RU2554761C1 - Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство - Google Patents
Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство Download PDFInfo
- Publication number
- RU2554761C1 RU2554761C1 RU2014119335/15A RU2014119335A RU2554761C1 RU 2554761 C1 RU2554761 C1 RU 2554761C1 RU 2014119335/15 A RU2014119335/15 A RU 2014119335/15A RU 2014119335 A RU2014119335 A RU 2014119335A RU 2554761 C1 RU2554761 C1 RU 2554761C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- immobilized
- drug
- cells
- interferon alpha
- Prior art date
Links
- 230000001044 anti-enteroviral effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000053 physical method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 claims description 7
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 3
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 48
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 206010014909 Enterovirus infection Diseases 0.000 description 5
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 239000006215 rectal suppository Substances 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- UOMKBIIXHQIERR-UHFFFAOYSA-N cridanimod Chemical compound C1=CC=C2N(CC(=O)O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 UOMKBIIXHQIERR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 108010092851 peginterferon alfa-2b Proteins 0.000 description 2
- 229940106366 pegintron Drugs 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 206010070971 Enteroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000004547 Hallucinations Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000034809 Product contamination Diseases 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960000459 cridanimod Drugs 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940002988 pegasys Drugs 0.000 description 1
- 108010092853 peginterferon alfa-2a Proteins 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство для перорального применения в виде капсул, содержащее интерферон и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества содержит интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, иммобилизированный на полиэтиленгликоле молекулярной массой 1,5 кДа с помощью физического способа связывания потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении. Изобретение обеспечивает расширение арсенала противоэнтеровирусных средств, обладающих иммуностимулирующими свойствами. 6 пр., 10 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, подавляющих размножение энтеровирусов и стимулирующих иммунную систему.
В последние годы в мире наметилась четкая тенденция активизации энтеровирусной инфекции, о чем свидетельствуют постоянно регистрируемые в разных странах эпидемиологические подъемы заболеваемости и вспышки. Энтеровирусная инфекция остается малоконтролируемой в практике здравоохранения и занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, протекающих с поражением ЦНС. Одной из основных особенностей этих инфекций является вирусоносительство, постоянно обусловливающее возникновение спорадических форм и массовых заболеваний, которое, как и заболеваемость, наблюдается не только среди детей младшего и старшего возраста, но и среди взрослых.
В качестве специфической терапии энтеровирусной инфекции применяют: лейкоцитарный интерферон, рекомбинантные интерфероны (виферон, реаферон, роферон), интерфероногены (циклоферон, неовир), иммуноглобулины для внутривенного введения (сандоглобулин, пентаглобин).
Наряду с высокой клинической эффективностью интерферонов (ИФН) при их применении часто наблюдаются побочные эффекты в виде гриппоподобного синдрома, артралгии, депрессивных состояний, диареи, галлюцинаций, кожных высыпаний, аллергии, заболеваний кроветворной системы, выпадения волос [1, 2]. У 30% больных при длительном применении больших доз рекомбинантных интерферонов образовывались нейтрализующие антивирусную активность препарата антитела, что сопровождалось развитием резистентности к рекомбинантным интерферонам [3].
Поэтому актуальной задачей является разработка новых подходов к терапии вирусных, и, в частности, энтеровирусных инфекций с целью уменьшения побочных эффектов. Одним из таких подходов является иммобилизация интерферонов на веществе-матрице, что позволяет уменьшить дозы и частоту введения лекарственных препаратов, защищает ткани от их раздражающего действия. Получил известность способ присоединения молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) к интерферону химическим путем (пегилирование). В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяется два вида пегилированного интерферона:
1. Пегилированный интерферон альфа-2b (ПегИнтрон, фирма «Schering-Plough», США).
2. Пегилированный интерферон альфа-2а (Пегасис, фирма «Roche», Швейцария).
Оба пегилированных интерферона (патент №5951974 USA от 14.09.1999 «Interferon polymer conjugates» - препарат «ПегИнтрон» и патент № ЕР 0809996 В1 от 02.04.2003 «Interferon-alpha polypeptides and conjugates» - препарат «Пегасис») используются для лечения хронического гепатита С. Однако применение пегилированных интерферонов имеет ряд недостатков: парентеральный путь введения препаратов; побочные эффекты в виде повышения температуры тела, слабости, головных болей, артралгий и др.; невозможность точно контролировать концентрацию интерферона в крови, т.к. препарат вводится раз в неделю. Немаловажен тот факт, что стоимость лекарства весьма высока. Кроме того, производство пегилированных препаратов многоэтапное, на некоторых стадиях используются токсические вещества, полная очистка от которых влечет снижение активности препарата, что приводит к увеличению дозировки.
