모글로빈, 적혈구 수, 적혈구 용적률, 평균 혈구 용적, 평균 혈구 헤모글로빈 농도, 평균 혈구 헤모글로빈, 백혈구 수, 백혈구 성분 백분율(호중구, 림프구, 호산구, 호염기구, 단핵 백혈구). 이들의 측정값을 기초로 하여, 접합 및 비접합 bG-CSF와 이의 변이체의 생물학적 효능을 평가하였다.

실시예 26

소의 혈액학적 반응에 있어서 bG - CSF - T133pAF 2 OK PEG 변이체의 영향을 평가하는 생체 내 연구

T133 위치에 단일 pAF 치환을 포함하는 재조합 bG-CSF (bG-CSF T133pAF-20K PEG)를 대장균 내에서 제조하였다. 상기 단백질은 N-말단 메티오닌을 가지며(서열번호 2), 서열번호 2에서 134번 위치의 트레오닌은 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환하였다. 상기 단백질을 20 KD 옥시아미노 PEG를 사용하여 pAF 도입 부위에서 PEG화하고, 양이온 교환 액체 크로마토그래피를 사용하여 >98% 순도로 정제하였다. 최종 제형은 4.26 mM NaAc; 5% 소르비톨; 0.0033% Tween 20; 0.565 mM NaCl (pH 4.0)로 이루어진 제형 버퍼 중에 7.377 mg/㎖의 PEG화된 bG-CSF를 포함하였다.

약 150 kg 중량의 시판되는 잉글랜드산 또는 북미산의 교배종 거세 수소를 구매하여 연구실로 운송하여, 이 곳에서 소들의 귀패를 각각 확인한 후 본 연구에 등록하기 전 7일간 환경에 적응시켰다. 소의 매입 또는 환경 적응 시기 동안에는 동물에게 항생제나 백신을 투여하지 않았다. 연구가 진행되는 동안에는 부수적으로 따르는 어떤 약물도 투여하지 않았다. 콘크리트 틈바닥(slotted floor)이 있는 축사에 동물을 수용하고 주위 온도에 노출시켰다. 동물들에게는 영양소를 고루 갖춘 펠렛화된 먹이(Rumilab® 5508)로 식욕을 돋구어 하루 한번 먹이를 주었다.

본 연구는 송아지들을 축사(블록)로 막아놓은 무작위 블록 완비 계획법(randomized complete block design)을 이용하여 수행하였다. 12마리의 동물들을 처리군 또는 음성 대조군(단백질이 없는 제형 버퍼)으로 할당하였다(6 마리/처리군). 동물들을 무작위로 블록으로 할당하고 블록 내에서 처리되도록 하였다.

실험 전날(-1일), 수의사가 질병의 임상적 징후에 대해 송아지들을 평가하였다. 평가 항목은 맥박수, 호흡률 및 직장 온도뿐 아니라, 전반적인 상태도 포함하였다. 체중과 직장 온도를 측정하고, 항응고 혈액 샘플을 혈액학 평가를 위해 수거하였다(처리 전 샘플). 문헌의 기준 범위를 기초로 정상적인 혈액학적 프로파일을 가지면서 질병의 임상적 징후가 없는 특정 체중 범위 내의 동물을 선별하여 본 연구에 포함시켰다.

실험 당일(0일), PEG화된 bG-CSF T133pAF (40 ㎍/kg) 또는 제형 버퍼 (1 ㎖/125kg)를 피하 주사하여 송아지들을 처리하였다. 주사는 목의 좌측에 극상근 부위에 투여하였다.

정맥의 전혈 샘플(~30㎖)을 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)(절대 백혈구 수 측정용) 또는 ACD (산-시트레이트-덱스트로스)(절대 호중구 수 측정용)를 포함하는 멸균 튜브 내에 수거하였다. 절대 백혈구 수는 베크만 카울터(Beckman Coulter) ACT₁₀™ 혈액 분석기를 이용하여 측정하였다. 절대 호중구 수(ANC)는 벡톤 디킨슨 FACSarray™ 생분석기를 이용해 CD45-염색된 전혈 샘플 중 호중구의 백분율을 유세포분석 평가함으로써 측정하였다. 절대 호중구 수는 절대 백혈구 수에 호중구의 백분율을 곱하여 계산하였다.

-1일에 수거한 처리 전 샘플 이외에, 샘플은 당일 4시간, 8시간 및 12시간째 되는 시점, 처리 후 24시간 및 36시간이 되는 시점, 그리고 3-14일째는 하루에 한번 채집하였다.

