MX2011000859A - Polipeptidos g-csf bovinos modificados y sus usos. - Google Patents

Abstract

Polipéptidos G-CSF bovinos modificados y usos de los mismos tal y como están descritos.

Description

POLIPEPTIDOS G-CSF BOVINOS MODIFICADOS Y SUS US PO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polipéptidos factor colonias de granulocitos bovino (bG-CSF) op ificados con al menos un aminoácido no codificado ural .

ECEDENTES DE LA INVENCIÓN El impacto económico de las enfermedades infecci ducción de animales destinados a alimentación umentado. Las enfermedades infecciosas reducen los entan los costes de producción y ponen en peligro lo menticios, así como afectan al rendimiento, la s nestar del animal . Las enfermedades pueden r dimiento y la calidad de la leche dando como resulta dida económica para productores lecheros y productor vacuno, particularmente cuando en algunos jas y cabras. La mastitis bovina es una infección de iantes tales como vacas, provocada principalmente po m positivas y gram negativas y especialmente en dades de producción de leche intensivas. La teriana da como resultado la inflamación de. la glánd decir pezones y ubre) . Los animales pueden vo ceptibles a la mastitis debido a una función micro trófilos afectada durante el periodo peripartu ermedad es particularmente problemática y de nómica considerable porque el patógeno se transfiere un animal a otro durante el proceso de ordeño. Con desarrolla en las primeras semanas alrededor del pa ver a aparecer con cada lactancia. Algunos de los roorganismos patógenos que provocan mastitis b philococcus. aureus, Streptococcus agalactiae, St ris, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, ogenes, Klebsiella pneumoniae y Pséudomonas aerugin ógenos que provocan mastitis se dividen en dos cretamente, contagiosos y ambientales. Las tagiosas, tales como Streptococcus agalactiae y Sta eus, colonizan principalmente sitios de tejido hué o glándulas mamarias, conductos de pezón y lesiones pezón; y se propagan de una vaca infectada a otra ceso de ordeño. Las bacterias ambientales, con reptococos, enterococos y organismos coliform sentes comúnmente en el entorno- de la vaca proc ntes tales como heces de vacas, tierra, materia hos o agua; e infectan mediante contacto oportunista animal. La distinción entre patógenos cont ientales, aunque no exclusiva, es de importanci que se necesitan diferentes medidas de mantenimiento heros para los diferentes grupos de microorganismos casos de mastitis bovina, independíentem roorganismo causante, la vía de transmisión de ección de ubre: la invasión de la cavidad de la roorganismos que se multiplican dentro de la vocan inflamación; (2) mastitis no clínica o subcl ma de mastitis en la que no hay hinchazón de la malía observable de la leche, aunque hay cambios e pueden detectarse mediante pruebas específicas. Es titis es con diferencia la más prevalente y provoc dida global en la mayoría de los rebaños. Con fre omina mastitis "oculta". (3) Mastitis clínica: un titis en la que los estados anómalos de la ubre y l observables. La mastitis clínica leve implica cam he tales como copos, coágulos y un aspecto aguado o or y la sensibilidad de la ubre son ligeros o aus de haber signos de hinchazón. La mastitis clínica gr repentina aparición con hinchazón del cuarto inf á caliente, duro y sensible. El aspecto de la leche disminuye la producción de leche. Algunas veces, ade pués ele estos "brotes" normalmente vuelve témpor ma no clínica. (Véase generalmente Current Concepts titis, publicado por The National Mastitis Council 1978 en la pág. 5) .

La mastitis continúa provocando grandes pérdidas e industria lechera. La mastitis afecta a la rentabil año de varias maneras, tanto directa como indi luyendo: (1) pérdida de producción de leche; (2) carte superiores de vacas infectadas, (3) disminució la leche; (4) leche desechada tras el trata ibióticos; (5) costes veterinarios (antibióticos y erinario) ; y (6) muertes. (Bovine Mastitis, Glenys ado anteriormente, en la pág. 33) .

Otra enfermedad común que afecta a la industria fiebre de embarque (enfermedad respiratoria bovina se ha denominado por algunos un "complejo de enferm motivos : habitualmente está provocada por una v tete, el embarque, el cambio de alimentación y la v humedad y temperatura ambiental, pueden preceder y c infección. En muchos casos esto se añade a la expo ado a patógenos durante el embarque cuando se co ado de otro origen en camiones, corrales y granjas d do como resultado la alta incidencia de la enfermeda regado a la explotación ganadera de engorde.

Se han aislado varias especies de bacterias y se h la ERB, y algunas de las más comunes son molytica, Pasteurella multocida y (o) Histophil mophílus soinnus es un patógeno virulento que provoca ganado y algunas veces las manifestaciones resultan ominado "complejo de Haemophilus somnus" , de las ma es la enfermedad respiratoria, virus t otraqueítis bovina infecciosa (RBI) , diarrea viral b virus sincitial respiratorio bovino (VSRB) tamb ticipar en iniciar un complejo de ERB, abriendo con os ele fiebre de embarque es una ¦ neumonía bitualmente Pasteurella) . La Pasteurella h ticularmente de tipo IA, .es la bacteria más común casos de enfermedad respiratoria en Norteaméric es la vacunación contra algunos de los agentes licados en la fiebre de embarque es útil, pero las v án disponibles y son eficaces para unos pocos de l se sabe que están implicados en el complejo de enfer La terapia con antibióticos ha sido una component la estrategia de control de mastitis y, ERB. adounidense n.s 7.182.948, que se incorpora como re sente documento en su totalidad, indica que se ha m baños para pezones antimicrobianos que contienen caces contra infecciones de mama y bacterias qu titis (Pankey, J. W. et al., (1983) J. Dairy Sci. 6 ) . Estas composiciones se administran habitualment ergiendo o pulverizando el pezón antes del ordeño as r ejemplo ácidos alquilaril-sulfónicós) , dióxido d tir de clorito) , y bisbiguanidas tales como clorhexi ntes, que , tienen diversos grados de eficacia/ nsmisión de la mastitis reduciendo las poblaciones d el pezón. Sin embargo, existen problemas asociados compuestos antimicrobianos. El más prevalente es la pezón y el agrietamiento del pezón. Para ali blemas, se han incluido aditivos emolientes t cerina y lanolina en tales composiciones. Sin embar el uso de esos emolientes todavía se produce irrit l .

La patente estadounidense n.9 6.790.867, que se o referencia al presente documento en su totalidad, dén usarse inyecciones subcutáneas de formulac binan un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AIN nixina, con un antibiótico derivado de tian ranfenicol fluorado tal como florfenicol, para trat taca la importancia de una higiene de los pezones o también un cuidado de los pezones adecuado para la la mastitis. El daño económico provocado por la m ducido a mucha investigación sobre su control . Se ha los estreses físicos así como las condiciones a bi ndes factores de contribución a la infección de mast publicación de patente estadounidense n.2: 200200517 orpora como referencia. Desde que se documentó que clínica estaba directamente relacionada con un mal pezones (Neijenhuis, P. et al., (2001) J. Dairy Sci. 2), han surgido varias disoluciones de baño pa erciales que incorporan agentes de acondicionamient titis Council, Su mary of Peer-Reviewed Public icacy of Premilking and Postmilking Teat Di lished Since 1980; enero de 2002) . Se ha mostra osidad y la callosidad de la punta del pezón ación directa con la mastitis clínica (Neijenhuis, tenido en glicerina desde el 2% hasta el 10% en una baño para pezones de yodo al 1% (National Mastiti mary of Peer-Revie ed Publications on Efficacy of Postmilking Teat Disinfectants Published Since 1980 2) . Por tanto, aunque están disponibles productos oluciones de baño para pezones, todavía existe una n uelta de modular la incidencia, recurrencia y/o gra titis .

La patente estadounidense . n. s 5.849.883, que se o referencia al presente documento en su totali ocer varios antibióticos usados en el tratamie titis incluyendo, pero sin limitarse a, a alactámicos tales como penicilinas (ampicilina, e acilina, nafeilina, penicilina G, (bencil-p caína-penicilina) y cefalosporinas (cefoperazona, alonio, cefapirina, cefoxazol, cefracetril) ; a noglicósidos ( framicetina, neomicina, n inistrarse antibióticos por vía parenteral ya usiones intramamari s son ineficaces debido al bloq ductos .

No se han conseguido las esperanzas iniciales ibióticos " permitirían un control completo de la guno de los antibióticos mencionados anteriormente ta ahora ha sido totalmente satisfactorio. Adiciona encontrado que es muy deseable sustituir el trata ibióticos por un tratamiento mediante compuestos d mioterápicos no antibióticos, por los siguientes mo deben usarse en la medicina veterinaria antibiótico la medicina humana, con el fin de no acumular resi a de bacterias que aparecen en enfermedades humana ibióticos deben reservarse para enfermedades para un compuesto de fármaco quimioterápico disponible, demostrado que las cepas bacterianas acumulan resist ibiótico tras un uso prolongado de tal antibióti menos ion compuesto de disulfuro de N-óxido de piri odo, de los mismos inventores se describe en adounidense n.s 4.401.666, que se incorpora como ref sente documento, que' reivindica un método para trat a la mastitis bovina con una cantidad eficaz de al metálica de 2-tiona-N-óxido de piridina. A pesar ios métodos publicados, sigue siendo muy importante odos rentables utilizando compuestos no antibió eren sustancialmente los inconvenientes de los a dos hasta ahora y sin embargo sean eficaces en el tr prevención de la mastitis.

Otra enfermedad común que afecta a la industria fiebre de embarque (enfermedad respiratoria bo ermedades respiratorias son una causa principal de ermedad en el ganado vacuno. La expresión "fiebre d usa para describir el complejo de enfermedades re ervado en el ganado de 6 meses de edad o más tras el osición a agentes infecciosos. La patente estadoun 97.869, que se incorpora como referencia al presente cribe algunos de los agentes infecciosos iniciales ctar al ganado. La mezcla de población puede ser un disposición más importante para la fiebre de embarq tores de estrés, aunque la enfermedad puede prod clar y los factores de estrés habitualmente sticamente la enfermedad respiratoria. Algunas entos por reducir el estrés del destete, la cast cornado, etc. y aclimatar el ganado a nuevas die anas antes del embarque son satisfactorios (pero pu tables) para reducir la incidencia de fiebre de unas veces la vacunación contra algunos de l ecciosos implicados en la fiebre de embarque es útil, vacunas disponibles y eficaces para unos pocos de se sabe que están implicados en el complejo de enfe Generalmente se reconoce que la causa final de m oplasma y/o las clamidias con más frecuencia provoc cial a las vías respiratorias, lo que predispone a l teriana grave y la enfermedad.

Un brote típico de . enfermedad respiratoria clínic itualmente en el plazo de horas o días desde la 1 ado a la explotación ganadera de engorde. El gan arcado en el intervalo de peso de 400 a 500 li únmente una morbilidad del 10 al 80% y una mortalida , o más, en cuanto a la enfermedad de las vías res ndo se analiza el suero de ganado para un icuerpos de cuatro. veces (seroconversión) y se somet piratorias y sus secreciones a aislamientos micro de identificarse una miríada de agentes etiológi trarse que muchos animales, los enfermos y los ap os, han experimentado infección por uno o m obablemente la enfermedad de las vías respiratori a vez a un único agente infeccioso) . Aunque el c La administración de un compuesto que trata o idencia, recurrencia, duración y/o gravedad de la ma ermedad respiratoria en ganado u otras infecciones humanos, incluyendo/ pero sin limitarse a, ganad ral, cerdos, caballos, perros y gatos, seria ú icina veterinaria. Ejemplos de tales infecciones inc se limitan a, septicemia neonatal en caballos, ple cerdos, y neumonía en animales no humanos. Tales dén restaurar o modular la función de los neutróf mal .

La familia de supergenes de la hormona del creci zan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991); Mott pbell, I. D. Current Opinión in Structural Biology 95); Silvennoinen,¦ 0. e Ihle, J. N. (1996) SIGNAL ATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) representa un c teínas con características estructurales simila mbro de esta familia de proteínas comprende un haz erferón tau, interferón épsilon, factor estimulante granulocitos (G-CSF) , factor estimulante de c nulocitos y macrófagos (GM-CSF) , factor estimulante macrófagos (M-CSF) y cardiotrofina-1 (CT-I) (Mla ergeñes de GH"). Los miembros de la familia de super nen estructuras secundarias y terciarias similares, ho de que generalmente tienen una identidad de secue aminoácidos limitada. Las características es partidas permiten identificar fácilmente nuevos miem ilia génica. Se describen polipéptidos de haz de cua el documento WO 2005/074650 titulado "Modified ical Bundle Polypeptides and'Their Uses", que se inc erencia en su totalidad.

Un miembro de la familia de supergenes de GH es imulante de colonias de granulocitos (G-CSF) . imulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es ersos factores de crecimiento de glicoproteínas con imulante de colonias de granulocitos es un potent a la proliferación de neutrófilos y la maduració hen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 1987; 84: 2484-bién Heidari et al., Vet. Immunol. Immunopathol . 200 incorporado al presente documento como referencia) bién puede inducir la activación funcional o trófilos maduros in vitro (Weisbart, R. H., Gasson, Golde. Annals of Internal Medicine 1989; 110:297-3 trado que el G-CSF ceba los granulocitos humanos y eración de superóxido estimulada por el péptido qui ormil-metionil-leucil-fenalalanina (S. Kitagawa, che . Biophys . Res. Commun. 1987; 144: 1143-1146, han, Blood 1989; 74:301-306), y activa la fagocitos IgA de neutrófilo humano (Weisbart, R, H., et a 8; 332: 647-649) .

Los neutrófilos son un componente crítico de los defensa del huésped contra infecciones bacterianas ela que la proteína tiene 204 aminoácidos de longit uencia señal de 3 aminoácidos. La proteína madura noácidos de longitud y no presenta ningún posibl cosilacion unida a N pero presenta varios posibles glicosilación unida a O. Se ha , descrito la clon resión de ADNc que codifica para G-CSF humano por gata, S. et al., Nature 319, 415-418 (1986); Souza, , Science 232, 61-65 (1986)). El primer informe de c de G-CSF sugirió que la proteína madura tenía 177 longitud. Los autores notificaron que tambi ntificado un clon de ADNc para G-CSF que codificab teína que carecía de un tramo de tres aminoácidos . corta de ADNc de G-CSF expresa la actividad de G-CS segundo informe describe una secuencia de ADNc idén ma corta y no menciona nada de otras variantes . Dad ores confirmaron que el ADNc corto expresa G-CSF co erado de actividad biológica, es probable que esta s sente documento, describe hibridomas que producen ocionales específicos para G-CSF humano y su ificación de G-CSF; el documento O 8702060, que se o referencia al presente documento, da a conocer p ilares a G-CSF humano y métodos de producción de los ente estadounidense, n.2 4.810.643, que se inco erencia al presente documento, da a conocer p ilares a G-CSF humano, secuencias que codifican para métodos para su producción; y los documentos WO 86 4506, que se incorporan como referencia al presente a conocer un gen que codifica para G-CSF humano e la infección que contienen G-CSF humano. El aislami F y la producción de G-CSF en células huésped tal i se describen, por ejemplo, en las patentes esta s 4.810.643; 4.999.291; 5.580.755; y 6.716.606, orporan como referencia al presente documento.

El G-CSF es una proteína farmacéuticamente activa tivo celular de la línea celular de carcinoma de vej 7 (Welte et al., Proc. Nati. Acad. Sci (1985) 82:15 uencia del ADNc que codifica para hG-CSF nativo s tir de Souza et al., Science (1986) 232:61 secuencia del corte y empalme alternativo en el seg sten dos formas que se producen de manera natural de ó 207 aminoácidos de los cuales los 30 primeros rep tido señal (Lymphokines, IRL Press, Oxford, Washin tores D. Male y C. Rickwood) . Se ha mostrado que 1 ura tiene un peso molecular de aproximadamente 19 kD iduos de cisteína que pueden formar puentes ermoleculares o intramoleculares . Estudios de trado que el hG-CSF se une a granulocitos neutr erva de poca a ninguna unión con líneas celulares foides, eritroideas, así como con macrófagos.

En seres humanos, el G-CSF endógeno puede detect sma sanguíneo (Jones et al. Bailliere's Clinical He a una proteína de 174 aminoácidos (Nagata et al. EMB (1986)), y se ha encontrado que la forma compues noácidos tiene la mayor actividad biológica especifi hG-CSF reacciona de manera cruzada entre especies, cuando se administra G-CSF humano a otro mamífero t on, perro o mono, se provoca una leucocitosis de tenida (Moore et al. PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987)).

El G-CSF puede obtenerse y purificarse a partir ntes. Puede aislarse G-CSF humano natural (nhG-CSF) renadantes de líneas celulares de tumor humano en arrollo de la tecnología de ADN recombinante, mplo, la patente estadounidense n.2 4.810.64 orporada en el presente documento como referencia, h producción de cantidades a escala comercial de G-CS cosilada como producto de la expresión en célul ariotas, y de G-CSF en forma no glicosilada como pro resión en células huésped procariotas . icit hematopoyéticos. resultantes de la quimioter ioterapia. Otras indicaciones incluyen el trat ersas enfermedades infecciosas y estados relaciona o sepsis, que está provocada normalmente por un me terias. El G-CSF también es útil solo, o en combi os compuestos, tales como otras citocinas, para el la expansión de células en cultivo, por eje splantes de médula ósea.

El receptor de G-CSF (G-CSFR) es un miembro de la eptores de factor de crecimiento/citocinas/hematopoy luye varios otros receptores de factor de crecimie o los receptores de interleucina (IL)-3, 4 y 6, el r tor estimulante de colonias de granulocitos y macr ) , el receptor de eritropoyetina (EPO) , asi como los prolactina y hormona del crecimiento. Véase, Bazan, d. Sci USA 87 :' 6934-6938 (1990) . Los miembros de la eptores de citocinas contienen cuatro residuos d Se ha comparado el hG-CSF glicosilado con glicosilado, preparado mediante digestión enzimátic neuraminidasa y endo-a-N-acetilgalactosaminidasa, c u estabilidad como una función del pH y la temperatu al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (20): 11432-35). glicosilado, disuelto a una concentración de 1 µg/ml fato 20 mM que contiene NaCl 0,2 M y Tween 20 a ctivó rápidamente dentro del intervalo de pH oximadamente , 7 hasta aproximadamente 8 tras una in días a 372C. En cambio, el hG-CSF glicosilado conse de su actividad en las mismas condiciones. luación de la estabilidad térmica de ambas formas ida mediante ensayo biológico y análisis calorímetr el hG-CSF desglicosilado era menos estable térmicam ma nativa de hG-CSF.

Se han empleado varios enfoques con el fin de p osiciones de G-CSF farmacéuticamente ace tables e porcionar protección frente a la degradación prote específicamente, moléculas de G-CSF modificadas en erminal que llevan polímeros unidos químicamente, ietilenglicol .

Se han determinado las estructuras de varias luyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett, 314:435 (1992 , Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. .- USA 90:5167 (1993)), GM-CSF. (Diederichs, K. , et : 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol . 22 92)), IL-2 (Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Science 257: 412 (1992)), IL-4 (Redfield et al., B 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 25 92)), e IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-1 iante estudios de difracción de rayos X y RM y m servación sorprendente con la estructura de la GH, falta de homología de secuencia primaria significati Un enfoque alternativo para aumentar la estabilid uentran en las posiciones 65 y 66, están todos sust residuo de serina. La patente estadounidense n.a 5.7 ocer los análogos de G-CSF modificados por ingenier se han conjugado de forma covalente a un polímero a.

Las diversas formas de G-CSF humano, incl paración y purificación, útiles en un método par venir la mastitis se describen en detalle en adounidense n.s 4.810.643, que se incorpora a umento como referencia. La patente estadounidense n. cribe y reivindica segmentos génicos novedosos, ombinantes biológicamente funcionales y vectores de ulas huésped procariotas y eucariotas, que contienen SF o una variante modificada por ingeniería genética G-CSF. Las células huésped expresan G-CSF biológicam una variante modificada por ingeniería genética de ente estadounidense n.e 5.849.883 y el documento ipéptido y análogos del mismo. El b-GCSF maduro noácidos de longitud (SEQ ID NO: 1) que tienen ología con el hG-CSF. Se muestra un polipéptido bG-iduo de aminoácido metionina inicial como SEQ ID uencia de polinucleótido que codifica para SEQ ID stra como SEQ ID NO: 3. La secuencia de polinucl ifica para SEQ ID NO: 2 se muestra como SEQ ID NO: al. describen la expresión, purificación y lógicas de bG-CSF en Veterinary Immunology and Immu 01) 81 :45-57.

La unión covalente del polímero hidrófilo politeti eviado PEG, es un método para aumentar la solubilid disponibilidad, aumentar la semivida en suero, a ivida terapéutica, modular la inmunogenicidad, ividad biológica, o extender el tiempo en circulació éculas biológicamente activas, incluyendo proteínas, ticularmente moléculas hidrófobas. Se ha usado PEG ubilidad en agua y semi ida circulante, sin afecta mpo de manera adversa a la bioáctividad de l ginal .

Los derivados de PEG se unen con frecuencia a lógicamente activas mediante funcionalidades ctivas, tales como residuos de lisina, cisteina e his remo terminal y los restos de hidratos de ca teínas y otras moléculas con frecuencia tienen itado de sitios reactivos disponibles para la unión frecuencia, los sitios más adecuados para la m iante unión a polímero desempeñan un papel significa on a receptores, y .son necesarios para conservar la lógica de la molécula. Como resultado, la unión ind cadenas de polímero a tales sitios reactivos en un lógicamente activa con. frecuencia conduce a una nificativa o incluso pérdida total de la actividad b molécula modificada con polímero, R. Clark et al., Los sitios reactivos que forman los loci para l ivados de PEG a proteínas vienen dictados por la es proteína. Las proteínas, incluyendo enzimas, están diversas secuencias de alfa-aminoácidos, que ructura general H2N-CHR-COOH . El resto amino alfa ( noácido se une al resto carboxilo {--COOH) de un acente para formar uniones amida, que pueden represe H-CHR-CO)n--, en los que el subíndice n" puede s ntos o miles . El fragmento representado por R pued ios reactivos para la actividad biológica de la prot unión de derivados de PEG.

Por ejemplo, en el caso del aminoácido lisina,-to -NH2 en la posición épsilon así como en la posici 2 épsilon está libre para su reacción en condici ico. Gran parte de la técnica en el campo de la der proteínas con PEG se ha dirigido a desarrollar deriv a su unión al resto -NH2 épsilon de residuos de lisin mplo en un sitio activo enzimático, o en los casos residuo de lisina desempeña un papel en la media eracción de la proteína con otras moléculas bioló o en el caso de sitios de unión a receptores .

Una segunda, e igualmente importante, complicac odos existentes para la pegilación de proteínas . ivados de PEG pueden experimentar reacciones secu eadas con residuos distintos de los deseados. La tiene un resto imino reactivo, representado estru o -N(H)-, pero muchas especies químicamente rea ccionan con -NH2 épsilon también pueden reaccionar manera similar, la cadena lateral del aminoácido cis grupo sulfhidrilo libre, representado estructuralme En algunos casos, los derivados de PEG dirigidos al ilon de lisina también reaccionan con cisterna, h os residuos . Esto puede crear mezclas heterogéneas c éculas bioactivas derivatizadas con PEG y riesgos Además de los residuos de lisina, se ha dirigido u siderable en la técnica hacia el desarrollo de reacti ivadps que se dirigen a otras cadenas laterales de a luyendo cisteína, histidina y el extremo N-termina ejemplo, la patente estadounidense n.s 6.610.2 orpora como referencia al presente documento, y wP col and Derivatives for Advanced PEGylation" , Nektar ineering Catalog, 2003, págs. 1-17. Puede intro iduo de cisteína de manera selectiva para el si ructura de proteínas usando mutagénesis dirigida as técnicas conocidas en la técnica, y puede hacerse resto sulfhidrilo libre resultante con derivados van grupos funcionales reactivos con tiol . Sin emb oque es complicado porque la introducción de fhidrilo libre puede complicar la expresión, el ple estabilidad de la proteína resultante. Por ta eable tener un medio para introducir un grupo funció to - H2 en la cadena lateral del aminoácido lisina y en la cadena lateral de cisterna, han demos blemáticos en cuanto a su síntesis y uso. Algú ones inestables con la proteína que se ven s rólisis y por tanto se descomponen, degradan o son d stables en entornos acuosos, tales como en e guíneo. Algunos forman uniones más estables, pe etidas a hidrólisis antes de formarse la unió nifica que el grupo reactivo en el derivado de ctivarse antes de que pueda unirse la proteína. A o tóxicos y por tanto son menos adecuados para su us unos tardan demasiado en reaccionar como para ser út ctica. Algunos dan como resultado una pérdida de l la proteína uniéndose a sitios responsables de la a proteína. Algunos no son específicos en cuanto a lo que se unen, lo que también puede dar como res dida de la actividad deseable y una falta de repro esidad en la técnica de derivados de PEG que sean q rtes en entornos fisiológicos hasta que se recurra a ccionar de manera selectiva para formar enlace ables ..

El uso de conjugados de hidroxialquilalmidón, y en uso de hidroxietilalmidón (HES) , unidos de forma cov ipéptido, se ha dado a conocer con el fin iblemente la inmunogenicidad y/o alergenicidad del p ylation (tratamiento con HES) es una tecnología alte ha dado a conocer en una serie de solicitudes idas a Fresenius Kabi AB incluyendo las public ente estadounidense n.os 20050063943, 20060121073, 2 50234230, 20050238723, 20060019877, 20070134197, 2 como la patente estadounidense n.s 7.285.661, todas incorporan al presente documento como referencia, imero natural modificado que se ha usado clínica ansor de volumen de plasma y la HESylation rep ecular de HES, puede diseñarse a medida una ampl jugados de HES. No obstante, el hidroxietilalmidón c ventaja común con todos los demás polímeros ualmente : su. polidispersidad. Los conjugados polim mezcla de moléculas que tienen pesos moleculares d ededor de un valor promedio. Esta falta de homogenei ultado un nivel bajo de caracterización química y b de impedir que el componente farmacéuticamente acti sitio de acción (receptor, enzima, etc.). En esto maco para ser activo requiere su administración e ginal no conjugada, y por tanto se requiere la es imero mediante reacciones metabólicas para su macéutica .

Recientemente, se ha notificado una tecnología va en la ciencia de proteínas, que promete superar limitaciones asociadas con las modificaciones espe io de proteínas. Específicamente/ .se han añad oisomerizables , aminoácidos de fotorreticulación (v mplo, Chin, J. W. , et al. (2002) Proc. Nati. Acad. S : 11020-11024; y, Chin, J. W. , et al.,' (2002) J. Am. :9026-9027), ceto-aminoácidos , aminoácidos que conti ados y aminoácidos glicosilados , se han incorporado caz y con alta fidelidad en proteínas en E. coli y respuesta al codón ámbar, TAG, usando esta metodolog ejemplo, J. W. Chin et al., (2002), Journal of' t mical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G 02), ChemBioChem 3 (11) : 1135-1137; J. W. Chin, et a S United States of America 99: 11020-11024; y, L. a ultz, (2002), Chem. Comm. , 1:1-11. Todas las refe orporan como referencia en su totalidad. Estos es ostrado que es posible introducir de manera s inaria grupos funcionales químicos, tales como gru pos alquino y restos azida, que no se encuentran en son químicamente inertes frente a todos los grupos cisteína, el grupo imino de histidina, etc. Se erminados grupos funcionales químicos son inertes fr pos funcionales que se encuentran en los 20 uñes, codificados de manera genética pero reaccionan pia y eficaz para formar uniones estables. Se co nica que los grupos azida y acetileno, por erimentan una reacción de cicloadición [3+2] de diciones acuosas en presencia de una cantidad cat re. Véanse, por ejemplo, Tornoe, et al., (2002) L 3057-3064; y, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Che : 2596-2599. Introduciendo un resto azida en una teica, por ejemplo, puede incorporarse un grupo fu químicamente inerte frente a aminas, sulfhidril boxílieos, grupos hidroxilo que se encuentran en o que también reacciona suave y eficazmente con tileno para formar un producto de cicloadición. ortante, en ausencia del resto acetileno, la azida ARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona polipéptidos bG-CSF que o más aminoácidos no codificados de manera natural.

En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF co ás modificaciones postraduccionales . En algunas rea polipéptido bG-CSF se une a un ligador, polímero lógicamente activa. En algunas realizaciones, el CSF se une a un polímero bifuncional, ligador bifunc os un polipéptido bG-CSF adicional.

En algunas realizaciones, el aminoácido no cod era natural se une a un polímero soluble en agua. lizaciones, el polímero soluble en agua comprende u i (etilenglicol ) . En algunas realizaciones, el ami ificado de manera natural se une al polímero solub un ligador o se une al polímero soluble en agua. lizaciones, la molécula de poli (etilenglicol) es u uncional. En algunas realizaciones, el polímero bif En algunas realizaciones, se incorpora uno o más codificados de manera natural- en una o más de las iciones en bG-CSF: antes de la posición 1 (es d remo N-terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 1 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, , 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, , 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, , 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, , 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, , 174, 175 (es decir, en el extremo carboxilo term teína) , y cualquier combinación de las mismas (SEQ lizaciones, se incorpora uno o más aminoácidos no manera natural en una o más de las siguientes posici : 3, .7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123·, 124, 133, , y cualquier combinación de las mismas (SEQ ID N noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2) . lizaciones, se incorpora uno o más aminoácidos no manera natural en una o más de las siguientes posici : 3, 7, 62, 133, 166, y cualquier combinación de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en : 2. En algunas realizaciones, se incorpora' u noácidos no codificados de manera natural en una o uientes posiciones de bG-CSF: 62, 133, y una combina mas (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondientes NO: 2) . En algunas realizaciones, se incorpora noácidos no codificados de manera natural en la pos CSF {SEQ ID NO: 1 o el aminoácido correspondiente e 2) . En algunas realizaciones, se incorpora En algunas realizaciones, el aminoácido que no se era natural en una o más de esas posiciones se imero soluble en agua, incluyendo, pero sin limita iciones: antes de la posición 1 (es decir en el minal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 9 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, , 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, , 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, , 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 decir, en el extremo carboxilo terminal de la pro binación de las mismas (SEQ ID NO: 1 o los d respondientes en la SEQ ID NO: 2) . En algunas realiz noácido que no se produce de manera natural en una s posiciones se une a un polímero soluble en agua, o sin limitarse a, las posiciones: 3, 7, 33, 43, 5 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, y cualquier comb mismas (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondie ID NO: 2) . En algunas realizaciones, el aminoácido duce de manera natural en una o más de esas posicione polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limit iciones: 3, 7, 62, 133, 166, y cualquier combinac mas (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes NO: 2) . En algunas realizaciones, el aminoácido no manera natural en una o más de esas posiciones se imero soluble en agua, incluyendo, pero sin limit , y una combinación de las mismas (SEQ ID NO: noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2) . 1, 2, u otra secuencia de bG-CSF se une a un polim agua.

En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF co titución, adición o deleción que modula la af ipéptido bG-CSF por un receptor o pareja de unión, o sin limitarse a, una proteína, polipéptido, moléc cido nucleico. En algunas realizaciones, el polipép prende una sustitución, adición o deleción que abilidad del polipéptido bG-CSF en comparació abilidad del bG-CSF correspondiente sin la sustituci deleción. La estabilidad y/o solubilidad puede medi ios ensayos diferentes conocidos por los exper nica. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, HPLC. En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CS sustitución, adición o deleción que modula la inmu polipéptido bG-CSF en comparación con la inmunoge CSF correspondiente sin la sustitución, adición o d bG-CSF correspondiente sin la sustitución, adición algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF com titución, adición o deleción que aumenta la solub ipeptido bG-CSF producido en una célula huésped en la solubilidad del bG-CSF correspondiente sin la s ción o deleción. En algunas realizaciones, el poli comprende una sustitución, adición o deleción que resión del polipéptido bG-CSF en una célula huésped síntesis in vitro en comparación con la expresión bG-CSF correspondiente sin la sustitución, adición polipéptido bG-CSF que comprende esta sustitución ividad agonista y conserva o mejora los niveles de e célula huésped. En algunas realizaciones, el poli comprende una sustitución, adición o deleción que-istencia a proteasas del polipéptido bG-CSF en comp resistencia a proteasas del bG-CSF correspondien titución, adición o deleción. ipéptido bG-CSF correspondiente sin la sustitución, eción. En algunas realizaciones/ el polipépti prende una sustitución, adición o deleción que atopoyesis en comparación con la hematopoyesis del CSF correspondiente sin la sustitución, adición o d unas realizaciones, el polipéptido bG-CSF comp titución, adición o deleción que modula la prolif trófilos en comparación con la proliferación de neut ipéptido bG-CSF correspondiente sin la sustitución, eción. En algunas realizaciones, el polipépti prende una sustitución, adición o deleción que uración de neutrófilos en comparación con la mad trófilos del polipéptido bG-CSF correspondient titución, adición o deleción. En algunas realiza ipéptido bG-CSF comprende una sustitución, adición aumenta la compatibilidad del polipéptido b servantes farmacéuticos (por ejemplo, w-cresol, fen ace intramolecular puede crearse de muchas maneras, o sin limitarse a, una reacción entre dos aminoác teína en condiciones adecuadas (uno o ambos aminoáci un aminoácido no natural) ,- una reacción con dos a a uno de los cuales puede estar codificado de manera estar codificado de manera natural, con un ligador, a molécula en condiciones adecuadas; etc.

En algunas realizaciones, una o más sustit noácido en el polipéptido bG-CSF pueden ser por noácidos que se producen de manera natural o que no manera natural. En algunas realizaciones las sustit noácido en el polipéptido bG-CSF pueden ser por amin producen de manera natural o que no se producen ural, siempre que al menos una sustitución se noácido no codificado de manera natural. E lizaciones, una o más sustituciones de aminoác ipéptido bG-CSF pueden ser por uno o más aminoáci lizaciones, el aminoácido no codificado de manera na estructura : en la que n es 0-10; Ri es un alquilo, aril tituido o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, ari tituido y arilo sustituido; y R3 es H, un amin ipéptido o un grupo de modificación de extremo amin 4 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de m extremo carboxilo terminal.

En algunas realizaciones, el aminoácido no cod era natural comprende un grupo aminooxilo. E lizaciones, el aminoácido no codificado de mane prende un grupo hidrazida. En algunas realiza noácido no codificado de manera natural comprende en la que n es 0-10; Ri es un alquilo, aril tituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, á presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un po grupo de modificación de extremo amino terminal, y noácido, un polipéptido o un grupo de modificación boxilo terminal.

En algunas realizaciones, el aminoácido no cod era natural comprende un grupo alquino. E lizaciones, el aminoácido no codificado de manera na estructura: (CH2)nR1X(CH2)mCCH erso del polipeptido bG-CSF. En algunas realiza nista, agonista parcial, antagonista, antagonista nista inverso del polipéptido bG-CSF comprende un ami ificado de manera natural unido a un polímero solubl algunas realizaciones , el polímero soluble en agua c to de poli (etilenglicol) . En algunas realiza nista, agonista parcial, antagonista, antagonista nista inverso del polipéptido bG-CSF comprende un am ificado de manera natural y una o más mod traduccionales , ligadores, polímeros o moléculas bio ivas .

La presente invención también proporciona ácidos lados que comprenden un polinucleótido que se diciones rigurosas con las SEQ ID NO: 3, 4 o ácidos codifican para polipéptidos de las SEQ ID NO: sente invención también proporciona ácidos nucleico comprenden un polinucleótido que se híbrida en inucleótido que codifica para los polipéptidos most ID NO: 1, 2 con uno o más aminoácidos no codificado ural . Resulta fácilmente evidente para los exper nica que varios polinucleótidos diferentes pueden a cualquier polipéptido de la presente invención.

En algunas realizaciones, el codón selector se sel po que consiste en un codón ámbar, codón ocre,, codó ón único, un codón raro, un codón de cinco bases y tro bases.

La presente invención también proporciona m paración de un polipéptido bG-CSF unido a un polím agua. En algunas realizaciones, el método comprend tacto un polipéptido bG-CSF aislado que comprende un codificado de manera natural con un polímero solub comprende un resto que reacciona con el ami ificado de manera natural. En algunas realiza noácidb no codificado de manera natural incorpor En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF imero soluble en agua se prepara haciendo rea ipéptido bG-CSF que comprende un aminoácido qu bonilo con una molécula de poli (etilenglicol) que c po aminooxilo, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. lizaciones, el grupo aminooxilo, hidrazina, hi icarbazida se une a la molécula de poli {etilenglicol un enlace amida. En algunas realizaciones, el grupo razina, hidrazida o semicarbazida se une a la m i {etilenglicol ) mediante un enlace de carbamato.

En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF imero soluble en agua se prepara haciendo . reac écula de poli (etilenglicol ) que comprende un grupo un polipéptido que comprende un aminoácido no co era natural que comprende un grupo aminooxilo, razida o semicarbazida.

En algunas realizaciones, el polipéptido bG-CSF ipeptido bG-CSF que comprende un aminoácido que con una molécula de poli (etilenglicol) que comprende uino. En algunas realizaciones, el grupo azida o alq a molécula de poli (etilenglicol) a través de un enlac En algunas realizaciones, la molécula de poli(et ne un peso molecular de entre aproximadamente oximadamente 100 kDa. En algunas realizaciones, la i (etilenglicol) tiene un peso molecular de entre 0, .

En algunas realizaciones, la molécula de poli(et un polímero ramificado. En algunas realizacio ificación del polímero ramificado de poli {etilengli peso molecular de entre 1 kDa y 100 kDa, o entre .

En algunas realizaciones, el polímero soluble en polipéptido bG-CSF comprende un resto de polialquile unas realizaciones, el residuo de aminoácido no co codificado de manera natural incorporado en el poli comprende un resto alcjuino y el polímero solubl prende un resto azida, en algunas realizaciones, el noácido no codificado de manera natural incorpor ipéptido bG-CSF comprende un resto azida y el polím agua comprende un resto alquino.

La presente invención también proporciona composi prenden un polipéptido bG-CSF que comprende un ami ificado de manera natural y un vehículo farmac ptable. En algunas realizaciones, el aminoácido no manera natural se une a un polímero soluble en agua.

La presente invención también proporciona cé prenden un polinucleótido que codifica para el poli que comprende un codón selector. En algunas realiza ulas comprenden una AKNF sintetasa ortogonal y/ ogonal para sustituir un aminoácido no codificado ural en el polipéptido bG-CSF. ificar el polipéptido bG-CSF de las células y/o e tivo.

La presente invención también proporciona métodos la semivida terapéutica, semivida en suero o culación de polipéptidos bG-CSF. La presente invenci porciona métodos de modulación de la inmunoge ipéptidos bG-CSF. En algunas realizaciones, lo prenden sustituir uno cualquiera o más amino ipéptidos bG-CSF que se producen de manera natur noácido no codificado de manera natural y16 unir el CSF a un ligador, un polímero, un polímero soluble molécula biológicamente activa.

La pr sente invención también proporciona m tamiento de un paciente que necesita un tratamien o con una cantidad eficaz de una molécula de bG sente invención. En algunas realizaciones, lo prenden administrar al paciente una cantidad terap La presente invención también proporciona polipépt comprenden una secuencia mostrada en la SEQ ID N lquier otra secuencia de polipéptido bG-CSF, excepto tituye al menos un aminoácido es por un ami ificado de manera natural. La presente invenci porciona polipéptidos bG-CSF que comprenden una trada como SEQ ID NO: 1, 2. En algunas realiza noácido no codificado de manera natural se une a uble en agua. En algunas realizaciones, el polímero a comprende un resto de poli (etilenglicol) . lizaciones, el aminoácido no codificado de mane prende un grupo carbonilo, un grupo aminooxilo, razida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida da o un grupo alquino, La presente invención también proporciona co macéuticas que comprenden un vehículo farmac ptable y un polipéptido bG-CSF que comprende la lizaciones, el polímero soluble en agua se une al medio de un resto sacárido. En algunas realiza ador, polímero o molécula biológicamente activa ipéptido bG-CSF por medio de un resto sacárido.

La presente invención también proporciona un poli qué comprende un polímero soluble en agua unido ace covalente al polipéptido bG-CSF en un único ami unas realizaciones, el polímero soluble en agua co to de poli (etilenglicol) . En algunas realizac noácido unido de forma covalente al polímero soluble aminoácido no codificado de manera natural prese ipéptido .

En algunas realizaciones de la presente invención, ipéptido bG-CSF que comprende un HES unido mediante alente al polipéptido bG-CSF, en un único amin unas realizaciones, el único aminoácido unido alente a HES es un aminoácido no codificado de man cional de un aminoácido no codificado de mane orporado de manera ribosomica en el polipéptido. lizaciones, el polipéptido está monopegilado . L ención también proporciona un polipéptido bG-CSF qu ligador, polímero o molécula biológicamente activa q o más aminoácidos no codificados de manera natural ho aminoácido no codificado de manera natural se i era ribosomica en el polipéptido en sitios preselecci Dentro del alcance de esta invención se incluye l er o señal de bG-CSF unida a una región codificant , así como una secuencia señal heteróloga unida a ificante para bG-CSF. La secuencia líder o señal eccionada debe ser una que se reconoce y procesa, p el sistema de secreción de la célula huésped para iblemente se escinde mediante una peptidasa seña ula huésped. Un método de tratamiento de un estado el bG-CSF de la presente invención se pretende q ipéptido purificado y aislado que tiene parte o la t confirmación estructural primaria y una o má piedades biológicas de G-CSF bovino que se produce ural, y secuencias de ADN que codifican para tal G-CS En otra realización de la invención, se administra tores estimulantes de colonias adicionales al anima G-CSF, incluyendo, pero sin limitarse a, . GM-CSF ti-CSF (IL-3). Los CSF se administran juntos o por s realización adicional, se tratan infecciones d inistrando G-CSF con uno o más de: los interferones o sin limitarse a, interferón a, IL2, y TNF o con a dicionales incluyendo, pero sin limitarse a, p alosporinas, y aminoglicósidos .

En otra realización, se usa tratamiento con bG-era profiláctica. Puede usarse bG-CSF como terapia p a aumentar la defensa de huésped de animales qu sgo de adquirir una infección bacteriana, por l sensibilizar su capacidad para luchar contra infec inistración del bG-CSF puede realizarse en el momento procesa el ganado, es decir, se vacuna, se marc tamiento con bG-CSF también puede realizarse durante vacas sin lactancia y/o justo antes de que la vaca d fin de reducir la posibilidad de infecciones in part'o, y de mastitis durante . las fases tempranas de nse Kehrli et al, Am. J. Vet . Res., 50, n.a 2, 2 ver et al., J. Dairy Sci . 71 .2584-2606 (1988); y , J Dairy Sci. 74:4399-4412 (1991) para una descrip ción bovina de los neutrófilos durante e iparturiento . De manera convencional, no hay ningún antibióticos justo antes del nacimiento debido a r recerían en la leche de las vacas haciendo que cuada para su uso.

En otra realización, la conjugación del polipépt comprende uno o más aminoácidos que no se producen VE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - se muestra un plásmido usado para la e CSF.

Figura 2 - se muestran detalles referentes a un ula huésped usada para expresar bG-CSF.

Figura 3 - se muestra análisis de SDS-PAGE de la e ipéptidos bG-CSF de la presente invención.

Figura 4¦ - se muestra análisis de SDS-PAGE de fr os de la columna CM FF de bG-CSF antes de la pegilaci Figura 5 - se muestra análisis de SDS-PAGE de fr os de la columna SP HP de bG-CSF-T133pAF pegilado.

Figura 6 - se muestra análisis de SDS-PAGE de b-GC pués de la pegilación.

Figura 7a - se muestra la digestión con tripsina/G de tipo natural (detección a 214 nm) .

Figura 7b - se muestra la digestión con tripsina/G Figura 9b - se muestra la digestión con Glu-C 3pAF (detección a 214 nm) .

Figura 10a - se muestra la digestión con Glu-C de o natural (detección a 250 nm) .

Figura 10b - se muestra la digestión con Glu-C 3pAF (detección a 250 nm) .

Figura 11 - se muestra un análisis de SE ipéptido bG-CSF pegilado.

Figura 12 - se muestra un análisis de SE ipéptido bG-CSF.

Figura 13 - se muestran valores de EC50 sin tratar proliferación de M-NFS60 de G-CSF T133pAF bovino peg de tipo natural .

Figura 14 - se muestran diferencias de EC50 en el liferación de M-NFS60 de G-CSF Tl33pAF bovino pegila nte a tipo natural .

Figura 15 - se muestran resultado.s de un exper Figura 18 - una gráfica lineal que muestra la pr he diaria media de vacas del ejemplo de 40 µg kg.

Figura 19 - una gráfica de barras que muestra las los recuentos de células somáticas en los días 3, s el parto entre cuatro grupos de vacas incluyend trol, un grupo tratado con bG-CSF no pegila riamente, un grupo al que se le inyecta BG-CSF p kg, y un grupo al que se le inyecta BG-CSF pegilado 2 INICIONES Debe entenderse que esta invención no se li odología, protocolos, líneas celulares, constructos ticulares descritos en el presente documento y dén variar. También debe entenderse que la termino el presente documento es únicamente para los fines d lizaciones particulares, y no se pretende que limite la resente invención ue se limitará ni m es proteínas e incluyen equivalentes de las mismas los expertos en la técnica, etcétera.

A menos que se defina lo contrario, todos lo nicos y científicos usados en el presente documento mo significado que el que entiende comúnmente un exp nica a la que pertenece esta invención. Aunque pu lquier método, dispositivo y material similar o eq descritos en el presente documento en la práctica invención, ahora se describen los métodos, disp eriales preferidos.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en umento se incorporan en el presente documento como a el fin de describir y dar a conocer, por ej structos y metodologías que se describen en las pub pueden usarse en relación con la invención descrita licaciones tratadas en el presente documento se p camente por su divulgación antes de la fecha de pres era natural, es decir una célula nativa, o célula hué o de polipéptidos bG-CSF producidos de manera recombi ipéptido bG-CSF que pueden estar sustancialmente erial celular incluyen preparaciones de proteína os de aproximadamente el 30%, menos de aproximadamen os de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamen os de aproximadamente el 10%, menos de aproximadame os de aproximadamente el 4%, menos de aproximadame os de aproximadamente el 2%, o menos de aproximadam peso seco) de proteína contaminante. Cuando el poli o variante del mismo se produce de manera recombina ulas huésped, la proteína puede estar pr oximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproxim , aproximadamente el 15%, aproximadamente oximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproxima aproximadamente el 2%, o aproximadamente el 1% o o seco de las células. Cuando el polipéptido bG-CSF ificado" según se produce mediante los métodos de l ención puede tener un nivel de pureza de oximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35% oximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45% oximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55% oximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65% oximadamente el 70%, específicamente, un nivel de pu os aproximadamente el 75%, 80%, 85%, y más específi el de pureza de al menos aproximadamente el 90%, u eza de al menos aproximadamente el 95%, un nivel de menos aproximadamente el 9 % o mayor según se iante métodos apropiados tales como análisis de SDS C, SEC, y electroforesis capilar.

