CN103796666B - 改良的肽药物 - Google Patents

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Abstract

本文描述共价改性的肽和/或蛋白质的合成方法和治疗用途。所述共价改性的肽和/或蛋白质使得可改良基于肽和蛋白质的治疗剂的医药特性。

Description

改良的肽药物
交叉参考
本申请案主张2011年5月18日提交的美国临时专利申请案第61/487,636号、2011年5月18日提交的美国临时专利申请案第61/487,638号、2011年10月5日提交的美国临时专利申请案第61/543,725号和2011年10月5日提交的美国临时专利申请案第61/543,721号的优先权，所述申请案均以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
共价改性的肽和蛋白质类似物使基于肽和/或蛋白质的治疗剂的医药特性改良。
背景技术
发明内容
肽和/或蛋白质药物在其用于医学中时受到许多限制(内斯特(Nestor)，J.J.，Jr.(2007)综合医药化学(Comprehensive Medicinal Chemistry)II2：573-601)-作用持续时间短、生物可用性不良以及缺少受体亚型选择性。另外，肽和/或蛋白质在调配物中不稳定，易发生聚集。在一些情况下，肽和/或蛋白质的聚集导致显现对原生与外源肽或蛋白质的免疫反应。
本文描述用于共价改性肽和/或蛋白质以产生具有改良的药物特性的产物的方法和试剂。在一些情况下，共价改性的肽和/或蛋白质使基于肽和/或蛋白质的治疗剂的稳定性、生物可用性、选择性以及作用持续时间改良。
本文描述某些具有改良的药物特性的共价改性的肽和/或蛋白质。在一些情况下，这些共价改性的肽和/或蛋白质使基于肽和/或蛋白质的治疗剂的稳定性、生物可用性、选择性以及作用持续时间改良。
在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质连接到糖苷表面活性剂。一方面，共价改性的肽和/或蛋白质连接到烷基糖苷。一方面，共价改性的肽和/或蛋白质连接到烷基糖苷表面活性剂，其中肽和/或蛋白质连接到表面活性剂中的糖苷，且接着糖苷连接到疏水性和/或烷基。在一些实施例中，本文提供通过并入如烷基糖苷的表面活性剂来共价改性肽和/或蛋白质的试剂和中间物。
本文提供包含共价连接到肽的表面活性剂X的肽产物，所述肽包含连接氨基酸U和至少一个其它氨基酸：
其中X为
其中
A为疏水性基团；且
B为通过连接氨基酸U共价连接到肽的亲水性基团。
在一些实施例中，通过使官能化表面活性剂与如此处所描述的肽反应来合成肽产物。在一些实施例中，如下合成肽产物：使官能化表面活性剂与如此处所描述的可逆保护的连接氨基酸反应，随后与一种或一种以上氨基酸反应形成被表面活性剂改性的肽产物。在一些实施例中，U为肽的末端氨基酸。在一些实施例中，U为肽的非末端氨基酸。
在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C1-C30烷基链、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分。在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C8-C20烷基链、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基、被取代或未被取代的1-芳烷基或含有类固醇核的部分。在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C10-C20烷基链、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基、被取代或未被取代的1-芳烷基或含有类固醇核的部分。
在一些实施例中，B为多元醇。在一些实施例中，多元醇为糖。在一些实施例中，糖为单糖、双糖或多糖。在一些实施例中，糖选自葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、二葡糖醛酸以及麦芽糖醛酸(maltouronic acid)。
在一些实施例中，表面活性剂为1-烷基糖苷类表面活性剂。
在一些实施例中，表面活性剂中的亲水性基团通过酰胺键连接到肽。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂由以下构成：1-二十烷基β-D-葡糖醛酸，1-十八烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基βD-葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-葡糖醛酸、1-癸基β-D-葡糖醛酸、1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-二十烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-二葡糖醛酸、1-癸基β-D-二葡糖醛酸、1-辛基β-D-二葡糖醛酸或官能化1-二十烷基β-D-葡萄糖、1-十八烷基β-D-葡萄糖、1-十六烷基β-D-葡萄糖、1-十四烷基β-D-葡萄糖、1-十二烷基β-D-葡萄糖、1-癸基β-D-葡萄糖、1-辛基β-D-葡萄糖、1-二十烷基β-D-麦芽糖苷、1-十八烷基β-D-麦芽糖苷、1-十六烷基β-D-麦芽糖苷、1-十二烷基β-D-麦芽糖苷、1-癸基β-D-麦芽糖苷、1-辛基β-D-麦芽糖苷等，且通过在前述基团与肽上的基团(例如前述基团中的-COOH基团与肽的氨基)之间形成键联来制备肽产物。
在一些实施例中，亲水性基团与疏水性基团组合产生表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂为离子型表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂为非离子型表面活性剂。在一些实施例中，疏水性基团为被取代或未被取代的C1-C30烷基链或芳烷基链。在一些实施例中，疏水性基团为具有混合疏水性和亲水性特性的链，例如聚乙二醇(PEG)基团。
在一些实施例中，连接氨基酸为天然D-或L-氨基酸。在一些实施例中，连接氨基酸为非天然氨基酸。在一些实施例中，连接氨基酸选自Lys、Cys、Orn、Asp、Glu或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团。在一些实施例中，连接氨基酸选自Lys、Cys、Orn或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团。在一些实施例中，用于共价连接到表面活性剂的官能团为-NH2、-SH、-OH、-N3、卤乙酰基、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或炔系基团，其中m为1-10。
在一些实施例中，肽为类鸦片肽。在一些实施例中，肽和/或蛋白质产物含有共价连接的烷基糖苷。在一些所述实施例中，肽和/或蛋白质产物含有共价连接的烷基糖苷，其为α或β构型的1-O-烷基葡糖醛酸。在一些所述实施例中，肽和/或蛋白质产物包含共价连接的烷基糖苷，其为1-O-烷基葡糖醛酸且烷基链为C1到C20烷基链。
在一些实施例中，肽产物具有式IA的结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式IA
其中：
aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5中的每一者独立地不存在，为D-或L-天然或非天然氨基酸、N-烷基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、CαR3氨基酸、Ψ-氨基酸或共价连接到表面活性剂X的连接氨基酸U；
Z为-OH、-NH2或-NHR3；
每一R3独立地为被取代或未被取代的C1-C12分支链或直链烷基、小于10Da的PEG链或被取代或未被取代的芳烷基链；
其限制条件为aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5中的一者或至少一者为共价连接到表面活性剂X的连接氨基酸U；
且其限制条件进一步为aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5并非都不存在。
一方面，本文提供一种具有式II结构的肽产物：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式II
其中：
aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5中的每一者独立地不存在，为D-或L-天然或非天然氨基酸、N-烷基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、CαR3氨基酸、Ψ-氨基酸或共价连接到表面活性剂X的连接氨基酸U；
Z为-OH、-NH2或-NHR3；
每一R3独立地为被取代或未被取代的C1-C12分支链或直链烷基、小于10Da的PEG链或被取代或未被取代的芳烷基链；且
X为
其中
A为疏水性基团；且
B为通过连接氨基酸U共价连接到肽的亲水性基团；
其限制条件为aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5中的一者或至少一者为共价连接到表面活性剂X的连接氨基酸U；
且其限制条件进一步为aa1、aa2、aa3、aa4以及aa5并非都不存在。
一方面，本文提供一种具有式III结构的肽产物：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式III(SEQ.ID.NO.1)
其中：
aa1为Tyr、Dmt、N-R3-Tyr、N-R3-Dmt、N-(R3)2-Tyr或N-(R3)2-Dmt；
aa2为Pro、D-Arg、D-U(X)、D-Ala、Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe、Trp、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、CαMePhe或Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；
aa5不存在或为Pro、Aib、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；且
U为双碱基天然或非天然氨基酸、包含巯基的天然或非天然氨基酸、包含-N3基团的非天然氨基酸、包含炔系基团的非天然氨基酸或包含-NH-C(＝O)-CH2-Br或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺的非天然氨基酸，其中m为1-10，这是用于共价连接到表面活性剂X。
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X具有以下结构：
其中：
A为被取代或未被取代的C1-C30烷基链、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-或-S-；
R2为一键、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺；且
m为1-10。
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X具有以下结构：
因此，在上文所描述的实施例中，R2为一键。
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X具有以下结构：
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X具有以下结构：
其中：
A为被取代或未被取代的C1-C30烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；
R2为一键。
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X具有以下结构：
其中：
A为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在上文和此处描述的式I、式II或式III的肽产物的一些实施例中，X如上文所描述且A为被取代或未被取代的C1-C20烷基。
本文还涵盖式I中的X具有以下结构的替代实施例：
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-S-，R2为C1-C30烷基，W2为S，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的半胱氨酸残基中的巯基与X形成硫醚)。
在上文所描述的X结构的另一示范性替代实施例中，W1为-O-，R2为C1-C30烷基，W2为O，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的丝氨酸或苏氨酸残基中的羟基与X形成醚)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.149)
其中：
U为双碱基天然或非天然氨基酸；
X为1-烷基糖苷类表面活性剂，其中1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基或被取代或未被取代的烷氧基芳基取代基；
Z为NH2；
aa1为Tyr、Dmt、Nα-Me-Tyr、Nα-Me-Tyr、N,Nα-diMe-Tyr或N,Nα-diMe-Dmt；
aa2为Pro、D-Arg、D-U(X)、D-Ala、Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe、Trp、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、CαMePhe或Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；
aa5不存在或为Pro、Aib、U(X)、D-或L-CαMeU(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.150)
其中：
X包括1-烷基葡糖醛酸或1-烷基二葡糖醛酸；
Z为NH2；
aa1为Dmt；
aa2为Pro、D-Lys(X)、Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)或Ψ-Phe；
aa4为Phe、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)或Lys(X)；
aa5不存在或为Pro、Aib、Lys(X)、D-或L-CαMeLys(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.151)
其中：
aa1为Dmt；
aa2为Pro；
aa3为Phe或Tmp；
aa4为Phe或Lys(X)；
aa5不存在或为Aib、Lys(X)、D-或L-CαMeLys(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.152)
其中：
aa1为Dmt；
aa2为Pro；
aa3为Phe或Tmp；
aa4为Phe或Lys(X)；
aa5不存在或为Lys(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.153)
其中：
U为双碱基天然或非天然氨基酸；
X为1-烷基糖苷类表面活性剂，其中1-烷基糖苷的1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基或被取代或未被取代的烷氧基芳基取代基；
aa1为Tyr、Dmt、N-R3-Tyr、N-R3-Tyr、N-(R3)2-Tyr或N-(R3)2-Dmt；
aa2为D-Arg或D-U(X)；
aa3为Phe、Trp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)或Tmp；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；
aa5不存在，为Pro或U(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.154)
其中：
X为1-烷基葡糖醛酸或1-烷基二葡糖醛酸类表面活性剂；
aa1为Dmt、Nα-Me-Dmt或N,Nα-Me-Dmt；
aa2为D-Arg、D-Lys(X)或D-Orn(X)；
aa3为Phe或Tmp；
aa4为Phe、Tmp、Lys(X)或Orn(X)；
aa5不存在或为Pro、Lys(X)或Orn(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.155)
其中：
U为双碱基天然或非天然氨基酸；
X为1-烷基糖苷类表面活性剂，其中1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基或被取代或未被取代的烷氧基芳氧基取代基；
Z为NH2；
aa1为Tyr、Dmt、N-R3-Tyr、N-R3-Dmt、N-(R3)2-Tyr或N-(R3)2-Dmt；
aa2为Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa2为Tic(Ψ[CH2-NH])时aa3为Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)或U(X)；
aa5不存在，为Pro、Aib或U(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.156)
其中：
X为1-烷基葡糖醛酸或1-烷基二葡糖醛酸类表面活性剂；
aa1为Tyr、Dmt、Nα-Me-Tyr、Nα-烷基-Dmt、N,Nα-diMe-Tyr或N,Nα-Me-Dmt；
aa2为Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa2为Tic(Ψ[CH2-NH])、Phe或Tmp时aa3为Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、Lys(X)或Orn(X)；
aa5不存在或为Aib、Lys(X)或Orn(X)。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.157)
其中：
X包括1-烷基葡糖醛酸或1-烷基二葡糖醛酸；
aa2为Tic或Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe或Ψ-Phe；
aa4为Lys(X)；
aa5不存在。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.158)
其中：
X包括1-烷基葡糖醛酸；
aa2为Tic；
aa3为Phe；
aa4为Lys(X)；
aa5不存在。
在一些实施例中，式III的肽产物为以下产物(SEQ.ID.NO.159)
其中：
X包括选自以下的1-烷基葡糖醛酸：1-甲基β-D-葡糖醛酸、1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸和1-十八烷基β-D-葡糖醛酸；
aa2为Tic；
aa3为Phe；
aa4为Lys(X)；
aa5不存在。
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-甲基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.78)
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(Nε-1-辛基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.80)
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(Nε-1-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.79)
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(Nε-1-十四烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.160)
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(Nε-1-十六烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.82)
在一些实施例中，式III的肽产物为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-十八烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。(SEQ.ID.NO.83)
在一些实施例中，肽产物具生物学活性。
在一特定实施例中，本文提供一种选自图1中的表1化合物的化合物。
本文还提供一种医药组合物，其包含治疗有效量的式I、II或III的肽产物或其医药学上可接受的盐和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
本文提供一种治疗疼痛的方法，其包含投予治疗有效量的式I、II或III的肽产物或图1中的表1化合物。
本文提供一种改良肽的医药和医学行为，从而改良其作用持续时间、生物可用性或其在调配物中的稳定性的方法，其包含将表面活性剂X共价连接到肽，其中X如本文所描述。
在一些实施例中，包含本文所描述的共价连接的烷基糖苷的肽产物为Leu-脑啡肽的类似物。在一些所述实施例中，肽和/或产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为Leu-脑啡肽的类似物。
在一些实施例中，包含本文所描述的共价连接的烷基糖苷的肽产物为类鸦片肽的类似物DPDPE(秋山(Akiyama)K等人，(1985)美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)82：2543-7)。在一些所述实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基葡糖醛酸，且肽为类鸦片肽的类似物DPDPE。
在一些实施例中，包含本文所描述的共价连接的烷基糖苷的肽产物为D-氨基酸的类似物，含有天然产物肽皮啡肽(梅尔基奥里(Melchiorri)，P.和内格里(Negri)，L.(1996)普通药理学(Gen Pharmacol)27：1099-1107)或新皮啡肽(埃斯派墨(Erspamer)，V.等人，(1989)美国科学院院刊86：5188-92)。在一些所述实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为皮啡肽或新皮啡肽的类似物。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为内吗啡肽-1或-2的类似物。在一些所述实施例中，肽产物包含共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为内吗啡肽的类似物(拉扎勒斯(Lazarus)，L.H.和冈田(Okada)，Y.(2012)治疗术专利专家评论(Expert Opin Ther Patents)22：1-14)。
在一些实施例中，包含本文所描述的共价连接的烷基糖苷的肽产物为类鸦片肽强啡肽的类似物(詹姆斯(James)，I.F.等人，(1982)生命科学(Life Sci)31：1331-4)。在一些所述实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为强啡肽的类似物。
在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成环状内酰胺。举例来说，在一些实施例中，Lys侧链与Glu的侧链形成环状内酰胺。在一些实施例中，所述内酰胺结构是逆转的且由Glu和Lys形成。在一些情况下，已知所述内酰胺键联使肽中的α螺旋结构稳定(康登(Condon)，S.M.等人，(2002)生物有机化学与医药化学(Bioorg Med Chem)10：731-736)。
在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团与含有-SH的侧链连接形成环状二硫化物。举例来说，在一些实施例中，两个青霉胺或两个Cys侧链可连接以限制肽的构象(秋山K等人，(1985)美国科学院院刊82：2543-7)以便得到较长作用持续时间或较大受体选择性。
在一特定实施例中，上文和此处所描述的式I、式II或式III的肽产物具有以下结构：
其中A为如图1的表1中所描述的C1-C20烷基链，R′为如图1的表1中所描述的肽，式V的W2为-O-，且式V的W1为-(C＝O)NH-且为与连接到肽R′的酰胺键联的一部分。在一些所述实施例中，A为C6-C20烷基链。在一些所述实施例中，A为C1-C10烷基链。在一些所述实施例中，A为C12-C20烷基链。在一些所述实施例中，A为C12-C18烷基链。
在上文所描述的实施例中，使用氨基酸和/或肽R′的氨基部分(例如氨基酸残基(如赖氨酸或肽R′内的赖氨酸)的氨基)与以下结构的化合物形成共价键联：
其中A为如上文和图1的表1中所描述的C1-C20烷基链。
在所述情况下，具有用以与上文所描述的式A的化合物形成共价键联的氨基部分的氨基酸残基(例如肽R′内的赖氨酸)为连接到表面活性剂X的连接氨基酸U。因此，作为一个实例，图1的表1的Lys(C12)具有以下结构：
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖通过肽与任一个或两个羧酸基团共价键联制备的由基于麦芽糖醛酸的表面活性剂衍生的式I的肽产物。因此，作为一个实例，图1的表1中的肽包含键结到基于麦芽糖醛酸的表面活性剂X且具有以下结构的赖氨酸连接氨基酸：
应了解，在一个实施例中，如下制备式I化合物：将赖氨酸连接到基团X，随后将其它氨基酸残基和/或肽连接到赖氨酸-X化合物，获得式I化合物。应了解，本文所描述的其它天然或非天然氨基酸还适用于连接到表面活性剂X且适用于连接其它氨基酸/肽以获得式I化合物。应了解，在另一个实施例中，如下制备式I化合物：将全长或部分长度的肽连接到基团X，随后任选地连接其它氨基酸残基和/或肽，获得式I化合物。
本文还提供一种医药组合物，其包含治疗有效量的上文所描述的肽产物或其可接受的盐和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，载剂为水基载剂。在一些实施例中，载剂为非水基载剂。在一些实施例中，非水基载剂为类氢氟烷烃溶剂，其包含亚微米无水α-乳糖或其它赋形剂。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖使包含带有亲核基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式I的肽产物。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖使包含带有离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含亲核基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式I的肽产物。
应了解，在一个实施例中，如下制备式I的化合物：使连接氨基酸U与X反应，随后将其它残基添加到U中，获得式I的肽产物。应了解，在一替代实施例中，如下制备式I化合物：使包含连接氨基酸U的适合的肽与X反应，随后任选地将其它残基添加到U中，获得式I的肽产物。
本文进一步提供适用于合成本文所描述的肽产物的某些中间物和/或试剂。在某些实施例中，所述中间物和/或试剂为允许与肽共价键联的官能化表面活性剂。在某些实施例中，所述中间物为允许与肽共价键联的官能化1-烷基糖苷表面活性剂。在某些实施例中，所述中间物为连接到允许与其它氨基酸共价键联形成肽的可逆保护的连接氨基酸的官能化1-烷基糖苷表面活性剂。应了解，适当官能化的表面活性剂通过与位于连接氨基酸上的适当匹配的官能团反应而共价偶合到肽。
在一些实施例中，适用于合成本文所描述的肽产物的中间物为式IV化合物。因此，本文提供中间物和/或式IV化合物：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、保护基、天然或非天然氨基酸、被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、保护基、天然或非天然氨基酸、被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2为H、保护基、天然或非天然氨基酸、被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10。
在一些实施例中，每一天然或非天然氨基酸独立地为可逆保护或游离连接氨基酸。在一些所述实施例中，连接氨基酸为可逆保护或游离赖氨酸。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-；
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基或被取代或未被取代的1-芳烷基，
R2为D-或L-构型的可逆保护的赖氨酸。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-；
R1a为被取代或未被取代的C8-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基或被取代或未被取代的1-芳烷基，
R2为D-或L-构型的可逆保护的赖氨酸。
在一些所述实施例中，R1a为辛基、癸基、十二烷基、十四烷基或十六烷基。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-NH-或-(C＝O)-O-；
R2为被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基或被取代或未被取代的1-芳烷基，
R1a为D-或L-构型的可逆保护的丝氨酸或苏氨酸。
在一些所述实施例中，R2为辛基、癸基、十二烷基、十四烷基或十六烷基。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
m为1-6；
W1为-CH2-；
R1a为C1-C30烷基疏水性基团、1-烷氧基芳基或1-芳烷基，
R2为-N3、NH2、-C2-炔烃、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺、NH-(C＝O)-CH2-Br或NH-(C＝O)-CH2-I。
在式IV的一些实施例中，
n为1；
W1为-(C＝O)-O-；
R2为H，
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基疏水性基团。
在式IV的一些实施例中，R2连接到肽或为肽中的氨基酸残基。在一些所述实施例中，R2为可逆保护或游离赖氨酸。
在式IV的一些实施例中，n为1。在式IV的一些实施例中，n为2，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷。
在式IV的一些实施例中，n为3，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷，且第二糖苷通过第二糖苷的W2与第三糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第三糖苷。
本文提供一种合成上文所描述的肽产物的方法，其包含以下依序步骤：
(a)使式IV化合物偶合到肽；和
(b)任选地使步骤(a)的偶合的肽脱去保护基。
在一些实施例中，去保护包含使用弱酸和或弱碱处理。在所述方法的一些实施例中，去保护包含使用强酸。
在一些实施例中，所述方法进一步包含以下步骤：色谱、通过反相高效液相色谱使中间物脱盐或中间物的离子交换色谱。
本文提供一种改良肽的医药和药物行为，从而改良其作用持续时间、生物可用性或其在调配物中的稳定性的方法，所述方法包含将表面活性剂X共价连接到肽，其中：
X为
其中
A为疏水性基团；且
B为通过连接氨基酸共价连接到肽的亲水性基团。
在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C1-C30烷基链、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基。
在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C8-C20烷基链、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基或被取代或未被取代的1-芳烷基。
在一些实施例中，A为被取代或未被取代的C10-C20烷基链、被取代或未被取代的1-烷氧基芳基或被取代或未被取代的1-芳烷基。
在一些实施例中，B为官能化多元醇。
在一些实施例中，多元醇为糖。
在一些实施例中，糖为单糖、双糖或多糖。
在一些实施例中，糖选自葡糖醛酸、半乳糖醛酸、二葡糖醛酸和麦芽糖醛酸。
上文所描述的合成方法适用于合成所有本文所描述的化合物，包括式I、II、III、2-I-1、2-III、2-V、2-VI、2-VII、3-I-A、3-III-A、3-III-B或3-V的化合物和图1、图2、图8和图9中分别提供的表1、表2、表3和表4中的化合物。
本文提供一种改良肽的医药和药物行为，从而改良其作用持续时间、生物可用性或其在调配物中的稳定性的方法，所述方法包含将表面活性剂X共价连接到肽，其中：
X为
其中
A为被取代或未被取代的C1-C20烷基链、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；且
B为通过连接氨基酸共价连接到肽的糖。
在一些实施例中，表面活性剂为1-烷基糖苷类表面活性剂。
在一些实施例中，表面活性剂中的亲水性基团通过酰胺键连接到肽。
在一些实施例中，表面活性剂由以下组成：1-十六烷基-β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基-β-D-葡糖醛酸、1-十二烷基-β-D-葡糖醛酸、1-癸基-β-D-葡糖醛酸、1-辛基-β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基-β-D-二葡糖醛酸、1-十四烷基-β-D-二葡糖醛酸、1-十二烷基-β-D-二葡糖醛酸、1-癸基-β-D-二葡糖醛酸、1-辛基-β-D-二葡糖醛酸。
本文提供一种治疗有需要个体的疼痛的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的肽产物或式IV化合物。
本文还提供一种共价改性的肽和/或蛋白质产物，其包含如本文所描述的亲水性基团；和共价连接到所述亲水性基团的疏水性基团。在特定实施例中，共价改性的肽和/或蛋白质产物包含为糖的亲水性基团和为C1-C20烷基链或芳烷基链的疏水性基团。
附图说明
图1图1中的表1描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.1和149-169的序列。另外，如图1的表1中所示，图1的表1提供化合物EU-A101到EU-A199和EU-A600到EU-A649的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO2-148，和SEQ.ID.NO.645。图1的表1中的化合物和其在图1的表1中所示的各别SEQ.ID.NO.由此并入所提交的说明书中。
图2.图2中的表2描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.170-174和SEQ.ID.NO.283-302的序列。另外，如图2的表2中所示，图2的表2提供化合物EU-201到EU-299和EU-900-EU-908的SEQ.ID.编号，分别为SEQ.ID.NO.175-282。由此将图2的表2中的化合物和其在图2的表2中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图3.图3具有两个图。图3中的上图说明PTH1-34或PTHrP1-34与基于受体细胞外域的x-射线晶体结构的PTH R1受体(普罗扎克(Piozak)，A.A.等人，(2009)生物化学杂志(JBiol Chem)284：28382-391)之间的相互作用。说明残基23′(W或F)、24′(L)和28′(L或I)的关键疏水性相互作用。在一些情况下，本文所描述的改性的肽上的表面活性剂改性替换这些关键的疏水性相互作用。图3中的下图展示PTH1-34和PTHrP1-34的序列之间的结构比较，且说明序列和肽螺旋构象中的强一致性和同源性区域。
图4.图4展示培养物(SaOS2)中人类细胞对本文所描述的代表性肽产物EU-232刺激的cAMP反应。纵坐标(垂直轴)将所述反应展示为相对于内部分析标准物(亦即PTHrP)所示的最大反应的百分比形式。资料说明对EU-232的超促效反应。
图5.图5展示培养物(SaOS2)中人类细胞对用不同剂量的EU-285(人类PTHrP的编码样品)治疗的反应。纵坐标(垂直轴)将所述cAMP反应展示为内部分析标准物(亦即PTHrP)的最大反应的百分比形式。
图6.在皮下给予大鼠生理食盐水(G1)、每公斤80微克PTH(G2)、每公斤80微克EU-232(G3)或每公斤320微克EU-232(G4)后不同时间点测试大鼠血清中的血磷含量。如最大的统计上显著的作用所证明，这种表面活性剂改性的类似物EU-232展示作用持续时间延长，这种情况见于分析中的最后时间点(亦即给药后5小时)。参见实例6。
图7.在皮下给予大鼠生理食盐水(G1)、每公斤80微克PTH(G2)、每公斤80微克EU-232(G3)或每公斤320微克EU-232(G4)后不同时间点测试大鼠血清中的血钙含量。并无群组在统计上显著不同于对照组(G1)。此外，展示EU-232(G4；在5小时处)的最为有效的剂量和时间点并无升高且因此在最为有效的剂量下无倾向于高钙血症的迹象。参见实例6。
图8图8中的表3描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.303-305和SEQ.ID.NO.619-644的序列。另外，如图8的表3中所示，图8的表3提供化合物EU-A300到EU-A425的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO.306-431。由此将图8的表3中的化合物和其在图8的表3中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图9图9中的表4描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.303-305和SEQ.ID.NO.619-644。另外，如图9的表4中所示，图9的表4提供化合物EU-A426到EU-A599的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO.432-520。由此将图2的表2中的化合物和其在图9的表4中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图10图10说明GLP-1受体的细胞外域的结合位点的x射线晶体结构(朗格(Runge)，S.等人，(2008)生物化学杂志283：11340-7)且说明受体和配体肠促胰岛素类似物-4的关键疏水性粘结剂(Val19*、Phe22*、Trp25*、Leu26*)，其由位于本发明的肽上的表面活性剂的疏水性1′-烷基部分模拟并替换。
图11图11展示代表性化合物EU-A178的细胞分析资料，其是与30nM DPDPE竞争作用于含有μ类鸦片受体(MOP)的细胞且作为拈抗剂作用于δ类鸦片受体(DOP)。代表性化合物展示MOP促效剂分析中的有效全促效行为和作为纯拈抗剂作用于DOP受体的高度有效的作用。
具体实施方式
本文提供改性的肽和/或蛋白质，其包含共价连接到亲水性基团(即“头”)(例如多元醇(例如糖))的肽和/或蛋白质；亲水性基团共价连接到疏水性基团(即“尾”)，从而产生表面活性剂。在一些实施例中，将疏水连接的糖苷表面活性剂(例如烷基糖苷)部分用于共价改性肽或蛋白质会通过多种机制延长肽或蛋白质的作用持续时间，所述机制包括在体内投药部位形成药物储槽且结合到疏水性载体蛋白。在一些实施例中，将位阻并入肽和/或蛋白质结构中可防止蛋白酶接近肽和/或蛋白质产物且从而防止蛋白水解。在一些实施例中，如本文所描述的肽和/或蛋白质的表面活性剂改性(例如共价连接烷基糖苷类表面活性剂)增加跨粘膜屏障的转运。因此，本文所描述的肽和/或蛋白质的改性提供合乎需要的益处，包括且不限于保护免于蛋白水解和从投予部位缓慢移动，从而致使药物动力学行为延长(例如循环t1/2延长)且经黏膜生物可用性改良。
在一些实施例中，通过截短序列、引入限制和/或并入位阻以有益方式改变改良的肽和/或蛋白质与其受体的相互作用。本文描述使刚度与位阻并入改性的肽和/或蛋白质中的新颖烷基糖苷试剂。在一些实施例中，位阻赋予受体对本文所描述的改性的肽和/或蛋白质的选择性。在一些实施例中，位阻提供保护免于蛋白水解。
蛋白质和肽经受许多可影响效能和安全性的物理和化学变化。这些变化中有聚集，其包括二聚、三聚和形成如淀粉样蛋白的高级聚集体。对于基于肽和/或蛋白质的治疗剂，聚集为造成多种可能的有害效应的关键问题，所述可能的有害效应包括功效损失、药物动力学改变、稳定性降低或产品存放期缩短和诱发不合需要的免疫原性。自缔合肽的生物可用性和药物动力学可受聚集体尺寸和皮下部位非共价分子间相互作用的容易破环性影响(马吉(Maji)，S.K.等人，(2008)公共科学图书馆·生物学(PLoS Biol)6：e17)。在一些情况下，肽可聚集到皮下储槽中，经30天或30天以上的t1/2分离。所述缓慢溶解可产生有利效应，如由单次皮下注射递送一个月，产生所述低血液浓度使肽看起来在活体内不具活性。因此，疏水性聚集看起来可完全妨碍肽的生物可用性和有效性(克劳德菲特(Clodfelter)，D.K.等人，(1998)药学研究(Pharm Res)15：254-262)。
聚集与投予的肽和/或蛋白质治疗剂的免疫原性增加有关。避免这一问题的一种方法为较低浓度的溶液一起作用，然而在一些情况下，为便于投予则需要浓肽和蛋白质溶液。在一些情况下，在纯化和浓缩过程中添加多元醇(例如单糖或寡糖)或烷基糖苷到肽和/或蛋白质溶液中会减少或消除聚集，从而为制造过程提供较大效率，并且得到潜在免疫原性较小的最终产物。
FDA和其它管理机构已加强了其对聚集的审查，尤其因为与不合需要的免疫原性有这一潜在联系。由于非共价分子间相互作用，故自缔合肽的免疫原性可受聚集体的形成影响。举例来说，已展示干扰素会聚集，从而产生抗体反应(赫尔梅林(Hermeling)，S.，等人(2006)药物科学杂志(J Pharm Sci)95：1084-1096)。在许多接受重组EPO的患者中，在改变血清白蛋白来源和浓度的调配物变化之后，对红细胞生成素的抗体反应产生“纯红细胞再生障碍”，一种有可能威胁生命的副作用(卡萨德瓦利(Casadevall)，N.等人，(2002)新英格兰医学杂志(N Engl J Med)346：469-475)。胰岛素由于在超过冷藏所见温度下搅动时的蛋白质聚集而失去活性(派荣(Pezron)，I.等人，(2002)药物科学杂志91：1135-1146，斯鲁克(Sluzky)，V.等人，(1991)美国科学院院刊88：9377-9381)。基于单株抗体的治疗剂由于蛋白质聚集而不活化(金(King)，H.D.等人，(2002)药物化学杂志(J Med Chem)45：4336-4343)。高浓缩单株抗体调配物造成与那些抗体的聚集潜力相关的稳定性、制造和递送挑战。酶也可能由于聚集而失去活性。举例来说，已报导尿激酶的热灭活通过聚集发生(波特(Porter)，W.R.等人，(1993)血栓形成研究(Thromb Res)71：265-279)。
冻干期间的蛋白质稳定还会造成问题。蛋白质治疗剂在冻干并复原之后通常由于聚集体形成和沉淀而失去生物活性。在一些情况下，添加复原添加剂(包括例如硫酸化多糖、聚磷酸、氨基酸、聚乙二醇(PEG)和多种表面活性剂(张(Zhang)，M.Z.等人，(1995)药学研究12：1447-1452，弗尔克连(Vrkljan)，M.等人，(1994)药学研究11：1004-1008)会减少聚集。在一些情况下，使用醇或其它有机溶剂的组合进行溶解。三氟乙醇对保持肽结构有影响且已用于混合物中以稳定多种肽(罗卡塔诺(Roccatano)，D.等人，(2002)美国科学院院刊99：12179-12184)。危险的是所述药剂对粘膜织物具有恶劣影响，从而使患者产生不适或局部毒性效应。美国专利7,390,788和美国专利7,425,542描述烷基糖苷因其温和的非离子型清洁剂样效应而作为稳定剂的用途。然而，迄今为止尚未描述将烷基糖苷共价并入肽和/或蛋白质结构本身中。
共价连接到蛋白质的通常天然存在的寡糖不具有表面活性剂特征。在一些实施例中，本文所描述的肽和/或蛋白质产物具有共价连接的糖和赋予改性的肽表面活性剂特征的其它疏水性基团，从而可调整被表面活性剂改性的肽的生物可用性、免疫原性和/或药物动力学行为。