Вместе с тем известна технология иммобилизации белков с помощью ионизирующего излучения, так называемый, физический способ (патент RU №2409669, «Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на носитель (варианты) и конъюгат БАВ-носитель, полученный данными способами», опубл. 27.02.2010). По этому способу в качестве БАВ использовали вещества, выбранные из группы: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронидаза, тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, соматотропин.
Физический способ связывания рекомбинантного интерферона с веществом-матрицей позволит защитить белковую молекулу интерферона от действия протеолитических ферментов и тем самым обеспечит возможность его перорального применения без потери фармакологической активности и терапевтической эффективности.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка препарата интерферона для лечения энтеровирусной инфекции при пероральном способе применения. Использование препарата позволит: 1) адресно доставлять иммобилизированный интерферон непосредственно к вирусинфицированным клеткам слизистой оболочки кишечника; 2) влиять на клетки лимфоидной ткани (макрофаги, нейтрофилы), ассоциированной со слизистой кишечника; 3) снизить дозировку интерферона при однократном его введении; 4) устранить побочные эффекты, характерные для парентерального введения препаратов интерферонов, что обеспечит возможность применения препаратов интерферона не только для лечения взрослых, но и в педиатрической и акушерской практике.
Поставленная задача достигается использованием иммобилизированного интерферона альфа-2b в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства, полученного путем смешивания облученного потоком ускоренных электронов водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ), молекулярной массы 1,5 кДа и раствора интерферона альфа-2b до конечной концентрации 10 мг в 1 мл. Смесь перемешивают до получения опалесцирующего раствора.
Применение полиэтиленгликоля в качестве основы позволяет защитить белковую молекулу интерферона от действия протеолитических ферментов и тем самым обеспечивает возможность его перорального применения. Выход готового продукта составляет 98%, активность препарата не менее 1×106 международных единиц (МЕ)/мл, молекулярная масса не менее 19,5±0,5кДа. Лекарственная форма иммобилизированного интерферона альфа-2b - твердая желатиновая капсула с крышечкой, размера «00».
Состав на 1 капсулу:
Активное вещество:
интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный иммобилизированный - 1000000 МЕ/капс.
Вспомогательные вещества:
| Мальтодекстрин | 75-90% | 0,3-0,36 г |
| Декстран | 8,98-22,45% | 0,03592-0,0898 г |
| Полиэтиленгликоль | 1-2,5% | 0,004-0,01 г |
| ЭДТА | 0,02%-0,05% | 0,08-0,2 мг |
Новым в предлагаемом изобретении является то, что иммобилизированный на ПЭГ интерферон альфа-2b впервые предложен для применения в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства для перорального введения.
Из отечественных препаратов интерферонов применяемых внутрь единственным препаратом является «Реаферон-ЕС-липинт» (прототип) (ЗАО «Вектор-Медика», Новосибирск) - липосомальный препарат интерферона альфа-2b (патент RU №2123328, «Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения», опубл. 20.12.1998). Указанное липосомальное лекарственное средство имеет недостаточный срок хранения (активность интерферона альфа-2 практически на постоянном уровне сохраняется не более 12 месяцев) и при его применении отмечается ряд побочных эффектов: гриппоподобное состояние; тошнота, рвота, поносы; нарушение картины крови и функции печени; головокружение, сонливость; снижение или повышение артериального давления, аритмии.
Сходным действием обладает препарат «Виферон» (ООО «Ферон», Москва) - суппозитории, в состав которых помимо рекомбинантного интерферона альфа-2b входят витамины Е и С (патент RU №2024253, «Ректальные свечи и устройство для введения ректальных свечей в полость организма» опубл. 15.12.1994). Ректальное применение «Виферона» способствует более длительной циркуляции интерферона в крови, чем при внутривенном или внутримышечном введении препаратов рекомбинантных интерферонов. Однако применение ректальных свечей неудобно, негигиенично, интерферон в свечах «Виферон» содержится в небольшой дозировке, использование свечей «Виферон» может приводить к местному раздражению при применении препарата у маленьких детей.