Una ¾célula huésped recombinante" o wcélula h iere a una célula que incluye un polinucleótid ependíentemente del método usado para la inse mplo, captación directa, transducción, apareamiento ulas huésped de levadura, células huésped de insec sped vegetales, células huésped eucariotas, células ífero, células CHO, células huésped procariotas, ulas huésped de Pseudomonas, y contenidos celulares. término puede abarcar medio en el que se ha hecho ula huésped, por ejemplo, medio en el que se ha s ipéptido bG-CSF, incluyendo medio o bien antes o b la etapa de proliferación. El término también pue pones o reactivos que contienen lisados de célul es como en el caso en el que el polipeptido bG-CSF manera intracelular y las células huésped se lisan a liberar el polipéptido bG-CSF.

"Agente reductor" , tal como se usa en el present respecto al replegamiento de la proteína, se d lquier compuesto o material que mantiene los grupos el estado reducido y reduce los puentes disulfu ermoleculares . Agentes reductores adecuados incluye lquier compuesto o material que puede extraer un ele puesto que está oxidándose. Agentes oxidantes luyen, pero no se limitan a, glutatión oxidado, tamina, . ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado ulta fácilmente evidente para los expertos en la t amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados los métodos de la presente invención.

"Agente de desnaturalización" o '"desnaturalizante" usa en el presente documento, se define como puesto o material que provocará un despliegue revers teína. La fuerza de un agente de desnatúral naturalizante se determinará tanto por las propiedad concentración del agente de desnaturali naturalizante particular. Agentes de desnatúral naturalizantes particulares pueden ser caotropos, d olventes orgánicos, disolventes miscibles c folípidos o una combinación de dos o más de tale oxicolato de sodio) o detergentes zwitteriónicos o ' sin limitarse a, sulfobetaínas (Zwittergen lamidopropil ) dimetilamonio-1-propano-sulfato (CHAPS) , lamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-l-propano-sulfon APSO) . Pueden usarse como desnaturalizantes ánicos miscibles con agua tales como acetonitrilo, eriores (especialmente alcanoles C2-C4 tales como propanol) , o alcanodioles inferiores (es anodioles C2-C4 tales como etilenglicol) . Fosfolípido presente invención pueden ser fosfolípidos que se era natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfat fatidilserina, y osfatidilinositol o derivados o v folípidos sintéticos tales como dihexanoilfosf tid eptanoilfosfatidilholina .

"Replegamiento" , tal como se usa en el presente cribe cualquier proceso, reacción o método que ipéptidos que contienen puentes disulfuro de un est Tal como se usa en el presente documento, "factor colonias de granulocitos" o "G-CSF" incluirá los pol teínas que tienen al menos una actividad biológic les como los descritos en las patentes estadouni 16.606; 6.689.351; 6.565.841; 6.162.426; 5.811.301; 18.893; 5.580.755; 5.536.495; 5.202.117; 5.043.156; 4 10.643 y 4.968.618 para hG-CSF que se incor erencia al presente documento) , así como análogos formas de G-CSF, compuestos miméticos de G-CSF, fra SF, proteínas G-CSF híbridas, oligómeros y mul teínas de fusión, homólogos, variantes de cosilación, y muteínas, independientemente de la lógica de los mismos, y además independientemente de tesis o preparación de los mismos incluyendo, itarse a, métodos recombinantes (ya se produzcan a c, ADN genómico/ ADN sintético u otra forma de ácido téticos, transgénicos y activados por genes. 10.643; y 6.242.218, que se incorporan como ref sente documento .

Tal como se usa en el presente documento, "factor colonias de granulocitos bovino", "G-CSF bovino" luirán aquellos polipéptidos y proteínas que tiene actividad biológica de bG-CSF, así como análogos formas de bG-CSF, compuestos miméticos de bG-CSF, fr CSF, proteínas bG-CSF híbridas, multímeros y oli teínas de fusión, homólogos, variantes de cosilación, y muteínas, independientemente de la lógica de los mismos, y además independientemente de tesis o preparación de los mismos incluyendo, itarse a, métodos recombinantes (ya se produzcan a c, ADN genómico, ADN sintético u otra forma de ácido téticos, transgénicos y activados por genes, ecífieos de G-CSF incluyen, pero no se limitan a, CSF, G-CSF glicosilado alterado, y análogos de G-CSF gmentos biológicamente activos, variantes bio ivas y estereoisómeros del G-CSF bovino que se era natural así como variantes agonistas, mi agonistas del G-CSF bovino que se produce de manera iones de polipéptidos del mismo. Ejemplos de poli puestos miméticos de bG-CSF incluyen los descri umento WO 89/10932, las patentes estadounidenses n.o 6.497.869, .que se incorporan como referencia a umento en su totalidad. Las fusiones que comprenden cionales en el extremo amino terminal, extremo minal, o ambos, quedan abarcadas por la expresión w CSF" . Fusiones a modo de ejemplo incluyen, pero no por ejemplo, metionil-bG-CSF en el que se une una m remo N terminal de bG-CSF {tal como el polipéptido e : 2) resultante de la expresión recombinante de la f bG-CSF, fusiones para los fines de purificación ( o sin limitarse a, polihistidina o epítopos de pectivamente, en el presente 'documento. También éculas de ácido nucleico que codifican para mutantes olipéptidos de hG-CSF mutantes.

El factor estimulante de colonias de granulocito CSF tiene una variedad de actividades biológicas o sin limitarse a, unión a su receptor, provocando d su receptor, estimulación de producción de neut imulación de proliferación y diferenciación celular algunas de las actividades biológicas de factor est onias de granulocitos y hG-CSF se describieron ante las patentes estadounidenses n.os 6.676.947; 31.121; 6.521.245; 6.489.293; 6.368.854; 6.316.254; 39.109; 6.165.283; 5.986.047; 5.830.851; 5.0 73.569, que se incorporan como referencia al umento .

Tal como se usa en el presente documento, "polipé ino", "polipéptido bG-CSF", *G-CSF bovino" o ttbG-CSF mos, independientemente de la actividad biológi mos, y además independientemente del método de paración de los mismos incluyendo, pero sin li odos recombinantes (ya se produzcan a partir de ómico, ADN sintético u otra forma de ácido nucleico) , vivo, mediante microinyección de moléculas de ácid téticos, transgénicos y activados por genes. Las lipéptido G-CSF bovino", "polipéptido bG-CSF", nG-CS -CSF" abarcan polipéptidos bG-CSF que comprenden tituciones, adiciones o deleciones de aminoácido, ente estadounidense n.s 5.849.883, que se inco erencia al presente documento, para análogos de G-CSF Se han descrito sustituciones en una amplia v iciones de aminoácido en bG-CSF. Las sustituciones o sin limitarse a, las que modulan la estabilidad fa entan la actividad agonista, aumentan la resi teasa, convierten el polipéptido en un antagonista, ención proporciona tratar una infección administr mal una proteína variante, habitualmente con u macéutico, en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Mutantes de bG-CSF tratados en la patente estadou 49.883, que se incorpora como referencia en su luyen polipéptidos diseñados con optimización de co coli y proteínas híbridas generadas con secuencia ino y humano. La patente estadounidense n.2 5.416.1 luye en el presente documento como referencia, en su cribe mutantes de hG-CSF en los que se ha realizad de las siguientes de aminoácido {la aminoácidos es con referencia a la proteína madura,-ndo hay una metionina N-terminal presente, se le ición -1 ó 0) : Cysl7 de la secuencia nativa sustitu iduo Serl7, Asp27 de la secuencia nativa sustitui iduo- Ser27, Leu 15 de la secuencia nativa sustitu iduo Glul5, Lys23 de la secuencia nativa sustitui iduo SerllS, y yrl65 de la secuencia nativa sustit iduo Argl65. Muchos de estos residuos están prese uencia de bG-CSF y una o más de estas sustitucio ontrarse en un polipéptidp bG-CSF de la invención. Biologicals (2004) 32:37 describen hG-CSF mutado qu ios de glicosiiación. Pueden encontrarse mutaciones polipéptidos bG-CSF de la invención.

En algunas realizaciones, lós polipéptidos bG-ención son sustancialmente idénticos a las SEQ ID N lquier otra secuencia de un polipéptido bG-CSF. Se c éculas de ácido nucleico que codifican para polipé , incluyendo mutantes y métodos para expresar y ipéptidos bG-CSF.

La expresión "polipéptido bG-CSF" también incluye fármacos farmacéuticamente aceptables, y profármac es, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos bio ivos, variantes biológicamente activas y estereois resultante de la expresión recombinante de la forma CSF que carece del péptido líder o señal o parte del una metionina al extremo N-terminal de bG-CSF resul resión recombinante), fusiones para el fin ' de la p cluyendo, pero sin limitarse a, polihistidina o e nidad) , fusiones con péptidos de unión a albúmin iones con proteínas séricas tales como albúmina ente estadounidense n.s 5.750.373, que se inco erencia al presente documento, describe un -mé eccionar proteínas novedosas tales como hormona del ariantes de fragmento de anticuerpo que tienen pro ón alteradas para sus moléculas receptoras respe odo comprende fusionar un gen que codifica para una erés con el dominio carboxilo terminal del gen teína de recubrimiento del fago filamentoso MI3. méricas que comprenden bG-CSF y una o más de otras molécula quimérica puede contener regiones o ula huésped eucariota. Partes de HSA a modo de ejemp polipéptido N-terminal (aminoácidos 1-369, 1-419, y ermedias comenzando con el aminoácido 1) , tal com ocer en la patente estadounidense n.s 5.766.8 licación WO 97/24445, que se incorporan como ref sente documento. Otros polipéptidos quiméricos pued proteína HSA con bG-CSF, o fragmentos del mismo, u de los extremos C-terminal y N-terminal de la U arse otras fusiones mediante fusión de bG-CSF con a de una inmunoglobulina b) un análogo de la parte unoglobulina; y c) fragmentos de la parte F unoglobulina.

Diversas referencias dan a conocer la modif ipéptidos mediante conjugación con polímero o glicos resión "polipéptido bG-CSF" incluye polipéptidos con polímero tal como PEG y pueden estar compuestos por ivatizaciones adicionales de cisteína, lisina u otro tenece a la superfamilia de la hormona del creci umento WO 00/23114 da a conocer IFNp glicosilado y p umento WO 00/23472 da a conocer proteínas de fusión c ente estadounidense n.Q 4.904.584 da a conocer p obrecidos en lisina pegilados, en los que al menos lisina se ha delecionado o sustituido por otro noácido. El documento WO 99/67291 da a conocer un pr a conjugar una proteína con PEG, en el que se de os un residuo de aminoácido en la proteína y s tacto la proteína con PEG en condiciones sufici rar la conjugación con la proteína. El documento WO onocer variantes pegiladas de polipéptidos que pert erfamilia de la hormona del crecimiento, en las tituido un residuo de cisterna por un residuo de am ncial ubicado en una región específica del polip umento WO 00/26354 da a conocer un método de pro íante de oli é tido licosil n La expresión "polipéptido bG-CSF" también incl cosilado, tal como, pero sin limitarse a, p cosilados en cualquier posición de aminoácid cosiladas unidas a N o unidas a 0 del polipéptido. sideran variantes que contienen cambios de un único o variantes biológicamente activas de polipépti bién se consideran variantes que contienen cambios d leótido como variantes biológicamente activas más, también se incluyen variantes de corte y e resión "polipéptido bG-CSF" también incluye het odímeros, heteromultímeros u homomultímeros de bG-lquiera o más bG-CSF o cualquier otro polipéptido, rato de carbono, polímero, molécula pequeña, ligador, a molécula activa de cualquier tipo, unida media micos o expresada como proteína de fusión (véanse l adounidenses n.os 6.261.550; 6.166.183; 6.204.247; 17.876, que se incorporan como referencia al ndo se menciona que la comparación se basa en la SEQ otra secuencia de bG-CSF) . Por ejemplo, el aminoá ición 1 de la SEQ ID NO: 1, es una treonina y l respondiente se ubica en la SEQ ID NO: 2 en la posic ertos en la técnica apreciarán que las posiciones de respondientes a las posiciones en la SEQ ID NO: ntificarse fácilmente en cualquier otra molécula de o la SEQ ID NO : 2. Los expertos en la técnica apr posiciones de aminoácido correspondientes a las po SEQ ID NO: 1, 2, o cualquier otra secuencia de bG- ntificarse fácilmente en cualquier otra molécula de o fusiones de bG-CSF, variantes, . fragmentos, etc. P dén usarse programas de alineación de secuencias ST para alinear e identificar una posición particu teína que corresponde a una posición en la SEQ ID N a secuencia de bG-CSF. Se pretende que las sus eciones o adiciones de aminoácidos descritas en e ciones o deleciones de aminoácido. Los polipéptidos presente invención pueden estar compuestos por mod uno o más aminoácidos naturales junto con modificac ás aminoácidos no naturales. Se han descrito susti o de ejemplo en una amplia variedad de posiciones de polipéptidos bG-CSF que se producen de maner luyendo, pero sin limitarse a, . sustituciones que abilidad farmacéutica, que modulan una o más de las logicas del polipéptido bG-CSF, tales como, pero si aumentan la actividad agonista, aumentan la solub ipéptidó, disminuyen la sensibilidad a la proteasa, polipéptido en un antagonista, etc. y quedan abarca resión "polipéptido bG-CSF" . En algunas realiza agonista de bG-CSF comprende un aminoácido no cod era natural unido a un polímero soluble en agua sente en una región de unión a receptor de la moléc . tituciones o deleciones pueden modular la afinid eptor, modular la semivida circulante, modular l apéutica, modular la estabilidad del polipéptido, isión por proteasas, modular la dosis, modular la l biodisponibilidad, facilitar la purificación, o erar una vía de administración particular. De maner polipéptidos bG-CSF pueden comprender secuencias d proteasa, grupos reactivos, dominios de unión a cluyendo, pero sin limitarse a, FLAG o poli-His uencias basadas en afinidad (incluyendo, pero sin l G, poli-His, GST, etc) , o moléculas unidas (incluy limitarse a, biotina) que mejoran la detección ( o sin limitarse a, GFP) , purificación u otros ipéptido .

La expresión "polipéptido bG-CSF" también abarca h erodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que es luyendo, pero sin limitarse a, los unidos directamen Un "aminoácido no codificado de manera natural" se aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos rolisina o selenocisteina. Otras expresiones que pue manera sinónima a la expresión "aminoácido no cod era natural" son "aminoácido no natural", "aminoácido duce de manera natural", y diversas versiones con ón de las mismas. La expresión "aminoácido no cod era natural" también incluye, pero no se limita a, se producen mediante modificación (por ejemplo mod traduccionales) de un aminoácido codificado de mane cluyendo, pero sin limitarse a, los 20 aminoácidos rolisina y selenocisteina) pero que no se incorpora manera natural en una cadena de polipéptido en iante el complejo de traducción. Ejemplos.de tales no se producen de manera natural incluyen, pero no JV-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilgluc onina, y 0-fosfotirosina. teínas solubles en agua tales como albúmina séric tos que aumentan la semivida en suero de péptidos .

Las expresiones "grupo funcional" , "resto activ ivante", "grupo saliente", "sitio reactivo" ínicamente reactivo" y "resto químicamente reactivo" técnica y en el presente documento para hacer re tes o unidades diferenciadas, definibles, de una mol resiones son algo sinónimas en las técnicas químicas el presente documento para indicar las partes de mo lizan alguna función o actividad y son reactivas éculas .

Los términos "enlace" o "ligador" se usan en e umento para referirse a grupos o enlaces que malmente como resultado de una reacción química y enlaces covalentes . Enlaces hidrolíticamente nifica que los enlaces son sustancialmente estables reaccionan con. agua a valores de pH útiles, incluy polímero o en el grupo ligador entre la estr imero y uno o más de los grupos funcionales termin écula de polímero. Por ejemplo, los enlaces éster fo reacción de PEG-ácidos carboxílicos o PEG-ácidos c ivados con grupos alcohol en un agente biológicamente rolizan generalmente en condiciones fisiológicas pa agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables o no se limitan a, enlaces carbonato; enlaces imina la reacción de* una amina y un aldehido; enlaces fato formados haciendo reaccionar un alcohol con fato; enlaces hidrazona que son un producto de reacc razida y un aldehido; enlaces acetal que son el p cción de un aldehido y un alcohol;, enlaces ortoéster ducto de reacción de un formiato y un alcoho tídicos formados por un grupo amina, incluyendo, itarse a, en un extremo de un polímero tal como PEG5 boxilo de un péptido; y enlaces oligonucleotídicos f anismO; incluyendo, pero sin limitarse a, virus, teriófagos, transposón, prión, insectos, hongos, males y seres humanos, en particular, tal como se sente documento, moléculas biológicamente activas o no se limitan a, cualquier sustancia previst gnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de seres humanos u otros animales, o potenciar de ot nestar físico o mental de seres humanos o animales. éculas biológicamente activas incluyen, pero no se tidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécul unas, inmunógenos, drogas duras, drogas blandas, h bono, moléculas o átomos inorgánicos, colorantes leósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxoides ulas procariotas y eucariotas, virus, polisacárid leicos y partes de los mismos obtenidos o derivados terias, insectos, animales o cualquier otra célu ular, liposomas, micropartículas y micelas. Los p cimiento, agentes esteroideos, toxinas derivadas de imilares .

Un "polímero bifuncional" se refiere a un po prende dos grupos funcionales diferenciados q ccionar específicamente con otros restos (incluyendo itarse a, grupos laterales de aminoácidos) para for alentes o no covalentes. Un ligador bifuncional qu po funcional reactivo con un grupo en un lógicamente activo particular, y otro grupo reacti po en un segundo componente biológico, puede usarse conjugado que incluye el primer componente bio ivo, el ligador bifuncional y el segundo lógicamente activo. Se conocen muchos procedi éculas de ligador para la unión de diversos co tidos. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente .256; las patentes estadounidenses n.os 4.671.958, 14.148, 4.699.784; 4.680.338; y 4.569.789 que se eada particular entre una o más moléculas unidas al eptor o bG-CSF.

Cuando se especifican grupos sustituyentes por SU micas convencionales, escritas de izquierda a derec almente los sustituyentes químicamente idént ultarían de escribir la estructura de derecha a izq mplo, la estructura -CH20- es equivalente a la estruc El término "sustituyentes" incluye, pero no se stituyentes que no interfieren". Los "sustituyent erfieren" son aquellos grupos que proporcionan ables. Radicales o sustituyentes que no interfiere luyen, pero no se limitan a, halógeno, alquilo Ci-Ci0, Cío, alquinilo C2-Ci0, alcoxilo C3.-C10, aralqui uilarilo Ci-Ca2, cicloalquilo C3-C12, cicloalqueni ilo, fenilo sustituido, toluilo, xilenilo, oxialquilo C2-Ci2, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialqu 2)m-0- (- (CH2)m-0~ (alquilo C1-C10) en el que cada m es ta'8, -C(0) R2, -C(S)NR2, -S02NR2, -NRC(0) R2/ - RC(S) los mismos, y similares. Cada R tal como se usa en umento es H, alquilo o alquilo sustituido, aril tituido, aralquilo o alcarilo.

El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y El término "alquilo", en sí mismo o como part tituyente, significa, a menos que se indique lo co ical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada, o binación de los mismos, que puede estar totalmente o o poliinsaturado, y puede incluir radic l tivalentes, que tiene el número de átomos de carbon decir C1-C10 significa de uno a diez carbonos) . E icales hidrocarbonados saturados incluyen, pero -no grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, i.sop ilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, c clohexil )metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e is uilo definidos en más detalle a continuación, teroalquilo" . Los grupos alquilo que se limitan rocarbonados se denominan "homoalquilo" .

El término "alquileno" en sí mismo o como ' part tituyente significa un radical divalente derivado de como se muestra a modo de ejemplo, pero no se limit ructuras -CH2CH2- y -<¾(¾(¾(¾- , y además incluye critos a continuación como "heteroalquileno" . Norma po alquilo (o alquileno) tendrá desde 1 hasta 24 bono, siendo los grupos que tienen 10 o menos átomos realización particular de los métodos y co critos en el -presente documento. Un "alquilo i quileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de ta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de car Los términos "alcoxilo" , "alquilamino" y "alq alcoxilo) se usan en su sentido convencional/ y se grupos alquilo unidos al resto de la molécula m nitrógeno y el azufre pueden estar opcionalmente oxi eroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cu Los heteroátomo (s) 0, N y S y Si pueden colocarse e ición interior del grupo heteroalquilo o en la posi se une el grupo < alquilo al resto de la molécula luyen, pero no se limitan a, -CH-CH2-0-CH3 , -CH2-CH -CH2-N (CH3 ) -CH3 , -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2-S (0) -CH3 , -CH2 -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3í -CH2-CH=N-OCH3 , y -CH=CH-de haber hasta dos heteroátomos consecutivos, tal mplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. De manera s mino "heteroalquileno" en sí mismo o como part tituyente significa un radical divalente de eroalquilo, tal como se muestra como ejemplo, p ita, por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . pos heteroalquileno, los mismos o diferentes h bién pueden ocupar uno cualquiera o ambos de lo minales de la cadena (incluyendo, pero sin li se indique lo contrario, versiones cíclicas de n teroalquilo" , respectivamente. Por tanto, un cicl erocicloalquilo incluye enlaces de anillo cialmente insaturados y completamente i cionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroá par la posición en la que se une el heterociclo al écula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se lopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-cic loheptilo, y similares. Ejemplos de heteroc luyen, pero no se limitan a, 1- ( 1 , 2 , , 6-tetrahidropi eridinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfo folinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrof rahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperaz erazinilo, y similares. Adicionalmente, el térm ructuras de anillo bicíclicas y tricíclicas . De mane término ttheterocicloalquileno" en sí mismo o como pa tituyente significa un radical divalente de ivida en suero, o alimento o modulación de la apéutica en relación con la forma no unogenicidad modulada, características de asociac uladas tales como agregación y formación de multímer eptor alterada, unión alterada a una o más parejas d erización o multimerización de receptor alterada. E uble en agua puede tener o no su propia actividad b de usarse como ligador para unir bG-CSF a otras luyendo, pero sin limitarse a, uno o más polipéptido o más moléculas biológicamente activas. Polímeros luyen, pero no se limitan a, poliet ietilenglicol-propionaldehído, derivados de mono-ale riloxilo de los mismos (descritos en la patente est 5.252.714 que se incorpora como referencia a umento) , monometoxi-polietilenglicol, polivinilp i {alcohol vinílico) , poliaminoácidos , anhídrido inil éter, JV- (2-hidroxipropil) -metacrilamida, i (vinil etil éteres),' y alfa-beta-poli [ (2-hidro artamida] , y similares, o mezclas de los mismos. E es polímeros solubles en agua incluyen,, pero no se ietilenglicol y albúmina sérica. Los documentos WO 0 03/074088 describen la conjugación de proteínas o ueñas con hidroxialguilalmidón (HAS) . Eje roxilalquilalmidones incluyen, pero no se l roxietilalmidón. Conjugados de idroxialcfuilalmidó écul , por ejemplo, pueden comprender un enlace cova pos aldehido terminales de HAS y grupos reactivos écula.

Tal como se usa en el presente documento, lialquilenglicol" o "poli (alquenglicol ) " se ietilenglicol {poli (etilenglicol) ) , ppliprop ibutilenglicol , y derivados de los mismos. E lialquilenglicol" abarca tanto polímeros line ificados y pesos moleculares promedio de entre 0,1 densan juntos o se · unen de forma covalente. teroarilo" se refiere a grupos {o anillos) arilo qu de uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, que los átomos de nitrógeno y azufre están op dados, y el/los átomos de nitrógeno está(n) op ternizado ( s) . Un grupo heteroarilo puede unirse al écula mediante un heteroátomo. Ejemplos no limi pos de arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-n tilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pir azolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2 xazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxa xazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5 urilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, iridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benz inilo, 2- bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquin quinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quin nolilo. Sustituyentes para cada uno de los sistema o sin limitarse a, * bencilo, fenetilo, piridi ilares) incluyendo aquellos grupos alquilo en los tituido un átomo de carbono (incluyendo, pero sin li grupo metileño) por, por ejemplo, un átomo cluyendo, pero sin limitarse a, fenoxime idiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y similares).

Se pretende que cada uno de los términos cluyendo, pero sin limitarse a, "alquilo", "hete ilo" y "heteroarilo" ) incluya tanto formas sustituid tituidas del radical indicado. A continuación se p tituyentes a modo de ejemplo para cada tipo de radica Sustituyentes para los radicales alquilo y he cluyendo los grupos denominados con frecuencia uenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, loalquilo, heterocicloalquilo, cicloalqueni erocicloalquenilq) pueden ser uno o más de una v pos seleccionados de, pero sin limitarse a: -0R' , =0, itarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos tituido o no sustituido, grupos alcoxilo o tioa pos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invenci de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los g ecciona independientemente como lo son cada grupo R' , cuando hay más de uno de esos grupos presente. Cuan án unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combin rno de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 ó 7 mi mplo, se pretende que -NR'R" incluya, pero no se li rolidinilo y 4-morfolinilo . A partir de la discusió sustituyentes, un experto en la técnica entende tende que el término "alquilo" incluya grupos qu mos de carbono unidos a grupos distintos de grupos es como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, - )CF3, -C(0)CH2OCH3, y similares).

De manera similar a los sustituyentes descrito ertas en el . sistema de anillo aromático; y en los q y R"" se seleccionan independientemente de hidrógen eroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compue ención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada pos R se selecciona independientemente como lo .son R" , R'" y R"" cuando hay más de uno de esos grupos p Tal como se usa en el presente documento, la mivida en suero modulada" significa el cambio ativo en la semivida circulante de un bG-CSF modi pecto a su forma no modificada. La semivida en sue ando muestras de sangre a diversos puntos de tiem inistración de bG-CSF, y determinando la concentrac écula en cada muestra. La correlación de la concen ro con el tiempo permite el cálculo de la semivida semivida en suero aumentada tiene de manera deseabl oximadamente el doble, pero un aumento menor puede ejemplo cuando permite un régimen de d e midiendo las propiedades farmacocinéti macodinámicas de la molécula en diversos puntos de t administración. Una semivida terapéutica aumentada era deseable un régimen de dosificación beneficioso dosis total beneficiosa particular, o evita un eado. En algunas realizaciones, la semivida entada resulta de una potencia aumentada, unión a minuida de la molécula modificada a su diana, des entada o disminuida de la molécula por enzimas teasas, o un aumento o disminución de otro p anismo de acción de la molécula no modificada o un minución del aclaramiento mediado por el recep écula.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido teína, significa que el ácido nucleico o la proteína al menos algunos de los componentes celulares con cia en el estado natural, o que el ácido nucleico o lítica tales como electroforesis en gel de poliac matografía de líquidos de alta resolución. Una prote especie predominante presente en una prepara tancialmente purificada. En particular, un gen ai arado de marcos de lectura abiertos que flanquean ifican para una proteína distinta del gen de i mino "purificado" significa que un ácido nuclei teína da lugar sustancialmente a una banda e ctroforético . Particularmente, puede significar que leico o la prbteína es puro en al menos el 85%, os el 90%, puro en al menos el 95%, puro en al meno .

La expresión "ácido nucleico" se r oxirribonucleotidos, desoxirribonucleosidos, ribonucl onucleótidos y polímeros de los mismos o bien ocatenaria o bien bicatenaria. A menos que ecíficamente , la expresión abarca ácidos nucl trario, una secuencia de ácido nucleico partícul rca implícitamente variantes modificadas de manera c la misma (incluyendo, pero sin limitarse a, sustit on degenerado) y secuencias complementarias así uencia indicada explícitamente. Específicame tituciones de codón degenerado pueden lograrse uencias en las que la tercera posición de uno o m eccionados (o todos) se sustituye por residuos de b desoxiinosina (Batzer et .al., Nucleic Acid Re 91); Ohtsuka et al, J. Biol . Chem. 260:2605-26 solini et al, Mot. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" era intercambiable en el presente documento para ref imero de residuos de aminoácido. Es decir, una desc refiere a un polipéptido se aplica igualmente a una un péptido y una descripción de una proteína, y vic minos se aplican a polímeros de aminoácidos que se como a análogos de aminoácidos y compuestos mi noácidos que funcionan de una manera similar a los se producen de mañera natural . Los .aminoácid ifican de manera natural son los 20 aminoácid anina, arginina, asparagina, ácido aspártico, tamina, ácido glutámico, glicina, histidina, cina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina onina, triptófano, tirosina, y valina) y pirrolisina teína. Los análogos de aminoácidos se refieren a com nen la misma estructura química básica que un aminoá duce de manera natural, es decir, un carbono a que e hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y u como, homoserina, norleucina, sulfóxido de ilsulfonio de metionina. Tales análogos tienen ificados (tales como norleucina) o estructuras ificadas, pero conservan la misma estructura química aminoácido que se produce de manera natural . La refe limitan a, a-metilo-aminoácidos (por ejemplo, a-meti minoácidos, aminoácidos similares a histidina (por no-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistid orometil-histidina y a-metil- histidina) , amino nen un metileno extra en la cadena lateral ( rno")/ y aminoácidos en los que se sustituye un grup do carboxílico en la cadena lateral por un g rónico (por ejemplo, ácido cistéico) . La incorp noácidos no naturales, incluyendo aminoácidos sin ivos, aminoácidos sustituidos, o uno o más D-aminoác teínas de la presente invención puede ser ventajosa eras diferentes. Los péptidos que contienen D-a . , muestran una estabilidad in vitro o in vivo au paración con sus equivalentes que contienen L-amino to, la ¾ construcción de péptidos, etc., que inc noácidos puede ser particularmente útil cuando se En el presente documento puede hacerse referen noácidos o bien por sus símbolos de tres letras ocidos o bien por los símbolos de una letra recomend isión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. de hacerse referencia a los nucleotidos mediante sus ras únicas comúnmente aceptados . wVariantes modificadas de manera conservativa" to a secuencias de aminoácidos como de ácido nuc pecto a secuencias de ácido nucleico particulares, ificadas de manera conservativa" se refiere a aque leicos que codifican para secuencias de aminoácidos ncialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico a una secuencia de aminoácidos, a secuencias es nticas. Debido a la degeneración del código genétic ero de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos cod lquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, codifican todos para el aminoácido alanina. Por tan un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualment ón para metionina, y TGG, que es habitualmente el a triptófano) puede modificarse para dar una cionalmente idéntica. Por consiguiente, cada enciosa de un ácido nucleico que codifica para un á implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un exp nica reconocerá que sustituciones/ deleciones o ividuales a una secuencia de ácido nucleico, ipéptido o proteína que alteren, añadan o elimine noácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en l ificada es una "variante modificada de manera conse que la alteración da como resultado la delec noácido, adición de un aminoácido, o sustituci noácido por un aminoácido químicamente similar. Los técnica conocen tablas de sustituciones conserv porcionan aminoácidos funcionalmente similares . Tale 2) Ácido aspártico (D)i, ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , glutamina (Q) ; * 4) Arginina (R) , lisina ( ) ,- 5) Isoleucina (I), leucina (L) , metionina (M) , vali 6) Fenilalanina (F) , tirosina (Y), triptófano (W) ; 1) Serina (S) , treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Stru ecular Properties ( H Freeman & Co.; 2a edición (d 3) .

Los términos nidéntico" o "identidad" en porcent texto de dos o más ácidos nucleicos o secu ipéptido, se refieren a dos o más secuencias o su son iguales. Las secuencias son "sustancialmente id nen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucle iguales (es decir, aproximadamente el 60% de oximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproxim iere al complemento de una secuencia de prueba. La de existir a lo largo de una región que tiene oximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longit go de una región que tiene 75-100 aminoácidos o nucl gitud, o, cuando no se especifica, a lo largo de la la secuencia de un polinucleótido o polipé inucleótido que codifica para un polipéptido de l ención, incluyendo homólogos de especies distinta ano, puede obtenerse mediante un procedimiento que etapas de examinar una biblioteca en condi ridación rigurosas con una sonda marcada que uencia de polinucleótido de la invención o un fragm ma, y aislar ADNc de longitud completa y clones ge tienen dicha secuencia de polinucleótido. Tales t ridación se conocen bien por el experto en la técnica Para la comparación de secuencias, normalmente un úa como secuencia de referencia, con la que s porcentaje para las secuencias ele prueba en relac uencia ele referencia, basándose en los parámetros de Un "intervalo de comparación", tal como- se usa en umento, incluye la referencia a un . segmento de una las varias posiciones análogas seleccionada del siste en desde 20 hasta 600, habitualmente de apro a aproximadamente 200, más habitualmente de aproxima proximadamente 150 en la que puede compararse una se secuencia de referencia del mismo número de tiguas tras haber alineado de manera óptima las dos expertos en la técnica conocen métodos de ali uencias para la comparación. La alineación óptima de a la comparación puede realizarse, incluyendo, itarse a, mediante el algoritmo de homología local erman (1970) Adv. Appl . ath. 2: 482c, mediante el a neación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Un ejemplo ele un algoritmo que es adecuado para de ntidad de secuencia en porcentaje y la similitud de los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altsc 90) J Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El so lizar análisis de BLAST está disponible al público tro Nacional de Información Biotecnologica en la Wor ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros W, T, y X del algo erminan la sensibilidad y velocidad de la aliñ grama BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa c longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) d 4 y una comparación de ambas cadenas. Para sec noácidos, el programa BLASTP usa como defectos una abra de 3, y esperanza (E) de 10,* y la matriz de SUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc . Nati. 89:10915) alineaciones (B) de 50, esperanza (E) d 4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritm respondencia entre dos secuencias de nucleóti noácidos . Por ejemplo, un ácido nucleico se consider secuencia de referencia si la menor suma de probabi comparación del ácido nucleico de prueba con el áci referencia es inferior a aproximadamente 0,2, o oximadamente 0,01, o inferior a aproximadamente 0,001.

La frase "se híbrida selectivamente (o especifican refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridac écula únicamente con una secuencia de nucleótidos pa diciones de hibridación rigurosas cuando esa secu sente en una mezcla compleja {incluyendo, pero sin l o ADN de biblioteca o celular total) .

La frase wcondiciones de hibridación rigurosas" se hibridación de secuencias de ADN, ARN, PNA u otros éticos de ácido nucleico, o combinaciones de los diciones de baja fuerza iónica y alta temperatura t oce e la técnica. Normalmente, en condiciones rig hniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hy h Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridi strategy of nucleic acid assays" (1993) . General diciones rigurosas se seleccionan para ser aproxima C inferiores al punto de fusión térmica (TJ para l ecífica a una fuerza iónica definida pH. La m es la una fuerza iónica definida, pH, y concentración leico) a la que el 50% de las sondas complementarias hibridan con la secuencia diana en el equilibrio { uencias diana están presentes en exceso, a Tm, el das está ocupado en el equilibrio) . Las condiciones dén ser aquellas en las que la concentración en sal aproximadamente ión sodio 1,0 M, normalmente una co ion sodio (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximad a sondas cortas (incluyendo, pero sin limitarse a, leótidos) y de al menos aproximadamente 602C para so C, con un lavado con 0,2X SSC# y SDS al 0,1% a 6 ados pueden realizarse durante 5, 15, 30, 60, 1 utos .

Tal como se usa en el presente documento, cariota" se refiere a organismos que pertenecen ogenético Eucarya tales como animales {incluyendo, itarse a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ntas (incluyendo, pero sin limitarse a, monoco otiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, rosporidios , protistas, etc.

Tal como se usa en el presente documento, la exp ariota" se refiere a organismos no eucariotas. Por anismo no eucariota puede pertenecer al dominio f acteria (incluyendo, pero sin limitarse a, Escheri rmus thermophilus, Bacillus stearothermophUus, orescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pulida dominio filogenético Archaea (incluyendo, pero sin l mal de compañía (por ejemplo, perros, gatos y mal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, c ilares) o un animal de laboratorio (por ejemp ones, cobayas, y similares) .

La expresión ttcantidad eficaz" tal como se usa en umento se refiere a la cantidad del polipeptido de natural modificado que se administra que aliviará ida uno o más de los síntomas de la enfermedad, storno que está tratándose. Las composiciones que c ipéptido de aminoácido no natural modificado descr sente documento pueden administrarse para t filácticos, de potenciación y/o terapéuticos.

Los términos "potenciar" o e potenciación" entar o prolongar o bien la potencia o bien la dura cto deseado. Por tanto, con respecto a la potenc cto de agentes terapéuticos, el término "de potenc iere a la capacidad para aumentar o prolongar estado de salud del animal y respuesta a los fárm terio del veterinario encargado.

El término "modificado", tal como se usa en e umento se refiere a cualquier cambio realizado a un o, tal- como cambios a la longitud del polipéptido, l aminoácidos, la estructura química, m raduccional , o modificación postraduccional de un p expresión forma tt (modificada) " significa que los p están tratándose están opcionalmente modificados, polipéptidos que están tratándose pueden estar mod modificados .

La expresión ''modificado postraduccionalmente" se lquier modificación de un aminoácido natural o no n produce en tal aminoácido tras haberse incorpora ena de polipéptido. La expresión abarca, únicamente mplo, modificaciones in vivo cotraduccionales , mod vitro cotraduccionales (tales como en un sistema de sidera que se encuentra dentro de la experiencia en erminar tales cantidades profilácticamente eficace erimentación de rutina (por ejemplo, un ensayo entó a escala de la dosis) .

El término "protegido" se refiere a la presencia *grupo protector" que impide la reacción del grupo ínicamente reactivo en determinadas condiciones de r po protector variará dependiendo del tipo de grupo q ctivo que está protegiéndose. Por ejemplo, si nticamente reactivo es una amina o una hidrazida, tector puede seleccionarse del grupo de terc-butilo Boc) y 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si micamente reactivo es un tiol, el grupo protector opiridildisulfido . Si el grupo químicamente react do carboxílico, tal como ácido butanoico y propió po hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo uilo tal como metilo, etilo, o tere-butilo. Tamb Boc PMBn tritio . acetito Fmoc Se describen otros grupos protectores en Green tective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wi va York, Y, 1999, que se incorpora en el presente o referencia en su totalidad. macos y el criterio del veterinario encargado . Se co encuentra dentro de la experiencia en la técnica es cantidades terapéuticamente eficaces erimentación rutinaria (por ejemplo, un ensayo entó a escala de la dosis) .

El término "tratar" se usa para referirse a t filácticos y/o terapéuticos.

Polipéptidos de aminoácido no codificado de mane sentados en el presente documento pueden incluir cados isotópicamente con uno . o más átomos sustitui rno que tiene una masa atómica o número de masa dife a atómica o número de masa que se encuentra habitualrr uraleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorpora sentes compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, rógeno, oxígeno, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13 , 110, 35S, 18F, 36C1, respectivamente. Determinados cados isotópicamente descritos en el presente docu Tocios los isómeros incluyendo, pero sin ' liir stereómeros , enantiómeros , y mezclas de los m sideran como parte de las composiciones descri sente documento. En otras realizaciones o adició ipéptidos de aminoácido no codificado de manera abolizan tras la administración a un organismo qu ducir un metabolito que entonces se usa para produci eado, incluyendo un efecto terapéutico deseado, lizaciones o adicionales, son metabolitos a ipéptidos de aminoácido no codificado de manera natur En algunas · situaciones, pueden existir polip noácido no codificado de manera natural como más, los polipéptidos de aminoácido no -codificado ural descritos en el presente documento pueden . mas tanto sin solvatar como solvatadas con macéuticamente aceptable tales como agua, etanol y bién se considera que las formas solvatadas se dan a teínas, bioquímica, técnicas de ADN recomb macología, dentro de la experiencia en la técnica.

CRIPCIÓN DETALLADA roducción Se proporcionan moléculas de b-GCSF que comprende aminoácido no natural en la invención. En d lizaciones de la invención, el polipéptido b-GCSF co aminoácido no natural incluye al menos una m traduccional . En una realización, la al menos una m traduccional comprende la unión de una molécula o sin limitarse a, hidroxialquilalmidón roxietilalmidón (PfES) , un marcador, un colorante, u polímero soluble en agua, un derivado de polietile nte de fotorreticulación, un radionúclido, un otóxico, un fármaco, un marcador de afinidad, un m oafinidad, un compuesto reactivo, una resina, u forma covalente o no covalente con otras moléculas oenjaulado, un resto excitable mediante radiación ac to fotoisomerizable, biotina, un derivado de b logo de biotina, un resto que incorpora un átomo po escindible químicamente, un grupo fotoescindible, eral alargada, un azúcar unido a carbono, un age ox, un aminotioácido, un resto tóxico, un res tópicamente, una sonda biofísica, un grupo fosfore po quimioluminiscente, un grupo electrodenso, nético, un grupo de intercalación, un cromóforo, un nsferencia de energía, un agente biológicamente cador detectable, una molécula pequeña, un punto cu otransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, captura de neutrones, o cualquier combinación de los ualquier otro compuesto o sustancia deseable, que c undo grupo reactivo a al menos un aminoácido no n prende un primer grupo reactivo utilizando metodolo itarse a, en el aminoácido no natural ^-azido-L-feni segundo grupo reactivo es el resto alquinilo. En d lizaciones del polipéptido b-GCSF modificado de l ención, se usa al menos un aminoácido no natural ( o sin limitarse a, aminoácido no natural que contien cional ceto) que comprende al menos una m traduccional, en el que la al menos una m traduccional comprende un resto de sacárido. En d lizaciones, la modificación postraduccional se reali una célula eucariota o en una célula no eucariota. imero, polímero soluble en agua u otra molécula pue écula al polipéptido. La molécula puede unirse dire ipéptido .

En determinadas realizaciones, la proteína incluy modificación postraduccional que se realiza in vi célula huésped, en la que la modificación postrad realiza normalmente mediante otro tipo de célula t En algunas realizaciones, el polipéptido b-GCSF co más aminoácidos no codificados de manera natura cosilación, acetilación, acilación, modificación mitoilación, adición de palmitato, fosforil ificación por unión de glicolípidos del polipéptido. lizaciones, el polipéptido . b-GCSF comprende u noácidos no codificados de manera natural para la gl polipéptido. En algunas realizaciones, el polipépt prende uno o más aminoácidos codificados de manera n glicosilación, acetilación, acilación, modificación mitoilación, adición de palmitato, fosforil ificación por unión de glicolípidos del polipéptido. lizaciones, el polipéptido b-GCSF comprende u noácidos codificados de manera natural para la gl polipéptido.

En algunas realizaciones, el polipéptido b-GCSF co ás adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no cod cosilación en un aminoácido diferente en el polip unas realizaciones, el polipéptido b-GCSF comprende ciones y/o sustituciones de aminoácidos no codi era natural que potencian la glicosilacion en un am ificado de manera natural en el polipéptido. lizaciones, el polipéptido b-GCSF comprende una o má sustituciones de aminoácidos no codificados de man potencian la glicosilacion en un aminoácido cod era natural en el polipéptido. En algunas realiza ipéptido b-GCSF comprende una o más adiciones y/o su aminoácidos codificados de manera natural que po cosilación en un aminoácido diferente en el polip unas realizaciones, el polipéptido b-GCSF comprende ciones y/o sustituciones de. aminoácidos no codi era natural que potencian la glicosilacion en un ificado de manera natural en el polipéptido. lizaciones>, el polipéptido b-GCSF comprende una o má prende la unión de un oligosacárido {incluyendo, itarse a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una seirina iante una unión GalNAc-serina, GalNAc-treonina, Glc GlcNAc-treonina . En determinadas realizaciones, una polipéptido de la invención puede comprender una s reción o localización, una cola de epítopo, una col de . polihistidina, una fusión de GST, y/o sími mplos de secuencias señal de secreción incluyen, itán a, una secuencia señal de secreción proca uencia señal de secreción eucariota, una secuenci reción eucariota optimizada en 5' para expresión secuencia señal de secreción novedosa, secuencia reción de pectato liasa, secuencia señal de secreci secuencia señal de secreción de fago. Los e uencias señal de secreción, incluyen, pero no se I (procariota), Fd Gilí y Mi3 (fago), Bgl2 (levad uencia señal bla derivada de un transposón. Cualquie ve, o diez o más aminoácidos no naturales. Los amin urales pueden ser iguales o diferentes, por ejem er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios difere teína que comprenden 1, 2 , 3, 4 , 5, 6 , 7, 8, 9 , noácidos no naturales diferentes. En d lizaciones, al menos uno, pero menos que' todo noácido particular presente en una versión que se era natural de la proteína se sustituye por un ami ural .

La presente invención proporciona métodos y co ados en b-GCSF que comprende al menos un ami ificado de manera natural. La introducción de al noácido no codificado de manera natural en b-mitir la aplicación de químicas de conjugación q cciones químicas específicas, incluyendo, pero sin l uno o más aminoácidos no codificados de mane ntras que no reaccionan con los 20 aminoácidos que noácidos que contienen grupos funcionales o sustitu se encuentran en los 20 aminoácidos incorporados ural, incluyendo, pero sin limitarse a, un resto ce cetileno, en proteínas en respuesta a un codón sel terior modificación de esos aminoácidos con un deriv ctivo de manera adecuada. Una vez incorporado, l erales del aminoácido pueden modificarse entonces odologías químicas que los expertos en la técnica sa cuadas para los grupos funcionales o sustituyentes p sentes en el aminoácido no codificado de maner odologías químicas conocidas de una amplia va cuadas para su uso en la presente invención para in imero soluble en agua en la proteína. Tales m luyen, pero no se limitan a, una reacción de cicload Huisgen {véanse, por ejemplo, Padwa, A. en Co anic Synthesis, Vol . 4, (1991) Ed. Trost, B, M. , ord, págs . 1069-1109; y, Huisgen, R. en iante la adición de cantidades catalíticas de sales mezcla de reacción. Véanse,, por ejemplo, Tomoe, et a Org. Chem. 67:3057-3064; y, Rostovtsev, et al., (20 m. Int. Ed. 41: 2596-2599; y el documento WO 03/1 écula que puede añadirse a una proteína de la i vés de una cicloadición [3+2] incluye prácticamente écula con un grupo funcional o sustituyente luyendo, pero , sin limitarse a, un derivado de tileno. Estas moléculas pueden añadirse a un ami ural con un grupo acetileno, incluyendo, pero sin li ropargiloxifenilalanina, o grupo azido, incluyendo, itarse a, p-azido-fenilalanina, respectivamente.