用寡糖改性的蛋白质和肽描述于以下：例如詹森(Jensen)，K.J.和布拉斯克(Brask)，J.(2005)生物聚合物(Biopolymers)80：747-761，通过使用酶促(吉森(Gijsen)，H.J.等人，(1996)化学评论(Chem Rev)96：443-474；西尔斯(Sears)，P.和王(Wong)，C.H.(1998)细胞和分子生命科学(Cell Mol Life Sci)54：223-252；郭(Guo)，Z.和邵(Shao)，N.(2005)医药研究评论(Med Res Rev)25：655-678)或化学方法(尤格(Urge)，L.等人，(1992)生物化学生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)184：1125-1132；萨尔瓦多(Salvador)，L.A.，等人(1995)四面体(Tetrahedron)51：5643-5656；奇赫博格(Kihlberg)，J.等人，(1997)酶学方法(Methods Enzymol)289：221-245；格雷戈瑞(Gregoriadis)，G.等人，(2000)细胞和分子生命科学57：1964-1969；查克拉波提(Chakraborty)，T.K.等人，(2005)糖复合物杂志(Glycoconj J)22：83-93；刘(Liu)，M.等人，(2005)碳水化合物研究(Carbohydr Res)340：2111-2122；佩恩(Payne)，R.J.等人，(2007)美国化学会志(J AmChem Soc)129：13527-13536；佩德森(Pedersen)，S.L.等人，(2010)生物化学(Chembiochem)11：366-374)并入糖或寡糖结构。肽以及蛋白质已通过糖基化改性(费莉娜(Filira)，F.等人，(2003)有机和生物分子化学(Org Biomol Chem)1：3059-3063)；(内格里，L.等人，(1999)药物化学杂志42：400-404)；(内格里，L.等人，(1998)英国药理学杂志(Br J Pharmacol)124：1516-1522)；罗基(Rocchi)，R.等人，(1987)国际肽蛋白研究杂志(Int J Pept Protein Res)29：250-261；费莉娜，F.等人，(1990)国际生物大分子杂志(IntJ Biol Macromol)12：41-49；戈博(Gobbo)，M.等人，(1992)国际肽蛋白研究杂志40：54-61；尤格，L.等人，(1992)生物化学生物物理学研究通讯184：1125-1132；杰达尼皮亚尔(Djedaini-Pilard)，F.等人，(1993)四面体通讯(Tetrahedron Lett)34：2457-2460；德鲁拉(Drouillat)，B.等人，(1997)生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Lett)7：2247-2250；罗荷夫(Lohof)，E.等人，(2000)德国应用化学(Angew Chem Int Ed Engl)39：2761-2764；格鲁纳(Gruner)，S.A.等人，(2001)有机化学通讯(Org Lett)3：3723-3725；潘恩(Pean)，C.等人，(2001)生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)1541：150-160；费莉娜，F.等人，(2003)有机和生物分子化学1：3059-3063；古腾堡(Grotenbreg)，G.M.等人，(2004)有机化学期刊(J Org Chem)69：7851-7859；比昂迪(Biondi)，L.等人，(2007)肽科学杂志(J Pept Sci)13：179-189；幸田(Koda)，Y.等人，(2008)生物有机化学与医药化学16：6286-6296；洛厄里(Lowery)J.J.等人，(2011)药理学与实验治疗学杂志(JPharmacol Exptl Therap)336：767-78；山本(Yamamoto)，T.等人，(2009)药物化学杂志52：5164-5175)。
然而，前述尝试未描述连接到与肽连接的寡糖的其它疏水性基团。因此，本文提供改性的肽和/或蛋白质，其并入有连接到与肽和/或蛋白质共价连接的糖和/或寡糖的疏水性基团且可调整生物可用性、免疫原性和/或药物动力学行为。因此，本文还提供使肽和/或蛋白质改性的包含寡糖和疏水性基团的表面活性剂试剂。
本文提供与肽共价键联的基于糖的表面活性剂改善肽和/或蛋白质特性的用途。在一些实施例中，如本文所描述的肽和/或蛋白质的表面活性剂改性(例如共价连接烷基糖苷类表面活性剂)增加跨粘膜屏障的转运。在一些实施例中，表面活性剂共价连接到肽和/或蛋白质产物会防止肽和/或蛋白质聚集。
本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质通过共价并入如烷基糖苷的表面活性剂作为新颖肽和蛋白质改性剂克服了肽药物的局限性，所述局限性包括且不限于作用持续时间短、生物可用性不良、聚集、免疫原性和缺少受体亚型特异性。
在某些情况下，表面活性剂的效应对于医药调配物的物理特性或性能是有益的，但会刺激皮肤和/或其它组织，且具体地说刺激粘膜，如鼻、口、眼睛、阴道、直肠、面颊或舌下区域中可见的粘膜。另外，在一些情况下，表面活性剂使蛋白质变性，因此破坏其生物功能。因为表面活性剂高于临界微胞浓度(CMC)就会发挥其效应，所以需要CMC低的表面活性剂，以便其可低浓度或少量但有效地用于医药调配物中。因此，在一些实施例中，适用于本文所描述的肽改性的表面活性剂(例如烷基糖苷)在纯水中或在水溶液中的CMC小于约1mM。仅举例来说，水中的烷基糖苷的某些CMC值为：辛基麦芽糖苷19.5mM；癸基麦芽糖苷1.8mM；十二烷基-β-D-麦芽糖苷0.17mM；十三烷基麦芽糖苷0.03mM；十四烷基麦芽糖苷0.01mM；蔗糖十二烷酸酯0.3mM。应了解，适合表面活性剂视所改性的肽和/或蛋白质而定可具有较高或较低的CMC。如本文所使用，“临界微胞浓度”或“CMC”为溶液中两亲性组分(烷基糖苷)的某一浓度，在这一浓度下溶液中开始形成微胞(球形微胞、圆杆、层状结构等)。在某些实施例中，烷基糖苷十二烷基、十三烷基和十四烷基麦芽糖苷或葡糖苷以及蔗糖十二烷酸酯、十三烷酸酯和十四烷酸酯具有较低CMC且适用于本文所描述的肽和/或蛋白质改性。
类鸦片肽和类似物
在一些实施例中，可经受本文所描述的肽改性方法的肽治疗剂类别为肽类鸦片治疗剂类别。这一类别衍生自在体内具有极宽范围的通过结合到μ(MOR)、δ(DOR)和κ(KOR)类鸦片受体来实现的功能的内源性肽类鸦片(席勒(Schiller)，P.W.(2005)美国药学科学家协会期刊(AAPS J)7：E560-565)。最受关注的是其在调节且具体地说抑制疼痛信号的传输和感觉中的作用。在所述药剂的研发中，中枢性副作用(呼吸抑制、指示自身投药的回应的位置偏好)为主要关注点，因此末梢作用剂颇具吸引力(斯坦(Stein)，C.等人，(2009)大脑研究评论(Brain Res Rev)60：90-113)。许多实验室的研究表明最佳药剂类别具有μ类鸦片受体促效作用，且可能具有δ受体拈抗作用(席勒，P.W.(201O)生命科学86：598-603)。
虽然内吗啡肽(贾内斯加(Janecka)，A.等人，(2007)当今医药化学(Curr MedChem)14：3201-3208)主要具有μ受体特异性，但构架的审慎改性可产生具有μ与δ选择性的分子(拉扎勒斯(Lazarus)，L.H.和奥卡达(Okada)，Y.(2012)治疗术专利专家评论22：1-14；凯雷斯泰什(Keresztes)，A.等人，(2010)药物化学(ChemMedChem)5：1176-96)。衍生自皮啡肽家族的是DALDA类的类似物(席勒，P.W.(2010)生命科学86：598-603)。还衍生自皮啡肽家族的是TIPP家族肽(席勒，P.W.，等人，(1999)生物聚合物51：411-25)。本文描述共价连接到烷基-糖苷表面活性剂的糖基且具有改良的医药特性的某些类鸦片肽。
一些本文所描述的示范性合成肽类似物衍生自内吗啡肽且一些衍生自皮啡肽，即两类天然肽类鸦片序列。一方面，本发明的天然序列的肽类似物为如EU-A101到EU-A115所说明的内啡肽相关的序列。另一方面，肽类似物为皮啡肽相关序列，如EU-A107、EU-A108以及EU-A120到EU-A133。相关类别的类鸦片肽类似物通过序列EU-A134到EU-A142所说明，其中Tic残基替换皮啡肽结构中所见的D-Ala残基(TIPP家族)。在用Tic(Ψ[CH2-NH])替换Tic时展示其它类别的特异性键联，这是因为这种情况需要互补的残基Ψ-Phe以完善键联。
在一些实施例中，表面活性剂改性的肽产物具有与通式III相对应的氨基酸序列：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式III(SEQ.ID.NO.1)
其中：
aa1为Tyr、Dmt、N-烷基-Tyr、N-烷基-Dmt、N-二烷基-Tyr、N-二烷基-Dmt等；
aa2为Pro、D-Arg、D-U(X)、D-Ala、Tic、Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe、Trp、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、CαMePhe、Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、D-或L-Nal(1)、D-或L-Nal(2)、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；
aa5不存在或为Pro、Aib、U(X)、D-或L-CαMeU(X)；
烷基或二烷基独立地为被取代或未被取代的C1-C10分支链或直链或被取代或未被取代的芳烷基链；
U为连接氨基酸；
X为连接到U的侧链的官能化表面活性剂；
Z为-OH或NH2。
在式III的一些特定实施例中，X具有以下结构：
其中：
A为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一个实施例中，N-烷基为N-甲基；U为二元氨基酸，如Lys或Orn；X为改性的1-烷基糖苷类非离子型清洁剂，其中烷基为C1-C20烷基或烷氧基芳基取代基，其中糖苷通过-O-或其它杂原子(例如S或N)键联到糖环；Z为NH2。
在另一个实施例中，1-烷基-糖苷中的1-烷基为被取代或未被取代的C1-C16烷基；U为Lys，Z为NH2；
aa1为Tyr、Dmt、Nα-Me-Tyr、Nα-Me-Dmt；
aa2为Pro；
aa3为Phe、Trp、Tmp；
aa4为Phe、Lys(X)；
aa5不存在或为Lys(X)。
在另一个实施例中，1-烷基糖苷中的1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基；Z为NH2；
aa1为Tyr、Dmt；
aa2为D-Arg、D-Lys(X)、Tic、Tic(Ψ[CH2-NH])；
aa3为Phe、Trp、Tmp、CαMePhe、Ψ-Phe；
aa4为Phe、Tmp、Lys(X)；
aa5不存在或为Pro、Aib、Lys(X)、D-或L-CαMeLys(X)。
内吗啡肽类亲本结构为：
内吗啡肽1-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2
内吗啡肽2-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2
某些类似物家族取代如下所示：
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5
Tyr Pro Phe Phe -NH2
Dmt Trp Tmp Lys(X)-NH2
N-烷基-Tyr Tmp Lys(X) Aib-NH2
N-烷基-Dmt CαMePhe CαMeLys(X) Pro-NH2
N-二烷基-Tyr D-或L-Nal(1) Pro
N-二烷基-Dmt D-或L-Nal(2)
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
某些序列含有以下氨基酸：
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5
Tyr Pro Phe Phe -NH2
Dmt Trp Tmp Lys(X)-NH2
Tmp Lys(X)
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
在特定实施例中，具有连接的表面活性剂的类似物包括且不限于：
位置1 位置2 位置3 位置4
EU-A101 Dmt Pro Tmp Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A102 Dmt Pro Tmp Lys(C8-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A103 Dmt Pro Tmp Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A105 Dmt Pro Tmp Phe-Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A106 Dmt Pro Tmp Phe-Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A162 Dmt Pro Phe Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A163 Dmt Pro Phe Lys(C8-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A164 Dmt Pro Phe Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A189 Dmt Pro Phe Phe-Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A190 Dmt Pro Phe Phe-Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
皮啡肽类亲本结构为：
亲本皮啡肽-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
某些类似物家族结构如下所示：
位置1 位置2 位置3 位置4
Tyr D-Arg Phe Phe NH2
Dmt D-Lys(X) Trp Tmp Lys(X)-NH2
N-烷基-Tyr D-Ala Tmp Lys(X) Pro-NH2
N-烷基-Dmt Tic CαMePhe CαMeLys(X) Aib-NH2
N-二烷基-Tyr Tic-(Ψ[CH2-NH]) Ψ-Phe
N-二烷基-Dmt D-或L-Nal(1) D-或L-Nal(1) D-或L-Nal(1)
D-或L-Nal(2) D-或L-Nal(2) D-或L-Nal(2)
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
在一些实施例中，某些适用于连接表面活性剂的类似物包括且不限于：
位置1 位置2 位置3 位置4
Tyr D-Arg Phe Phe NH2
Dmt D-Lys(X) Trp Tmp Lys(X)-NH2
Tic Tmp Lys(X) Pro-NH2
Tic-(Ψ[CH2-NH]) Ψ-Phe Aib-NH2
CαMePhe
D-或L-Nal(1) D-或L-Nal(1)
D-或L-Nal(2) D-或L-Nal(2)
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
在特定实施例中，适用于连接表面活性剂的类似物包括且不限于：
位置1 位置2 位置3 位置4
EU-A107 Dmt D-Lys(C1-葡糖醛酸基) Tmp Phe-NH2
EU-A108 Dmt D-Lys(C12-葡糖醛酸基) Tmp Phe-NH2
EU-A120 Dmt D-Lys(C8-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A121 Dmt D-Lys(C12-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A122 Dmt D-Lys(C16-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A123 Dmt D-Lys(C18-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A124 Dmt D-Lys(C20-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A125 Dmt D-Lys(C22-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A126 Dmt D-Lys(C24-葡糖醛酸基) Nal(1) Phe-NH2
EU-A178 Dmt Tic Phe Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A179 Dmt Tic Phe Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A180 Dmt Tic Phe Lys(C8-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A181 Dmt Tic Phe Lys(C10-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A182 Dmt Tic Phe Lys(C16-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A183 Dmt Tic Phe Lys(C18-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A184 Dmt Tic Phe Lys(C20-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A189 Dmt Tic Phe Phe-Lys(C1-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A190 Dmt Tic Phe Phe-Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A191 Dmt Tic Phe Phe-Lys(C8-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A600 Dmt Tic Phe Lys(C1-葡糖醛酸基)-Aib-NH2
EU-A601 Dmt Tic Phe Lys(C8-葡糖醛酸基)-Aib-NH2
EU-A603 Dmt Tic Phe Lys(C12-葡糖醛酸基)-Aib-NH2
EU-A615 Dmt Tic Phe D-Lys(C1-葡糖醛酸基)-Aib-NH2
EU-A616 Dmt Tic Phe D-Lys(C8-葡糖醛酸基)-Aib-NH2
EU-A618 Dmt Tic Phe D-Lys(C12-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A619 Dmt Tic Phe D-Lys(C16-葡糖醛酸基)-NH2
EU-A620 Dmt Tic Phe Lys(C1-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A621 Dmt Tic Phe Lys(C8-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A623 Dmt Tic Phe Lys(C12-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A624 Dmt Tic Phe Lys(C16-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A639 Dmt Tic Phe D-Lys(C1-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A642 Dmt Tic Phe D-Lys(C12-葡糖醛酸基)-NHCH2Ph
EU-A648 Dmt Tic Phe Lys(C16-葡糖醛酸基)-NH2
EU-649 Dmt Tic Phe Lys(C14-葡糖醛酸基)-NH2
X＝被1-(C1-C20烷基、芳氧基烷基等)取代的1-烷基葡糖醛酸基或1-烷基甘露糖醛酸基
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖如下在适合位置被取代的肽链：在连接氨基酸上(在例如Lys的ε-位置)用具有饱和或不饱和烷基链的脂肪酸(如辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、3-苯基丙酸等)酰化而对本文所主张的类似物进行取代(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学(Current Medicinal Chemistry)16：4399-4418；张(Zhang)，L和布拉吉(Bulaj)，G.(2012)当今医药化学19：1602-18)。所述类似物的非限制性说明性实例为：
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-乙酰基)-NH2，(SEQ.ID.NO.161)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-十二酰基)-NH2，(SEQ.ID.NO.162)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-十四酰基)-NH2，(SEQ.ID.NO.163)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-(γ-谷氨酰基)-N-α-十二酰基))-NH2，(SEQ.ID.NO.164)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-(γ-谷氨酰基)-N-α-十四酰基))-NH2，(SEQ.ID.NO.165)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-乙酰基)-NH-苯甲基，(SEQ.ID.NO.166)
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-十二酰基)-NH-苯甲基(SEQ.ID.NO.167)等。
在本发明的其它实施例中，肽链可通过在连接氨基酸(例如Cys的硫氢基)上与间隔基和疏水性部分(如类固醇核，例如胆固醇部分)反应而在适合位置被取代。在一些所述实施例中，改性的肽进一步包含一个或一个以上PEG链。所述分子的非限制性实例为：
H-Dmt-Tic-Phe-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))-NH2，(SEQ.ID.NO.168)
H-Dmt-Tic-Phe-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))-NH-苯甲基(SEQ.ID.NO.169)等。
如实例12中所描述，分析式I、式II或式III的化合物在细胞分析中的μ类鸦片受体活性(促效剂和拈抗剂模型中的MOP)，和在细胞分析中的δ2类鸦片受体活性(促效剂和拈抗剂模型中的DOP)。
在某些实施例中，如实例12中所示，具有纯MOP促效剂活性以及纯DOP拈抗活性的化合物为适用于临床应用的概况。本揭示案的范畴内还涵盖具有低溶解度和低活体外表观效能且展示延长的活体内作用(药效作用)持续时间的化合物。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖式I、式II或式III的肽产物，其中肽产物包含一个或大于一个表面活性剂基团(例如具有式I结构的基团X)。在一个实施例中，式I、式II或式III的肽产物包含一个表面活性剂基团。在另一个实施例中，式I、式II或式III的肽产物包含两个表面活性剂基团。在又一个实施例中，式I、式II或式III的肽产物包含三个表面活性剂基团。
PTH肽和类似物
在一些实施例中，本文还提供用于通过并入表面活性剂合成改性的肽和/或蛋白质(例如改性的PTH、PTHrP等)的试剂和中间物。
在一些实施例中，本文提供包含共价连接到肽的表面活性剂X的肽产物，所述肽包含连接氨基酸U和至少一个其它氨基酸
其中表面活性剂X为式2-I的基团：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10；
肽选自式2-II：
aa1-Val2-aa3-Glu4-aa5aa6-aa7-aa8-His9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-Z 式2-II(SEQ.ID.NO.170)
其中：
Z为OH或-NH-R3，
R3为H、被取代或未被取代的C1-C12烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为Aib、Ac5c或Deg；
aa3为Aib、Ac4c或Deg；
aa5为His或Ile；
aa6为Gln或Cit；
aa7为Leu或Phe；
aa8为Leu或Nle；
aa10为Asp、Asn、Gln、Glu、Cit、Ala或Aib；
aa11为Arg或hArg；
aa12为Gly、Glu、Lys、Ala、Aib或Ac5c；
aa13为Lys或Arg；
aa14为Ser、His、Trp、Phe、Leu、Arg、Lys、Glu或Nal(2)；
aa15为Ile、Leu或Aib；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Ser、Cit、Aib或U；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa18不存在或为Leu、Gln、Cit、Aib、Ac5c、Lys、Glu或U；
aa19不存在或为Arg、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa20不存在或为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa21不存在或为Arg、Val、Aib、Ac5C、Deg或U；
aa22不存在或为Phe、Glu、Aib、Ac5c、Lys或U；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U；
aa24不存在或为His、Arg或U；
aa25不存在或为His、Lys或U且
aa26不存在或为Aib、Ac5c、Lys；
U为包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团的天然或非天然氨基酸；
其中aa1-aa26中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16-aa26中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在一些实施例中，n为1。在一些实施例中，n为2，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷。在一些实施例中，n为3，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷，且第二糖苷通过第二糖苷的W2与第三糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第三糖苷。
在一个实施例中，式I-A的化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为H、保护基、被取代或未被取代的C1-C30烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-或-S-；
R2为一键、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺；且
m为1-10。
在另一个实施例中，式I-A的化合物为X具有以下结构的化合物：
因此，在上文所描述的实施例中，R2为一键。
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-C(＝O)NH-，R2为W1与肽内的氨基酸残基U(例如肽中存在的赖氨酸残基的侧链中的氨基)之间的键。
在另一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-CH2-且R2为位于X上的连接烷基的顺丁烯二酰亚胺官能团，且R2连接到肽内的氨基酸残基U的适合部分(例如肽的半胱氨酸残基中的巯基与X上的顺丁烯二酰亚胺形成硫醚)。
在又一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为H、保护基、被取代或未被取代的C1-C30烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；
R2为一键。
在另一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在上文和此处所描述的一些实施例中，R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基。
在上文和此处所描述的一些实施例中，R1a为被取代或未被取代的C6-C20烷基。
本文还涵盖式2-I-A中的X具有以下结构的替代实施例：
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-S-，R2为C1-C30烷基，W2为S，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的半胱氨酸残基中的巯基与X形成硫醚)。
在上文所描述的X结构的另一示范性替代实施例中，W1为-O-，R2为C1-C30烷基，W2为O，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的丝氨酸或苏氨酸残基中的羟基与X形成醚)。
在一些实施例中，U用于共价连接到X且为双碱基天然或非天然氨基酸、包含巯基的天然或非天然氨基酸、包含-N3基团的非天然氨基酸、包含炔系基团的非天然氨基酸或包含-NH-C(＝O)-CH2-Br或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺的非天然氨基酸，其中m为1-10。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂为1-烷基糖苷类表面活性剂。在肽产物的一些实施例中，表面活性剂通过酰胺键连接到肽。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂X由以下构成：1-二十烷基β-D-葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基βD-葡糖醛酸、1-十二烷基βD-葡糖醛酸、1-癸基β-D-葡糖醛酸、1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-二十烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-二葡糖醛酸、1-癸基β-D-二葡糖醛酸、1-辛基β-D-二葡糖醛酸或官能化1-二十烷基β-D-葡萄糖、1-十八烷基β-D-葡萄糖、1-十六烷基β-D-葡萄糖、1-十四烷基β-D-葡萄糖、1-十二烷基β-D-葡萄糖、1-癸基β-D-葡萄糖、1-辛基β-D-葡萄糖、1-二十烷基β-D-麦芽糖苷、1-十八烷基β-D-麦芽糖苷、1-十六烷基β-D-麦芽糖苷、1-十二烷基β-D-麦芽糖苷、1-癸基β-D-麦芽糖苷、1-辛基β-D-麦芽糖苷等，且肽产物通过在前述基团与肽上的基团(例如前述基团中的-COOH基团与肽的氨基)之间形成键联来制备。
在肽产物的一些实施例中，U为肽的末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为肽的非末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为天然D-或L-氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为非天然氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U选自Lys、Cys、Orn或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团。
在肽产物的一些实施例中，用于将肽共价连接到表面活性剂X的官能团为-NH2、-SH、-OH、-N3、卤乙酰基、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺(其中m为1-10)或炔系基团。
在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成环状内酰胺。举例来说，Lys14侧链可与Glu18的侧链形成环状内酰胺，或Lys18可与Glu22的侧链形成内酰胺。在一些实施例中，所述内酰胺结构是逆转的且由例如Glu14和Lys18形成。在一些情况下，所述内酰胺键联使肽中的α螺旋结构稳定(康登，S.M.等人，(2002)生物有机化学与医药化学10：731-736)。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为共价改性的PTH或其类似物。在一些所述实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为PTH的类似物。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为共价改性的PTHrP或其类似物。在一些所述实施例中，肽产物包含共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为PTHrP的类似物。
在一些实施例中，肽产物具有式2-III的结构：
aa1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-aa12-Arg13-aa14-Ile15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-Z 式2-III(SEQ.ID.NO.171)
其中：
Z为OH或-NH2；
aa1为Aib或Ac5c；
aa12为Ala、Glu、Lys、Aib或Ac5c；
aa14为Trp、Phe、Lys、Glu或Nal(2)；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Cit或U(X)；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5C或U(X)；
aa18不存在或为Leu、Gln、Aib、Lys、Glu或U(X)；
aa19不存在或为Arg、Glu、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa20不存在或为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c；
aa21不存在或为Arg、Val、Aib、Ac5C或Deg；
aa22不存在或为Phe、Glu、Lys或U(X)；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U(X)；
aa24不存在或为His、Arg或U(X)；
aa25不存在或为His、Lys或U(X)；且
aa26不存在或为Aib、Ac5c；
其中aa1-aa26中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16、aa17、aa18、aa22、aa23、aa24或aa25中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在式2-III的一些实施例中，U为本文所描述的任何连接氨基酸。在一些实施例中，式2-III化合物为aa12和aa16通过其侧链环化形成内酰胺键联的化合物。在一些实施例中，式2-III化合物为aa16和aa20通过其侧链环化形成内酰胺键联的化合物。
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)18-NH2。(SEQ.ID.NO.180)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2，其中烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.283)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Ac4c19-NH2，其中烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.284)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Glu*16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Lys*20-NH2，其中Glu*16和Lys*20通过其侧链由内酰胺连接，且烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.285)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Glu*12-Arg13-Trp14-Ile15-Lys*16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2，其中Glu*12和Lys*16通过其侧链由内酰胺连接，且烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.286)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Phe14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2，其中烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.287)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Aib20-NH2，其中烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.288)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Glu*12-Arg13-Trp14-Ile15-Lys*16-Aib17-Lys(N-ε-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Aib20-NH2，其中Glu*12和Lys*16通过其侧链由内酰胺连接，且烷基为十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。(SEQ.ID.NO.289)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2。(SEQ.ID.NO.207)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十四烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2。(SEQ.ID.NO.260)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十六烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2。(SEQ.ID.NO.261)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十八烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-NH2。(SEQ.ID.NO.262)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Aib20-NH2。(SEQ.ID.NO.275)
在一些实施例中，肽产物具有以下结构：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-1′-十六烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Aib20-NH2。(SEQ.ID.NO.277)
在一些实施例中，肽产物为结合到PTH受体(PTHR1)的生物学活性肽产物。
在一特定实施例中，上文和此处所描述的式2-I-A的肽产物具有以下结构：
其中R1a为如图2的表2中所描述的C1-C20烷基链，R′为如图2的表2中所描述的肽，式I-A的W2为-O-，且式2-I-A的W1为-(C＝O)NH-且为与肽R′的酰胺键联的一部分。在一些所述实施例中，R1a为C6-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C8-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C8-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C8-C18烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C8-C16烷基链。
在上文所描述的实施例中，使用氨基酸和/或肽R′的氨基部分(例如氨基酸残基(如赖氨酸或肽R′内的赖氨酸)的氨基)与以下结构的化合物形成共价键联：
其中R1a为如图2的表2中所描述的C1-C20烷基链。
在所述情况下，具有用以与上文所描述的化合物A形成共价键联的氨基部分的氨基酸(例如肽R′内的赖氨酸残基)为连接到具有式2-A结构的表面活性剂X的连接氨基酸U。因此，作为一个实例，图2的表2的Lys(C12)具有以下结构：
在本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖通过在任一个或两个羧酸官能团处结合而由基于麦芽糖醛酸的表面活性剂衍生的式2-I-A的肽产物。因此，作为一个实例，图2的表2中的肽包含键结到基于麦芽糖醛酸的表面活性剂X且具有以下结构的赖氨酸连接氨基酸：
应了解，在一个实施例中，如下制备式2-I-A的化合物：将赖氨酸连接到基团X，随后将其它氨基酸残基和/或肽连接到赖氨酸-X化合物获得式2-I-A化合物。应了解，本文所描述的其它天然或非天然氨基酸还适用于连接到表面活性剂X且适用于连接其它氨基酸/肽以获得式2-I-A化合物。应了解，在另一个实施例中，如下制备式2-I-A的化合物：将全长或部分长度的肽连接到基团X，随后任选地连接其它氨基酸残基和/或肽获得式2-I-A化合物。
在一特定实施例中，本文提供选自图2中的表2化合物的化合物。
本文还提供一种医药组合物，其包含治疗有效量的上文所描述的肽产物或其可接受的盐和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在医药组合物的一些实施例中，载剂为水基载剂。在医药组合物的一些实施例中，载剂为非水基载剂。在医药组合物的一些实施例中，非水基载剂为类氢氟烷烃溶剂，其包含亚微米无水α-乳糖或其它赋形剂。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖使包含带有亲核基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式2-I-A的肽产物。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖使包含带有离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含亲核基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式2-I-A的肽产物。
应了解，在一个实施例中，如下制备式2-I-A化合物：使连接氨基酸U与X反应，随后将其它残基添加到U中，获得式2-I-A的肽产物。应了解，在一替代实施例中，如下制备式2-I-A的化合物：使包含连接氨基酸U的适合肽与X反应，随后任选地将其它残基添加到U中，获得式2-I-A的肽产物。
本文提供治疗甲状旁腺功能减退的方法，所述方法包含向有需要个体投予治疗有效量的上文所描述的肽产物。在一些实施例中，甲状旁腺功能减退与骨骼质量减少有关。
本文还提供刺激骨骼修复或有利于移植骨骼植入物的方法，所述方法包含向有需要个体投予治疗有效量的上文所描述的肽产物。
本文还提供一种共价改性的PTH或PTHrP肽或其类似物，其包含如本文所描述的亲水性基团；和共价连接到所述亲水性基团的疏水性基团。在特定实施例中，共价改性的肽和/或蛋白质产物包含为糖的亲水性基团和为C1-C20烷基链或芳烷基链的疏水性基团。
在一个实施例中，提供一种通过与表面活性剂共价键联以增加或维持组合物或分子的生物作用(例如受体结合或酶活性)而对分子进行化学改性的方法。在一些实施例中，分子为肽。所述方法又可包括进一步改性，其包含将组合物中的分子共价连接到如聚乙二醇的聚合物。
在另一个实施例中，提供一种通过将肽链共价连接到至少一个烷基糖苷(其中烷基具有1到30个碳原子)而降低或消除肽和/或蛋白质药物的免疫原性的方法。
还提供一种治疗甲状旁腺功能减退、骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病(Paget's disease)、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、老年骨质疏松症、体液性高钙血症等的方法，所述方法包含投予包含共价连接到至少一个烷基糖苷的肽且递送到脊椎动物的药物组合物，其中烷基具有1到30个碳原子，或进一步6到16个范围内的碳原子，且其中烷基糖苷共价键联到肽会增加药物的稳定性、生物可用性和/或作用持续时间。
在一些实施例中，共价改性的肽和/或蛋白质为共价改性的PTH或PTHrP或其类似物，通过用烷基糖苷表面活性剂部分共价改性对其进行改性以改良其医药和医学特性。这些表面活性剂改性的类似物的位阻增加，由此阻止蛋白水解，减缓吸收且减缓身体清除。