Применение иммобилизированного на ПЭГ интерферона стало возможным благодаря обнаружению у него способности подавлять репликацию энтеровирусов различных штаммов in vitro. Выявлено наличие иммунотропных свойств, а именно стимуляция гуморального иммунного ответа и фагоцитарных реакций при пероральном введении лабораторным животным, а также усиление спонтанной и стимулированной выработки интерлейкина 2 (ИЛ-2) и ИФН-γ без дополнительной стимуляции митогеном при добавлении иммобилизированного интерферона in vitro. Применение иммобилизированного на ПЭГ интерферона для перорального введения в качестве противоэнтеровирусного и иммуностимулирующего средства в литературе не описано и явным образом не вытекает из уровня техники для специалиста. Иммобилизированный интерферон можно будет использовать для применения у больных с энтеровирусной инфекцией, в том числе ассоциированной с иммунной недостаточностью.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Противовирусные свойства иммобилизированного на ПЭГ интерферона альфа-2b были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям. Было проведено изучение противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в отношении вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) и вируса Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15) на культуре клеток RD (рабдомиосаркома человека). Культура клеток RD является адекватной моделью для исследования противовирусной активности интерферона [9]. Для исследования противовирусной активности была использована схема с преинкубацией клеток RD с различными концентрациями рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b (оба производства ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», Новосибирск). Разведения препаратов интерферона на культуральной среде Игла-ДМЕМ добавляли к клеткам культивированным в стандартных 96-луночных культуральных микропланшетах за 6 часов до инфицирования [9].
Результаты, подтверждающие противовирусные свойства иммобилизированного на ПЭГ рекомбинантного интерферона альфа-2b.
Пример 1. При добавлении рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b in vitro исследуемые препараты не оказывали токсического воздействия на культуру клеток RD во всем диапазоне используемых концентраций (разведения 1:30-1:93750). Инфицирование осуществляли дозой 100 ТЦД50 вируса Коксаки А7. Результаты представлены в таблице 1 (указан процент жизнеспособных клеток через 30 часов после инфицирования).
В контролях вируса (к клеткам вместо исследуемого лекарственного средства добавляли равные объемы культуральной среды) к этому сроку наблюдалась 100%-ая вирусиндуцированная гибель клеточного монослоя. Как видно из табл. 1, добавление in vitro как рекомбинантного человеческого ИФН альфа-2b, так и лекарственного средства на основе иммобилизированного ИФН альфа-2b в концентрации 2000 МЕ/мл и выше в культуру клеток RD, зараженных вирусом Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8), приводило к 100% защите от вирусиндуцированной гибели.
Пример 2. Инфицирование клеток RD осуществляли дозой 100 ТЦД50 вируса Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15). К культуре клеток RD добавляли различные концентрации рекомбинантного интерферона альфа-2b и исследуемого лекарственного средства основе иммобилизированного интерферона альфа-2b за 6 ч до инфицирования. Результаты исследования представлены в таблице 2 (указан процент жизнеспособных клеток через 30 часов после инфицирования). В контролях вируса (к клеткам вместо исследуемого лекарственного средства добавляли равные объемы культуральной среды) к этому сроку наблюдалась 100%-ая вирусиндуцированная гибель клеточного монослоя.
Как видно из табл. 2, добавление in vitro как рекомбинантного человеческого ИФН альфа-2b, так и лекарственного средства на основе иммобилизированного ИФН альфа-2b в концентрации 2000 МЕ/мл и выше в культуру клеток RD, зараженных вирусом Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15), приводило к 100% защите от вирусиндуцированной гибели. Достоверных отличий противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в отношении двух используемых энтеровирусных штаммов не отмечено.
Эффективность подавления репликации вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) исследуемым лекарственным средством на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b в инфицированных клетках RD также была исследована посредством количественного анализа с использованием полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР). Монослой клеток RD с различными концентрациями лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b инкубировали в течение 6 часов, после чего клетки инфицировали дозой 100 ТЦД50 вируса Коксаки А7, через 30 часов после инфицирования в клеточных лизатах определяли количества вирусной РНК. Количественный ОТ-ПЦР анализ выполняли согласно методологии, изложенной Lu J., Yi L., Zhao J. et al. (2012). Количества вирусной РНК в клетках, проинкубированных с препаратами интерферона, нормализовали относительно контроля вируса (KB, инфицированные вирусом клетки RD без преинкубации с интерфероном). Результаты представлены в таблице 3.
Таким образом, исследование противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b показало, что данное лекарственное средство обладает сравнимой специфической активностью с исходным неиммобилизированным рекомбинантным человеческим интерфероном альфа-2b (производство ЗАО «СЦФБ»). Так, методом количественного ОТ-ПЦР, было показано, что лекарственное средство на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b приблизительно в 5 раз менее активно в сравнении с неиммобилизированным интерфероном альфа-2b. Эти данные хорошо согласуются с результатами для пегилированных белков (цитокинов) на in vitro моделях [10, 11, 12].