El anillo de cinco miembros que resulta de la c 2]· de Huisgen no es generalmente reversible e uctores y es estable frente a la hidrólisis durant longados en entornos acuosos. Por consigui acterísticas físicas y químicas de una amplia v La invención también proporciona derivados solubles rolíticamente estables de los derivados de PEG y rófilos relacionados que tienen uno o más restos a da. Los derivados poliméricos de PEG que contie tileno son altamente selectivos para el acoplamiento da que se han introducido selectivamente en pr puesta a un codón selector. De manera similar, los iméricos de PEG que contienen restos azida son ectivos para el acoplamiento con restos acetileno roducido selectivamente en proteínas en respuesta ector.

Más específicamente, los restos azida comprenden, itán a, alquil-azidas , aril-azidas y derivados de es derivados de las alquil y aril-azidas pueden inc tituyentes siempre que se mantenga la reactividad es tileno. Los restos acetileno comprenden alquil tilenos y derivados de cada uno. Los derivados d IO orreticulación,- un radionúclido; un compuesto cito maco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoa puesto reactivo; una resina; una segunda proteína o nálogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de quelante de metales; un cofactor; un ácido graso; un bono; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un pol isentido; un sacárido; un dendrímero soluble en lodextrina; un ácido ribonucleico inhibidor; un b nanopartícula; un marcador de espín; un fluoróforo contiene metal; un resto radiactivo; un grupo edoso; un grupo que interacciona de forma coval alente con otras moléculas; un resto fotoenjaulado itable mediante radiación actínica; un resto fotois tina; un derivado de biotina; un análogo de biotina incorpora un átomo pesado; un grupo escindible qu grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; do a carbono; un agente activo redox; un aminoti tancia deseable. La presente invención tambié jugados de sustancias que tienen restos azida o ace derivados poliméricos de PEG que tienen los restos da correspondientes. Por ejemplo, un polímero d tiene un resto azida puede acoplarse a una lógicamente activa en un posición en la proteína q aminoácido no codificado genéticamente que cionalidad acetileno. La unión mediante la que se y la molécula biológicamente activa incluye pero no producto de la cicloadición [3+2] de Huisgen.

Está bien establecido en la técnica que puede usar ificar las superficies de biomateriales (véanse, po patente estadounidense 6.610.281; Mehvar, R. , J. P ., 3 (1): 125-136 (2000) que se incorporan como ref sente documento) . La invención también incluye bi comprenden una superficie que tiene uno o más sitio azida o acetileno y uno o más de los polímeros co La invención incluye un método de síntesis de los contienen azida y acetileno de la invención. En e ivado de PEG que contiene azida, la azida pu ectamente a un átomo de carbono del polímero. Altern derivado de PEG que contiene azida puede prepararse ón de un agente de unión que tiene el resto azida en minal a un polímero activado convencional de mo imero resultante tiene el resto azida en su extremo el caso del derivado de PEG que contiene ace tileno puede unirse directamente a un átomo de c imero. Alternativamente, el derivado de PEG qu tileno puede prepararse mediante la unión de un agen tiene el resto acetileno en un extremo terminal a ivado convencional de modo que el polímero resultant to acetileno en su extremo terminal.

Más específicamente, en el caso del derivado d tiene azida, un polímero soluble en agua que tiene minal del polímero. Alternativamente, un polímero a que tiene al menos un resto nucleófilo o electróf erimenta una reacción con un agente de unión que da en un extremo terminal de modo que se forma alente entre el polímero de PEG y el agente de unión da se sitúa en el extremo terminal del políme leófilos y electrófilos , incluyendo aminas, tioles, razinas, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, ésteres y similares, los conocen los expertos en la t Más específicamente, en el caso del derivado d tiene acetileno, un polímero soluble en agua que tie resto hidroxilo activo experimenta una reacción par halógeno u otro grupo saliente activado de un pre tiene un resto acetileno. Alternativamente, un polím agua que tiene al menos un resto nucleófilo o ivo experimenta una reacción con un agente de unión acetileno en un extremo terminal de modo que se form proteína modificada, incluyendo, pero sin lim imeros solubles en agua tales como PEG y derivados tienen un resto azida o acetileno. Los derivados tienen azida y acetileno pueden usarse para mod piedades de superficies y moléculas en las que son biocompatibilidad, estabilidad, solubilidad . y unogenicidad, mientras que al mismo tiempo se p ios más selectivos de unión de los derivados de PEG se conocían previamente en la técnica.

GCSF bovino Los polipéptidos bG-CSF de la invención pueden u orar o prevenir infecciones en animales. Las lógicas así como los ensayos para caracterizar las lógicas de G-CSF bovino y humano los conoce un exp nica. Los ensayos que implican una evaluación del trófilos y la función de los neutrófilos los conoce itarse a, para la expresión de proteínas o d eración de variantes, derivados, casetes de expresió uencias derivadas de un polipéptido bG-CSF. E lizaciones, las secuencias que codifican para los p la invención están operativamente unidas a un erólogo. El aislamiento de hG-CSF y la producción d ulas huésped se describen en, por ejemplo, la adounidenses n.os 4.810.643; 4.999.291; 5.580.755; y se incorporan como referencia al presente documento.

Una secuencia de nucleótidos que codifica para un CSF que comprende un aminoácido no codificado de man de sintetizarse basándose en la secuencia de amino ipéptido original, incluyendo, pero sin limitarse a, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, biando la secuencia de nucleótidos de modo que se roducción (es decir, incorporación o sustitución) o decir, deleción o sustitución) del/de los res ones que están favorecidos en la célula huésped en ducirá el polipéptido recombinante. Por ejempl tetizarse varios pequeños oligonucleótidos que codi tes del polipéptido deseado y ensamblarse mediante r ena de ligamiento o ligamiento mediante PCR5. V mplo, Barany, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 189- patente estadounidense 6.521.427 que se incorp erencia al presente documento.

Esta invención utiliza técnicas rutinarias en el c ética recombinante. Textos básicos que dan a c odos generales de uso en esta invención incluyen S Molecular Cloning, A Laboratory Manual {3a egler, Gene Transfer and Expression: A Laborat 90) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausub ., 1994)).

Los textos generales que describen técnicas d ecular incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molécul tores, promotores y muchos otros temas relevantes r , incluyendo, pero sin limitarse a, la generación inucleótidos que incluyen codones selectores para la. proteínas que incluyen aminoácidos no natura ogonales, sintetasas ortogonales, y pares de los mism Se usan diversos tipos de mutagenesis en la inve variedad de fines, incluyendo, pero sin limitarse tetasas o ARNt novedosos, mutar moléculas de A inucleótidos que codifican para sintetasas, liotecas de ARNt, producir bibliotecas de sintetasas ones selectores, insertar codones selectores que cod noácidos no naturales en una proteína o un poli eres. Incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis io, puntual al azar, recombinación homologa, interca tros métodos de mutagénesis recursivos, construcción agénesis usando moldes que contienen uracilo, ígida por oligonucleótidos , mutagénesis de ADN modi luyendo, pero sin limitarse a, que implican méricos, en la presente invención. En una reali agénesis puede estar guiada por información conoc écula que se produce de manera natural o . la moléc duce de manera natural alterada o mutada, incluyendo itarse a, secuencia, comparaciones de secuencias, icas, estructura. secundaria, terciaria o c ructura cristalina o similares.

Los textos y ejemplos que se encuentran en e umento describen estos procedimientos. Se encuentra cional en las siguientes publicaciones y referencias mismas: Ling et al., Approaches to DNA mutag rview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dal gonucletide-directed random mutagenesis us sphorothioate method, Methods Mol Biol, 57:369-3 th, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-4 stein & Shortlc, Strategies and applications of ymol. 154, 367-382 (1987) ; Bass et al . , Mutant Trp h new DNA-binding specificities , Science 242:240-2 ler & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis ived vectors : an efficient and general procedur duction of point mutations in any DNA fragment, Nu , 10:6487-6500 (1982) ; Zoller & Smith, Oligonucleoti agenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors, ymol. 100:468-500 (1983) ; Zoller S Smith, Oligo ected mutagenesis: a simple method using two olig mers and a single-stranded DNA témplate, Methods i :329-350 (1987) ; Tailor et al . , The use of p osph ified DNA in restriction enzyme reactions to prep , Nucí. Acids Res.- 13: 8749-8764 (1985) ; Tailor id generation of oligonucleotide-directed mutation quency using phosphorothioate-modified DNA, Nucí. : 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhi triction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothi struction, Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); tz Oligonucleotide-directed construction of muta ped dúplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 {198 al . , Improved enzymatic in vitro reactions in.the ga approach to oligonucleotide-directed constr ations, Nucí. Acids Res. 16: 7207 (1988); Frit gonucleotide-directed construction of mutations: lex DNA procedure without enzymatic . reactions in vi ds Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al . , e/base mismatches are corrected with different effi methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. 879-887 (1984); Cartel et al . , Improved oligonucleo ected mutagenesis using Ml 3 vectors, Nucl. Acids 1-4443 (1985); Cárter, Improved oligonucleoti agenesis using 13 vectors, Methods in Enzymol . 15 87) ; Eghtedarzadeh & Henikoff , Use of oligonucl erate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1 hod for generation of múltiple mutations in defined 315-323 (1985); Grundstrom et al., 01igonucleoti agenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, N . 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleoti ble-strand break repair in plasmids of Escherichi hod for site-specific mutagenesis, Proc, Nati. Acad, 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering f ironments, Current Opinión in Biotechnology 4:450-4 ber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001) mmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, leic Acis Res. 23, 3067-8 (1995). Pueden encontrars cionales de muchos de los métodos anteriores en ymology Volumen 154, que también describe controles olver los problemas de diversos métodos de mutagénesi Los oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en la presente invención, por ejemplo, que mutan bibl tétasas, o alteran ARNt , normalmente se sintetizan q ogonales. Las células huésped se modifican mediante ética (incluyendo, pero sin limitarse a, t nsducir o transfectar) con los polinucleotidos de l constructos que incluyen ^un polinucleótido de la luyendo, pero sin limitarse a, un vector de la inve de ser, por ejemplo, un vector de clonación o un resión. Por ejemplo, las regiones codificantes pa ogonal, la ARNt sintetasa ortogonal, y la proteína ivatizarse están operativamente unidas a elementos la expresión génica que son funcionales en la cél eada. El vector puede estar, por ejemplo, en fo smido, un cósmido, un fago, una bacteria, un inucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. L introducen en células y/o microorganismos median ituales incluyendo electroporación (Fromm et al., P d. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infección mediant ales, penetración balística de alta velocidad median rmalmente retrovirales) y transfección mediada por teína de la envuelta viral [Dzau et al , technology 11: 205-210 (1993)]. En algunas situaci deseable dotar la fuente de ácido nucleico de un ecciona como diana las células diana, tal como un ecífico para una proteína de membrana de superficie célula diana, un ligando para un receptor en la cé . Cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteí n a una proteína de membrana de superficie celular a ocitosis para seleccionar como diana y/o para fa tación, por ejemplo, de proteínas de la cápside o fr mismas típicos para un tipo celular particular, a proteínas que experimentan internalización e teínas que dirigen la localización intracelular y p ud-vida intracelular Las células huésped modificadas mediante ingenier dén cultivarse en medios de nutrientes con erencias citadas en ese documento, Payne et al (1 1 and Tissue Culture in Liquid Systems John iley & va York, NY, Gamborg y Phillips (eds ) (1995) P sue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer inger-Verlag (Beilm Heidelberg New York) y Atlas y P Handbook of Miciobiological Media (1993) CRC P on, FL.

Están disponibles varios métodos bien con roducción de ácidos nucleicos diana en células, cua cuales puede usarse en la invención. Éstos incluye células del receptor con protoplastos bacter tienen el ADN, electroporación, bombardeo con pro ección con vectores virales (tratados adiciona tinuación) , etc. Pueden usarse células bacteri lificar el número de plásmidos que contienen" constru esta invención. Se hacen crecer las bacterias arítmica y pueden aislarse los plásmidos dentr ectar organismos . Los vectores típicos contienen t la transcripción y la traducción, secuencias de ini transcripción y la traducción, y promotores ú ulación de ^la expresión del ácido nucleico diana vectores comprenden opcionalmente casetes de éricos que contienen al menos una secuencia de ependiente, secuencias que permiten la replicación eucariotas, o procariotas, o ambos, (incluyendo, itarse a, vectores lanzadera) y marcadores de sele temas tanto procariotas como eucariotas . Los ve cuados para la replicación e integración en p ariotas, o ambos. Véanse, Gillam & Smith, Gene 8: erts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, tein Expr. Purif. 6(1): 10-14 (1995); AusubeL Sambr dos citados anteriormente) . Se proporciona un c terias y bacteriófagos útiles para la clonación, po la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Ba sonalizada a cualquiera de una variedad de fuentes c es como Midland Certified Reagent Company (Mi ponible en la World Wide Web en mcrc.com), The Grea e Company {Ramona, CA disponible en la World Wi co.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible e e Web en expressgen.com), Operon Technologies Inc. y muchas otras .

ONES SELECTORES Los codones selectores de la invención expanden el ones genético de la maquinaria de biosíntesis de pro mplo, un codón selector incluye, pero no se limita a tres bases único, un codón sin sentido, tal como u minación, incluyendo, pero sin limitarse a, un c G) , un codón ocre, o un codón ópalo (UGA) , un codón codón de cuatro bases o más, un codón raro, o ulta fácilmente evidente para los expertos en la t duce un O-ARNt que reconoce el codón de t luyendo, pero sin limitarse a, UAG, y se aminoacil ORS con un aminoácido no natural deseado. Este 0-onocen las aminoacil-AR-Nt sintetasas del huéspe ducen de manera natural. Puede usarse mutagénesis d ío convencional para introducir el codón de t luyendo, pero sin limitarse a, TAG, en el sitio de polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers (1988), 5 '-3' Exonucleases in phosphoroth gonucleotide-directed mutagénesis. Nucleic Acis Re . Cuando la O-RS, el O-ARNt y el ácido nucleico q a el polipéptido de interés se combinan in vivo, el natural se incorpora en respuesta al codón UAG p ipéptido que contiene el aminoácido no natural en 1 ecificada.

La incorporación de aminoácidos no naturales in lizarse sin una perturbación significativa de la cél Los aminoácidos no naturales también pueden codif ones raros. Por ejemplo, cuando se reduce la concen inina en una reacción de síntesis de proteínas in on de arginina raro, AGG, ha demostrado ser efic erción de Ala mediante un AR t sintético acilado co se, por ejemplo, Ma et al., Biochemistry. 32:7939 e caso, el ARNt sintético compite con la Arg de A duce de manera natural, que existe como una especie Escherichia coli . Algunos organismos no usan todos plete. Se ha utilizado un codón AGA no asignado en eus para la inserción de aminoácidos en un e nscripción/traducción in vitro. Véase, por ejemplo ver, Nucí. Acid. Res., 25:4685 (1997). Pueden ponentes de la presente invención para usar estos co vivo.

Los codones selectores también comprenden codones luyendo, pero sin limitarse a, codones de cuatro ba tiples aminoácidos no naturales en la misma pro mplo, en presencia de O-ARNt mutados, incluyendo, itarse a, un ARNt supresor del desplazamiento del tura especial, con bucles anticodón, por ejemplo, icodón de al menos 8-10 nt, el codón de cuatro base como aminoácido individual . En otras * realizaciones , icodón pueden decodificar, incluyendo, pero sin limit os un codón de cuatro bases, al menos un codón de c l menos un codón de seis bases o más. Puesto que e ones de cuatro bases posibles, pueden codificarse noácidos no naturales en la misma célula usando u tro bases o más. Véase, Anderson et al., (2002) Exp its of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biol ; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Se icient Suppressors of Four-base Codons and ídentif ifty" Four-base Codons with a Library Approach in i, J. Mol. Biol. 307: 755-769. 99 ) J. Am. Chem. Soc, 121 : 12194 . En un estudio in al . examinaron la capacidad de derivados de A icodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede se y encontraron que el cuadruplete UAGA puede de iante un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una efic 26% con poca decodificación en el marco 0 ó -1 . Véas , ( 2000 ) J, Mol. Biol., 298 : 195 . En una realizaci rse codones extendidos basados en codones raros o tido en la presente invención, que pueden reducir la tido erróneo y la supresión del desplazamiento de tura en otros sitios no deseados.

Para un sistema dado, un codón selector también pu de los codones de tres bases naturales, en los que ógeno no usa (o usa rara vez) el codón de bases n mplo, esto incluye un sistema que carece de un onoce el codón de tres bases natural, y/o un sistema codón de tres bases es un codón raro. ural naciente. Las descripciones de pares de bases n pueden adaptarse para los métodos y las co luyen, por ejemplo, Hirao, et al., (2002) An unna r for incorporating amino acid analogues into prote technology. 20: 177-182. Véase, también, Wu, Y., et m. Chem. Soc. 124:14626-14630. A continuación se in licaciones relevantes .

Para la utilización in vivo, el nucleósido no meable en membrana y se fosforila para formar el respondiente . Además, la información genética au able y no se destruye por enzimas celulares. Los vios de Benner y otros se aprovechaban de patrones hidrógeno que son diferentes de los que se encuentr Watson-Crick canónicos, cuyo ejemplo más notable es so-G. Véanse, por ejemplo, Switzer et al., (1989) J. . 1 11:8322; y Piccirilli et al .. (1990) Nature, 34 00) Curr. Opin, Chem. Biol . , 4:602. Estas bases en ultz, Romesberg y colaboradores han temáticamente y estudiado una serie de bases hid urales . Se encuentra que un autopar PICS.PICS es m los pares de bases naturales, y puede incorporarse ADN mediante el fragmento de Klenow de ADN polim herichia coli (KF) . Véanse, por ejemplo, McMinn et Am. Chem. Soc, 121:11585-6; y Ogawa et al., (2000) J. , 122:3274. Puede sintetizarse un auto par 3M : 3M eficacia y selectividad suficientes para la función se, por ejemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. :8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un ter ena para la replicación adicional. Recientemen arrollado una ADN polimerasa mutante que puede u licar el autopar de PICS. Además, puede replicarse 7AI . Véase, por ejemplo, Tae et al., (2001) J. Am. :7439. También se ha desarrollado un par de edoso, Dipic:Py, que forma un par estable con la secuencia grande en un gen pero no se traduce en p uencia contiene una estructura que sirve como im ucir que el ribosoma se salte la secuencia y ducción en sentido corriente abajo de la inserción.

En determinadas realizaciones, la proteína o el interés (o parte de los mismos) en los método posiciones de la invención se codifica por .un ácido malmente, el ácido nucleico comprende al menos ector, al menos dos codones selectores, al menos tr ectores, al menos cuatro codones selectores, al m ones selectores, al menos seis codones selectores, te codones selectores, al menos ocho codones sele os nueve codones selectores, diez o más codones selec Los genes que codifican para proteínas o polip erés pueden mutagenizarse usando métodos conocid erto en la técnica y descritos en él presente doc luir, por ejemplo, uno o más codones selectore respondientes, es decir, cualquier ácido nucleico con ones selectores que codifica para uno o más amin urales .

Las moléculas de ácido nucleico que codifican teína de interés tal como un polipéptido bG-CSF pue ilmente para introducir una cisterna en cualquie eada del polipéptido. La cisterna se usa amplia roducir moléculas reactivas, polímeros solubles teínas, o una amplia variedad de otras molécula teína de interés . Los métodos adecuados paira la in cisterna en una posición deseada de un polipéptido expertos en la técnica, tales como los descritos en adounidense n.2 6.608.183, que se incorpora como re sente documento, y técnicas de mutagénesis convencion Aminoácidos no codificados de manera natural Una muy amplia variedad de aminoácidos no codi ilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, ina) . En algunas realizaciones, los aminoácidos no manera natural incluyen grupos funcionales de cade reaccionan eficaz y selectivamente con grupos func se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (inclu limitarse a, grupos azido, cetona, aldehido y amino mar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido luye un aminoácido no codificado de manera natural q grupo funcional azido puede hacerse reaccionar con cluyendo, pero sin limitarse a, poli (etilengl ernativamente, un segundo polipéptido que contiene u uino para formar un conjugado estable que result cción selectiva de los grupos funcionales azida y a mar un producto de cicloadición [3+2] de Huisgen.

La estructura genérica de un alfa-aminoácido se il uíente manera (fórmula I) : i a su uso en la presente invención. Dado que los ami ificados de manera natural de la invención normalmen los aminoácidos naturales sólo en la estructura de eral, los aminoácidos no codificados de manera natu aces amida con otros aminoácidos, incluyendo, itarse a, codificados de manera natural o no codi era natural, de la misma manera en que se ipéptidos que se producen de manera natural. Sin e noácidos no codificados de manera natural tienen ena lateral que los distinguen de los aminoácidos ejemplo, R opcionalmente comprende un grupo alqui lo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, uenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonil onato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, eno ehído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, o s lquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos ducen de manera natural de interés que pueden ser tina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosil o una serina sustituida con azúcar, otros ificados con hidratos de carbono, aminoácidos que o, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o noácidos sustituidos con átomos pesados, indibles químicamente y/o fotoescindibles , aminoácid ena lateral alargada en comparación con los urales, incluyendo, pero sin limitarse a, po rocarburos de cadena larga, incluyendo, pero sin li de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 noácidos que contienen azúcar unidos a carbono, ivos redox, aminoácidos . que contiene aminoti noácidos que comprenden uno o más restos tóxicos .

Los aminoácidos no codificados de manera natural mplo que pueden ser adecuados para su uso en l ención y que son útiles para reacciones con polímer agua incluyen, pero no se limitan a, aquellos se produce de manera natural entre el aminoácido y reemplaza por una unión covalente que no se únmente en la naturaleza, incluyendo, pero sin limit ueno, una oxima, un tioéter, una amida y simi mplos de tales aminoácidos también incluyen sacáridos uentran comúnmente en proteínas que se producen ural tales como 2-desoxi-glucosa, 2-desoxigal ilares.

Muchos de los aminoácidos no codificados de mane porcionados en el presente documento están ercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich (St. UU. ) , Novabiochem (una división de EMD Biosciences, mania) , o Peptech (Burlington, MA, EE.UU.). Los qu ponibles comercialmente se sintetizan opcionalmente t porciona en el presente documento o usando métodos ocidos por los expertos en la técnica. Para las t tesis orgánica, véanse, por ejemplo, Organic Ch noácidos no naturales que pueden ser adecuados para presente invención también comprenden opcionalmente ncipales modificadas, incluyendo, pero sin limitars ilustra mediante las estructuras de fórmula II y III: prenden opcionalmente sustituciones en el grupo boxilo según se ilustra mediante las fórmulas II noácidos no naturales de este tipo incluyen, pero no a-hidroxiácidos, a-tioácidos, a-aminotioca luyendo, pero sin limitarse a, con cadenas respondientes a los veinte aminoácidos naturales enas laterales no naturales. Además, las sustituci bono a incluyen opcionalmente, pero no se l noácidos L, D, o a-a-disustituidos tales como D-glu niña, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y as alternativas estructurales incluyen aminoácidos es como análogos de prolina así como análogos de llos de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, ß y ?-aminoácidos lanina sustituida y ácido y^aminobutírico .

Muchos aminoácidos no naturales se basan en urales, tales como tirosina, glutamina, fenila 2o ole cadena lineal o ramificado, un hidrocarburo aturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un gr grupo alquinilo o similares. Además, también se llos de arilo sustituidos de forma múltiple. Los a tamina que pueden ser adecuados para su uso en l ención incluyen, pero no se limitan a, a-hidrox ivados ?-sustituidos , derivados cíclicos, y der tamina sustituidos con amida. Los análogos de feni o de ejemplo que pueden ser adecuados para su sente invención incluyen, pero no se limitan a, fe a-sustituidas , fenilalaninas orto-sustituidas y fe a-sustituidas, en las que el sustituyente luyendo, pero sin limitarse a, un grupo hidroxilo, oxilo, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo, pero sin un grupo acetilo) , un benzoílo, un grupo al ilare . Los e em los es ecíficos de aminoácidos no fonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofe p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanin pargiloxi-fenilalanina, y similares. Se proporciona estructuras de una variedad de aminoácidos no nat dén ser adecuados para su uso en la presente invenci mplo, el documento WO 2002 / 085923 titulado orporation of non-natural amino acids". Véase tambié , ( 2002 ) Incorporation of azides into recombinant pr moselective modification by the Staudinger liga 19 - 24 , que se incorpora como referencia al presente a análogos de metionina adicionales . La solicitud in PCT/US06/47822 titulada "Compositions Containin olving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Pol se incorpora como referencia al presente documento alquilación , reductora de restos de aminas luyendo, pero sin limitarse a, p-amino-fenilalanina uctora. ele' forma covalente) al ARNt ortogonal, incluyendo, itarse a, unirse de forma covalente al ARNt ortogona un enlace amino-acilo, unirse de forma covalente a un H de un azúcar de ribosa terminal del ARNt ortogonal, Los restos químicos por medio de aminoácidos no na dén incorporarse en proteínas ofrecen una variedad anipulaciones de la proteína. Por ejemplo, la reacti un grupo funcional ceto permite la modificación se teínas con cualquiera de varios reactivos que razina o hidroxilamina in vitro e in vivo. Un ami ural con átomos pesados, por ejemplo, puede ser útil ructurales de rayos X sobre fases. La introducción sitio de átomos pesados usando aminoácidos no bién proporciona selectividad y flexibilidad en la e iciones para átomos pesados. Los aminoácidos no orreactivos (incluyendo, pero sin limitarse a, amino enas laterales de benzofenona y arilazidas (incluy luyendo, pero sin limitarse a, grupo metil tópicamente, como sonda de la dinámica y estruct luyendo, pero sin limitarse a, con el uso de nética nuclear y espectroscopia vibracional . Grupos uinilo o azido, por ejemplo, permiten la modificació proteínas con moléculas a través de una re loadición [3+2] .

Un aminoácido no natural incorporado en un polipé remo amino terminal puede componerse de un grupo lquier sustituyente distinto de uno usado en noácidos naturales y un 29 grupo reactivo diferente presente normalmente en a-aminoácidos (véase la fór noácido no natural similar puede incorporarse en boxilo terminal con un 2 grupo reactivo diferente H presente normalmente en a-aminoácidos (véase la fón Los aminoácidos no naturales de la invenci eccionarse o diseñarse ara ro orcionar cara istencia a la degradación enzimática, y similares, f ificación y procesamiento, propiedades est piedades espectroscopicas, propiedades quími oquímicas, actividad catalítica, potencial redox, acidad para reaccionar con otras moléculas, por e ma covalente o no covalente, y similares.

RUCTURA Y SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALE BONILO, SIMILARES A CARBONILO, CARBONILO ENMASCARADO, TEGIDOS Y GRUPOS HIDROXILAMINA En algunas realizaciones la presente invención CSF unido a un polímero soluble en agua, por ejempl iante un enlace oxima.

Muchos tipos de aminoácidos no codificados de man adecuados para la formación de enlaces oxima. Ésto o no se limitan a, aminoácidos no codificados de man contienen un grupo carbonilo, dicarbonilo o hid 83.970 y la patente estadounidense n.s 7.045.33 orporan como referencia al presente documento en su t Algunas realizaciones de la invención utilizan p CSF que se sustituyen en una o más posiciones con un para-acetilfenilalanina . La síntesis de p-ac ilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describe et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorp erencia. Otros aminoácidos que contienen ca arbonilo puede prepararlos de manera similar un exp nica. Además, se presentan síntesis a modo de itativo de aminoácidos no naturales que están inclu sente documento en las figuras 4, 24-34 y 36-39 de adounidense n.2 7.083.970, que se incorpora como re sente documento en su totalidad.

Los aminoácidos con un grupo reactivo electrófil variedad de reacciones para unir moléculas por cciones de adición nucleófila entre otros. Tal po ceto y un grupo dicarbonilo) tras su desprotecci noácidos incluyen aminoácidos que tienen la est mula (IV) : en la que: A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, eteroarileno quilen o alquilen sustituido)-, -C(S)-,- -C(S)-( uilen sustituido)-, -N(R'):-, - R' - (alquilen o tituido)-, -CÍO)N(R')-, -CO (R' )- (alquilen o tituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquilen o tituido)-, -N(R' )C0- (alquilen o alquilen su R' )C(0)0-, -S(0)kN(R' )-, -N(R' )C(0)N(R' )-, -N(RT(S ' )S(0)kN(R' )-, -N(R' ) -N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')2. -N=N- , y -C(R' )2-N(R' )-N(R' )-, en los . que ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; cada R" es independientemente uilo sustituido, o un grupo protector, o cuando más está presente, dos R" forman opcional cada uno de R3 y R4 es independientemente H, haloge erior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o do man opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalq o los grupos -A-B-J-R forman juntos un cicl erocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprend grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarboni bonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo p po carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo ascarado; o el grupo -J-R forma en conjunto un cicl erocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprend grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarboni bonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo p po carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo ascarado; con la condición de que cuando A es fenileno y ca stá presente; y que cuando A es -(CH2 ) 4 - y cada R3 es en la que: A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido,¦ cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, eterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; B es opcional, y cuando está presente es eccionado del grupo que consiste en alquileno uileno inferior sustituido, alquenileno inferior, erior sustituido, heteroalquileno inferior, hete ')C{0)0-, -S(0)kN<R' )-, -N(R') C(0)N<R')-, -N(R')C(S ')S(O)kN), -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N(R' ) - , -C ( ' )2-N=N- y -C (R' ) 2~ (R' ) -N (R> , en los que ca ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, pólip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; con la condición de que cuando A es fenilen sente; y que cuando A es -(CH2)4-, B no es -NHC(0)( cuando A y B están ausentes, R no es metilo.

Además, están incluidos aminoácidos que tienen la fórmula (VI) : B es un ligador seleccionado del grupo que c uileno inferior, alquileno inferior sustituido, erior, alquenileno inferior sustituido, nete erior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0-( uilen sustituido)-, -S-, -S- (alquilen o alquilen su 0)k- en el que k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquilen tituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquilen o alquilen susti )-, -C (S) - (alquilen o alquilen sustituido)-, - N(R quilen o alquilen sustituido)-, -C(0)N(R')-, -C0N(R' ) lquilen sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquilen tituido)-, -N (R' ) CO- (alquilen o alquilen su R' )C(0)0-, -S(,0)kN(R' ) - , -N(R' )C(0)N(R' ) -. -N(R' )C(S ' ) S (0)kN(R' ) - , -N (R' ) -N=, -C(R' ) =N- , -C (R# )=N-N(R' ) - , -C(R' )2-N=N-, y -C(R' )2-N(R' )-N(R' en los que ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; )kR' en el que k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2/ -OR' ,y - que cada R' es independientemente H, alquilo, tituido.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos: los que tales compuestos son opcionalmente grupo pr amino, protegido en el carboxilo o una sal de l más, puede ¦ incorporarse cualquiera de los noácidos no naturales en un polipéptido con amin urales .

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (VII) : en la que B es opcional, y cuando está presente es tituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R' ) - (alquilen o tituido)-, -CSN(R')-, -CSN{R' )- {alquilen o tituido)-, -N(R' ) C0- (alquilen o alquilen sustit ')C(0)0-, -S(O)kN), -N(R' )C(0)N(R' )-, -N(R')C(S) ' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=# -C (R' ) =N- , -C (R' ) =N- N (R' ) - , -C{R' )2-N=N-, y -C(R' )2-N(R')-N(R' )-, en los que ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Rx es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido,. poíi inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, poli inucleótido,- cada Ra se selecciona independientemente del siste en H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, , en los que tales compues ionalmente protegidos en el amino, opcionalmente pro carboxilo, opcionalmente protegidos en el amino y pr carboxilo, o una sal de los mismos. Además, estos naturales y cualquiera de los siguientes amin urales pueden incorporarse en un polipéptido con ami urales. en la que A es opcional, y cuando está presente e erior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralcjuileno o tituido B es opcional, y cuando está presente es eccionado del grupo que consiste en alquileno uileno inferior sustituido, alquenileno inferior, erior sustituido, heteroalquileno inferior, hete erior sustituido, -0-, -0^ (alquilen o alquilen sust -S- (alquilen o alquilen sustituido)-, -S(0)k X- en e 2 ó 3, -S (0) k (alquilen o alquilen sustituido)-, -C( -C (R' ) 2-N=N- y -C(R' )2-N(R' )-N{R' )-, en los que c ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; Rx es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (IX) : B es opcional, y cuando está presente es U tituido)-, . -C(0)N(R')-, -CO (R' )- (alquilen o tituido)-, -CS (R')-, - -CS (R' )- (alquilen o tituido)-, - (R' ) C0- (alquilen o alquilen sustit ')C(0)0-, -S(0)kN(R' )-, -N (R' ) C (0) N (R' ) - , % -N(R'.)C(S) ' )S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C (R' ) =N- , -C(R!)=N- N(R')-, -C(R' )2-N=N-, y -C(R' )2-N(R' )-N(R' )-, en los que ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es . H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente,' es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; en los que cada Ra se selecciona independientement consiste en H, halógeno, alquilo, alquilo sustituid los que tales compuestos están opcionalmente proteg o, opcionalmente protegidos en el carboxilo, op tegidos en el amino y protegidos en el carboxilo, o mismos. Además, estos aminoácidos no naturales y cu siguientes aminoácidos no naturales pueden incorpor ipéptido con aminoácidos no naturales.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (X) : quilen o alquilen sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-( uilen sustituido)-, -N(R' ) - , -NR' - (alquilen o tituido)-, -C(0)N(R')-, -CO (R' )- (alquilen o tituido)-, -CSN(R')-, -CS (R' )- (alquilen o tituido)-, -N(R' ) C0- (alquilen o alquilen sustit ' )C{0)0-, -S (0)kN(R' ) , -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(S ')S(0)kN(R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N (R' ) - , -C (R' ) 2-N=N- y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en los que c ependientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, . y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; en los que tales compuestos están op tegidos en el amino, opcionalmente protegidos en el ionalmente protegidos en el amino y protegidos en el na sal de los mismos. Además, estos aminoácidos no lquier de los siguientes aminoácidos no natura orporarse en un polipéptido con aminoácidos no natura Además de estructuras de monocarbonilo, los amin urales descritos en el presente documento pueden inc es como grupos dicarbonilo, similar a dicarbonilo, ascarado y dicarbonilo protegido.

Por ejemplo, están incluidos los siguientes amino nen la estructura de fórmula (XI) : uenileno inferior' sustituido, alquinileno, hete erior, eteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; B es opcional, y cuando está presente es eccionado del grupo que consiste en alquileno uileno inferior sustituido, alquenileno inferior, erior sustituido, heteroalquileno inferior, hete erior sustituido, -O-, -O- (alquilen o alquilen susti -S- (alquilen o alquilen sustituido)-, -S(0)k- en el ó 3, -S (O) k (alquilen o alquilen sustituido)-, -C(O quilen o alquilen sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-( uilen sustituido)-, - (R' ) - , -NR' - (alquilen o tituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R' ) (alquilen o tituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquilen o Rx es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleotido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleotido.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XII) : B es opcional, y cuando está presente es eccionado del grupo que consiste en alquileno uileno inferior sustituido, alquenileno inferior, tituido)-, -N( (R' ) CO- (alquilen o alquilen sustit R')C(0)0-, -S(0)¾N((R')-, -N ( (R' )C(0)N(R' )-, -N(R')C( ' )S(0)kN(R' )-, -N(R' ) -N= -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C{R/)2-N=N- y -C(R' )2-N(R' )-N(R' )-, en los que c ependíentemente H, alquilo o alquilo sustituido,* R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, poli inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, poli inucleótido ; en los que cada R8 se selecciona independientement consiste en H, halógeno, alquilo, alquilo sustituid (0)kR' en el que k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -0R' , y - que cada R' es independientemente H, alquilo, el amino y protegidos en el carboxilo, o una sal de 1 más, estos aminoácidos no naturales y cualquie ruientes aminoácidos no naturales pueden incorpora ipéptido con aminoácidos no naturales.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XIII) : en la que B es opcional, y cuando está presente es eccionado del grupo que consiste en alquileno uileno inferior sustituido, alquenileno inferior, erior sustituido, heteroalquileno inferior, hete erior sustituido, -0-, -0- (alquilen o alquilen susti -S- (alquilen o alquilen sustituido)-, -S(0)k~ en el -C(R' )2-?=?-, y -C(R' )2-N(R' )-N(R' )-, en los que ependientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector "de amino, resina, aminoácido, pólip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido ; cada Ra se selecciona independientemente del siste en H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, )kR' en el que k es 1, 2 ó 3, -C (O)N(R' -0R' , y - que cada R' es independientemente H, 1 alquilo tituido,- y n es de 0 a 8.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos: y ; en los que 'tales compu ionalmente protegidos en el amino, opcionalmente pro carboxilo, opcionalmente protegidos . en el amino y pr carboxilo, o una sal de los mismos. Además, estos naturales y cualquier de los siguientes amin urales pueden incorporarse en un polipéptido con ami urales .

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XIV) : o leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralqüileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loal.quilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, poli inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, poli inucleótido; Xi es C, S o S(0); y L es alquileno, alquileno ' ) (alquileno) o N(R' ) (alquileno sustituido), en los alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o c tituido .

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XIV-A) : loalquileno - inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, eteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido,- R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está " presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(al ' ) (alquileno sustituido) , en los que R' es H, alqui en la que: A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip en la que; A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, poli lquiera con los grupos R adyacentes pueden formar loalquilo.

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XV-A) : en la que : A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, ciclpalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; n es 0, 1, 2, 3, 4 ó" 5; y cada R8 y R9 en cada gru ecciona independientemente del grupo que consis oxilo, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo, o cua pueden formar juntos =0.o un cicloalquilo, o cualqui pos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XV-B) : en la que: arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tectór de amino, resina, aminoácido, poli inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, poli inucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4 ó 5; y cada R8 y R9 en cada gru ecciona independientemente del grupo que consis oxilo, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo, o cua pueden formar juntos =0 o un cicloalquilo, o cual pos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquil Además, están incluidos los siguientes aminoácidos estructura de fórmula (XVI); loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido; Ra es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; Xi es C, S o S{0); y L es alquileno, alquileno ' ) (alquileno) o (R' ) (alquileno sustituido), en los en la que: A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, heterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo loalquilo sustituido,- Ri es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y en la que : A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete erior, heteroalquileno sustituido, eterocic erior, heterocicloalquileno inferior sustituido, leno sustituido, heteroarileno, heteroarileno arileno, alcarileno sustituido, aralquileno o tituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, ciclo L es alquileno, alquileno sustituido, N{R')(al ' ) (alquileno sustituido) , en los que R' es H, alqui tituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.

Además, están incluidos aminoácidos que tienen la fórmula (XVII) : en la que: A es opcional, y cuando está presente es alquilen uileno inferior sustituido, cicloalquileno loalquileno inferior sustituido, alquenileno uenileno inferior sustituido, alquinileno, hete s el que (a) indica la unión al grupo A y (b) indica pos carbonilo respectivos, R3 y R4 se eligen indepen H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicl loalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o do man opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalq R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cic loalquilo sustituido; T3 es un enlace, C(R)(R), 0, o S, y R es H, uilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o c tituido; Ri es opcional, y cuando está presente, es H, donde : -CR3)-, M es en la que (a) indica la unión al grupo A y (b) ón a grupos carbonilo respectivos, R3 y R ependíentemente de H, halógeno, alquilo, alquilo Ra es opcional, y cuando está presente, es H, tector de amino, resina, aminoácido, polip inucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente, es OH, tector de éster, resina, aminoácido, polip inucleótido; cada. Ra se selecciona independientemente del siste en H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido/ )kR' en el que k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -0R' , y - que cada R' es independientemente H, alquilo, tituido .

Además, están incluidos los aminoácidos que ructura de fórmula (XIX) : en la que: R es H,, halógeno, alquilo, alquilo loalquilo, o cicloalquilo sustituido .

Además, están incluidos los siguientes aminoácidos ructuras de fórmula (XXI) : medio de digestión química o enzimática) para g cionalidad aldehido en condiciones de escisión oxida ndo peryodatp. Véanse, , por ejemplo, Gaertner, conjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & conjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. :7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conoci nica se limitan al aminoácido en el extremo N-te tido o la proteína.

En la presente invención, un aminoácido no natural pos hidroxilo y amino adyacentes puede incorpora ipéptido como una funcionalidad aldehido "enmasca mplo, la 5-hidroxilisina lleva un grupo hidroxilo a amina épsilon. Las condiciones de reacción para ehído implican normalmente la adición de un exces aperyodato de sodio en condiciones suaves para dación en otros sitios dentro del polipéptido. El cción de oxidación es normalmente de aproximadament estable en condiciones fisiológicas. Véanse, po cks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); n( J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). ctividad única del grupo carbonilo o dicarbonilo ificación selectiva en presencia de las otras cadena aminoácido. Véanse, por ejemplo, Cornish, V. W. , et m. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & St conjug. Chem, 3:138-146 (1992); Mahal, L . K. , et a :1125-1128 (1997) . ructura y síntesis de aminoácidos no naturales: amin tienen hidroxilamina La solicitud provisional de patente estadoun 638.418 se incorpora como referencia en su tota to, las descripciones proporcionadas en la Sección inoácidos no naturales"), Parte B (titulada: wEs tesis de aminoácidos no naturales: aminoácidos que publicaciones de patente estadounidense n.os 20 6 / 0217532 y 2006 / 0217289 y el documento WO 2006 / 0692 mpositions containing, methods involving, and use ural amino acids and polypeptides" , también se inc sente documento como referencia en su totalidad.

TESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados p la presente invención están disponibles comerciali mplo, de Sigma (EE.UU.) o Aldrich (Milwaukee, WÍE, E no están disponibles comercialmente se ionalmente tal como se proporciona en el presente ún se proporciona en diversas publicaciones o usan ituales conocidos por los expertos en la técnica, nicas de síntesis orgánica, véanse, por ejempl mistry de Fessendon y Fessendon, ( 1982 , segund lard Grant Press, Boston Mass) ; Advanced Organic C d from Phthilated Intermediates . J. Chem. Soc, edman, O. . & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Der tamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. . 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) figuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(die ethylbutyl] amino] uinoline (Chloroquine) . J. Org. 7-1170; Azoulay, M., Vilmont, . & Frappier, tamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synt stituted Prolines as Conformationally Constrained logues. J. Org. Chem, 54, 1859-1866; Christie, B.D. (1985) Synthesis of Optically Pur Pipecolates aragine. Application to the Total Synthesis of (+)-A ough Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cycl . Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesi ha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical thesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, Grupos reactivos carbonilo Los aminoácidos con un grupo reactivo carbonilo pe iedad de reacciones para unir moléculas (incluyendo itarse a, PEG u otras moléculas solubles en agua) po cciones de adición' nucleófila o de condensación aldó os .

Los aminoácidos que contienen carbonilo a modo dén representarse tal como sigue: en la que n es de 0-10; Ri es un alquilo, aril tituido o arilo sustituido; R2 es Hr alquilo, aril tituido y arilo sustituido; y R3 es H, un amin ona se sitúa en la posición meta con respecto a eral de alquilo.

'La síntesis de A-acetil- ( +/- ) -fenilalanina y m-ac ilalanina se describe en Zhang, Z., et al., Bioche 5-6746 (2003), que se incorpora como, referencia a umento. Otros aminoácidos · que contienen carbon pararlos de manera similar un experto en la técnica. lizaciones, un polipéptido que comprende un ami ificado de manera natural se modifica químicamente p grupo funcional carbonilo reactivo. Por ejemp erarse una funcionalidad aldehido útil para rea jugación a partir de una funcionalidad que tiene gru roxilo adyacentes . Cuando la molécula biológicamente polipéptido, por ejemplo, puede usarse una serina* o minal (que puede estar presente normalmente o puede medio de digestión química o enzimática) para g cionalidad aldehido en condiciones de escisión oxida orporarse en el polipéptido como una funcionalida mascarada". Por ejemplo, la 5-hidroxilisina lleva roxilo adyacente a la amina épsilon. Las cond cción para generar el aldehido implican normalmente un exceso molar de metaperyodato . de sodio en condici a evitar la oxidación en otros sitios dentro del p pH de la reacción de oxidación es norma oximadamente 7,0. Una reacción típica implica la adi eso molar de aproximadamente 1,5 de metaperyodato disolución tamponada del polipéptido, seguido por ante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. mplo la patente estadounidense n.e 6.423.685 que s presente documento como referencia.

La funcionalidad carbonilo puede hacerse ectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, roxilamina o semicarbazida en condiciones suaves en osa para formar las uniones hidrazona, oxima o se ghegan, K. F. & Stroh, J. G. , Bioconjug. Chem, 92); Mahal, L . K. , et al., Science 276:1125-1128 (199 Grupos reactivos hidrazina, hidrazida o semicarbazida Los aminoácidos no codificados de manera na tienen un grupo nucleófilo, tal como una hidrazina, icarbazida, permiten la reacción con una variedad ctrófilos para formar conjugados (incluyendo, itarse a, con PEG u otros polímeros solubles en noácidos que contienen hidrazina, hidrazida o semic o de ejemplo pueden representarse tal como sigue: en la que n es de 0-10; Ri es un alquilo, aril O, y el átomo de oxígeno se sitúa en para con respec fático en el anillo de arilo.

Los aminoácidos que contienen hidrazina, hi iicarbazida están disponibles de fuentes comerci mplo, L-glutamato-y-hidrazida está disponible de Sig . Louis, MO) . Otros aminoácidos no disponibles com de prepararlos un experto en la técnica. Véase, por ente estadounidense n.s 6.2.81.211, que se inco erencia al presente documento.