一些研究显示约50％患有骨质疏松症的患者在第一年内会中止口服双膦酸盐治疗。在中止这些治疗的患者中，许多患者这样做是因为包括不耐性的副作用。虽然截短重组甲状旁腺激素1-34(rhPTH1-34)可以作为特立帕肽(teriparatide)(Lilly)的骨骼合成代谢剂(布里克森(Brixen)，K.T.等人，(2004)基础与临床药理学与毒理学(Basic ClinPharmacol Toxicol)94：260-270；多布尼格(Dobnig)，H.(2004)药物疗法新观点杂志(Expert Opin Pharmacother)5：1153-1162)购得，但顺应性不良仍是一个严重问题。近年来，已核准针对控制破骨细胞功能的配体的抗体(地诺单抗(denosumab)，安进公司(Amgen))，但其具有明显的已知副作用(严重皮肤感染、观察到颚骨坏死的情况和明显抑制骨骼重塑)，其中一些可具有尚不清楚的长期影响。
骨骼结构
通过致使骨骼再吸收的破骨细胞和造出新骨基质的成骨细胞的协调作用维护并且精心制造人的骨骼架构。骨骼为体内储存钙(关键信号传导离子)的重要储槽，且周围细胞外Ca含量降低通过甲状旁腺细胞膜上的Ca感应受体使PTH分泌增加。PTH与其存在于成骨细胞细胞膜上的受体(PTHR1)结合，从而表达“细胞核因子-κB的受体活化子的配体”(RANKL)。RANKL与其在破骨细胞前体上的受体RANK结合，从而刺激其分化和增殖(博伊斯(Boyce)，B.F.和邢(Xing)，L.(2007)关节炎研究与治疗(Arthritis Res Ther)9增刊1：S1)。由此致使骨骼再吸收、钙从骨骼移动。PTH还用以增加肾小管Ca再吸收并且通过其对肾脏1-α胆钙化醇羟化酶的刺激作用(增加循环钙三醇)间接增强肠Ca吸收。两种作用用以使循环钙离子长期增加。
天然形式的人类甲状旁腺激素(hPTH)为在维持哺乳动物的钙体内平衡中起重要作用的84-氨基酸肽(罗斯(Rosen)，C.J.和比利兹垦(Bilezikian)，J.P.(2001)临床内分泌代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)86：957-964)。结构上相关但独立的激素，即甲状旁腺激素相关的蛋白质(PTHrP)起旁分泌作用，集中于局部组织中的骨骼生长。两种激素皆结合到成骨细胞上的相同受体PTHR1，并且致使活化多个信号传导路径，包括通过cAMP含量增加来调节的路径。
然而PTH(1-34)间歇存在仅使得成骨细胞受到刺激、RANKL表达缺乏并且骨骼密度增加。PTH(1-34)展示在通过间歇注射以外源方式给予时对骨架的有效合成代谢影响。一小组患者通过每日皮下注射而接受特立帕肽6-24个月(里夫(Reeve)，J.等人，(1980)英国医学杂志(Br Med J)280：1340-1344)，且成对的骨骼活检体揭示髂小梁骨的体积实质上增加，证明有新骨骼形成并且表明骨骼形成与再吸收速率之间不相关。大量的研究证实在每日注射PTH类似物之后骨骼组织得以改善(豪德斯曼(Hodsman)，A.B.等人，(2005)内分泌评论(Endocr Rev)26：688-703；程(Cheng)，Z.等人，(2009)骨与矿物研究杂志(J Bone MinerRes)24：209-220)。对文献的评论支持以下观察结果：每日注射特立帕肽之后在骨架内发生架构改良，此结果与在用抗再吸收剂治疗之后观察到的骨骼架构相反，后者主要是通过抑制成骨细胞活性起作用以减少骨转换，由此保持而非建构新骨骼。
外源性PTH(1-34)的连续而非间歇投予会引起骨骼吸收。由此由输注PTH(1-34)不到6小时的治疗致使骨骼密度增加，但输注超过8小时或更长会引起骨骼再吸收(弗罗黎克(Frolik)，C.A.等人，(2003)骨(Bone)33：372-379)。延长PTH(1-34)投予使RANKL得以表达、成骨细胞前体上的RANK活化，由此刺激其分化和增殖(博伊斯，B.F.和邢，L.(2007)关节炎研究与治疗9增刊1：S1)。这一观察结果已产生当前治疗模式，每日一次通过皮下注射投予PTH(1-34)。近年来，输注PTH(1-34)一天且戒断一周的研究显示骨骼密度的重要增益(江藤(Etoh)，M.和山口(Yamaguchi)，A.(2010)骨矿物质研究杂志(J Bone Miner Metab)，28：641-9))。特立帕肽的Cmax为10分钟且半衰期为19分钟(弗罗黎克，C.A.等人，(2003)骨33：372-379)。可预期更有效的PTH类似物会产生更大量的骨骼密度增加。
在PTH(1-34)和PTH(1-84)的毒理学研究期间，观察到相当大百分比的大鼠从约20个月开始显现骨肉瘤(塔什吉安(Tas hjian)，A.H.，Jr.和戈尔茨曼(Goltzman)，D.(2008)骨与矿物研究杂志23：803-811)。在重组PTH(1-34)(即特立帕肽())的人类试验中未报导治疗相关的肉瘤。然而，用当前疗法治疗限于连续每日皮下注射不到2年。
PTH和PTHrP
在一些实施例中，本文所描述的方法和组合物包含使用PTH和/或PTHrP肽和/或蛋白质和/或其类似物。完整人类PTH(hPTH1-84)的所有生物活性均存在于N端序列中；大多数临床研究已使用称为特立帕肽的34-氨基酸肽hPTH(1-34)。前两个氨基酸对于生物活性具有专性，且骨骼合成代谢特性看起来会通过缩短的片段hPTH(1-31)或其环化内酰胺而充分维持(惠特菲尔德(Whitfield)，J.F.和莫雷(Morley)，P.(1995)药物学研究进展(TrendsPharmacol Sci)16：382-386)。近年来，短到hPTH(1-11)的序列的研究显示具有活性，且可进行进一步改性以将其EC50降到低nM范围(清水(Shimizu)，M.等人，(2000)生物化学杂志275：21836-21843；清水，N.等人，(2004)骨与矿物研究杂志19：2078-2086)。
PTH和PTHrP与PTH1R的相互作用的研究指示配体各自具有两个结合区，一个在N端1-14区域中且另一个在C端15-34区域中。1-14部分具有更局部有序的结构且与受体的7-跨膜区相互作用，而15-34区域为α螺旋状的且与受体的细胞外N末端延伸相互作用。尽管这些肽的N端区域通过这种近膜区相互作用看起来具有主要受体活化作用，但C端螺旋状区域通过与受体细胞外区域相互作用(迪恩(Dean)，T.等人，(2006)生物化学杂志281：32485-32495；普特瓦(Potetinova)，Z.等人，(2006)生物化学(Biochemistry)45：11113-11121)而具有产生较高配体效能的重要结合相互作用(图2)(加德拉(Gardella)，T.J.等人，(1994)内分泌学(Endocrinology)135：1186-1194；勒克(Luck)，M.D.等人，(1999)分子内分泌学(Mol Endocrinol)13：670-680)。由此产生还会延伸到B类GPCR家族的其它成员的两结构域结合模型(霍尔特曼(Holtmann)，M.H.等人，(1995)生物化学杂志270：14394-14398；贝格维茨(Bergwitz)，C.等人，(1996)生物化学杂志271：26469-26472；朗格，S.等人，(2003)生物化学杂志278：28005-28010)。
因此，本文提供具有使得结合到PTH1R的序列的共价改性的肽或肽类似物。PTH/PTHrP类中的配体的共价改性依赖于N端配体序列的出现，所述序列与偶合到C端区域的PTHR1的近膜部分相互作用，所述C端区域通过使用表面活性剂部分截短且简化(例如1-烷基-葡糖醛酸部分，如衍生自葡萄糖的1-烷基葡糖醛酸)。因为大部分C端区域相互作用涉及与受体细胞外区域中的疏水性通道的一般疏水性相互作用(皮奥斯扎克(Pioszak)，A.A.和徐(Xu)，H.E.(2008)美国科学院院刊105：5034-5039；皮奥斯扎克，A.A.，等人(2009)生物化学杂志284：28382-28391)，所以本文所描述的共价改性通过低特异性相互作用使结合相互作用增加。
通过本文所描述的表面活性剂改性的肽改良细胞刺激的实例示于图4中。因此，与内部标准物人类PTHrP相比，用一定剂量的EU-232刺激的细胞显示实质上较大的cAMP输出(125％；超促效刺激)(图5)。类似地，编码的人类PTHrP样本(图6；EU-285)获得仅100％的最大内部分析标准物(即人类PTHrP)刺激。EU-232在C端区域中用1-十二烷基β-D-葡糖醛酸部分改性。重要地是，预期较短肽链或未用1-十二烷基β-D-葡糖醛酸部分改性的这种尺寸的肽链显示功效降低。
类似地，对这一表面活性剂改性的类似物EU-232的活体内反应显示高效能和延长的作用持续时间(图7)。测试给予大鼠生理食盐水(G1)、每公斤80微克PTH(G2)、每公斤80微克EU-232(G3)或每公斤320微克EU-232(G4)后不同时间点的血磷含量。EU-232展示作用持续时间延长是由于在分析中最后的时间点(给药后5小时)可见最大的统计上显著的效应。
如图7中所示，测试给予大鼠生理食盐水(G1)、每公斤80微克PTH(G2)、每公斤80微克EU-232(G3)或每公斤320微克EU-232(G4)后不同时间点的血钙含量。并无群组在统计上显著不同于对照组(G1)。重要地是，展示EU-232(G4；在5小时处)的最为有效的剂量和时间点并无升高且因此在最为有效的剂量下无倾向于高钙血症的迹象。高钙血症为投予PTH1-34和PTH的有效类似物之后可见的重要副作用。
上文和图中所描述的与得到本文所描述的肽的表面活性剂改性有关的改良对其在医学中的用途有重要意义。所述分子适于每日一次或不太频繁地投予使用以得到相比于用如PTH(T1/2为30分钟，通过皮下注射)或PTHrP的短效天然激素治疗增强的生物结果。可预期表面活性剂改性的肽(如EU-232)在鼻内吹入投予时由于表面活性剂对经鼻生物可用性的熟知影响而显示较大生物效应。
因此，在一些实施例中，本文所描述的表面活性剂改性的肽产物减少蛋白水解降解的发生。在一些实施例中，共价改性PTH和/或PTHrP和/或其类似物使治疗剂的生产成本降低，且由于共价连接的表面活性剂部分的存在而提供有利医药特性。在一些实施例中，相比于缺乏所述共价改性的其它已知肽配体(如迪恩等人的肽配体(迪恩，T.，等人(2006)生物化学杂志281：32485-32495))，本文所描述的表面活性剂改性的PTH和/或PTHrP会延长所得配体的PK和作用持续时间(PD)行为。本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖长期并且安全投予表面活性剂改性的PTH和/或PTHrP和/或其类似物。
在一些情况下，N端结合区中止于约残基14处并且螺旋状区域涵盖残基16向前。因此，在1-14区域最佳化并且在15向前区域进行1-烷基葡糖醛酸改性的配体具有高效能(1-烷基改性)的高特异性结合(N端)。在C端区域使用α-螺旋状稳定取代(考尔(Kaul)，R.和巴拉茹阿玛(Balaram)，P.(1999)生物有机化学与医药化学7：105-117)产生较高螺旋含量和较高效能。常用α-螺旋状稳定剂为Ala和1，1-二烷基氨基酸类，如Aib、Ac4c、Ac5c等(参见以下定义)。使PTH结构减到最小产生缩短类似物(清水，M.等人，(2000)生物化学杂志275：21836-21843)，其中受限制α-螺旋状稳定剂会产生重要的效能增加。举例来说，将Aib取代到PTH1-14和PTH1-11类似物的位置1和3使效能增加(清水，N.等人，(2001)生物化学杂志276：49003-49012)。将更多受阻α-螺旋状稳定剂并入位置1中使效能进一步增加(清水，N.等人，(2004)骨与矿物研究杂志19：2078-2086)。将Aib取代到PTH1-34类似物的多个位置中还会使效能改良，位置12和13处的取代尤其如此(佩吉(Peggion)，E.等人，(2003)生物聚合物68：437-457)。然而，显示简单PTH1-11序列的位置1和3中的Aib不可接受(巴拉扎(Barazza)，A.等人，(2005)肽研究杂志(J Pept Res)65：23-35)。因此，在一些实施例中，PTH和/或PTHrP的α-螺旋状内含物为具有肽产物稳定性的决定子(马克思(Marx)，U.C.等人，(1995)生物化学杂志270：15194-15202；斯基耶瓦诺(Schievano)，E.等人，(2000)生物聚合物54：429-447)。
在一些实施例中，如在本文所描述的共价肽改性中的Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-赖氨酸中使用长侧链使α-螺旋不稳定。因此，本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖包含α-螺旋状稳定剂的改性。因此，在一些实施例中，本文所描述的表面活性剂改性的肽产物包含螺旋稳定剂(例如在表面活性剂取代的刚好N端和/或刚好C端的位置中)。在一些实施例中，α-螺旋稳定剂位于PTH和/或PTHrP链中的位置12处。仅举例来说，下表所描述EU-212到EU-282，亦即某些包含α-螺旋稳定剂的表面活性剂改性的肽产物(EU-212到EU-282)。
一方面，共价改性且适用于本文所描述的方法的肽为PTHrP和/或相关激素PTH的截短类似物，其包括且不限于：
hPTH(1-34)：Ser1-Val2-Ser3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10-Leu11-Gly12-Lys13-His14-Leu15-Asn16-Ser17-Met18-Glu19-Arg20-Val21-Glu22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys26-Lys27-Leu28-Gln29-Asp30-Val31-His32-Asn33-Phe34-OH；(SEQ.ID.NO.290)或
hPTHrP(1-34)：Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-Ser14-Leu15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Phe22-Phe23-Leu24-His25-His26-Leu27-Ile28-Ala29-Glu30-Ile31-His32-Thr33-Ala34-OH(SEQ.ID.NO.291)
在一些实施例中，本文所描述的肽产物具有式2-V的结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-Z 式2-V(SEQ.ID.NO.172)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或C1-C12烷基；或小于10Da的PEG链。
aa1为Ala、Ser、Val、Pro、Aib、Ac5c或Deg；
aa2为Val；
aa3为Ser、Ala、Aib、Ac4c或Deg；
aa4为Glu；
aa5为His或Ile；
aa6为Gln或Cit；
aa7为Leu或Phe；
aa8为Leu、Met或Nle；
aa9为His；
aa10为Asp、Asn、Gln、Glu、Cit、Ala或Aib；
aa11为Lys、Leu、Ile、Arg或hArg；
aa12为Gly、Ala、Glu、Lys、Aib或Ac5c；
aa13为Lys或Arg；
aa14为Ser、His、Trp、Phe、Leu、Arg、Lys、Glu、Nal(2)或环化到位置aa18；
aa15为Ile、Leu、Aib；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Ser、Cit、Aib、Ac5c、U(X)；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5c、U(X)、Z；
aa18不存在，为Leu、Gln、Cit、Aib、Ac5c、Lys、Glu或U(X)，或环化到位置aa14；
aa19不存在，为Arg、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20不存在，为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21不存在，为Arg、Val、Aib、Ac5c、Deg或U(X)；
aa22不存在，为Phe、Glu、Aib、Ac5c、Lys、U(X)或环化到位置aa18或aa26；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U(X)；
aa24不存在，为His、Arg、Leu、Aib、Ac5c或U(X)；
aa25不存在，为His、Lys、Arg或U(X)；
aa26不存在，为His、Lys、Arg、Aib、Ac5c或环化到位置aa22；
aa27不存在，为Leu或Lys；
aa28不存在，为Ile或Leu；
aa29不存在，为Ala、Gln、Cit或Aib；
aa30不存在，为Glu、Asp或Aib；
aa31不存在，为Ile、Val、Aib、Ac5C或U(X)；
aa32不存在，为His、Aib、Ac5C或U(X)；
aa33不存在，为Thr、Asn、Aib、Ac5C或U(X)；
aa34不存在，为Ala、Phe、Aib、Ac5C或U(X)；
aa35不存在，为Aib、Ac5C或U(X)；
aa36不存在，为Aib、Ac5C或U(X)；
U为连接氨基酸；且
X为连接到U的侧链的表面活性剂；
其中aa1-aa36中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa1-aa36中的一者或至少一者为U。
在一些实施例中，本文所描述的肽产物包含如上文所描述的式V的aa1-aa20(SEQ.ID.NO.292)。在一些实施例中，本文所描述的肽产物包含如上文所描述的式V的aa1-aa19(SEQ.ID.NO.293)。
在特定实施例中，连接氨基酸U为如Lys或Orn的二氨基酸，X为连接到U的来自1-烷基糖苷类的改性的表面活性剂，且Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或C1-C12；或小于10Da的PEG链。
在一些实施例中，本文所描述的肽产物具有式2-VI的结构：
aa1-Val2-aa3-Glu4-aa5aa6-aa7-aa8-His9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-Z 式2-VI(SEQ.ID.NO.173)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H、C1-C12烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为Aib、Ac5c、Deg；
aa3为Aib、Ac4c、Deg；
aa5为His、Ile；
aa6为Gln、Cit；
aa7为Leu、Phe；
aa8为Leu、Nle；
aa10为Asp、Asn、Gln、Glu、Cit、Ala、Aib；
aa11为Arg、hArg；
aa12为Gly、Ala、Glu、Lys、Aib、Ac5c；
aa13为Lys、Arg；
aa14为Ser、His、Trp、Phe、Leu、Arg、Lys、Nal(2)；
aa15为Ile、Leu、Aib；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Ser、Cit、Aib、U(X)；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5c、U(X)；
aa18不存在或为Leu、Gln、Cit、Aib、Ac5c、Lys、Glu、U(X)；
aa19不存在或为Arg、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c、U(X)；
aa20不存在或为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c、U(X)；
aa21不存在或为Arg、Val、Aib、Ac5C、Deg、U(X)；
aa22不存在或为Phe、Glu、Lys或U(X)；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U(X)；
aa24不存在或为Leu、His、Arg或U(X)；
aa25不存在或为His、Lys或U(X)且
aa26不存在或为Aib、Ac5c；
U为连接氨基酸；
X为连接到U的来自1-烷基糖苷类的改性的表面活性剂，其中1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基或被取代或未被取代的C1-C20芳烷基；
其限制条件为aa1-aa26中的一者或至少一者为U。
在一些实施例中，本文所描述的肽产物具有式2-VII的结构
aa1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-aa12-Arg13-aa14-Ile15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-Z 式2-VII(SEQ.ID.NO.174)
其中：
Z为OH或-NH2；
aa1为Aib、Ac5c；
aa12为Ala、Glu、Lys、Aib、Ac5c；
aa14为Trp、Phe、Nal(2)；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Cit、U(X)；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5c、U(X)；
aa18不存在或为Leu、Gln、Aib、U(X)；
aa19不存在或为Arg、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c；
aa20不存在或为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c；
aa21不存在或为Arg、Val、Aib、Ac5C、Deg；
aa22不存在或为Phe、Glu、Lys或U(X)；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U(X)；
aa24不存在或为His、Arg或U；
aa25不存在或为His、Lys或U且
aa26不存在或为Aib、Ac5c；
U为连接氨基酸；且
X为连接到U的来自1-烷基糖苷类的改性的表面活性剂，其中1-烷基为被取代或未被取代的C1-C20烷基或被取代或未被取代的C1-C20芳烷基；
其限制条件为aa1-aa26中的一者或至少一者为U。
在一些实施例中，肽产物具有式2-III的结构：
aa1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-aa12-Arg13-aa14-Ile15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-Z 式2-III(SEQ.ID.NO.171)
其中：
Z为OH或-NH2；
aa1为Aib或Ac5c；
aa12为Ala、Aib、Glu、Lys或Ac5c；
aa14为Trp、Phe、Lys、Glu或Nal(2)；
aa16为Gln、Asn、Glu、Lys、Cit或U(X)；
aa17为Asp、Ser、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18不存在或为Leu、Gln、Aib、Lys、Glu或U(X)；
aa19不存在或为Arg、Glu、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa20不存在或为Arg、Glu、Lys、Aib、Ac4c、Ac5c；
aa21不存在或为Arg、Val、Aib、Ac5C或Deg；
aa22不存在或为Phe、Glu、Lys或U(X)；
aa23不存在或为Leu、Phe、Trp或U(X)；
aa24不存在或为His、Arg或U(X)；
aa25不存在或为His、Lys或U(X)；且
aa26不存在或为Aib、Ac5c；
其中aa1-aa26中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16、aa17、aa18、aa22、aa23、aa24或aa25中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在上文式2-III的一特定实施例中，X具有以下结构：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一些上文所描述的实施例中，R1a为C1-C20烷基、C1-C18烷基、C1-C16烷基或C1-C12烷基。在一些式2-III的实施例中，U为本文所描述的任何连接氨基酸。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖式2-I-A、式2-III、式2-V、式2-VI或式2-VII的肽产物，其中肽产物包含一个或一个以上表面活性剂基团(例如具有式I结构的基团X)。在一个实施例中，式2-I-A、式2-III、式2-V、式2-VI或式2-VII的肽产物包含一个表面活性剂基团。在另一个实施例中，式2-I-A、式2-III、式2-V、式2-VI或式2-VII的肽产物包含两个表面活性剂基团。在又一个实施例中，式2-I-A、式2-III、式2-V、式2-VI或式2-VII的肽产物包含三个表面活性剂基团。
图2中的表2说明适用于与如本文所描述的表面活性剂共价键联的肽的某些实例。
本文认识到SEQ.ID.NO.170的某些部分对治疗与骨质流失和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的重要性，所述病状包括且不限于骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、发炎性骨质流失、植入物固定、颚骨坏死、干细胞增殖、老年骨质疏松症、体液性高钙血症等。
因此，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.170的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.170的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.170的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.170的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投予上文所描述的所述PTH类似物使骨骼密度增加。
本文认识到SEQ.ID.NO.171、173、174、645或646的某些部分治疗与骨质流失和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的重要性。所述病状包括且不限于骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、发炎性骨质流失、植入物固定、颚骨坏死、干细胞增殖、老年骨质疏松症、体液性高钙血症等。
因此，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.171、173、174、290或291的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.171、173、174、290或291的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.171、173、174、290或291的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的与骨质流失(例如骨质疏松症)和/或甲状旁腺功能亢进有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的PTH类似物，所述PTH类似物包含SEQ.ID.NO.171、173、174、290或291的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投予上文所描述的所述PTH类似物使骨骼密度增加。
在任一个上文所描述的实施例中，所述PTH类似物用式2-I的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为键结到U的键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基、或被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10。
在一特定实施例中，所述PTH类似物用具有以下结构的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一些上文所描述的实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
可任选地将氨基或羧基末端处的改性引入肽中(例如PTH或PTHrP)(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418)。举例来说，如一些肽所见，肽可在N端处截短或酰化以得到展示低功效、部分促效剂和拈抗剂活性的肽类似物(顾雷特(Gourlet)，P.等人，(1998)欧洲药理学杂志(Eur J Pharmacol)354：105-111，高茜斯(Gozes)，I.和弗曼(Furman)，S.(2003)当代药物设计(Curr Pharm Des)9：483-494)，所述文献的内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，缺失bPTH的前6个残基得到拈抗类似物(马哈菲(Mahaffey)，J.E.，等人，(1979)生物化学杂志254：6496-6498；高曼(Goldman)，M.E.等人，(1988)内分泌学123：2597-2599)]且对本文所描述的肽的类似操作产生有效拈抗类似物。对肽的N端的其它改性(如缺失或并入D-氨基酸(如D-Phe))在用本文所描述的改性(如长链烷基糖苷)取代时还可得到有效且长效促效剂或拈抗剂。所述促效剂和拈抗剂还具有商业效用且在本文所描述的涵盖实施例的范畴内。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖PTH(例如7-34残基类似物)或PTHrP的N端截短，从而提供反向促效剂(加德拉，T.J.等人，(1996)内分泌学137：3936-3941)或拈抗剂。在一些实施例中，PTH和/或PTHrP的反向促效剂和/或拈抗剂适用于治疗与多种肿瘤有关的“体液性高钙血症”。
本文所描述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到肽类似物的表面活性剂，其中如下来改性天然肽：乙酰化、酰化、聚乙二醇化、ADP核糖基化、酰胺化、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、将氨基酸以转移RNA介导的方式添加到蛋白质中(如精氨酰基化)和泛素化。参见例如(内斯特，J.J.，Jr.(2007)综合医药化学数据库(Comprehensive Medicinal Chemistry)II2：573-601，内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418，克赖顿(Creighton)，T.E.(1993，沃尔德(Wold)，F.(1983)蛋白质的翻译后共价改性(Posttranslational Covalent Modification ofProteins)1-12，塞夫特(Seifter)，S.和恩格拉德(Englard)，S.(1990)酶学方法182：626-646，拉坦(Rattan)，S.I.，等人(1992)纽约科学院年报(Ann N Y Acad Sci)663：48-62)。
本文所描述的实施例的范畴内还涵盖分支链或环状肽(有或没有分支链)。环状、分支链和分支链环形肽由翻译后天然过程产生且还通过适合合成方法制得。在一些实施例中，本文所描述的任何肽产物包含上文所描述的肽类似物，其接着共价连接到烷基-糖苷表面活性剂部分。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖如下在适合位置被取代的肽链：例如在连接氨基酸上(在例如Lys的ε-位置)用脂肪酸(如辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、3-苯基丙酸等)或饱和或不饱和烷基链酰化而对本文所主张的类似物进行改性(张，L.和布拉吉，G.(2012)当今医药化学19：1602-1618)。所述类似物的非限制性说明性实例为：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十二酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.294)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十二酰基)18-NH2，(SEQ.ID.NO.295)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十六酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.296)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Phe14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十二酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.297)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十四酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.298)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-十四酰基)18-Aib19-Aib20-NH2，(SEQ.ID.NO.299)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Lys(N-ε-(Nα-十二酰基-L-谷氨酰基))18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.300)等。
在其它实施例中，肽链可通过在连接氨基酸(例如Cys的硫氢基)上与间隔基和疏水性部分(如类固醇核，例如胆固醇部分)反应而在适合位置被取代。在一些所述实施例中，改性的肽进一步包含一个或一个以上PEG链。所述分子的非限制性实例为：
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.301)
Ac5c1-Val2-Aib3-Glu4-Ile5-Gln6-Leu7-Nle8-His9-Gln10-hArg11-Ala12-Arg13-Trp14-Ile15-Gln16-Aib17-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))18-NH2，(SEQ.ID.NO.302)等。
GLP肽和类似物
在一些实施例中，本文还提供用于通过并入表面活性剂合成改性的肽和/或蛋白质(例如改性的GLP-1、胰高血糖素、胰高血糖素或GLP-1的类似物等)的试剂和中间物。
在一些实施例中，本文提供包含共价连接到肽的表面活性剂X的肽产物，所述肽包含连接氨基酸U和至少一个其它氨基酸：
其中表面活性剂X为式I的基团：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10；
肽选自式3-II：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-Z 式3-II(SEQ.ID.NO.303)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或C1-C12被取代或未被取代的烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为His、N-Ac-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、Ala、Gly、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、F2Phe、Me2Phe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip或Bip2EtMeO；
aa11为Ser、Asn或U；
aa12为Lys、Glu、Ser、Arg或U；
aa13不存在或为Tyr、Gln、Cit或U；
aa14不存在或为Leu、Met、Nle或U；
aa15不存在或为Asp、Glu或U；
aa16不存在或为Ser、Gly、Glu、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U；
aa17不存在或为Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa18不存在或为Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa19不存在或为Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa20不存在或为Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa21不存在或为Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa22不存在或为Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa23不存在或为Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa24不存在或为Gln、Ala、Glu、Cit或U；
aa25不存在或为Trp、Nal2或U；
aa26不存在或为Leu或U；
aa27不存在或为Met、Val、Nle、Lys或U；
aa28不存在或为Asn、Lys或U；
aa29不存在或为Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa30不存在或为Lys、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa31不存在或为Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa32不存在或为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa33不存在或为Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa34不存在或为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa35不存在或为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U；
aa36不存在或为Ile、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa36不存在或为Ala、Aib、Ac4c、Ac5C或U；
aa37不存在或为U；
U为包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团的天然或非天然氨基酸；
其中aa1-aa37中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa11-aa37中的一者或至少一者为共价连接到X的连接氨基酸U。
在一些实施例中，n为1。在一些实施例中，n为2，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷。在一些实施例中，n为3，且第一糖苷通过第一糖苷的W2与第二糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第二糖苷，且第二糖苷通过第二糖苷的W2与第三糖苷的OR1b、OR1c或OR1d中的任一者之间的键连接到第三糖苷。
在一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为H、保护基、被取代或未被取代的C1-C30烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-S-；
R2为一键、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺；且
m为1-10。
在另一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
因此，在上文所描述的实施例中，R2为一键。
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-C(＝O)NH-，R2为W1与肽内的氨基酸残基U(例如肽中存在的赖氨酸残基的侧链中的氨基)之间的键。
在另一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-CH2-且R2为位于X上的连接烷基的顺丁烯二酰亚胺官能团，且R2连接到肽内的氨基酸残基U的适合部分(例如肽的半胱氨酸残基中的巯基与X上的顺丁烯二酰亚胺形成硫醚)。
在又一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为H、保护基、被取代或未被取代的C1-C30烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为H、保护基或被取代或未被取代的C1-C30烷基；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；
R2为一键。
在另一个实施例中，式I-A化合物为X具有以下结构的化合物：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在上文和此处所描述的一些实施例中，R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基。
在上文和此处所描述的一些实施例中，R1a为被取代或未被取代的C6-C20烷基。
本文还涵盖式3-I-A中的X具有以下结构的替代实施例：
举例来说，在上文所描述的X结构的示范性实施例中，W1为-S-，R2为C1-C30烷基，W2为S，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的半胱氨酸残基中的巯基与X形成硫醚)。
在上文所描述的X结构的另一示范性替代实施例中，W1为-O-，R2为C1-C30烷基，W2为O，R1a为W2与肽内的氨基酸残基U的适合部分之间的键(例如肽的丝氨酸或苏氨酸残基中的羟基与X形成醚)。
在一些实施例中，U用于共价连接到X且为双碱基天然或非天然氨基酸、包含巯基的天然或非天然氨基酸、包含-N3基团的非天然氨基酸、包含炔系基团的非天然氨基酸或包含-NH-C(＝O)-CH2-Br或-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺的非天然氨基酸，其中m为1-10。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂为1-烷基糖苷类表面活性剂。在肽产物的一些实施例中，表面活性剂通过酰胺键连接到肽。
在肽产物的一些实施例中，表面活性剂X由以下构成：1-二十烷基β-D-葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基βD-葡糖醛酸、1-十二烷基βD-葡糖醛酸、1-癸基β-D-葡糖醛酸、1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-二十烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-二葡糖醛酸、1-十二烷基β-D-二葡糖醛酸、1-癸基β-D-二葡糖醛酸、1-辛基β-D-二葡糖醛酸或官能化1-二十烷基β-D-葡萄糖、1-十八烷基β-D-葡萄糖、1-十六烷基β-D-葡萄糖、1-十四烷基β-D-葡萄糖、1-十二烷基β-D-葡萄糖、1-癸基β-D-葡萄糖、1-辛基β-D-葡萄糖、1-二十烷基β-D-麦芽糖苷、1-十八烷基β-D-麦芽糖苷、1-十六烷基β-D-麦芽糖苷、1-十二烷基β-D-麦芽糖苷、1-癸基β-D-麦芽糖苷、1-辛基β-D-麦芽糖苷等，且肽产物通过在前述基团与肽上的基团(例如前述基团中的-COOH基团与肽的氨基)之间形成键联来制备。
在肽产物的一些实施例中，U为肽的末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为肽的非末端氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为天然D-或L-氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U为非天然氨基酸。在肽产物的一些实施例中，U选自Lys、Cys、Orn或非天然氨基酸，其包含用于共价连接到表面活性剂X的官能团。
在肽产物的一些实施例中，用于将肽共价连接到表面活性剂X的官能团为-NH2、-SH、-OH、-N3、卤乙酰基、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺(其中m为1-10)或炔系基团。
在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成环状内酰胺。举例来说，在一些实施例中，Lys侧链与Glu的侧链形成环状内酰胺。在一些实施例中，所述内酰胺结构是逆转的且由Glu和Lys形成。在一些情况下，已知所述内酰胺键联使肽中的α螺旋结构稳定(康登，S.M.等人，(2002)生物有机化学与医药化学10：731-736；米拉吉(Murage)，E.N.等人，(2008)生物有机化学与医药化学16：10106-12)；米拉吉，E.N.等人，(2010)药物化学杂志53：6412-20)。在一些实施例中，半胱氨酸残基可通过形成双硫键进行连接以实现类似形式的构象限制并且参与螺旋结构形成(李(Li)，Y.等人，(2011)肽(Peptides)32：1400-1407)。在一些实施例中，两个不同氨基酸残基的侧链官能团连接形成通过侧链叠氮化物和炔烃官能团之间的“点击反应”产生的杂环，以获得类似形式的构象限制和稳定的螺旋构象(雷希瓦利埃以撒(Le Chevalier Isaad)A.等人，(2009)肽科学杂志(J PeptideSci)15：451-4)。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为共价改性的胰高血糖素或其类似物。在一些所述实施例中，肽产物含有共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为胰高血糖素的类似物。