Иммунотропные свойства иммобилизированного на ПЭГ интерферона были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.
Для установления иммунотропной активности иммобилизированного рекомбинантного интерферона альфа-2b (имИФН-α2b) было изучено его влияние на фагоцитоз перитонеальных макрофагов и нейтрофилов, гуморальный иммунный ответ лабораторных животных при пероральном способе применения исследуемого препарата. Оценку иммунотропной активности изучаемого препарата проводили также в системе in vitro на культуре мононуклеаров периферической крови здоровых доноров. При этом проводилось изучение влияния имИФН-α2b на синтез ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ мононуклеарами периферической крови здоровых доноров спонтанно и при их стимуляции полисахаридом энтеробактерий и фитогемагглютинином.
В качестве препарата сравнения использовали реаферон-ЕС-липинт (ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцове, Новосибирской обл., рег. уд. PN000821/01). Этот препарат является рекомбинантным интерфероном альфа-2 для перорального применения, заключенным в липосомы, что защищает интерферон от разрушения в пищеварительном тракте. В качестве препарата сравнения в опытах in vitro при добавлении в культуру мононуклеарных клеток здоровых доноров использовали вместо реаферона-ЕС-липинта его аналог для парентерального введения - реаферон-ЕС (ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцове, Новосибирской обл., per. уд. PN000642/01).
Изучение иммунотропной активности иммобилизированного на ПЭГ интерферона альфа-2b (имИФН-α2b) и реаферона-ЕС-липинт (РФН-ЕС-л) проводилось согласно «Методическим рекомендациям по доклиническому изучению иммунотропной активности лекарственных средств» [13].
В исследовании было использовано 160 мышей-самцов линии CBA/CaLac 6-8-недельного возраста с массой тела 18-22 г. Мыши конвенциональные 1-й категории (сертификат здоровья лабораторных животных, выданный «НЦБМТ» РАМН от 17.10.12 г.). Содержание: в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Мыши находились согласно нормам рассадки животных в пластиковых клетках фирмы VELAZ на подстилке из мелкой древесной стружки. Температура воздуха в виварии 18-24°С, влажность - 50±20%, объем воздухообмена (вытяжка/приток) - 8:10, световой режим (день/ночь) - 1:1. Мыши имели постоянный доступ к воде и пище. Корм - полнорационный экструдированный комбикорм Рецепт ПК-120 (содержание) для лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков), сбалансированный по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам, производство ООО «Лабороторкорм», г. Москва. В качестве питьевой воды использовалась дистиллированная вода. Работы с животными проводились в соответствии с регламентирующим документом на содержание животных: «Лабораторные животные». - М., 2003 [14]. Содержание животных соответствует правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №708 от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
При проведении опытов in vitro в качестве источника материала была использована периферическая кровь 10 здоровых доноров в возрасте от 22 до 36 лет.
Мышам иммобилизированный интерферон альфа-2b и реаферон-ЕС-липинт вводили перорально курсом в течение 5-ти суток один раз в день в терапевтической дозе (1,8×105 МЕ/кг), которая была пересчитана, исходя из средней терапевтической дозы интерферона альфа-2b для человека (1000000 ME), в объеме 0,2 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) («МР Biomedicals», США), контрольные животные получали в эквивалентном объеме растворитель. В опытах in vitro иммобилизированный интерферон альфа-2b и реаферон-ЕС добавлялись в культуру клеток в дозах 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл. При изучении влияния препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов в качестве фона использовали интактных животных соответствующего пола и возраста. При исследовании влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ в качестве фона использовали мышей, получивших антиген, но без курсового введения растворителя. Забивали животных декапитацией после СО2-камеры либо передозировкой хлороформа.
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. На мазках содержимого перитонеальной полости учитывали процент макрофагов или нейтрофилов, поглотивших микробы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [13].
Влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации мышей эритроцитами барана (ЗАО «ЭКОлаб», Россия). Иммунизацию животных осуществляли после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт минимальной дозой эритроцитов барана - 5×106 на мышь внутрибрюшинно. Определение АОК осуществляли на 4-е и 7-е сутки после иммунизации методом локального гемолиза [15] с предварительным подсчетом общего количества спленоцитов (ОКС), а уровень специфических антител (IgM и IgG-гемагглютинины), содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, определяли с помощью реакции гемагглютинации (РГА) [16]. Количество антителообразующих клеток выражали в относительных (%) и абсолютных (106/орган) единицах, а титр антител - величиной log2T.