Los polipéptidos que contienen aminoácidos no codi era natural que llevan funcionalidades hidrazida, h icarbazida puede hacerse reaccionar eficaz y selecti variedad de moléculas que contienen aldehidos u ot cionales con reactividad química similar. Véase, po o, J. y Tarn, J. , J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 ctividad única de los grupos funcionales hidrazida, icarbazida los hace significativamente más reactivo roxilamina) permiten la reacción con una variedad ctrófilos para formar conjugados (incluyendo, itarse a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) razinas, hidrazidas y semicarbazidas , la nucleofilia grupo aminooxilo le permite reaccionar eficaz y sel una variedad de moléculas que contienen aldehido pos funcionales con reactividad química similar. V mplo, Shao, J. y Tarn, J., J. Am. Chem Soc. 11 95); H. Hang y C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34: 121-ntras que el resultado de la reacción con un grupo h hidrazona correspondiente,¦ sin embargo, generalmen oxima de la reacción de un grupo aminooxilo con un tiene carbonilo tal como una cetona.

Los aminoácidos que contienen grupos aminooxilo mplo pueden representarse tal como sigue: (9H2)n rX-(CH2)m-Y-0-NH2 grupo de modificación de extremo carboxilo terminal. lizaciones, n es 1, Ri es fenilo, X es 0, m es 1, sente. En algunas realizaciones, n es 2, R| y X sentes, m es 0, e Y no está presente.

Los aminoácidos que contienen aminooxilo pueden p tir de precursores de aminoácido fácilmente moserina, serina y treonina) . Véase, por e emplo, M, Brown, J Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). D noácidos que contienen aminooxilo, tales como ácido aminooxi) butírico) , se han aislado de fuentes senthal, G. , Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Otros contienen aminooxilo puede prepararlos un expe nica.

Grupos reactivos azida y alquino La reactividad única de los grupos funcionale uino los hace extremadamente útiles para la m resorte" de los grupos azida y alquino se revela y ectiva y eficazmente por medio de la reacción de c 2] de Huisgen para generar el triazol correspondien ejemplo, Chin J., et al, Science 301: 964-7 (2003) ; al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) ; Chin, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) .

Dado que la reacción de cicloadicion de Huisgen i cción de cicloadicion selectiva (véanse, por ejemp en COMPREHE SIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol . 4, (ed. Tr 1) , págs. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CY MISTRY, (ed. Padwa, A., 1984) , págs. 1-176) en titución nucleófila, la incorporación de amino ificados de manera natural que llevan cadenas lat tienen azida y alquino permite que se modifiquen sel polipéptidos resultantes en la posición del ami ificado de manera natural. La reacción de cicloa lica polipéptido bG-CSF que contiene azida o alq luyen, incluyendo, pero sin limitarse a, ascorb álico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutatión, +, Co2+, y un potencial eléctrico aplicado.

En algunos casos, en los que se desea una r loadición [3+2] de Huisgen entre un azida y un a ipéptido bG-CSF comprende un aminoácido no codificado ural que comprende un resto alquino y el polímero a que va a unirse al aminoácido comprende un re ernativamente, también puede llevarse a cabo l esta (es decir, con el resto azida en el aminoácido uino presente en el polímero soluble en agua) .

El grupo funcional azida también puede hacerse ectivamente con un polímero soluble en agua que c er arílico y funcionalizarse apropiadamente con un r fina para generar una unión amida. El grupo aril-fos azida in situ y la amina resultante reaccion cazmente con una unión éster proximal para genera en la que X puede ser O, N3 S o no está prese ilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser uilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido. modo de ejemplo incluyen pero no se limitan a -CH2, , -NR^", -SR' , -halógeno, -C(0)R', -CO R'R", -)2NR'R", -CN y -N02 - R' , R" , R" ' y R"" se refiere ependíentemente a hidrógeno, heteroal uilo sustit tituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyend itarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos tituido o no sustituido, grupos alcoxilo o tioa pos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invenci de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los g luyen átomos de carbono unidos a grupos distintos rógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limi )CH3, -C(0)CF3/ -C(0)CH2OCH3/ y similares).

El grupo funcional azida también puede hacerse ectivamente con un polímero soluble en agua que c éster y funcionalizarse apropiadamente con un r fina para generar una unión amida. El grupo aril-fos azida in situ y la amina resultante reaccion cazmente con la unión tioéster para generar respondiente . Los polímeros solubles en agua que co éster y un resto fosfina a modo de ejemplo pueden re como sigue: en la que n es de 0-10; Ri es un alquilo,' aril tituido o arilo sustituido o no está presente; X es está presente; m es de 0-10, R2 es H, un amin ipéptido o un grupo de modificación de extremo amin 3 es H, un aminoácido, un polipeptido o un grupo de m extremo carboxilo terminal. En algunas realizaciones, fenilo, X no está presente, m es. 0 y el resto ac úa . en la posición' para con respecto a la cadena uilo. En algunas realizaciones, n es 1, R4 es fenilo, 1 y el grupo' propargiloxilo se sitúa en la posició pecto a lá cadena lateral, de alquilo (es decir, O osina) . En algunas realizaciones, n es 1, R y sentes y m es 0 (es decir, propargilglicina) .

Los aminoácidos que contienen alquino están ercialmente . Por ejemplo, propargilglicina está la técnica puede preparar otros aminoácidos que uino .

Los aminoácidos que contienen azida a modo de eje resentarse tal como sigue: en la que n es de 0-10; Rx es un alquilo, aril tituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, á presente; m es de 0-10; R2 es H, un aminoácido, un n grupo de modificación de extremo amino terminal, y noácido, un polipéptido o un grupo de modificación boxilo terminal. En algunas realizaciones, n es 1( ¾ o está presente, m es 0 y el resto azida se sitúa e pecto a la cadena lateral de alquilo. En algunas rea ponibles comercialmente, el grupo azida puede pre era relativamente sencilla usando métodos habituales los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin li medio de desplazamiento de un grupo saliente cluyendo, pero sin limitarse a, haluro, mesilato, t medio de la apertura de una lactona protegida cuada. Véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistr rcera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York) .

Grupos reactivos aminotiol La reactividad única de los grupos funcionales a-sustituidos los, hace extremadamente útiles ificación selectiva de polipéptidos y otras lógicas que contienen grupos aldehido por medio de l la tiazolidina. véase, por ejemplo, J. Shao y J. Ta m. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas realiza noácidos de aminotiol beta-sustituidos pueden incor Los grupos reactivos adicionales y aminoácidos no manera natural, incluyendo, pero sin limitarse á, ilalanina, que pueden incorporarse en polipéptidos b ención se describen en las siguientes solicitudes se incorporan todas como referencia en su . to sente documento: publicación de patente estadoun 6/0194256, publicación de patente estadounid 6/0217532, publicación de patente estadounid 6/0217289, patente provisional estadounidense n.-ente provisional estadounidense n.s 60/755.711 visional estadounidense n.s 60/755.018; solicitud ernacional n.2 PCT/US06/49397 ; documento WO 2 ente provisional estadounidense n.s 60/743.041 visional estadounidense n.2 60/743.040; solicitud ernacional n.s PCT/US06 /47822 ; patente adounidense n.2 60/882.819; patente provisional est 60/882.500; y patente provisional estadouni eccionan aminoácidos no naturales, incluyendo, iitarse a, para su incorporación en una proteína. Po alta densidad de carga de los a-aminoácidos sugie robable que estos compuestos sean permeables a las c rioácidos naturales se captan en l célula eucariota una colección de sistemas de transporte basados en de realizarse un examen rápido que evalúe qué amin urales, si alguno, se captan por las células. V mplo, los ensayos de toxicidad en, por ejemplo, la patente estadounidense n.2 US 2004/0198637 titulad ays" que se incorpora como referencia al presente d , D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the e organism with an expanded genetic code. PNAS Uni 4780-4785. Aunque la captación se analiza fáci ersos ensayos, una alternativa al diseño de amin urales que son adecuados para rutas de captación porcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos ula, la invención proporciona tales métodos. Por e eran opcionalmente rutas biosintéticas para amin urales en células huésped mediante la adición de nue a modificación de rutas de células huésped existent imas adicionales son opcionalmente enzimas que se p era natural o enzimas desarrolladas artificial mplo, la biosíntesis de /7-aminofenilalanina (ta senta en un ejemplo en el documento WO 2002/085923 t o incorporation of unnatural amino acids") se b ción de una combinación de enzimas conocidas a parti anismos. Los genes para estas enzimas pueden intro célula eucariota mediante transformación de la cél smido que comprende los genes. Los genes, cuando se célula, proporcionan una ruta enzimática para sin puesto deseado. Se facilitan ejemplos de los tipos se añaden opcionalmente en los ejemplos a contin uentran secuencias de enzimas adicionales, por e Maxygen, Inc. (disponible en la World Wid ygen.com) , se usa opcionalmente para desarrollar imas y novedosas. Véanse, por ejemplo, Stemmer (19 lution of a protein in vitro by DNA shuffli (4) .389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling gmentation and reassembly: In vitro recombination fo lution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 91:10747-10751. ilar DesignPath™, desarrollado por Genencor (dispon ld Wide Web en genencor.com) se usa opcionalment eniería genética de rutas metabólicas, incluyendo, itarse a, modificar mediante ingeniería genética una ar 0-metil-L-tirosina en una célula. Esta onstruye rutas existentes en organismos huésped binación de nuevos genes, incluyendo, pero sin limit ntificados a través de genómica funcional, y de eño moleculares. Diversa Corporation (disponible e e Web en diversa.com) también proporciona tecno ulares. Las concentraciones típicas producidas in vi era son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0, que se transforma una célula con un plásmido que corr es usados para producir enzimas deseadas para ecífica y se genera un aminoácido no natural, ionalmente selecciones in vivo para optimizar adicio ducción del aminoácido no natural tanto para l osómica de proteínas como para el crecimiento celular.

IPÉPTIDOS CON AMINOÁCIDOS NO NATURALES La incorporación de un aminoácido no natural puede a una variedad de fines, incluyendo, pero sin li eñar a medida cambios en la estructura y/o teínas, cambiar el tamaño, la acidez, nucleofilia, rógeno, idrofobicidad, accesibilidad de sitios teasas, direccionamiento a un resto (incluyendo, itarse a, para una matriz proteica) , añadir un ifican opcionalmente mediante la inclusión de un ami ural en una proteína: toxicidad, biodistribución, ructurales, propiedades espectroscópicas, propiedade fotoquímicas, capacidad catalítica, semivida ( inclu limitarse a, semivida en suero) , capacidad para rea as moléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, alente o no covalente, y similares. Las composi luyen proteínas que incluyen al menos un aminoácido útiles para, incluyendo, pero sin limitarse a, edosa, diagnóstico, enzimas catalíticas, enzimas in teínas de unión (incluyendo, pero sin lim icuerpos) , e incluyendo, pero sin limitarse a, el est ructura y función de proteínas. Véase, por ejemplo, 00) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Str ction, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652.

En un aspecto de la invención, una composición os una proteína con al menos uno, incluyendo, al menos uno, pero menos que todos, de un ticular presente en la proteína se sustituye por el natural . Para una proteína dada con más de un ami ural, los aminoácidos no naturales pueden ser i erentes (incluyendo, pero sin limitarse a, la prote luir dos o más tipos diferentes de aminoácidos no n dén incluir dos del mismo aminoácido no natural) . teína dada con más de dos aminoácidos no natu noácidos no naturales pueden ser iguales, difere binación de múltiples aminoácidos no naturales . de se con al menos un aminoácido no natural diferente.

Las proteínas o los polipéptidos de interés con a noácido no natural son una característica de. la in ención también incluye polipéptidos o proteínas con noácido no natural producido usando las composici odos de la invención, un excipiente (incluyendo, itarse a, un excipiente farmacéuticamente aceptabl liza mediante una célula procariota. Por ej ificación postraduccional incluye, incluyendo/ itarse a, acetilación, acilación,. modificación mitoilación, adición de palmitato, fosforilación, m unión de glicolípidos , glicosilación, y similar ecto, la modificación postraduccional incluye la u gosacárido {incluyendo, pero sin limitarse a, (GlcNAc NAc-GlcNAc) ) a una asparagina mediante una uni aragina. Véase la tabla 1 que indica algunos e gosacáridos unidos a N de proteínas eucariotas (tam ar presentes residuos adicionales, que no se muestra ecto, la modificación postraduccional incluye la u gosacárido (incluyendo, pero sin limitarse a, Gal-G NAc, etc.) a una serina o treonina mediante una uni iña o GalNAc-treonina, o una unión GlcNAc-serina onina.

Aún en otro aspecto, la modificación postraduceio cesamiento proteolítico de precursores (incluyendo, itarse a, precursor de calcitonina, precursor acionado con el gen de calcitonina, hormona prepropa proinsulina, proinsulina, prepro-opiórnel opiomelanocortina y similares) , ensambla e en una p tiples subunidades o ensamblaje macromolecular, tra o sitio en la célula (incluyendo, pero sin li ánulos, tales como el retículo endoplasmático, el gi, - el núcleo, lisosomas, peroxisomas , m roplastos, vacuolas, etc., o a través de la ruta sec traduccional es a través del aminoácido no na mplo, la modificación postraduccional puede ser a tra cción nucleófilo-electrófilo . La mayoría de las ualmente usadas para la modificación selectiva de lican la formación de enlace covalente entre cción nucleófila y electrófila, incluyendo, pero sin la reacción de a-halocetonas con cadenas laterales d isteína. La selectividad en esos casos se determina ero y la accesibilidad de los residuos nucleófi teína. En proteínas de la invención, pueden us cciones más selectivas tales como la reacción de noácido no natural con hidrazidas o compuestos de vitro e in vivo. Véase, por ejemplo, Cornish, et al., Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997 :1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500 , (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027; Chin, et c. Nati. Acad. ScL. 99:11020-11024; Wang, et al., (2 o referencia al presente documento. También pueden ificaciones postraduccionales, incluyendo, pero sin a través de un aminoácido azido, mediante el l udinger (incluyendo, pero sin limitarse a, con re arilfosfina) . Véase, por ejemplo, Kiick et al orporation of azides into recombinant prot moselective modification by the Staudinger liga 19-24.

Esta invención proporciona otro método altamente e mod ficación selectiva de proteínas, que i orporación genética de aminoácidos no naturales, o sin limitarse a, que contienen un resto azida o a teínas en respuesta a un codón selector. Est erales de aminoácidos pueden modificarse entonces luyendo, pero sin limitarse a, una reacción de c 2] de Huisgen (véase, por ejemplo, Padwa, A. en Co anic Synthesis. Vol . 4. (1991) Ed. Trost, B. M. , liante la adición de cantidades catalíticas de sales mezcla de reacción. Véase, por ejemplo, Tornoe, et a Org. Chem. 67:3057-3064; y, Rostovtsev, et al., {20 m. Int. Ed. 41: 2596-2599. Otro método que puede us ercambio de ligandos en un compuesto bisarsénico con tetracisteína, véase, por ejemplo, Griffin, et a ence 281: 269-272.

Una molécula que puede añadirse a una proteí ención a través de una cicloadición incluye pr lquier molécula con un derivado de azida o alquinilo. luyen, pero no se limitan a, colorantes, fluoróforo reticulación, derivados de sacáridos, polímeros ( o sin limitarse a, derivados de polietilenglicol) , orreticulación, compuestos citotóxicos, marcadores de ivados de biotina, resinas, perlas, una segunda ipéptido (o más), polinucleótido (s) {incluyendo, itarse a, ADN, ARN, etc.), quelantes de metales, El polipéptidos bG-CSF de la invención puede ge o usando AR t modificado y AR t sintetasas para tituir aminoácidos que no se codifican en sistem ducen de manera natural .

Métodos para generar ARNt y ARNt sintetasas noácidos que no se codifican en sistemas que se p era natural se describen, por ejemplo, en la adounidenses n.os 7.045.337 y 7.083.970 que se inco erencia al presente documento. Estos métodos implic maquinaria de traducción que funciona independien sintetasas y los ARNt endógenos al sistema de tra tanto algunas veces se denomina *ortogonal" ) . Norm tema de traducción comprende un ARNt ortogonal (O-A noacil-ARNt sintetasa ortogonal (ORS) . Normalmente noacila preferiblemente el O-ARNt con al menos un no se produce de manera natural en el sistema de t O-ARNt reconoce al menos un codón selector que no . cuados para su uso en la presente invención. Por e criben O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas específicas g, L., et al. Proc. Nati Acad. Sci . USA 100:56-6 ng, Z. et al., Biochem. 42 (22 ): 6735-6746 (2003). O-RS mplo, o partes de la misma, se codifican mediante se inucleótido e incluyen secuencias de aminoácidos ocer en las patentes estadounidenses n.os 7.045.337 y orporada cada una en el presente documento como-bién se describen moléculas de O-ARNt correspondient con las O-RS en las patentes estadounidenses n.os 7 83.970 que se incorporan como referencia al presente describen ejemplos adicionales de pares de O-ARNt t sintetasa en los documentos WO 2005/007870, WO 200 2005/019415.

Se describe un ejemplo de un sistema O-ARNt/a i tetasa específico de azida en Chin, J. W. , et al, J. . 124:9026-9027 (2002). Secuencias de O-RS a modo se incorpora como referencia al presente docume mplos de pares de O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa a aminoácidos particulares no codificados de manera criben en la patente estadounidense n.s 7.045.3 orpora como referencia al presente documento. 0-RS y orporan aminoácidos que contienen tanto ceto como a evisiae se describen en Chin, J. W. , et al, Science (2003) .

Se han notificado varios otros pares ortogonales. ase, por ejemplo, Liu, D. R. , y Schultz, P. G. (1 i. Acad. Sci. U.S.A. 96:4780-4785), aspartilo ( mplo, Pastrnak, M. , et al., (2000) Helv. Chim. Act 6), y tirosilo (véase, por ejemplo, Ohno, S., et al., chem. (Tokio, Jpn) . 124:1065-1068; y, Kowal, A. K. 01) Proc. Nati, Acad, Sci, U.S.A. 98:2268-2273) se h temas derivados de ARNt y sintetasas de S. cerevisi ible incorporación de aminoácidos no naturales en E t sintetasas implica la selección de un codón espe ifica para el aminoácido no codificado de maner ntras que puede usarse cualquier codón, gener eable seleccionar un codón que se use con poca fr ca en la célula en la que se expresa la O-ARNt/ami tetasa. Por ejemplo, codones a modo de ejemplo incl sentido tal como codones de terminación (ámbar, ocr ones de cuatro bases o más y otros codones de urales que se usan con poca frecuencia o no se usan.

Pueden (n) introducirse codón/codones s ecífico(s) en posiciones apropiadas en la sec ifica para polinucleótido bG-CSF usando métodos de ocidos en la técnica (incluyendo, pero sin li agénesis específica del sitio, mutagénesis d agénesis de selección de restricción, etc.).

Métodos para generar componentes de la sintética de proteínas, tales como O-RS, O-ARNt y p a seleccionar un par de ARNt-ARNt sintetasa ortogon en un sistema de traducción in vivo de un organismo criben en las patentes estadounidenses n.os 7 . 83 . 970 que se incorporan como referencia al presente publicación PCT n.2 O 04 / 035743 titulada wSit orporation of Keto Arnino Acids into Proteins", que se o referencia al presente documento en su totalidad es de RS y ARNt ortogonales para la incorporación noácidos. La publicación PCT n.s WO 04 / 094593 panding the Eukaryotic Genetic Code", que se inco erencia al presente documento en su totalidad, desc RS y ARNt ortogonales para la incorporación de amin ificados de manera natural en células huésped eucario Métodos para producir al menos una aminoacil-ARNt ogonal recombinante (O-RS) comprenden: (a) ge lioteca de RS {opcionalmente mutantes) derivadas d aminoacil-ARNt sintetasa (RS) de un primer noácido natural, proporcionando así una reser cionalmente mutantes) activas; y/o, (c) cionalmente a través de selección negativa) la re erminar RS activas (incluyendo, pero sin limita antes) que aminoacilan preferiblemente el O-ARNt e aminoácido no codificado de manera natural, proporc menos una O-RS recombinante; en el que la al meno ombinante aminoacila preferiblemente el O-ARNt noácido no codificado de manera natural.

En una realización, la RS es una RS inactiva. La de generarse mutando una RS activa. Por ejemplo, la de generarse mutando al menos aproximadamente 1, oximadamente 2 , al menos aproximadamente 3 , oximadamente 4 , al menos aproximadamente 5 , oximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más a dar aminoácidos diferentes, incluyendo, pero sin l niña . structos quiméricos , diseño racional y mediante otr critos en el presente documento o conocidos en la téc En una realización, la selección (y/o el exam lioteca de RS (opcionalmente RS mutantes) para m ros que son activos, incluyendo, pero sin limita noacilan un AR t ortogonal (O-ARNt) en presenc noácido no codificado de manera natural y un ural, incluye: introducir un marcador de selecció itivo, incluyendo, pero sin limitarse a, un gen de antibióticos, o similar, y la biblioteca de RS (op antes) en una pluralidad de células, en la que el ección y/o examen positivo comprende al menos ector, incluyendo, pero sin limitarse a, un codón ám lo; hacer crecer la pluralidad de células en prese nte de selección; identificar las células que sob stran una respuesta específica) en presencia del ección y/o examen suprimiendo el al menos un codón cador de selección positivo es un gen de ß-lactamasa ector es un codón de terminación ámbar en el gen de ß otro aspecto el marcador de examen positivo co cador de examen fluorescente o luminiscente o un m men basado en afinidad (incluyendo, pero sin limit cador de superficie celular) .

En una realización, seleccionar o examinar de mane reserva para detectar RS (opcionalmente mutantes) a noacilan preferiblemente el O-ARNt en ausencia del codificado de manera natural incluye: introducir un men o de selección negativo con la reserva de RS (op antes) activas- de la selección o el examen posit ralidad de células de un segundo organismo, en cador de examen o de selección negativo comprende a ón selector (incluyendo, pero sin limitarse a, istencia a antibióticos, incluyendo/ pero sin limit de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e, ntificación de CAT actúa opcionalmente como una itiva y/o un examen negativo en la determinació ombinantes apropiadas. Por ejemplo, se replica op reserva de clones en placas de crecimiento que con e comprende al menos un codón selector) o bien con o más aminoácidos no codificados de manera natural. considera que las colonias que crecen exclusivame eas que contienen aminoácidos no codificados de mane tienen O-RS recombinante . En un aspecto, se centración del agente de selección (y/o examen) . ectos el primer y el segundo organismo son difer to, el primero y/o el segundo organismo ionalmente: un procariota, un eucariota, un ma herichia coli, un hongo, una levadura, una archaeba acteria, una planta, un insecto, un protista, etc. lizaciones, el marcador de examen comprende un m men fluorescente o luminiscente o un marcador de ex cador tóxico, incluyendo, pero sin limitarse a, onucleasa bamasa, que comprende al menos un codón se reserva de RS {opcionalmente mutantes) activa ralidad de células de un segundo organismo; e ulas que sobreviven o muestran una respuesta ecífica en un primer medio no complementado con el codificado de manera natural, pero no logran so trar una respuesta de examen específica en un seg plementado con el aminoácido no codificado de maner porcionando así células que sobreviven o examinadas os una O-RS recombinante,. en el que la al menos ombinante es específica para el aminoácido no cod era natural. En un aspecto, el al menos un codó prende aproximadamente dos o más codones selecto lizaciones pueden incluir opcionalmente en las que e codón selector comprende dos o más codones selectores el primer y el segundo organismo son diferentes ( orescente o luminiscente o un marcador de examen nidad. En las realizaciones en el presente docu menes y/o las selecciones incluyen opcionalmente la la rigurosidad de examen y/o selección.

En una realización, los métodos para produci al noacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) recombina prender además: (d) aislar la al menos una O-RS re generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalment ivadas de la al menos una O-RS recombinante; y, (f) pas (b) y (c) hasta que se obtiene una O-RS prende una capacidad para aminoacilar preferibleme t. Opcionalmente, se repiten las etapas (d)-(f), o sin limitarse a, al menos aproximadamente dos ve ecto, el segundo conjunto de O-RS mutadas derivadas O-RS recombinante puede generarse mediante m luyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis al azar, ecífica del sitio, recombinación o una combinaci ección/examen negativa (c) o las etapas de selec to positiva como negativa (b) y (c) comprende icador, en el que el indicador se detecta mediante flujo activada por fluorescencia (FACS) o en icador se detecta mediante luminiscencia. Opciona icador se presenta en una superficie celular, sentacion en fago o similares y se selecciona basán nidad o actividad catalítica que implica el ami ificado de manera natural o un análogo. En una real tetasa mutada se presenta en una superficie célul sentacion en fago o similares.

Métodos para producir un ARNt ortogonal (O-ARNft) r luyen: (a) generar una biblioteca de ARNt mutantes d menos un ARNt, incluyendo, pero sin limitarse a resor, a partir de un primer organismo; (b) cluyendo, pero sin limitarse a, selección negativa) biblioteca para detectar ARNt (opcionalmente mutant iante la RS del segundo organismo y se feriblemente mediante la O-RS. En algunas realizaci os un ARNt es un ARNt supresor y/o comprende un cod es único de bases naturales y/o no naturales, o es u tido, un codón raro, un codón no natural, un prende al menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ón de terminación ópalo. En una realización, ombinante tiene una mejora de ortogonalidad. Se apr algunas realizaciones, el OAR t se importa opcionalm mer organismo a partir de un segundo organismo sin n ificación. En diversas realizaciones, el primer y anismo son o bien iguales o bien diferentes y ionalmente de, incluyendo, pero sin limitarse a, cluyendo, pero sin limitarse a, Methanococcus hanobacterium thermoautotrophicum, Escherichi obacteriu , etc.), eucariotas, mamíferos, hongos, haebacteria, eubacteria, plantas, insectos, proti En un aspecto, seleccionar (incluyendo/ pero sin li ección negativa) o examinar la biblioteca para dét cionalmente mutantes) que se aminoacilan med noacil-AR t sintetasa (etapa (b) ) incluye: introduc cador tóxico, en el que el gen marcador tóxico co os uno de los codones selectores (o un gen que co ducción de un agente tóxico o estático o un gen ese organismo en el qué tal gen marcador comprende a ón selector) y la biblioteca de ARNt (opcionalmente una pluralidad de células del segundo organismo; y, ulas que sobreviven, en las que las células que tienen la reserva de ARNt (opcionalmente muta I prende- al menos un ARNt ortogonal o ARNt no func mplo, pueden seleccionarse células que sobreviven ayo de densidad celular con razón de comparación.

En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede inc codónes selectores. En otra realización de los m que el gen marcador positivo comprende un gen de res macos {incluyendo, pero sin limitarse a, gen de ß-lac prende al menos uno de los codones selectores, tal os un codón de terminación ámbar) o un gen esenci anismo, o un- gen que conduce a la destoxificación de ico, junto con la O-RS, y la reserva de ARNt (op antes) en una pluralidad de células del segundo org ntificar células que sobreviven o se examinan que cer en presencia de un agente de selección luyendo, pero sin limitarse a, un antibiótico, pro una reserva de células que presentan el al men ombinante, en el que el al menos un ARNt recom noacila mediante la O-RS e inserta un aminoácido en traducción codificado mediante el gen marcador po puesta a al menos un codón selector. En otra reali e variar la concentración del agente de selección y/o Se proporcionan métodos para generar pares de antes) para detectar miembros que se aminoacilan me ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando así al t recombinante . El al menos un O-ARNt recombinante ón selector y no se reconoce eficazmente mediante undo organismo y se aminoacila preferiblemente medi El método también incluye (d) generar una biblio cionalmente mutantes) derivadas de al menos una ami tetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar biblioteca de RS mutantes para detectar mie noacilan preferiblemente el al menos un O-AR t reco sencia de un aminoácido no codificado de manera na noácido natural, proporcionando así una reser cionalmente mutantes) activas; y, (f) seleccionar o era negativa la reserva para detectar RS (op antes) activas que aminoacilan preferiblemente el a RNt recombinante en ausencia del aminoácido no cod era natural, proporcionando así el al menos un par d par mutRNAGlu-mutGluRS, o similares. Adicionalmei odos incluyen en los que el primer y el tercer organi mo (incluyendo, pero sin limitarse a, Me naschi X) .

Métodos para seleccionar un par de ARNt-ARNt ogonal para su uso en un sistema de traducción in undo organismo también se incluyen en la presente métodos incluyen: introducir un gen marcador, un noacil-ARNt sintetasa (RS) aislados o derivados de anismo en un primer conjunto de células del segundo roducir el gen marcador y el ARNt en un' conjunto licado de un segundo organismo; y, seleccionar par ulas que sobreviven en el primer conjunto que revivir en el conjunto de células duplicado o exa ectar células que muestran una respuesta de examen no logran dar tal respuesta en el conjunto licado, en el que el primer conjunto y el conjunto Los organismos de la presente invención comp iedad de organismos y una variedad de combina mplo, el primer y el segundo organismo de los mét sente invención pueden ser iguales o diferentes lización, los organismos son opcionalmente un cariota, incluyendo, pero sin limitarse a, Me naschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Hal herichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. hori nix, T. thermophilics, o similares. Alternativa anismos comprenden opcionalmente un organismo luyendo, pero sin limitarse a, plantas (incluyendo, itarse a, plantas complejas tales como monocoti otiledóneas) , algas, protistas, hongos (incluyendo, itarse a, levadura, etc.), animales (incluyendo, itarse a, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o otra realización, el segundo organismo es un cariota, incluyendo, pero sin limitarse a, Me Ubicación ele aminoácidos que no se producen de man polipéptidos bG-CSF La presente invención contempla la incorporación d noácidos que no se producen de manera natural en p CSF. Puede incorporarse uno o más aminoácidos ducen de manera natural en una posición partícul era la actividad del polipéptido. Esto puede lizando sustituciones "conservativas", incluyendo, itarse a, sustituir aminoácidos hidrófobos por rófobos, aminoácidos voluminosos por aminoácidos v noácidos hidrófilos por aminoácidos hidrófilos y/o noácido que no se produce de manera natural en un no se requiere para la actividad.

Puede emplearse una variedad de enfoques bio ructurales para seleccionar los sitios deseados titución por un aminoácido no codificado - de mane tro del polipéptido bG-CSF. Resulta fácilmente evi agonistas, moduladores de unión a receptor, modu ividad de receptor, formación de dímeros o multimer io en la actividad o propiedad en comparación con 1 iva, o manipulación de cualquier propiedad física o ipéptido tal como solubilidad, agregación o estábi mplo, pueden identificarse ubicaciones en el ueridas para la actividad biológica de polipépti ndo análisis de mutación puntual, barrido con agénesis por saturación y barrido para determinar la lógica, o métodos de barrido homólogos conocidos en dén usarse otros métodos para identificar residuo ificación de polipéptidos bG-CSF que incluyen, p itán a, obtención de perfil de secuencia, sele liotecas de rotámeros, potenciales de pares de r eño racional usando la tecnología de automatización proteínas. (Véanse las patentes' estadounidenses n.os 69.312; 6.403.312; documento WO98/47089, que se-luyen sobre la actividad . del polipéptido con una na. Se describen estudios de mutagénesis por b niña de G-CSF en Reidhaar-Olson JF et al., Biochemis 16; 35 (28) .9034-41, Young DC et al. Protein Sci. ):1228-36, y Layton et al. (1997) JBC 272(47): 2 iduos distintos de los identificados como crítico ividad biológica mediante mutagénesis por barrido con óloga pueden ser buenos candidatos para la sustituc noácido no codificado de manera natural dependie ividad deseada buscada para el polipéptido. Altern sitios identificados como críticos para la activida ibién pueden ser buenos candidatos para la sustituc noácido no codificado de manera natural, de nuevo la actividad deseada buscada para el polipépt ernaÉiva sería sencillamente preparar sustituciones e a posición en la cadena de polipéptido por un ami ificado de manera natural y observar el efecto un aminoácido no codificado de manera natural. De ilar, la digestión con proteasa y los anticuerpos m dén usarse para identificar regiones de bG-CSF ponsables de la unión a su receptor. Layton et al, ( 39 ) 36779-36787 describen estudios con anticuerpo u receptor. Una vez eliminados los residuos que es p toleren la sustitución por aminoácidos no codificados ural, puede examinarse el impacto de sustituciones cada una de las posiciones restantes. Pueden genera artir de las estructuras cristalinas tridimensionale mbros de la familia de CSF y receptores de CSF. E os de Proteínas (PDB, disponible en la World Wi b.org) es una base de datos centralizada que cont ructurales tridimensionales de moléculas grandes de dos nucleicos. Pueden realizarse modelos invest ructura secundaria y terciaria de polipéptidos , si n ructurales tridimensionales disponibles . Hay estructu En algunas realizaciones, los polipéptidos bG-ención comprende uno o más aminoácidos que no se p era natural ubicados en una región de la proteina qu estructura del polipéptido.

Residuos a modo de ejemplo de incorporación de un codificado de manera natural pueden ser los que se ibles regiones de unión a receptor, pueden esta cialmente expuestos a disolvente, tienen intera ntes de hidrógeno mínimas o inexistentes con residuo dén estar mínimamente expuestos a residuos reactivo dén estar en una o más de las caras expuestas, pue io o sitios. ue están yuxtapuestos a un segundo bG-C écula o fragmento de la misma, pueden estar en regió amente flexibles, o estructuralmente rígidas, según iante la estructura tridimensional secundaria, t ternaria de bG-CSF, unido o no unido a su receptor, o acoplado a otra molécula biológicamente activa, ención es sustituir un aminoácido no codificado ural por un aminoácido que es un residuo expue erficie.

En algunas realizaciones, se incorpora uno o más codificados de manera natural en una o más de las iciones en bG-CSF: antes de la posición 1 (es d remo N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, S 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 1 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, , 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, , 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, , 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, , 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 17 lquier combinación de las mismas de la SEQ ID NO noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2. lizaciones , se incorpora uno o más aminoácidos no manera natural en una o más de las siguientes posicio : 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, , y cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2) . lizaciones, se incorpora uno o más aminoácidos no manera natural en una o más de las siguientes posicio : 3, 7, 62, 133, 166, y cualquier combinación de las SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en 2. En algunas realizaciones, se incorpora u noácidos no codificados de manera natural en una o uientes posiciones de bG-CSF: 62, 133, y una combinac mas (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondientes NO: 2). En algunas realizaciones, se incorpora aminoácidos no naturales en una secuencia líder o s C terminal con respecto a la SEQ ID NO: 1, 2, u otr CSF. En algunas realizaciones, se incorpora u noácidos no codificados de manera natural en iciones del bG-CSF (SEQ ID NO: 1) y el uno o má noácidos no codificados de manera natural no tidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina ptófano, alanina, cisteína, asparaginas, valina, iña, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido onina, o aminoácidos no proteogénicos que se produce ural tales como ß-alanina, ornitina, etc. E lizaciones, se incorpora uno o más aminoácidos no manera natural en una o más posiciones del bG-CSF ( y el uno o más ácidos o aminoácidos no codificados ural no incluyen histidina, arginina, lisina, ilalanina, leucina, triptófano, alanina, cisteína, a ina, glicina, , serina, glutamina, tirosina, ácido teogénicos que se producen de manera natural tal niña, ornitina, etc.

En algunas realizaciones, se incorpora de manera o más aminoácidos no codificados de manera natura posiciones del bG-CSF (SEQ ID NO: 1) y el uno o má noácidos no codificados de manera natural no tidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina ptófano, alanina, cisterna, asparaginas, valina, iña, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido onina, o aminoácidos no proteogénicos que se produce ural tales como ß-alanina, ornitina, etc. E lizaciones, se incorpora de manera ribosómica noácidos no codificados de manera natural en iciones del bG-CSF {SEQ ID NO: 2) y el uno o má noácidos no codificados de manera natural no tidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina tófano alanina cisterna as ara inas valina tamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico, t noácidos no proteogénicos que se producen de mane es como ß-alanina, ornitina, etc. En algunas realiza orpora uno o más aminoácidos no codificados de mane una o más posiciones del bG-CSF (SEQ ID NO: 1) en el ás ácidos o aminoácidos no codificados de manera nat ienen un grupo o grupos funcionales no reconocidos m endógena. En algunas realizaciones, se incorpora noácidos no codificados de manera natural en u iciones del bG-CSF { SEQ ID NO: 2) en el que el uno o minoácidos no codificados de manera natural tiene o po o grupos funcionales no reconocidos mediant ógena. En algunas realizaciones, el polipéptido bG sente invención tiene un aminoácido incorporado en 1 de la SEQ ID NO: 1, o la posición correspondiente e 2 , en el que el aminoácido tiene un grupo o grupos reconocidos mediante una RS endógena. En algunas rea imero soluble en agua, incluyendo, .pero sin limita iciones: antes de la posición 1 (es decir en el minal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, .26, 27, 28, 29, 3 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 9 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, , 112, 113, 114, 115, 116, 117; 118, 119, 120, 121, , 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, , 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, , 151, 152, 153, 154,' 155, 156, 157, 158, 159, 160, , 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 decir, en el extremo carboxilo terminal de la pr lquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: .2 o los noácido que no se produce de manera natural en una s posiciones se une a un polímero soluble en agua, i o sin limitarse a, las posiciones: 3, 7, 33, 43, 5 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, y cualquier comb mismas (SEQ ID NO: l.o los aminoácidos correspondie ID NO: 2) . En algunas realizaciones, el aminoácido duce de manera natural en una o más de esas posicione polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limita iciones: 3/ 7, 62, 133, 166, y cualquier combinac mas {SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondientes NO: 2). En algunas realizaciones, el aminoácido no manera natural en una o más de esas posiciones se imero' soluble en agua, incluyendo, pero sin limita , y una combinación de las mismas ( SEQ ID NO: noácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2) . lizaciones, el aminoácido no codificado de manera nat ición 62 se une a un polímero soluble en agua (SEQ Un examen de la estructura cristalina de bG-CSF o la familia de bG-CSF y su interacción con el recepto de indicar que determinados residuos de aminoáci enas laterales que son total parcialmente accesibl olvente. La cadena lateral de un aminoácido no cod era natural en esas posiciones puede estar dirigida la ' superficie de la proteína y hacia el disolvente.

Una amplia variedad de aminoácidos no codificados ural puede sustituirse por, o incorporarse en, un a en un polipéptido bG-CSF. En general, un ami ificado de manera natural particular se seleccion orporación basándose en -un examen de la estructura dimensional de un polipéptido bG-CSF u otro miem ilia de G-CSF con su receptor, una prefere tituciones conservativas (es decir, aminoácidos no manera natural basados en arilo, tales tilfenilalanina u O-propargiltirosina sustituyen a En una realización, el método incluye además incor teína el aminoácido no natural, en el que el ami ural comprende un primer grupo reactivo; y poner en teína con una molécula (incluyendo, pero sin li roxialquilalmidón (HAS) , hidroxietilalmidón (HES) , u colorante, un polímero, un polímero soluble en ivado de polietilenglicol , un agente de fotorreticu ionúclido, un compuesto citotóxico, un fármaco, un nidad, un marcador de fotoafinidad, un compuesto re ina, una segunda proteína o polipéptido o a ipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, metales, un cofactor, un ácido graso, un hidrato de inucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido anti árido, un dendrímero soluble en agua, una ciclode do ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nan marcador de espín, un fluoróforo, un resto que cont resto radiactivo, un grupo funcional novedoso, un po fosforescente, un grupo quimioluminiscente, ctrodenso, un grupo magnético, un grupo de interca móforo, un agente de transferencia de energía, lógicamente activo, un marcador detectable, una üeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radio radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, binación de los anteriores, o cualquier otro c tancia deseable) que comprende un segundo grupo re mer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo re r la molécula al aminoácido no natural a trav loadición [3+2] . En una realización, el primer grup un resto alquinilo o azido y el segundo grupo reac to azido o alquinilo. Por ejemplo, el primer grupo resto alquinilo (incluyendo, pero sin limitarse noácido no natural p-propargiloxifenilalanina) y po reactivo es el resto azido. En otro ejemplo, el p ctivo es el resto azido (incluyendo, pero sin limit istencia a la degradación proteolítica) del polipépt umentar la afinidad del polipéptido bG-CSF para su r unos casos, las otras adiciones, sustituciones o dén aumentar la estabilidad farmacéutica del polip . En algunos casos, las otras adiciones, susti eciones pueden potenciar la actividad biológica del CSF. En algunos casos', las otras adiciones, susti eciones pueden aumentar la solubilidad (incluyendo, itarse a, cuando se expresa en E. coli u otras célul polipéptido bG-CSF. En algunas realizaciones, las tituciones o deleciones pueden aumentar la solub ipéptido bG-CSF tras la expresión en E. coli u otr sped recombinantes . En algunas realizaciones, se ios para la sustitución con un aminoácido codificado ural o no natural además de otro sitio para la incor aminoácido no natural que da como resultado el aum ubilidad del polipéptido tras la expresión en E. co titución o deleción que aumenta la afinidad de la v CSF para su receptor. De manera similar, los polipé pueden comprender, secuencias de escisión quími imas, secuencias de escisión por proteasa, grupos inios de unión a anticuerpo (incluyendo, pero sin li G o poli-His) u otras secuencias basadas en cluyendo, pero sin limitarse a, FLAG, poli-His, GS éculas unidas (incluyendo, pero sin limitarse a, bi oran la detección (incluye do, pero sin limitarse ificación, transporte a través de tejidos o ulares, activación o liberación de profármaco, red año de bG-CSF, u otros rasgos del polipéptido.

En algunas realizaciones, la sustitución de un ami ificado de manera natural genera un antagonista de unas realizaciones, se sustituye o añade un ami ificado de manera natural en una región implicada en eptor. En algunas realizaciones, los antagonistas noácido no codificado de manera natural unido a u uble en agua que está presente en una región d eptor de la molécula de bG-CSF.

En algunos casos, se sustituye 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7 más aminoácidos por uno o más aminoácidos no codi era natural. En algunos casos, el polipéptido bG-C más 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustit noácidos que se producen de manera natural por noácidos no. codificados de manera natural. Por e unas realizaciones, se sustituye uno o más residuos uno o más aminoácidos no codificados de manera n unos casos, el uno o más residuos no codificados ural están unidos a uno o más PEG lineales o rami or peso molecular, potenciando así la afinidad de ivida en suero comparable con respecto a las especie único 'PEG de mayor peso molecular.

En algunas realizaciones, se sustituyen hasta d a un ácido nucleico que codifica para una proteína, ón a ribosoma para el inicio de la traducción. Los e técnica conocen promotores bacterianos adecua criben, por ejemplo, en Sambrook et al y Ausubel et a Sistemas de expresión bacteriana para expresar p CSF de la invención están disponibles en, incluyendo itarse a, E. coli, Bacillus sp.r Pseudomonas f udomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, y Salmonella Gen 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 83)). Hay kits para tales sistemas de expresión com ponibles. Los expertos en la técnica conocen s resión eucariota para células de mamífero, levadura insecto y también están comercialmente disponibles . que se usan ARNt y aminoacil-ARNt sintetasas scritos anteriormente) para expresar los polipéptidos invención, se seleccionan células huésped para la ándose en su capacidad para usar los componentes o Una célula huésped eucariota o célula huésped no e presente invención proporciona la capacidad para teínas que comprenden aminoácidos no naturales tidades útiles. En un aspecto, la composició ionalmente, incluyendo, pero sin limitarse a, al rogramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 micro os 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al rogramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 mil os 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos de la proteína que comprende un aminoácido no natu tidad que puede lograrse con métodos de producción d vivo (en el presente documento se proporcionan deta producción y purificación de proteínas recombinantes ecto, la proteína está opcionalmente presente en la una concentración de, incluyendo, pero sin limita os 10 microgramos de proteína por litro, al rogramos de proteína por litro, al menos 75 micr cualquiera desde aproximadamente 1 ni hasta aproxima o más) . La producción de grandes cantidades (incluy limitarse a, mayor de lo que es normalmente posible odos, incluyendo, pero sin limitarse a, traducción i proteina en una célula eucariota incluyendo al noácido no natural es una característica de la invenc Una célula huésped eucariota o célula huésped no e presente invención proporciona la capacidad para bi teínas que comprenden aminoácidos no naturales tidades útiles. Por ejemplo, pueden producirse pro prenden un aminoácido no natural en una concent luyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 µg/litro µg/litro, al menos 75 µg/litro, al menos 100 g/litr µg litro, al menos 250 µg/litro, o al menos 500 µg os 1 mg/litro, al . menos 2 mg/litro, al menos 3 mg os 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Tale luyen pCDNA3.1 (+) \Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Calif., -neo (Stratagene, La Jolla, Calif., EE.UU.). Pu smidos bacterianos, tales como plásmidos de E. coli, 322, pET3a y pET12a, plásmidos de gama de huéspedes es como RP4, ADN de fago, por ejemplo, los numerosos fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de o M 13 y fagos de ADN monocatenario filamentoso. El erivados del mismo, el vector POT1 (patente estadou 31.373 que se incorpora como referencia), el vec crito en (Okkels, Ann. New York Acad. Sci . 782, 202 PICZ A, B o C (Invitrogen) pueden usarse con células adura. Para células de insecto, los vectores incluy limitan a, pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolati ine and Human Genes for Mullerian Inhibíting Sub ression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, (1986), pBluebac 4.5 y pMelbac (Invitrogen, Carlsbad, iña) . Otros péptidos . señal incluyen pero no se lim tido señal de factor a de S. cerevisiae (patente est 4.870.008 que se incorpora como referencia 1 a umento) , el péptido señal de amilasa salival de . enbuchle et al., Nature 289, 1981, págs. 643-646), al de carboxipeptidasa modificado (L. A. Vails et al. 7, págs. 887-897), el péptido señal BARI de levadura 87/02670, que se incorpora como referencia a umento) , y el péptido señal de proteasa aspártica 3 P3) (véase . Egel-Mitani et al,, . Yeast 6, 1990, ).

Ejemplos de células de mamífero adecuadas los c ertos en la técnica. Tales células huésped puede ser rio de hámster chino (CHO) , (por ejemplo CHO-K1; AT ulas de mono verde (COS) (por ejemplo COS 1 (ATCC 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratón (por ejem eas celulares de riñón de hámster recién nacido * describe en la patente estadounidense n.s 5.047.33 orpora como referencia al presente documento.