在一些实施例中，包含共价连接的烷基糖苷的肽产物为共价改性的GLP-1或其类似物。在一些所述实施例中，肽产物包含共价连接的1-O-烷基β-D-葡糖醛酸，且肽为GLP-1的类似物。
在一些实施例中，式I-A的肽产物具有式III-A的结构
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-Z 式3-III-A(SEQ.ID.NO.304)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或C1-C12被取代或未被取代的烷基或小于10Da的PEG链；
aa1为His、N-Ac-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、Ala、Gly、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、F2Phe、Me2Phe或Nal2；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip或Bip2EtMeO；
aa11为Ser、Asn或U；
aa12为Lys、Glu、Ser、Arg或U(X)；
aa13不存在或为Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14不存在或为Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15不存在或为Asp、Glu或U(X)；
aa16不存在或为Ser、Gly、Glu、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U(X)；
aa17不存在或为Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18不存在或为Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19不存在或为Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20不存在或为Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21不存在或为Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22不存在或为Phe、Trp、Nal2、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23不存在或为Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa24不存在或为Gln、Ala、Glu、Cit或U(X)；
aa25不存在或为Trp、Nal2或U(X)；
aa26不存在或为Leu或U(X)；
aa27不存在或为Met、Val、Nle、Lys或U(X)；
aa28不存在或为Asn、Lys或U(X)；
aa29不存在或为Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
其中aa1-aa29中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23、aa24、aa25、aa26、aa27、aa28或aa29中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在一些实施例中，式I-A的肽产物具有式3-III-B的结构：
His1-aa2-aa3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-Z 式3-III-B(SEQ.ID.NO.305)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或被取代或未被取代的C1-C12烷基；或小于10Da的PEG链；
aa2为Ser、Ala、Gly、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa6为Phe、Trp、F2Phe、Me2Phe、MePhe或Nal2；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip或Bip2EtMeO；
aa11为Ser、Asn或U(X)；
aa12为Lys、Glu、Ser或U(X)；
aa13不存在或为Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14不存在或为Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15不存在或为Asp、Glu或U(X)；
aa16不存在或为Ser、Gly、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c、Lys、R或U(X)；
aa17不存在或为Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18不存在或为Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19不存在或为Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20不存在或为Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21不存在或为Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22不存在或为Phe、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23不存在或为Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
其中aa1-aa23中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23或aa24的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，U为本文所描述的任何连接氨基酸。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，U为本文所描述的任何连接氨基酸。在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa12为赖氨酸。在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa14为白氨酸。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa12为赖氨酸。在式I-A、III-A、III-B或式V的一些实施例中，aa14为白氨酸。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa18为连接到X的赖氨酸残基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa17为高精氨酸(hArg)残基。
在式I-A、III-A、III-B或式V的一些实施例中，aa17为甘氨酸残基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa2为Aib或Ac4c残基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽包含一个或一个以上Aib残基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽在C端包含一个或一个以上Aib残基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.619)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-NH2；其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa17为Arg、hArg或Gln；
aa19为Aib、Ac4c或Ac5c；且
烷基为C8到C20直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.620)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-aa20-NH2；其中
aa2为Aib或Ac4c，
aa17为Arg、hArg或Gln，
aa19和aa20个别地为Aib、Ac4c或Ac5c；且
烷基为C8到C20直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.621)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-NH2；其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa16为Aib或Ac4c；
aa17为Arg、hArg或Gln；
aa19为Aib、Ac4c或Ac5c；且
烷基为C8到C20直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa16和aa20环化形成内酰胺键联。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构：(SEQ.ID.NO.622)
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17Ala18-Ala19-aa20-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)24-Trp25-Leu26-aa27-Asn28-Thr29-NH2；其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa16和aa20各自个别地为Lys或Glu且通过其侧链环化形成内酰胺键联；
aa17为Arg、hArg或Gln；
aa27为Met或Nle；且
烷基为C8-C20直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.623)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环状(Glu16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20)-Glu21-Phe22-Ile23-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-aa29-NH2；其中aa2为Aib或Ac4c，aa29为Thr、Aib、Ac4c或Ac5c，且1′-烷基选自十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基；且氨基酸上位置16和20中的侧链环化形成侧链内酰胺。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，aa12和aa16环化形成内酰胺键联。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.624)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-aa12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-aa20-NH2；其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa12和aa16各自个别地为Lys或Glu且通过其侧链环化形成内酰胺键联；
aa17为Arg或hArg；
aa19和aa20个别地为Aib、Ac4c或Ac5c；且
烷基为C8-C20直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.625)：
His1-Ac4c2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-环(Glu12-Tyr13-Leu14-Asp15-Lys16)-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-Aib19-Aib20-NH2；其中
aa12和aa16通过其侧链环化形成内酰胺键联；
aa17为Arg或hArg；且
烷基为C12、C14、C16或C18直链烷基链。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.626)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-aa12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-aa20-NH2；
其中
aa12和aa16各自个别地为Lys或Glu；
且aa12和aa16通过其侧链环化形成内酰胺键联；aa17为Arg或hArg；aa19和aa20个别地为Aib、Ac4c或Ac5c；且1′-烷基选自十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.627)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Aib17-Lys(N-ω-1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-NH2；其中aa2为Aib或Ac4c，aa6为Me2Phe、MePhe或Phe；且aa19为Aib、Ac4c或Ac5c。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.628)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-aa17-Lys(N-ω-1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-aa20-NH2；其中aa2为Aib或Ac4c，aa6为Me2Phe、MePhe或Phe；aa17为Arg或hArg，且aa19或aa20为Aib、Ac4c或Ac5c。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.629)：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-环(Glu16-Arg17-Ala18-Ala19-Lys20)-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)21-Phe22-aa23-NH2；其中aa23为Aib、Ac4c或Ac5c且1′-烷基选自十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.630)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-aa12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-aa18-Ala19-aa20-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)21-Phe22-aa23-NH2；
其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa6为Me2Phe、MePhe或Phe；
aa12和aa16各自个别地为Lys或Glu；
且aa16和aa20通过其侧链环化形成内酰胺键联；
aa17为Arg、hArg或Gln；
aa18为Aib或Ala；
aa23为Aib、Ac4c或Ac5c且1′-烷基选自十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。
在式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的一些实施例中，肽产物具有以下结构(SEQ.ID.NO.631)：
His1-aa2-Gln3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-aa12-Tyr13-Leu14-Asp15-aa16-aa17-Lys(N-ω-1′-烷基β-D-葡糖醛酸基)18-aa19-aa20-NH2；
其中
aa2为Aib或Ac4c；
aa6为Phe；
aa12和aa16各自个别地为Lys或Glu；且aa12和aa16通过其侧链环化形成内酰胺键联；
aa17为Arg或hArg；
aa19为Aib、Ac4c或Ac5c；
aa20为Aib、Ac4c或Ac5c且1′-烷基选自十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。
在一些实施例中，对于式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的任何化合物而言，X由十二烷基烷基链构成。
在一些实施例中，肽产物为结合到GLP1R和/或GLCR的生物学活性肽产物。
在一特定实施例中，上文和此处所描述的式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物具有以下结构：
其中R1a为如图1的表1中所描述的C1-C20烷基链，R′为如图8的表3和图9的表4中所描述的肽，式I-A的W2为-O-，且式I-A的W1为-(C＝O)NH-且为键联到肽R′的酰胺键联的一部分。在一些所述实施例中，R1a为C6-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C8-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C12-C20烷基链。在一些所述实施例中，R1a为C12-C16烷基链。
在上文所描述的实施例中，使用氨基酸和/或肽R′的氨基部分(例如氨基酸残基(如赖氨酸或肽R′内的赖氨酸残基)的氨基)与以下结构的化合物形成共价键：
其中R1a为如上文和图8的表3和图9的表4中所描述的C1-C20烷基链。
在所述情况下，用以与上文所描述的化合物A形成共价键联的具有氨基部分的氨基酸残基(例如肽R′内的赖氨酸)为连接到具有式A结构的表面活性剂X的连接氨基酸U。因此，作为一个实例，图8的表3和图9的表4的Lys(C12)具有以下结构：
在本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖由通过在任一个或两个羧酸官能团处结合而由基于麦芽糖醛酸的表面活性剂衍生的式3-I-A的肽产物。因此，作为一个实例，图8的表3和图9的表4中的肽包含键结到基于麦芽糖醛酸的表面活性剂X且具有以下结构的赖氨酸连接氨基酸：
应了解，在一个实施例中，如下制备式3-I-A的化合物：将赖氨酸连接到基团X，随后将其它氨基酸残基和/或肽连接到赖氨酸-X化合物获得式3-I-A化合物。应了解，本文所描述的其它天然或非天然氨基酸还适用于连接到表面活性剂X且适用于连接其它氨基酸/肽以获得式3-I-A化合物。应了解，在另一个实施例中，如下制备式3-I-A的化合物：将全长或部分长度的肽连接到基团X，随后任选地连接其它氨基酸残基和/或肽以获得式3-I-A化合物。
在一特定实施例中，本文提供选自图8中的表3和图9中的表4的化合物的化合物。
本文还提供医药组合物，其包含治疗有效量的上文所描述的肽产物或其可接受的盐和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在医药组合物的一些实施例中，载剂为水基载剂。在医药组合物的一些实施例中，载剂为非水基载剂。在医药组合物的一些实施例中，非水基载剂为类氢氟烷烃溶剂，其包含亚微米无水α-乳糖或其它赋形剂。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖使包含带有亲核基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式3-I-A的肽产物。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖使包含带有离去基或可被活化而含有离去基的官能团(例如羧酸)或任何其它反应基团的连接氨基酸U的氨基酸和/或肽与包含亲核基团的基团X反应，从而通过连接氨基酸U使氨基酸和/或肽共价键联到表面活性剂X，得到式I-A的肽产物。
应了解，在一个实施例中，如下制备式3-I-A化合物：使连接氨基酸U与X反应，随后将其它残基添加到U中，获得式3-I-A的肽产物。应了解，在一替代实施例中，如下制备式3-I-A的化合物：使包含连接氨基酸U的适合肽与X反应，随后任选地将其它残基添加到U中，获得式3-I-A的肽产物。
本文提供治疗与胰岛素抗性有关的病状的方法，其包含投予式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的化合物。
本文提供治疗以下疾病的方法：糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、创伤愈合、抗胰岛素症、高血糖症、高胰岛素血症、新陈代谢综合症、糖尿病并发症、游离脂肪酸或甘油血液含量升高、高脂质血症、肥胖症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、急性心脏血管综合症、梗塞形成、缺血性再灌注或高血压，所述方法包含向有需要个体投予治疗有效量的上文和此处所描述的肽产物。
本文提供减少重量增加或诱导体量减轻的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的上文和此处所描述的肽产物。
本文提供治疗特征为与肥胖症相关的抗胰岛素症或新陈代谢综合症的哺乳动物病状的方法，其包含向有需要个体投予体量减轻诱导或对胰岛素敏感的量的上文和此处所描述的肽产物。
在一些实施例中，待治疗的病状为新陈代谢综合症(综合症X)。在一些实施例中，待治疗的病状为糖尿病。在一些实施例中，待治疗的病状为高脂质血症。在一些实施例中，待治疗的病状为高血压。在一些实施例中，待治疗的病状为包括动脉粥样硬化的血管病或特征为C反应蛋白升高的全身性发炎。
在所述方法的一些实施例中，用于投予的肽产物的有效量为约0.1μg/kg/天到约100.0μg/kg/天、或0.01μg/kg/天到约1mg/kg/天或0.1μg/kg/天到约50mg/kg/天。
本文提供治疗新陈代谢综合症或其组分疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的上文所描述的肽产物。在一些实施例中，新陈代谢综合症病状已发展成糖尿病。
本文还提供一种共价改性的GLCR和/或GLP1R结合肽或其类似物，其包含如本文所描述的亲水性基团；和共价连接到所述亲水性基团的疏水性基团。在特定实施例中，共价改性的肽和/或蛋白质产物包含为糖的亲水性基团和为C1-C20烷基链或芳烷基链的疏水性基团。
胰岛素抗性
与长期高血糖症有关的风险包括微血管并发症、感觉神经病、心肌梗塞、中风、大血管死亡和全因死亡的风险增加。2型糖尿病的病因还与肥胖症(即另一种全球流行病)有关。在2007年全世界将至少2320亿美元花在治疗和预防糖尿病上，其中在工业化国家中四分之三的钱花在治疗长期并发症和综合护理上，如努力防止微血管和大血管并发症。在2007年，美国经济中糖尿病(归因于糖尿病的病废、生产能力丧失和早亡)的估计间接花费为580亿美元。
肥胖症会引起胰岛素抗性，即通过减少胰岛素受体的量和减少那些受体与关键细胞内信号传导系统的偶合使体内细胞对胰岛素刺激的反应能力降低。肥胖病况进一步引起“新陈代谢综合症”，即一系列具有极大保健后果的疾病(胰岛素抗性、高血压、动脉粥样硬化等)。如果足够早地诊断出胰岛素抗性，则由旨在减少热量摄入和体脂肪的生活方式干预并且通过药物治疗以校正血糖控制可预防或延缓明显的2型糖尿病。尽管治疗准则推荐及早进行积极干预，但许多患者未能达到血糖控制的目的。许多因素均会导致成功地处理2型糖尿病失败，所述因素包括社会心理学和经济影响和可获得的抗糖尿病药的功效、便利性和耐受性概况中的不足。本文所描述的肽和/或蛋白质产物经过设计能克服这些缺点。
肠促胰岛素效应
使用“肠促胰岛素效应”描述以下现象：经口递送的葡萄糖负荷相比于静脉内投予的相同葡萄糖负荷产生较大胰岛素分泌。这种效应由肠L细胞分泌的至少两种肠促胰岛素激素介导。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)被鉴别为肠促胰岛素，且认为健康个体可自肠促胰岛素效应得到多达70％的其膳食胰岛素分泌反应。
通常，肠促胰岛素肽响应于摄取的养分视需要进行分泌，并且由于二肽基肽酶IV(DPP-4)的降解而具有短血浆半衰期。在患有2型糖尿病的人中，胰脏对GLP-1的反应性削弱，但胰岛素分泌反应可由药理学剂量的人类GLP-1得以恢复(基弗(Kieffer)，T.J.等人，(1995)内分泌学136：3585-3596)。另外，GLP-1促进β-细胞新生和保存(艾鲍(Aaboe)，K.等人，(2008)糖尿病、肥胖与代谢(Diabetes Obes Metab)10：994-1003)。GLP-1如对心脏功能具有其它有益效应：例如改良人类个体的左心室功能(索科斯(Sokos)，G.G.等人，(2006)心力衰竭杂志(J Card Fail)12：694-699)。GLP-1还可减缓人类胃排空并且降低食欲(托夫特-尼耳森(Toft-Nielsen)，M.B.等人，(1999)糖尿病护理(Diabetes Care)22：1137-1143)。
用GLP-1的代谢稳定且长效类似物治疗糖尿病患者描述于例如德拉布(Drab)，S.R.(2010)药物治疗(Pharmacotherapy)30：609-624中，面临与使用便利性和副作用(如恶心、发生胰脏炎和甲状腺癌的风险)相关的问题。GLP-1类似物提供胰岛素分泌的葡萄糖依赖性刺激且使发生低血糖症的风险降低。另外，尽管如下文所描述糖尿病的许多当前治疗会导致重量增加，但GLP-1类似物却诱发饱食和轻度重量损失。因此，在一些实施例中，本文提供GLP-1类似物，其为长效的并且以低剂量投予从而减少与当前治疗有关的副作用。
已知许多肽肠激素可调节食欲(桑格(Sanger)，G.J.和李(Lee)，K.(2008)自然评论药物发现(Nat Rev Drug Discov)7：241-254)。若干肽来源于例如以下的胰高血糖素前原基因产物的组织特异性酶法加工(激素原转化酶；PC)：胰高血糖素、GLP-1、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、肠高血糖素和调酸催素(OXM)(杜拉克(Drucker)，D.J.(2005)自然临床实践内分泌代谢杂志(Nat Clin Pract Endocrinol Metab)1：22-31；辛克莱(Sinclair)，E.M.和杜拉克，D.J.(2005)生理学(Physiology)(贝塞斯达(Bethesda))20：357-365)。GLP-1、GLP-2、肠高血糖素和OXM在肠中响应于进食而自L-细胞共同分泌。或者对胰高血糖素前原进行加工(PC2)在胰岛中的α-细胞中产生胰高血糖素。OXM的结构基本上为具有8个残基的C末端延伸的胰高血糖素。
除刺激胰岛素生物合成和葡萄糖依赖性胰岛素分泌之外，GLP-1和其稳定模拟物(例如艾塞那肽(Byetta))在动物模型(马克(Mack)，C.M.等人，(2006)国际肥胖症杂志(IntJ Obes)(伦敦(Lond))30：1332-1340)和2型糖尿病患者(DeFronzo，R.A.，等人(2005)糖尿病治疗28：1092-1100；Buse，J.B.，等人(2010)糖尿病治疗33：1255-1261)中还会产生适度重量损失。胰高血糖素输注会减少人的食物摄入(吉尔里(Geary)，N.等人，(1992)美国生理学杂志(Am J Physiol)262：R975-980)，而脂肪组织的连续胰高血糖素治疗还将促进脂解(汉克梅尔(Heckemeyer)，C.M.等人，(1983)内分泌学113：270-276)和重量损失(索尔特(Salter)，J.M.等人，(1960)新陈代谢(Metabolism)9：753-768；陈(Chan)，E.K.等人，(1984)实验与分子病理学(Exp Mol Pathol)40：320-327)。胰高血糖素对能量代谢具有广泛影响(黑普纳(Heppner)，K.M.等人，(2010)生理行为(Physiol Behav))。胰高血糖素或类似物可以诊断方式用于肠道的暂时性麻痹。因此，来自胰高血糖素前原蛋白质的PC加工的产物中的至少两者与饱食和新陈代谢效应有关。
在啮齿动物中，重复腹膜内投予OXM(胰高血糖素前原的三级产物)与相较于对照的白色脂肪组织降低和重量减轻有关(戴金(Dakin)，C.L.等人，(2004)内分泌学145：2687-2695)。Oxm在静脉内输注投予正常重量人类期间使食物摄入减少19.3％，且这种效应在输注之后将持续12小时以上(科恩(Cohen)，M.A.等人，(2003)临床内分泌代谢杂志88：4696-4701)。经4周时间治疗志愿者产生持续饱食效应和反映体脂肪减少的重量损失(魏恩(Wynne)，K.等人，(2005)糖尿病(Diabetes)54：2390-2395)。
OXM与GLP-1和胰高血糖素在结构上同源，且使胰高血糖素受体(GCGR)和GLP-1受体(GLP1R)活化，但效能为齐名配体的1/100到1/10。另外，OXM与GLP1R相互作用的研究表明与GLP-1相比其对β-抑制蛋白募集具有不同影响(乔根森(Jorgensen)，R.等人，(2007)实验治疗学杂志(J Pharmacol Exp Ther)322：148-154)，因此充当“偏向”配体。OXM的独特受体已搜寻了许多年，但尚未阐明且认为其通过GLP1R和GCGR路径起作用。因此，本文提供诱发饱食、重量损失、减缓胰岛素抗性和/或延缓前期糖尿病进展到糖尿病的肠肽的表面活性剂改性的方法。
GLP-1
鉴于上文所描述的胰高血糖素前原蛋白质产物对饱食和代谢的复合和相互作用的行为，来自多个群组的工作人员已研究GLP-1和胰高血糖素结构的结构活性关系。显示整个序列的残基接受置换。举例来说，已广泛接受通过Ala在GLP-1的N端区域，尤其在2、3、5、8、11和12处置换(阿德赫斯特(Adelhorst)，K.等人，(1994)生物化学杂志269：6275-6278)。
显示能够结合到GLP1R和GLCR的嵌合类似物可通过将来自GLP-1的C端残基接枝到胰高血糖素的N端上获得(约尔特(Hjorth)，S.A.等人，(1994)生物化学杂志269：30121-30124)。位置3处的残基(GLP1中的酸性Glu或胰高血糖素或OXM中的中性Gln)使胰高血糖素(朗格，S.，等人(2003)生物化学杂志278：28005-28010)或OXM(普卡(Pocai)，A.等人，(2009)糖尿病58：2258-2266)对G1P1R的亲和力降低。研究对用GLP-1的稳定类似物或在位置3具有Gln的胰高血糖素或OXM处理的动物代谢概况的影响(戴(Day)，J.W.等人，(2009)自然化学生物学(Nat Chem Biol)5：749-757；德鲁斯(Druce)，M.R.，等人(2009)内分泌学150：1712-1722；普卡，A.等人，(2009)糖尿病58：2258-2266)。这些类似物经过设计对GLP1R与GCGR具有促效作用(戴，J.W.等人，US2010/0190701A1)。
嵌合类似物应具有作用于其受体的合乎需要的亲本激素效应，且因此与OXM的效应类似，其显然可作用于GLP-1R与GLCR：葡萄糖依赖性胰岛素分泌和饱食、与脂解偶合和使归因于胰高血糖素的脂肪燃烧增加。显示类似物会产生使重量减少和脂肪燃烧增加的所要效应。所述概况在肥胖症的治疗中将引人注目，但肥胖症治疗中的主要挑战为顺应性。虽然目前已知的分别对GLP-1和GLCR具有亲和力的胰高血糖素和OXM的全长类似物可引起重量损失，但这些类似物并不能使最佳药物治疗方案所必需的高生物可用性、医药特性和对患者的适宜递送达到最佳。因此，本文提供肠肽类似物(例如GLP、OXM、胰高血糖素等)，其使得在如肥胖症和/或糖尿病和/或新陈代谢综合症的病状的治疗中达到高生物可用性和/或获得改善的治疗结果的持久效应。
使用OXM样分子达到对新陈代谢综合症和糖尿病的最佳治疗的其它因素涉及治疗持续时间和胰高血糖素作用量。举例来说，用活化GLP-1和胰高血糖素受体(OXM药理学概况)的类似物连续治疗可产生极大且快速的脂肪质量损失(戴，J.W.，等人(2009)自然化学生物学5：749-757)，但其还可以使瘦肌肉质量损失(科辛斯基(Kosinski)，J.R.，等人(2012)肥胖症(Obesity)(银泉(Silver Spring))：数字目标标识(doi)：10.1038/oby.2012.67)，此情况对于这类药物不利。举例来说，在科辛斯基，J.R.等人的研究论文中，从Alzet小型泵连续投予天然激素Oxm14天且使脂肪质量减少30％，而且使瘦质量(肌肉)减少7％。
已知胰高血糖素作用会刺激肝糖分解、脂解和脂肪燃烧增加，但还可以对肌肉产生分解代谢作用。使用组合GLP-1和胰高血糖素作用(OXM概况)的药剂的成功治疗需要在合理量的胰高血糖素作用(脂肪燃烧)下使饱食和GLP-1类似物的葡萄糖依赖性胰岛素分泌加强达到最佳。另外，间歇使用所述药剂将通过脂肪质量损失和最小瘦质量损失提供所要的适度连续重量损失的临床概况。本文提供合具有乎需要的GLP-1和OXM作用组合以及可调药物动力学/药效概况以使治疗(例如在新陈代谢综合症、糖尿病、肥胖症等中)中的用途最佳的分子。
在一个实施例中，式3-I-A、3-III-A、3-III-B和3-V的化合物经过设计提供胰高血糖素样活性或GLP-1样活性。在另一个实施例中，式3-I-A、3-III-A、3-III-B和3-V的化合物提供可调活性。举例来说，在一种情况下，本文所描述的肽产物(例如图8的表3和图9的表4中的化合物)针对胰高血糖素与GLP-1的受体的EC50小于约500nM，优选小于约50nM，更优选小于约20nM。在另一种情况下，本文所描述的肽产物(例如图8的表3和图9的表4中的化合物)对于GLP-1受体更有效的(例如EC50为小于10nM，优选地小于5nM，更优选地为约1nM)，且对于胰高血糖素受体则不太有效(例如EC50为小于50nM，优选地小于约20nM，更优选地为约5nM)。生物活性的这一可调性可使得合理量的胰高血糖素作用有一定保留，从而发生脂肪燃烧，同时还保留葡萄糖依赖性胰岛素分泌加强的有益效应。OXM与GLP-1和胰高血糖素在结构上同源，且会活化胰高血糖素受体(GCGR)与GLP-1受体(GLP1R)。因此，在一些实施例中，式3-I-A、3-III-A、3-III-B和3-V的化合物提供可调OXM样生物活性。在一些特定实施例中，本文所描述的肽产物包含具有GLP-1和/或其类似物(例如包含如本文所描述的改性的非天然氨基酸置换、如本文所描述的环化内酰胺键联、如本文所描述的表面活性剂改性或其组合的类似物)的氨基酸残基1-17的肽。在一些其它实施例中，本文所描述的肽产物包含具有GLP-1和/或其类似物(例如包含如本文所描述的改性的非天然氨基酸置换、如本文所描述的环化内酰胺键联、如本文所描述的表面活性剂改性或其组合的类似物)的氨基酸残基1-16的肽。在其它实施例中，本文所描述的肽产物包含具有GLP-1和/或其类似物(例如包含如本文所描述的改性的非天然氨基酸置换、如本文所描述的环化内酰胺键联、如本文所描述的表面活性剂改性或其组合的类似物)的氨基酸残基1-18的肽。本文所描述的肽产物另外包含一个或一个以上使所设计的式3-I-A、3-III-A、3-III-B和3-V的化合物和图8的表3和图9的表4中的化合物螺旋稳定的残基(例如Aib、Ac4C)。
相信配体的胰高血糖素子族以许多B类受体(胰泌素类、G蛋白质偶合受体(GPCR))共有的两种结构域模式结合到其受体。对于GLP-1而言，感觉到存在结合到跨膜螺旋区(近膜区)顶部的残基1到约残基16的N端区域和结合到受体的大细胞外N末端延伸(ECD)的17到31的螺旋状C端区域。这些配体的结合集中于以下事实：这些肽配体的N端截短类似物仍可仅对受体的分离的ECD区域保留实质结合亲和力和选择性。因此，已表明N端区域对受体活化负责，而C端区域对结合负责。近来已显示GLP-1的短N端类似物可为有效结合剂以及受体活化剂(马佩里(Mapelli)，C.等人，(2009)药物化学杂志52：7788-7799；哈克(Haque)，T.S.等人，(2010)肽31：950-955；哈克，T.S.等人，(2010)肽31：1353-1360)。
另外，GLP1R的N端区域(在此区域结合有GLP-1模拟物(肠促胰岛素类似物-4(艾塞那肽))的截短拈抗剂类似物)的x射线晶体结构的研究(朗格，S.，等人(2008)生物化学杂志283：11340-7)显示ECD中的关键配体结合区域具有高疏水性(图10)。除Glu15以外，肠促胰岛素类似物-4的序列与这一极具疏水性的区域(Val19*、Phe22*、Trp25*、Leu26*)以两亲性螺旋形式相互作用。在一个实施例中，GLP-1或胰高血糖素的截短N端片段改性以结合到GLCR且共价连接到表面活性剂。表面活性剂的疏水性1′-烷基部分模拟并且置换天然激素配体的C端区域，且使肽效能、功效和作用持续时间增加。另外，所述类似物由于其尺寸较小而具有主要优点，由此会降低其复杂性、合成成本和对蛋白水解的敏感性。另外，较小的肽更容易通过鼻粘膜或肠上皮细胞屏障吸收。
低血糖症为一种可危急生命的低血糖的病状，且在将通过强化胰岛素治疗更积极治疗血糖升高用于更多患者时日益可见。在血糖含量降到过低而不能为脑和肌肉提供足够能量以进行身体活动时可见到低血糖症。可使用胰高血糖素治疗这一病状且通过刺激肝脏分解肝糖产生葡萄糖且使血糖含量升到标准值来实现。可使用保留活化GLCR能力的胰高血糖素类似物获得对血糖含量的这一合乎需要的的影响。
活化GLP1R的GLP-1类似物刺激产生胰岛素并且在高血糖含量存在下从胰腺释放胰岛素。如当前产品(如艾塞那肽())所见，此举致使有效控制并且校正血糖含量。另外，所述产物看起来会使食欲降低且减缓食物从胃移动。因此其通过多种机制有效治疗糖尿病。组合胰高血糖素和GLP-1活化GLCR与GLP1R的效应的类似物可通过抑制食欲、以葡萄糖依赖性方式释放胰岛素、有助于免患低血糖症和加速脂肪燃烧的协同作用为糖尿病治疗提供益处。
预期所述治疗高血糖症(包括胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠期糖尿病)的方法适用于减少糖尿病并发症(包括肾病、视网膜病和血管病)。在心血管疾病中的应用涵盖微血管以及大血管疾病(戴维森(Davidson)，M.H.，(2011)美国心脏病学杂志(Am J Cardiol)108[增刊]：33B-41B；杰吉(Gejl)，M.，等人(2012)临床内分泌代谢杂志97：数字目标标识：10.1210/jc.2011-3456)且包括对心肌梗塞的治疗。预期所述降低食欲或促进重量损失的方法适用于减少体重、防止重量增加或治疗多原因的肥胖症(包括药物诱发的肥胖症)，并且减少与肥胖症有关的并发症，包括血管病(冠状动脉病、中风、末梢血管疾病、缺血性再灌注等)、高血压、II型糖尿病发作、高脂质血症和肌肉骨胳疾病。
如本文所使用，术语胰高血糖素或GLP-1类似物包括所有医药学上可接受的盐或其酯。
一方面，共价改性且适用于本文所描述的方法的肽为胰高血糖素和/或相关激素GLP-1的截短类似物，其包括且不限于：
胰高血糖素：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29 (SEQ.ID.NO.632)
调酸素：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-Lys30-Arg31-Asn32-Arg33-Asn34-Asn35-Ile36-Ala37(SEQ.ID.NO.633)
GLP-1(使用胰高血糖素编号)：
His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Lys28-Gly29-Arg30(SEQ.ID.NO.634)
在一些实施例中，本文所描述的肽产物具有式3-V的结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-aa24-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-aa30-aa31-aa32-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-Z 式3-V(SEQ.ID.NO.635)
其中：
U为连接氨基酸；
X为连接到U的侧链的表面活性剂；
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或C1-C12被取代或未被取代的烷基；
aa1为His、N-Ac-His、pGlu-His或N-R3-His；
aa2为Ser、Ala、Gly、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa4为Gly或D-Ala；
aa5为Thr或Ser；
aa6为Phe、Trp、F2Phe、Me2Phe或Nal(2)；
aa7为Thr或Ser；
aa8为Ser或Asp；
aa9为Asp或Glu；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal(2)、Bip或Bip2EtMeO；
aa11为Ser、Asn或U(X)；
aa12为Lys、Glu、Ser、Arg或U(X)；
aa13不存在，为Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14不存在，为Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15不存在，为Asp、Glu或U(X)；
aa16不存在，为Ser、Gly、Glu、Aib、Ac5c、Lys、Arg或U(X)；
aa17不存在，为Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18不存在，为Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19不存在，为Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20不存在，为Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21不存在，为Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22不存在，为Phe、Trp、Nal(2)，Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23不存在，为Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa24不存在，为Gln、Ala、Glu、Cit或U(X)；
aa25不存在，为Trp、Nal(2)或U(X)；
aa26不存在，为Leu、U(X)；
aa27不存在，为Met、Val、Nle、Lys或U(X)；
aa28不存在，为Asn、Lys或U(X)；
aa29不存在，为Thr、Gly、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa30不存在，为Lys、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa31不存在，为Arg、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa32不存在，为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa33不存在，为Arg、Aib、Ac5c或U(X)；
aa34不存在，为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa35不存在，为Asn、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa36不存在，为Ile、Aib、Ac4c、Ac5C或U(X)；
aa36不存在，为Ala、Aib、Ac4c、Ac5C或U(X)；
aa37不存在或为U(X)；
其限制条件为aa11-aa37中的一者或至少一者为U(X)。
在特定实施例中，连接氨基酸U为如Lys或Orn的二氨基酸，X为连接到U的来自1-烷基糖苷类的改性的表面活性剂，且Z为OH或-NH-R2，其中R3为H或C1-C12；或小于10Da的PEG链。
在一些实施例中，本文所描述的肽产物具有式III-B的结构：
His1-aa2-aa3-Gly4-Thr5-aa6-Thr7-Ser8-Asp9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20-aa21-aa22-aa23-Z 式3-III-B(SEQ.ID.NO.305)
其中：
Z为OH或-NH-R3，其中R3为H或被取代或未被取代的C1-C12烷基；或小于10Da的PEG链；
aa2为Ser、Ala、Gly、Aib、Ac4c或Ac5c；
aa3为Gln或Cit；
aa6为Phe、Trp、F2Phe、Me2Phe、MePhe或Na12；
aa10为Tyr、Leu、Met、Nal2、Bip或Bip2EtMeO；
aa11为Ser、Asn或U；
aa12为Lys、Glu、Ser或U(X)；
aa13不存在或为Tyr、Gln、Cit或U(X)；
aa14不存在或为Leu、Met、Nle或U(X)；
aa15不存在或为Asp、Glu或U(X)；
aa16不存在或为Ser、Gly、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c、Lys、R或U(X)；