ANC에 대한 PEG화된 bG-CSF 투여의 결과를 도 16에 나타내었다. 제형 버퍼만으로 처리한 동물은 전반적으로 연구 기간 동안에 비교적 일정한 ANC 수치를 나타내었다. 이와는 반대로, PEG화된 bG-CSF를 투여받은 동물들은 처리 후 8시간 안에 ANC가 현저한 증가를 나타내었다. 최대 ANC 수치(대략 처리 전 수준의 10배)는 처리 후 72시간째 되는 시점에서 관찰되었다. 절대 호중구 수는 처리 후 5일째 되는 날까지 처리 전 수준에 비해 약 4배 내지 5배 감소하였고, 10일째가 될 때까지 이 수준을 유지하였다. 11일째에서 14일째 되는 날까지 수치는 더욱 떨어져 처리 전 수준의 약 3.5배까지 감소하였다.

이러한 결과들은 T133 위치에서 bG-CSF의 부위 특이적 PEG화로 강한 조혈 활성을 얻을 수 있음(단백질의 단회 투여 처리된 송아지에서 2주 이상 지속됨)을 시사하는 것이다.

실시예 27

bG - CSF - T133 PEG화된 변이체의 혈액학적 연구 요약

가축의 혈액학적 반응에 있어서 bG-CSF-T133pAF 2OK PEG 변이체의 영향을 평가하는 생체 내 연구를 수행하였다.

T133 위치에 단일 pAF 치환을 포함하는 재조합 bG-CSF를 대장균 내에서 제조하였다. 상기 단백질을 20 KD 옥시아미노 PEG를 사용하여 pAF 도입 부위에서 PEG화하고, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 >98% 순도로 정제하였다. 최종 제형은 4.26 mM NaAc; 5% 소르비톨; 0.0033% Tween 20; 0.565 mM NaCl (pH 4.0)로 이루어진 제형 버퍼 중에 7.377 mg/㎖의 PEG화된 bG-CSF를 포함하였다.

약 150 kg 중량의 시판되는 잉글랜드산 또는 북미산의 교배종 거세 수소를 구매하여 연구실로 운송하여, 이 곳에서 소들의 귀패를 각각 확인한 후 본 연구에 등록하기 전 7일간 환경에 적응시켰다. 소의 매입 또는 환경 적응 시기 동안에는 동물에게 항생제나 백신을 투여하지 않았다. 연구가 진행되는 동안에는 부수적으로 따르는 어떤 약물도 투여하지 않았다. 콘크리트 틈바닥(slotted floor)이 있는 축사에 동물을 수용하고 주위 온도에 노출시켰다. 동물들을 영양소를 고루 갖춘 펠렛화된 먹이(Rumilab® 5508)로 식욕을 돋구어 하루 한번 먹이를 주었다.

실험 당일(0일), PEG화된 bG-CSF (40 ㎍/kg) 또는 제형 버퍼 (1 ㎖/125kg)를 피하 주사하여 송아지들을 처리하였다. 주사는 목의 좌측에 극상근 부위에 투여하였다.

-1일에 수거한 처리 전 샘플 이외에, 샘플은 당일 4시간, 8시간 및 12시간째 되는 시점, 당일 24시간 및 36시간이 되는 시점, 그리고 3-14일째는 하루에 한번 채집하였다.

ANC에 대한 PEG화된 bG-CSF 투여의 결과를 도 17에 나타내었다. 제형 버퍼만으로 처리한 동물은 전반적으로 연구 기간 동안에 비교적 일정한 ANC 수치를 나타내었다. 이와는 반대로, PEG화된 bG-CSF를 투여받은 동물들은 처리 후 8시간 안에 ANC가 현저한 증가를 나타내었다. 최대 ANC 수치(대략 처리 전 수준의 10배)는 처리 후 72시간째 되는 시점에서 관찰되었다. 절대 호중구 수는 처리 후 5일째 되는 날까지 처리 전 수준에 비해 약 4배 내지 5배 감소하였고, 10일째가 될 때까지 이 수준을 유지하였다. 11일째에서 14일째 되는 날까지 수치는 더욱 떨어져 처리 전 수준의 약 3.5배까지 감소하였다(도 17 참조).