Los métodos para la introducción de ADN exógeno sped de mamífero incluyen pero no se limitan a, t iada por fosfato de calcio, electroporación, t iada por DEAE-dextrano, transíección mediada por tores virales y los métodos de transfección descrito nnologies Ltd, Paisley, R.U. usando Lipofectamin 20 gnostics Corporation, Indianápolis , EE.UU. usando os métodos se conocen bien en la técnica y se des bel et al. (eds) . , 1996, Current Protocols in logy, John Wiley & Sons, Nueva York, EE.UU. El ulas de mamífero puede realizarse según métodos es ejemplo según se da a conocer en {Animal Cell Bio hods and Protocols, editado por Nigel Jenkins, 1 ss Inc. Totowa, N.J., EE.UU. y Harrison Mass, y Rae hniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1 adura Tal como se utiliza en el presente documento, vadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras resar un gen que codifica para un polipéptido bG-aduras incluyen, pero no se limitan a, osporogenous (Endomycetales) , levaduras Basidiospo aduras pertenecientes al grupo Fungi astomycetes) . Las levaduras ascosporogenous se divi ilias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Esta pone de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoi mplo, género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Li accharomycoideae (por e emplo, géneros Pichia, Kluy charomyces) . Las levaduras Basidiosporogenous in eros Leucosporidium, Rhodosporidium, Spo obasidium, y Filobasidiella . Las levaduras pertene po Fungí imperfecti {Blastomycetes) se dividen en do formis, K. lactis, K. fragius, C. albicans, C. a imorpha .

La selección de levaduras adecuadas para la ex ipéptidos bG-CSF está dentro del conocimiento de un técnica. En la selección de huéspedes de levadur resión, los huéspedes adecuados pueden incluir lo trado que tienen, por ejemplo, buena capacidad de a actividad proteolítica, buena capacidad de secrec ducción de proteínas solubles y robustez global. La án disponibles generalmente a partir de una variedad luyendo, pero sin limitarse a, el Centro de Reserva adúras, Departamento de Biofísica y Física Médica, California (Berkeley, CA) , y la Colección Americana o ("ATCC") (Manassas, VA).

La expresión "huésped de levadura" o "célula adura" incluye levaduras que pueden usarse, o se o receptor para vectores recombinantes u otr acterizarse mediante la propiedad relevante, tal sencia de una secuencia de nucleótidos que codific ipéptido bG-CSF, están incluidos en la progenie iante está definición.

Se han desarrollado vectores de expresión y tran luyendo replicones extracromosómicos o vectores de i a su transformación en muchos huéspedes de lev mplo, se han desarrollado vectores de expresión evisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; I BACTERIOL . (1983) 153 : 163; Hinnen et al., PROC. . USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., L. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC 85) 25: 141); H. polimorpha (Gleeson et al., J. GEN. 86) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL, GENETICS AN 86) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERI :1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTER :737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 244 234) ,- y hongos filamentosos tales como, po rospora, Peniciltium, Tolypocladiu (documento WO a uno incorporado como referencia al presente documen Los expertos en la técnica conocen secuencias co tores de levadura e incluyen, pero no se limitan motoras de genes tales como alcohol deshidroge cumento EP 0 284 044) ; enolasa; glucocinasa glucos merasa gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP ocinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfoglicerato mutasa; asa (PyK) (documento EP 0 329 203). El gen PH05 d codifica para fosfatasa ácida, también puede p uencias promotoras útiles (Miyanohara et al., PROC. . USA (1983) 80:1) . Otras secuencias promotoras ade uso con huéspedes de levadura pueden incluir los a 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. B 80) 255: 12073); y otras enzimas glicolíticas , uvato descarboxilasa, triosa fosfato isomerasa, y f galactosa . Se describen adicionalmente vectores y cuados para su uso en la expresión en levaduras en e 0 073 657.

También pueden usarse potenciadores de lev motores de levadura. Además, los promotores sintéti dén funcionar como promotores de levadura. Por ej uencias de activación en sentido 5' (UAS) de un p adura puede unirse con la región de activaci nscripción de otro promotor de levadura, creando u rido sintético. Los ejemplos de tales promotore luyen la secuencia reguladora de ADH unida a la ivación de la transcripción de GAP. Véanse la adounidenses n.os 4.880.734 y 4.876.197, que se inco erencia al presente documento. Otros ejemplos de ridos incluyen promotores que consisten en las uiadoras de los genes ADH2 , GAL4, GALIO o PH05, com región de activación de la transcripción de un gen M. (1981) 256:1385). Además, el origen de repli gen del plásmido 2µ es adecuado para levadura. ección adecuado para su uso en levaduras es. el sente en el plásmido de levadura. Véase Tschumper e 80) 10:157; ingsman et al., GEN (1979) 7:141. El porciona un marcador de selección para una cepa adura que carece de la capacidad para crecer en tri era similar, las cepas de levadura deficientes en 622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos con van el gen Leu2.

Los expertos en la técnica conocen métodos de intr exógeno en huéspedes de levadura, y normalmente inc se limitan a, o bien la transformación de esferoplas células huésped de levadura intactas tratadas co alinos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la transf adura según el método descrito en Hsiao et al., P D. SCI . USA (1979) 76:3829 y Van Solingen et al., Los expertos en la técnica conocen otros mé resar proteínas heterólogas en células huésped de nse generalmente la publicación de patente estadoun 20055169, las patentes estadounidenses n.os 12.923; 6.183.985; 6.083.723; 6.017.731; 5.674.706; 02.034; y 5.089.398; las patentes estadounidenses r s RE37.343 y RE35,749; las solicitudes de patente PCT 99/07862; WO 98/37208; y WO 98/26080; las soli ente europea EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 4 10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; . Véanse también Gellissen et al., ANTONIE VAN 92) 62 (1-2) :79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8 { ddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, orporado como referencia al presente documento.

Las cepas huésped de levadura pueden hacerse rientadores durante la fase de amplificación usando rientación semicontinuos convencionales conocidos de requerir alimentaciones de glicerol, m goelementos, pero sólo sales de amonio sencillas a una expresión y un crecimiento óptimos. Véanse, po patente estadounidense n.e 5.324.639; Elliott e TEIN CHEM. (1990) 9:95; y Fieschko et al., BIOTEC 87) 29:1113, incorporados como referencia -al umento .

Tales métodos de fermentación, sin embargo, pu rtas características comunes independientes de la ce levadura empleada. Por ejemplo, un nutriente lim cimiento, normalmente carbono, puede añadirse al ante la fase de amplificación para permitir un imo . Además , los métodos de fermentación emplean g medio de fermentación- diseñado para contener cuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósfo rientes minoritarios {vitaminas, oligoelementos y sa describen ejemplos de medios de fermentación adecuad nsferencia. La expresión incluye la progenie de sped de insecto original que se ha transfectado . S la progenie de una única célula parental pue esariamente idéntica por completo en morfología ómico o total complementario al progenitor original mutación accidental o deliberada. La progenie de ental que son suficientemente similares a la célul va a caracterizarse mediante la propiedad relevant presencia de un secuencia de nucleótidos que codifi ipéptido bG-CSF, están incluidos en la progenie iante esta definición.

La selección de células de insecto adecuada resión de polipéptidos bG-CSF la conocen los expe nica. Se describen bien varias especies de inse nica y están disponibles comercialmente incluy ypti, Bombyx morí, Drosophila melanogaster, giperda y Trichoplusia ni. Al seleccionar huéspedes Generalmente, los componentes de un sistema de ex ecto infectado por baculovirus incluyen un nsferencia, habitualmente un plásmido bacteriano, qu to un fragmento del genoma del baculovirus, como u tricción conveniente para la inserción del gen hete a expresarse; un baculovirus de tipo natural con ólogas al fragmento específico de baculovirus en el nsferencia (esto permite la recombinación homolog erólogo en el genoma del baculovirus) ; y células ecto y medios de crecimiento apropiados . Los odos y técnicas usados en la construcción de los ve nsfección de las células, la recogida de las cimiento de células en cultivo, y similares se con nica y están disponibles manuales que describen estas Tras insertar el gen heterólogo en el nsferencia, el vector y el genoma viral de tipo nsfectan en una célula huésped de insecto en 87), incorporado al presente documento como referen bién, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: RESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT P ECULAR BIOLOGY 16,9-16,11 (1994); KING AND PO ULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992) ; y O'REIL ULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (199 De hecho, la producción de diversas proteínas ndo sistemas de expresión en baculovirus/célula de ocen los expertos habituales en la técnica. V mplo, las patentes estadounidenses n.os 6.368.825; 38.846; 6.261.805; 6.245.528; 6.225.060; 6.183.987; 26.944; 6.096.304; 6.013.433; 5.965.393; 5.939.285; 71.986; 5.861.279; 5.858.368; 5.843.733; 5.762.939; 05.827; 5.583.023; 5.571.709; 5.516.657; 5.290.686; 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO ographa californica (VPNAc) , que es un vector de al, independiente, auxiliar. Los vectores de expré ivados de este sistema usan normalmente el promotor ihedrina viral fuerte para impulsar la expresión erólogos . Véase en general, O'Reilly ET AL., RESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).

Antes de insertar el gen foráneo en el g ulovirus, los componentes descritos anteriorm prenden un promotor, secuencia líder (si se desea) , ificante de interés, y secuencia de terminaci nscripción, se ensamblan normalmente en un con nsposición intermedio (vector de transíerenc structos de transposición intermedios se mantienen a replicón, como un elemento cromosómico extra (po smidos) que puede proporcionar el mantenimiento est sped, tal como bacterias. El replicón tendrá un licación, que le permite por tanto mantenerse en luyendo, por ejemplo, pVL985, que altera . el codón de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un nación BamHI 32 pares de bases en el sentido de 3' . Véase Luckow y Summers, VIROLOGY 170:31 {198 tores disponibles comercialmente incluyen, por ueBac4.5/VS-His; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 p. , Carlsbad, CA) .

Tras la inserción del gen heterólogo, el nsferencia y el genoma de baculovirus de tipo nsfectan conjuntamente en un huésped de células de i ocen en la técnica métodos para introducir ADN heteró io deseado en el virus baculovirus . Véase SUMMERS AS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 15 th et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow OLOGY (1989) 170:31. Por ejemplo, la inserción puede tal como el gen de la polihedrina, mediante recomb recruzamiento doble homologa; la inserción también pu mplo, Liebman et al . , BIOTECHNIQUES (1999) 26(1) :36; , BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al . , J. B 98) 273 (22) : 13570; Schmidt et . al . , PROTEIN EXPR IFICATION (1998) 12:323; Siffert et al . , NATURE GENE 45; TILKINS ET AL. , CELL BIOLOGY: Á LABORATORY HANDB 98) ; Caí et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICAT 263; Dolphin et al . , NATURE GENETICS (1997) 17:49 , GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al . , J. BIOL. C :22203; Rowles et al . , J. BIOL. CHEM. (1996) 271 erey et al., J. BIOL. CHE . (1996) 271 ( 39) : 23607-10 ; J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al. , J. VI (2) :766; y Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2 osomas disponibles comercialmente incluyen, por lfectin® y Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carl más, puede usarse la transfección con fosfato de ca TTER Y WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; 90) 18(19) :5667; y Mann y King, J. GEN. VIROL. (1989) ión de iniciación de la transcripción incluye norm io de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicia nscripción. Un promotor de baculovirus puede tener undo dominio denominado potenciador que, si está pr itualmente distal respecto al gen estructural. resión puede ser o bien regulada o bien constitutiva.

Los genes estructurales, transcritos de manera ab ientos tardíos en el ciclo de infección, proporcionan motoras particularmente útiles. Los ejemplos uencias derivadas del gen que codifica para l ihedrina viral (FRIESEN E AL. , The Regulation of e Expression en THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUS umentos EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codif teína ??? (Vlak et l., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765).

El vector de expresión de baculovirus recién aqueta en un baculovirus recombinante infe teriormente pueden purificarse las placas que crece doptera frugiperda y Trichoplusia ni . Véanse rig 86) 321:718; Carbonell et al, J. VIROL. (1985) 56:153 , MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Véase de maner ser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 2 ecíficamente, las líneas celulares usadas para s tor de expresión de baculovirus incluyen comúnmente/ itán a, Sf9 {Spodoptera frugiperda) (n.s de la ATCC 1 {Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., n.e de (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 {Trichopulsia ni) y High-5B1-4 {Trichopulsia ni) .

Están disponibles comercialmente células y medios a la expresión tanto directa como por fusión de p erólogos en un baculovirus/expresión, y los expertos la técnica conocen generalmente la tecnología ular.

Los expertos habituales en la técnica conocen ecies de Pseudomonas y otras técnicas de expresión sabe bien, los vectores normalmente implican marc miten la selección, marcadores que pueden p istencia a agentes citotóxicos, prototrof a o cuentemente, está presente una pluralidad de marca porcionan diferentes características.

Un promotor bacteriano es cualquier secuencia d da unirse a ARN polimerasa bacteriana e i nscripción en el sentido de 3 ' de una secuencia r ejemplo, gen estructural) para dar AR m. Un promo región de iniciación de la transcripción que es itualmente de manera proximal al extremo ' de la ificante. Esta región de iniciación de la transcripc malmente un sitio de unión a ARN polimerasa y u ciación de la transcripción. Un promotor bacteria de tener un segundo dominio denominado operador, aparse con un sitio de unión a ARN polimerasa ienza la síntesis de ARN. El operador permite una tr ivadora de genes es la proteína activadora de P) , que ayuda a iniciar la transcripción del oper herichia coli (E. coli) [Raibaud et al., A NU. R 84) 18:173]. Por tanto, la expresión regulada puede itiva o bien negativa/ o bien potenciando o bien re modo la transcripción.

Las secuencias que codifican para enzimas abólicas proporcionan secuencias promotoras ' part les. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras de imas que metabolizan azúcares, tales como galactos c) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], y ma mplos adicionales incluyen secuencias promotoras de imas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goed . ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NucL. 81) 9:731; la patente estadounidense n.2 4.738 licaciones EP n.os G36 776 y 121 775, que se incor erencia al presente documento] . El sistema promo eles . Los expertos habituales en la técnica conocen es vectores e incluyen la serie pET29 de Novag tores pPOP descritos en el documento WO99/05297 orpora como referencia al presente documento. Tales resión pueden producir altos niveles de polipéptidos huésped sin comprometer la viabilidad de la célula parámetros de ¦ crecimiento. pETl9 (Novagen) es o ocido en la técnica.

Además, promotores sintéticos que no se produ uraleza también funcionan como promotores bacter mplo, pueden unirse secuencias de activació nscripcion de un promotor bacteriano o de bacteriófa uencias de operón de otro promotor bacteria teriófago, creando un promotor híbrido sintétic adounidense n.s 4.551.433, que se incorpora como re sente documento] . Por ejemplo, el promotor tac es -lac híbrido compuesto tanto por el promotor trp resión de algunos genes en procariotas. El s motor/AR polimerasa de bacteriófago T7 es un eje tema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BI : 113; Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) más, un promotor híbrido también puede estar compue motor de bacteriófago y una región de operador blicación EP n.a 267 851).

Además de una secuencia promotora que funciona, u on a ribosomas eficaz es también útil para la ex es foráneos en procariotas. En E. coli, el sitio osomas se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD) e ón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucl gitud ubicada 3-11 nucleotidos en el sentido de 5' d ciación [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Se c uencia SD estimula la unión de ARNm al ribosoma r reamiento de bases entre la secuencia SD y el extr r 16S de E. coli [Steitz et al. "Genetic signáis and do, como receptor para vectores recombinantes u · o nsferencia. La expresión incluye la progenie de sped bacteriana original que se ha transfectado . S la progenie de una única célula parental pue esariamente idéntica por completo en morfología o en enómico complementario al del progenitor original, d ación accidental o deliberada. La progenie de ental que es suficientemente similar al progenitor acterizarse mediante la propiedad relevante, tal sencia de una secuencia de nucleótidos que codifi ipéptido bG-CSF, se incluye en la progenie pretendi a definición.

Los expertos habituales en la técnica conocen la s terias huésped adecuadas para la expresión de polip . En la selección de huéspedes bacterianos para la huéspedes adecuados pueden incluir los que han mo nen, entre otros, buena capacidad de formación de cepas B (por ejemplo BL21) . Estas cepas son part les porque sus parámetros de crecimiento son ext n conocidos y robustos. Además, estas cepas no son que es comercialmente importante por motivos de s ioambientales . Otros ejemplos de huéspedes de E. col luyen, pero no se limitan a, cepas de BL21, DH10B o las mismas. En otra realización de los métodos de l ención, el , huésped de E. coli es una cepa def teasas incluyendo, pero sin limitarse a, OMP- y LON célula huésped puede ser una especie de Pseudomonas, o sin limitarse a, Pseudomonas fluorescens, uginosa y Pseudomonas putida. Se sabe que orescens biovar 1, designada como cepa MBIOI, es út ducción recombinante y está disponible para pr ducción de proteínas terapéuticas. Los ejemplos de expresión de Pseudomonas incluyen los sistemas disp Dow Chemical Company como cepa huésped (Midland, MI ula huésped recombinante dependerá de la hatur structo de expresión utilizado y la identidad de sped. Normalmente, se cultivan cepas huésped re ndo métodos que conocen los expertos habituales en 1 nalmente, se cultivan células huésped recombinantes uido que contiene fuentes asimilables de carbono, n es inorgánicas, y, opcionalmente, que contiene noácidos, factores de crecimiento y otros compl tivo proteicos conocidos por los expertos , habitua nica. Los medios líquidos para el cultivo de célul dén contener opcionalmente . antibióticos o antifún edir el crecimiento de microorganismos no dés puestos que incluyen, pero no se limitan a, antibió eccionar células huésped que contienen el vector de e Pueden cultivarse células huésped recombinantes e tinuos o discontinuos, con o bien recogida de célu o en el que el polipéptido bG-CSF se acumula intrace nica. La patente estadounidense n. s 5.849.883 y el d 10932, que se incorporan como referencia al present su totalidad, describen la clonación de b-GCSF y a mo en células huésped y métodos de aislamiento y pu polipéptidos bG-CSF producidos en células huésped dén ser escasamente solubles o insolubles (en forma inclusión) . En una realización de la presente invenc erse fácilmente sustituciones de aminoácidos en el CSF que se seleccionan con el fin de aumentar la sol proteína producida de manera recombinante util odos' dados a conocer en el presente documento as ocidos en la técnica. En el caso de una proteína in teína puede recogerse de lisados de células huéspe trifugación y a esto le puede seguir además la homo las células. En el caso de una proteína escasament dén añadirse compuestos que incluyen, pero no se ietilenimina (PEI) para inducir la precipitación de icacióri, homogeneización Dounce o ruptura con liberac sión. En una realización del método de la presente usa la técnica de liberación a alta presión para ulas huésped de E. coli para liberar los cuerpos d los polipéptidos bG-CSF. Cuando se manipulan lusión de polipeptido bG-CSF, puede ser ventajoso m mpo de homogeneización en repeticiones con el fin d rendimiento de cuerpos de inclusión sin pérdida tores tales como solubilización, cizallamiento rr teólisis .

Entonces, el polipéptido bG-CSF insoluble o precip ubilizarse usando cualquiera de varios ag ubilización adecuados conocidos en la técnica. El CSF puede solubilizarse con urea o clorhidrato de gu umen del polipéptido bG-CSF solubilizado debe mini o que puedan producirse lotes grandes usando tamañ venientemente manejables. Este factor puede ser si nte desnaturalizante más suave, urea, para solub rpos de inclusión de polipéptido bG-CSF en lugar naturalizante más agresivo clorhidrato de guanidina. a reduce significativamente el riesgo de daño al ro inoxidable utilizado en el proceso de fab ificación del polipéptido bG-CSF mientras que cazmente los cuerpos de inclusión del polipéptido bG- En el caso de una proteína bG-CSF soluble, puede CSF en el espacio periplásmico o en el medio d más, puede estar presente bG-CSF soluble en el cit células huésped. Puede desearse concentrar bG-C es de llevar a cabo las etapas de purificación. Pu nicas convencionales conocidas por los expertos hab técnica para concentrar bG-CSF soluble a parti mplo, medio de cultivo o Usados celulares. Adem rse técnicas convencionales conocidas por los ituales en la técnica para romper las células huéspe minación de la secuencia de fusión estará determin ntidad de la fusión, y las condiciones de reacci ecificadas por la elección de la enzima tal como dente para un experto habitual en la técnica. L mica puede lograrse usando reactivos conocidos por l ituales en la técnica, incluyendo pero sin limitarse cianógeno, proteasa TEV y otros reactivos. El polip escindido puede purificarse de la secuencia indida mediante métodos conocidos por los expertos la técnica- Tales métodos se determinarán mediante l as propiedades de la secuencia de fusión y el polip , tal como resultará evidente para un experto habi nica. Los métodos para la purificación pueden inclui limitan a, cromatografía de exclusión molecular, er interacción hidrófoba, cromatografía de intercambi lisis o cualquier combinación de las mismas.

El polipéptido bG-CSF también puede purificarse pa minación de las moléculas de ácido nucleico del hué tor importante en un entorno en el que el polipéptid sarse para tratar animales o seres humanos y los mét sente invención reducen el ADN de la célula hué eles farmacéuticamente aceptables .

Pueden usarse también métodos para la fermentación ala o a gran escala en la expresión, de proteínas, o sin limitarse a, fermentadores , matraces rreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fi temas de cultivo de frascos rotativos y sistemas de tanque agitado. Cada uno de estos métodos puede re proceso en modo discontinuo, semicontinuo o continuo.

Los polipéptidos bG-CSF de la invención pueden eralmente usando métodos convencionales en la té mplo, el medio de cultivo o lisado celular puede ce filtrarse para eliminar desechos celulares . El s de concentrarse o diluirse hasta un volumen deseado ónico o catiónico (usando, incluyendo pero sin li E SEPHAROSE) ; cromatografía, sobre sílice; cromat uidos de alta resolución (HPLC) ; HPLC de fas tración en gel (usando, incluyendo pero sin li HADEX G-75); cromatografía de interacción matografía de exclusión molecular; cromatografía d álicos; ultrafiltración/diafiltracion; precipita nol; precipitación con sulfato de amonio; crom matografía de desplazamiento; procedimientos elect cluyendo pero sin limitarse a isoelectroenfoque pr ubilidad diferencial (incluyendo pero sin li cipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE o extracc Las proteínas de la presente invención, incluyend itarse a, proteínas que comprenden aminoácidos no tidos que comprenden aminoácidos no naturales, nte a proteínas que comprenden aminoácidos no ejas de unión para proteínas que comprenden amin matografía en columna de afinidad, cromatografía de ónico o catiónico, cromatografía en fos matografía de interacción hidrófoba, cromato roxilapatita, cromatografía con lectinas, electrofore imilares. Pueden usarse etapas de replegamiento de ún se desee, en la preparación de proteína rectamente plegadas . Puede emplearse cromatografía alta resolución (HPLC) , cromatografía de afinida odos adecuados en etapas de purificación finales en ea alta pureza. En una realización, se usan parados contra aminoácidos no naturales {o proteínas comprenden aminoácidos no naturales) como re ificación, incluyendo pero sin limitarse a, ificación basada en afinidad de proteínas o pé prenden uno o más aminoácido (s) no natural (es), ificados, parcialmente o hasta homogeneidad, según polipéptidos se usan opcionalmente para una amplia icuerpos usando una variedad de técnicas conocida dén usarse ratones transgénicos , u otros organismos, os mamíferos, para expresar anticuerpos humaniz icuerpos descritos anteriormente pueden emplearse pa a identificar clones que expresan el polipépti ificar los polipéptidos . También pueden emplearse tra polipéptidos de la presente invención pa ermedades .

Pueden usarse también polipéptidos y polinucleót sente invención como vacunas. Por consiguiente, en cional, la presente invención se refiere a un m ucir una respuesta inmunológica en un mamífero que cular al mamífero un polipéptido de la presente cuado para producir una respuesta inmunitaria de células T, incluyendo, por ejemplo, células T ci ulas T productoras de citocinas, para proteger a d nte a la enfermedad, esté ya establecida esa enferm eadas como recubrimiento sobre partículas o de otra tor de ácido nucleico de este tipo puede comprender ácido nucleico modificado, o un híbrido de ADN/ARN. o vacuna, se proporcionará normalmente un polipép tor de ácido nucleico como formulación de vacuna (co formulación puede comprender además un vehículo sto que un polipéptido puede descomponerse en el de administrarse por vía parenteral (por ejemplo, cutánea, intramuscular, intravenosa o intradérm mulaciones adecuadas para la administración parenter oluciones para inyección estériles acuosas y no a dén contener antióxidantes , tampones, bacterios utos que hacen que la formulación sea isotónica con receptor; y suspensiones estériles acuosas y no a dén incluir agentes de suspensión o agentes espe mulación de vacuna puede incluir también sistemas a potenciar la inmunogenicidad de la formulación q . 182: Guide to Protein Purification, Academic Pres (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins ss, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein. Methods, ey-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocol ana Press, , NJ, Harris y Angal, (1990) Protein P lications: A Practica! Approac IRL Press at Oxfor laterra; Harris y Angal, Protein Purification ctical Approach IRL Press at . Oxford, Oxford, pes, (1993) Protein Purification: Principies and P ción Springer Verlag, NY; Janson y Ryden, (199 ification: Principies, High Resolution Met lications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; . y Walk tein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las adas en los mismos.

Una ventaja de la producción de una proteína o un interés con un aminoácido no natural en una célu ariota o célula huésped no eucariota es que norma ocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse adición de una chaperonina a la proteina o el ???? erés, mediante la solubilizacion de las proteínas en trópico tal como guanidina HC1, la utilización d ulfuro isomerasa, etc.

En general, en ocasiones es deseable desnaturaliza polipéptidos expresados y entonces provocar ipéptidos vuelvan a plegarse en la conformación pref mplo, puede añadirse guanidina, urea, DTT, DTE peronina a un producto de traducción de interés . Lo la técnica conocen métodos de reducción, desnatura aturalización de proteínas (véanse las referencias a inski, et al. (1993) J. Biol. Chem. , 268: 14065-1407 astan (1993) Bioconjug. Chem.. 4: 581-585; y. Buchne 92) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et mplo, describen la desnaturalización y reducción de cuerpos de inclusión en guanidina-DTE . Las proteí ucida. La bioactividad de la proteína puede iante "replegamiento" . En general, el polipépti gado de manera errónea vuelve a plegarse ubilización (cuando el polipéptido bG-CSF e oluble) , despliegue y reducción de la cadena de ndo, por ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (p a y/o guanidina) y un agente reductor que puede redu ulfuro (por ejemplo ditiotreitol , DTT o 2-mercapto . A una concentración moderada de agente caotrópico onces un agente oxidante (por ejemplo, oxígeno,-tamina) , que permite que vuelvan a formarse l ulfuro. El polipéptido bG-CSF puede volverse a ple odos convencionales conocidos en la técnica, tales critos en las patentes estadounidenses n.os 4.511.502, 4.512.922, que se incorporan como referencia a umento. El polipéptido bG-CSF también puede juntamente con otras proteínas para formar heter binación de los mismos. La purificación adicional ta luir una etapa de secado o precipitación de l ificada .

Tras la purificación, bG-CSF puede intercam erentes tampones ylo concentrarse mediante cualqui iedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo itarse a, diafiltración y diálisis. bG-CSF que se o una única proteína purificada puede verse s egación y precipitación.

El bG-CSF purificado puede ser puro en al menos e o se mide mediante cromatografía de líquidos de alta fase inversa, RP-HPLC, o electroforesis en ecilsulfato de sodio-poliacrilamida, SDS-PAGE) o p os el 95%, o puro en al menos el 98%, o puro en al m ás . Independientemente del valor numérico exacto de bG-CSF, el bG-CSF es suficientemente puro para s ducto farmacéutico o para procesamiento adicional, Puede realizarse una cualquiera de una variedad de lamiento en el lisado celular, extracto, medio d rpos de inclusión, espacio periplásmico de las célul oplasma de las células huésped, u otro material, qu ipéptido bG-CSF o en cualquier mezcla de polipéptido ulte de cualquier etapa de aislamiento incluyendo, itarse a, cromatografía de afinidad, cromato ercambio iónico, cromatografía de interacción matografía de filtración en gel, cromatografía de 1 a resolución ("HPLC"), HPLC de fase inversa orción en lecho expandido, o cualquier combin etición de las mismas y en cualquier orden apropiado.

El equipo y otros materiales necesarios usad lización de las técnicas descritas en el presente án disponibles comercialmente . Están disponible ectores de fracciones, monitores, registradores pletos de, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster ipo especializado tal como una bomba. Las bombas ercialmente incluyen, pero no se limitan a, la bomba la bomba peristáltica P-I, la bomba P-901 y la b ersham Biosciences, Piscataway, NJ) .

Los ejemplos de colectores de fracciones inclüyen fracciones RediFrac, los colectores de fracciones C-200 y el colector de fracciones SUPERFRAC® sciences, Piscataway, NJ) . También están eladoras para formar gradientes de concentración lin Las mezcladoras disponibles comerciales incluyen la dient GM-I y mezcladoras In-Line (Amersham B cataway, NJ) .

El proceso cromatográfico puede monitorizar lcjuier monitor disponible comercialmente . Tales dén usarse para reunir información como UV, pH y con ejemplos de detectores incluyen el monitor UV-I, - - ultante en urea, seguido por dilución con tampón tiene un agente reductor (tal como DTT) a un pH ad a realización, el polipéptido bG-CSF se desnaturali un intervalo de concentración de entre aproximadam oximadamente 9 M, seguido por dilución con tampón TR el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamen cla de replegamiento de esta realización puede onces. En una realización, la mezcla de replegamient emperatura ambiente durante de cuatro a veinticuatro cla de polipéptido bG-CSF reducido y desnaturali onces aislarse o purificarse adicionalmente.

Tal como se establece en el presente documento, e mera mezcla de polipéptido bG-CSF puede ajustarse lizar cualquier etapa de aislamiento posterior. mera mezcla de polipéptido bG-CSF o cualquier mezcl mismo puede concentrarse usando técnicas conoci nica. Además, el tampón de elución que comprende cla de polipéptido bG-CSF. Véase en general IO OMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (n.e de cat . rsham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . Las co ercambio iónico disponibles comercialmente inc umnas HITRAP®, HIPREP® y HILOAD® (Amersham. B cataway, NJ) . Tales columnas utilizan inter ónicos fuertes tales como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q h Performance y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores rtes tales como SP SEPHAROSE® High Performance, SP t Flow y SP SEPHAROSE® XL; intercambiadores aniónic es como DEAE SEPHAROSE Fast Flow; e intercambiadores iles tales como CM SEPHAROSE® Fast Flow {Amersham B cataway, NJ) . La cromatografía en columna de ónico o catiónico puede realizarse con el polipéptid lquier fase del proceso de purificación para aislar CSF sustancialmente purificado. La etapa de crómat iestireno, sílice, poliéter o materiales comp lquiera de los anteriores.

La matriz de intercambio catiónico puede ser ercambiador catiónico adecuado incluyendo inter iónicos fuertes y débiles. Los intercambiadores rtes pueden permanecer ionizados a lo largo de ervalo de pH y, por tanto, pueden ser capaces de un a lo largo de un amplio intervalo de pH. Sin em erca biadores catiónicos débiles pueden perder la o una función del pH. Por ejemplo, un intercambiado il puede perder la carga cuando el pH disminuye por oximadamente pH 4 o pH 5. Los intercambiadores rtes adecuados incluyen, pero no se limitan cionales cargados tales como sulfopropilo (SP) , met o sulfoetilo (SE) . La matriz de intercambio catió un intercambiador catiónico fuerte, que tiene pref intervalo de pH de unión a bG-CSF de aproximadam oximadamente 8,0. La matriz de intercambio catiónico intercambiador catiónico fuerte que tiene preferib ervalo de pH de unión a bG-CSF de aproximadame oximadamente 12,5. Alternativamente, el int iónico fuerte puede tener un intervalo de pH de unió aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 12,0.

Antes de cargar el bG-CSF, la matriz de intercambi de equilibrarse, por ejemplo, usando varios vo umna de un ácido débil, diluido, por ejemplo, cuatro columna de ácido acético 20 mM, pH 3. Tras la equ de añadirse el bG-CSF y la columna puede lavarse ias veces, antes de la elución de bG-CSF sust ificado, usando también una disolución de ácido débi disolución de ácido * fosfórico o ácido acético mplo, pueden usarse aproximadamente 2-4 volúmenes de do acético 20 mM, pH 3, para lavar la columna. Pue bién lavados adicionales usando, por ejemplo, 2-4 vo icientemente bajo como para desplazar el bG-CSF de pH del tampón de elución puede oscilar desde aproxim hasta aproximadamente pH 6,0. Más específicamente, ???? de elución puede oscilar desde aproximadamente pH oximadamente pH 5,5, de aproximadamente pH oximadamente pH 5,0. El tampón de elución puede tene oximadamente 3,0. Además , la cantidad del tampón de variar ampliamente y generalmente estará en el in oximadamente 2 a aproximadamente 10 volúmenes de colu ' Tras la adsorción del polipéptido bG-CSF a la ercambiador catiónico, puede eluirse el polipépt tancialmente purificado poniendo en contacto la mat pón que tiene una fuerza iónica o un pH suficiente o para desplazar el polipéptido bG-CSF de la m ipones adecuados para su uso en la elución a p ipéptido bG-CSF sustancialmente purificado pueden in limitarse a, tampones citrato, fosfato, formiato a aislar polipeptido bG-CSF sustancialmente purificad tido, pueden usarse resinas derivatizadas con s cionalidades alquilo con una amplia variedad de luyendo, pero sin limitarse a, resinas de oximadamente C3 a al menos aproximadamente C30, de oximadamente C3 a al menos aproximadamente C2o o d oximadamente C3 a al menos aproximadamente Ci8. Altern de usarse una resina polimérica. Por ejemplo, puede ina TosoHaas Amberchrome CGIOOOsd, que es una imero de estireno. Pueden usarse también resina iméricas con una amplia variedad de longitudes de uilo. Además, la columna de RP-HPLC puede lavar olvente tal como etanol . La columna Source RP es ot una columna de RP-HPLC .

Puede usarse un tampón de elución adecuado que c nte de apareamiento iónico adecuado y un modificado como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acet separación y para disminuir la anchura de los p odo implica el uso de dos gradientes con diferentes concentración de disolventes. Los ejemplos de t ción adecuados para su uso en el presente docume luir, pero no se limitan a, disoluciones de acetato tonitrilo . nicas de purificación mediante cromatografía de rófoba Puede realizarse cromatografía de interacción hidr el polipéptido bG-CSF. Véase en general ERAC ION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND ?? cat. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, orpora como referencia al presente documento. Las m adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a tituidas con alquilo o arilo, tales como matrices butilo, 1 hexilo, octilo o fenilo incluyendo m En resumen, antes ele la carga, la columna de ilibrarse usando tampones convencionales conocido ertos habituales en la técnica, tales como una dis do acético/cloruro de sodio o HEPES que contiene nio. Puede usarse sulfato de amonio como tampón para umna de HIC. Tras cargar el polipéptido bG-CSF, de lavarse entonces usando condiciones y vencionales para eliminar materiales no dese servando el polipéptido bG-CSF en la columna d ipéptido bG-CSF puede eluirse con de aproximada oximadamente 10 volúmenes de columna de un tampón co como un tampón HEPES que contiene EDTA y una conce fato de amonio inferior que el tampón de equilibra pón de ácido acético/cloruro de sodio, entre ot rse también un gradiente salino lineal decreciente mplo, un gradiente de fosfato de potasio, para éculas de bG-CSF. El eluyente puede concentrarse en incorpora como referencia al presente documento, cr hidroxiapatita (las matrices adecuadas incluyen, itán a, HA-Ultrogel, High Resolution (C roxiapatita cerámica CHT (BioRad) , hidroxiapatita Bio oRad) ) , HPLC, adsorción en lecho expandido, ultra filtración, liofilización y similares, en la primera ipéptido bG-CSF o¦ cualquier mezcla posterior del m minar cualquier sal en exceso y para reemplazar el tampón adecuado para la siguiente etapa de ais luso la formulación del producto terminado final .

El rendimiento de polipéptido bG-CSF, incluyendo CSF sustancialmente purificado, puede monitorizars pa descrita en el presente documento usando técnica los expertos habituales en la técnica. Tales, técni rse también para evaluar el rendimiento de polipépt tancialmente purificado tras la última etapa de a ejemplo, el rendimiento de polipéptido bG-menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamen menos aproximadamente el 99,9% o al menos aproxima 99% del bG-CSF en el material de partida para cad ificación.

La pureza puede determinarse usando técnicas conv es como SDS-PAGE, o midiendo el polipéptido bG-ayos de inmunotransferencia de tipo Western y mplo, pueden generarse anticuerpos policlonal rófobas . La elución se realiza con un gradiente de a ácido trifluoracético diluido. Se realiza HPLC ndo una columna de acero inoxidable (rellena de ros de gel de sílice Vydac C4) . El eluato de id rogel se acidifica añadiendo ácido trifluoroacético la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución, díente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético d ogen fracciones y se neutralizan inmediatamente fato. Se agrupan las fracciones de polipéptido bG-CS tro de los límites de IPC.

El material de DEAE Sepharose (Pharmacia) . consiste tilaminoetilo (DEAE) que se unen de forma coval erficie de perlas de Sepharose. La unión del polipép los grupos DEAE está mediada por interacciones i tonitrilo y el ácido trifluoroacético pasan a tra umna sin retenerse. Tras haberse eliminado por la tancias, se eliminan impurezas traza lavando la c pón de equilibración. Entonces se lava la columna con ado (tampón acetato de sodio) seguido por lavado con ilibración. Posteriormente, se eluye el polipéptido columna con tampón de elución (cloruro de sodio, asio/sodio) y se recoge en una única fracción según elución principal . El eluato de la columna de DEAE S sta a la conductividad especificada. El princi ultante se esteriliza por filtración en botellas de t acena a -702C.

Los métodos adicionales que pueden emplearse incl se limitan a, etapas para eliminar endotoxinas. Las lipopolisacáridos (LPS) que se ubican en la membra células huésped Gram-negativas , tales como, po herichia coli. Un experto habitual en la técnica con a reducir los niveles de endotoxinas e incluyen, itán a, técnicas de purificación usando soportes vo de vidrio o cromatografía en hidroxiapatita, un sistema colorimétrico, de un único tubo q tuchos precargados con reactivo LAL, sustrato cro otoxina convencional de control junto con un espect ual. Los métodos alternativos incluyen, pero no se método de LAL cinético que es turbidimétrico y usa 96 pocilios .

Puede usarse una amplia variedad de métodos y pro a evaluar el rendimiento y la pureza de una proteína prende uno o más aminoácidos no codificados de mane luyendo pero sin limitarse a, el ensayo Bradford, -PAGE con tinción con plata, SDS-PAGE con tinción de ectrometría de masas (incluyendo pero sin limitarse ) y otros métodos para caracterizar proteínas conoci erto habitual en la técnica.

Los métodos adicionales incluyen, pero no se limit E acoplada con métodos de tinción ,de unotransferencia, espectrometría de ma ombinantes, células huésped mutageniz das o en siste células. Estos sistemas también son adecuados para su paraci.ón de los polipéptidos bG-CSF de la presente derivatización de aminoácidos con cadenas laterales es como Lys, Cys y Tyr dio como resultado la ina en N2-acetil-lisina . La. síntesis química también método sencillo para incorporar aminoácidos no natu reciente desarrollo de la ligación enzimática y l mica nativa de fragmentos de péptidos, es posibl teínas más grandes. Véase, por ejemplo, P. E. Dawson t, Annu. Rev. Biochem. 69:923 (2000). La ligación tidos y la ligación química nativa se describen en adounidense n.2 6.184.344, la publicación d adounidense n.2 2004/0138412, la publicación d adounidense n.e 2003/020804.6, el documento WO 02/0 umento WO 03/042235, que se incorporan como ref sente documento. Se ha usado un método biosintétic e-specific incorporation of unnatural amino a teins, Science 244:182-188 (1989); y J.D. Bain, CG. , A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic si orporation of a non-natural amino acid into a polyp Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Se ha introducid a de grupos funcionales en proteínas para es abilidad de proteínas, plegamiento de proteínas, . imático y transduccion de señales .

Se desarrolló un método in vivo, denominado incorp sión selectiva, para aprovechar la promiscuida tetasas de tipo natural. Véase, por ejemplo, . . ks, S. Alefeider, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder EB J., 13:41 (1999). Se hace crecer una cepa auxótr la ruta metabólica relevante que suministra a la noácido natural particular está inactivada, en medio tiene concentraciones limitadas del aminoácido ntras que la transcripción del gen diana está in Budisa, Anal. Bio chem., 284:29 (2000); se fluorometionina para reemplazar la metionina en l teriófago T4 para estudiar su interacción con l tooligosacárido mediante 19F-RMN, véase,, por ejemplo, Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36:34 se ha incorporado trifluoroleucina en lugar de leuc o resultado un aumento de la estabilidad térmica y proteína con cremallera de leucina. Véase, por e g, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. De Tirrell, Angew. Chem. Int, Ed. Engl .. 40:1494 (2001 incorporan selenometionina y telurometionina en teínas recombinantes para facilitar la resolución d stalografía de rayos X. véanse, por ejemplo, w. A. H R. Hoiton y D . M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (199 es, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L.

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El éxito de este método depende del reconocimie logos de aminoácidos no naturales por ami tetasas, que, en general, requieren alta selecti antizar la fidelidad de la traducción de proteínas . andir el alcance de este método es relajar la espec trato de las aminoacil-ARNt sintetasas, lo que se ha número limitado de casos. Por ejemplo, la sustituci Gly en fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS) de Esche enta el tamaño del bolsillo de unión a sustratos, ultado la acilación de ARJMtPhe por p-Cl-fenilalan ) . Véase, M. Ibba, P. Kast y H. Herrnecke, Bi :7107 (1994). Una cepa de Escherichia coli que al RS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilal fenilalanina en lugar de fenilalanina . Véanse, por Otra estrategia para incorporar aminoácidos no na teinas in vivo es modificar sintetasas que tienen me rección de lectura. Estas sintetasas no pueden dis tanto activan aminoácidos que son estructuralmente aminoácidos naturales relacionados. Este error se sitio separado, que desacila el aminoácido cargado e ARMt para mantener la fidelidad de la traducción de la actividad correctora de lectura de la si activa, análogos estructurales que están activados ónea pueden escapar de la función de edición e in e enfoque se ha demostrado recientemente con la tetasa (ValRS) . Véase, V. Doring, H. D. Mootz, L. A.

Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. ence, 292:501 (2001). ValRS puede aminoacilar de man AVal con Cys, Thr o aminobutirato (Abu) ; estos amin acionados se hidrolizan posteriormente por el ción. Tras la mutagenesis al azar del cromosoma de stra que aproximadamente el 24% de las valinas se Abu en cada posición de valina en la proteína nativa.

Métodos semisintéticos y de síntesis en fase mitido también la síntesis de varias proteínas que noácidos novedosos. Por ejemplo, véanse las licaciqnes y las referencias citadas en las mismas, uientes : Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watt eral nature of the genetic code for proteins . Na 7-1232 (1961); Hofmann, K. , Bonn, H. Studies on p VI. The effect of pyrazole-imidazole replacements tein activating potency of an S-peptide fragment, J (24) .5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic app logically active peptides and proteins including en m Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, . , Sasaki, T., K tide segment coupling catalyzed by the semisynthe osubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing ' Se ha usado modificación química para introducir u cadenas laterales no naturales, incluyendo cadores de espín y oligonucleótidos en proteínas nse, por ejemplo, Corey, D.R. , Schultz, P.G. Gener rid sequence-specific single-stranded deoxyri ence. 238 (4832 ) : 1401-1403 ( 1987 ) ; Kaiser, E.T., Lawr ita, S.E. The chemical. modification of enzymatic s u Rev Biochem, 54:565-595 (1985) ; Kaiser, E. Tlf Lawr mical mutation of enzyme active sites, Science, 226 ( (1984) ; Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Pro ol-subtilisin, J Biol . Chem, 243 (24) : 6392-6401 (1968 et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetica ive site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 8 66) ; y Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P. G. I nucleophiles and spectroscopic probes into antibody es, Science. 242 (4881 ) : 1038-1040 (1988) .

Alternativamente, se han usado métodos biosint ognition particle, Proc . Natl. Acad. Sci, 83(22): 86) .

Previamente, se ha mostrado que pueden i noácidos no naturales de manera específica del teínas ín vitro mediante la adición de ARNt nocilados químicamente a reacciones de síntesis de gramadas con un gen que contiene una mutación sin se eada. Usando estos enfoques/ pueden sustituirse var nte aminoácidos comunes por homólogos estructurales ejemplo, fluorofenilanalina por fenilalanina, us ótrofas para un aminoácido particular. Véanse, po en, CJ., Anthony-Cahi11 , Griffith, M.C., Schultz eral method for site-specific incorporation of unnat ds into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. , Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C. . , Chamberlin, A.R, , Díala, E.S. Biosynthetic si orporation of a non-natural amino acids into a polyp Por ejemplo, se preparó un ARNt supresor que re on de terminación UAG y se aminoaciló uímicamen noácido no natural . Se usó mutagénesis dirigida vencional para introducir el codón de terminación io de interés en el gen de la proteína, véase, po ers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5 '-3' Exonu sphorothioate-basedolignoucleotide-directed m leic Acids Res, 16 (3 ): 791-802 (1988). Cuando se com t supresor acilado y el gen mutante en un nscripción/traducción in vitro, el aminoácido no orporó en respuesta al codón UAG que dio una pr tenía ese aminoácido en la posición especificada. E ndo [3H]-Phe y experimentos con a-hidroxiácidos demo o se incorpora el aminoácido deseado en la ecificada por el codón UAG y que este aminoác orpora en ningún otro sitio en la proteína. V mplo, Noren, et al, citado anteriormente Kobayas éculas enzimáticas , incluyendo pero sin limitarse a término "ribozima" es intercambiable con "ARN catalit olaboradores (Cech, 1987, Science, 236: 1532-1539; M , 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demostraron la ARN que se producían de manera natural que pueden a alizadores (ribozimas) . Sin embargo, aunque se ha mo os catalizadores de ARN naturales actúan sólo sobre ácido ribonucleico para la escisión y el corte y e íente desarrollo de la evolución artificial de ri andido el repertorio de catálisis a diversas micas . Los estudios han identificado moléculas d dén catalizar enlaces ' aminoacil-ARN en sus propio ) 3 ' -terminales (Illangakekare et al., 1995 Scienc ) , y una molécula de ARN que puede transferir un ami molécula de ARN a otra (Lohse et al., 1996, Nature ) .

La publicación de solicitud de patente est ías magnéticas. La producción y el uso de ovilizada en sustrato de ribozima para la aminoac cribe en Chemistry and Biology 2003, 10.1077-1 licación de solicitud de patente estadounidense 20 se incorpora como referencia al presente documento.