aa17不存在或为Arg、hArg、Gln、Glu、Cit、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa18不存在或为Arg、hArg、Ala、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa19不存在或为Ala、Val、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa20不存在或为Gln、Lys、Arg、Cit、Glu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa21不存在或为Asp、Glu、Leu、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa22不存在或为Phe、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
aa23不存在或为Val、Ile、Aib、Ac4c、Ac5c或U(X)；
其中aa1-aa23中的任何两者任选地通过其侧链环化形成内酰胺键联；且
其限制条件为aa16、aa17、aa18、aa19、aa20、aa21、aa22、aa23或aa24中的一者或至少一者为共价连接到X的天然或非天然氨基酸U。
在式3-III-A、式3-III-B和式3-V的一些特定实施例中，X具有以下结构：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一些上文所描述的实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
在式3-III-B的一些实施例中，U为本文所描述的任何连接氨基酸。图8的表3和图9的表4说明与如本文所描述的表面活性剂共价连接的肽的某些实例。
本文所呈现的实施例的范畴内涵盖式3-I-A、式3-III-A、式3-III-B或式3-V的肽产物，其中肽产物包含一个或一个以上表面活性剂基团(例如具有式3-I结构的基团X)。在一个实施例中，式3-I-A、式3-III-A、式3-III-B或式3-V的肽产物包含一个表面活性剂基团。在另一个实施例中，式3-I-A、式3-III-A、式3-III-B或式3-V的肽产物包含两个表面活性剂基团。在又一个实施例中，式3-I-A、式3-III-A、式3-III-B或式3-V的肽产物包含三个表面活性剂基团。
本文认识到SEQ.ID.NO.632的某些部分治疗与胰岛素抗性有关的病状和/或心脏血管病状的重要性。因此，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投予上文所描述的所述胰高血糖素类似物产生重量损失。
本文认识到SEQ.ID.NO.303的某些部分治疗与胰岛素抗性有关的病状和/或心脏血管病状的重要性。因此，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa17。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa18。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa19。
在另一个实施例中，本文提供一种治疗有需要个体的糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa20。
在另一个实施例中，投予上文所描述的所述胰高血糖素类似物产生重量损失。
在任一个上文所描述的实施例中，所述胰高血糖素类似物用式3-I的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为键结到U的键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10。
在一特定实施例中，所述胰高血糖素类似物用具有以下结构的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一些上文所描述的实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa17。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa18。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa19。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.632的氨基酸残基aa1-aa20。
在上文所描述的实施例的一些情况下，当心血管疾病与缺血性事件有关时投予所述胰高血糖素类似物。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa17。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa18。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa19。
本文还提供一种治疗有需要个体的心脏血管疾病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的胰高血糖素类似物，所述胰高血糖素类似物包含SEQ.ID.NO.303的氨基酸残基aa1-aa20。
在上文所描述的实施例的一些情况下，当心血管疾病与缺血性事件有关时投予所述胰高血糖素类似物。
在任一个上文所描述的实施例中，所述胰高血糖素类似物用式3-I的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a在每次出现时独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基、被取代或未被取代的芳烷基或含有类固醇核的部分；
R1b、R1c和R1d在每次出现时各自独立地为一键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基；
W1在每次出现时独立地为-CH2-、-CH2-O-、-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-(C＝S)-、-(C＝S)-NH-或-CH2-S-；
W2为-O-、-CH2-或-S-；
R2在每次出现时独立地为键结到U的键、H、被取代或未被取代的C1-C30烷基、被取代或未被取代的烷氧基芳基或被取代或未被取代的芳烷基、-NH2、-SH、C2-C4烯烃、C2-C4炔烃、-NH(C＝O)-CH2-Br、-(CH2)m-顺丁烯二酰亚胺或-N3；
n为1、2或3；且
m为1-10。
在一特定实施例中，所述胰高血糖素类似物用具有以下结构的表面活性剂X进行改性：
其中：
R1a为被取代或未被取代的C1-C30烷基；
R1b、R1c和R1d为H；
W1为-(C＝O)-NH-；
W2为-O-；且
R2为一键。
在一些上文所描述的实施例中，R1a为C1-C20烷基、C8-C20烷基、C12-C18烷基或C14-C18烷基。
可任选地将氨基或羧基末端的改性引入肽(例如胰高血糖素或GLP-1)中(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418)。举例来说，如一些肽所见，肽可在N端截短或酰化以产生展示低功效、部分促效剂和拈抗剂活性的肽类似物(顾雷特，P.等人，(1998)欧洲药理学杂志354：105-111，高茜斯，I.和弗曼，S.(2003)当代药物设计9：483-494)，所述文献的内容以引用的方式并入本文中)。举例来说，bPTH的前6个残基缺失得到拈抗类似物(马哈菲，J.E.等人，(1979)生物化学杂志254：6496-6498；高曼，M.E.等人，(1988)内分泌学123：2597-2599)且对本文所描述的肽的类似操作产生有效拈抗类似物。对肽的N端的其它改性(如缺失或并入D-氨基酸(如D-Phe))在用本文所描述的改性(如长链烷基糖苷)取代时还可得到有效且长效的促效剂或拈抗剂。所述促效剂和拈抗剂还具有商业效用且在本文所描述的所涵盖的实施例的范畴内。
本文所描述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到肽类似物的表面活性剂，其中如下来改性天然肽：乙酰化、酰化、聚乙二醇化、ADP核糖基化、酰胺化、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、将氨基酸以转移RNA介导的方式添加到蛋白质中(如精氨酰基化)和泛素化。参见例如(内斯特，J.J.，Jr.(2007)综合医药化学II2：573-601，内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418，克雷顿(Creighton)，T.E.(1993，沃尔德，F.(1983)蛋白质的翻译后共价改性1-12，塞夫特，S.和恩格拉德，S.(1990)酶学方法182：626-646，拉坦，S.I.，等人(1992)纽约科学院年报663：48-62)。本文所描述的实施例的范畴内还涵盖分支链或有或没有分支链的环状肽。环状、分支链和分支链环形肽由翻译后天然过程产生且还通过适合合成方法制得。在一些实施例中，本文所描述的任何肽产物包含上文所描述的肽类似物，其接着共价连接到烷基-糖苷表面活性剂部分。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖如下在适合位置被取代的肽链：在连接氨基酸上(在例如Lys的ε-位置)用具有饱和或不饱和烷基链的脂肪酸(如辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、3-苯基丙酸等)酰化而对本文所主张的类似物进行取代(张，L.和布拉吉，G.(2012)当今医药化学19：1602-1618)。所述类似物的非限制性说明性实例为：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Lys(N-ε-十二酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.636)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Lys(N-ε-十四酰基)18-Ac4c19-NH2，(SEQ.ID.NO.637)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Lys(N-ε-十六酰基)18-Aib19-NH2，(SEQ.ID.NO.638)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-Arg17-Lys(N-ε-十二酰基)18-NH2，(SEQ.ID.NO.639)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-Arg17-Lys(N-ε-十四酰基)18-NH2，(SEQ.ID.NO.640)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-Arg17-Lys(N-ε-十六酰基)18-NH2，(SEQ.ID.NO.641)
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Lys(N-ε-(γ-谷氨酰基)-N-α-十四酰基))18-Aib19-NH2(SEQ.ID.NO.642)等。
在其它实施例中，肽链可任选地通过在连接氨基酸(例如Cys的硫氢基)上与间隔基和疏水性部分(如类固醇核，例如胆固醇部分)反应而在适合位置被取代。在一些所述实施例中，改性的肽进一步包含一个或一个以上PEG链。所述分子的非限制性实例为：
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Aib16-Arg17-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))18-Aib19-NH2(SEQ.ID.NO.643)，
His1-Aib2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-环(Glu12-Tyr13-Leu14-Asp15-Lys16)-Arg17-Cys(S-(3-(PEG4-氨基乙基乙酰胺-胆固醇)))18-NH2(SEQ.ID.NO.644)。
如上文所描述，除了20种标准氨基酸以外，还存在大量所述领域中已知且可并入本文所描述的化合物中的“非标准氨基酸”或非天然氨基酸。其它非标准氨基酸用反应性侧链进行改性以实现结合(高蒂尔(Gauthier)，M.A.和克洛克(Klok)，H.A.(2008)化学通讯(Chem Commun)(剑桥(Camb))2591-2611；德格拉夫(de Graaf)，A.J.等人，(2009)生物结合化学(Bioconjug Chem)20：1281-1295)。在一个方法中，进化的tRNA/tRNA合成酶对在表达质粒中用琥珀抑制因子密码子编码(戴特斯(Deiters)，A等人，(2004).生物有机化学与医药化学通讯(Bio-org.Med.Chem.Lett.)14，5743-5)。举例来说，对叠氮基苯丙氨酸并入肽中且接着在还原剂和铜离子存在下与官能化表面活性剂或具有乙炔部分的PEG聚合物反应以有助于被称为“胡伊斯根(Huisgen)[3+2]环加成”的有机反应。使用含有乙炔改性的烷基糖苷或PEG改性的糖苷的本文所描述的试剂的类似反应序次将产生聚乙二醇化或烷基糖苷改性的肽。对于小于约50个残基的肽而言，使用标准固相合成在链中的所要位置并入所述的反应性氨基酸残基。所述表面活性剂改性的肽和/或蛋白质提供相比于通过单独并入PEG而改性的肽不同范围的药理学和药物特性。
熟练技术人员将了解，可能发生肽类似物的许多置换，且倘若氨基酸序列具有并入的表面活性剂部分，则将具有本文所描述的表面活性剂改性的肽产物的合乎需要的属性。
某些定义
如本说明书中所使用，“一(a/an)”的意思是一个(种)或一个(种)以上。如权利要求中所使用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一”的意思是一个(种)或一个(种)以上。如本文所使用，“另一”的意思是至少第二个(种)或第二个(种)以上。
如本文所使用，多种常见氨基酸的一个和三个字母的缩写如纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)31，639-645(1972)和40，277-290(1974)中所推荐，且遵从37CFR§1.822(55FR18245，1990年5月1日)。除非另外表示为D-或DL，否则所述缩写表示L-氨基酸。某些氨基酸(天然与非天然)为非手性的，例如甘氨酸、α-氨基-异丁酸(Aib)。所有肽序列均用左边的N端氨基酸和右边的C端氨基酸呈现。
“烷基”係指脂肪族烃基。提及烷基，包括“饱和烷基”和/或“不饱和烷基”，亦即烯烃或炔烃。烷基(饱和或不饱和的)包括分支链、直链或环状基团。烷基任选地被取代基取代，所述取代基包括且不限于氧代、卤素、芳基、环烷基、疏水性天然产物(如类固醇)、芳烷基链(包括烷氧基芳基)、含有酰基部分的烷基链等。在一些实施例中，烷基连接到肽中的残基(例如Tyr或Dmt)的Nα位置。这一类被称为N-烷基且包含直链或分支链C1-C10烷基或被芳基取代的烷基，如苯甲基、苯乙基等。在一些实施例中，烷基部分为位于与糖部分的糖苷键联(通常例如葡萄糖的1位)中的1-烷基。所述1-烷基为C1-C30烷基。
“芳基”涉及形成环的每一原子为碳原子的芳环。本文所描述的芳基环包括具有五个、六个、七个、八个、九个或九个以上碳原子的环。芳基任选地被选自以下的取代基取代：卤素、烷基、酰基、烷氧基、烷硫基、磺酰基、二烷基-氨基、羧基酯、氰基等。芳基的实例包括(但不限于)苯基和萘基。
术语“酰基”涉及C1-C20酰基链。这一链可包含含有酰基部分的直链脂肪链、分支链脂肪链、含有环状烷基部分的链、疏水性天然产物(如类固醇)、芳烷基链或烷基链。
术语“类固醇核”涉及类固醇的核心，其包含四个如下所示命名为A、B、C和D的稠合环的排列：
含有类固醇核的部分的实例包括且不限于胆固醇等。
如本文所使用，“治疗组合物”可包含与水性或有机载剂或赋形剂的混合物，且可例如与常见无毒的医药学上可接受的载剂一起配制为片剂、丸粒、胶囊、冻干物、栓剂、溶液、乳液、悬浮液或其它适用形式。所述载剂除上文所揭示的载剂之外还可包括海藻酸盐、胶原蛋白、葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶态二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中等链长的三酸甘油酯、聚葡萄糖和适用于制造固体、半固体或液体形式的制剂的其它载剂。另外，可使用助剂稳定剂、增稠剂或著色剂，例如稳定干燥剂，如丙酮糖(triulose)。
如本文所使用，“医药学上可接受的载剂”或“治疗有效的载剂”为水性或非水性的(固体)，例如醇性或油性的或其混合物，且可含有表面活性剂、润肤剂、润滑剂、稳定剂、染料、香料、防腐剂、用于调节pH值的酸或碱、溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂、稳定剂、润湿剂、延时释放剂、保湿剂或特定形式的医药组合物中通常包括的其它组分。医药学上可接受的载剂在所述领域熟知且包括例如水溶液，如水或生理学上缓冲盐水；或其它溶剂或媒剂，如二醇、甘油和油(如橄榄油或可注射有机酯)。医药学上可接受的载剂可含有生理学上可接受的化合物，例如用以使特定抑制剂(例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂)的吸收稳定或增加。
医药组合物视近似生理条件所需要还可含有其它医药学上可接受的助剂物质，所述“物质”包括(但不限于)pH值调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。另外，肽或其变体的悬浮液可包括脂质保护剂，其保护脂质在储存时免受自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性自由基抑止剂(如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(如铁草胺(ferrioxamine))皆适合。
如本文所使用，“表面活性剂”为对水的界面张力进行改性的表面活性剂。通常，表面活性剂在分子中具有一个亲脂性和一个亲水性基团或区域。广泛地，所述基团包括肥皂、清洁剂、乳化剂、分散剂和湿润剂和若干防腐剂基团。更特定地说，表面活性剂包括硬脂酰三乙醇胺、月桂基硫酸钠、牛磺胆酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、氯化苯甲烃铵、苄索氯铵和单硬脂酸甘油酯；和亲水性聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素或烷基糖苷。在一些实施例中，表面活性剂为非离子型表面活性剂(例如烷基糖苷表面活性剂)。在一些实施例中，表面活性剂为离子型表面活性剂。
如所述领域中所已知，如本文所使用，“烷基糖苷”涉及通过键联接合到任何疏水性烷基的任何糖。疏水性烷基视糖部分的所要疏水性和亲水性而定可选择任何所要的尺寸。一方面，烷基链的范围为1到30个碳原子；或6到16个碳原子。
如本文所使用，“糖”包括直链或环形式的单糖、寡糖或多糖。寡糖为具有两个或两个以上单糖残基的糖。适用于官能化形式的许多可能存在的糖的一些实例包括葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、蔗糖、海藻糖等。
如本文所使用，“蔗糖酯”为脂肪酸蔗糖酯。蔗糖酯由于可用于反应的蔗糖中的八个羟基和来自可与蔗糖反应的达更大且更笨重的脂肪上的乙酸酯的许多脂肪酸基团而可呈许多形式。这一灵活性的意思是许多产物和官能团可基于所用的脂肪酸部分进行调整。蔗糖酯具有食品和非食品用途，尤其用作表面活性剂和乳化剂，在药物、化妆品、清洁剂和食品添加剂中的应用日益增多。其为生物可降解、无毒且对于皮肤温和的。
如本文所使用，“适合”烷基糖苷的意思是烷基糖苷无毒且为非离子型的。在一些情况下，当通过眼、鼻、鼻泪、舌下、颊、吸入途径或通过注射途径(如皮下、肌肉内或静脉内途径)投予化合物时适合烷基糖苷使化合物的免疫原性或聚集降低且使生物可用性增加。适合化合物可使用所述领域已知的方法和实例中所阐述的那些方法进行测定。
“连接氨基酸”为包含用以与官能化表面活性剂共价键联的反应性官能团的任何天然或非天然氨基酸(德格拉夫，A.J.，等人(2009)生物结合化学20：1281-1295)。举例来说，在一些实施例中，连接氨基酸为具有反应性官能团-NH2的Lys或Orn；或具有反应性官能团-SH的Cys；或具有反应性官能团-C(＝O)-OH的Asp或Glu。举例来说，在一些其它实施例中，连接氨基酸为具有用以与适当官能化的表面活性剂形成共价键联的反应性官能团(如-OH、-N3、卤乙酰基或炔系基团)的任何氨基酸。
如本文所使用，“官能化表面活性剂”为包含适用于与连接氨基酸共价键联的反应性基团的表面活性剂。举例来说，在一些实施例中，官能化表面活性剂包含羧酸基团(例如在单糖的6位)作为适用于与连接氨基酸共价键联的反应性基团。举例来说，在一些实施例中，官能化表面活性剂例如在单糖的6位(如流程6中所示)包含允许与适合连接氨基酸共价键联的-NH2基团、-N3基团、炔系基团、卤乙酰基、-O-NH2基团或-(CH2-)m-顺丁烯二酰亚胺基。在一些实施例中，官能化表面活性剂为如本文所描述的式IV化合物。
如本文所使用，术语“肽”为包含两个或两个以上氨基酸的任何肽。术语肽包括短肽(例如包含介于2到14个氨基酸的肽)、中等长度的肽(15-50)或长链肽(例如蛋白质)。术语肽、中等长度的肽和蛋白质在本文中可互换使用。如本文所使用，术语“肽”解释为意思是由以下构成的聚合物：通过肽键、其相关天然结构变体和合成非天然类似物连接的氨基酸残基、其相关天然结构变体和合成非天然类似物。合成肽可例如使用自动肽合成器合成。
肽可含有除20个基因编码的氨基酸外的氨基酸。“肽”既包括通过天然方法(如加工和其它翻译后改性)改性的肽，还包括通过化学改性技术改性的肽。所述改性充分描述于基本文本和更详细描述的专题论文中，且为所属领域的技术人员所熟知。应了解，在一些实施例中，同一类型的改性以相同或不同程度存在于既定肽中的若干位点。在一些实施例中，既定肽还含有一种以上类型的改性。改性存在于肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。
因此，本文所描述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到改性的肽的表面活性剂，所述改性包括例如以下改性：乙酰化、酰化、聚乙二醇化、ADP核糖基化、酰胺化、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸的共价交联形成的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的将氨基酸添加到蛋白质中(如精氨酰基化)和泛素化。例如，参见(内斯特，J.J.，Jr.(2007)综合医药化学II2：573-601，内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418，克雷顿，T.E.(1993，沃尔德，F.(1983)蛋白质的翻译后共价改性1-12，塞夫特，S.和恩格拉德，S.(1990)酶学方法182：626-646，拉坦，S.I.，等人(1992)纽约科学院年报663：48-62)。本文所描述的实施例的范畴内还涵盖分支链肽或有或没有分支链的环状肽。环状、分支链和分支链环形肽通过翻译后天然过程产生且还通过适合合成方法制得。
术语肽包括包含天然和非天然氨基酸或天然氨基酸的类似物的肽或蛋白质。如本文所使用，肽和/或蛋白质“类似物”包含基于天然氨基酸的非天然氨基酸，例如酪氨酸类似物，其包括被对位取代的酪氨酸、被邻位取代的酪氨酸和被间位取代的酪氨酸，其中酪氨酸上的取代基包含乙酰基、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、巯基、羧基、甲基、异丙基、C2-C20直链或分支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、卤素、硝基等。Tyr类似物的实例包括2,4-二甲基-酪氨酸(Dmt)、2,4-二乙基-酪氨酸、O-4-烯丙基-酪氨酸、4-丙基-酪氨酸、Cα-甲基-酪氨酸等。赖氨酸类似物的实例包括鸟氨酸(Orn)、高赖氨酸、Cα-甲基-赖氨酸(CMeLys)等。苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)被间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含甲氧基、C1-C20烷基(例如甲基)、烯丙基、乙酰基等。特定实例包括(但不限于)2,4,6-三甲基-L-苯丙氨酸(Tmp)、O-甲基-酪氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸(Nal(2))、3-(1-萘基)丙氨酸(Nal(1))、3-甲基-苯丙氨酸，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)、氟化苯丙氨酸、异丙基-苯丙氨酸、对叠氮基-苯丙氨酸、对酰基-苯丙氨酸、对苯甲酰基-苯丙氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-苯丙氨酸和异丙基-苯丙氨酸等。所述领域已知且肽类似物设计中所用的大量非标准或非天然氨基酸中有C-α-二取代的氨基酸，如Aib、Cα-二乙基甘氨酸(Deg)、氨基环戊烷-1-甲酸(Ac4c)、氨基环戊烷-1-甲酸(Ac5c)等。所述氨基酸通常产生通常偏向于α螺旋结构的限制结构(考尔，R.和巴拉茹阿玛，P.(1999)生物有机化学与医药化学7：105-117)。适用于类似物设计的所述非天然氨基酸的其它实例是高精氨酸(Har)等。在某些情况下，取代还原的酰胺键可改良针对酶促破坏的保护或改变受体结合。举例来说，将具有还原的酰胺键的Tic-Phe二肽单元并入残基之间(表示为Tic-Ψ[CH2-NH]-Ψ-Phe)会减少酶促降解。因此，本文所描述的实施例的范畴内还涵盖共价连接到肽的表面活性剂，所述肽包含上文所描述的改性的氨基酸和/或肽类似物。某些非天然氨基酸如下所示。
如本文所使用，“类鸦片肽”为结合到体内的类鸦片受体的氨基酸的短序列。在一些实施例中，类鸦片肽是内源性肽，如内啡肽、脑啡肽、内吗啡肽、皮啡肽等。在一些实施例中，类鸦片肽衍生自内源性类鸦片肽(例如伪肽、受限制的肽、α-甲基类似物等)。在一些实施例中，类鸦片肽为外源性和/或合成的且包含模拟类鸦片肽的效应的改性的氨基酸和/或非天然氨基酸。
如本文所使用，术语“变体”解释为意思是不同于参考肽但保留必需特性的肽。肽的典型变体与另一参考肽的氨基酸序列不同。一般来说，差异有限以便参考肽和变体的序列总体上非常相似且在许多区域中相同。变体和参考肽的氨基酸序列可因一次或一次以上取代、添加、缺失的任何组合而不同。被取代或被插入的氨基酸残基可能为或可能不为通过基因密码编码的氨基酸残基。肽的非天然存在的变体可通过突变诱发技术、通过直接合成并且通过其它适合重组方法制得。
现可详细参考本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的多个实施例和特定应用。尽管共价改性的肽和/或蛋白质将结合多个实施例和应用进行描述，但应了解所述实施例和应用为示范性的且不打算限制本文所描述的实施例的范畴。另外，在本揭示案全文中可参考多个专利、专利申请案、网站和公开案，且除非另外指出，否则每一本文所参考的相关揭示案均以引用的方式并入。
肽
体内的肽能起到许多重要作用且已开发出一些商业机会(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418；史蒂文森(Stevenson)，C.L.(2009)当代药物生物技术(Curr Pharm Biotechnol)10：122-137)。然而，即使是这些识别的目标(廷德尔(Tyndall)，J.D.等人，(2005)化学评论105：793-826)和产品也仍不断出现作用持续时间和生物可用性的不足。在一些实施例中，本文所描述的改良的肽提供相比于目前可用的商业产品较长的作用持续时间和/或生物可用性和/或治疗功效。表示用于临床开发的类似物设计(促效剂和拈抗剂)的引人注目的商业目标的肽的一些说明性实例包括例如B类的成员、G蛋白质偶合受体(GPCR)配体和相关肽(“胰泌素家族”)：胰泌素、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关的蛋白质(PTHrP)、胰高血糖素、胰高血糖素样蛋白质-1和-2(GLP-1、GLP-2)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、调酸素、垂体腺苷酸环化酶活化肽(PACAP)、血管活性肠肽(VIP)、淀粉素(和类似物，如普兰林肽(pramlintide)、达瓦林肽(devalintide)等)、降钙素(和类似物，如鲑鱼降钙素、依降钙素等)、降钙素基因相关肽(CGRP)、肾上腺髓质素、促皮质素释放因子家族(CRF、扎瑟普(Xerecept)；尿皮质激素)等，包括通过用本文所描述的方法进一步改性改良为临床产品的其合成类似物。本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖类鸦片肽家族；所述肽受益于本文所描述的肽改性方法以使作用持续时间增加且使特异性增加。举例来说，内吗啡肽、强啡肽、脑啡肽、皮啡肽、酪啡肽等肽家族的类似物为疼痛、成瘾症等的治疗提供引人注目的治疗方法。进行改性以产生本文所描述肽产物的其它引人注目的肽目标为丘脑下部激素，例如促性腺激素释放激素和其类似物(例如那法瑞林(nafarelin)、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)、夫替瑞林(fertirelin)、组胺瑞林(histrelin)、布舍瑞林(buserelin)、加尼瑞克(ganirelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地加瑞克(degarelix)、德舍瑞林(deslorelin)等)、促肾上腺皮质激素、生长抑素(例如奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)、伐普肽(valpreotide)等)、促甲状腺激素释放激素、生长激素释放激素和神经降压素。引人注目的商业目标的另一个实例为垂体激素和类似物(如加压素(去氨加压素等))、催产素和类似物、甲状腺激素刺激激素、促乳素、生长激素、促黄体生成激素、滤泡刺激激素、α黑素细胞刺激激素类似物(美拉诺坦(melanotan)类似物)等以及其类似物。生长因子为宜可使用本文所描述的方法改性以产生改良的医药候选物的一个重要分子类别，例如胰岛素(和类似物，如赖脯胰岛素(Lispro)、地特胰岛素(Levemir)、甘精胰岛素(glargin)等)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I或促生长因子-C)、神经生长因子(NGF)、纤维母细胞生长因子(FGF；FGF-18、FGF-20、FGF-21等)、角质细胞生长因子(KGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等。尤其引人注目的目标为控制肠功能和食欲但具有短作用持续时间的那些肽(其中一些如上文所提及)，包括(但不限于)胃內激素、胰脏肽、肽YY、神经肽Y、胆囊收缩素(辛卡利特(Sincalide等)、黑皮质素等。受益于本文所描述的方法的其它目标为与肥胖症有关的促发炎脂肪组织产物，包括瘦体素(和相关类似物，如OB-3肽)、脂肪因子、脂联素、趋化素、内脏脂肪素、瘦素(nesfatin)、抵抗素、肿瘤坏死因子α、趋化因子、单核细胞趋化性蛋白质-1(MCP-1)、网膜素、介白素等。受益于改良的医药和药效行为的重要目标为控制免疫功能的蛋白质，其中有以下实例(其意思不是限制仅是说明)：干扰素家族的成员(干扰素-α、-β、-γ、-κ、-ω、IL-10细胞因子家族，包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26等)、胸腺喷丁(Thymopentin)、胸腺素α1等。控制循环或血液凝固的重要肽产物将通过本文所描述的方法改良，由此实现作用持续时间增长，所述肽产物为例如比伐卢定(bivalirudin)(安吉马(Angiomax))、埃替菲巴肽(eptifibatide)(因特格林(Integrelin))、心房利钠肽(ANP，乌拉立肽(Ularitide))、脑利钠肽、c型利钠肽、b型利钠肽(奈西立肽(nesiritide))、血管收缩素、血管生长抑素、罗替加肽(Rotigaptide)、凝血栓蛋白等。刺激干细胞增殖和分化的肽为可通过本文所描述的改性进行改良的重要药剂。举例来说，涵盖红细胞生成素、赫马替德(hematide)、血小板生成素、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、介白素-6(IL-6)、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)等作为适用于共价连接到表面活性剂(例如烷基糖苷表面活性剂)的肽。神经营养因子为极大受益于本文所描述的改性以使作用持续时间和功效增加的另一类小蛋白质。举例来说，胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)和家族(神经秩蛋白(neurturin)、阿特因(artemin)、泊塞因(persephin))、神经营养因子(如神经生长因子(NGF))、BDNF等。促发炎和疼痛产生的肽为通过本文所描述的改性进行改良的重要肽目标。举例来说，缓激肽(或其释放，例如艾卡拉肽(ecallantide))和物质P(尤其拈抗剂)的抑制剂提供重要的治疗目标(艾替班特(icatibant)等)，其适用于共价连接表面活性剂(例如烷基-糖苷表面活性剂)。病毒融合(恩夫韦地(Fuzeon))、蛋白质成熟(蛋白酶抑制剂)或整合的抑制剂有短作用持续时间。通过共价连接表面活性剂(例如烷基-糖苷表面活性剂)改性所述抑制剂使作用持续时间变长。已发现许多蛋白酶与疾病有关，且其作用的抑制剂已用于临床(阿拜纳特(Abbenante)，G.和费尔利(Fairlie)，D.P.(2005)医药化学(Med Chem)1：71-104)，但将通过本文所描述的改性进一步改良，且所述目标也涵盖在本文所描述的实施例的范畴内。其它天然肽产物和其类似物(如针对疼痛的芋螺毒素肽、抗菌防御素等)在生理性液体中还会经历生物可用性缺少和短作用持续时间，且因此受益于本文所描述的肽改性。所属领域的技术人员将认识到许多经受本文所描述的改性且使作用持续时间和生物可用性增加的其它商业上重要的肽，且所述肽也涵盖在本发明的范畴内。
可任选地将氨基或羧基末端处的改性引入本发明的肽中(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418)。举例来说，如一些肽所见，本发明的肽可在N端截短或酰化以产生展示低功效、部分促效和拈抗活性的肽(顾雷特，P.，等人(1998)欧洲药理学杂志354：105-111，高茜斯，I.和弗曼，S.(2003)当代药物设计9：483-494)，所述文献的内容以引用的方式并入本文中)。对肽的N端的其它改性(如缺失或并入D-氨基酸(如D-Phe))在用本文所描述的改性(如长链烷基糖苷)取代时还可得到有效且长效的促效剂或拈抗剂。所述促效剂和拈抗剂还具有商业效用且在本文所描述的所涵盖实施例的范畴内。
如上文所描述，除了20种标准氨基酸以外，还存在大量所述领域中已知且可并入本文所描述的化合物中的“非标准氨基酸”或非天然氨基酸。其它非标准氨基酸用反应性侧链进行改性以实现结合(高蒂尔，M.A.和克洛克，H.A.(2008)化学通讯(剑桥)2591-2611；德格拉夫，A.J.等人，(2009)生物结合化学20：1281-1295)。在一个方法中，进化的tRNA/tRNA合成酶对在表达质粒中用琥珀抑制因子密码子编码(戴特斯，A等人，(2004).生物有机化学与医药化学通讯14，5743-5)。举例来说，将对叠氮基苯丙氨酸并入肽中且接着在还原剂和铜离子存在下与官能化表面活性剂或具有乙炔部分的PEG聚合物反应以有助于被称为“胡伊斯根[3+2]环加成”的有机反应。使用含有乙炔改性的烷基糖苷或PEG改性的糖苷的本文所描述的试剂的类似反应序次将产生聚乙二醇化或烷基糖苷改性的肽。对于小于约50个残基的肽而言，使用标准固相合成在链中的所要位置并入所述的反应性氨基酸残基。所述表面活性剂改性的肽和/或蛋白质提供相比于通过单独并入PEG而改性的肽不同范围的药理学和药物特性。
中间物
在一个实施例中，本文提供包含表面活性剂部分和能够与天然或非天然氨基酸上的反应性官能团形成键的反应性官能团的中间物和/或试剂。这些中间物和/或试剂使用于人类和动物疾病的肽和/或蛋白质的生物可用性和医药、药物动力学和/或药效行为改良。所述中间物和/或试剂通过氨基酸侧链上的官能团(例如Lys的ε-氨基官能团、Cys的硫氢基或肽和/或蛋白质目标的氨基或羧基末端处)的共价连接使得可以合成本文所描述的肽产物。在特定实施例中，非离子型表面活性剂部分为被O-烷基糖苷取代的单或双糖，所述糖苷键联具有α或β构型。在特定实施例中，O-烷基链为C1-C20或C6-C16烷基链。
在另一个实施例中，本文提供包含具有模拟O-烷基糖苷键联的某些烷基糖苷键联的非离子型表面活性剂部分和能够与天然或非天然氨基酸上的反应性官能团形成键的反应性官能团的中间物和/或试剂。所述中间物和/或试剂含有S-连接烷基链或N-连接烷基链且，并且相比于与O-连接烷基糖苷连接的产物已改变了化学和/或酶促稳定性。
在一些实施例中，本文提供的中间物和/或试剂为亲水性基团为改性的葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、葡糖醛酸、二葡糖醛酸、麦芽糖醛酸等的化合物。在一些实施例中，亲水性基团为葡萄糖、麦芽糖、葡糖醛酸、二葡糖醛酸或麦芽糖醛酸，且疏水性基团为C1-C20烷基链或芳烷基链。在一些实施例中，疏水性基团的糖苷键联具有α构型，且在一些实施例中，在糖上变旋异构中心处键联为β构型。
在一些实施例中，亲水性基团为葡萄糖、麦芽糖、葡糖醛酸、二葡糖醛酸或麦芽糖醛酸，且疏水性基团为C1-C20烷基链或芳烷基链。
在一些实施例中，本文提供的中间物和/或试剂包含含有反应性官能团的表面活性剂，所述反应性官能团为羧酸基、氨基、叠氮基、醛、顺丁烯二酰亚胺、硫氢基、羟氨基、炔烃等。
在一些实施例中，中间物和/或试剂为一个羟基官能团改性成为羧酸或氨基官能团的O-连接烷基糖苷。在一些实施例中，试剂为α或β构型的1-O-烷基葡糖醛酸且烷基链长度为C1到C20。在一些所述实施例中，烷基的长度为C6到C18。在一些所述实施例中，烷基的长度为C6到C16。
在一些实施例中，试剂包含α或β构型的1-O-烷基二葡糖醛酸且烷基链长度为C1到C20。在一些所述实施例中，烷基的长度为C6到C16。
在一些实施例中，试剂为一个羟基官能团改性成为羧酸或氨基官能团的α或β构型的S-连接烷基糖苷。
在一些实施例中，试剂为一个羟基官能团改性成为羧酸或氨基官能团的α或β构型的N-连接烷基糖苷。
在又一个实施例中，本文提供具有用于人类和动物疾病中可接受的特性的含有共价连接的烷基糖苷的肽和/或蛋白质产物。流程1列举可被改性以产生适用于合成本文所描述的表面活性剂改性的肽产物的试剂和/或中间物的示范性非离子型表面活性剂。
流程1.可购得的烷基糖苷类的非离子型表面活性剂的实例
在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质将表面活性剂部分并入肽结构中。在特定实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质并入有烷基、烷氧基芳基或芳烷基糖苷类的非离子型表面活性剂。烷基糖苷为重要商品且广泛用于食品、服务和清洁行业。因此，其商业意义规模的生产为广泛研究的目标。酶促与化学方法皆可用于使其以极低成本生产(帕克(Park)，D.W.等人，(2000)生物技术快报(BiotechnologyLetters)22：951-956)。这些烷基糖苷可进行进一步改性以产生用于合成本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的中间物。因此，已知当在氧气存在下使用未被保护的物质和铂黑催化剂时1-十二烷基β-D-葡糖苷优先在6位进行氧化以高产率产生相应葡糖醛酸类似物(范贝克(van Bekkum)，H.(1990)作为有机原料的碳水化合物(Carbohydrates as OrganicRaw Materials)289-310)。可获得在烷基葡糖苷的6位氧化一级醇的其它化学选择方法。举例来说，使用催化量的2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)以及化学计量的有机氧化剂[双(乙酰氧基)碘]苯(BAIB)(黛米科(De Mico)，A.，等人(1997)有机化学期刊1997：6974-6977)通过氧化一级羟基得到显著产量的核苷-5′-甲酸(埃普(EPP)，J.B.和维德斯科(Widlanski)，T.S.(1999)有机化学期刊64：293-295)。这一氧化作用甚至在其它二级羟基未被保护时还对一级羟基具有化学选择性(科迪(Codee)，J.D.等人，(2005)美国化学会志127：3767-3773)。以类似方式，在水中通过使用KBr和次氯酸钠作为化学计量的氧化剂用TEMPO氧化将1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷和1-十四烷基β-D-吡喃葡萄糖苷氧化成相应糖醛酸(1-十二烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-葡糖醛酸)(密克瑞特(Milkereit)，G.等人，(2004)化学物理脂质(Chem Phys Lipids)127：47-63)。实例中提供使用(二乙酰氧基碘)苯(DAIB亦称为BAIB)的轻度氧化程序。某些这些葡糖醛酸中间物可购得(例如辛基b-D-葡糖醛酸；卡博森斯(Carbosynth)，MO07928)，且如所示，大多数均通过常规方法(沙曼(Schamann)，M.和沙弗尔(Schafer)，H.J.(2003)欧洲有机化学期刊(Eur J Org Chem)351-358；范登博斯(Van den Bos)，L.J.，等人(2007)欧洲有机化学期刊3963-3976)或根据要求进行制备。流程2说明例如包含-COOH基团作为反应性官能团的某些官能化表面活性剂中间物，其用以制备本文所描述的中间物和/或试剂。
流程2.烷基葡糖醛酸和二葡糖醛酸类试剂的实例.
类似地，芳烷基糖苷(包括烷氧基芳基)可形成用于紧密相关非离子型表面活性剂的基础。举例来说，4-烷氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷容易通过在醚合三氟化硼存在下使4-烷氧基酚与五-O-乙酰基β-D-葡萄糖反应合成。在甲醇/水中使用三甲胺的后续去乙酰化和如上文和实例中所描述的选择性氧化产生适用于形成本文所描述的试剂和肽的烷氧基芳基葡糖醛酸试剂(史密斯(Smits)，E.等人，(1996)化学会杂志珀金汇报(J Chem Soc，Perkin Trans)I2873-2877；史密斯，E.等人，(1997)液晶(Liquid Crystals)23：481-488)。
流程3.芳烷基或烷氧基芳基表面活性剂部分的说明性成员.
葡糖醛酸类中间物容易通过标准偶合剂活化以与氨基酸侧链(例如Lys的氨基酸侧链)键联。因此，如流程4中所示，Fmoc-Lys-O-Tms(三甲基硅烷基＝TMS)可在偶合剂存在下与辛基β-D-葡糖醛酸反应，且O-Tms保护基接着可经水性处理而水解产生Fmoc-Lys(1-辛基β-D-葡糖醛酰胺)。当需要接近分子的N端区域并入表面活性剂部分时，可使用标准偶合方案将这种试剂用以并入肽的固相合成中。由于Lys氨基官能团的反应性非常高，故二级羟基可能未被保护，或其可通过全乙酰化进行保护。如果使用被乙酰基保护的形式，则可通过用MeOH/NaOMe或MeOH/Et3N处理以高产率去除乙酰基保护基。流程4说明本文所描述的试剂的制备。
流程4.试剂的制备实例
在一些实施例中，用于制备本文所描述的生物学活性肽产物的试剂和/或中间物包含并入合成肽产物中的表面活性剂改性的连接氨基酸家族。因此，在一个实施例中，本文所描述的肽产物以线性方式合成，其中官能化表面活性剂通过连接氨基酸侧链上的官能团(例如赖氨酸残基的氨基)连接到可逆保护的连接氨基酸产生专属试剂(如流程4中所示)，其可并入生长肽链中且接着通过将其它氨基酸连接到半胱氨酸残基而合成剩余肽。适用于合成本文所描述的改性的肽和/或蛋白质的保护基描述于例如T.W.格林(Green)、P.G.M.伍特斯(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，威利国际科学(Wiley-Interscience)，纽约(New York)，1999，503-507，736-739中，其揭示内容以引用的方式并入本文中。
在另一个实施例中，本文所描述的肽产物由官能化表面活性剂通过肽链中的连接氨基酸上的适合官能团共价连接到全长肽而合成。
或者，可将官能化表面活性剂添加到已在肽的固相合成过程中脱除保护基的连接氨基酸侧链中。举例来说，烷基葡糖醛酸基在肽固相合成期间可直接添加到连接氨基酸侧链(例如脱除保护基的Lys侧链)中。举例来说，将Fmoc-Lys(Alloc)-OH用作次单元提供可去除但肽仍位于树脂上的正交保护。因此，使用Pd/二乙硫巴比土酸或其它alloc脱除保护基方法使Lys侧链脱除保护基可使氨基暴露以与被酰基保护或未被保护的1-辛基β-D-葡糖醛酸单元偶合。最终用低百分比的CF3CO2H(TFA)裂解混合液脱除保护基将接着递送所要的产物。虽然糖苷键联对于强酸不稳定，但此处和其他人的经验为对于低百分比TFA裂解条件相对稳定。或者，糖OH官能团上的酰基保护(例如乙酰基，Ac；苯甲酰基，Bz)或三烷基硅烷基保护可用以使对糖苷键联的保护增加。后续通过碱(NH2NH2/MeOH；NH3/MeOH，NaOMe/MeOH)脱除保护基产生所要的脱除保护基的产物。流程4说明本文所描述的试剂。流程5说明本文所描述的肽中间物。
流程5.肽中间物的说明性实例.