본 명세서에 기술된 실시예 및 실시 양태들은 단지 예시를 하기 위한 것이며, 이를 다양하게 변형 또는 변화시킬 수 있다는 점은 당업자라면 시사받을 수 있으며, 이러한 변형도 본 출원의 기술사상 및 범위, 그리고 첨부되는 청구 범위 내에 포함된다. 본 출원에 인용되는 모든 공보, 특허, 특허출원 및/또는 기타 문헌들은, 각각의 개별 공보, 특허, 특허출원 및/또는 기타 문헌들이 여러 가지 목적을 위해 각기 참조로서 본원에 포함된다고 명시한 바와 동일하게, 그 내용 전체가 본 명세서에 여러 가지 목적을 위해 참조로 포함된다.

실시예 28

bG - CSF T-133 PEG화된 변이체의 유선염에 대한 효능 연구 요약

유선염의 주요 병원균과 관련이 있는 천연 발생적인 유선 내 감염 질환에 있어서, 유선염 감염을 유도한 모델을 이용해 bG-CSF-T133pAF 2OK PEG 변이체의 질병 잠복기에서의 치료 효능을 평가하였다.

T133 위치에 단일 pAF 치환을 포함하는 재조합 bG-CSF를 대장균 내에서 제조하였다. 상기 단백질을 20 KD 옥시아미노 PEG를 사용하여 pAF 도입 부위에서 PEG화하고, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종 제형은 10 mM NaAc; 5% 소르비톨 및 0.0033% Tween 20 (pH 4.0)로 이루어진 제형 버퍼 중에 PEG화된 bG-CSF를 포함하였다.

사육하여 생산되는 짐승들 가운데 약 600-800 kg 중량의 복산성 홀스타인-프리시안(Holstein-Friesian) 전환기 소를 선택하였다. 본 연구에 등록하기 30일 이내에는 어떠한 항균 처리제도 투여하지 않았다. 동물들의 먹이는 분만 전에는 적당히 마른 소먹이를 공급해주었고, 분만이 시작되는 날부터 전환기 소먹이를 주어 본 연구가 진행되는 동안 계속 공급하였다. 동물들에게 신선한 물은 제한없이 허용하였다. 소들에게 일상적인 낙농 절차를 수반하여 1일 2회 착유하였다.

건강한 소들은, 목장 관리자의 사육 기록과 분만이 임박했다는 평가를 기초로 계산된 분만 예상일 약 7일 전에 본 연구에 참가시켰다. 완전 무작위 계획법(completely randomized design)에 따라 소들을 처리 군에 할당하였다. 각 처리 군은 약 50마리의 소를 포함하였다.

실험 참가 당일 그리고 분만 당일에, 멸균 생리식염수(음성 대조군), 일일 주사량(-7일째 ~ 6일째)의 PEG화되지 않은 bG-CSF T133pAF, 또는 다양한 투여량의 bG-CSF-T133pAF 2OK PEG 변이체를 피하 주사하여 소들을 처리하였다. 이러한 처리는 목의 극상근 부위에 피하 주사를 통해 투여하였다.

0-28일째에 각 처리군들에서 임의의 동물을 선별하여 각 동물로부터 착유시에 유선염의 임상적 징후에 대해 관찰하였다. 구체적인 관찰 항목으로는 우유의 외관 및 유선의 상태를 기초로 한 임상 스코어링 작업을 포함하였다. 조금이라도 이상한 점이 관찰되면, 그 피해 축사에 대해 캘리포니아 유선염 시험(California Mastitis Test)을 수행하고 그 동물의 직장 온도를 기록하였다. 본 연구를 수행하는 기간 동안 폐사한 동물은 가능하면 부검하여 그 사인을 알아보았다.

우유 생산량을 0-28일째에 각각 착유시에 기록하고, 우유 조성 분석(체세포 수, 유지, 유즙 단백질, 락토스 및 고형분 포함)을 위해 혼합 우유 샘플을 3일, 5일, 7일 및 10일째에 건강한 축사로부터 수거하였다. 또한, 박테리아성 병원균의 존재에 대한 임상적 이상성을 나타내는 축사에서도 추가의 우유 샘플을 수거하였다.

생식(임신) 건강에 대한 치료의 영향을 평가하기 위해, 본 연구에 참가한 모든 소에 대해 정상 출산율 및 재출산 후 인공 수정에 의한 초대 인공수정 성공률을 수집하였다. 또한, 모든 송아지들에 대해서도 생후 30일 동안 매일 건강을 관찰하여 기록하고, 이상한 점이 있다면 내용을 기록해 놓아 송아지의 건강에 대한 치료의 영향을 평가하도록 하였다.