Los métodos de aminoacilación química incluyen, itán a, los introducidos por Hecht y colaboradores Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roess C; Chang, P.; Hecht, S. M. Bióchemistry 1988, 27, 7 M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol . , 4517) y por Schultz, Chamberlin, Dougherty y otros W. ; Mendel, D. ; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. 5, 34, 621; Robertson, S. A.,- Ellman, J. A.; Schultz Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J. ; Anthony- Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, D.; Glabe, C. G. ; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. . 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, Los métodos para generar AR catalítico puede erar conjuntos separados de secuencias de atorizadas, realizar la evolución dirigida en los minar los conjuntos para detectar la acti noacilación deseada y seleccionar las secuencia ozimas que presentan la actividad de aminoacilacion d Las ribozimas pueden comprender motivos y/o re ilitan la < actividad de acilación, tales como un mo región rica en U. Por ejemplo, se ha notificado qu as en U pueden facilitar el reconocimiento de un s noácido, y un motivo GGU puede formar pares de bas remos 3' terminales de un ARNt. En combinación, el m región rica en U facilitan el reconocimiento simult aminoácido como del . ARNt , simultáneamente, y de ilitan la aminoacilacion del extremo 3' terminal del Las ribozimas pueden generarse mediante selecció ndo un r24mini parcialmente aleatorizado conj La inmovilización sobre un sustrato puede us mitir una purificación por afinidad eficaz de noacilados. Los ejemplos de sustratos adecuados incl se limitan a, agarosa,. Sepharose y perlas magné ozimas pueden inmovilizarse sobre resinas aprovechán ructura química del A , tal como que el 3'-cis-osa del ARN puede oxidarse con peryodato para p respondiente dialdehído para facilitar la inmovili sobre la resina. Pueden usarse diversos tipos luyendo resinas de hidrazida baratas en las que la uctora hace que la interacción entre la resina y l una unión irreversible. La síntesis de aminoacil-ilitarse significativamente mediante esta té noacilación en columna. Kourouklis et al. Methods 20 escriben un sistema de aminoacilación basado en colum El aislamiento de los ARMt aminoacilados puede l variedad de modos . Un método adecuado es eluir parado mediante la reacción de traducción. Los e temas de traducción en los que los ARNt aminoacil sente invención pueden usarse incluyen, pero no se ados celulares. Los lisados celulares proporcionan reacción necesarios para la traducción in vit ipéptido a partir de un ARNm de entrada. Los ejemplo ponentes de reacción incluyen pero no se limitan a osómicas, ARNr , aminoácidos, ARNt, GTP, ATP, f ngación e iniciación de la traducción y factores ciados con la traducción. Adicionalmente, los s ducción pueden ser traducciones por lotes o partimentalizada . Los sistemas de traducción por lot componentes de reacción en un único compartimento m sistemas de traducción compartimentalizada se ponentes de la reacción de traducción de los pr cción que pueden inhibir la eficacia de la traduce temas de traducción están disponibles comercialmente. ponentes de la traducción tales como ribosomas y f ducción. Adicionalmente, se incluye una ARN polímera nscripción del ADN de entrada para dar un molde de A en la traducción. El RTS puede usar la compartime los componentes de reacción por medio de un erpuesta entre los compartimentos de reacción, ine partimento de suministro/desechos y un compart nscripción/traducción .

La aminoacilación del ARNt puede realizarse medi ntes, incluyendo pero sin * limitarse a, tr imerasas, anticuerpos catalíticos, proteínas multifu ilares .

Stephan en Scientist 10 de octubre de 2005; pág cribe métodos adicionales . para incorporar amino ificados de manera natural en proteínas. Lu et al. e ubre de 2001; 8(4):759-69 describen un método en teína se liga químicamente a un péptido sintético ,q ectaron conj ntamente dos especies de ARN preparadas ARJSTm que codifica para la proteina diana con un minación UAG en la posición de aminoácido de interés resor ámbar aminoacilado con el aminoácido no natura maquinaria de traducción del ovocito inserta e noácido no natural en la posición especificada por odo ha permitido estudios de estructura-función i te nas integrales de membrana, que generalment cuadas para sistemas de expresión in vitro. Lo luyen la incorporación de un aminoácido fluoresce eptor de neurocinina 2 taquicinina para medir iante transferencia de energía por resonancia de flu se, por ejemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Ed eth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel y Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación de tinilados para identificar residuos expuestos en la canales iónicos, véase, por ejemplo, J. P, Galli gherty y H. A, Lester, Cell, 96 : 89 ( 1999 ) ; y T. Lu, A Mainland, L. Y. Jan, p. G. Schultz y J. Yang, Nat. 39 ( 2001 ) . La capacidad para incorporar amino urales directamente en proteínas ín vivo ofrece iedad de ventajas incluyendo pero sin limitarse dimientos de proteínas mutantes, facilidad té ibilidad de estudiar las proteínas mutantes en iblemente en organismos vivos y el uso de estas antes en tratamientos terapéuticos y usos de diagn acidad par.a incluir aminoácidos no naturales co años, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidade piedades en proteínas puede expandir en gran acidad para manipular de manera racional y siste ructuras de las proteínas, tanto para estudiar co ción de la proteína como para crear nuevas p anismos con propiedades novedosas.

En un intento por incorporar de manera específica cariotas o eucariotas. Los sistemas de traducción luyen, pero no se limitan a, preparaciones de célula es como células permeabilizadas o cultivos celulares de transcribirse una secuencia de ácido nucleico de ARNm y traducirse el ARNm. Están disponibles com temas de traducción libres de células y se conocen os y sistemas diferentes. Los ejemplos de sistemas ulas incluyen, pero no se limitan a, lisados procar o lisados de Escheríchia coli, y lisados eucariotas ractos de germen de trigo, lisados de células d ados de reticulocitos de conejo, lisados de ovocitos lisados de células humanas. Pueden preferirse ractos eucariotas cuando la proteína result cosilada, fosforilada o modificada de otra forma de has de tales modificaciones sólo son posibles e ariotas. Algunos de estos extractos y lisados están ercialmente (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; arrollo de sistemas de expresión de proteínas ulas. Véanse, por ejemplo, Kim, D.M. y J.R technology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); K . Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2 . , y J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-39 , D.M., y J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengine -188, (1999); y Patnaik, R. y J.R. Swartz, Biotech -868, (1998); la patente estadounidense n.2 6.3 licación de patente estadounidense n.2 2002/00 umento O 00/55353; el documento WO 90/05785, que se o referencia al presente documento. Otro enfoque icarse a la expresión de polipéptidos bG-CSF que co noácido no codificado de manera natural incluye la ión ARNm-péptido . Véanse, por ejemplo, R. Roberts y c. Nati Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). En este e duce un molde de AR m unido a puromicina para dar un aminoácidos no codificados de manera natural para ipéptidos que tienen propiedades deseadas . Más rec han notificado traducciones en ribosomas in ponentes purificados cjue permiten la síntesis d tituidos con aminoácidos no codificados de maner se, por ejemplo, A. Forster et al, Proc. Nati Acad. :6353 (2003) .

También pueden usarse sistemas de traducción reco bién se han usado satisfactoriamente mezclas de f ducción purificados para traducir ARNm en proteína binaciones de lisados o lisados complementados con ducción purificados tales como factor de iniciación 2, IF-3 (a o ß) , factor de elongación T (EF-Tu) , o minación. Los sistemas libres de células pueden s temas de transcripción/traducción acoplados en l roduce ADN en el sistema, se transcribe en ARNm y se m tal como se describe en Current Protocols in traducen con alta eficacia en el sistema de iculocitos.

Polímeros macromoleculares acoplados a polipéptidos Pueden efectuarse diversas modificaciones en los p aminoácidos no naturales descritos en el presente ndo las composiciones, los métodos, las técnicas y critos en el presente documento. Estas modificacione incorporación de una funcionalidad adicional en el aminoácido no natural del polipéptido, incluyendo itarse a, hidroxialquilalmidón (HAS) , hidroxietilalm marcador; un colorante; un polímero; un polímero a; un derivado de polietilenglicol; un orreticulación; un radionúclido; un compuesto cito maco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoa puesto reactivo; una resina; una segunda proteína o nálogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de itable mediante radiación actínica; un resto fotois tina; un derivado de biotina; un análogo de biotina incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; do a carbono; un agente redox activo; un aminoti to tóxico; un resto marcadó isotópicamente; física; un grupo fosforescente; un grupo quimiolumini po electrodenso; un grupo magnético; un grupo de int cromóforo; un agente de transferencia de energía; lógicamente activo; un marcador detectable; una ueña; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radio radiotransmisor; un agente de captura de neutrones; binación de los anteriores, o cualquier otro c tancia deseable. Como ejemplo ilustrativo, no limitat posiciones, los métodos, las técnicas y las critos en el presente documento, la siguiente desc trará en añadir polímeros macromoleculares al polip Puede unirse una amplia variedad de romoleculares y otras moléculas a polipéptidos bG-sente invención para modular las propiedades biol ipéptido bG-CSF, y/o proporcionar nuevas propiedades a molécula de bG-CSF. Estos polímeros macromolecula rse al polipéptido bG-CSF por medio de un aminoácido manera natural, por medio de un aminoácido no cod era natural, o cualquier sustituyente funcion noácido natural o no natural, o cualquier sustituyen cional añadido a un aminoácido natural o no natura ecular del polímero puede ser de un amplio luyendo pero sin limitarse a, entre aproximadamente oximadamente 100.000 Da o más. El peso molecular de de ser de entre aproximadamente 100 Da y apro .000 Da, incluyendo pero sin limitarse a, 100.000 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 ecular del polímero es de entre aproximadamente 1 oximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, ecular del polímero es de entre aproximadamente 5 oximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, ecular del polímero es de entre aproximadamente 10 oximadamente 40.000 Da.

La presente invención proporciona pr tancialmente homogéneas de conjugados de polímer stancialmente homogéneo" tal como se usa en el umento significa que se observa que las moléculas de polímero : proteína son más de la mitad de la proteína ugado de polímero : proteína tiene actividad biológ sentes preparaciones de polipéptido bG-CSF stancialmente homogéneas" proporcionadas en el umento son las que son suficientemente homogéneas sentar las ventajas de una preparación homogénea, po ilidad en su aplicación clínica y en su predictibil conjugado de monopplimero .proteína preparado usando la presente invención, y tener una mezcla con una erminada de conjugados de monopolímero : proteína .

El polímero seleccionado puede ser soluble en ag la proteína a la que se une no precipita en un ento como un entorno fisiológico. El polímero puede ser o ramificado. Para el uso terapéutico de la prep ducto final, el polímero será farmacéuticamente acept Los ejemplos de polímeros incluyen pero no se ialquiléteres y análogos con extremos ocupados con mismos {por ejemplo, polioxiet ioxietilen/propilenglicol y análogos con extremos o oxilo o etoxilo de los mismos, es ioxietilenglicol , este último se conoce tam ietileneglicol o PEG) ; polivinilpi ivinilalquiléteres ; polioxazolinas , polialquiloxa ihidroxialquiloxazolinas; polia ivados, por ejemplo, quitosano, succinil boximetilquitina, carboximetilquitosano; ácido nia derivados; almidones; alginatos; sulfato de c úmina; pululano y carboximetilpululano; poliamin ivados de los mismos, por ejemplo, poli (ácidos g ilisinas, poli (ácidos aspárticos) , polias olímeros de anhídrido maleico tales como: cop ireno-anhídrido maleico, copolímero de divinile ídrido maleico; poli (alcoholes vinílicos); copolíme mos; terpolímeros de los mismos; mezclas de l roxialquilalmidón (HAS) , incluyendo pero sin lim roxietilalmidón (HES) ; y derivados de los anteriores.

La proporción de moléculas de polietilenglicol con éculas de proteína variará, así como sus concentraci cla de reacción. En general, la razón óptima (en c cacia de la reacción en la que hay un mínimo exceso proteína sin reaccionar) puede determinarse median Tal como se usa en el presente documento, y templan conjugados de PEG:polipéptido bG-CSF, la ntidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una ca porciona el beneficio deseado a un animal . La cantid un individuo a otro y dependerá de varios factores, estado físico global del paciente y la causa suby ado que va a tratarse. La cantidad de polipéptido bG a la terapia proporciona una tasa de cambio a tiene una respuesta deseada a un nivel beneficioso. itual en la técnicá puede determinar fácilmente un apéutreamente eficaz de las presentes composició eriales y procedimientos disponibles para el público.

El polímero soluble en agua puede ser cualcj ructural incluyendo pero sin limitarse a lineal, en ificada. Normalmente, el polímero soluble en ag i (alquilenglicol) , tal como poli (etilenglicol) (PE dén emplearse también otros polímeros solubles en ag lio para abarcar cualquier molécula de poliet ependíentemente del tamaño o la modificación en un e , y puede representarse como unido al polipépt iante la fórmula: (CH2CH20)n-CH2CH2-Y la que n es de 2 a 10.000 y X es H o una modificació luyendo pero sin limitarse a, un grupo alquilo Ci-4 tector o un grupo funcional terminal .

En algunos casos, un PEG usado en la invención te remo con hidroxilo o metoxilo, es decir, X es H o CH " ) . Alternativamente, el PEG puede terminar con ctivo, formando de ese modo un polímero bifuncional. ctivos típicos pueden incluir los grupos reactivos q únmente para reaccionar con los grupos funcional uentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo itarse a, grupos maleimida, carbonatos activados o sin limitarse a, éster p-nitrofenílico) , ésteres ipéptido bG-CSF por medio de un aminoácido que se era natural o no codificado de manera natural. Por de ser una unión amida, carbamato o urea con un g cluyendo pero sin limitarse a, la amina épsilon de l extremo N-terminal) del polipéptido. Alternativament una unión maleimida con un grupo tiol (incluyend itarse a, el grupo tiol de la cisteína) . Alternati de ser una unión con un residuo que no es comúnment medio de los 20 aminoácidos comunes. Por ejem erse reaccionar un grupo azida en el PEG con un gru el polipéptido bG-CSF para formar un producto de c 2] de Huisgen. Alternativamente, puede hacerse rea po alquino en el PEG con un grupo azida prese noácido no codificado de manera natural para formar ilar. En algunas realizaciones, puede hacerse rea leófilo fuerte (incluyendo pero sin limitarse a, razida, hidroxilamina, semicarbazida) con un grupo Puede usarse cualquier masa molecular para un PE ee de manera práctica, incluyendo pero sin limita de aproximadamente 100 Daltons (Da) hasta 100.000 ún se desee (incluyendo pero sin limitarse a, alg -50 kDa o 10-40 kDa) . El peso molecular del PEG pu lio intervalo, incluyendo pero sin limitarse oximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da o m de estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadame incluyendo pero sin limitarse a, 100.000 Da, 95.000 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 55.000 Da, '50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 7.000 Da, 6.000 Da3 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 00 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da y 100 Da. En algunas realizaciones, el PEG e oximadamente 100 Da y aproximadamente 50.000 Da. lizaciones, el PEG es de entre aproximadamente kDa o 5-20 kDa) . El peso molecular de cada cadena ena ramificada puede ser, incluyendo pero sin limit re aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 100.000 peso molecular de cada cadena del PEG de cadena de ser de entre aproximadamente 1.000 Da y apro .000 Da, incluyendo pero sin limitarse a, 100.000 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 00 Da y 1.000 Da. En algunas realizaciones, el pes cada cadena del PEG de cadena ramificada es oximadamente 1.000 Da y aproximadamente 50.000 Da. lizaciones, el peso molecular de cada cadena del PEG ificada es de entre aproximadamente 1.000 Da y apro 000 Da. En algunas realizaciones, el peso molécul ena del PEG de cadena ramificada es de entre apro Generalmente, al menos un extremo terminal de la está disponible para la reacción con el ami ificado de manera natural. Por ejemplo, pueden usars PEG que llevan restos alquino y azida para la re enas laterales de aminoácidos para unir PEG a amin dificados de manera natural tal como se describe en umento. Si el aminoácido no codificado de mane prende una azida, entonces el PEG contendrá' normalme resto alquino para efectuar la formación del p loadición [3+2] o bien una especie de PEG activada er, carbonato) que contiene un grupo fosfina para e mación del enlace amida. Alternativamente, si el am ificado de manera, natural comprende un alquino, ento tendrá normalmente un resto azida para efectuar la producto de cicloadicion [3+2] de Huisgen. Si el am ificado de manera natural comprende un grupo carboni prenderá normalmente un nucleofilo potente (incluyen En algunas realizaciones, la variante de polipépt un derivado . de PEG contiene una funcionalidad quím ctiva con la funcionalidad química presente en eral del aminoácido no codificado de manera natural.

La invención proporciona en algunas realizaciones iméricos que contienen acetileno y azida que comp ructura principal de polímero soluble en agua que ti ecular promedio de desde aproximadamente 800 oximadamente 100.000 Da. La estructura principal d polímero soluble en agua puede ser poli (etilengl argo, debe entenderse que una amplia variedad de ubles en agua incluyendo pero sin lim i (etilen) glicol y otros polímeros relacionados, i(dextrano) y poli {propilenglicol ) , también son adec uso en la práctica de esta invención y que el uso o poli (etilenglicol) pretende abarcar e incluir éculas de este tipo. El término PEG incluye, pero no micos, no se hidroliza ni se deteriora, y es gener ico. Se considera que el poli (etilenglicol) es bio que significa que el PEG puede coexistir con or idos vivos sin causar daño. Más específicamente, tancialmente no inmunogénico, lo que significa que nde a producir una respuesta inmunitaria en el cuer une a una molécula que tiene alguna función dese rpo, tal como un agente biológicamente activo, el PE ascarar el agente y puede reducir o eliminar puesta inmunitaria de modo que un organismo puede sencia del agente. Los conjugados de PEG no tienden respuesta inmunitaria sustancial ni a provocar coa os efectos no deseados . El PEG que tiene la fórmul 2CH20)n-CH2CH2- , en la que n es de desde aproximadamen oximadamente 4000, normalmente desde aproximadament oximadamente 2000, es adecuado para su uso en l ención. El PEG que tiene un peso molecular 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 00 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 D Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. lizaciones, el peso molecular del PEG es oximadamente 100 Da y aproximadamente 50.000 Da. lizaciones, el peso molecular del PEG es oximadamente 100 Da y aproximadamente 40.000 Da. lizaciones, el peso molecular del PEG es oximadamente 1.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. lizaciones, el peso molecular del PEG es oximadamente 5.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. lizaciones, el peso molecular del PEG es oximadamente 10.000 Da y aproximadamente 40.000 Da.

La estructura principal de polímero puede ser ificada. Se conocen en general en la técnica i ( etilenglicol ) ramificado puede representarse en fo o R(-PEG-OH)m en la que R se deriva de un resto de o glicerol, oligómeros de glicerol o pentaeritr resenta el número de brazos . También pueden us ructura principal de polímero moléculas de PEG de zos, tales como las descritas en las patentes esta 5.932.462; 5.643.575; 5.229.490; 4.289.872; la so ente estadounidense 2003/0143596; el documento WO 9 documento WO 93/21259, cada uno de los cuales se inc erencia al presente documento en su totalidad.

El PEG ramificado también puede estar en forma de cjuilla representado mediante PEG (~YCHZ2)H/ en la qu po de unión y Z es un grupo terminal activado iante una cadena de átomos de longitud definida.

Aún otra, forma ramificada, el PEG colgante, ti ctivos, tales como carboxilo, a lo largo de la ncipal de PEG en vez de en el extremo de las cadenas Los expertos habituales en la técnica entiend mino" poli (etilenglicol) o PEG representa o incluye mas conocidas en la técnica incluyendo pero sin limi as a conocer en el presente documento .

Muchos otros polímeros son también adecuados para presente invención. En algunas realizacio ticularmente útiles, en la invención estructuras pri imero que son solubles en agua, con desde oximadamente 300 extremos terminales. Los ejemplos d cuados incluyen, pero .no se' limitan i (alquilenglicoles) , tales como poli (propilenglicol olímeros de los mismos (incluyendo pero sin l olímeros de etilenglicol* y propilenglicol) , terpolím mos, mezclas de los mismos y similares. Aunqu ecular de cada cadena de la estructura principal d de variar, está normalmente en el intervalo oximadamente 800 Da hasta aproximadamente 100.000 Da 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da., 700 D Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. E lizaciones, el peso molecular de cada cadena de la ncipal de polímero es de entre aproximadamente oximadamente 50.000 Da. En algunas realizaciones, ecular de cada cadena de la estructura principal de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 40. unas realizaciones, el peso molecular de cada cad ructura principal de polímero es de entre aproximada y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizacione ecular de cada cadena de la estructura principal de entre aproximadamente 5.000 Da y aproximadamente 40. unas realizaciones, el peso molecular de cada cad ructura principal de polímero es de entre apro 000 Da y aproximadamente 40.000 Da.

Los expertos habituales en la técnica reconocer ta anterior de estructuras principales sustancialmen remos terminales, funcionalizados o activados con cional. Los derivados poliméricoss multifuncionales o no se limitan a, polímeros lineales que tienen do minales, estando unido cada extremo terminal a cional que puede ser igual o diferente .

En una realización, el derivado polimérico ructura : -POLI-B-N=N=N en la que: =N es un resto azida;. s un resto de unión, que puede estar presente o ausen I es un polímero no antigénico soluble en agua; s un resto de unión, que puede estar presente o aus de ser igual que B o diferente ; y s un segundo grupo funcional .

Los ejemplos de un resto de unión para A y B ind se limitan a, un grupo alquilo funcionalizado de for contiene hasta 18, y puede contener entre 1-10 luyen los grupos de unión descritos en las adounidenses n.os 5.932.462; 5.643.575; y la publ icitud de patente estadounidense 2003/0143596, cada les se incorpora como referencia al presente docui ertos habituales en la técnica reconocerán que erior de restos de unión no es de ningún modo exhau amente ilustrativa, y que se contempla que todos los ón que tienen las cualidades descritas anterio cuados para su uso en la presente invención.

Los ejemplos de grupos funcionales adecuados para ncluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo oxilo, éster activo, tal como esteres de N-hidroxisu ésteres de 1-benzotriazolilo, carbonato activo, bonatos de N-hidroxisuccinimidilo y carbonato zotriazolilo, acetal, aldehido, hidratos de uenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfo na, aminooxilo, amina protegida, hidrazida, significa que el segundo grupo funcional (es dec bién un resto azida, o heterobifuncionales , lo que el segundo grupo funcional es un grupo funcional dif El término "protegido" se refiere a la presencia d grupo protector que impide la reacción del grupo micamente reactivo en ciertas condiciones de reacción tector variará dependiendo del tipo de grupo q ctivo que está protegiéndose. Por ejemplo, si micamente reactivo es una amina o una hidrazida, tector puede seleccionarse del grupo de terc-butilo Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si micamente reactivo es un tiol, el grupo protector ulfuro de ortopiridilo . Si el grupo químicamente reac do carboxílico, tal como ácido butanoico o propió po hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo uilo tal como metilo, etilo o terc-butilp. Tamb rse en la presente invención otros grupos protectore anoato de succinimidilo {véase, por ejemplo, Olson yíethylene glycol) C emistry & Biological Applicati -181, Harris & Zalipsky Eds . , ACS,. Washington, D se también la patente estadounidense n.s 5.672.662), succinimidilo (véanse, por ejemplo, Abuchowski et chem. Biophys . 7:175 (1984) y Joppich et al. Makro :1381 (1979), éster de succinimidilo (véase, por e ente estadounidense n.2 4.670.417), carbonato de b ase, por ejemplo, la patente estadounidense n.e cidil éter (véanse, por ejemplo,- Pitha et al. Eur. 11 (1979), Elling et al., Biotec . Appl . Bioch 91), oxicarbonilimidazol (véanse, por ejemplo, Bea , Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. éase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (v mplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 85),· y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:4 ehído (véanse, por ejemplo, Harris et al. J. Polym. adounidense n.9 5.900.461). Todas las patentes y eriores se incorporan al presente documento como refe En ciertas realizaciones de la presente inve ivados poliméricos de la invención comprenden una ncipal de polímero que tiene la estructura: H2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-N==N=N en la que: s un grupo funcional tal como se describió anterior de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000.

En otra realización, los derivados poliméric ención comprenden una estructura principal de po ne la estructura: H2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-0- (CH2)m-W-N=N=N en la que: . s un resto ligador alifático o aromático que compren átomos de carbono; n es de aproximadamente 20 a apro 0; y s un grupo funcional tal como se describió anteriorm re 1 y 10. minal unido a un grupo saliente adecuado, se hace un anión azida (que puede estar apareado con cua ios contraiones adecuados, incluyendo sodio, pota ilamonio, etcétera) . El grupo saliente exper plazamiento nucleófilo y se sustituye por el re porcionando el polímero de PEG que contiene azida dés EG-L + N3- -»X-PEG-N3 Tal como se muestra, una estructura principal d cuada para su uso en la presente invención tiene la -L, en la que PEG es poli (etilenglicol ) y X es cional que no reacciona con grupos azida y L es íente adecuado. Los ejemplos de grupos funcionales luyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo tal, alquenilo, amina, aminooxilo, amina protegida, tegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido tegido, maleimida, ditiopiridina y vinilpiridina, y mplos de grupos salientes adecuados incluyen, p cionalidad química que reaccionará selectivamente cionalidad química en el polímero de PEG, para ducto de derivado polimérico que contiene azida en da está separada de la estructura principal de polím po de unión.

Se muestra a continuación un esquema de reacción mplo : EG- + N-ligador-N=N=N ? PG-X-PEG-ligador-N=N=N en el es poli (etilenglicol) y X es un grupo de ocupación como alcoxilo o un grupo funcional tal como se eriormente; y s un grupo funcional que no es reactivo con la fu da pero que reaccionará eficaz y selectivamente co cional N.

Los ejemplos de grupos funcionales adecuados incl se limitan a, M que es un ácido carboxílico, carbona ivo si N es una amina; M que es una cetona si N e -diamina monoprotegida resultante se hace reaccion to de unión que lleva la funcionalidad azida: H -PEG-NH2 + H02C-(CH2)3-N=N=N En este caso, el grupo amina puede acoplarse al g boxílico usando una variedad de agentes de activa o cloruro de tionilo o reactivos de carbodiim roxisuccinimida o N-hidroxibenzotriazol para crear da entre el derivado' de monoamina-PEG y el resto l va azida. Tras la formación satisfactoria del enlace ivado que contiene azida protegido con N-ter ultante puede usarse directamente para modificar activas o puede elaborarse adicionalmente para inst pos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo N-t rolizarse mediante tratamiento con ácido fuerte pa omega-amino-PEG-azida. La amina resultante puede u dero sintético para instalar otra funcionalidad úti pos maleimida, disulfuros activados, ésteres ivado, etcétera, a un extremo terminal del PEG y un tiene un grupo acetileno al otro extremo terminal de En otra realización de la invención, el derivado ne la estructura: -POLI-B-C=C-R en la que: puede ser o bien H o bien un grupo alquilo, uiloxilo, o arilo o arilo sustituido; s un resto de unión, que puede estar presente o ausen I es un polímero no antigénico soluble en agua; s un resto de unión, que puede estar presente o aus de ser igual que B o diferente; y s un segundo grupo funcional .

Los ejemplos de un resto de unión para A y B inc se limitan a, un "grupo alquilo funcionalizado" tiple que contiene hasta 18, y puede contener entre carbono. Puede incluirse con la cadena de a eroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre. La licación de solicitud de patente estadounidense 20 a una de las cuales se incorpora como referencia a umento. Los expertos habituales en la técnica recon lista anterior de restos de unión no es de n austiva y pretende ser meramente ilustrativa, templa que una amplia variedad de restos de unión cualidades descritas anteriormente son útiles en l ención.

Los ejemplos de grupos funcionales adecuados p o X incluyen hidroxilo, hidroxilo protegido, alcox ivo, tal como ésteres de N-hidroxisuccinimidilo y és zotriazolilo, carbonato activo, tal como carbona roxisuccinimidilo y carbonatos de 1-benzotriazolil ehído, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, m ilamida, sulfona activa, amina, aminooxilo, . amina razida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido c do carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, nifica que el segundo grupo funcional es un grupo érente.

En otra realización de la presente invención, los iméricos comprenden una estructura principal de po ne la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2-0- (CH2)m- : s un grupo funcional tal como se describió anteriorme n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; m es de entre 1 y 10.

Se muestran a continuación ejemplos específic imeros de PEG heterobifuncionales .

Los derivados de PEG que contienen acetileno de l dén prepararse usando métodos conocidos por lo ituales en la técnica y/o dados a conocer en e umento. En un método, una estructura principal d uble en agua que tiene un peso molecular promedi oximadamente 800 Da hasta aproximadamente 100.000 D tituye por el resto nucleófilo, proporcionando el po tiene acetileno deseado.

EG-Nu + L-A-C -> X-PEG-Nu- A-C=CR' Tal como se muestra, una estructura principal d ferida para su uso en la reacción tiene la fórmula X que PEG es poli (etilenglicol) , Nu es un resto nucleó grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la fu tileno .

Los ejemplos de Nu incluyen, pero no se limitan na, alcoxilo, ariloxilo, sulfhidrilo, imino, c razida, aminoxilo que reaccionarían principalmente po mecanismo de tipo SN2. Los ejemplos adicionales de luyen aquellos grupos funcionales que re ncipalmente por medio de una reacción de adición ejemplos de grupos L incluyen cloruro, bromur ilato, tresilato y tosilato y otros grupos que se cional que no reacciona con grupos azida y L es íente adecuado.

En otro método para la preparación de los de imero que contienen acetileno de la invención, un p que tiene un peso molecular promedio de desde apro Da hasta aproximadamente 100.000 Da, que lleva o bi cional protegido o bien un agente de ocupación de extremo terminal y un grupo saliente adecuado e remo terminal, se pone en contacto con un anión aceti Se muestra a continuación un esquema de reacción mplo : EG-L + -C==CR' -> X-PEG-C=CR' en el que: es poli (etilenglicol) y X es un grupo de ocupación como alcoxilo o un grupo funcional tal como se eriormente; y es o bien H, un grupo alquilo, alcoxilo, arilo o n un grupo alquilo, alcoxilo, arilo o ariloxilo susti La purificación del producto bruto puede itualmente mediante métodos conocidos en la técnica i o sin limitarse a, precipitación del producto s matografía, si es necesario.

Pueden unirse polímeros solubles en agua a los p CSF de la invención. Los polímeros solubles en a rse por medio de un aminoácido no codificado de mane orporado en el polipéptido bG-CSF o cualquier grupo f tituyente de un aminoácido no codificado de manera ificado de manera natural, o cualquier grupo f tituyente añadido a un aminoácido no codificado ural o codificado de manera natural. Alternativa imeros solubles en agua se unen a un polipépt orporando un aminoácido no codificado de manera n io de un aminoácido que se produce de maner cluyendo pero sin limitarse a, cisteína, lisina o na del residuo N-terminal) . En algunos casos, los p ención comprenden uno o más aminoácido (s) codificados natural unidos a polímeros solubles en agua y noácidos que se producen de manera natural unidos a ubles en agua. En algunas realizaciones, los polímer agua usados en la presente invención potencian la S ro del polipéptido bG-CSF en relación con la jugada .

El número de polímeros solubles en agua uni ipéptido bG-CSF (es decir, el grado de peg cosilación) de la presente invención puede ajus porcionar una característica farmacodinámica, farmaco macológica alterada (incluyendo pero sin limitarse a, isminuida) tal como semivida in vivo. En algunas rea semivida de bG-CSF aumenta al menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces eces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 contiene carbonilo se modifica con un derivado tiene un resto hidrazina, hidroxilamina, hi icarbazida terminal que se une directamente a la ncipal de PEG.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG hi minal tendrá la estructura: ( CH2CH20 ) n-0- ( CH2 ) m-0- H2 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molécul de entre 5-40 kDa) .

En algunas realizaciones, el derivado de PEG qu razina o hidrazida tendrá la estructura: ( CH2CH20 ) n-0- ( CH2 ) m-X-NH-NH2 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10 y n es 100-1.000 y X es opcionalmente un grup 0) que puede estar presente o ausente.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG qu une a la estructura principal de PEG por medio de da.

En algunas realizaciones, los derivados de PEG hid minal tienen la estructura: (CH2CH20) n-0- {CH2 ) 2-NH-C (0) (CH2 ) m-0- H2 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, - propi s 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecula de entre 5-40 kDa) .

En algunas realizaciones/ los derivados de PEG que razina o hidrazida tienen la estructura: (CH2CH20) n-0- (CH2 ) 2-NH-C (O) (CH2) m-X-NH-NH2 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, propi s 2-10, n es 100-1.000 y X es opcionalmente un grupo 0) que puede estar presente o ausente.

En algunas realizaciones, los derivados de PEG que icarbazida tienen la estructura: (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2)m-NH-C (0) -NH-NH2 En otra realización de la invención, un polipépt comprende un aminoácido no codificado de manera ifica con un derivado de PEG que tiene una ificada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el hidrazina o hidrazida-terminal tendrá la siguiente e - { CH2CH20 ) n-0- ( CH2 ) 2 - H-C (0 ). ] 2CH { CH2 ) m-X-NH-NH2 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop es 2-10. y n es 100-1.000, y X es opcionalmente bonilo (C=0) que puede estar presente o ausente .

En algunas realizaciones, los derivados de PEG qu grupo semicarbazida tendrán la estructura: - ( CH2CH20) n-0- ( CH2 ) 2-C (0) -NH-CH2-CH2 ] 2CH-X- ( CH2 ) m- H-C (0) - H-N la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s opcionalmente NH, O, S, C{0) o no está presente, m s 100-1.000.

En algunas realizaciones, los derivados de PEG qu grupo hidroxilamina tendrán la estructura: ipéptido bG-CSF se une al receptor con una oximadamente 400 nM o inferior, con una Kd de erior, y en algunos casos con una ¾ de 100 nM o in ?? se mide en un ensayo de unión en equilibrio, t crito en Spencer et al, J. Biol. Chem. , 263:7862-7867 Los métodos y la química para la activación de pol o para la conjugación de péptidos se describ liografía y se conocen en la técnica. Los méto iúnmente para la activación de polímeros incluyen, itán a, activación de grupos funcionales con nógeno, peryodato, glutaraldehído, biepóxidos, epic inilsulfona, carbodiimida, haluros de clorotriazina, etc.. {véanse, R. F. Tailor, (1991 OBILISATION.. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel De S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUG SSLINKING, CRC Press, Boca Ratón,- G. T. Hermans 93),' IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic iews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-3 ipsky, Bioconjugate Chem. 6; 150-165 (1995).

También pueden encontrarse métodos para la act imeros en el documento WO 94/17039, patente estadou 24.844, documento WO 94/18247, documento WO 94/0419 adounidense n.9 5.219.564, patente estadouni 22.614, documento WO 90/13540, patente estadoun 81.698 y documento WO 93/15189, y para la conjuga imeros activados y enzimas incluyendo pero sin l tor de coagulación VIII (documento WO 94/15625) , cumento WO 94/09027), molécula portadora de oxigen adounidense' n.2 4.412.989), ribonucleasa y superóxid ronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (19 referencias y patentes citadas se incorporan como presente documento.

La pegilación (es decir, la adición de cualquie uble en agua) de polipéptidos bG-CSF que co varse a cabo la reacción (en general, aproximadamente ejemplos de tampones adecuados para la pegilación ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, HEPES ato, TRIS-HC1, EPPS y TES. El pH se monitoriza y era continua si es necesario. Normalmente, se de cción continúe durante entre aproximadamente 1-48 hor Los productos de reacción se someten posteri matografia de interacción hidrófoba para separar las polipéptido bG-CSF pegiladas de mPEG (5000) -0-CH2-C= lquier complejo de alto peso molecular del polipépt ilado que pueda formarse cuando se activa PEG no bl os extremos de la molécula, reticulando de ese modo iantes de polipéptido bG-CSF. Las condiciones matografia de interacción hidrófoba son tales que mP -C=CH libre fluye a través de la columna, mientras qu plejo variante de polipéptido bG-CSF pegilado ret ye tras las formas deseadas, que contienen un Si es necesario, el polipéptido bG-CSF pegilado tir ele la cromatografía hidrófoba puede cionalmente mediante uno o más procedimientos que c ertos habituales en la técnica incluyendo, pero sin cromatografía de afinidad; cromatografía de ónico o catiónico (usando, incluyendo pero sin li E SEPHAROSE) ; cromatografía sobre sílice; HPLC de fa tración en gel {usando, incluyendo pero sin li HADEX G-75); cromatografía de interacción matografía de exclusión molecular, cromatografía d álicos; ultrafiltración/diafiltración; precipita nol; precipitación con sulfato de amonio; crom matografía de desplazamiento; procedimientos elect cluyendo pero sin limitarse a isoelectroenfoque pr ubilidad diferencial (incluyendo pero sin cipitación con sulfato de amonio) o extracción, ecular aparente puede estimarse por GPC mediante Un polímero soluble en agua unido a un aminoác ipéptido bG-CSF de la invención puede deriva tituirse adicionalmente sin limitación. ivados de PEG que contienen azida En otra realización de la invención, un polipéptid ifica con un derivado de PEG que contiene un resto ccionará con un resto alquino presente en la cadena noácido no codificado de manera natural. En ge ivados de PEG tendrán un peso molecular promedio de 1-100 kDa y, en algunas realizaciones, desde 10-40 En algunas realizaciones, el derivado de PEG azi drá la estructura: (CH2CH20) n-O- {CH2 ) m-N3 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molécul de entre 5-40 kDa) . derivado de PEG ramificado que contiene un r minal, teniendo cada cadena del PEG ramificado un P de 10-40 kDa y puede ser de desde 5-20 kDa. Por e unas realizaciones, el derivado de PEG azida-terminal uíente estructura: -(CH2CH20)n-0- (CH2)2- H-C(0) ]2CH(CH2)m-X- (CH2)pN3 la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10, p es 2-10, y n es 100-1.000, y X es opcional S o grupo carbonilo (C=0) , que en cada caso que sente o ausente . ivados de PEG que contienen alquino En otra realización de la invención, un polipéptid ifica con un derivado de PEG que contiene un resto ccionará con un resto azida presente en la cadena .1 noácido no codificado de manera natural.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG alqui resto alquino terminal o azida terminal que se ructura principal de PEG por medio de un enlace amida En algunas realizaciones, el derivado de PEG alqui drá la siguiente estructura: (CH2CH20) n-0- (CH2 ) m-NH-C (0) - (CH2) P-C=CH la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10, p es 2-10 y n es 100-1.000.

En otra realización de la invención, un polipépt comprende un aminoácido que contiene azida se modif ivado de PEG ramificado que contiene un resto alquin iendo cada cadena del PEG ramificado un PM que oscil kDa y puede ser de desde 5-20 kDa. Por ejemplo, lizaciones, el derivado de PEG alquino-terminal uíente estructura: - (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) } 2CH (CH2) m-X- (CH2 ) P-C=CH la que R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, prop s 2-10, p es 2-10, y n es 100-1.000, y X es opcional era natural. En general, los derivados de PEG tendr ecular promedio que oscila desde 1-100 kDa y, lizaciones, desde 10-40 kDa.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG ructura : en la que n es 1-10; X puede ser O, N, S o no est es fenilo, y W es un polímero soluble en agua.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG ructura : itarse a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, grupo oxilo o tioalcoxilo sustituidos o no sustituidos, lalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye po R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se ependíentemente tal como cada grupo R' , R", R' " y á presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con e rógeno para formar un anillo de 5, 6 ó 7 miembros. P 'R" pretende incluir, pero sin limitarse a, 1-pirro orfolinilo . A partir de la discusión anterior de sus experto en la técnica entenderá que el término tende incluir grupos que incluyen átomos de carbon pos distintos de grupos hidrógeno, tales como cluyendo pero sin limitarse a, -CF3 y - CH2CF3) cluyendo pero sin limitarse a, -C(0)CH3/ -C(0)CF3, -C{ ilares) . 2/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 20 2/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 20 1/0044526; 2001/0021763; las patentes estadounid 46.110 5.824.778; 5.4.76.653; 5.219.564; 5.629.384; 02.502 5.281.698; 5.122.614; 5.473.034; 5.516.673; 52.167 6.610.281; 6.515.100; 6.461.603; 6.436.386; 90.237 5.900.461; 5.739.208; 5.672.662; 5.446.090; 12.460 5.324.844; 5.252.714; 6.420.339; 6.201.072; 06.821 5.559.213; 5.747.646; 5.834.594; 5.849.860; 04.573; 6.129.912; documento 97/32607, documento E umento EP 402.378, documento WO 92/16555, doc 04193, documento WO 94/14758, documento WO 94/17039, 94/18247, documento WO 94/28024, documento WO umento WO 95/11924, documento WO95/13090, doc 33490, documento WO 96/00080, documento WO 97/18832, 98/41562, documento WO 98/48837, documento WO umento WO 99/32139, documento WO 99/32140, doc rse en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse cilla, cadena ramificada, cadena de . múltiple ofuncional , bifuncional, multifuncional o cualquier los mismos.

Derivados de PEG y polímero adicionales incluyend itarse a, derivados hidroxilamina (aminooxilo) criben en las siguientes solicitudes de patent orporan todas como referencia en su totalidad en e umento: publicación de patente estadounidense n.2 20 licación de patente estadounidense n.2 20 licación de patente estadounidense n.2 2006/021728 visional estadounidense n.9 60/755.338; patente adounidense n.2 60/755.711; patente provisional est 60/755.018; solicitud de patente internaci /US06/49397; documento WO 2006/069246; patente adounidense n.s 60/743.041; patente provisional est 60/743.040; solicitud de patente internaci contienen cadenas polipeptídicas unidas entre s aces disulfuro, que tienen normalmente dos cadenas cadenas, pesadas. En cada cadena, un dominio (V) uencia de aminoácidos variable dependiendo de la es anticuerpos de la molécula. Los otros dominios (C) uencia bastante constante común para moléculas de se.

Tal como se usa en el presente documento, la parte unoglobulina tiene el significado comúnmente dado al campo de la inmunología. Específicamente, este iere a un fragmento de anticuerpo que se obtiene eli regiones de unión a antígeno (los fragmentos icuerpo. Un modo de eliminar los fragmentos Fab es unoglobulina con la proteasa papaína. Por tanto, la ma a partir de fragmentos de tamaño aproximadamente i ión constante de ambas cadenas pesadas, que se asoci interacciones no covalentes y enlaces disulfuro. L teínas Fe representativas que contienen una región c inios CH2 y CH3 , y un sitio de N-glicosilación se co la técnica.

Hay cinco tipos de regiones Fe de inmunoglobulin diferentes funciones efectoras y propiedades fármac , IgA, IgM, IgD e IgE. IgG es la inmunoglobulina más suero. IgG tiene también la semivida más larga e lquier inmunoglobulina (23 días) . A diferencia iunoglobulinas, IgG se recircula eficazmente tras la eptor de Fe. Hay cuatro subclases de IgG, Gl, G2, G3 de las cuales tiene diferentes funciones efectoras. pueden unirse a CIq y fijar complemento mientras de hacerlo. Aun cuando G3 pude unirse a CIq más efic Gl es más eficaz en la mediación de la lisis célul el complemento. G2 fija complemento de manera muy i io de unión a CIq en IgG se ubica en la región minal del dominio CH2. ne tres funciones efectoras . Se une a un receptor es en macrófagos y eosinófilos, que dirige la fag ranulación, respectivamente. Puede fijar también medio de una ruta alternativa desconocida.

Ig se expresa como o bien un pentámero o bien u éndose ambos entre sí mediante una cadena J. IgM ivida en suero de 5 días. Se une débilmente a CIq po sitio de unión ubicado en su dominio CH3. IgD ivida de 3 días en suero. No está claro qué funcione dén atribuirse a esta Ig. IgE es una Ig monomérica ivida en suero de 2,5 días . IgE se une a dos recept dirigen la degranulación y dan como resultado la li ntes proinflamatorios .

Dependiendo del efecto in vivo deseado, las pr ión heterólogas de la presente invención puede lquiera de los isotipos descritos anteriormente tener regiones Fe mutadas en las que las funciones de manera que inter ccionen a través de enlaces dis forman de manera natural entre regiones Fe. Estos dén ser . homogéneos con respecto al compuesto de bG-CS tener diferentes compuestos de bG-CSF fusionados en erminal de la parte Fe de la proteína de fusión.

Independientemente de la estructura final de la p ión, la región Fe o de tipo Fe puede servir para pr ivida plasmática in vivo del compuesto de bG-CSF fu extremo N-terminal. Además, el componente de bG-puesto de proteína de fusión debe conservar al ividad biológica . de bG-CSF. Puede demostrarse un aum ivida en circulación o terapéutica usando el método presente documento o conocido en la técnica, en ivida de la proteína de fusión se . compara con la se puesto de bG-CSF. solo. La actividad biológ erminarse mediante métodos in vitro e in vivo conoc nica. indica que el sitio catabólico es distinto de licados en la unión a receptor de Fe o CIq. [Wawr , (1992) Molecular ' Immunology 29:221]. Estudios' de ígida al sitio usando una región Fe de IgGl murina el sitio de la región Fe de IgGl que control abólica se ubica en el punto de contacto del domini dén modificarse regiones Fe en el sitio catab imizar la semivida de las proteínas de fusión. La da para las proteínas de fusión de la presente inve ivarse de una región Fe de IgG o IgGl, y puede con regiones CH2 como CH3 incluyendo la región de bisagr teínas de fusión de albúmina heterólogas Puede fusionarse bG-CSF descrito en el presente ectamente o por medio de un ligador peptídico, polím agua o ligador de profármaco a albúmina o un análogo, derivado de la misma. Generalmente, las proteínas d ghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747, cada les se incorpora como referencia al presente documen crito una variedad de variantes polimórficas así co fragmentos de albúmina. [Véase Weitkamp, et al., ( . Genet. 37:219]. Por ejemplo, en el documento E ersas formas más cortas de HSA. Algunos de estos fr se dan a conocer, incluyendo HSA(l-373), HSA(l-38 ), HSA(l-369) y HSA (1-419) y fragmentos entre 1-36 documento EP 399.666 da a conocer fragmentos de al luyen HSA (1-177) y HSA (1-200) y fragmentos entre SA (1-200) .