如以下流程6中所示，通过对6位官能团进行改性得到不同的氨基酸侧链官能团键联方式，产生其它试剂。因此，可使用氨基取代与Asp或Glu侧链键联。可使用叠氮基或炔烃取代与含有互补接受体的非天然氨基酸键联以实现胡伊斯根3+2环加成(高蒂尔，M.A.和克洛克，H.A.(2008)化学通讯(剑桥)2591-2611)。可使用氨氧基或醛官能团分别连接到醛(亦即肟键联)或氨基官能团(亦即还原性烷基化)。顺丁烯二酰亚胺或-NH-(C＝O)-CH2-Br官能团可与Cys或其它SH官能团以化学选择方式结合。这些类型的键联策略在与本文所描述的试剂结合使用时有利。官能团的相互转化广泛实行于有机合成中，且可获得本文所列举的每一官能团改性的多种途径的详尽清单(拉罗克(Larock)，R.C.(1999))“有机官能团转换(Comprehensive Organic Transformations)”，VCH出版社，纽约。
因此，例如，辛基1-β-D-葡糖苷的位置6上的一级羟基通过活化和用叠氮阴离子置换、反应(如用于碳水化合物化学反应的反应)(例如通过甲苯磺酰化，然后为NaN3)转化成叠氮化物。相应叠氮化物通过在吡啶中用硫代乙酸还原(埃洛弗松(Elofsson)，M.，等人(1997)四面体53：369-390)或通过类似的氨基产生方法来还原成氨基官能团(丹吉尔(Stangier)，P.等人，(1994)液晶17：589-595)。得到乙炔、氨氧基和醛部分的方法最佳是对从可购得的葡糖苷通过用Ac2O处理、随后一级胺轻度水解获得的三乙酰氧基形式实施。这种6-羟基形式可选择性地氧化成醛，或活化成甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯，且通过NH2OH或通过乙炔钠置换。顺丁烯二酰亚胺键联可通过如所示的碳键联或优选通过O或酰胺键联，又通过所述领域中熟知的置换活化的羟基或使葡糖醛酸衍生物与连接氨基的顺丁烯二酰亚胺试剂偶合实现。其它官能团相互转化为所属药物化学领域的技术人员所熟知且在本文所描述的实施例的范畴内。
本文所描述的合成方法的范畴内还涵盖糖和疏水链通过α糖苷键联共价连接的表面活性剂。主要产生α-连接糖苷的合成途径在所述领域已熟知且通常由全乙酰基糖起始并且使用酸性催化(例如SnCl4、BF3或HCl)以实现α-糖基化(丘迪奇(Cudic)，M.和伯斯坦(Burstein)，G.D.(2008)分子生物学方法(Methods Mol Biol)494：187-208，维尔(Vill)，V.，等人(2000)化学物理脂质104：75-91，所述揭示内容以引用的方式并入本文中)。双糖糖苷存在类似合成途径(冯明登(von Minden)，H.M.，等人(2000)化学物理脂质106：157-179，所述揭示内容以引用的方式并入本文中)。接着如上进行官能团相互转化产生6-羧酸等，从而产生相应α-连接试剂。
流程6列举适用于合成本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的某些化合物和试剂。使用的标准命名使用氨基酸的单个字母缩写。
流程6.其它试剂实例.
许多烷基糖苷可通过如例如(罗斯维尔(Rosevear)，P.等人，(1980)生物化学19：4108-4115，李，Y.T.，等人(1991)生物化学杂志266：10723-10726)或科埃兹瓦(Koeltzow)和尤夫(Urfer)，美国油化学会杂志(J.Am.Oil Chem.Soc.)，61：1651-1655(1984)，美国专利第3,219,656号和美国专利第3,839,318号中所描述的已知程序或如例如(李，Y.T.，等人(1991)生物化学杂志266：10723-10726，格帕兰(Gopalan)，V.等人，(1992)生物化学杂志267：9629-9638)中所描述以酶促方式合成。与天然氨基酸(如Ser)的O-烷基键联可在Fmoc-Ser-OH上使用全乙酰基葡萄糖进行，产生Nα-Fmoc-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-L-丝氨酸。这种物质在一级碳原子(位置6)处以选择性方式脱除保护基且使用如上文所描述的TEMPO/BAIB以选择性方式氧化以产生相应6-羧基官能团，其可偶合到亲脂性胺以产生一类新的非离子型表面活性剂和试剂(流程7)。
流程7.非离子型表面活性剂试剂的替代性实例.
疏水性烷基与亲水性糖之间的键联的其它可能性中可包括糖苷、硫糖苷、酰胺(作为有机原料的碳水化合物，F.W.里奇腾塔勒(Lichtenthaler)编，VCH出版社，纽约，1991)、酰脲(奥地利专利386,414(1988)；化学摘要(Chem.Abstr.)110：137536p(1989)；参见格鲁伯(Gruber)，H.和戈伯(Greber)，G.，作为有机原料的碳水化合物中的“反应性蔗糖衍生物(Reactive Sucrose Derivatives)”，第95-116页)或酯键联(糖酯：制备和应用(SugarEsters：Preparation and Application)，J.C.考伯特(Colbert)编，(诺伊斯数据公司(Noyes Data Corp.)，新泽西州(New Jersey))，(1974))。
可选择用于改性试剂或调配本文所描述的产物的有用烷基糖苷的实例包括：烷基糖苷，如辛基-、壬基-、癸基-、十一烷基-、十二烷基-、十三烷基-、十四烷基、十五烷基-、十六烷基-、十七烷基-和十八烷基-D-麦芽糖苷、-葡糖苷或-蔗糖苷(亦即蔗糖酯)(根据以下合成：科埃兹瓦和尤夫；阿那曲斯公司(Anatrace Inc.)，茂米城(Maumee)，俄亥俄州(Ohio)；卡泊岑(Calbiochem)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)；弗鲁卡化学(Fluka Chemie)，瑞士(Switzerland))；烷基硫麦芽糖苷，如庚基、辛基、十二烷基-、十三烷基-和十四烷基-β-D-硫麦芽糖苷(根据以下合成：德费(Defaye)，J.和佩德森(Pederson)，C.，作为有机原料的碳水化合物中的“用于碳水化合物转化技术的氟化氢、溶剂和试剂(Hydrogen Fluoride，Solvent and Reagent for Carbohydrate ConversionTechnology)”，247-265(F.W.里奇腾塔勒编)VCH出版社，纽约(1991)；费伦希(Ferenci)，T.，J.细菌学(Bacteriol)，144：7-11(1980))；烷基硫葡糖苷，如1-十二烷基-或1-辛基-硫基α-或β-D-吡喃葡萄糖苷(阿那曲斯公司，茂米城，俄亥俄州；参见西户(Saito)，S.和土屋(Tsuchiya)，T.化学药物简报(Chem.Pharm.Bull).33：503-508(1985))；烷基硫蔗糖(根据以下合成：例如宾德(Binder)，T.P.和罗伯特(Robyt)，J.F.，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)140：9-20(1985))；烷基麦芽三糖苷(根据科埃兹瓦和尤夫合成)；蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰胺；(根据以下合成：奥地利专利382,381(1987)；化学摘要，108：114719(1988)和格鲁伯和戈伯第95-116页)；通过酰胺键联连接到烷基链的帕拉金糖和异麦芽胺的衍生物(根据以下合成：孔兹(Kunz)，M.，作为有机原料的碳水化合物中的“作为中间物用于合成表面活性剂和聚合物的基于蔗糖的亲水性构筑嵌段”，127-153)；通过尿素连接到烷基链的异麦芽胺的衍生物(根据孔兹合成)；蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰脲(根据格鲁伯和戈伯，第95-116页合成)；和蔗糖氨基-烷基醚的长链脂肪族碳酸酰胺(根据奥地利专利382,381(1987),化学摘要，108：114719(1988)和格鲁伯和戈伯，第95-116页合成)。
一些优选糖苷包括通过糖苷或酯键联连接到具有6、8、10、12或14个碳原子的烷基链的糖类麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和半乳糖，例如己基-、辛基-、癸基-、十二烷基-和十四烷基-麦芽糖苷、蔗糖苷、葡糖苷和半乳糖苷。这些糖苷在体内被降解成无毒醇或脂肪酸和寡糖或糖。以上实例说明用于本文所主张的方法中的烷基糖苷类型，然而，清单并不意欲具有详尽性。
一般来说，这些表面活性剂(例如烷基糖苷)任选地经过设计或选择以对肽的生物特性进行改性，如调节生物可用性、半衰期、受体选择性、毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、抗酶促降解性等)、用于纯化和加工的便利性、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化活性、氧化还原电位、与其它分子反应(例如共价或非共价反应)的能力等。
表面活性剂
术语“表面活性剂(surfactant)”由使短语“表面活性剂(surface activeagent)”缩短产生。在医药应用中，表面活性剂适用于液体医药调配物，在其中其用于许多目的，充当乳化剂、增溶剂和湿润剂。乳化剂使亲脂性或部分亲脂性物质的水溶液稳定。增溶剂使医药组合物的组分的溶解性增加，从而增加可获得的浓度。润湿剂为使流体的表面张力减小从而诱导其容易地扩散到其所涂覆的表面的化学添加剂，由此用流体使表面均匀“湿润”。湿润剂提供一种实现液体调配物与接触医药调配物的粘膜或其它表面积密切接触的方式。因此，表面活性剂可为适用于使本文所描述的肽产物的调配物稳定以及对肽本身的特性进行改性的添加剂。
在特定实施例中，易于合成的烷基糖苷(例如烷基糖苷十二烷基、十三烷基和十四烷基麦芽糖苷或葡糖苷以及蔗糖十二烷酸酯、十三烷酸酯和十四烷酸酯)适用于共价连接到如本文所描述的肽。类似地，相应烷基硫糖苷为可为调配物研发所接受的稳定且易于合成的表面活性剂。
多种物理和表面活性剂特性可通过表面活性剂(例如烷基糖苷)的疏水性或亲水性区域的适当改性来实现。举例来说，比较十二烷基麦芽糖苷(DM)与十二烷基葡糖苷(DG)的双层活性的研究发现DM为DG的三倍以上，但具有相同的疏水尾长度(洛佩斯(Lopez)，O.等人，(2002)胶体聚合物科学杂志(Colloid Polym Sci)280：352-357)。在这种特定情况下，极性区域的一致性(双糖对单糖)影响表面活性剂行为。在表面活性剂连接到肽(例如本文所描述的肽产物)的情况下，肽区域还可影响整个分子的疏水性或亲水性特征。因此，调整物理和表面活性剂特性可用以实现适用于个别肽目标的特定物理和医药特性。
PEG改性
在一些实施例中，本文所描述的表面活性剂改性的肽产物进行进一步改性以并入一个或一个以上PEG部分(威罗尼(Veronese)，F.M.和梅罗(Mero)，A.(2008)生物制药(BioDrugs)22：315-329)。在一些情况下，并入大PEG链防止肽在肾中的肾小球中过滤至肾中形成的稀尿液中(内斯特，J.J.，Jr.(2009)当今医药化学16：4399-4418，卡利切蒂(Caliceti)，P.和威罗尼，F.M.(2003)先进药物递送综述(Adv Drug Deliv Rev)55：1261-1277)。在一些实施例中，可选PEG亲水链使通过并入较长链烷基糖苷部分而具有疏水性的肽或蛋白质的溶解性和物理特性平衡。
蛋白质的聚乙二醇化还可能具有负效应。因此，聚乙二醇化可使一些蛋白质产生实质上的生物活性损失，且此举可涉及特定受体类别的配体。在所述情况下，可逆聚乙二醇化可能有利(法勒-舒尔曼(Peleg-Shulman)，T.等人，(2004)药物化学杂志47：4897-4904，格林沃尔德(Greenwald)，R.B.等人，(2003)先进药物递送综述55：217-250，罗伯茨(Roberts)，M.J.和哈里斯(Harris)，J.M.(1998)药物科学杂志87：1440-1445)。
另外，分子质量增加可防止穿透除肾小球膜屏障外的生理性屏障。举例来说，已表明高分子量形式的聚乙二醇化可防止穿透到一些组织中且从而降低治疗功效。另外，高分子量可防止跨粘膜屏障(经鼻、经颊、经阴道、经口、经直肠、经肺递送)的吸收。然而，延缓吸收对于将稳定分子投予肺可能高度有利，实质上延长了作用持续时间。本文所描述的肽和/或蛋白质产物使经粘膜的生物可用性增加且由此允许较长链PEG改性与表面活性剂改性结合使用，在鼻内或其它经粘膜途径之后实现商业意义的生物可用性。
在一些实施例中，长链PEG聚合物和短链PEG聚合物适用于本文所描述的蛋白质和肽的改性。通过吸入对糖尿病投予治疗为一种递送药物的新颖方法，且肺具有高度可渗透屏障(例如艾伯拉(Exubera))。对于这种延缓肺屏障的穿透的应用来说，优选聚乙二醇化形式在C10到C400的较低分子量范围内(约250到10,000Da)。因此，尽管通过PEG的主要延长途径为实现“有效分子量”高于肾小球过滤截留值(大于68kDa)，但是使用较短的链可为一种延长在肺中的滞留以治疗肺病和其它呼吸性病状的途径。因此，约500到3000Da的PEG链的尺寸足以减缓进入末梢循环中，但不足以使其具有极其延长的循环时间。在一些实施例中，对于本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质，应用聚乙二醇化使得对肺组织的局部功效增加，同时降低全身性副作用的可能性。在一些所述实施例中，约750到约1500Da范围内的PEG链总称为“PEG1K”。
另外，其它聚合物可与本文所描述的化合物结合使用以使其物理特性最佳。举例来说，聚(2-乙基2-噁唑啉)结合物具有可变疏水性且其尺寸足以使作用持续时间增加(梅罗，A.等人，(2008)控制释放期刊(J Control Release)125：87-95)。所述聚合物与糖键联产生一类适用于本文所描述的肽和/或蛋白质改性的表面活性剂。
将聚乙二醇链官能化使其与肽和/或蛋白质链上的反应性基团结合。典型官能团允许通过聚乙二醇链上的相应羧基、氨基或顺丁烯二酰亚氨基(等)与肽上的氨基、羧基或硫氢基反应。在一个实施例中，PEG包含C10-C3000链。在另一个实施例中，PEG的分子量高于40,000道尔顿。在又一个实施例中，PEG的分子量低于10,000道尔顿。作为蛋白质改性的PEG在所属领域中熟知且其用途描述于例如美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；和第4,179,337号中。
将非传统型PEG链改性成实质上两亲性的。也就是说，其具有两种亲水性PEG结构，但经过改性含有疏水性区域，如脂肪酸酯和其它疏水性组分。参见例如(米勒(Miller)，M.A.等人，(2006)生物结合化学17：267-274)；艾克雷博(Ekwuribe)等人，US6,309,633；艾克雷博等人，US6,815,530；艾克雷博等人，US6,835,802)。虽然这些与蛋白质的两亲性PEG结合物最初显现出使经口生物可用性增加，但其在此作用上相对无效。然而，使用具有两性肽的所述两亲性PEG结合物将使肺中的滞留明显延长以延伸这些医药的有用生物活性。优选PEG链的分子量范围在500到3000Da。以上参考文献中提供这些结合物的合成方法的详细说明，其所有内容均引入本文中。
PEG实体本身不具有连接到目标分子(如肽)的官能团。因此，为产生PEG连接，必须首先将PEG实体官能化，接着使用官能化连接将PEG实体连接到目标分子(如肽)(格林沃尔德，R.B.等人，(2003)先进药物递送综述55：217-250，威罗尼，F.M.和帕苏婷(Pasut)，G.(2005)当今药物发现(Drug Discov Today)10：1451-1458，罗伯茨，M.J.等人，(2002)先进药物递送综述54：459-476)。在一个实施例中，位点特异性聚乙二醇化可通过肽分子上的Cys取代实现。目标肽可通过固相合成、重组方式或如本文所描述的其它方式合成。
因此，在一些实施例中，本文所描述的肽产物包含用烷基糖苷和在至少一个Cys残基、Lys残基或分子其它地方的其它反应性氨基酸残基上特异性聚乙二醇化改性的Lys或其它反应性残基。
在另一个实施例中，Lys或具有亲核侧链的其它残基可用于并入PEG残基。此举可通过用酰胺或氨基甲酸酯键联到PEG-羧基或PEG-碳酸酯链来实现。参见例如所描述(威罗尼，F.M.和帕苏婷，G.(2005)当今药物发现10：1451-1458)。替代方法为通过连接含有SH的残基(如氢硫基乙酰基、氢硫基丙酰基(CO-CH2-CH2-CH2-SH)等)来改性Lys侧链氨基官能团。或者，可在合成程中将PEG链并入C端作为酰胺。连接PEG链的其它方法利用与His和Trp的侧链的反应。对肽链进行改性以允许连接PEG链的其它类似方法在所属领域已知且以引用的方式并入本文中(罗伯茨，M.J.，等人(2002)先进药物递送综述54：459-476)。
调配物
在一个实施例中，调配物中提供如本文所揭示的共价改性的肽或蛋白质，所述调配物在投予个体时进一步减少、防止或减轻组合物中的肽和/或蛋白质缔合或聚集，例如减少肽和/或蛋白质自身缔合或自身聚集，或减少与其它肽或蛋白质的缔合或聚集。
高蛋白浓度下的自身缔合为治疗调配物中的一个问题。举例来说，自身缔合使浓单株抗体水溶液的黏度增加。浓胰岛素制剂不会通过自身聚集来活化。这些尤其高蛋白浓度下的自身缔合蛋白质相互作用可降低、调节或清除许多治疗剂的生物活性(克劳德菲特(Clodfelter)，D.K.等人，(1998)药学研究15：254-262)。通过注射或其它方式递送的以高浓度调配的治疗蛋白质由于这些蛋白质相互作用故而可为物理上不稳定或不可溶的。
制备肽和蛋白质调配物的重要挑战为研发可制造且稳定的剂型。对于加工和处理关键的物理稳定特性通常表征不佳且难以预测。如通过蛋白质相互作用和溶解特性所测定，会遇到许多物理不稳定性现象，如缔合、聚集、结晶和沉淀。由此产生重要的制造、稳定性、分析和递送挑战。在许多临床情形下均需要研发需要高剂量(大约mg/kg)的肽和蛋白质药物的调配物。举例来说，使用皮下途径，约＜1.5mL为容许投予体积。此情况可需要＞100mg/mL蛋白质浓度以达到适当剂量。在单株抗体的高浓度冻干调配物的研发中存在类似考虑。一般来说，较高蛋白质浓度允许较小的待使用注射体积，此情况对于患者的舒适性、便利性和顺应性极其重要。本文所描述的表面活性剂改性的化合物经过设计使所述聚集事件降到最小且可通过使用少量如本文所描述的表面活性剂得以进一步促进。
因为对于许多人来说注射是不舒服的投予模式，所以已在寻觅肽治疗剂的其它投予方式。某些肽和蛋白质治疗剂可例如通过鼻内、经颊、经口、经阴道、吸入或其它经粘膜投予来投药。实例为以商业经鼻喷雾调配物形式投予的那法瑞林()和降钙素。本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质经过设计有助于所述经粘膜投药，且所述调配物可通过使用少量如本文所描述的表面活性剂得以进一步促进。
典型调配物参数包括最佳溶液pH值、缓冲液和稳定赋形剂的选择。另外，冻干饼复原对于冻干或粉末化调配物十分重要。另一个重要问题包含自身缔合时蛋白质调配物黏度的变化。黏度变化可明显改变例如用于鼻内、肺部或口腔喷雾的喷雾剂(气雾剂)递送中的递送特性。此外，黏度增加可使通过注射器或静脉内管线进行的注射递送更困难或不可能。
进行许多尝试以稳定并且维持已报导的肽的完整性和生理活性。尤其对于胰岛素泵系统，一些尝试已产生稳定作用对抗热变性和聚集。描述聚合表面活性剂(瑟罗(Thurow)，H.和杰森(Geisen)，K.(1984)糖尿病学(Diabetologia)27：212-218；查瓦拉(Chawla)，A.S.等人，(1985)糖尿病34：420-424)。认为通过这些化合物稳定胰岛素具有空间性质。其它所用系统中有糖(荒川(Arakawa)，T.和蒂马沙夫(Timasheff)，S.N.(1982)生物化学21：6536-6544)；渗透物，如氨基酸(荒川，T.和蒂马沙夫，S.N.(1985)物理学期刊(Biophys J)47：411-414)；和水结构解聚剂，如尿素(萨托(Sato)，S.等人，(1983)药物科学杂志72：228-232)。这些化合物通过调节蛋白质或肽的分子内疏水性相互作用发挥其作用。
多种肽、肽或蛋白质描述于本文中，且可用任一种本文所描述的共价结合的表面活性剂试剂进行改性。本文所描述的肽改性宜包含有包含亲水性(例如糖)基团与疏水性(例如烷基链)基团的表面活性剂的共价连接，从而在生理条件下使肽稳定。在一些实施例中，包含亲水性基团和疏水性基团的部分(例如糖苷表面活性剂)与本文所描述的肽和/或蛋白质的共价键联消除对肽和/或蛋白质的氨基酸序列进行改性以增强稳定性(例如减少聚集)的需要。
在一些实施例中，调配物包含至少一种包含用本文所描述的表面活性剂衍生试剂改性的肽的药物，且在调配物中另外可与表面活性剂缔合，其中表面活性剂进一步由例如糖、烷基糖苷或其它赋形剂构成，且可以选自由以下组成的群组的形式投予：滴剂、喷雾剂、气雾剂、冻干产物、喷雾干燥产物、可注射和持续释放形式。喷雾剂和气雾剂可通过使用适当分配器获得且可通过鼻内、经颊、吸入或其它经粘膜途径投予。冻干产物可含有其它化合物，如甘露糖醇、糖、次微米无水α-乳糖、明胶、生物相容性凝胶或聚合物。持续释放形式可为眼部插入物、可侵蚀微粒、可水解聚合物、膨胀粘附微粒、pH值敏感微粒、纳米粒子/乳胶系统、离子交换树脂和其它聚合凝胶和植入物(爱克赛(Ocusert)，阿尔扎公司(AlzaCorp.)，加利福尼亚州(California)；乔希(Joshi)，A.，S.平(Ping)和K.J.西梅尔斯坦(Himmelstein)，专利申请案WO91/19481)。也可实现重要经口生物可用性。
本文所描述的肽和蛋白质改性减轻且在一些情况下可消除对有机溶剂的需要。已使用海藻糖、乳糖和甘露糖醇以及其它糖类以防止聚集。抗IgE人类化单株抗体的聚集通过与摩尔比等于或高于300∶1到500∶1(赋形剂∶蛋白质)范围内的海藻糖进行调配降到最低。然而，粉末会过度内聚且不适用于气雾剂投予或在储存期间会展示不合需要的蛋白质糖化(安迪(Andya)，J.D.等人，(1999)药学研究16：350-358)。每一种所发现的添加剂作为治疗剂的添加剂均具有局限性，其包括异型生物质代谢、刺激或毒性或高成本。与本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质一起使用者涵盖赋形剂，所述赋形剂有效、无刺激性且无毒并且因为其由天然糖、脂肪酸或长链醇构成故而不需要异型生物质代谢，且其还可用以使水溶液中或在由水性体液(如血浆或唾液)通过生理性水溶液复原使干燥肽和/或蛋白质调配物就地水溶液复原时的聚集降到最低。
其它调配物组分可包括缓冲剂和生理性盐、无毒蛋白酶抑制剂(如抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制剂)、α-1-抗胰蛋白酶和蛋白酶不活化单株抗体等。缓冲剂可包括有机物，如乙酸酯、柠檬酸酯、葡糖酸酯、反丁烯二酸酯、苹果酸酯、聚赖氨酸、聚谷氨酸、壳聚糖、硫酸葡聚糖等，或无机物，如磷酸盐和硫酸盐。所述调配物可另外含有低浓度的抑菌剂，如苯甲醇等。
适用于鼻内投予的调配物还包含本文所描述的改性的肽和/或蛋白质产物在可接受的蒸发溶剂(如氢氟烷烃)中的溶液或悬浮液。所述调配物适用于由定量吸入器(MDI)投予且具有从投予部位缺乏移动、低刺激和不存在灭菌需要的优点。所述调配物还可含有可接受的赋形剂或膨化剂，如次微米无水α-乳糖。
另一方面，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质展示储存期限增加。如本文所使用，短语“储存期限”广泛描述为产物可储存而不会不适用或不会发生消耗的时间长度。本文所描述的组合物的“储存期限”还可指示与组合物品质的可允许损失对应的时间长度。如本文所使用，组合物的储存期限不同于截止日期；“储存期限”涉及本文所描述的组合物的品质，但是“截止日期”更多地涉及组合物的制造和测试要求。举例来说，超过其“截止日期”的组合物可能仍安全且有效，但制造商不再确保品质为最佳。
方法
一方面，本文提供向有需要个体投予有效量的本文所描述的治疗组合物的方法。如本文所使用，为达到本文的目的，“治疗有效量”可与“有效量”互换，且通过如所属领域已知的所述考虑因素测定。所述量必须在患有疾病的被治疗个体中有效实现所要药物介导的效应。治疗有效量还包括(但不限于)所属领域的技术人员所选择的适量度，例如存活率改良、回收更快速、或症状的改善、改良或消除、或其它可接受的生物标记或替代标记。
将本文所描述的组合物递送到需要治疗的脊椎动物个体(包括(但不限于)例如人类)中。此外，视所治疗的病状而定，可调配这些治疗组合物并且全身或局部投予。调配及投予技术可见于最新版的“雷明登氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)”(马克(Mack)出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton Pa.))中。适合途径可例如包括经口或经粘膜投予；如鼻内；经颊；眼部、经阴道；经直肠；以及不经肠递送，其包括肌肉内、皮下、静脉内或腹膜内投予。
在所述方法的一些实施例中，用于投予的肽产物的有效量为约0.1μg/kg/天到约100.0μg/kg/天、或0.01μg/kg/天到约1mg/kg/天或0.1μg/kg/天到约50mg/kg/天。在一些实施例中，所述肽产物不经肠投予。在一些实施例中，所述肽产物皮下投予。在一些实施例中，肽产物的投予方法为经鼻吹入。
然而，应了解，用于任何特定有治疗需要个体的特定剂量和给药频率可发生改变，且将视包括以下的许多因素而定：所使用的特定化合物的活性、那种化合物的代谢稳定性和作用持续时间、年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、投药方式及时间、排泄速率、药物组合、特定病状的严重程度和经受治疗的主体。
在一个实施例中，提供一种通过与表面活性剂共价键联以增加或维持组合物或分子的生物作用(例如受体结合或酶活性)而对分子进行化学改性的方法。在一些实施例中，所述分子为肽。所述方法又可包括进一步改性，其包含将组合物中的分子共价连接到如聚乙二醇的聚合物。
所述方法包括本文所描述的组合物的所有方面，包括(但不限于)降低或消除肽和/或蛋白质药物的免疫原性、无刺激性、具有抗细菌或抗真菌活性、药物的稳定性或生物可用性增加、药物的生物可用性偏差降低、避免首次肝清除且减少或消除任何副作用的组合物。如本文所使用，术语“免疫原性”为特定物质或组合物或药剂引起免疫反应的能力。本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的免疫原性通过在所属领域已知的方法得以证实。
还提供一种投予包含共价连接到至少一个烷基糖苷的肽且递送到脊椎动物的药物组合物的方法，其中烷基具有1到30个碳原子，或进一步在6到16个碳原子的范围内，且烷基糖苷会使药物的稳定性、生物可用性和/或作用持续时间增加。
在另一个实施例中，提供一种将肽链共价连接到至少一个烷基糖苷(其中烷基具有1到30个碳原子)而降低或消除肽和/或蛋白质药物的免疫原性的方法。
整个本申请案中参考了多个公开案。所属领域的技术人员将理解，所参考的这些公开案的揭示内容以引用的方式并入本申请案中。
治疗方法
在一些实施例中，本文提供治疗包括手术后或慢性疼痛的疼痛的方法，其包含向有需要个体投予本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式I、II或III的肽产物)。在一些所述实施例中，本文所描述的类鸦片类似物无成瘾或成习惯性，和/或以相比于当前药物(例如可待因)较低的剂量投予且相比于当前药物持续较长时间。
在一些实施例中，本文提供预防和/或治疗与甲状旁腺功能减退和/或骨骼质量密度降低有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)。在一些实施例中，特征为骨骼质量密度降低的病状包括(且不限于)骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、老年骨质疏松症、体液性高钙血症等。
在一些实施例中，本文提供治疗甲状旁腺功能减退的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)。在一些实施例中，甲状旁腺功能减退与骨骼质量密度降低有关。
本文进一步提供刺激骨骼修复或有利于移植骨骼植入物的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的上文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)。
在又一个实施例中，本文提供增加骨骼密度和/或降低骨折发病率(例如椎骨骨折、髋部骨折等)的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)
在一些实施例中，本文提供治疗体液性高钙血症的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)。在一些实施例中，体液性高钙血症与肿瘤有关。在一些所述实施例中，肽产物(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)为PTH或PTHrP的反向促效剂或拈抗剂。
在上文所描述的方法的一些实施例中，共价连接到表面活性剂的肽和/或蛋白质为PTH、PTHrP或其类似物。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)以预防方式投予且会延缓与骨骼密度损失有关的任何病状发生，所述病状包括(且不限于)骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、老年骨质疏松症等。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)以治疗方式投予且会延缓与骨骼密度损失有关的任何病状进展，所述病状包括(且不限于)骨质疏松症、骨质减少、绝经后骨质疏松症、佩吉特氏病、糖皮质激素诱发的骨质疏松症、体液性高钙血症等。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)以预防和/或治疗方式投予且延缓骨质减少进展到骨质疏松症。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)以预防和/或治疗方式投予且减少或停止骨骼密度进一步损失，从而使疾病稳定。
在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)不经肠投予。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)皮下投予。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)通过经鼻吹入投予。
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)具有相比于包含目前已知的治疗剂(例如重组PTH、双膦酸盐、抗体地诺单抗等)的药物较长的作用持续时间。在一些实施例中，投予表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)相比于包含目前已知治疗剂(例如重组PTH、双膦酸盐、抗体地诺单抗等)的药物历时较长的时间(例如两年以上)，同时减少或改善与目前已知的治疗剂(例如重组PTH、双膦酸盐、抗体地诺单抗等)有关的副作用(例如颚骨坏死、皮肤感染等)。在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)为PTH或PTHrP的促效剂。在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)为PTH或PTHrP的拈抗剂。在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)为PTH或PTHrP的反向促效剂。
在一些实施例中，本文提供预防和/或治疗与胰岛素敏感性降低有关的病状的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)。在一些实施例中，特征为胰岛素敏感性降低的病状包括(且不限于)新陈代谢综合症、肥胖症相关的胰岛素抗性、高血压、与高C反应蛋白有关的全身性发炎、糖尿病等。
还提供一种治疗与胰岛素抗性有关的病状的方法，所述病状包括(且不限于)肥胖症、新陈代谢综合症、2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等，所述方法包含投予包含共价连接到至少一个烷基糖苷的肽且递送到脊椎动物的药物组合物，其中烷基具有1到30个碳原子，或进一步6到18个范围内的碳原子(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)，且其中烷基糖苷共价键联到肽会增加药物的稳定性、生物可用性和/或作用持续时间。
本文还提供治疗与胰岛胰岛素抗性的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)。在一些实施例中，胰岛素抗性与新陈代谢综合症(综合症X)和/或糖尿病有关。
本文进一步提供刺激身体对胰岛素复敏的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)。
在又一个实施例中，本文提供通过重量损失增加胰岛素敏感性的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V和图1的表1和图2的表2中的肽产物)。
本文还提供治疗糖尿病或前驱糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的上文和此处所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物。
本文提供治疗选自以下的病状或延缓其进展或发作的方法：糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、胰岛素抗性、高血糖症、高胰岛素血症、新陈代谢综合症、糖尿病并发症、游离脂肪酸或甘油血液含量升高、高脂质血症、肥胖症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、急性心脏血管综合症、梗塞形成、缺血性再灌注、高血压，所述方法包含向有需要个体投予治疗有效量的上文所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物。在另一个实施例中，本文提供治疗创伤愈合延缓的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物。
在一个实施例中，所述待治疗的病状为糖尿病。在一个实施例中，所述待治疗的病状为胰岛素抗性。在一个实施例中，所述待治疗的病状为新陈代谢综合症。在一个实施例中，所述肽的所述有效量为约0.1μg/kg/天到约100.0μg/kg/天。
在一个实施例中，投药方法为不经肠投药。在一个实施例中，投药方法为口服投药。在一个实施例中，投药方法为皮下投药。在一个实施例中，投药方法为经鼻吹入投药。
本文进一步提供减少重量增加或诱导重量损失的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物。在一些实施例中，重量增加与新陈代谢综合症有关。
本文提供治疗低血糖症的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物。
本文还提供治疗糖尿病的方法，其包含向有需要个体投予治疗有效量的本文所描述和图1的表1和图2的表2中的肽产物和至少一种其它治疗剂；其中所述治疗剂选自抗糖尿病剂、抗肥胖症剂、饱食剂、消炎剂、抗高血压剂、抗动脉粥样硬化剂和降脂剂。
在上文所描述的方法的一些实施例中，共价连接到表面活性剂的肽和/或蛋白质为胰高血糖素或GLP-1肽或其类似物。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)以预防方式投予且延缓与胰岛素抗性有关的任何病状发生，所述病状包括(且不限于)新陈代谢综合症、高血压、糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、高脂质血症、动脉粥样硬化、全身性发炎等。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)以治疗方式投予且延缓与以下有关的任何病状的进展：新陈代谢综合症、高血压、糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、高脂质血症、动脉粥样硬化、全身性发炎等。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)以预防和/或治疗方式投予且延缓胰岛素抗性进展到糖尿病。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)以预防和/或治疗方式投予且减少或停止胰岛素抗性的进一步损失，从而使疾病稳定。
在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)不经肠投予。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)皮下投予。在一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)通过经鼻吹入投予。
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)具有相比于包含目前已知的治疗剂(例如艾塞那肽、二甲双胍等)的药物较长的作用持续时间。
用PTH类似物组合治疗
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)与以下组合投予：包括双膦酸盐(例如阿仑膦酸盐)或锶盐的骨骼再吸收抑制剂；或具有雌激素样效应的物质，例如雌激素；或选择性雌激素受体调节剂，例如雷洛昔芬(raloxifene)、泰莫西芬(tamoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、艾多昔芬(idoxifene)或左美洛昔芬(levormeloxifene)；或降钙素样物质，例如降钙素；或维生素D类似物；或钙盐。任选地同时或以任何次序依序投予治疗剂。举例来说，在上文所描述的方法的一些实施例中，向有需要个体投予第一方案的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)，且所述方案之后为第二方案的双膦酸盐治疗。举例来说，在一些其它实施例中，向有需要个体投予第一方案的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式2-I-A、2-III、2-V、2-VI或2-VII的肽产物)，随后为药物假期，随后为第二方案的雌激素受体调节剂。
用GLP类似物组合治疗
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)与选自包含以下的群组的新陈代谢综合症的其它治疗方法组合投予：抗糖尿病剂、抗肥胖症剂、抗高血压剂、抗动脉粥样硬化剂和降脂剂。举例来说，适用于与本文所描述的表面活性剂改性的肽和/或蛋白质产物组合投予的有效抗糖尿病剂包括双胍、磺酰脲、葡糖苷酶抑制剂、PPARγ促效剂、PPARα/γ双重促效剂、aP2抑制剂、DPP4抑制剂、胰岛素增感剂、GLP-1类似物、胰岛素和美格列奈(meglitinide)。其它实例包括二甲双胍、格列苯脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列嘧啶(glipyride)、格列吡嗪(glipizide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列齐特(gliclazide)、阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、吡格列酮(pioglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、莫格列扎(muraglitazar)、胰岛素、G1-262570、伊沙列酮(isaglitazone)、JTT-501、NN-2344、L895645、YM-440、R-119702、A19677、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、KAD1129、AR-HO39242、GW-40I544、KRP2I7、AC2993、LY3I5902、NVP-DPP-728A和沙格列汀(saxagliptin)。
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)与选自有效抗肥胖症剂的群组的新陈代谢综合症的其它治疗方法组合投予。举例来说，适用于与本文所描述的肽产物一起投予的有效抗肥胖症剂包括β3肾上腺素能促效剂、脂肪酶抑制剂、血清素(和多巴胺)再吸收抑制剂、甲状腺受体β化合物、CB-1拈抗剂、NPY-Y2和NPY-Y4受体促效剂和厌食剂。这些类别的特定成员包含奥利司他(orlistat)、AfL-962、A19671、L750355、CP331648、诺美婷(sibutramine)、托吡酯(topiramate)、阿索开(axokine)、右旋安菲他明(dexamphetamine)、苯丁胺(phentermine)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、利莫纳班(rimonabant)(SR14I7164)和马吲哚(mazindol)。
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)与选自有效降脂剂的群组的新陈代谢综合症的其它治疗方法组合投予。举例来说，适用于与本文所描述的肽产物一起投予的有效降脂剂包括选自由以下组成的群组的药剂：MTP抑制剂、胆固醇酯转移蛋白质、HMG CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、纤维酸衍生物、LDL受体活性上调剂、脂肪加氧酶抑制剂和ACAT抑制剂。这些类别的特定实例包含普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、尼伐他汀(nisvastatin)、瑞舒伐他汀(visastatin)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、安妥明(clofibrate)、阿伐麦布(avasimibe)、TS-962、MD-700、CP-529414和LY295427。