소들과 개별 축사 양자의 경우에 대하여, 처리군들 간에 질병률을 비교하여 효능을 평가하였다. 2차 평가 목표로는 폐사의 발생, 우유 생산, 우유 조성 및 초대 인공수정 성공률에 대한 치료의 영향을 평가하는 것을 포함한다.

임상적 유선염 및 폐사의 발생률에 대한 다양한 치료의 영향을 표 10에 요약 기술하였다.

치료 설명	발병	폐사
멸균 식염수 (SID×2, -7일 및 0일)	26/50 (52%)	4
bG-CSF T133-pAF (3㎍/kg, SID×14, -7일 ~ 6일)	16/49 (33%)	6
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (40㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	6/53 (11%)	2
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (20㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	7/52 (13%)	3

일일 용량의 PEG화되지 않은 bG-CSF T-133 pAF 투여는, 식염수 대조군에 비해 새로운 임상적 유선염 감염 발생률을 현저히 감소시켰다. bG-CSF T133-pAF 2OK PEG의 투여는, 그 투여 용량에 상관없이, 식염수 대조군 또는 PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF를 일일 용량 주사한 것에 비해 새로운 임상적 유선염 감염의 발생률을 현저히 감소시켰다. bG-CSF T133-pAF의 투여는, 그 투여량에 상관없이, 식염수 대조군에 비해 폐사율의 수치를 조금 감소시켰다.

건강한 소의 일일 우유 생산량에 대한 치료의 영향을 도 18에 개괄하였다. 우유 생산 수준은 멸균 식염수, PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF 및 저용량의 bG-CSF T133-pAF 2OK PEG 중 하나의 것으로 처리한 소에 있어서는 유사하였다. 이러한 동물들은 본 연구를 진행하는 기간 동안 우유 생산량이 증가되는 현상을 나타냈다(일반적으로, 수유하는 첫 달 동안 정상적인 것으로 관찰된 동물). 고용량의 bG-CSF T133-pAF 2OK PEG로 처리한 동물들은 본 연구를 지속하는 동안 다른 처리군에 비해 현저히 감소된 일일 우유 생산량을 나타냈다.

체세포 수에 대한 치료의 영향을 도 19에 개괄하였다. PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF 또는 bG-CSF T133 pAF 2OK PEG로 처리한 동물들은, 분만 후 3일째, 5일째 및 7일째에 식염수 대조군에서 관찰된 것과 유사하거나 더 낮은 체세포 수를 나타냈다. 분만 후 10일째 되는 날에는, PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF 또는 bG-CSF T133 pAF 2OK PEG로 처리한 동물들의 체세포 수가 식염수 대조군의 체세포 수보다 현저히 더 낮아지는데, 이는 이러한 치료가 임상적 유선염 이외에도 비임상적 유선염의 발병률을 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

미생물학적 분석 결과, 병에 걸린 소들은 스트렙토코커스 종, 스타필로코커스 종 및 바실러스 종을 포함하는 통상적인 범주의 박테리아 병원체를 나타내고 있음을 알 수 있다. 이러한 결과들은 bG-CSF T133-pAF 2OK PEG의 투여가 그람 양성 및 그람 음성 종 박테리아 양자 모두에 대한 질병을 감소시키는데 유효한 것임을 시사하는 것이다.

정상 출산율 및 초대 인공수정 성공률에 대한 치료의 영향을 표 11에 개괄하였다. 치료군들 간에 정상 출산의 백분율에 있어서 그렇게 현저한 차이가 있지는 않았는데, 이는 본 실험적인 치료가 자궁 내의 송아지의 생존에는 아무런 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다. 초대 인공수정 성공률의 경우에는, PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF 또는 bG-CSF T133 pAF 2OK PEG로 처리한 동물들과 식염수 대조군 간에 수치 향상이 존재하였다. 이러한 결과는 본 실험적인 치료가 생식 건강에는 아무런 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 말해주는 것이다.