Se entiende que las proteínas de fusión heteról sente invención incluyen compuestos de bG-CSF piados a cualquier proteína de albúmina incluyendo logos y derivados en los que tal proteína de lógicamente activa y tiene una semivida plasmática el compuesto de bG-CSF solo. Por tanto, no es neces servativas en el compuesto de bG-CSF y/o la part úmina de la proteína de fusión. Una '"sustitución co el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido qu ma carga electrónica neta y aproximadamente el mism ma. Los aminoácidos con cadenas laterales de fáticas sustituidas o alifáticas tienen aproxima mo tamaño cuando el número total de carbonos y hete cadenas laterales difiere en no más de aproximadame nen aproximadamente la misma forma cuando el iificaciones en sus cadenas laterales difiere en no m considera que aminoácidos con grupos fenilo sus ilo en sus cadenas laterales tienen aproximadament año y forma. Excepto a menos que se indique específi trario en el presente documento, preferiblemente tituciones conservativas con aminoácidos que se p era natural .

Pueden obtenerse proteínas de inmunoglobulina y a chemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc . . USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Nati. 79:7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298: rison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol . 2:239-25 erencias que dan a conocer secuencias ele ADN y p úmina incluyen Meloun, et al. (1975) FEBS Lette rens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et leic Acids Research 9:6102-6114; y Minghetti, et al. l. Chem. 261:6747. acterización de las proteínas de fusión heterólo sente invención Existen numerosos métodos para caracterizar las p ión de la presente invención. Algunos de est luyen, pero no se limitan a: SDS-PAGE acoplada con ción de proteínas o inmunotransferencia usando i-IgG o anti-HSA. Otros métodos incluyen espectr ipéptidos bG-CSF en suero. En algunas realizaciones, ionan moléculas a polipéptidos bG-CSF de la inve enciar la afinidad por albúmina sérica endógena en un Por ejemplo, en algunos casos, se hace u ombinante de un polipéptido bG-CSF y una secuencia úmina. Las secuencias de unión a albúmina a modo luyen, pero no se limitan a, el dominio de unión a prote na G de estreptococos (véanse, por ejemplo, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) y Sjola Immunol Methods 201: 115-123 (1997)), o péptidos úmina tales como los descritos en, por ejemplo, Denn Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

En otras realizaciones, los polipéptidos bG-C sente invención se acilan con ácidos grasos . El alg ácidos grasos promueven la unión a albúmina sérica. mplo, Kurtzhals, et al, Biochem. J. 312:725-731 (1995 En otras realizaciones, los polipéptidos bG-C La invención incluye polipéptidos bG-CSF que incorp aminoácidos no codificados de manera natural iduos de sacárido. Los residuos de sacárido pueden urales {incluyendo pero sin limitarse a, N-acetilgluc naturales (incluyendo pero sin limitarse a, 3-fluoro sacáridos pueden unirse a los aminoácidos no codi era natural o bien mediante un enlace glicosídico un O {incluyendo pero sin limitarse a, N-acetilgalactos ien un enlace no natural (incluyendo pero sin limita ma o el correspondiente glicósido unido en C o en S) .

Los restos de sacárido (incluyendo pero sin li cosilo) pueden añadirse a polipéptidos bG-CSF o bien n in vi tro. En algunas realizaciones de la inv ipéptido bG-CSF que comprende un aminoácido no cod era natural que contiene carbonilo se modifica con ivatizado con un grupo aminooxilo para generar el cosilado correspondiente unido mediante un enlace ructura definida preparado como un derivado de amin erto habitual en la técnica reconocerá que pueden us cionalidades , incluyendo azida, alquino, hidrazida, icarbazida, para unir el sacárido al aminoácido no manera natural .

En algunas realizaciones de la invención, un poli que comprende un aminoácido no codificado de mane contiene azida o alquinilo puede modificarse iante, incluyendo pero sin limitarse a, una r loadición [3+2] de Huisgen con, incluyendo pero sin derivados de alquinilo o azida, respectivamente. E mite que las proteínas se modifiquen con una s remadamente alta.

Dimeros y multímeros de bG-CSF La presente invención también proporciona binaciones de análogos de bG-CSF tales como h tímeros de bG-CSF pueden presentar propiedades eables, incluyendo pero sin limitarse a semivida ulada, farmacodinámica, farmacocinética, fa érente, o semivida plasmática modulada en relación monomérico. En algunas realizaciones, los dímeros de invención modularán la transducción de señales del r SF . En otras realizaciones, los dímeros o multímeros la presente invención actuarán como antagonista, ulador del receptor.

En algunas realizaciones, una o más de las molécu presentes en un dímero o multímero que conti prende(n) un aminoácido no codificado de manera natur polímero soluble en agua.

En algunas realizaciones, los polipéptidos bG-CS ectamente, incluyendo pero sin limitarse a, por m ace amida Asn-Lys o enlace disulfuro Cys-Cys. lizaciones, los polipéptidos bG-CSF y/o la molécula tiene cetona pueden conjugarse con un segundo polip prende un aminoácido no codificado de manera n tiene hidroxilamina y los polipéptidos se hacen reac io de la formación de la correspondiente oxima.

Alternativamente, los dos polipéptidos bG-CSF écula que no es bG-CSF unida, se unen por medio de de usarse cualquier ligador hetero u homobifuncional dos moléculas, y/o las moléculas que no son bG-CSF dén tener una secuencia primaria igual o diferente. os, el ligador usado para mantener el bG-CSF, y/o la no son bG-CSF unidas entre sí puede ser un react uncional . El ligador puede tener un amplio in gitud molecular o peso molecular. Pueden usarse ?? o molecular mayor o menor para proporcionar una conf ación espacial deseada entre bG-CSF y la entidad uni CSF y su receptor, o entre la entidad unida y su ón, si hay alguna. También pueden usarse ligadores imero; y b) al menos un segundo grupo funcional en remo de la estructura principal de polímero. El seg cional puede ser igual o diferente que el pri cional. El segundo grupo funcional, en algunas rea es reactivo con el primer grupo funcional . La porciona, en algunas realizaciones, compuestos solubl comprenden al menos un brazo de una estructura ificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramifi dendrítica.

En algunas realizaciones, la invención proporciona comprenden uno o más polipéptidos bG-CSF, formado cciones con polímeros activados solubles en agua que ructura : CH2CH20)n-0-(CH2)m-X la que n es de desde aproximadamente 5 hasta 3.000, uede ser una azida, un alquino, una hidrazina, una grupo aminooxilo, una hidroxilamina, un acetilo, o u na, ' aminooxilo, amina protegida, hidrazida, tegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido tegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vi iopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, nas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alqueno y ceto Medición de la actividad del polipéptido bG-CSF y CSF por un receptor Puede determinarse la actividad del polipéptido bG ayos in vi tro o in vivo convencionales o conocid lizarse polipéptidos bG-CSF para determinar su lógica mediante métodos convencionales conocidos en es ensayos incluyen, pero no se limitan a, los de ari efc al . Veterinary Immunology and Immunopathol 45-57 y ensayos que evalúan las actividades biológi .

Pueden analizarse polipéptidos bG-CSF para dét erenciación de células mediante polipéptidos bG-ención.

Pueden analizarse polipéptidos bG-CSF para dét acidad para unirse a un receptor. Puede prepararse u G-CSF usando técnicas y métodos que conoce un expert la técnica. El receptor de hG-CSF puede prepararse t cribe en la patente estadounidense n.a 5.574.13 orpora como referencia al presente documento . Po dén usarse células o líneas celulares que actúan resp o se unen a G-CSF (incluyendo pero sin limitarse contienen receptores de G-CSF activos tales co ductoras de receptores de G-CSF recombinantes ) para unión a receptor de bG-CSF. Para un polipéptido ilado o pegilado que comprende un aminoácido no n nidad de bG-CSF por su receptor o por otro recepto de medirse usando un biosensor BIAcore™ (Pharm ayos de unión adecuados incluyen, pero no se limitan ptoras se llevan en proximidad estrecha mediante in eculares que se producen cuando cada una se une a un receptor, respectivamente. Puede competirse eracción ligando-receptor usando variantes de unión ntras que las variantes que no se unen no competirán.

Puede determinarse la actividad del polipéptido bG ayos in vitro o in vivo convencionales o cono mplo, pueden usarse células o líneas celulares que presencia de hG-CSF o se unen a hG-CSF (incluyend itarse a, células que contienen receptores de G-C es como células de médula ósea de ratón, WEHI-3B (D CC) , o células productoras de receptores ombinantes) para monitorizar la unión a receptor se, por ejemplo, King et al., Exp. Hematol. 20:2 ente estadounidense n.s 6.385.505, que se incor erencia al presente documento. Los modelos animales o los ensayos clínicos en seres humanos para somete timidina tritiada para determinar el grado d ular. Sin embargo, pueden usarse otros ensayos bioló erminar la actividad deseada. Ensayos biológicos eter a ensayo para determinar la capacidad pa erenciación terminal en la línea celular leucémica W ratón, también proporcionan indicación de la activ . Véase Nicola, et al. Blood 54: 614-27 (1979). Pue os ensayos in vitro para determinar la actividad se Nicola, Ann. Rev. Biochem. 58: 45-77 (1989). En eba para determinar la actividad biológica debe prop lisis para determinar el resultado deseado, tal como na disminución en la actividad biológica (en compara no alterado) , actividad biológica diferente (en G-CSF no alterado) , análisis de afinidad por pareja eptor, cambios estructurales o conformacionales del o su receptor (en comparación con el bG-CSF modi lisis de la semivida en suero. ara de los reactivos mediante filtración en gel y er intercambio iónico. La actividad específica del ural es de aproximadamente 100 µCi/µg de proteína.

La compilación anterior de referencias para metod ayo no es exhaustiva, los expertos habituales en onocerán otros ensayos útiles para someter a p erminar el resultado final deseado. Los expertos ha técnica conocen alteraciones a tales ensayos.

I Medición de la potencia, la semivida in vivo ámetros farmacocinéticos Un aspecto importante de . la invención es l lógica prolongada que se obtiene mediante la const ipéptido b-GCSF con o sin conjugación del polipépt to de polímero soluble en agua. La rápida disminuci inistración de las concentraciones séricas del poli ha hecho que sea importante para evaluar las medición de la semivida in vivo de hG-CSF o variante describe en la patente estadounidense n.2 5.824.7 orpora como referencia al presente documento. La med ivida biológica in vivo se lleva a cabo tal como se presente documento.

La potencia y la semivida funcional in vivo de un CSF que comprende un aminoácido no codificado de man de determinarse según el protocolo descrito en la adounidenses n.e 6.646.110; 6.555.660; 6.166.183; 24.778; 5.773.581, que se incorporan como ref sente documento. Estos protocolos pueden usarse ta CSF.

Los parámetros farmacocinéticos para un polipépt comprende un aminoácido no codificado de manera nat luarse en ratas macho Sprague-Dawley normales " (N=5 a po de tratamiento) . Los animales recibirán o bien is de 25 ug/rata i.v. o bien 50 ug/rata s.c, y s era natural pueden compararse directamente con enidos para polipéptidos bG-CSF que comprenden un ami ificado de manera natural.

Pueden realizarse estudios farmacocinéticos de p CSF en ratones, ratas o en un primate, por ejem omolgus. Normalmente, se administra una única inyecc vía subcutánea o bien por vía intravenosa, y se niveles séricos de bG-CSF a lo largo del tiempo. adounidense n.2 5.849.883 y el documento WO 89/109 orporan como referencia al presente documento, descri élos animales que pueden usarse para evaluar los p CSF de la invención. Los estudios con animales lizarse implican ganado expuesto a Pasteurella ado con exposición bacteriana de la glándula mamaria mastitis {Klebsiella pneu oniae) . Otros estudios lizarse evalúan el control, la incidencia y la dura ermedad respiratoria bovina, o la prevención de la m incluyen cerdos en crecimiento. Algunos de estos criben en la patente estadounidense n.2 5.849. umento WO 89/10932. Los expertos habituales en ocen modelos tales como estos.

Se describen ejemplos adicionales de ensayos para 1 la actividad biológica in vivo de hG-CSF o variantes las patentes estadounidenses n.os 5.681.720; 24.778; 5.985.265; y en Bowen et al, Experimental 425-432 (1999), incorporándose cada una de las c erencia al presente documento.

. Administración de las composiciones farmacéuticas Los polipeptidos o proteínas de la invención (incl limitarse a, bG-CSF, sintetasas, proteínas que comp ás aminoácidos no naturales, etc.) se emplean op a usos terapéuticos, incluyendo pero sin limita binación con un vehículo farmacéuticamente adecú la administración de los polipéptidos de la inve posiciones pueden estar en una forma soluble en agua sentes como sales farmacéuticamente aceptables, lo ir que incluyen sales de adición tanto de ácidos como patente estadounidense n.2 6.497.869, que se inco erencia al presente documento, trata de las formulac iinistración de polipéptidos G-CSF, incluyendo itarse a, hG-CSF y bG-CSF. Se trataron sales que es sulfato tales como sulfato de amonio, sulfato fato de magnesio y mezclas de los mismos, así co ponantes tales como acetato, citrato, fosfato, H S, EPPS, TES y mezclas de los mismos.

Las composiciones terapéuticas que comprenden ipéptidos de la invención se someten a prueba opcio o más modelos animales de enfermedad apropiados in vivo, para confirmar la eficacia, el metabolismo tis imar las dosificaciones, según métodos conocidos ipéptido bG-CSF modificado para incluir uno o más naturales con un tratamiento con bG-CSF disponi ualidad) , es decir, en un ensayo relevante.

La administración se realiza mediante cualquiera d das normalmente para introducir una molécula en conta las células tisulares o sanguíneas. Los polip noácidos no naturales de la invención se admi lquier manera adecuada, opcionalmente con uno o más macéuticamente aceptables. Se dispone de métodos ad inistración de tales polipéptidos en el contexto de 1 ención a un paciente y, aunque puede usarse más de u inistrar una composición particular, a menudo ticular puede proporcionar una acción o reacción más ás eficaz que otra vía.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se det te por la composición particular que está administrá o por el método particular- usado para admin ecciones o infusiones. Las composiciones de polipépt inistrarse mediante varias vías incluyendo, pero sin edios orales, intravenosos, intraperitoneales , intra nsdérmicos, subcutáneos, tópicos, su ravasculares, intramainarios o rectales. Las composi prenden polipéptidos de aminoácidos no naturales, mo modificados, también pueden administrarse por osomas . Tales vías de administración y formulaciones eralmente las conocen los expertos en la té ipéptido bG-CSF puede usarse solo o en combinación ponentes adecuados tales como un vehículo farmac ipéptido bG-CSF puede usarse en combinación con otros puestos terapéuticos .

El polipéptido bG-CSF que comprende un aminoácido o o en combinación con otros componentes adecuado de prepararse en formulaciones en aerosol (es dec bulizarse") para administrarse por medio de inhal osas, que pueden contener antioxidantes, teriostáticos y solutos que hacen que la formu tónica con la sangre del receptor previsto, y s ériles acuosas y no acuosas que pueden incluir pensión, solubilizantes , agentes espesantes, estábil servantes . Las formulaciones de bG-CSF pueden pres ipientes sellados de dosis unitarias o de múltip es como ampollas y viales.

La administración parenteral y la administración los métodos de administración preferidos . En parti s de administración ya en uso para los agentes t ólogos de aminoácidos naturales (incluyendo pero sin los usados normalmente para EPO, GH, G-CSF, GM erleucinas, anticuerpos, FGFs3 y/o cualquier otr inistrada farmacéuticamente) , junto con las formul actual, proporcionan las vías de administración y feridas para los polipeptidos de la invención. . erficial del animal que va a tratarse. El tamaño d i ién viene determinado por la existencia, naturaleza lquier efecto secundario adverso que acompa inistración de un vector, formulación particular, o un animal particular.

En la determinación de la cantidad eficaz del v mulación que va administrarse en el tratamiento o la la enfermedad, el veterinario evalúa los niveles culantes, las toxicidades de la formulación, la evol ermedad y/o si es relevante, la producción de anticu ipéptido con aminoácidos no naturales.

La dosis administrada normalmente está en el ivalente a las dosificaciones de proteínas terapéuti ualmente, ajustadas para la actividad alterada o la ro de la composición relevante. Los vectores o fo macéuticas de esta invención pueden complementar con tamiento mediante cualquier terapia convencional diversas concentraciones, incluyendo pero sin li ndo se aplica a la salud global y masa del inistracion puede llevarse a cabo por medio de dosi ididas .

Si un animal que se somete a infusión de una arrolla fiebre, escalofríos o dolores musculares, pu dosis apropiada de aspirina, ibuprofeno, paraceta maco de control del dolor/fiebre apropiado para ani males que experimentan reacciones a la infusión bre, dolores musculares y escalofríos se medican pre utos antes de las infusiones futuras, o bien con acetamol, o bien incluyendo pero sin lim enhidramina u otro fármaco apropiado para anima rse meperidina para los dolores musculares y los graves que no responden rápidamente a antip ihistamínicos . La infusión de células se ralen errumpe dependiendo de la gravedad de la reacción. lingual) , vaginal, parenteral (incluyendo pero sin li cutánea, intramuscular, intradérmica, intr rapleural, intraperitoneal , intracerebral, intraa ravenosa) , tópica (es decir, tanto superficies cut osas, incluyendo superficies de las vías resp monar, intraocular, intranasal y transdérmica, aun adecuada en cualquier caso dado dependerá de la na gravedad del estado que está tratándose. La adm de ser o bien local o bien sistémica. Las formul puestos pueden presentarse en recipientes sellados tarias o múltiples dosis, tales como ampollas y v ipéptidos bG-CSF de la invención pueden preparar cla en una forma inyectable de dosificación cluyendo pero sin limitarse a, disolución, sus lsión) con un vehículo farmacéuticamente acept ipéptidos bG-CSF de la invención también pueden a iante infusión continua (usando, incluyendo pero si esantes, estabilizadores y conservantes. Las diso pensiones pueden prepararse a partir de comprimidos, vos estériles del tipo descrito anteriormente.

La liofilización es una técnica comúnmente emp sentar proteínas que sirve para eliminar el ag paración de proteínas de interés. La liofilización, congelación, es un proceso mediante el cual el mater secarse se congela primero y luego se elimina el ado o congelado mediante sublimación en un entorn de incluirse un excipiente en las formulaciones l viamente para aumentar la estabilidad durante el ado por congelación y/o para mejorar estabilidad de filizado en almacenamiento. Pikal, M. Biopharm. 90) y Arakawa et al. Pharm. Res. 8 ( ): 285-291 (1991).

Los expertos habituales en la técnica también ado por pulverización de productos farmacéuticos. Po se Broadhead, J. et al., wThe Spray Drying of Pharma olución de alimentación en una pulverización; b) tacto con aire la pulverización; c) secar la pulver separar el producto seco del aire de secado. La adounidenses n.os 6.235.710 y 6.001.800, que se inco erencia al presente documento, describen la prep tropoyetina recombinante mediante secado por pulveriz Las composiciones y formulaciones farmacéutic ención pueden comprender un vehículo, exci abilizador farmacéuticamente aceptable. Los macéuticamente aceptables se determinan en part posición particular que está administrándose, así c odo particular usado para administrar la compos siguiente, hay una amplia variedad de formulaciones composiciones farmacéuticas (incluyendo vehículos, estabilizadores farmacéuticamente aceptables opciona sente invención {véase, por ejemplo, Remington's Pha ences, 17* ed. 1985) ) . limitarse a, polivinilpirrolidona; aminoácidos inclu limitarse a, glicina, glutamina, asparagina, tidina o derivados de histidina/ metionina, glutamato osacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, o sin limitarse a, trehalosa, sacarosa, glucosa, trinas; agentes quelantes incluyendo pero sin limitar dentato disódico; iones metálicos divalentes inclu limitarse a, zinc, cobalto o cobre; alcoholes luyendo pero sin limitarse a, manitol o sorbitol; forman sales incluyendo pero sin limitarse a, sodio sodio; cargas tales como celulosa microcristalina idón de maíz y otros almidones; agentes de unión; e otros agentes saborizantes; agentes coloran sioactivos no iónicos incluyendo pero sin limitars cluyendo pero sin limitarse' a, Tween 80 (polisorb en 20 (polisorbato 20) , Pluronics™ y otros ácidos luyendo pero sin limitarse a, ácido plurónico F68 ( ndotte, Mich.) y se describen adicionalmente en adounidense n.2 4.820.352 incorporada en el presente su totalidad como referencia. Otros polímeros de leno/polipropileno pueden ser tensioactivos adecua rse un tensioactivo o una combinación de tensioac abilizar bG-CSF pegilado frente a una o más luyendo pero sin limitarse una tensión que r tación. Algunos de los anteriores pueden denominars carga" . Algunos pueden denominarse también "modifica icidad" . También pueden aplicarse conservantes anti a la eficacia antimicrobiana y estabilidad del pro servantes adecuados incluyen pero sin limitarse cílico, cloruro de benzalconio, il/propilparabeno, cresol y fenol, o una combinaci mos . La patente estadounidense n.e 7.144.574, que s o referencia al presente documento, describe cionales que pueden ser adecuados en las compo limitarse a, películas o microcápsulas . Las m eración sostenida incluyen desde materiales bio es como poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer med. Mater. Res,, 15: 267-277 (1981).; Langer, Chem, 105 (1982), acetato de etilenvinilo '(Langer et eriormente) o poli (ácido D- {- ) -3-hidroxibutírico) . (d .988), polilactidas (poli (ácido láctico)) adounidense n.2 3.773.919; documento EP 58.481), po límero de ácido glicólico) , poli (lactida-co polímeros de ácido láctico y ácido glicólico) , poli olímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutam al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(or ipéptidos, ácido hialuronico, colágeno, sulfato de c dos carboxílieos, ácidos grasos, fosfolípidos , pol dos nucleicos, poliaminoácidos , aminoácidos t ilalanina, tirosina, isoleucina, polin ivinilpropileno, polivinilpirrolidona y sílic onesa 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4. 44.545; y documento EP 102.324. Todas las refe entes citadas se incorporan como referencia al umento .

Los polipéptidos bG-CSF atrapados en liposom pararse mediante métodos descritos en, por ej umento DE 3.218.121; Eppstein et al, Proc . Nati. .A., 82: 3688-3692 (1985) ; Hwang et al, Proc. Nati .A., 77: 4030-4034 (1980) ; documentos EP 52.322; ente estadounidense n.s 4.619.794; documento EP ente estadounidense n.s 5.021.234; solicitud d onesa 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4. 44.545; y documento EP 102.324. La composición y el liposomas se conocen bien o un experto habitual en de determinarlos fácilmente de manera empírica mplos de liposomas se describen en, por ejemplo, P Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995) ; presente documento. Se han descrito varias formulado y las conocen los expertos habituales en la técnica.

La dosis administrada a un animal en .el conte sente invención debe ser suficiente para producir un eficiosa en el sujeto a lo largo del tiempo. Genera tidad farmacéuticamente eficaz total del polipéptido presente invención administrada por vía parenteral á en el intervalo de aproximadamente 0,01 roximadamente 100 µg kg/ o de aproximadamente 0,0 oximadamente 1 mg/kg, de peso corporal del animal, ende del criterio terapéutico. La frecuencia de la d ibién depende del criterio terapéutico y puede ser má menos frecuente que los productos de polipépti ponibles comercialmente aprobados para su uso en eralmente, un polipéptido bG-CSF pegilado de la inve inistrarse mediante cualquiera de las vías de adm critas anteriormente. ección. Los polipéptidos bG-CSF de la presente inven inistrarse a animales que tienen una infección. Las pueden tratarse con polipéptidos bG-CSF de la luyen pero sin limitarse a, mastitis y fiebre de e realización de la presente invención, se aditi ipéptido bG-CSF pegilado de la presente invención a re dos semanas y un día antes del parto. En una rea presente invención, se administra un polipépti ilado de la presente invención a un animal entre dos día antes del parto, y adicionalmente se administra parto o hasta una semana tras el parto. En una rea presente invención, se administra un polipéptido bG sente invención a un animal entre dos semanas y un parto. En una realización de la presente inv inistra un polipéptido bG-CSF de la presente inve mal entre dos semanas y un día antes del cionalmente se administra en el día del parto o ipéptido bG-CSF de la presente invención a un animal ana y un día antes del parto. En una realización de ención, se administra un polipéptido bG-CSF de l ención a un animal entre una semana y un día antes d cionalmente se administra en el día del parto o ana tras el parto.

En una realización de la presente invención, se ad ipéptido bG-CSF de la presente invención a un animal anas antes y el día del embarque. En una realiza sente invención, se administra un polipéptido bG-sente invención a un animal entre una semana y un dí arque. En una realización de la presente inv inistra un polipéptido bG-CSF de la presente inve mal entre una semana y un día antes del e cionalmente se administra en el día de embarque o ana tras el embarque.

En una realización de la presente invención, se ad administra en el día del parto. En una realizac sente invención, se administra un polipéptido bG-sente invención a un animal siete días antes del par lización de la presente invención, se administra un CSF de la presente invención a un animal una semana to, y adicionalmente se administra en el día del par semana tras el parto. En una realización de l ención, se administra un polipéptido bG-CSF de l ención a un animal una semana antes del parto, y adi administra en el día del parto. En una realizac sente invención, se administra un polipéptido bG-sente invención a una vaca antes de o en el día del venir la enfermedad en el ternero. En una realiza sente invención, se administra , un polipéptido bG-CS la presente invención a una vaca antes de o en el dí a prevenir la enfermedad en el ternero. En una real presente invención, se administra un polipéptido bG 1; .0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0/26; 0,27; 0,28; 0,29; 0 2; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0 3; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; o 0,50 µg/ lización, el polipeptido bG-CSF pegilado de la ención se administra en una dosis de 0,01; 0,02; 0 5; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0 6; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 7; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31 ; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 8; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 9; o 0,50 g/kg. En una realización, el polipéptido presente invención está pegilado y se administra en 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0 1; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 2; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 3; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 4; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; O 0,50 µg k - is de 0,01 µg/kg. En una realización, el polipépt ilado de la presente invención se administra en un 1 g/kg.

En una realización, el polipéptido bG-CSF de l ención se administra en una dosis de 0,1; 0,2; 0,3; ; 0,7; 0,8; o 1,0 µg kg. En una realización, el poli pegilado de la presente invención se administra en 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; o 1,0 µg/ lización, el polipéptido bG-CSF de la presente inve ilado y se administra en una dosis de 0,1; 0,2; 0,3; ; 0,7; 0,8; o 1,0 µg/kg. En una realización, el poli pegilado de la presente invención está pegil inistra* en una dosis de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; ,0 µg/kg. En vina realización, el polipéptido bG-sehte invención se administra en una dosis de 0,1 µg lización, el polipéptido bG-CSF pegilado de l lización, el polipéptido bG-CSF de la presente in inistra en una dosis de 0,4 g/kg. En una reali ipéptido bG-CSF pegilado de la presente invención se una dosis de 0,4 µg/kg. En una realización, el poli de la presente invención se administra en una do kg. En una realización, el polipéptido bG-CSF pegi sente invención se administra en una dosis de 0,5 µg/ En una realización, el polipéptido bG-CSF de l ención se administra en una dosis de 1, 2, 3, 4, 5, 6 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2 27, *28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, l 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 3 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 g kg. En una reali ipéptido bG-CSF pegilado de la presente invención se lización, el polipéptido bG-CSF pegilado de la ención se administra en una dosis de 10 µg./kg lización, el polipéptido bG-CSF de la presente in inistra en una dosis de 20 µg/kg. En una reali ipéptido bG-CSF pegilado de la presente invención se una dosis de 20 µ^/]^. En . una realización, el pólip de la presente invención se administra en una d kg. En una realización, el polipéptido bG-CSF pegi sente invención se administra en una dosis de 30 µg/ lización, el polipéptido bG-CSF de la presente in inistra en una dosis de 40 µg/kg. En una reali ipéptido bG-CSF pegilado de la presente invención se una dosis de 40 µg/kg. En una realización, el pólip de la presente invención se administra en una d kg. En una realización, el polipéptido bG-CSF pegi sente invención se administra en una dosis de 50 g ectuosa,' . o bien solos o bien como parte de un ermedad. Las cantidades promedio del bG-CSF pueden v ticular deben basarse en las recomendaciones y la p un veterinario cualificado. La cantidad exacta de stión de preferencia sujeta a factores tales com cto de estado que está tratándose, el estado del á tratándose, así como los otros componentes en la c invención también proporciona la administración de u apéuticamente eficaz de otro principio activo. itual en la técnica puede determinar fácilmente la c a administrarse basándose en la terapia con bG-CSF. la presente invención puede usarse por tanto para es ducción de glóbulos blancos y para corregir l minuidos de glóbulos rojos. Lo más comúnmente, los bulos blancos están disminuidos debido a cáncer, i mioterapia. También pueden tratarse estados que pued neutropenia en animales por lo demás sanos, ta Las composiciones farmacéuticas de la invenci ricarse de una manera convencional .

MPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustra I a limitar, la invención reivindicada, mplo 1 ección del sitio para la incorporación de amin ificados de manera natural en bG-CSF Este ejemplo describe algunos de los muchos co terios posibles para la selección de sitios de incor noácidos no codificados de manera natural en bG-CSF.

Se generó un modelo teórico de GCSF bovino ructura cristalina de GCSF humano unido a receptor 2D9Q) . Las coordenadas para esta estructura de G n disponibles del Banco de Datos de Proteínas (PDB) rófobo con o sin carga. No se seleccionaron para su iduos que pueden ser estructuralmente relevantes , o sin limitarse a, glicinas, prolinas y residuos im ocupación de extremos helicoidales . Tampoco se se a su sustitución residuos en las regiones de unión ocidas. La posición 123 (Asp) y 141 {Thr) de SEQ dén ser críticas para la interacción con un re ición 7 (Arg) puede ser crítica para el plega ipéptido. La posición 133 (Thr) es el sitio de gl do en 0 en el G-CSF humano.

En algunas realizaciones, uno o más amino ificados de manera natural se incorporan en una o uientes posiciones en bG-CSF: antes de la posición 1 el extremo N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,. 22, 23, 24, 25, 2 30, 31, 32, 33, 34, 35,. 36, 37, 38, 39, 40, 41, 4 46, 47, 48, 49, -50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5 , 173, 174, 175 {es decir, en el extremo carboxilo t proteína) , y cualquier combinación de las mismas (SE los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: noácidos correspondientes en otro polipéptido bG-CSF) .

En algunas realizaciones, uno o más amino ificados de manera natural se incorporan en una o uientes posiciones de bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, , y cualquier combinación de las mismas de SEQ ID N noácidos correspondientes en SEQ ID NO : 2. E lizaciones, uno o más aminoácidos no codificados ural se incorporan en una o más de las siguientes po CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, , y cualquier combinación de las mismas (SEQ ID N noácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2) . E lizaciones, uno o más aminoácidos no codificados ural se incorporan en una o más de las siguientes po 1 o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 2) . lizaciones, uno o más aminoácidos no codificados ural se incorporan en la posición 133 de bG-CSF (SEQ aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 2) . lizaciones, el polipéptido de la invención comprende tituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos na unas realizaciones, se incorporan uno o más amin urales en una secuencia líder o señal que es N o C t pecto a SEQ ID NO: 1, 2, u otra secuencia de bG-CSF.

En algunas realizaciones, los aminoácidos que no s manera natural en una o más de estas posiciones se imero soluble en agua, incluyendo pero sin limita iciones: antes de .la posición 1 (es decir, en el inal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5.9, 60, 61, 6 decir, en el extremo carboxilo terminal de la pr lquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: noácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2 o los respondientes en otro polipéptido bG-CSF) .

En algunas realizaciones, el aminoácido que no se era natural en una o más de estas posiciones se imero soluble en agua, incluyendo pero sin limita iciones: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, , 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, y binación de las mismas (SEQ ID NO: l o los respondientes en SEQ ID NO: 2) . En algunas realiza noácido que no se produce de manera natural en una as posiciones se une a un polímero soluble en agua, o sin limitarse a, las posiciones: 3, 7, 33, 43, 5 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, y cualquier comb mismas {SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondie NO: 2) . En algunas realizaciones, el aminoácido noácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2). E lizaciones, el aminoácido no codificado de manera ición 62 se une a un polímero soluble en agua (SEQ aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 2) . lizaciones, el aminoácido no codificado de manera nat ición 133 se une a un polímero soluble en agua (SEQ aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 2) . lizaciones, el aminoácido que no se produce de mane la secuencia señal o líder N o C terminal con respec 1, 2, u otra secuencia de bG-CSF se une a un polim agua . mplo 2 nación y expresión de un polipéptido bG-CSF que c noácido no codificado de manera natural y que se pro i.

Este ejemplo detalla la clonación y expresi presente documento, y Heidari et al. Veterinary Immu unopathology (2001) 81:45-57.

El ADNc que codifica para bG-CSF maduro se muestr NO: 3. El polipéptido codificado por esta secuencia o SEQ ID. NO : 1.

El ADNc que codifica para el bG-CSF maduro con una el extremo N terminal se muestra como SEQ ID ipéptido codificado por esta secuencia se muestra c 2.

Se usa un sistema de traducción introducido que co t ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa RS) para expresar bG-CSF que contiene un amin ificado de manera natural. La O-RS aminoacila pref O-ARNt con un aminoácido no codificado de manera nat , el sistema de traducción inserta el aminoácido no manera natural en bG-CSF, en respuesta un codó ificado. Secuencias adecuadas de O-RS y O-ARNt se de Tabla 2: Secuencias de O-RS y O-ARNt.

La transformación de E. coli con plásmidos que co uencia de polinucleótido de bG-CSF modificado noacil ARNt sintetasa/ARNt ortogonales (específic noácido no codificado de manera natural deseado) orporación específica de sitio del aminoácido no cod era natural en el polipéptido bG-CSF. El plásmido usa resión de bG-CSF se muestra como figura 1. El gen trado como ejemplo es bG-CSF con un codón selector ( mplaza al codón que codifica para T 133. El polip a-acetilfenilalanina en la posición 133 se denom 3pAF. Plpp - promotor constitutivo de E. coli; Pro ías en tándem de ARNt para prolina de E. coli; Fl 3 ias en tándem de un ARNt para tirosina de Me naschii modificado del documento WO 2007/021297; E9 irosil ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii del 2006/068802; T7 pro - promotor de T7; terminador de tilfenilalanina (pAF; pAcF) , que sustituía al ificado de manera natural en una de las siguientes R7, E33, H43, Q58, S62 , Q67, L69, L99, D123, L124, 1 y R166 (los números de posición se refieren a SEQ sto que cada uno de los polipéptidos b-GCSF mutantes lan cada uno una metionina en el extremo N terminal ID NO: 2 para la secuencia de tipo natural del G- l'a metionina en el extremo N terminal) , los polip F expresados tenían sustituciones de aminoácidos no el número de posición +1 (por ejemplo, un mutant cina en la posición 4 de SEQ ID NO: 2 sustituida por verificación de la secuencia, se transformaron los p ulas W3110 B2, y se hicieron crecer las colonias en. icilina. La información de la línea celular de stra como figura 2. Estas colonias se usaron para in LB con una dilución 1 : 1000 de cultivos de ampicili ieron crecer a 37 SC hasta una D.O.600 =0,8. Entonces he. A la mañana siguiente, se añadió 4X tampón de m vitrogen, Carlsbad, CA) , se calentaron las muestras ante 5 minutos, y se añadió 10X agente reductor d vitrogen, Carlsbad, CA) . Entonces se resolvieron la iante SDS-PAGE en geles en gradiente al 4-12% ( lsbad, CA) en tampón MES y se visualizaron usando S eStain (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La figura 3 m stras generadas a partir de cultivos de tipo natural bG-CSF tras el análisis en geles en gradiente a ción con Coomassie. ubilizacion de la preparación de cuerpos de inclusión Se resúspendió la pasta celular mezclando hasta u sólidos final del 10% en tampón I de cuerpos de incl 2C (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Trito 4SC) . Se lisaron las células haciendo pasar e uspendido a través de un microfluidizador un tot volumen de tampón II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 4eC) . Tras la resuspensión, se centrifugaron las 000 g durante 15 minutos a 4eC, y se decantó el so onces se resuspendió el sedimento de CI en un vol ipón II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 tomaron alícuotas de CI añadiéndolos en recipientes centrifugaron las muestras a 10.000 g durante 15 minu e decantó el sobrenadante. Entonces los cuerpos de i ubilizaron o se almacenaron -80SC hasta su uso adició ubilización de los cuerpos de inclusión Se solubilizaron los cuerpos de inclusión centración final de entre 10-15 mg/mL en ubilización (Tris 20 mM, pH 8,0; guanidina 8 M; ß-?? ubaron los CI solubilizados a temperatura ambiente c stante durante 1 hora hasta que se solubilizaron com ajustó la concentración de proteínas mediante di ificación Se añadió a las muestras (NH )2S04 sólido centración final del 20% con mezclado suave. Se vemente las muestras a 4eC durante 30 minutos. Se se teína precipitada (que contenía bG-CSF) mediante cen 2.000g durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenad uspendió el sedimento en 1/2 volumen de replegamien pH 4,5. No todo el sedimento volvió a la disolu vió a la disolución el bG-CSF. Se sedimentó el m ubilizado mediante centrifugación a 12.000 g d utos . Se decantaron las muestras y se guardó el so filtró el material de bG-CSF a través de un filtro d onces se cargó el material en una columna CM FF {GE ilibrada en tampón A (NaAc 20 mM, pH 4,5). El ma m/S antes de la carga en la columna. Se eluyó el bG umna con un gradiente lineal en 10 volúmenes de col exceso molar de 12:1 o 8:1 de hidroxilamina-bG-CS ubó la mezcla a 28 eC durante 48-72 horas. Entonces s cla 8-10 veces con agua {< 8 m/S) y luego se ca umna de SP HP {GE Healthcare) equilibrada en tampón pH 4,5). Se eluyó el bG-CSF pegilado con un gradie 40 volúmenes de columna hasta el 100% de tampón B { 4,5; NaCl 500 mM) . La figura 5 muestra el análisis fracciones pico a partir de la columna SP HP pa 3pAF pegilado. También puede usarse etilenglicol mplo, en el tampón de elución.

Se agruparon las fracciones de bG-CSF pegil lizaron frente al tampón de formulación de bG-CSF pH 4,0; NaCl 0,565 mM; Tween 20 al 0,0033%; sorbit concentró el material de PEG hasta entre 6-8 mg/mL e esterilizó por filtración usando un filtro PES de acenó la proteína a 42C o se sometió a congelación s acenó a -80=C para almacenamiento prolongado. La ilación y bG-CSF de tipo natural hasta una concentra guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM pH 7,8 y se redujeron a 37 eC durante una hora. Se alquiló la muestra con ante 40 minutos en la oscuridad a temperatura ambi inguió la reacción con la adición de DTT 20 mM. lizo el material en bicarbonato de amonio 100 mM p tó con tripsina 1:50 (proteína : enzima) durante cuat C. A esta reacción le siguió la adición de Glu-C 1 : noche a 252C. Se extinguió la digestión con la adic a obtener una concentración final del 0,1%. Se stra en una columna en fase inversa Grace Vydac C8 un espectrómetro de masas con trampa iónica ThermoF a. El gradiente comenzó en el 98% de fase móvil A {T agua) de manera isocrática durante ocho minuto minuyó hasta el 60% de fase móvil B (TFA al tonitrilo) a lo largo de 90 minutos con detección nm. Se aplicó una velocidad de flujo de 0,2 mL/ CSF de tipo natural, el tiempo de retención del p tiene TÍ33 fue de 42,79 minutos; para bG-CSF T plazó el péptido que contiene Tl33pAF y tuvo un ención de 46,89 minutos .

La figura 8a muestra el digesto de tripsina/Glu-C tipo natural (detección a 250 nm) . La figura 8b esto de tripsina/Glu-C de bG-CSF T133pAF (detección análisis a 250 nm, las señales de proteína/péptido o la señal debida a pAF- es fuerte. El péptido que co se indica en la figura 8b con un tiempo de retenció utos . eo de péptidos (endoproteinasa Glu-0 de bG-CSF) Se diluyó bG-CSF Tl33pAF purificado antes de la ta una concentración final de guanidina-HCl 6 M, Tri y. se redujo con DTT 10 mM a 372C durante una hora. muestra con IAA 20 mM durante 40 minutos en la o agua) de manera isocrática durante ocho minuto minuyó hasta el 60% de fase móvil B (TFA al tonitrilo) a lo largo de 90 minutos con detección nm. Se aplicó una velocidad de flujo de 0,2 mL/ peratura de la columna de 40SC. Se fijó el voltaje c on intervalo de barrido completo de 100-2000 m/z. El isión para EM/EM fue el 42% del normalizado.

La figura 9a muestra el digesto de Glu-C de bG-C ural (detección a 214 nm) . La figura 9b muestra el -C de bG-CSF T133pAF (detección a 214 nm) . Para bG-C ural, el péptido que contiene TI33 tuvo un tiempo d 52,04 minutos; para T133pAF bG-CSF, el péptido qu 3pAF tuvo un tiempo de retención de 53,95 minutos.

La figura 10a muestra el digesto de Glu-C de bG-C ural (detección a 250 nm) . La figura 10b muestra el -C de bG-CSF Tl33pAF (detección a 250 nm) . Con el nm, las señales de la proteína/péptido son baja mulación (acetato de sodio 4,26 mM pH 4,0, clorur 65 mM, Tween-20 al 0,0033% y sorbitol al 5%) y se in en una columna en fase inversa (C8) de octilo de por Baker (4,6 x 100 mm, 5 µ???) . El gradiente comenzó con e móvil A (TFA al 0,1% en agua) y aumentó hasta el 7 il B (TFA al 0,1% en acetonitrilo) a lo largo de 26 eneró la columna con un 90%, de fase móvil B durante reequilibro con un 50% de fase móvil A a lo largo de aplicaron una velocidad de flujo de 1,5 mL/ir peratura de la columna de 60 eC con detección a 2 lizó el análisis ¦ sando el software Agilent Chems la 3 muestra el pico principal (PEG-bG-CSF T133pAF d tiempo de retención de 8,50 minutos. Mediante el cál área, se obtuvo (jue el 91,2% de la muestra ilado .

TABLA También se analizó el bG-CSF que no estaba pegila HPLC. La tabla 4 muestra el pico principal (bG-CSF T tiempo de retención de 8,893 minutos. Mediante el cá área, se obtuvo que el 64,3% de la muestra era bG-CS tiene un 97% de fosfato de sodio 63 mM pH 7,0 y u panol. Se aplicó una velocidad de flujo de 0,3. mL tperatura de la columna de 259C con detección a 2 lizó. el análisis usando el software Agilent Chems la 5 muestra el pico principal con un tiempo de re 57 minutos. Mediante el cálculo del % del área, se 98,3% de la muestra era PEG-bG-CSF monomérico. Véase para el análisis de SEC-HPLC del polipéptido pegilado.

También se analizó el bG-CSF que no estaba pegila -HPLC. La tabla 6 muestra el pico principal con un TABLA 6 Tiempo (minutos) Area Area% 10.4 10.0 0.0 11.1 6.8 0.0 11.7 178.2 0.5 12.6 129.5 0.4 13.1 33514.3 99.0 También se realizó el análisis de ESI-TOF de alta ilent Technology) del polipéptido bG-CSF para co ntidad del polipéptido bG-CSF . Se dializó el bG-C ificado en ácido fórmico al 0,1%. Se aplicó la mué tucho C-18 durante un minuto con agua y luego se tonitrilo al 50% en agua. El tiempo de ejecución to s minutos con una velocidad de flujo de 0,3 mL/min. taje capilar ESI a 4 kV, y se fijó el voltaje del f OF a 300 V. Se llevó a cabo la deconvolución de la 8) . Se descongelaron las células y se mantuvieron en BS al 10% + penicilina / estreptomicina + 2-mercapt + mIL-3 20 ng/mL (Invitrogen, Carlsbad, CA; m rmingen n.2 de catálogo 554579). Se dividieron las c días y se sembraron a 0,02x10s células/mL.

El día antes del ensayo, se dividieron las cél xlO6 células/mL. Tras 16-24 horas, se sembraron las io de ensayo en placas negras, de fondo plano, de 96 0.000 células/pocilio y se añadieron por duplicado serie de los compuestos de bG-CSF. El volumen total de 100 µ?,, y el medio de ensayo fue RP I 1640 + FB . También se añadieron patrones por duplicado, pogen® ' y bG-CSF de tipo natural, para cada placa. E ubaron las placas a 372C, C02 al 5% durante 42 horas, ubación de 42 horas, se añadieron 10 uL/pocillo de osource n.- de catálogo: DALI IOO) y se incubaron ante otras 6 horas a 372G, C02 al 5%. Entonces se ce cularon los valores de CE50 en SigmaPlot. Se enum ores de CE50 sin procesar para todos los compue cularon las diferencias en veces (se compararon coi F bovino pegilado con bG-CSF de tipo natural) . Los e realizaron múltiples veces para establecer un CV ayo <20% y un CV entre ensayos <30%. Figura 13 /tabla proliferación con -NFS60 - valores de CE50 sin proc T133pAF bovino pegilado. de 20K y de tipo natur tabla 8 = Ensayo de proliferación con -NFS60 - dife 0 en veces de G-CSF Tl33pAF bovino pegilado de 20K o natural.

Se sometieron a ensayo otras moléculas de prenden una sustitución de aminoácido no codificado ural . La tabla 9 muestra los valores de CE50 enidos .

·' TABLA 7 ción con CDllb de neutrofilos bovinos Se añadieron 50 ul -de sangre bovina a una pí illos de poliestireno no tratada (Cal . Poli Po imularon las células añadiendo 50 ul de Neupogen®, N CSF-Tl33pAcF-20K PEG diluido en PBS {.de 200 ng/ml a 0 al) . Se mezcló suavemente la disolución y se incubó utos a 392C en un incubador de C02. Se añadieron.2 icuerpo primario a las células (CDllb de ratón a 2A, VMRD) . Se incubaron las células a 4SC durante 3 centrifugó la placa de ensayo a 800xg durante 2 min echó el sobrenadante. Se lisaron los eritrocitos uto añadiendo 150 ul de disolución de lisis frío (fo pH 1,2), y se restauró la isotonicidad añadiendo olución de restauración (fosfato 0,15 M, NaCl 0,5 M centrifugó de nuevo la placa, y se desechó el sobre itió el procedimiento de lisis hasta que se elimin trumento FACS Array de BD para adquirir 50.000 evento células positivas para CDllb.