В опытах in vitro изучали влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС при их добавлении в культуру мононкуларов периферической крови здоровых доноров на продукцию ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ. Для этого в качестве материала использовали супернатанты культур мононуклеаров, полученные на первые сутки их культивирования in vitro при температуре 37°С в СО2-инкубаторе, содержащего 5% СО2. Для выделения мононуклеаров кровь разводили 1:2 средой 199 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), затем наслаивали на градиент фиколл-пака («Pharmacia», Швеция) с плотностью 1,077 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 мин. Белое кольцо, образующееся на разделе фаз и содержащее мононуклеары, аккуратно отсасывали пипеткой и 2 раза отмывали средой 199 с помощью центрифугирования 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде (ПРС), состоящей из среды RPMI-1640 («HyClone», США), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone», США), 10 мМ HEPES («Sigma», США), 2 мМ L-глютамина («Sigma», США) и 40 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхимфарм», Россия), и мононуклеары доводили до концентрации 2 млн/мл и культивировали сутки. Получали 4 вида супернатанта: 1) от клеток, стимулированных липополисахаридом (ЛПС, 10 мкг/мл) («Sigma», США) - для индукции продукции ИЛ-1β, либо фитогемагглютинином (ФГА, 10 мкг/мл) («Sigma», США) - для индукции продукции ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ в присутствии исследуемых препаратов в конечной концентрации 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл; 2) от клеток, стимулированных ЛПС, либо ФГА; 3) от клеток, культивируемых в присутствии исследуемых препаратов в конечной концентрации 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл; 4) от клеток, культивируемых только в ПРС. Цитокины (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ) в супернатантах культур мононуклеаров определяли с помощью иммуноферментного метода, используя соответствующие наборы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) и ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Оценивали способность исследуемых препаратов усиливать (мононуклеары, стимулированные ЛПС или ФГА + препарат) и индуцировать (мононуклеары, стимулированные только препаратом) выработку цитокинов.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты, подтверждающие иммунотропные свойства иммобилизированного на ПЭГ рекомбинантного интерферона альфа-2b, при пероральном способе применения, проиллюстрированы следующими примерами.
Пример 3. Изучение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и нейтрофилов оценивалась через 24 ч после окончания 5-дневного курса введения иммобилизированного интерферона альфа-2b (группа 4), реаферона-ЕС-липинт (группа 3) или растворителя (группа 2) по способности фагоцитов поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209. Курсовое введение РФН-ЕС-л не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа перитонеальных макрофагов экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой, лишь относительно фона наблюдалось статистически значимое увеличение фагоцитарной активности макрофагов (ФЧ) (табл. 4).
Курсовое введение имИФН-α2b не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов экспериментальных животных как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, но при этом статистически значимо повышалось среднее количество поглощенных одной клеткой бактерий (ФЧ). У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось достоверное повышение фагоцитарного числа перитонеальных макрофагов по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.
Курсовое введение РФН-ЕС-л не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа нейтрофилов экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой, лишь относительно фона наблюдалось статистически значимое увеличение количества поглощенных бактерий (ФЧ) (табл. 5). Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению относительного количества фагоцитирующих нейтрофилов экспериментальных животных как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой. При этом число поглощенных бактерий (ФЧ) статистически значимо не изменялось. У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось достоверное повышение относительного числа фагоцитирующих нейтрофилов по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л в такой же дозе.
Пример 4. Влияние иммобилизированного ИФН альфа-2b и реаферона-ЕС-липинт на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации мышей эритроцитами барана (табл. 6). Курсовое введение РФН-ЕС-л приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, относительного и абсолютного количества АОК в селезенках, титра IgM в сыворотке крови на 4-е сутки после иммунизации, но лишь относительно фоновых значений, а по сравнению с контрольной группой наблюдалось статистически значимое снижение относительного количества АОК и титров IgG, хотя титр IgM был достоверно выше.
Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, относительного и абсолютного количества АОК в селезенках экспериментальных животных на 4-е сутки после иммунизации как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, но при этом активность АОК, судя по титрам специфических гемагглютининов в сыворотке крови, увеличивалась незначительно. У мышей, получавших имИФН-α2b, отмечалось статистически значимое повышение абсолютного и относительного числа антителообразующих клеток, титров IgG и суммарных антител по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.
Курсовое введение РФН-ЕС-л приводило к достоверному повышению числа спленоцитов и абсолютного количества АОК в селезенках как по сравнению с контролем, так и с фоновой группой (табл. 7), а также относительно этой группы увеличивалось процентное содержание антителообразующих клеток и титр IgG в сыворотке крови на 7-е сутки после иммунизации.