在上文所描述的方法的一些实施例中，表面活性剂改性的肽和/或蛋白质(例如式3-I-A、3-III-A、3-III-B或式3-V的肽产物)与已知在动物模型和人中展示促饱食效应的肽激素和其类似物组合投予。本文所呈现的实施例的范畴内涵盖本文所描述的肽产物和治疗肥胖症的长效饱食剂的组合。所述肽饱食剂的实例包括GLP-1、胰多肽(PP)、胆囊收缩素(CCK)、肽YY(PYY)、淀粉素、降钙素、OXM、神经肽Y(NPY)和其类似物(布卢姆(Bloom)，S.R.等人，(2008)分子介入(Mol Interv)8：82-98；菲尔德(Field)，B.C.等人，(2009)英国临床药理学杂志(Br J Clin Pharmacol)68：830-843)。
本文所呈现的实施例的范畴内还涵盖治疗肥胖症的方法，其包含投予本文所描述的肽产物以及包括(且不限于)瘦体素、胃內激素和CART(被可卡因和安非他命调节的转录物)类似物和拈抗剂的肽激素。
体内的其它肽产物与脂肪细胞或肥胖病况(脂肪因子)有关且已知具有促发炎效应(冈萨雷斯-培瑞兹(Gonzalez-Periz)，A.和科莱恩(Claria)，J.(2010)世界科学杂志(ScientificWorldJournal)10：832-856)。所述药剂在与本文所描述的肽产物组合使用时具有其它有利作用。在与本文所描述的肽产物组合使用时提供有益效应的药剂的实例包括脂联素、趋化素、内脏脂肪素、新饱食分子蛋白(nesfatin)、网膜素、抵抗素、TNFα、IL-6和肥胖抑制素的类似物和拈抗剂。
给药
可以任何赋予许多疾病病况有益治疗效果的量投予本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质。在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质适用于治疗发炎。在一个实施例中，本文所呈现的化合物赋予有益的调节手术后或慢性疼痛的活性。在一个实施例中，本发明肽以高于或低于其它调节疼痛的治疗形式的浓度投予患者。在又一个实施例中，本发明肽与其它化合物一起投予以产生协同治疗效果。
代表性递送方案包括经口、不经肠(包括皮下、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、经颊(包括舌下)、经皮、吸入、眼部和鼻内递送方案。引人注目且广泛使用的肽递送方法需要皮下注射控制释放的可注射调配物。在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质适用于皮下、鼻内和吸入投予。
精确剂量和组合物和最适当递送方案的选择将尤其受选择肽的药理学特性、所治疗的病状的性质和严重程度和接受者的身体条件和精神敏锐度影响。另外，投药途径将致使吸收物质的量不同。通过不同途径的肽投予的生物可用性尤其可改变，可见到量小于1％到接近100％。通常，除静脉内、腹膜内或皮下注射外的途径的生物可用性为50％或50％以下。
一般而言，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质或其盐以每天每公斤体重约0.001与20mg之间、每天每公斤体重约0.01与10mg之间、每天每公斤体重约0.1与1000μg之间或每天每公斤体重约0.1与100μg之间的量投予。投药途径不同。举例而言，本文所描述的共价改性的类鸦片肽和/或蛋白质或其盐以每天每公斤体重约0.1与1000μg之间、或每天每公斤体重约0.1与100μg之间的通过量皮下注射投予。举例来说，对于50kg人类雌性个体，皮下注射的活性成分的日剂量为约5到约5000μg。视投药途径、化合物效能、药物动力学特征和观察到的适当生物可用性和活性剂和所治疗的疾病而定需要不同剂量。在通过吸入投药的替代实施例中，日剂量为1000到约20,000μg，每天两次。在如马、犬和牛的其它哺乳动物中，可能需要较高剂量。这一剂量可视需要通过单次投药、通过多次施用或通过控制释放以常规医药组合物递送以获得最有效结果。
医药学上可接受的盐在无有毒副作用的情况下保留亲本肽的所要生物活性。所述盐的实例为(a)与以下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；和与以下有机酸形成的盐：如乙酸、三氟乙酸、酒石酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、双羟萘酸、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等；(b)与以下多价金属阳离子：如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等；或与由N，N′-二苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐或复合物；或(c)(a)和(b)的组合，例如丹宁酸锌盐等。
在一些实施例中，还涵盖包含本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质或其医药学上可接受的盐作为活性成分与医药学上可接受的无毒载剂混合的医药组合物。如上文所提及，所述组合物可被制备成尤其液体溶液或悬浮液形式用于不经肠(皮下、肌肉内或静脉内)投药；尤其片剂或胶囊形式用于经口或经颊投药；尤其粉末、滴鼻剂、蒸发溶液或气雾剂形式用于鼻内投药；尤其与赋形剂的液体溶液或干粉形式(广义定义)用于吸入；和用于经直肠或经皮投药。
组合物宜可以单位剂型投予且可通过例如雷明登氏药学大全，第17版，马克出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿(1985)(以引用的方式并入本文中)中所描述的医药领域熟知的任一方法来制备。用于不经肠投予的调配物可含有无菌水或盐水、烷二醇(如丙二醇)、聚伸烷二醇(如聚乙二醇)、糖、植物源性油、氢化萘、血清白蛋白纳米粒子(如以AbraxaneTM所用，美国制药伙伴公司(American Pharmaceutical Partners，Inc.)伊利诺斯州绍姆堡县(Schaumburg IL))等作为赋形剂。对于经口投药，调配物可通过添加胆汁盐或酰肉碱增强。用于经鼻投药的调配物可为固体或于蒸发溶剂(如氢氟碳化物)中的溶液，且可含有用于稳定的赋形剂，例如糖、表面活性剂、次微米无水α-乳糖或聚葡萄糖，或可为以滴鼻剂或定量喷雾剂形式使用的水溶液或油性溶液。对于经颊投药，典型赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶凝化淀粉等。
在调配用于经鼻投药时，跨鼻粘膜的吸收可通过约0.1与15重量百分比之间、约0.5与4重量百分比之间的范围内或约2重量百分比的量的表面活性剂(如甘胆酸、胆酸、牛胆酸、乙基胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、环糊精等)进一步增强。报导在低刺激下展示较大功效的其它类吸收增强剂为烷基麦芽糖苷类，如十四烷基麦芽糖苷(阿诺德(Arnold)，J.J.等人，(2004)药物科学杂志93：2205-2213，阿尔森(Ahsan)，F.等人，(2001)药学研究18：1742-1746)和其中的参考文献，所有文献以引用的方式并入本文中。
在经过调配通过吸入递送时，许多调配物均会提供优点。将活性肽吸附到容易分散的固体(如二酮哌嗪)(例如技术领域粒子(Technosphere particles)；(普菲茨纳(Pfutzner)，A.和福斯特(Forst)，T.(2005)药物递送的专家观点(Expert Opin DrugDeliv)2：1097-1106)或类似结构上得到使治疗剂最初快速吸收的调配物。含有活性肽和赋形剂的冻干粉末，尤其玻璃状颗粒在良好生物可用性下适用于递送到肺，例如参见(辉瑞(Pfizer)和安万特医药公司(Aventis Pharmaceuticals Inc.)的吸入胰岛素)。描述其它通过吸入递送肽的系统(曼陀罗(Mandal)，T.K.，美国卫生系统药学杂志(Am.J.Health Syst.Pharm.)62：1359-64(2005))。
本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质经较长时段递送到个体(例如一周到一年的时段)可通过单次投予含有足够活性成分的控制释放系统历时所要的释放时段来实现。出于此目的可利用如整体或储集器型微胶囊、储槽式植入物、聚合水凝胶、渗透泵、泡囊、微胞、脂质体、经皮贴片、离子电渗装置和替代性可注射剂型的多种控制释放系统。定位于需要递送活性成分的部位为一些控制释放装置的其它特征，其可证实对于治疗某些病症有益。
一种形式的控制释放调配物含有分散或囊封在缓慢降解的无毒、非抗原性的聚合物(如共聚(乳酸/乙醇酸))中的肽或其盐，如以引用的方式并入本文中的肯特(Kent)、路易斯(Lewis)、桑德斯(Sanders)和泰斯(Tice)的美国专利第4,675,189号的开拓性工作中所描述。化合物或其盐还可调配于胆固醇或其它脂质基质丸粒或硅塑料基质植入物中。其它缓慢释放、储槽式植入物或可注射调配物对熟练技术人员显而易见。参见例如持续和控制释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.罗宾逊(Robinson)编，马塞尔德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，1978和R.W.贝克(Baker)，生物活性剂的控制释放(Controlled Release of Biologically ActiveAgents)，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约，1987。
其它形式的控制释放调配物包含生物可降解聚合物(如共聚(乳酸/乙醇酸)或乳酸和PEG的嵌段共聚物)于生物学上可接受的溶剂中的溶液，所述调配物经皮下或肌肉内注入以获得储槽式调配物。本文所描述的肽与所述聚合调配物混合适合于获得极长作用持续时间的调配物。
本说明书中所提及的所有公开案和专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同每一独立公开案或专利申请案特定且个别地指示为以引用的方式并入一般。
本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和用于其合成的试剂更特定描述于以下实例中，所述实例打算仅具说明性，这是因为其中的许多改性和变化对所属领域的技术人员显而易见。
实例
实例1：试剂-N-α-Fmoc，N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸
在烘干的250mL锥形瓶中放置1-辛基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯有限公司(Carbosynth Ltd.)，3.06g，10mmol)、50mL无水DMF和无水1-羟基苯并三唑(1.62g，12mmol)。伴随搅拌添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(2.48g，12mmol)于50mL DMF中的冷却(4℃)溶液，且使反应进行5分钟。经烧结玻璃漏斗过滤丰富的N，N′-二环己脲的白色沉淀物且将滤液添加到N-α-Fmoc-L-赖氨酸(3.68g，10mmol)于25ml无水DMF中的溶液中。使反应进行25分钟，同时升温到室温或直至茚三酮颜色极其淡。过滤反应混合物，汽提至干燥且通过溶解于MeOH中从MeOH/Et2O结晶，且用Et2O缓慢稀释到混浊点，随后冷冻。可通过使用EtOAc到EtOAc/EtOH/AcOH的溶剂梯度的硅胶色谱法实现进一步纯化。
以类似方式，但用N-α-Boc-L-赖氨酸取代，获得适用于N端并入且裂解成游离N端的N-α-Boc,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用N-α-Ac-L-赖氨酸取代，获得适用于在N端并入N端被阻断的肽的N-α-Ac,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用适量N-α-Fmoc-L-鸟氨酸取代，获得N-α-Fmoc,N-δ-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-鸟氨酸。以类似方式，但用其它N-单保护二氨基酸取代，获得相应试剂。或者，在偶合期间使用暂时Me3Si酯保护基并且不预先活化1-辛基β-D-葡糖醛酸提供形成试剂的容易途径。暂时Me3Si酯通过在二氯甲烷(CH2Cl2)中使Fmoc-Lys-OH与等摩尔量的N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺的反应产生。有机层含有如上准备与1-烷基葡糖苷酸偶合的呈于CH2Cl2中的溶液形式的所要试剂。用NaHSO4水溶液洗涤过滤的反应混合物以水解Me3Si酯，经MgSO4干燥且去除溶剂。
类似地，但使用全乙酰基或全苯甲酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸，获得Ac或Bz保护形式的试剂(例如2,3,4-三乙酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸等，由用Ac2O处理形成)。所述试剂在从树脂酸裂解期间的稳定性增加，且在检测到脱除保护基期间的不稳定性时加以使用，参见(奇赫博格，J.等人，(1997)酶学方法289：221-245)和其中的参考文献。最终脱除所述产物的保护基通过在裂解之后如上文所描述使用MeOH/NH3、MeOH/NaOMe、MeOH/NH2NH2进行碱催化酯基转移来实现。
实例2：合成肽类似物
一般说来，肽合成方法包括将被保护的氨基酸依序添加到生长肽链中。通常，对第一氨基酸和任何反应性侧链基团的氨基或羧基加以保护。接着将这一被保护的氨基酸连接到惰性固体载体或用于溶液中，且在适合形成酰胺键联的条件下添加序列中的下一个还被适当保护的氨基酸。在将所有所要的氨基酸以适当序次连接之后，去除保护基和任何固体载体得到粗肽。将肽脱盐且用色谱纯化。
制备氨基酸少于约五十个的生理学活性截短肽的类似物的优选方法包括固相肽合成。在这种方法中，α-氨基(Nα)官能团和任何反应性侧链用酸或碱敏感基团加以保护。保护基应为对于肽键联形成条件稳定，同时容易在不影响现存肽链的情况下去除。适合α-氨基保护基包括(但不限于)叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)、邻氯苯甲氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、异冰片基氧羰基、α，α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、邻硝基苯次磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)等，优选为Boc或更优选为Fmoc。适合侧链保护基包括(但不限于)：乙酰基、苯甲基(Bzl)、苯甲氧基甲基(Bom)、Boc、叔丁基、邻溴苯甲氧羰基、叔丁基、叔丁基二甲基硅烷基、2-氯苯甲基(Cl-z)、2,6-二氯苯甲基、环己基、环戊基、异丙基、新戊酰、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三甲基硅烷基和三苯甲基。合成化合物的优选Nα-保护基为Fmoc基团。优选侧链保护基为Glu、Tyr、Thr、Asp和Ser的O-叔丁基；Lys和Trp侧链的Boc基团；Arg的Pbf基团；Asn、Gin和His的Trt基团。对于Lys残基的选择性改性，用不会由裂解基于Fmoc或叔丁基的保护基的试剂去除的保护基正交保护为优选。Lys侧链改性的优选实例包括(但不限于)通过肼而非哌啶去除的改性；例如1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)或1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)和烯丙氧羰基(Alloc)。
在需要形成侧链内酰胺的情况下，Fmoc-Lys(ivDde)或Fmoc-Lys(Dde)保护基流程为优选(休斯敦(Houston)，M.E.，Jr.等人，(1995)肽科学杂志1：274-282；米拉吉，E.N.等人，(2010)药物化学杂志)，因为在这种情况下可将Fmoc-Glu(O-Allyl)和Fmoc-Lys(Alloc)并入且用以提供暂时保护，接着脱除保护基形成内酰胺，同时剩余Lys(Dde)保护基随后进行去除且与官能化表面活性剂反应。
在固相合成中，首先将C端氨基酸连接到适合树脂载体。适合树脂载体为那些对于逐步缩合和脱除保护基反应的试剂和反应条件为惰性以及不可溶于所用介质中的物质。可购得的树脂的实例包括用以下反应性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂：例如氯甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。对于肽酸的制备，苯甲基化羟甲基化苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂为优选。当化合物的C端为酰胺时，优选树脂为对甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二乙烯基-苯)树脂、基于2,4二甲氧基二苯甲基氨基的树脂(“林克酰胺(Rink amide)”)等。合成较大肽的尤其优选载体为可购得的含有接枝到其它聚合基质上的PEG序列的树脂，如林克酰胺-PEG和PAL-PEG-PS树脂(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))或设计用于使用Fmoc方案合成肽酰胺的类似树脂。因此，在某些情况下，需要具有与PEG链的酰胺键联。在那些情况下，宜将N-Fmoc-氨基-PEG-羧酸连接到上述形成酰胺的树脂(例如林克酰胺树脂等)。链的第一氨基酸可与PEG链的氨基官能团偶合成N-Fmoc-氨基酸。最终脱除保护基将产生所要肽-NH-PEG-CO-NH2产物。
与PAM树脂的连接可通过在例如约40℃与60℃之间、优选约50℃的高温下使Nα保护的氨基酸(例如Boc-氨基酸)(呈其于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的铵、铯、三乙基铵、1，5-二氮杂双环-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基铵或类似盐形式，优选于DMF中的铯盐)与树脂反应约12到72小时、优选约48小时来实现。由此将最终在酸裂解之后产生肽酸产物或在氨解之后产生酰胺。
可在约10℃与50℃之间、优选25℃的温度下，在如CH2Cl2或DMF、优选CH2Cl2的溶剂中借助于例如N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)介导的偶合约2到约24小时、优选约2小时将Nα-Boc-氨基酸连接到二苯甲基胺树脂。
对于基于Boc的方案，可用在所属领域熟知的方法，通常在自动肽合成器中连续偶合被保护的氨基酸。在用三乙胺、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)、三甲基吡啶或类似碱中和之后，引入约1.5到2.5倍摩尔过量的每一被保护的氨基酸，且在环境温度下在如CH2Cl2、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)或其混合物的惰性非水性极性溶剂中、优选在二氯甲烷中进行偶合。对于基于Fmoc的方案，不使用酸脱除保护基，但通常将碱、优选DIEA或NMM并入偶合混合物中。通常在DMF、NMP、DMA或混合溶剂、优选DMF中进行偶合。代表性偶合剂为单独或在HOBt、O-酰基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)鏻(PyBop)、N-羟基丁二酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟存在下的N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基-碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺。或者，可使用被保护的氨基酸活性酯(例如对硝基苯基、五氟苯基等)或对称酸酐。优选偶合剂为铵/脲盐(供应商所用的替代命名)类，如六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HBTU)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲盐(HATU)、六氟磷酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HCTU)等。
Fmoc-PAL-PEG-PS树脂的优选连接方法可通过用含20％哌啶的DMF使树脂连接子脱除保护基，随后为如下N-α-Fmoc保护的氨基酸的反应(约5倍摩尔过量的N-α-Fmoc-氨基酸，在微波辅助的肽合成器中使用含HBTU：二异丙基乙胺(DIEA)(1∶2)的DMF，及5分钟、最大75℃的偶合循环)来实现。
对于这个微波辅助肽合成器中的基于Fmoc的方案，用含20％哌啶的DMF(含有0.1M1-羟基苯并三唑(HOBt))去除N-α-Fmoc氨基酸保护基，在双重脱除保护基方案中历时30秒，且接着在设定为75℃的最高温度下历时3分钟。将HOBt添加到脱除保护基溶液中以减少天冬酰亚胺形成。下一个氨基酸的偶合接着采用五倍摩尔过量，使用HBTU∶DIEA(1∶2)，及5分钟、最大75℃的双重偶合循环。
在固相合成结束时，从树脂去除充分保护的肽。当与树脂载体键联为苯甲酯类型时，裂解可借助于在约-10℃与50℃之间、优选约25℃的温度下对于具有烷基酰胺C端的肽用烷基胺或氟烷基胺氨解，或对于具有未被取代的酰胺C端的肽用例如氨水/甲醇或氨水/乙醇氨解约12与24小时之间、优选约18小时来实现。具有羟基C端的肽可通过HF或其它强酸性脱除保护基方案或通过皂化来裂解。或者，可通过酯基转移(例如用甲醇)，随后氨解或皂化从树脂去除肽。被保护的肽可通过硅胶或反相HPLC纯化。
侧链保护基可如下从肽去除：在苯甲醚或其它碳正离子清除剂存在下用例如无水液体氟化氢处理氨解产物，用氟化氢/吡啶复合物处理、用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸处理，通过在约-10℃与+10℃之间，优选约0℃的温度下用氢气和钯/碳或聚乙烯吡咯烷酮还原，或通过用含钠的液体氨、优选用液体氟化氢和苯甲醚还原约15分钟与2小时之间、优选约1.5小时。
对于二苯甲基胺型树脂上的肽，树脂裂解和脱除保护基步骤利用如上文所描述的液体氟化氢和苯甲醚或优选通过使用温和裂解混合液可合併于单个步骤中。举例来说，对于PAL-PEG-PS树脂，优选方法通过在微波辅助肽合成器中每次均在38℃下使用一种在所属领域已知的温和裂解混合液(如TFA/水/三异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)(92.5/2.5/2.5/2.5)使用双重脱除保护基方案18分钟来实现。含有烷基糖苷的物质的裂解显示使用TFA/水比率在9/1到19/1范围内的方案存在烷基糖苷键联。典型混合液为94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS。通常，将充分脱除保护基的产物沉淀且用冷(-70℃到4℃)二乙醚洗涤，溶解于去离子水中且冻干。
可将肽溶液脱盐(例如用BioRad阴离子交换树脂)且通过一系列采用任何或所有以下类型的色谱步骤使对肽进行纯化：经乙酸酯形式的弱碱性树脂的离子交换；经未衍生化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的疏水性吸附色谱，例如XAD；硅胶吸附色谱；经羧甲基纤维素的离子交换色谱；例如经G-25的分配色谱；反流分布；超临界流体色谱；或HPLC，尤其经结合辛基或十八烷基硅烷基二氧化硅(ODS)的相管柱填充物的反相HPLC。
本文还提供制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体，和纯化产物，得到生理学活性的截短同源物的类似物和本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的类似物。在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质并入有如上文所定义的烷基糖苷改性。
另一方面涉及制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含使用基于微波辅助的固相合成的方法或标准肽合成方案以将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体和纯化产物，得到如上文所定义的生理学活性肽的类似物。
实例3：N端内吗啡肽-1类似物-AcLys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)内吗啡肽1(Ac-Lys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2(AcLys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)内吗啡肽1)
如上文所描述，如(幸田，Y.等人，(2008)生物有机化学与医药化学16：6286-6296)中所描述制备Fmoc-Tyr(t-Bu)-Pro-Trp(Boc)-Phe-NH-林克酰胺MBHA树脂。树脂用哌啶/DMF溶液进行Nα-脱除保护基，用溶剂洗涤且使用标准偶合混合物(例如HBTU/DIPEA)与2当量N-α-Ac,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸偶合。偶合完成之后，使用脱除保护基混合物(95％TFA/5％H2O或DODT)使肽脱除保护基且从树脂裂解。通过氮气流去除溶剂，且用冷Et2O使粗肽沉淀，收集，溶解于20％乙腈中且冻干。通过在含有H2O到H2O/乙腈梯度(使用0.1％TFA或NH4OAc缓冲系统)的移动相中的反相hplc进行纯化。使混合物经历多次从H2O冻干。
实例4：N端内吗啡肽-1类似物-AcLys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)内吗啡肽1(Ac-Lys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2(AcLys(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)内吗啡肽1)
如上文所描述，如所描述制备Ac-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Pro-Trp(Boc)-Phe-NH-林克酰胺MBHA树脂。合成完成之后，使用脱除保护基混合物(95％TFA/5％H2O或DODT)使肽脱除保护基且从树脂裂解。通过氮气流去除溶剂，且用冷Et2O使粗肽沉淀，收集，溶解于20％乙腈中且冻干。在DMF或类似无水非质子性溶剂中使用标准偶合混合物(例如HBTU/DIPEA)使含有脱除保护基的Lysε-氨基官能团的肽与2当量1-辛基β-D-葡糖醛酸偶合。真空去除溶剂且从20％乙腈或H2O冻干产物。通过在含有H2O到H2O/乙腈梯度(使用0.1％TFA或NH4OAc缓冲系统)的移动相中的反相hplc进行纯化。使混合物经历多次从H2O冻干。
实例5：2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-脯氨酰基-2′，4′，6′-三甲基-L-苯丙氨酰基-N ε-(1′-辛基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸酰胺(EU-A102).
使用标准DIC/HOBt固相偶合方案(3当量DIC/HOBt和氨基酸)使0.3mmol Fmoc-林克-酰胺树脂样本(0.5mmol/g)与以下一系列氨基酸偶合：Fmoc-L-赖氨酸(Nε-Alloc)；Fmoc-2′，4′，6′-三甲基-L-苯丙氨酸；Fmoc-L-脯氨酸；Fmoc-2′，4′-二甲基-L-酪氨酸。
通过在黑暗中在室温下用含Pd(PPh3)4(0.5eq)和DMBA(20eq)的DMF/CH2Cl2(1∶1)培育过夜使2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-脯氨酰基-2′，4′，6′-三甲基-L-苯丙氨酰基-Nε-(Alloc)-L-赖氨酸酰胺树脂的样本在Lys-Nε位置脱除保护基。在用DMF/CH2Cl2洗涤之后，通过使用DIC/HOBt用含1′-辛基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯)的DMF/CH2Cl2将Lys侧链酰化。通过茚三酮检查偶合完成，且用CH2Cl2全面洗涤产物。
使产物树脂(0.77g)经受最终脱除保护基且在室温下通过用裂解混合液(94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS)处理240分钟时间而从树脂裂解。用Et2O处理混合物使产物沉淀且用Et2O全面洗涤，在真空干燥之后产生290mg粗标题肽产物。
分两批通过反相(C18)hplc进行纯化。将粗肽装载于流速为15mL/min(15％有机改性剂；乙酸缓冲液)的4.1×25cm hplc管柱上且在50℃下用60分钟内15-45％缓冲液B梯度进行洗脱。将产物份冻干，产生100mg标题产物肽，通过分析性hplc/质谱分析(M+1峰＝911.87)得到纯度＞96％。总合成产率经过计算为18％。
以类似方式，但使用试剂1′-甲基β-D-葡糖醛酸和1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸，制备标题化合物的相应Nε-(1′-甲基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸4(EU-A101)和Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸4(EUA-103)类似物。
通过使用下表提供的洗脱剂梯度的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置4Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min洗脱)
EU-A101 Me 812.95 812.80 13.6[a]
EU-A102 正辛基 911.16 910.87 12.9[b]
EU-A103 正十二烷基 967.27 966.53 12.5[c]
在0.1％TFA中的HPLC梯度[a.]30分钟内20到50％CH3CN
[b.]30分钟内35到65％CH3CN、[c.]20分钟内40到75％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例6：2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-脯氨酰基-2′，4′，6′-三甲基-L-苯丙氨酰基- L-苯丙氨酰基-Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸酰胺(EU-A106).
以与上文提供的实例5中的固相合成和赖氨酸侧链改性所提供类似的方式，但使用1-十二烷基β-D-葡糖醛酸(米尔克赖特，G.等人，(2004)化学物理脂质127：47-63)进行赖氨酸Nε-酰化，制备呈粗产物的标题肽。在如上反相hplc纯化之后，获得呈白色粉末状的标题产物，通过hplc/质谱分析(M+1＝1114.8)得到纯度为96.1％。
以类似方式，但使用试剂1′-甲基β-D-葡糖醛酸，制备标题化合物的相应Nε-(1′-甲基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸5(EUA-105)类似物。
通过使用下表提供的梯度洗脱剂的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置5Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min洗脱)
EU-A105 Me 960.12 959.60 8.8[d]
EU-A106 正十二烷基 1114.44 1113.80 11.6[e]
在0.1％TFA中的HPLC梯度[d.]20分钟内30到60％CH3CN
[e.]20分钟内45到75％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例7：2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-D-赖氨酰 基-2′，4′，6′-三甲基-L-苯丙氨酰基-L-苯丙氨酸-酰胺(EU-A108).
以与实例6中所提供类似的方式，制备呈白色粉末状的标题肽，通过hplc/质谱分析(M＝1017.07)得到纯度为95.8％。
以类似方式，但使用试剂1′-甲基β-D-葡糖醛酸，制备标题化合物的相应Nε-(1′-甲基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸(EU-A107)类似物。
通过使用下表提供的洗脱剂梯度的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置2Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min洗脱)
EU-A107 Me 862.01 862.73 11.6[f]
EU-A108 正十二烷基 1017.32 1017.07 11.9[g]
在0.1％TFA中的HPLC梯度[f.]20分钟内25到55％CH3CN
[g.]20分钟内50到80％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例8：2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-L-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羰基-L-苯丙氨酰 基-Nε-(1′-甲基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酰基-酰胺(EU-A178).
以与实例6中所提供类似的方式，制备呈白色粉末状的标题肽，通过hplc/质谱分析(M＝832.33)得到纯度为95.5％。
以类似方式，但使用试剂1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸，制备标题化合物的相应Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸类似物(EU-A179)。以类似方式，但使用相应1-烷基葡糖醛酸试剂，制造相应本发明肽、EU-A180、EU-A181、EU-A182、EU-A183、EU-A184、EU-A185等。
通过使用下表提供的洗脱剂梯度的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置4Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min洗脱)
EU-A178 Me 832.91 832.33 11.2[h]
EU-A179 正十二烷基 987.23 986.47 10.7[f]
EU-A180 正辛基 931.12 930.67 10.1[i]
在0.1％TFA中的HPLC梯度为[f.]20分钟内25到55％CH3CN
[h.]20分钟内20到50％CH3CN[i.]20分钟内35到65％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例9：2′，6′-二甲基-L-酪氨酰基-L-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羰基-L-苯丙氨酰 基-L-苯丙氨酰基-Nε-(1′-甲基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酰基-酰胺(EU-A189).
以与实例6中所提供类似的方式，制备呈白色粉末状的标题肽，通过hplc/质谱分析(M＝979.53)得到纯度为98.99％。
以类似方式，但使用试剂1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸，制备标题化合物的相应Nε-(1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-L-赖氨酸(EU-A190)类似物。
通过使用下表提供的梯度洗脱剂的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置5Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min洗脱)
EU-A189 Me 980.09 979.53 10.9[e]
EU-A190 正十二烷基 1134.41 1134.53 12.5[e]
在0.1％TFA中的HPLC梯度[e.]20分钟内45到75％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例10：其它本发明类似物.
以与实例6中所提供类似的方式，但使用相应1-烷基β-D-葡糖醛酸试剂制备呈白色粉末状的其它本发明肽，通过hplc/质谱分析得到纯度大于95％。
通过使用适当洗脱剂梯度(如下表提供的洗脱剂梯度)的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 位置3或4Nε 预期分子量 实验分子量 HPLC(min；洗脱)
EU-A600 Me 918.02 918.00 10.7[h]
EU-A601 正辛基 1016.23 1015.87 10.1[i]
EU-A615 Me 832.91 832.67 11.0[h]
EU-A620 Me 923.06 922.73 9.5[d]
EU-A639 Me 923.06 922.80 11.5[f]
在0.1％TFA中的HPLC梯度[d.]20分钟内30到60％CH3CN
[e.]20分钟内45到75％CH3CN[h.]20分钟内20到50％CH3CN
[f.]20分钟内25到55％CH3CN[i.]20分钟内35到65％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC
实例11.糖醛酸的通用氧化方法
向1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(卡博森斯)[2.0g，5.74mmol]于20mL乙腈和20mLDI水中的溶液中添加(二乙酰氧碘基)苯(佛鲁卡(Fluka))[4.4g，13.7mmol]和TEMPO(阿德里奇化学(SigmaAldrich))[0.180g，1.15mmol]。在室温下搅拌所得混合物20小时。用水稀释反应混合物且冻干至干燥，得到1.52g(粗产率73.1％)呈白色粉末状的粗产物1-十二烷基β-D-葡糖醛酸，其未经进一步纯化即直接用于固相合成。以类似方式，但使用相应1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(购自阿那曲斯，茂米城，俄亥俄州)，制备用于制造本文所描述的产物和试剂的所要烷基糖糖醛酸。这种产物先前通过替代方法使用NaOCl作为氧化剂来制备且还可用于较长烷基。
实例12：化合物的细胞分析.
精确称重约2mg量的化合物且通过合同研究组织西瑞普公司(Cerep Inc.)(铂尔曼(Pullman)，华盛顿(WA))用如在其子公司西瑞普SA(勒布瓦勒维克(Le Bois l'Eveque)，法国(France))所实行的标准细胞分析进行分析。读数为用促效剂或拈抗剂模式的测试化合物处理的细胞中所产生的cAMP的量。所用分析为μ类鸦片受体细胞分析(促效剂和拈抗剂模式的MOP)、δ2类鸦片受体细胞分析(促效剂和拈抗剂模式的DOP)和κ类鸦片受体细胞分析(促效剂和拈抗剂模式的KOP)。所用分析描述于王(Wang)，J.B.等人，(1994)欧州生物化学会通讯(FEBS Lett)338：217-222，刘(Law)，P.Y.和罗(Loh)，H.H.(1993)分子药理学(MolPharmacol)43：684-693和阿维多尔-瑞斯(Avidor-Reiss)，T.等人，(1995)欧州生物化学会通讯361：70-74中。DOR拈抗剂分析中细胞的刺激物为3x10E-8M DPDPE，一种被充分接受DOR文献标准物。
对于一系列化合物EU-A101到EU-A103，表面活性剂的疏水性部分(1-烷基葡糖醛酸)的长度从C1变化到C12，受体选择性和活化(参见下文)的特征从全促效剂(C1)变化到纯拈抗剂(C12)。在用于DOP或KOP分析的细胞中未见活性，因此显示对于作为促效剂的μ类鸦片受体具有全选择性。这种行为展示本文所描述的改性对于改变受体相互作用的基本特性的能力。分子其它地方的改性(例如使用氨基酸类似物)用以进一步改变药物候选者的相互作用的效能和特征。
化合物名称 结构 MOP促效剂EC50(nM) MOP拮抗剂IC50(nM) 表征
EU-A101 Me 13 nc 纯促效剂
EU-A102 正辛基 100 100 部分促效剂
EU-A103 正十二烷基 nc 86 纯拈抗剂
EU-A107 Me 60 nc 促效剂
通过抑制3×10E-8M DPDPE的刺激cAMP反应评估DOP拈抗活性。
§指示溶解期间的溶解性问题，NT的意思是未测试，nc的意思是不可计算
实例13：化合物的用途
本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质视所考虑的疾病类别而定适用于预防和治疗许多疾病。举例来说，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质适用于慢性和急性疼痛和其它MOR或DOR相关疾病病况的预防和治疗性治疗。也已记录对晒伤、瘙痒、癌症、免疫功能、发炎、心血管疾病的应用(拉扎勒斯(Lazarus)，L.H.等人，(2012)治疗术专利专家评论22：1-14)。
代表性递送方案包括经口、不经肠(包括皮下、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、经颊(包括舌下)、经皮、吸入、眼部和鼻内递方送案。引人注目且广泛使用的肽递送方法需要皮下注射控制释放的可注射调配物。施用本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的其它投药途径为皮下、鼻内和吸入投药。
实例14.治疗疼痛的医药用量.