La figura 15 muestra los resultados del experimento tiñeron neutrófilos bovinos con anticuerpo CDllb pa capacidad de respuesta a diversas moléculas . S ensidad media de fluorescencia {IMF) para granulo erminar el nivel de presentación de CDllb presenta erficie celular. El % de IMF es un valor norm ación con un grupo control no estimulado. Se genera respuesta a la dosis y valores de CE50 para Neupogen G-CSF Tl33pAF-20K PEG basándose en un ajuste de 4 valor de CE50 para Neupogen® fue de 3,18 ng/ml. Para valor de CE50 fue de 2,84 ng/ml, y para bG-CSF T133p valor de CE50 fue de 6,23 ng/ml. mplo 3 roducción de un aminoácido que contiene carbonilo 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 3 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,, 6 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 8 86, 87, 88, 89, 90,. 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, , 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, , 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, , 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, , 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, , 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (es de remo carboxilo terminal de la proteína) , y binación de los mismos (SEQ ID NO: 1 o los respondientes en SEQ ID NO: 2 o los respondientes en otro polipeptido bG-CSF) por un am ificado de manera natural que tiene la siguiente estr ) , y SEQ ID NO: 23 ó 5 (mutfRNA, M. jannaschii mtRNAtr NO: 22, 24, 17, 18, 19 (TyrRS LWI, 5 ó 6) descri mplo 2 anterior.

Una vez modificado, se hace reaccionar la a ipéptido bG-CSF que comprende el aminoácido que bonilo con un derivado de PEG que contiene aminoo ma : R-PEG(N) -O- {CH2)n-0-NH2 en la que R es metilo, n es 3 y N es aproximadament Se hace reaccionar el b-GCSF que contiene p-acetilf ificado disuelto a 10 mg/mL en MES 25 mM (Sigma Che is, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Lou , o en acetato de sodio 10 mM (Sigma Chemical, St. 4,5, con un exceso de 10 a 100 veces de PEG qu nooxilo, y luego se agita durante 10 - 16 horas a iente (Jencks, W. J Am. Chem. Soc. 1959, 81, onces se diluye el PEG-b-GCSF en un tampón apropia EG(N) -0- <CH2)2-NH-C{0) (CH2)n -0-NH2 la que R = metilo, n=4 y N es aproximadamente 20.000 diciones de reacción, purificación y análisis son t cribe en el ejemplo 3. mplo 5 roducción de dos aminoácidos no codificados de mane tintos en polipéptidos bG-CSF Este ejemplo demuestra un método para la genera ipéptido bG-CSF que incorpora un aminoácido no cod era natural que comprende una funcionalidad ceto iciones entre los siguientes residuos: antes de la decir, en el extremo N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 3 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 5 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 7 minal de la proteína) , y cualquier combinación de Q ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ aminoácidos correspondientes en otro polipéptido b para el polipéptido bG-CSF tal como se describe en l 2, excepto porque se introduce el codón selector en tintos dentro del ácido nucleico. mplo 6 jugación del polipéptido bG-CSF con un PEG qu razida y posterior reducción xn si tu Se prepara un polipéptido bG-CSF que incorpora un contiene carbonilo según el procedimiento descri mplos 2 y 3. pna vez modificado, se conjuga un PEG q razida que tiene la siguiente estructura con el poli : hidrazona correspondiente in situ mediante la adición de reserva (Sigma Chemical, St. Louis, MO) , se disue ta una concentración final de 10-50 iti . Se llevan cciones en la oscuridad a 4SC a TA durante 18-24 ienen las reacciones mediante la adición de Tris mical, St. Louis, MO) a aproximadamente pH 7,6 centración final de Tris de 50 m o se diluyen en opiado para la purificación inmediata. mplo 7 roducción de un aminoácido que contiene alqui ipéptido bG-CSF y derivatizacion con mPEG-azida Se sustituye cada uno de los siguientes residuos, ición 1 (es decir, en el extremo N terminal), 1, 2, 3 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2 25, 26, ,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 3 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 , 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (es decir, en boxilo terminal de la proteína) , y cualquier combina mos {SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondientes 2 o los aminoácidos correspondientes en otro pólip ) , por el siguiente aminoácido no codificado de maner Las secuencias utilizadas para la incorporación es io de p-propargil-tirosina en bG-CSF son SEQ ID NO: NO: 5 (muttRNA, M. jannaschii mtRNA tryCÜA ) , y critas en el ejemplo 2 anterior. El polipéptido tiene la propargil tirosina se expresa en E. coli y ndo las condiciones descritas en el ejemplo 3. ravés ele una membrana de diálisis. Puede analizarse a la adición, incluyendo pero sin limitarse a, cedimientos similares descritos en el ejemplo 3.

En este ejemplo, el PEG tendrá la siguiente estruct EG (N) -0- {CH2 ) 2-NH-C {0) (CH2 ) n-N3 la que R es metilo, n es 4 y N es 10.000 de PM. mplo 8 titución de un aminoácido hidrófobo grande en un CSF por propargil tirosina Se sustituye un residuo de Phe, Trp o Tyr presente las siguientes regiones de bG-CSF: antes de la posi ir, en el extremo N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,. 38, 39, 4 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,. 53, 54, 55, 5 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 1 minal de la proteína) , y cualquier combinación de Q ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ aminoácidos correspondientes en otro polipéptido b siguiente aminoácido no codificado de manera natura describe en el ejemplo 7: Una vez modificado, se une un PEG a la v ipéptido bG-CSF que comprende el aminoácido qu uiño. El PEG tendrá la siguiente estructura: Me-PEG (N) -0- (CH2)2-N3 y le seguirían procedimientos de acoplamiento co mplo 7. Esto generará un variante de polipéptido prende un aminoácido no codificado de manera natu oximadamente isostérico con uno de los aminoácidos ndes que se producen de manera natural y que se modi ivado de PEG en un sitio distinto dentro del polipépt la que n es 4 y el PEG tiene un PM promedio de apro OO, para generar el homodímero de polipépti respondiente en el que las dos moléculas de bG aradas físicamente por PEG. De una' manera anál plarse un polipéptido bG-CSF a uno o más de otros p a formar heterodímeros, homomultímeros o heteromult plamiento, la purificación y los análisis se realizar ejemplos 7 y 3. mplo 10 plamiento de un resto de sacárido a un polipéptido bG Se sustituye un residuo de los siguientes por el codificado de manera natural a continuación: an ición 1 (es decir, en el extremo N terminal), 1, 2, 3 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 3 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 , 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 {es decir, en boxilo terminal de la proteína) , y cualquier combinac mos (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondientes 2 o los aminoácidos correspondientes en otro pólip ) tal como se describe en el ejemplo 3.

Una vez modificado, se hace reaccionar la v ipéptido bG-CSF que comprende el aminoácido qu bonilo con un análogo de aminooxilo unido en tilglucosamina (GlcNAc) . Se mezclan la variante de mplo 11 eración de un antagonista de polipéptido bG-CSF pegil Se sustituye un residuo, incluyendo pero sin limit licados en la unión al receptor de bG-CSF por el noácido no codificado de manera natural tal como se ejemplo 3.

Una vez modificado, se hará reaccionar la v ipéptido bG-CSF que comprende el aminoácido qu bonilo con un derivado de PEG que contiene aminoo ma : mplo 12 eración de un homodímero, heterodímero, homomu eromultímero de polipeptido bG-CSF en el que las mo CSF se unen directamente Una variante de polipeptido bG-CSF que coi noácido que contiene alquino puede acoplarse dire a variante de polipéptido bG-CSF que comprende el contiene azida. De una manera análoga, un polipépt de acoplarse a uno o más de otros polipéptidos p erodímeros, homomultímeros o heteromultímeros.

El acoplamiento, la purificación y los análisis s o en los ejemplos 3# 6 y 7. mplo 13 -OH + Br-(CH2)n -C=CR ? PEG-O- (CH2) n-C=CR > A B üilo es un alquilo saturado o insaturado de C malmente, PEG-OH es polietilenglicol (PEG) o ietilenglicol (mPEG) que tiene un peso molecular 000 Daltons (Da) . mplo 14 G-OH + Br-CH2 -C=CH ? mPEG-0-CH2C=CH Se trató mPEG-OH con un peso molecular de 20.000 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) con NaH (12 mg, 0,5 mm mL) . Entonces se añadieron una disolución de pargilo, disuelto como una disolución al 80% en peso 56 mL, 5 mmol, 50 equiv. , Aldrich) , y una cantidad KI a la disolución y se calentó la mezcla result lujo durante 2 horas. Entonces se añadió agua (1 minó el disolvente a vacío. Se añadió al residuo CH2 a fase orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 an u o el volumen hasta aproximadamente 2 mL. »Esta dis (35 mL) . Entonces se .añadieron a la mezcla ivalentes de 5-bromo-l-penteno (0,53 mL, 5 mmol, Aldr tidad catalítica dé KI . Se calentó la mezcla result lujo durante 16 horas. Entonces se añadió agua (1 minó el disolvente a vacío. Se añadió al residuo CH2 a fase orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 an ujo el volumen hasta aproximadamente 2 mL. Esta dis Cl2 se añadió a dietil éter (150 mL) gota a gota. Se cipitado . resultante, se lavó con varias partes de d o, y se secó para dar el alquino correspondiente. Pu loro-l-penteno en una reacción similar. mplo 16 ducción de mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-Cl CH m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br- CH2-C=CH -> m-HOCH2C6H40-CH2 m-HOCH2C6H40-CH2-C=CH + sCl + N(Et) 3 - OT-MsOCH2C6H40- m-MsOCH2C6H40-CH2-C=CH + LiBr ?m-Br-CH2C6H40-CH2-C= CH rajo el residuo con acetato de etilo (3 x 15 mL) y fases orgánicas combinadas con disolución saturada d , se secaron sobre MgS04 y se concentraron para dar ropargiloxibencílico .

Se añadieron cloruro de metanosulfonilo (2,5 g, 15 etilamina (2,8 mL, 20 mmol) a una disolución del c 0 g, 11,0 mmol) en CH2C12 a 09C y se colocó la reac era durante 16 horas. Un tratamiento final habitu ilato como un aceite amarillo pálido. Se disolvió e 4 g, 9,2 mmol) en THF (20 mL) y se añadió LiBr (2 l) . Se calentó la mezcla de reacción hasta reflujo a y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Se a ela agua {2,5 mL) y se eliminó el disolvente a rajo el residuo con acetato de etilo (3 x 15 mL) y fases orgánicas combinadas con disolución saturada , se secaron sobre Na2S0 anhidro y se concentraron muro deseado. dió al residuo (¾<¾ (25 mL) y la fase orgánica se ó sobre Na2S04 anhidro y se redujo el volu oximadamente 2 mL. La adición gota a gota a una dis r (150 mL) dio como resultado un precipitado blan ogió para dar el derivado de PEG. mplo 17 G-NH2 + X-C (O) - (CH2)n-C=CR' ? mPEG-NH-C (O) (CH2)n-C=CR' Los polímeros de poli (etilenglicol) que contien minal también pueden obtenerse acoplando un po i (etilenglicol) que contiene un grupo funcional term écula reactiva que contiene la funcionalidad alquino mostró anteriormente, n es entre 1 y 10. R' puede po alquilo pequeño desde Cl hasta C4. mplo 18 ducción de mPEG-NH-C (O) - (CH2 ) 2-C=CH Se disolvió mPEG-NH2 con un peso molecular de 5.000 , 1 g, Sunbio) en THF (50 mL) y se enfrió la mezcla añadió éster de HS 7 (400 mg, .0,4 mmol) en por tación vigorosa. Se permitió que la mezcla se agitar as mientras se calentaba hasta temperatura ambiente añadió agua (2 mL) y se eliminó el disolvente a dió al residuo CH2C12 (50 mL) y la fase orgánica se ó sobre Na2S04 anhidro y se redujo el volu oximadamente 2 mL. Esta disolución de CH2C12 se aña 0 mL) gota a gota. Se recogió el precipitado resulta acío . mplo 19 paración de metanosulfonato o mesilato de poliíetilen Este ejemplo representa la preparación . del anosulfonilo de poli (etilenglicol) , que tamb ominarse metanosulfonato o mesilato de poliíetileng a a gota 1,2 mL de cloruro de metanosulfonilo des l) . Se agitó la disolución a temperatura amb rógeno durante la noche, y se extinguió la reacción de etanol absoluto. Se evaporó la mezcla a vacío pa disolventes, principalmente los distintos de t tró, se concentró de nuevo a vacío y luego se preci de dietil éter. Se lavó el filtrado con varias parte r frío y secó a vacío para dar el mesilato.

Se disolvió el mesilato (20 g, 8 mmol) en 75 mi d rió la disolución hasta 2C. A la disolución enfr dió azida de sodio (1,56 g, 24 mmol) . Se calentó ta reflujo bajo nitrógeno durante 2 horas. E poraron los disolventes y se diluyó el residuo con . Se lavó la fracción orgánica con disolución de NaC re MgS0 anhidro. Se redujo el volumen hasta 20 cipitó el producto mediante adición a 150 mi de éter anosulfonilo (2,5 g, 15,7 mmol) y triétilamina (2 l) a una disolución de alcohol 4-azidobencílico (1, l) en CH2C12 a 02C y se colocó la reacción en la nev horas . Un tratamiento final habitual dio el mesila ite amarillo pálido. Se disolvió este aceite (9,2 mm mL) y se añadió LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). Se calentó reacción hasta reflujo durante 1 hora y luego se en peratura ambiente. Se añadió a la mezcla agua (2,5 minó el disolvente a vacío. Se extrajo el residuo c etilo (3 x 15 mL) y se lavaron las fases orgánicas disolución saturada de NaCl (10 mL) , se secaron s idro y se concentraron para dar el bromuro deseado G-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) con NaH (12 mg, THF (35 mL) y se añadió el bromuro (3,32 g, 15 ela junto con una cantidad catalítica de KI . Se -ela resultante hasta reflujo durante 12 horas. Se a 0 mL) a la mezcla y se eliminó el disolvente a vacío. -PEG-0-CH2CH2C02H + N3-CH2CH2C02- HS ? N3 -CH2CH2-C( CH2C02H Se disolvió NH2-PEG-0-CH2CH2C02H (PM 3.400 Da, 2,0 olución acuosa saturada de NaHC03 (10 mL) y se olución hasta 02C. Se añadió propionato de 3 roxisuccinimido (5 equiv. ) con agitación vigoros as, se añadieron 20 mL de H20 y se agitó la mezcla utos adicionales a temperatura ambiente. Se ajustó H2S0 0,5 N y Se añadió NaCl a una concen oximadamente el 15% en peso. Se extrajo la mezcla CH2C12 (100. mL x 3), se secó sobre Na2S04 y se conc precipitación con dietil éter frío, se recogió e iante filtración y se secó a vacío para dar el deri ga-carboxi-azida . mplo 22 G-O s + HC=CLi ? mPEG-0-CH2-CH2-C=C-H concentración ele aproximadamente el 15% en peso. Se ela de reacción con CH2C12 (100 mL x 3), se secó sob concentró. Tras la precipitación con dietil éter ogió el producto mediante filtración y se secó a vací but-3-iniloxi) -metoxipolietilenglicol (mPEG) . mplo 23 orporación de aminoácidos que contienen azida y aceti Pueden incorporarse aminoácidos que contienen tileno de manera selectiva de sitio en proteínas odos descritos en L. Wang, et al., (2001), Science 2 . Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Ch 02), Journal of the American Chemical Society 124:90 Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11): W. Chin, et al., (2002), PNAS United States 11020-11024: y L. Wang, & P, G. Schultz, (2002), C 1-11. Una vez incorporados los aminoácidos, se lleva La pAF racémica se sintetiza usando el procedimient eriormente en Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., , C, Se Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735- Para sintetizar el derivado de m-PEG-hidroxil pletan los siguientes procedimientos. A una disolució t-Boc-aminooxi) acético (0,382 g, 2,0 mmol) sopropilcarbodiimida (0,16 mL, 1,0 mmol) en diclorom mL) , que se agita a temperatura ambiente (TA) duran le añaden metoxi-polietilenglicol-amina (m-PEG-NH2, 7 1, Mt. 30 K, de BioVectra) y diisopropiletilamina (0 l) . Se agita la reacción a TA durante 48 horas, centra hasta aproximadamente 100 mL. Se añade gota ela a éter frío (800 mL) . Se precipita el producto t-Boc y se recoge mediante filtración y se lava me 100 mL. Se purifica adicionalmente redisolviendo e y precipitando en éter (800 mL) dos veces. Se seca acío dando 7,2 g (96%) , confirmado mediante RM y la 97%) mediante filtración, se lava con éter 3 x 100 acío, se almacena bajo nitrógeno. Se sintetizan otro PEG (5K, 20K) hidroxilamina usando el mismo procedimi mplo 25 ividad in vitro e in vivo de bG-CSF pegiládo Se administra a ratones o ratas PEG-bG-CSF, ificado y disolución tampón. Los resultados mo ividad superior y la semivida prolongada del bG-CSF presente invención en comparación con bG-CSF no mod se indica por las cantidades significativamente au trófilos y por un cambio en el recuento de glóbul I imo utilizando la misma dosis por ratón. lisis farmacocinético Se administra un polipéptido bG-CSF de la invenci s intravenosas o subcutáneas a ratones . Se extrae sa es de y en puntos de tiempo tras la dosificación. Se sma de cada muestra. y se analiza mediante radioinmuno Los polipéptidos de la invención pueden administ elo animal de enfermedad. Los estudios con animales lizarse implican ganado expuesto a Pasteurella ado con exposición bacteriana de la glándula mamaria/ mastitis {Klebsiella pneumoniae) . Otros estudios c lizarse evalúan el control, la incidencia y la dura ermedad respiratoria bovina, o la prevención de la ma iformes. Un experto habitual en la técnica conoce mé luar la salud de los animales,, la producción de uento de neutrófilos y otros parámetros . Otros m den usarse para evaluar los polipéptidos bG-CSF de l luyen pero sin limitarse a, modelos animales de i osición a infección tales como un modelo de hámster Pseudomonas aeruginosa, un modelo de rata de pielone dida albicans, modelos que incluyen potros neonatales uspenden en un medio de crecimiento. Se coloca una a µ? que contiene aproximadamente 10.000 células en c una placa de microtitulación de 96 pocilios. Se aña ilio muestras del análogo de G-CSF purificado (ta paró anteriormente), y se incuban durante 68 horas, idita tritiada a los pocilios y se deja incubar dur as adicionales. Tras el tiempo de incubación de ci células se recogen, se filtran y se enjuagan metic añaden filtros a un vial que contiene líquido de ce ntan las emisiones beta (contador de centelleo LKB analizan patrones y análogos por triplicado y se eter a ensayo las muestras que están sustancialmente or debajo de la curva patrón con la dilución apr ifican los resultados como el promedio de los da logos por triplicado con respecto a los resultados bG-CSF no alterado.

Se somete a ensayo la inducción de proliferación cas de 96 pocilios de fondo plano a 372C en C02 al ante 2 días. Se someten a ensayo las muestras por d concentración variaba a lo largo de un intervalo es. Entonces se pulsan los cultivos durante 4 µ??/pocilio de 3 H-timidina {New England Nuclea s.). Se mide la captación de 3H-timidina tal como se uta, et al., Blood, 61, 781 (1983).

Inducción de diferenciación de WEHI-3B D+. Se some capacidad de los polipéptidos bG-CSF de la presente a inducir la diferenciación de la línea celular d lomonocítica murina WEHI-3B D+ en medio de agar semi o se describe en Metcalf, Int. J. Cáncer, 25, 225 uban el producto de bG-CSF recombinante y control ios con aproximadamente 60 células WEHI-3B DVpocillo al 5% en aire durante 7 días. Se incuban las muestra 24 pocilios de fondo plano y la concentración va go de un intervalo de 2000 veces. Se clasifican la od, 61, 250 (1983)] usando células de médula ose sidad, no adherentes de voluntarios humanos san rse células de otras fuentes. Se realiza una compara ividades biológicas de CFU-GM, BFU-E y CFU-GEMM dades de polipéptidos o bien bG-CSF o bien G-ención.

Se realizan ensayos con colonias con células de baja densidad no adherentes. Se someten células de ana a un gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque 77 g/cm3; Pharmacia) . Entonces se resuspenden las a densidad en medio de Dulbecco modificado de tiene suero bovino fetal y se colocan para dét erencia en placas de cultivo tisular Falcon (n.a 30 kinson, Cockeysville, Md.) durante 1 1/2 horas a 372C El control del medio consiste en medio de Dulbecco Iscove más FCS al 10%, hemina 0,2 mM y 1 tropoyetina recombinante. Para el ensayo de CFU-GM, Para los ensayos con BFU-E y CFU-GEMM, se añaden lO5) a 1 mi de mezcla de medio de Dulbecco modificad bco) , metilcelulosa al 0,8%, suero bovino fetal a captoetanol 0,05 nM, hemina 0,2 mM y 1 unidad de eri ombinante. Se incuban las placas en una atmósfera h C02 al 5% y 02 al 5%. Se obtiene una baja tensión ndo un dispositivo Oxireducer de Reming Bio racuse, N.Y.). Se puntúan las colonias tras 1 ubación. Se determina el número de colonias como , tal como se determina a partir de placas por duplic Se espera que todas las colonias formadas en el -GM sean positivas para cloroacetato esterasa y neg erasa no específica (alfa-naftil-acetato esterasa cuerda con que las colonias sean de tipo granulo era que tanto G-CSF de tipo natural como los polip de la invención tengan una actividad específi teína pura de aproximadamente lxlO8 U/mg, cuando s Medición de la semivida in . vivo de bG-CSF conju jugado y variantes del mismo. Se usan ratas Spra o (de aproximadamente 7 semanas de edad) . En inistración, se mide el peso de cada animal. Se inyec kg de peso corporal de las muestras de bG-CSF conj jugado por v a intravenosa en la vena dé la cola de t minuto, 30 minutos, 1, 2, 4, 6 y 24 horas tras la extraen 500 µ? de sangre de cada rata mientras se man stesia de C02. Se almacenan las muestras de sangre a iente durante 1,5 horas seguido por aislamiento iante centrifugación (42C, 18000xg durante 5 mi acenan las muestras de suero a -80SC hasta el día del cuantifica la cantidad de bG-CSF activo en las m ro mediante el ensayo de actividad de bG-CSF in congelar las muestras en hielo.

Medición de la actividad biológica in vivo en rata CSF con u ado no con u ado varian e l mi m En el día de administración, se mantienen las rata ante 16 horas seguido por la inyección subcutánea de de peso corporal de bG-CSF o una variante del mismo. a muestra de bG-CSF en un grupo de 6 ratas aleator raen muestras de sangre de 300 µ? de sangre estábi ? de la vena de la cola de las ratas antes de la dosi las 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 y 144 hora ificación. Se analizan las muestras de sangre para siguientes parámetros hematológicos : hemoglobina, r bulos rojos, hematocrito, volumen celular medio, co hemoglobina celular media, hemoglobina celular . media glóbulos blancos, . recuento diferencial de utrófilos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, tiendo de la base de estas mediciones, se evalúa l lógica de bG-CSF conjugado y no conjugado y var mo. 24 horas antes de la administración de las muest , se inyecta a las ratas por vía i.p. 50 mg por poral de ciclofosfamida (CPA) para inducir neutrope meja a la neutropenia que resulta de la qu icancerígena . En el día 0 , se inyectan 100 g por poral de bG-CSF o una variante del mismo por ví ecta cada muestra de bG-CSF en un grupo de atorizadas. Se extraen muestras de sangre de 300 µ? abilizada con EDTA de la vena de la cola de las rata dosificación y a las 6 , 12 , 24 , 36 , 48 , 72 , 96 , 120 s la dosificación. Se analizan las muestras de s erminar los siguientes parámetros hematológicos : uento de glóbulos rojos, hematocrito, volumen celu centración de hemoglobina celular media, hemoglobi ia, recuento de glóbulos blancos, recuento dife cocitos (neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, ocitos . Partiendo de la base de estas mediciones Se produjo bG-CSF recombinante que contenía titución de pAF en la posición T133 (bG-CSF Tl33pAF-2 coli. Esta proteína tenía una metionina N terminal ( y la treonina en la posición 134 de la SEQ ID tituyó por para-acetilfenilalanina. Se pegiló la prot io de incorporación de pAF usando oxiamino-PEG de 2 ificó mediante cromatografía de líquidos de iónico hasta una pureza >98%. La formulación fina 77 mg/ml de bG-CSF pegilado en tampón de formulación NaAc 4,26 mM; sorbitol al 5%; Tween 20 al 0,0033%; pH 4,0.

Se adquirieron novillos cruzados ingleses comerci to de Europa que pesaban aproximadamente 150 nsportaron a las instalaciones de investigación en ntificaron individualmente con etiquetas en las or imataron durante 7 días antes de su inclusión en el administraron antibióticos ni vacunas a los anímal ral . Se asignaron doce animales o bien a grupos tr trol negativo (tampón de formulación sin pro males/tratamiento) . Se asignaron aleatoriamente los bloques y a los tratamientos dentro de los bloques .

En el día -1, un veterinario evaluó a los ter erminar signos clínicos de enfermedad. Las e luyeron la frecuencia.de pulso, la frecuencia resp temperaturas rectales, así como el estado g erminaron los pesos corporales y las temperaturas re ogieron muestras de sangre anti-coagulada para las e atológicas (muestra antes del tratamiento) . Se se animales dentro del intervalo de peso especi files hematológicos normales basándose en los int erencia de la bibliografía y sin signos clínicos de a su inclusión en el estudio'.

En el día 0, se trató a los terneros ó bien con ección subcutánea de bG-CSF Tl33pAF pegilado (40 µg uentos absolutos de leucocitos se determinaron lizador de sangre ACT10™ de Beckman Coulter. Los olutos de neutrofilos (RAN) se determinaron me luación citométrica de flujo de los porcentajes de muestras de sangre completa teñidas con CD45 analizador FACSarray™ de Becton Dickinson. Los olutos de. neutrofilos se calcularon multiplicando e oluto de leucocitos por el porcentaje de neutrofilos.

¦Además de las muestras antes del tratamiento recog -1, se recogieron muestras a las 4, 8 y 12 horas en y 36 horas tras el tratamiento, y una vez al día e 4.

Los resultados de la administración de bG-CSF pegi RAN se presentan en la figura 16. Los animales tr pón de formulación soló mostraron valores de RAN re stantes durante toda la duración del estudio. Por el animales que recibieron bG-CSF pegilado mostraron ima del nivel antes del tratamiento desde el día 1 14.

Estos resultados indican pegilación específica d CSF en la posición T133, lo que permitió obtener u ividad hematopoyética que persistió durante al anas en los terneros tratados con una única in teína . mplo 27 íante pegilada de bG-CSF T-133 umen del estudio hematológico Se realizó un estudio in vivo para evaluar el imp íante bG-CSF-T133pAF 0K PEG sobre las respuestas he ganado .

Se produjo bG-CSF recombinante que contenía titución de pAF en la posición T133 en E. coli. Se teína en el sitio de incorporación de pAF usando o n'tificaron individualmente con etiquetas en las o imataron durante 7 días antes de su inclusión en el administraron antibióticos ni vacunas a los anímal periodos de adquisición o aclimatación. No se ad icamentos concomitantes a los animales durante el e jó a los animales en corrales con suelos ranurados se expusieron a la temperatura ambiente. Se alime males una vez al día a voluntad con una ración co nulos (Rumilab® 5508) .

El estudio se realizó usando un diseño en bloque atorizados en el que los terneros se asignaban a ral. Se asignaron doce animales o bien a grupos tr trol negativo (tampón de formulación sin pro males/tratamiento) . Se asignaron aleatoriamente los bloques y a los tratamientos dentro de los bloques.

En el día -1, un veterinario evaluó a los ter erminar signos clínicos de enfermedad. Las e erencia de la bibliografía y sin signos clínicos de a su inclusión en el estudio.

En el día 0, se. trató a los terneros o bien con ección subcutánea de bG-CSF pegilado (40 µg/kg) o pón de formulación (1 mi/125 kg) . Las inyec inistraron en la región preescapular del lado izcj llo .

Se recogieron muestras de sangre completa venosa ( os estériles que contenían o bien EDT lendiaminotetraacético) para los recuentos abs cocitos o bien ACD (ácido - citrato - dextrosa erminación de los recuentos absolutos de neutró uentos absolutos de leucocitos se determinaron lizador de sangre ACT10™ de Beckman Coulter. Los olutos de neutrófilos (RA ) se determinaron me luación citométrica de flujo de los porcentajes de muestras de san re com leta teñid n D4 Los resultados ' de la administración de bG-CSF peg RAN se presentan en la figura 16. Los animales tr pón de formulación solo mostraron valores de RAN re stantes durante toda la duración del estudio. Por el animales que recibieron bG-CSF pegilado mostraron entó en el RAN en el plazo de 8 horas tras el trat ervaron valores máximos de RAN (aproximadamente 10 ima de los niveles antes del tratamiento) a las 72 tratamiento. Los recuentos absolutos de minuyeron hasta aproximadamente de 4 a 5 veces por el antes del tratamiento en el día 5 tras el tra manecieron en este nivel hasta el día 10. L minuyeron adicionalmente hasta aproximadamente 3 , 5 ima del nivel antes del tratamiento desde el día 1 14 (ver figura 17) .

Estos resultados indican pegilación específica d CSF en la posición T133, lo que permitió obtener las reivindicaciones adjuntas. Todas las publ entes , solicitudes de patente y/u otros . documentos a solicitud se incorporan como referencia en su tota os los fines en el mismo grado que si se ividualmente que cada publicación, patente, sol ente y/u otro documento individual se incorpora como a todos los fines . mpio 28 Variante pegilada bG-CSF T-133 Resumen del estudio de eficacia en mastitis Se evaluó la eficacia metafiláctica de la varian 3pAF 20K PEG frente a infecciones intramamarias que s manera natural asociadas con patógenos de mastitis cl modelo de infección de mastitis inducida.

Se produjo bG-CSF recombinante que contenía titución de pAF en la posición T133 en E. coli. Se vacas en el plazo de 30 días antes de su inclu udio. Se alimentaron los animales con una ración a apropiada antes del parto y una ración para nsición comenzando el día del parto y continuando ación del estudio. Se dejó a los animales acceso a a fresca. Se siguieron procedimientos de producción ina y se ordeñaron las vacas dos veces al día.

Se incluyeron vacas sanas en el estudio aproximadai s antes de su fecha de parto anticipada basándo istros de reproducción y una evaluación de su prepa ir por el vaquero. Se asignaron las vacas a tamiento usando un diseño completamente aleatori po de tratamiento contenía aproximadamente cincuenta Se trataron las vacas con o bien solución sali ntrol negativo) , inyecciones diarias (día -7 a día -T133pAF no pegilado o bien diversas dosis de varia 3pAF 20K en el día de inclusión y el día de ifornia en el/los cuarto (s) afectado (s) y se r iperatura rectal del animal. Se hizo la autopsia de mal que muriese durante el transcurso del est erminar la causa de la muerte si era posible.

Se registró la producción de leche en cada ordeño 8, y se recogieron muestras de leche compuestas os en los días 3, 5, 7 y 10 para análisis de composi he incluyendo: recuentos de células somáticas, gra teína láctea, lactosa y sólidos. También se recogier leche adicionales de cuartos que presentaban anomalí a la identificación de patógenos bacterianos.

Se recogieron los porcentajes de nacimientos ?? as de concepción al primer servicio tras la recrí eminación artificial para todas las vacas inclui udio para evaluar el impacto de los tratamientos sob roductora. Se registraron también observaciones dia ud para todos los terneros durante sus primeros 30 d impacto de los diversos tratamientos sobre mastitis clínica y mortalidades se resume en la tabla TABLA 0 cripcíón del Tratamiento Morbilidad Morta fina Estéril (SfPx2 Día - 7 y Día 0) 26/50 (52%) SF T133-DAF (3 nafta. SIDxH, DÁ -7 » D .'<* 6) 16/49 (33%) SF T133-DAF 20K PEG (40 ua/ka. SIDx2, D * -7 & DiaO) 6/53 (11%) SF T133-DAF 20 PEG (20 µa/kq. SIDx24 -7 & D ¾ 0} 7/52 (13%! La administración de dosis diarias de bG-CSF T- ilado redujo significativamente la incidencia ecciones clínicas por mastitis con respecto a los C ución salina. La administración de cualquier dosis 3-pAF 20K PEG redujo significativamente la incidenci ducción de leche fueron similares para vacas trat n solución salina estéril, bG-CSF T133-pAF no peg is inferior de bG-CSF Tl33-pAF 20K PEG . Estos sentaban aumentos en la producción de leche a lo l ación del estudio típicos de los observados normalme primer mes de lactancia. Los animales tratados co erior de bG-CSF T133-pAF 20K PEG presentaban una pr he diaria significativamente reducida en relación co tamientos durante toda la duración del estudio .

El impacto de los tratamientos sobre los recuentos áticas se resume en la figura 19. Animales tratados CSF Tl33-pAF no pegilado o bien bG-CSF T133 pA sentaban recuentos de células somáticas que er ilares a o bien inferiores a los observados en los c ución salina en los días 3, 5 y 7 tras el parto. En s el parto, los recuentos de células somáticas par tados con bG-CSF Tl33-pAF no pegilado o bG-CSF T133 ultados sugieren que la administración de bG-CSF T1 era eficaz para reducir la enfermedad, frente a e terías Gram positivas y Gram negativas.

El impacto de los tratamientos sobre los nacimient tasas de concepción al primer servicio se resumen e No hubo ninguna diferencia significativa en los por imientos vivos entre tratamientos, lo que sugier tamientos experimentales no tenían ningún impacto bilidad de los terneros en el útero. Hubo una mejor las tasas de concepción al primer servicio entr tados con o bien bG-CSF T133-pAF no pegilado o bien 20K PEG y los controles de solución salina. Estos ieren que los tratamientos experimentales no . teñ acto negativo sobre la salud reproductora.

TABLA 11 freimientos Tasas de Descripción del Tratamiento Concepción % Vivos Primer Serv udio se resume en la tabla 12. Estos resultados i guno de los tratamientos experimentales redujo la in ermedad entérica o respiratoria en relación con los solución salina durante los primeros treinta días d argo, tanto bG-CSF Tl33-pAF no pegilado como bG-CS PEG redujeron significativamente el número de mort ación con , los controles de solución salina. Estos ieren que los tratamientos experimentales tenían itivo sobre la gravedad de la enfermedad.

TABLA 12 Incidencia Incidencia de de Enfermedad Enfermedades Descripción del Tratamiento ortali Entérica Respiratorias Salina Estéril (SIDx2 Día - 7 y Día 0) 28 1 G-CSF T133-pAF (3 ig/kg, SIDx14, Di* -7 - D. * 6) 32 1 G-CSF T133-pAF 20K PEG (40 µ?ß, S!Dx2, D.'« -7 & D»'e¡ 0) 30 2 G-CSF T133-pAF 20K PEG (20 SIDx2, D.'c-7 & D«&0) 34 2 ina que se produce de manera natural en condiciones engorde comercial.

Se produce bG-CSF recombinante que contiene titución de pAF en la posición T133 en E. coli. Se teína en el sitio de incorporación de pAF usando o 20 KD y se purifica mediante cromatografía de liquid olución de exclusión molecular. La formulación fina CSF pegilado en tampón de formulación compuesto por bitol al 5% y Tween 20 al 0,0033% a pH 4,0.

Se adquirieron novillos cruzados ingleses comerci to de Europa que pesaban aproximadamente 500 libras terneros de engorde comerciales en uno o más esta este de los Estados Unidos. Tras la llegada al nión, se identifican los animales individualme erinario los examina para detectar anomalías cl istran también las temperaturas rectales y los an án libres de signos clínicos de enfermedad TABLA 13 Tratamiento Régimen de Dosis # de Animales 1) Salina Estéril S1DX1 40 2) bG-CSF-T133 20K PEG (20 g/kg) SIDX1 40 3) bG-CSF-T133 20K PEG (10 fjg/kg) SIDX1 40 4) bG-CSF-T133 20K PEG (5 µ^) S1DX1 40 Se administra solución salina estéril o bG-CSF-T1 mediante inyección subcutánea en la región preesc llo .

La siguiente mañana, se cargan los terneros en ca uentos se usan para confirmar que los anima pondiendo* al tratamiento tal como se demuestra m entó en los números de neutrófilos absolutos. Se atoriamente los terneros en corrales de estudio que eo animales de cada grupo de tratamiento para un t males por corral.

Un veterinario ciego a las asignaciones de erva los terneros diariamente durante 14 días tras a detectar signos clínicos de enfermedad. Cada ani puntuación de enfermedad que oscila desde 0 (san ribundo) . Los animales que presentan puntuaciones de se trasladan a una zona de procesamiento y se r peratura rectal . Los animales que presentan puntú ermedad >0 y temperaturas rectales =104SF se identi bidos y se tratan con un antibiótico aprobado y se corral de estudio. Se registran las identidades de l mueren durante el. transcurso del estudio y se Se entiende que los ejemplos y realizaciones descr sente documento son únicamente para fines ilustrativ expertos habituales en la técnica se les ocurrirá ificaciones o cambios en vista de los mismos y luirse dentro del espíritu y ámbito de esta solicitu las reivindicaciones adjuntas. Todas las pub entes, solicitudes de patente y/u otros documentos a solicitud se incorporan como referencia en su tot os los fines en el mismo grado crue si se ividualmente que cada publicación, patente, so ente y/u otro documento individual se incorpora, como a todos los fines.

LA 14: Secuencias, citadas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Polipéptido bG-CSF que comprende uno o más amin codificados de manera natural. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF una o más modificaciones postradu Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, polipéptido unido a un ligador, polímero o biológicamente activa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 3, polipéptido unido a un polímero soluble en agua. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, polipéptido unido a un polímero bifuncional bifuncional o al menos un polipéptido bG-CSF adicion Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 5, en polímero o ligador bifuncional está unido á Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, en el polímero soluble en agua se une a un aminoácido no de manera natural presente en dicho polipéptido b-GC Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos antes de la posición 1 (es decir, en el terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 8 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, una posición seleccionada del grupo que consis residuos: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 125, 133, 134, .136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, combinación de los mismos de SEQ ID NO: 1 o los correspondientes en SEQ ID NO : 2. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 10, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 134, 141, 166, y cualquier combinación de los mism NO: l o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID N Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 10, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos 3, 7, 62, 133, 166, y cualquier combinac mismos (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondie ID NO: 2) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos antes de la posición 1 (es decir, en el terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5 61, 62, 63, 64, 65, 66., 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 8 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122/ 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,. 149, 150, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 17 combinación de los mismos de SEQ ID NO: l o los correspondientes en SEQ ID NO: 2. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 16, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, -99, 123, 124, 141, 166, y cualquier combinación de los mismos (SE o los aminoácidos . correspondientes en SEQ ID NO: 2). Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 16, en aminoácido no codificado de manera natural está su una posición seleccionada del grupo que consis residuos 3, 7, 62, 133, 166, y cualquier combina mismos (SEQ ID NO: l o los aminoácidos correspondie ID NO: 2,) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 16, en aminoácido no codificado de manera, natural está su la posición 62 (SEQ ID NO: 1 o el aminoácido corr más aminoácidos que modula la afinidad del polipépt por un receptor de bG-CSF. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compre polipéptido bG-CSF sustitución, adición o deleción más aminoácidos que aumenta la estabilidad o solub polipéptido bG-CSF. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF sustitución, adición o deleción más aminoácidos que aumenta la expresión del polip CSF en una célula huésped recombinante o sintetizado Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF sustitución, adición o deleción más aminoácidos que aumenta la resistencia a pro polipéptido bG-CSF. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, en aminoácido no codificado de manera natural es react a un ligador, polímero o molécula biológicamente Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 27, en aminoácido no codificado de manera natural comprend carbonilo . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 28, en aminoácido no codificado de manera natural estructura : en la que n es 0-10; RL es un alquilo, aril sustituido o arilo sustituido; R2 es H, un alqui alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 aminoácido, un polipéptido o un grupo de modif extremo amino terminal, y R4 es H, un amino polipéptido o un grupo de modificación de extremo terminal . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 27, en aminoácido no codificado de manera natural comprend hidrazina . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 27, en residuo de aminoácido no codificado de maner comprende un grupo semicarbazida . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 27, en residuo de aminoácido no codificado de maner comprende un grupo azida. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 34, en aminoácido no codificado de manera natural estructura : en la que n es 0-10; ? es un alquilo, aril Polipéptido bG-CSF s,egún la reivindicación 36, en aminoácido no codificado de manera natural estructura: en la que n es 0-10; R2 es un alquilo, aril sustituido o arilo sustituido; X es O, N, S presente; m es 0-10, R2 es H, un aminoácido, un po un grupo de modificación de extremo amino terminal, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modif extremo carboxilo terminal . Polipéptido bG-CSF según la reivindicació 4, en polímero soluble en agua tiene un peso molecula aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 40, en grupo aminooxilo, hidrazina, hidrazida o semicarbaz al polímero soluble en agua a través de un enlace am Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, que haciendo reaccionar un polímero soluble en agua qu un grupo carbonilo con un polipéptido que co aminoácido no codificado de manera natural que co grupo aminooxilo, un grupo hidrazina, un grupo hidr grupo semicarbazida . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, que haciendo reaccionar un polipéptido bG-CSF que co aminoácido que contiene alquino con un polímero agua que comprende un resto azida.. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, que haciendo reaccionar un polipéptido bG-CSF que, co aminoácido que contiene azida con un polímero solub que comprende un resto alquino. molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproxima kDa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, en . polipéptido es un antagonista de bG-CSF. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 48, en polipéptido comprende una o más modificación postr ligador, polímero o molécula biológicamente activa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 49, en polímero comprende un resto seleccionado de un consiste en un polímero soluble en agua y poli(etile Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 48, en polipéptido impide la activación del receptor de bG-Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, en aminoácido no codificado de manera natural comprend de sacárido. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 3, en ligador, polímero o molécula biológicamente activa codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón únic raro y un codón de cuatro bases. Método de preparación del polipéptido bG-CSF reivindicación 3 , comprendiendo el método poner en polipéptido bG-CSF aislado que comprende un ami codificado de manera natural con un ligador, molécula biológicamente activa que comprende un reacciona con el aminoácido no codificado de manera Método según la reivindicación 56, en el que e comprende un resto seleccionado de un grupo que con polímero soluble en agua y poli (etilenglicol) . Método según la reivindicación 56, en el que el ami codificado de manera natural comprende un grupo ca grupo aminooxilo, un grupo hidrazida, un grupo hid grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alqui Método según la reivindicación 56, en el que el ami codificado de manera natural comprende un resto car Método según la reivindicación 56, en el que el ami codificado de manera natural comprende un resto al ligador, polímero o molécula biológicamente activa un resto azida. Método según la reivindicación 56, en el que el am codificado de manera natural comprende un resto ligador, polímero o molécula biológicamente activa un resto alquino. Método según la reivindicación 58, en el ciue el res alquino se une a un ligador, polímero o biológicamente activa a través de un enlace amida. Método según la reivindicación 57, en el que el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular promedi aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa. Método según la reivindicación 57, en el que el poli (etilenglicol ) es un polímero ramificado o de brazos . cantidad terapéuticamente eficaz de la composició reivindicación 66. Célula que comprende el ácido nucleico según la rei 54. Célula según la reivindicación 69, comprendiendo la ARNt sintetasa ortogonal o un ARNt ortogonal. Método de preparación de un polipéptido bG-CSF que un aminoácido no codificado de manera natural, co el método cultivar células que comprenden un polin polinucleótidos que codifican para un polipéptido comprende un codón selector, una ARN sintetasa orto ARNt ortogonal en condiciones para permitir la exp polipéptido bG-CSF que comprende un aminoácido no de manera natural; y purificar el polipéptido bG-CSF Método de modulación de la semivida en suero o del circulación de un polipéptido bG-CSF, comprendiendo sustituir uno cualquiera o más aminoácidos que se Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 73, en aminoácido no codificado de manera natural se ligador, polímero, polímero soluble en agua o biológicamente activa. i Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 74, en polímero soluble en agua comprende un poli (etilenglicol),. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 73, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos antes de la posición 1 (es decir, en el terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11/ 12, i 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25/26, 27, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 8 cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 76, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, combinación de los mismos de SEQ ID NO: l o los correspondientes en SEQ ID NO: 2. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 76, en aminoácido no codificado de manera natural está sus una posición seleccionada del grupo que consis residuos 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 141, 166, y cualquier combinación de los mismos (SE o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 76, en aminoácido no codificado de manera natural está sus Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 73, en aminoácido no codificado de manera natural está sus la posición 133 (SEQ ID NO: 1 o el aminoácido corr de SEQ ID NO : 2 ) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 73, en aminoácido no codificado de manera natural comprend carbonilo, un grupo aminooxilo, un grupo hidrazida hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida alguino . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 75, en resto de poli (etilenglicol) tiene un peso molecula aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 75, en resto de poli {etilenglicol ) es un polímero ramif múltiples brazos. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 84, en resto de poli (etilenglicol) tiene un peso molecula Polipéptido bG-CSF que comprende un polímero solub unido mediante un enlace covalente al polipéptido b único aminoácido . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 88, en polímero soluble en agua comprende un poli (etilenglicol) . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 88, en aminoácido de forma covalente unido al polímero agua es un aminoácido no codificado de manera natura Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 10, en e aminoácido no. codificado de manera natural se molécula de poli (etilenglicol) . Polipéptido bG-CSF que comprende al menos un ligado o molécula biológicamente activa, en el que dich polímero o molécula biológicamente activa se polipéptido a través de un grupo funcional de un am codificado de manera natural incorporado de manera manera ribosómica en el · polipéptido e preseleccionados . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 94, co el polipéptido bG-CSF uno de dicho ligador, molécula biológicamente activa. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF substitución, adición o deleció más aminoácidos que modula la hematopoyesis en un la administración del polipéptido. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF substitución, adición o deleció más aminoácidos que modula la semivida en suero o e circulación del polipéptido bG-CSF. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 1, compr polipéptido bG-CSF substitución, adición o deleció más aminoácidos que modula la proliferación de los en un animal tras la administración del polipéptido. Polipéptido bG-CSF según la reivindicación .1 , compre polipéptido bG-CSF substitución, adición o deleció más aminoácidos que modula la función de los neutróf animal tras la administración del polipéptido . . Método de tratamiento de un animal con una infecció por bG-CSF que comprende administrar al animal un terapéuticamente eficaz de la composición reivindicación 66. . Polipéptido bG-CSF según la reivindicación 4, en polímero soluble en agua se une a dicho polipéptid un enlace oxima. . Método de prevención de una infección en un i comprende administrar al animal una cantidad terap eficaz de la composición según la reivindicación 66.