Курсовое введение имИФН-α2b приводило к достоверному повышению числа спленоцитов, абсолютного количества АОК в селезенках экспериментальных животных и титра специфических гемагглютининов в сыворотке крови на 7-е сутки после иммунизации как по сравнению с контрольной группой, так и с фоновой, а также относительно этой группы увеличивался титр IgG. Изученные показатели в группе мышей, получавших имИФН-α2b, статистически значимо не отличались по сравнению с группой животных с применением РФН-ЕС-л.
Пример 5. Влияние иммобилизированного интерферона альфа-2b и реаферона-ЕС при их добавлении в культуру мононуклеаров периферической крови здоровых доноров на продукцию ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ. Для этого в качестве материала использовали супернатанты культур мононуклеаров, полученные на первые сутки их культивирования in vitro.
При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b и РФН-ЕС в различных концентрациях (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-1β и ИЛ-4 достоверно не изменялась по сравнению с контрольной группой (без добавления препарата) (табл. 8, 9). Не отмечалось статистически значимых различий в выработке указанных цитокинов и при сравнении соответствующих по вносимым дозам препаратов групп.
Как при добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b, так и РФН-ЕС повышалась продукция ИЛ-2 при всех исследованных дозах препаратов (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) по сравнению с контролем. При внесении имИФН-α2b в дозе 150 МЕ/мл наблюдалось достоверное усиление спонтанной выработки ИФН-γ. Добавление РФН-ЕС в культуру мононуклеаров в дозах 15 МЕ/мл и 150 МЕ/мл без митогена статистически значимо повышало продукцию изучаемого цитокина как по сравнению с контролем, так и в дозе 15 МЕ/мл с группой с внесением имИФН-α2b в такой же концентрации.
При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b совместно с ФГА повышалась продукция ИЛ-2 при всех исследованных дозах препарата (15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл) по сравнению с контролем (табл. 9). Максимальная выработка изученного цитокина отмечалась при внесении им-ИФН-α2b в концентрации 15 МЕ/мл. При добавлении РФН-ЕС статистически значимое усиление продукции ИЛ-2 наблюдалось лишь при дозе вносимого препарата 150 МЕ/мл. При сравнении соответствующих по дозам групп препаратов не отмечалось статистически значимых различий в выработке исследованного цитокина.
При добавлении в культуру мононуклеаров имИФН-α2b и РФН-ЕС совместно с ФГА повышение продукции ИФН-γ наблюдалось при вносимых дозах препаратов 15 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл, но статистически незначимо.
Таким образом, использование предложенного способа физической иммобилизации рекомбинантного интерферона альфа-2b на полиэтиленгликоле, массой 1,5 кДа, позволяет получить препарат для перорального применения, который проявляет противоэнтеровирусную активность in vitro и существенную иммуностимулирующую активность в условиях in vivo, что выражается в усилении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и нейтрофилов и гуморального иммунного ответа, сравнимых или превосходящих таковые при воздействии реаферона-ЕС-липинт, и in vitro, что выражается в повышении спонтанной и стимулированной выработки ИЛ-2, более эффективно, чем препарат сравнения РФН-ЕС, а также и ИФН-γ без дополнительной стимуляции митогеном.
Пример 6. Изготовление капсулированного лекарственного средства. Приготовление композиции для лиофильной сушки:
Состав композиции для лиофильной сушки приведен в таблице 10.
| Таблица 10 | |
| Состав компонентов композиции для лиофильной сушки | |
| Название компонента | Количество |
| 1. Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный иммобилизированный 2×107 МЕ/мл | 60,0 мл |
| 2. Декстран-40 | 50,00 г |
| 3. Фосфатно-солевой буфер (10 mM NaH2PO4, рН 7.4±0,2) | 450,0 мл |
| 3. ЭДТА | 1,00 г |
| 4. ПЭГ-1500 | 2,00 г |
Навеску декстрана-40 50,00±0,01 г растворили в 450,0 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (10 mM NaH2PO4, рН 7,4±0,2). На электронных весах «Ohaus Adventurer RV 313» в химическом стакане на 1000 мл взвесили 449,0±0,1 г раствора декстрана-40 10% в фосфатно-солевом буфере и растворили в нем навески веществ: 1,00±0,01 г ЭДТА и 2,00±0,01 г ПЭГ-1500. К полученному раствору добавили 60,0 мл раствора субстанции иммобилизированного интерферона альфа-2b с активностью 2×107 МЕ/мл и перемешали. Полученный раствор профильтровали через фильтр 0,2 мкм с использованием вакуумной стерилизационной системы «Stericup» Millipore для снижения контаминации продукта, стерильно разлили в поддоны для сушки и подвергли глубокой заморозке при -70°С в гибернаторе «UTLF-80» в течение суток.