치료 설명	정상 출산%	초대 인공수정 성공률
멸균 식염수 (SID×2, -7일 및 0일)	94%	25.6%
bG-CSF T133-pAF (3㎍/kg, SID×14, -7일 ~ 6일)	98%	41.2%
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (40㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	92%	34.2%
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (20㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	93%	34.2%

치료에 대한 자궁 노출로 인해, 본 연구에 참가한 동물에게서 태어난 송아지의 건강에는 영향이 없는지에 대해 표 12에 그 내용을 개괄하였다. 이러한 결과들은, 본 실험적 치료 중 그 어떤 것도 식염수 대조군에 비해 생후 30일 동안의 장질환 또는 호흡기 질환의 발병률을 감소시키지 못했다는 것을 나타낸다. 그러나, PEG화되지 않은 bG-CSF T133-pAF와 bG-CSF T133-pAF 2OK PEG 양자 모두 식염수 대조군에 비해 폐사 동물의 수는 현저히 감소시켰다. 상기 결과는 본 실험적 치료가 질병의 극렬한 정도에 긍정적인 영향을 주었다는 사실을 의미하는 것이다.

치료 설명	장질환 발생	호흡기질환 발생	폐사
멸균 식염수 (SID×2, -7일 및 0일)	28	1	6
bG-CSF T133-pAF (3㎍/kg, SID×14, -7일 ~ 6일)	32	1	1
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (40㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	30	2	0
bG-CSF T133-pAF 20K PEG (20㎍/kg, SID×2, -7일 & 0일)	34	2	1

실시예 29

bG - CSF T-133 PEG화된 변이체의 호흡기 질환

효능 연구 요약

천연 발생적인 소의 호흡기 질환에 있어, 다양한 용량의 bG-CSF-T133-pAF 2OK PEG 변이체의 질병 잠복기에서의 치료 효능을 상업적인 사육장 조건 하에 평가하였다.

약 500 lbs 중량의 시판되는 잉글랜드산 또는 북미산의 교배종 거세 수소, 특히 시판되는 비육용 송아지들을 미국 남동부에 있는 하나 이상의 도매상 우사(salebarn)에서 구매하였다. 동물들이 도착하여 서로 합류하면, 이들을 각기 확인하여 수의사가 임상적 이상에 대해 검사하였다. 또한, 직장 온도를 기록하여 질병의 임상적 징후가 없고 ≤104 ℉인 직장 온도를 가지는 동물들을 선택하여 본 연구에 투입하였다. 이들을 처리하기 전에, 전체 백혈구 수와 성분 백분율을 위해 혈액 샘플을 수거하였다.

표 13에 개괄된 바와 같이 송아지들을 처리군으로 무작위 할당하였다.

처리	용량 처방	동물의 수
1) 멸균 식염수	SID×1	40
2) bG-CSF-T133 20K PEG (20㎍/kg)	SID×1	40
3) bG-CSF-T133 20K PEG (10㎍/kg)	SID×1	40
4) bG-CSF-T133 20K PEG (5㎍/kg)	SID×1	40

멸균 식염수 또는 bG-CSF-T133-pAF 2OK PEG를 목의 극상근 부위에 피하 주사로 투여하였다.

다음날 아침, 송아지들을 트럭에 싣고 이들을 북부 콜로라도에 있는 상업적인 사육장으로 약 1,400 마일 운송하였다. 도착하면, 송아지들을 도착 우리에 하차시키고 먹이와 물을 주었다. 도착 4시간 이내에, 동물들을 작업 장소로 옮겨 무게를 재고, 첫 10마리의 송아지들을 각 처리군으로 할당한 후, 전체 백혈구 수와 성분 백분율 검사를 위해 채혈하여 샘플을 수거하였다. 이러한 수치들은 절대 호중구 수의 증가로 확인할 수 있는 바와 같이 동물들이 치료에 반응하고 있다는 것을 확인하는데 사용한다. 우리당 총 20마리의 동물이 수용된 각 처리군으로부터 5마리의 송아지를 차출하여 연구 우리 내에 무작위로 할당하였다.

송아지들이 도착한 후 14일간은 수의사가 이들에 대해 무작위로 처리 과제를 설정하여 질병의 임상적 징후에 대해 매일 관찰하였다. 이에 따라 각 동물은 0 (건강함) 내지 4 (빈사 상태) 범위의 질병 스코어를 부여받게 된다. 질병 스코어가 >0 임을 나타내는 동물들은 작업 장소로 옮겨 이들의 직장 온도를 기록하였다. 질병 스코어가 >0 이고 직장 온도가 ≥104 ℉ 임을 나타내는 동물들은 질병에 걸린 것으로 여겨 적절한 항생제로 처리하여 연구 우리로 돌려보냈다. 연구 기간 동안 폐사한 동물들에 대해서는 그들의 유사성에 대해 기록해 두고, 그 동물을 부검하여 사인을 알아보았다.