Лиофильная сушка композиции для сушки:
Лиофильную сушку замороженной композиции для сушки производили на лабораторной лиофильной сушилке «MLW LGA 05» при температуре -50°С и давлении в сушильной камере не более 0,4 мм рт.ст. в течение суток. Сухой лиофилизат пересыпали в полиэтиленовый пакет.
Приготовление лекарственной смеси для заполнения капсул:
Навески лиофилизата композиции для сушки (45,0±0,1 г) и мальтодекстрина (405,0±0,1 г) перенесли в емкость для смешивания, и полученную лекарственную смесь перемешивали на комбайне в течение 30 мин до получения однородной, равномерно перемешанной и рассыпчатой смеси.
Капсулирование и упаковка лекарственной смеси:
Капсулирование лекарственной смеси массой 420,0±0,1 г в желатиновые капсулы №00 желтого цвета (масса содержимого капсулы 0,4 г) осуществляли на полуавтоматической машине для заполнения капсул «CGN-208» согласно технологической инструкции. Для очистки капсул от пыли использовали машину для полировки и обеспыливания капсул «С&С-100». Обеспыленные капсулы (950 шт.) упаковали в прозрачные полиэтиленовые пакеты на машине для подсчета и упаковки капсул «РА2000» и герметично запаяли.
Источники литературы
1. Patten S.B. What is the best approach to treating interferon-induced depression in people with multiple sclerosis? // J. Neurosci. - 2001. - V. 26. - P. 66.
2. Wills R.J. Clinical pharmacokinetics of interferons // Clin. Pharmacokinet. - 1990. - Vol. 19. - №5. - Р. 390-399.
3. Prummer O., Streichan U., Porzsolt F. Treatment-induced interferon (IFN)-α antibodies: Differential neutralisation of the antiviral and antiproliferative IFN-α activity in vitro // J. Interferon Res. - 1991. - №11. - P. 265.
4. US Pat. №5951974 A «Interferon polymer conjugates», опубл. 14.09.1999.
5. EP Pat. №0809996 B1 «Interferon-alpha polypeptides and conjugates», опубл. 02.04.2003.
6. Патент (RU) на изобретение №2409669 «Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на носитель (варианты) и конъюгат БАВ-носитель, полученный данными способами», опубл. 27.02.2010.
7. Патент (RU) на изобретение №2123328 «Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения», опубл. 20.12.1998.
8. Патент (RU) №2024253 «Ректальные свечи и устройство для введения ректальных свечей в полость организма» опубл. 15.12.1994.
9. Lu J., Yi L., Zhao J., Yu J., Chen Y., Lin M. C., Kung H.F., Hea M.L. Enterovirus 71 Disrupts Interferon Signaling by Reducing the Level of Interferon Receptor 1 // Journal of Virology. - 2012. - V. 86, №7. - P. 3767-3776.
10. Pasut G. PEGylated a Interferons: two different strategies to achieve increased effi cacy. In: PEGylated protein drugs: basic science and clinical applications (ed. Veronese FM) // Birkhauser Verlag, Basel, 2009.
11. Pasut G., Vemose F. PEGylation of proteins as tailored chemistry for optimized bioconju-gates // Adv Polym Sci. - 2006. -Vol. 192. - P. 95-134.
12. Veronese F.M. Pasut G. Protein PEGylation In: Long Acting Injections and Implants (Eds: Wright J.C., Burgess D.J.) // Springer, - New York, Dordrecht, Heidelberg, London, - 2012. - P. 295-314.
13. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - M.: Гриф и К, 2013. - 944 с.
14. Лабораторные животные (Положение и руководство) // под ред. чл.-корр. РАМН И.Н. Каркищенко. - M.: изд-во «ВПК». - 2003. - 138 с.
15. Cunningham A.I. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells // Nature. - 1965. - V. 207, №5001. - P. 1106-1107.
16. Линг Н. Р., Кэтти Д. Темагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза. Антитела. Методы / Под ред. Д. Кэтти. кн. 1. M.: Мир, 1991. - С.238-243.
Claims (1)
- Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство для перорального применения в виде капсул, содержащее интерферон и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества содержит интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, иммобилизированный на полиэтиленгликоле молекулярной массой 1,5 кДа с помощью физического способа связывания потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад при следующем соотношении компонентов на капсулу:
интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный иммобилизированный 1000000 ME вспомогательные вещества: мальтодекстрин 0,3-0,36 г декстран 0,03592-0,0898 г полиэтиленгликоль 0,004-0,01 г эдта 0,08-0,2 мг
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014119335/15A RU2554761C1 (ru) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014119335/15A RU2554761C1 (ru) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2554761C1 true RU2554761C1 (ru) | 2015-06-27 |
Family
ID=53498642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014119335/15A RU2554761C1 (ru) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2554761C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678332C1 (ru) * | 2017-09-08 | 2019-01-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") | Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0809996A2 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Interferon conjugates |
| RU2123328C1 (ru) * | 1996-04-19 | 1998-12-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения |
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| RU2447083C1 (ru) * | 2010-07-20 | 2012-04-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ |
-
2014
- 2014-05-13 RU RU2014119335/15A patent/RU2554761C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| RU2123328C1 (ru) * | 1996-04-19 | 1998-12-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения |
| EP0809996A2 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Interferon conjugates |
| RU2447083C1 (ru) * | 2010-07-20 | 2012-04-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Инструкция по применению лекарственного препарата для медицинского применения Альгерон, дата регистрации 28.02.2013, найдено в Интернет на сайте: http://grls.rosminzdrav.ru/InstrImgMZ.aspx?regNr=%D0%9B%D0%9F-002017&page=1 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678332C1 (ru) * | 2017-09-08 | 2019-01-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") | Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения |
| WO2019050437A1 (ru) * | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Общество С Ограниченной Ответственностью"Саентифик Фьючер Менеджмент" | Пегилированный интерферон лямбда при пероральном применении и способ его получения |
| CN111065405A (zh) * | 2017-09-08 | 2020-04-24 | 科学未来管理有限责任公司 | 口服生物利用度高的聚乙二醇化干扰素λ及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0906119B1 (en) | Stimulation of host defense mechanisms against cancer | |
| BRPI1101565A2 (pt) | novo conjugado de polietileno glicol estável de interferon alfa, representado por um isÈmero posicional | |
| Chan et al. | Immunomodulatory effects of Agaricus blazei Murill in Balb/cByJ mice | |
| RU2140285C1 (ru) | Противовирусное средство - капли в нос "гриппферон" | |
| Nodarse-Cuní et al. | Cuban interferon alpha-2b. Thirty years as an effective and safe drug | |
| TWI737583B (zh) | 用於長效型干擾素之劑量方案 | |
| RU2554761C1 (ru) | Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство | |
| CN1090506C (zh) | 溶菌酶二聚体的新应用 | |
| KR20200047524A (ko) | B형 간염 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 이의 용도 | |
| JPH02111727A (ja) | 免疫反応が減少したときの免疫系のためのインターロイキン―２の使用 | |
| RU2264819C2 (ru) | Фармацевтическая противогерпетическая композиция и способ получения лекарственной формы на ее основе | |
| RU2486896C1 (ru) | Способ получения препарата для активизации неспецифической резистентности, профилактики и терапии болезней молодняка сельскохозяйственных животных | |
| AU724190B2 (en) | Stimulation of host defense mechanisms against tumors | |
| RU2404770C1 (ru) | Способ получения комплексного иммунотропного препарата для животных | |
| MXPA06013050A (es) | Composiciones a base de compuestos inmunoreguladores para el tratamiento o prevencion de infecciones virales respiratorias. | |
| JPH01149730A (ja) | レトロウイルス増殖抑制剤 | |
| US7182962B2 (en) | Immunostimulator for animals and humans, and method of preventing animal and human infectious diseases and cancer | |
| RU2833350C1 (ru) | Интраназальное противовирусное средство | |
| Dzik et al. | Therapeutic properties of lactoferrin. | |
| Hiraoka et al. | Effects of granulocyte colony-stimulating factor upon coxsackievirus B3 myocarditis in mice | |
| RU2620548C1 (ru) | Способ профилактики респираторных болезней телят | |
| RU2486897C1 (ru) | Способ получения иммунотропного препарата для профилактики и лечения воспалительных процессов сельскохозяйственных животных | |
| RU2121364C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО α-2-ИНТЕРФЕРОНА ПРОТИВ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЛОТОЯДНЫХ | |
| RU2380405C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека | |
| RU2162337C1 (ru) | Противовирусное средство - капли в нос |