효능을 측정하는 1차적인 목표는 처리군들 간의 상대적인 발병률을 알아보는 것이다. 효능 측정의 2차적인 목표는 각 처리군에 대한 발병률, 평균 일일 체중 증가량 및 평균 일일 질병 스코어를 확인하는 것을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> Hays Putnam, Anna-Maria Knudsen, Nick Norman, Thea Koder, Alan Kraynov, Vadim Ho, Lillian Canning, Peter <120> Modified Bovine G-CSF Polypeptides and Their Uses <130> AMBX-0154.00PCT <150> 61/083,132 <151> 2008-07-23 <160> 24 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met 35 40 45 Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Thr Ser Cys Leu Asn Gln Leu His Gly 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro 115 120 125 Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe 130 135 140 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catgcctgaa tcaactgcac 240 ggaggcctgt tcctgtatca gggtctgctg caggcgctgg ccgggatttc cccggagctg 300 gcaccgacac tggacaccct gcaactggat gtaacggact ttgctactaa catctggctg 360 cagatggaag atctgggagc ggccccagca gtgcaaccta cacagggcgc tatgccgacc 420 ttcacgtcgg cgtttcagcg tcgcgccggt ggcgttctgg tcgcaagcca actgcatcgt 480 ttcctggagc tggcgtaccg cggtctgcgt tatctggctg aaccgtaa 528 <210> 5 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 5 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 6 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized amber supressor tRNA <400> 6 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 7 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 7 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 8 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl 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p-azido-phenylalanine <400> 13 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 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Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 15 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 15 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly 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Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl-phenylalanine <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 18 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl -phenylalanine <400> 18 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp 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Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 21 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 22 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 22 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctgttatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tatatttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtga acatggtctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgggattcat 480 tatgagggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 23 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 23 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccagcccgc cggacca 77 <210> 24 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 24 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys 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Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305

Claims

서열번호 1의 133번 위치 또는 서열번호 2의 134번 위치에서 치환되는 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드로서,
pAF는 폴리 에틸렌 글리콜에 결합되고, 폴리 에틸렌 글리콜은 10 kDa 내지 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인
bG-CSF 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 폴리 에틸렌 글리콜이 20 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 bG-CSF 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유선염의 치료 또는 예방을 위한 조성물.
제1항의 bG-CSF 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산.
제4항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, pAF의 bG-CSF 내 도입에 특이적인 오르소고날 tRNA 합성효소 및 오르소고날 tRNA를 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함하는 벡터.
제4항의 핵산, 또는
제4항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터, 또는
제4항의 단리된 핵산, 및 pAF의 bG-CSF 내 도입에 특이적인 오르소고날 tRNA 합성효소 및 오르소고날 tRNA를 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함하는 벡터
를 포함하는 숙주 세포.
파라-아세틸페닐알라닌(pAF)을 포함하는 bG-CSF 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
bG-CSF 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서, 제7항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
bG-CSF 폴리펩타이드를 정제하는 단계; 및
bG-CSF 폴리펩타이드를 PEG화시키는 단계
를 포함하는 제조 방법.
제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드 또는
제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물
을 포함하는, 유선염의 치료 또는 예방을 위한 제약 생성물.
비인간 동물에게 제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 비인간 동물에서 유선염을 치료하는 방법.
제10항에 있어서, 동물이 소과인 방법.
제11항에 있어서, 유선염이 소과 유선염인 방법.
제12항에 있어서, 소과 유선염 감염이 박테리아성 감염인 방법.
비인간 동물에게 제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는, 비인간 동물에서 유선염을 예방하는 방법.
제14항에 있어서, 동물이 소과인 방법.
제15항에 있어서, 유선염이 소과 유선염인 방법.
유선염을 가지는 비인간 동물에게 치료 유효량의 제3항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 유선염을 가지는 비인간 동물을 치료하는 방법.
제17항에 있어서, 동물이 소과인 방법.
제18항에 있어서, 유선염이 소과 유선염인 방법.
비인간 동물에게 제3항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비인간 동물에서 유선염을 예방하는 방법.
제20항에 있어서, 동물이 소과인 방법.
제21항에 있어서, 유선염이 소과 유선염인 방법.
제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는, 유선염의 치료를 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항의 bG-CSF 폴리펩타이드를 포함하는, 유선염의 예방을 위한 제약 조성물.
제3항에 있어서, 유선염의 치료를 위한 조성물.
제3항에 있어서, 유선염의 예방을 위한 조성물.
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