用EU-A178通过由所属领域所用的标准雾化器鼻内投予(200μL)含有0.5到10mg/mL医药剂且含有标准赋形剂(如苯甲醇)的医药剂于生理盐水中的溶液来治疗患有急性或慢性疼痛的人类患者。视疼痛缓减所需要重复进行治疗。或者，视减轻疼痛所需要，通过MDI鼻内投予EU-A178和所选赋形剂于含有如氢氟烷烃的蒸发溶剂中的溶液。或者，视减轻疼痛所需要，通过皮下注射投予EU-A178和所选赋形剂的水溶液。
从对患者的评估(包括生活质量问卷)来确定治疗效果。疼痛量表是基于自身报告、观察(行为)或生理数据。一些适用于临床环境的疼痛量表包括阿尔德海伊(Alder Hey)验伤疼痛评分、简明疼痛调查表(BPI)、达拉斯(Dallas)疼痛问卷、测痛计疼痛指数(DPI)、麦吉尔(McGill)疼痛问卷(MPQ)、数字11点方框(BS-11)、数字评定量表(NRS-11)、罗兰-莫里斯(Roland-Morris)背痛问卷、视觉模拟量表(VAS)等。
以类似方式，测试通过经颊、阴道内、吸入、皮下、静脉内、眼内或经口途径投予的调节量以确定疼痛的减轻。
实例2-1：试剂-N-α-Fmoc，N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸
在烘干的250mL锥形瓶中放置1-辛基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯有限公司(Carbosynth Ltd.)，3.06g，10mmol)、50mL无水DMF和无水1-羟基苯并三唑(1.62g，12mmol)。伴随搅拌添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(2.48g，12mmol)于50mL DMF中的冷却(4℃)溶液，且使反应进行5分钟。经烧结玻璃漏斗过滤丰富的N，N′-二环己脲的白色沉淀物且将滤液添加到N-α-Fmoc-L-赖氨酸(3.68g，10mmol)于25ml无水DMF中的溶液中。使反应进行25分钟，同时升温到室温或直至茚三酮颜色极其淡。过滤反应混合物，汽提至干燥且通过溶解于MeOH中从MeOH/Et2O结晶，且用Et2O缓慢稀释到混浊点，随后冷冻。可通过使用EtOAc到EtOAc/EtOH/AcOH的溶剂梯度的硅胶色谱法实现进一步纯化。
以类似方式，但用N-α-Boc-L-赖氨酸取代，获得适用于N端并入且裂解成游离N端的N-α-Boc,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用N-α-Ac-L-赖氨酸取代，获得适用于在N端并入N端被阻断的肽的N-α-Ac,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用适量N-α-Fmoc-L-鸟氨酸取代，获得N-α-Fmoc,N-δ-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-鸟氨酸。以类似方式，但用其它N-单保护二氨基酸取代，获得相应试剂。或者，在偶合期间使用暂时Me3Si酯保护基并且不预先活化1-辛基β-D-葡糖醛酸提供形成试剂的容易途径。暂时Me3Si酯通过在二氯甲烷(CH2Cl2)中使Fmoc-Lys-OH与等摩尔量的N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺的反应产生。有机层含有如上准备与1-烷基葡糖苷酸偶合的呈于CH2Cl2中的溶液形式的所要试剂。用NaHSO4水溶液洗涤过滤的反应混合物以水解Me3Si酯，经MgSO4干燥且去除溶剂。
类似地，但使用全乙酰基或全苯甲酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸，获得Ac或Bz保护形式的试剂(例如2,3,4-三乙酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸等，由用Ac2O处理形成)。所述试剂在从树脂酸裂解期间的稳定性增加，且在检测到脱除保护基期间的不稳定性时加以使用，参见(奇赫博格，J.等人，(1997)酶学方法289：221-245)和其中的参考文献。最终脱除所述产物的保护基通过在裂解之后如上文所描述使用MeOH/NH3、MeOH/NaOMe、MeOH/NH2NH2进行碱催化酯基转移来实现。
实例2-2：合成肽类似物
一般说来，肽合成方法包括将被保护的氨基酸依序添加到生长肽链中。通常，对第一氨基酸和任何反应性侧链基团的氨基或羧基加以保护。接着将这一被保护的氨基酸连接到惰性固体载体或用于溶液中，且在适合形成酰胺键联的条件下添加序列中的下一个还被适当保护的氨基酸。在将所有所要的氨基酸以适当序次连接之后，去除保护基和任何固体载体得到粗肽。将肽脱盐且用色谱纯化。
制备氨基酸少于约五十个的生理学活性截短肽的类似物的优选方法包括固相肽合成。在这种方法中，α-氨基(Nα)官能团和任何反应性侧链用酸或碱敏感基团加以保护。保护基应为对于肽键联形成条件稳定，同时容易在不影响现存肽链的情况下去除。适合α-氨基保护基包括(但不限于)叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)、邻氯苯甲氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、异冰片基氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、邻硝基苯次磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)等，优选为Boc或更优选为Fmoc。适合侧链保护基包括(但不限于)：乙酰基、苯甲基(Bzl)、苯甲氧基甲基(Bom)、Boc、叔丁基、邻溴苯甲氧羰基、叔丁基、叔丁基二甲基硅烷基、2-氯苯甲基(Cl-z)、2,6-二氯苯甲基、环己基、环戊基、异丙基、新戊酰、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三甲基硅烷基和三苯甲基。合成化合物的优选Nα-保护基为Fmoc基团。优选侧链保护基为Glu、Tyr、Thr、Asp和Ser的O-叔丁基；Lys和Trp侧链的Boc基团；Arg的Pbf基团；Asn、Gln和His的Trt基团。对于Lys残基的选择性改性，用不会由裂解基于Fmoc或叔丁基的保护基的试剂去除的保护基正交保护为优选。Lys侧链改性的优选实例包括(但不限于)通过肼而非哌啶去除的改性；例如1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)或1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)和烯丙氧羰基(Alloc)。
在需要形成侧链内酰胺的情况下，Fmoc-Lys(ivDde)或Fmoc-Lys(Dde)保护基流程为优选(休斯敦(Houston)，M.E.，Jr.等人，(1995)肽科学杂志1：274-282；米拉吉，E.N.等人，(2010)药物化学杂志)，因为在这种情况下可将Fmoc-Glu(O-Allyl)和Fmoc-Lys(Alloc)并入且用以提供暂时保护，接着脱除保护基形成内酰胺，同时剩余Lys(Dde)保护基随后进行去除且与官能化表面活性剂反应。
在固相合成中，首先将C端氨基酸连接到适合树脂载体。适合树脂载体为那些对于逐步缩合和脱除保护基反应的试剂和反应条件为惰性以及不可溶于所用介质中的物质。可购得的树脂的实例包括用以下反应性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂：例如氯甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。对于肽酸的制备，苯甲基化羟甲基化苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂为优选。当化合物的C端为酰胺时，优选树脂为对甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二乙烯基-苯)树脂、基于2,4二甲氧基二苯甲基氨基的树脂(“林克酰胺(Rink amide)”)等。合成较大肽的尤其优选载体为可购得的含有接枝到其它聚合基质上的PEG序列的树脂，如林克酰胺-PEG和PAL-PEG-PS树脂(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))或设计用于使用Fmoc方案合成肽酰胺的类似树脂。因此，在某些情况下，需要具有与PEG链的酰胺键联。在那些情况下，宜将N-Fmoc-氨基-PEG-羧酸连接到上述形成酰胺的树脂(例如林克酰胺树脂等)。链的第一氨基酸可与PEG链的氨基官能团偶合成N-Fmoc-氨基酸。最终脱除保护基将产生所要肽-NH-PEG-CO-NH2产物。
与PAM树脂的连接可通过在例如约40℃与60℃之间、优选约50℃的高温下使Nα保护的氨基酸(例如Boc-氨基酸)(呈其于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的铵、铯、三乙基铵、1，5-二氮杂双环-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基铵或类似盐形式，优选于DMF中的铯盐)与树脂反应约12到72小时、优选约48小时来实现。由此将最终在酸裂解之后产生肽酸产物或在氨解之后产生酰胺。
可在约10℃与50℃之间、优选25℃的温度下，在如CH2Cl2或DMF、优选CH2Cl2的溶剂中借助于例如N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)介导的偶合约2到约24小时、优选约2小时将Nα-Boc-氨基酸连接到二苯甲基胺树脂。
对于基于Boc的方案，可用在所属领域熟知的方法，通常在自动肽合成器中连续偶合被保护的氨基酸。在用三乙胺、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)、三甲基吡啶或类似碱中和之后，引入约1.5到2.5倍摩尔过量的每一被保护的氨基酸，且在环境温度下在如CH2Cl2、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)或其混合物的惰性非水性极性溶剂中、优选在二氯甲烷中进行偶合。对于基于Fmoc的方案，不使用酸脱除保护基，但通常将碱、优选DIEA或NMM并入偶合混合物中。通常在DMF、NMP、DMA或混合溶剂、优选DMF中进行偶合。代表性偶合剂为单独或在HOBt、O-酰基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)鏻(PyBop)、N-羟基丁二酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟存在下的N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基-碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺。或者，可使用被保护的氨基酸活性酯(例如对硝基苯基、五氟苯基等)或对称酸酐。优选偶合剂为铵/脲盐(供应商所用的替代命名)类，如六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HBTU)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲盐(HATU)、六氟磷酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HCTU)等。
Fmoc-PAL-PEG-PS树脂的优选连接方法可通过用含20％哌啶的DMF使树脂连接子脱除保护基，随后为如下N-α-Fmoc保护的氨基酸的反应(约5倍摩尔过量的N-α-Fmoc-氨基酸，在微波辅助的肽合成器中使用含HBTU：二异丙基乙胺(DIEA)(1∶2)的DMF，及5分钟、最大75℃的偶合循环)来实现。
对于这个微波辅助肽合成器中的基于Fmoc的方案，用含20％哌啶的DMF(含有0.1M1-羟基苯并三唑(HOBt))去除N-α-Fmoc氨基酸保护基，在双重脱除保护基方案中历时30秒，且接着在设定为75℃的最高温度下历时3分钟。将HOBt添加到脱除保护基溶液中以减少天冬酰亚胺形成。下一个氨基酸的偶合接着采用五倍摩尔过量，使用HBTU∶DIEA(1∶2)，及5分钟、最大75℃的双重偶合循环。
在固相合成结束时，从树脂去除充分保护的肽。当与树脂载体键联为苯甲酯类型时，裂解可借助于在约-10℃与50℃之间、优选约25℃的温度下对于具有烷基酰胺C端的肽用烷基胺或氟烷基胺氨解，或对于具有未被取代的酰胺C端的肽用例如氨水/甲醇或氨水/乙醇氨解约12与24小时之间、优选约18小时来实现。具有羟基C端的肽可通过HF或其它强酸性脱除保护基方案或通过皂化来裂解。或者，可通过酯基转移(例如用甲醇)，随后氨解或皂化从树脂去除肽。被保护的肽可通过硅胶或反相HPLC纯化。
侧链保护基可如下从肽去除：在苯甲醚或其它碳正离子清除剂存在下用例如无水液体氟化氢处理氨解产物，用氟化氢/吡啶复合物处理、用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸处理，通过在约-10℃与+10℃之间，优选约0℃的温度下用氢气和钯/碳或聚乙烯吡咯烷酮还原，或通过用含钠的液体氨、优选用液体氟化氢和苯甲醚还原约15分钟与2小时之间、优选约1.5小时。
对于二苯甲基胺型树脂上的肽，树脂裂解和脱除保护基步骤利用如上文所描述的液体氟化氢和苯甲醚或优选通过使用温和裂解混合液可合併于单个步骤中。举例来说，对于PAL-PEG-PS树脂，优选方法通过在微波辅助肽合成器中每次均在38℃下使用一种在所属领域已知的温和裂解混合液(如TFA/水/三异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)(92.5/2.5/2.5/2.5)使用双重脱除保护基方案18分钟来实现。含有烷基糖苷的物质的裂解显示使用TFA/水比率在9/1到19/1范围内的方案存在烷基糖苷键联。典型混合液为94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS。通常，将充分脱除保护基的产物沉淀且用冷(-70℃到4℃)Et2O洗涤，溶解于去离子水中且冻干。
可将肽溶液脱盐(例如用BioRad阴离子交换树脂)且通过一系列采用任何或所有以下类型的色谱步骤使对肽进行纯化：经乙酸酯形式的弱碱性树脂的离子交换；经未衍生化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的疏水性吸附色谱，例如XAD；硅胶吸附色谱；经羧甲基纤维素的离子交换色谱；例如经G-25的分配色谱；反流分布；超临界流体色谱；或HPLC，尤其经结合辛基或十八烷基硅烷基二氧化硅(ODS)的相管柱填充物的反相HPLC。
本文还提供制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体，和纯化产物，得到生理学活性的截短同源物的类似物和本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的类似物。在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质并入有如上文所定义的烷基糖苷改性。
另一方面涉及制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含使用基于微波辅助的固相合成的方法或标准肽合成方案以将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体和纯化产物，得到如上文所定义的生理学活性肽的类似物。
实例2-3.糖醛酸的通用氧化方法
向1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(卡博森斯)[2.0g，5.74mmol]于20mL乙腈和20mLDI水中的溶液中添加(二乙酰氧碘基)苯(佛鲁卡)[4.4g，13.7mmol]和TEMPO(阿德里奇化学)[0.180g，1.15mmol]。在室温下搅拌所得混合物20小时。用水稀释反应混合物且冻干至干燥，得到1.52g(粗产率73.1％)呈白色粉末状的粗产物1-十二烷基β-D-葡糖醛酸，其未经进一步纯化即直接用于固相合成。这种产物先前如说明书中所描述通过替代方法使用NaOCl作为氧化剂来制备，且还可用于较长烷基。以类似方式，但使用相应1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(购自阿那曲斯，茂米城，俄亥俄州)，制备用于制造本文所描述的产物和试剂的所要烷基糖糖醛酸。
实例2-4：制备PTHrP类似物EU-204.
通过在黑暗中在室温下用含Pd(PPh3)4(0.5eq)和DMBA(20eq)的DMF/CH2Cl2(1∶1)培育过夜使Fmoc-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Arg-Ala-Arg-Trp-Ile-Gln-Lys(Alloc)-林克酰胺树脂的样本在Lys-N-ε位置脱除保护基。在用DMF/CH2Cl2洗涤之后，通过使用DIC/HOBt用含1′-辛基十二烷基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯)的DMF/CH2Cl2将Lys侧链酰化。通过茚三酮检查偶合完成，且用CH2Cl2全面洗涤产物。
使产物树脂经受最终脱除保护基且在室温下通过用裂解混合液(94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS)处理240分钟时间而从树脂裂解。用Et2O处理混合物使产物沉淀且用Et2O全面洗涤，在真空干燥之后产生粗标题肽产物。
分两批通过反相(C18)hplc进行纯化。将粗肽装载于流速为15mL/min(15％有机改性剂；乙酸缓冲液)的4.1×25cm hplc管柱上且在50℃下用60分钟内15-45％缓冲液B梯度进行洗脱。将产物份冻干，产生标题产物肽，通过分析性hplc(12.0分钟；含35-65％CH3CN的0.1％TFA)/质谱分析(M+1峰＝2473.9)得到纯度＞97％。
使用如上文所描述制备的相应葡糖醛酸来制备相应1-甲基、1-辛基、1-癸基、1-十二烷基、1-十四烷基、1-十六烷基、1-十八烷基和1-二十烷基类似物。或者，1-烷基葡糖醛酸基或其它糖醛酰化类似物可通过脱除保护基或部分脱除保护基的肽的初始纯化，随后通过所要糖醛酸试剂酰化来制备。
通过阳离子模式的HPLC/质谱分析使用下表提供的梯度洗脱剂进行分析。
化合物名称 预期分子量 实验分子量 HPLC(min；洗脱)
EU-201 2278.63 2278.14 14.1[a]
EU-202 2376.86 2376.80 11.2[b]
EU-203 2432.97 2432.40 14.1[c]
EU-204 2472.00 2471.86 12.0[d]
EU-205 2343.87 2344.26 8.0[e]
EU-207 2557.12 2557.06 13.2[c]
EU-232 2642.23 2642.14 12.6[c]
EU-251 2941.56 2942.26 13.1[c]
EU-260 2967.61 2966.66 13.9[c]
EU-283 2881.47 2882.26 11.0[c]
EU-284 3640.39 3640.00 11.9[c]
EU-286 2670.47 2669.86 6.3[e]
EU-287 2698.47 2697.74 8.4[e]
EU-288 2726.47 2726.26 10.9[f]
HPLC梯度为在0.1％TFA中的
[a.]30分钟内20到50％CH3CN
[b.]20分钟内25到55％CH3CN
[c.]20分钟内30到60％CH3CN
[d.]20分钟内35到65％CH3CN
[e.]20分钟内40到70％CH3CN
[f.]20分钟内45到75％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC。
实例2-5：化合物的细胞分析.
精确称重量为约1mg的化合物且用标准细胞分析(西瑞普SA)进行分析。读数为用促效剂或拈抗剂模式的测试化合物处理的细胞中所产生的cAMP的量。所用的PTH1细胞分析描述于奥尔洛夫马(Orloff)，J.J.等人，(1992)内分泌学学报(Endocrinol)131：1603-1611中。
对于一系列化合物EU-201到EU-203，其中表面活性剂的疏水性部分(1-烷基葡糖醛酸)的长度为C1至C12，细胞反应使得效能和功效随链长的增加而增强。所有类似物均为促效剂。其它取代会产生EC50与PTH1-34类似但具有超促效活性的分子(例如EU-232)，且所述分子在医学中有重要应用。其它类似物经过设计具有极长活体内作用持续时间(即EU-286、EU-287和EU-288)。在这一分析中，PTHrP(被编码的样本)的EC50为2.9nM且最大反应为100％，同时内部标准物，PTH的EC50为1.4nM且最大反应为105％。将化合物溶解于水中且用含有1％牛血清白蛋白的分析缓冲液稀释。下表显示本文所描述的某些肽产物的效能和功效。
化合物名称 结构 EC50(nM) 最大反应(％PTHrP) 表征
EU-201 1-Me 40 115 促效剂
EU-202 1-辛基 25 118 促效剂
EU-203 1-十二烷基 25 129 促效剂
EU-204 1-十二烷基 20 135 促效剂
EU-205 1-十二烷基 40 115 促效剂
EU-207 1-十二烷基 40 110 促效剂
EU-232 1-十二烷基 2.4 145 促效剂
EU-251 1-十二烷基 4.3 135 促效剂
EU-260 1-十二烷基 2.2 120 促效剂
EU-283 1-十二烷基 5.2 100 促效剂
EU-284 1-十二烷基 62 110 促效剂
当以拈抗剂模式测试时，在添加PTHrP的情况下，最大效果甚至更大(对于C-12化合物EU-203最大为PTHrP的146％)。这种行为展示本文所描述的改性改变受体相互作用的基本特性的能力。分子其它地方的改性可用以进一步改变药物候选者的相互作用的效能和特征。
实例2-6：化合物的活体内分析.
按照弗罗黎克，C.A.等人，(2003)骨33：372-379，20的方法，使来自中英西普尔/必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR/BK Lab Animal Ltd)的20只雄性大鼠适应标准实验室条件7天时间。在适应之后，按年龄将动物分为5组。将组中的每一动物用单次皮下注射媒剂或测试药剂进行处理。
将两个测试组中的动物用每只动物80mcg huPTH1-34(巴亨(Bachem))或每只动物80mcg EU-232处理。将第四组每只动物用320mcg EU-232处理。在注射后0.5、1、2、4和5小时通过眼眶后静脉收集血液样本，且将血液样本储存于冰上，之后进行离心并且测试血液PO4和Ca含量。
在80mcg组(PTH和EU-232)中，存在响应于PTH或EU-232的暂时而不是统计上显著的血液PO4含量降低，且在1小时之后PO4含量不会进一步减少。响应于用EU-232处理，血液PO4含量随时间减少到统计上明显低的含量，且在5小时时间点看到最大减少(比0小时的含量减少了25-35％)，指示EU-232有效且延长的作用持续时间。并无群组显示在任何时间点相比于媒剂统计上不同的血Ca含量，因此不指示在给药后有高钙血症的倾向。
以类似方式，测试本文所描述的类似物(包括图1中的表1的化合物)以评价其活体内效能和作用持续时间。
本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质适用于预防和治疗许多疾病。PTHR1促效剂对于以下骨骼密度疾病的治疗有效：如绝经后或老年骨质疏松症、甲状旁腺功能减退、骨质减少、植入物固定和某些转移性肿瘤。拈抗类似物适用于治疗高钙血症，尤其与恶性疾病的甲状旁腺功能亢进或高钙血症相关的治疗。PTH和PTHrP促效剂可用以在活体内或活体外调动骨髓造血干细胞(HSC)的增殖以用于骨髓移植和与低血细胞浓度相关的疾病综合症。移植后扩增也是一个引人注目的应用。因为血液中的许多细胞来源于HSC，所以可能存在多种应用。适当标记的表面活性剂改性的肽可用作诊断探针。
代表性传递方案包括经口、不经肠(包括皮下、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、经颊(包括舌下)、经皮、吸入、眼部和鼻内传递方案。引人注目且广泛使用的肽传递方法需要皮下注射控制释放的可注射调配物。施用本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的其它投药途径为皮下、鼻内和吸入投药。
实例2-7.治疗骨质疏松症的医药用量.
用EU-204通过由所属领域所用的标准雾化器鼻内投予(200μL)含有0.5到10mg/mL医药剂且含有标准赋形剂(如苯甲醇)的医药剂于生理盐水中的溶液来治疗有骨质疏松症或骨质减少迹象的人类患者。视如骨骼疼痛、骨质减少、低骨骼密度或骨折的症状的缓减所需要重复进行治疗。以类似方式，视刺激骨骼增长所需要，通过定量吸入器(MDI)鼻内投予EU-204和所选赋形剂于含有如氢氟烷烃的蒸发溶剂中的溶液。使用包括骨矿物密度测试(BMD测试)的标准测试测量治疗效果。
图1的表1中所描述的所有化合物均使用类似方案来测试。
以类似方式，测试通过经颊、阴道内、吸入、皮下、静脉内、眼内或经口途径投予的调节量以确定体内PTHR1对细胞刺激的程度并且确定治疗效果。
实例3-1：试剂-N-α-Fmoc，N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸
在烘干的250mL锥形瓶中放置1-辛基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯有限公司(Carbosynth Ltd.)，3.06g，10mmol)、50mL无水DMF和无水1-羟基苯并三唑(1.62g，12mmol)。伴随搅拌添加N，N′-二环己基碳化二亚胺(2.48g，12mmol)于50mL DMF中的冷却(4℃)溶液，且使反应进行5分钟。经烧结玻璃漏斗过滤丰富的N，N′-二环己脲的白色沉淀物且将滤液添加到N-α-Fmoc-L-赖氨酸(3.68g，10mmol)于25ml无水DMF中的溶液中。使反应进行25分钟，同时升温到室温或直至茚三酮颜色极其淡。过滤反应混合物，汽提至干燥且通过溶解于MeOH中从MeOH/Et2O结晶，且用Et2O缓慢稀释到混浊点，随后冷冻。可通过使用EtOAc到EtOAc/EtOH/AcOH的溶剂梯度的硅胶色谱法实现进一步纯化。
以类似方式，但用N-α-Boc-L-赖氨酸取代，获得适用于N端并入且裂解成游离N端的N-α-Boc,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用N-α-Ac-L-赖氨酸取代，获得适用于在N端并入N端被阻断的肽的N-α-Ac,N-ε-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-赖氨酸。以类似方式，但用适量N-α-Fmoc-L-鸟氨酸取代，获得N-α-Fmoc,N-δ-(1-辛基β-D-葡糖苷酸-6-基)-L-鸟氨酸。以类似方式，但用其它N-单保护二氨基酸取代，获得相应试剂。或者，在偶合期间使用暂时Me3Si酯保护基并且不预先活化1-辛基β-D-葡糖醛酸提供形成试剂的容易途径。暂时Me3Si酯通过在二氯甲烷(CH2Cl2)中使Fmoc-Lys-OH与等摩尔量的N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺的反应产生。有机层含有如上准备与1-烷基葡糖苷酸偶合的呈于CH2Cl2中的溶液形式的所要试剂。用NaHSO4水溶液洗涤过滤的反应混合物以水解Me3Si酯，经MgSO4干燥且去除溶剂。
类似地，但使用全乙酰基或全苯甲酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸，获得Ac或Bz保护形式的试剂(例如2,3,4-三乙酰基1-辛基β-D-葡糖醛酸等，由用Ac2O处理形成)。所述试剂在从树脂酸裂解期间的稳定性增加，且在检测到脱除保护基期间的不稳定性时加以使用，参见(奇赫博格，J.等人，(1997)酶学方法289：221-245)和其中的参考文献。最终脱除所述产物的保护基通过在裂解之后如上文所描述使用MeOH/NH3、MeOH/NaOMe、MeOH/NH2NH2进行碱催化酯基转移来实现。
实例3-2：合成肽类似物
一般说来，肽合成方法包括将被保护的氨基酸依序添加到生长肽链中。通常，对第一氨基酸和任何反应性侧链基团的氨基或羧基加以保护。接着将这一被保护的氨基酸连接到惰性固体载体或用于溶液中，且在适合形成酰胺键联的条件下添加序列中的下一个还被适当保护的氨基酸。在将所有所要的氨基酸以适当序次连接之后，去除保护基和任何固体载体得到粗肽。将肽脱盐且用色谱纯化。
制备氨基酸少于约五十个的生理学活性截短肽的类似物的优选方法包括固相肽合成。在这种方法中，α-氨基(Nα)官能团和任何反应性侧链用酸或碱敏感基团加以保护。保护基应为对于肽键联形成条件稳定，同时容易在不影响现存肽链的情况下去除。适合α-氨基保护基包括(但不限于)叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)、邻氯苯甲氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、异冰片基氧羰基、α，α-二甲基-3,5-二甲氧基苯甲氧基羰基、邻硝基苯次磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)等，优选为Boc或更优选为Fmoc。适合侧链保护基包括(但不限于)：乙酰基、苯甲基(Bzl)、苯甲氧基甲基(Bom)、Boc、叔丁基、邻溴苯甲氧羰基、叔丁基、叔丁基二甲基硅烷基、2-氯苯甲基(Cl-z)、2,6-二氯苯甲基、环己基、环戊基、异丙基、新戊酰、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三甲基硅烷基和三苯甲基。合成化合物的优选Nα-保护基为Fmoc基团。优选侧链保护基为Glu、Tyr、Thr、Asp和Ser的O-叔丁基；Lys和Trp侧链的Boc基团；Arg的Pbf基团；Asn、Gln和His的Trt基团。对于Lys残基的选择性改性，用不会由裂解基于Fmoc或叔丁基的保护基的试剂去除的保护基正交保护为优选。Lys侧链改性的优选实例包括(但不限于)通过肼而非哌啶去除的改性；例如1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)或1-(4，4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)和烯丙氧羰基(Alloc)。在需要形成侧链内酰胺的情况下，Fmoc-Lys(ivDde)或Fmoc-Lys(Dde)保护基流程为优选(休斯敦，M.E.，Jr.等人，(1995)肽科学杂志1：274-282；米拉吉，E.N.等人，(2010)药物化学杂志)，因为在这种情况下可将Fmoc-Glu(O-Allyl)和Fmoc-Lys(Alloc)并入且用以提供暂时保护，接着脱除保护基形成内酰胺，同时剩余Lys(Dde)保护基随后进行去除且与官能化表面活性剂反应。
在固相合成中，首先将C端氨基酸连接到适合树脂载体。适合树脂载体为那些对于逐步缩合和脱除保护基反应的试剂和反应条件为惰性以及不可溶于所用介质中的物质。可购得的树脂的实例包括用以下反应性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂：例如氯甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟甲基化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。对于肽酸的制备，苯甲基化羟甲基化苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂为优选。当化合物的C端为酰胺时，优选树脂为对甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二乙烯基-苯)树脂、基于2,4二甲氧基二苯甲基氨基的树脂(“林克酰胺(Rink amide)”)等。合成较大肽的尤其优选载体为可购得的含有接枝到其它聚合基质上的PEG序列的树脂，如林克酰胺-PEG和PAL-PEG-PS树脂(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))或设计用于使用Fmoc方案合成肽酰胺的类似树脂。因此，在某些情况下，需要具有与PEG链的酰胺键联。在那些情况下，宜将N-Fmoc-氨基-PEG-羧酸连接到上述形成酰胺的树脂(例如林克酰胺树脂等)。链的第一氨基酸可与PEG链的氨基官能团偶合成N-Fmoc-氨基酸。最终脱除保护基将产生所要肽-NH-PEG-CO-NH2产物。
与PAM树脂的连接可通过在例如约40℃与60℃之间、优选约50℃的高温下使Nα保护的氨基酸(例如Boc-氨基酸)(呈其于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的铵、铯、三乙基铵、1，5-二氮杂双环-[5.4.0]十一-5-烯、四甲基铵或类似盐形式，优选于DMF中的铯盐)与树脂反应约12到72小时、优选约48小时来实现。由此将最终在酸裂解之后产生肽酸产物或在氨解之后产生酰胺。
可在约10℃与50℃之间、优选25℃的温度下，在如CH2Cl2或DMF、优选CH2Cl2的溶剂中借助于例如N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)介导的偶合约2到约24小时、优选约2小时将Nα-Boc-氨基酸连接到二苯甲基胺树脂。
对于基于Boc的方案，可用在所属领域熟知的方法，通常在自动肽合成器中连续偶合被保护的氨基酸。在用三乙胺、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)、三甲基吡啶或类似碱中和之后，引入约1.5到2.5倍摩尔过量的每一被保护的氨基酸，且在环境温度下在如CH2Cl2、DMF、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)或其混合物的惰性非水性极性溶剂中、优选在二氯甲烷中进行偶合。对于基于Fmoc的方案，不使用酸脱除保护基，但通常将碱、优选DIEA或NMM并入偶合混合物中。通常在DMF、NMP、DMA或混合溶剂、优选DMF中进行偶合。代表性偶合剂为单独或在HOBt、O-酰基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)鏻(PyBop)、N-羟基丁二酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟存在下的N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基-碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺。或者，可使用被保护的氨基酸活性酯(例如对硝基苯基、五氟苯基等)或对称酸酐。优选偶合剂为铵/脲盐(供应商所用的替代命名)类，如六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HBTU)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲盐(HATU)、六氟磷酸2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵(HCTU)等。
Fmoc-PAL-PEG-PS树脂的优选连接方法可通过用含20％哌啶的DMF使树脂连接子脱除保护基，随后为如下N-α-Fmoc保护的氨基酸的反应(约5倍摩尔过量的N-α-Fmoc-氨基酸，在微波辅助的肽合成器中使用含HBTU：二异丙基乙胺(DIEA)(1∶2)的DMF，及5分钟、最大75℃的偶合循环)来实现。
对于这个微波辅助肽合成器中的基于Fmoc的方案，用含20％哌啶的DMF(含有0.1M1-羟基苯并三唑(HOBt))去除N-α-Fmoc氨基酸保护基，在双重脱除保护基方案中历时30秒，且接着在设定为75℃的最高温度下历时3分钟。将HOBt添加到脱除保护基溶液中以减少天冬酰亚胺形成。下一个氨基酸的偶合接着采用五倍摩尔过量，使用HBTU∶DIEA(1∶2)，及5分钟、最大75℃的双重偶合循环。
在固相合成结束时，从树脂去除充分保护的肽。当与树脂载体键联为苯甲酯类型时，裂解可借助于在约-10℃与50℃之间、优选约25℃的温度下对于具有烷基酰胺C端的肽用烷基胺或氟烷基胺氨解，或对于具有未被取代的酰胺C端的肽用例如氨水/甲醇或氨水/乙醇氨解约12与24小时之间、优选约18小时来实现。具有羟基C端的肽可通过HF或其它强酸性脱除保护基方案或通过皂化来裂解。或者，可通过酯基转移(例如用甲醇)，随后氨解或皂化从树脂去除肽。被保护的肽可通过硅胶或反相HPLC纯化。
侧链保护基可如下从肽去除：在苯甲醚或其它碳正离子清除剂存在下用例如无水液体氟化氢处理氨解产物，用氟化氢/吡啶复合物处理、用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸处理，通过在约-10℃与+10℃之间，优选约0℃的温度下用氢气和钯/碳或聚乙烯吡咯烷酮还原，或通过用含钠的液体氨、优选用液体氟化氢和苯甲醚还原约15分钟与2小时之间、优选约1.5小时。
对于二苯甲基胺型树脂上的肽，树脂裂解和脱除保护基步骤利用如上文所描述的液体氟化氢和苯甲醚或优选通过使用温和裂解混合液可合併于单个步骤中。举例来说，对于PAL-PEG-PS树脂，优选方法通过在微波辅助肽合成器中每次均在38℃下使用一种在所属领域已知的温和裂解混合液(如TFA/水/三异丙基硅烷/3,6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)(92.5/2.5/2.5/2.5)使用双重脱除保护基方案18分钟来实现。含有烷基糖苷的物质的裂解显示使用TFA/水比率在9/1到19/1范围内的方案存在烷基糖苷键联。典型混合液为94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS。通常，将充分脱除保护基的产物沉淀且用冷(-70℃到4℃)二乙醚洗涤，溶解于去离子水中且冻干。
可将肽溶液脱盐(例如用BioRad阴离子交换树脂)且通过一系列采用任何或所有以下类型的色谱步骤使对肽进行纯化：经乙酸酯形式的弱碱性树脂的离子交换；经未衍生化共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的疏水性吸附色谱，例如XAD；硅胶吸附色谱；经羧甲基纤维素的离子交换色谱；例如经G-25的分配色谱；反流分布；超临界流体色谱；或HPLC，尤其经结合辛基或十八烷基硅烷基二氧化硅(ODS)的相管柱填充物的反相HPLC。
本文还提供制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体，和纯化产物，得到生理学活性的截短同源物的类似物和本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的类似物。在一些实施例中，本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质并入有如上文所定义的烷基糖苷改性。另一方面涉及制备本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质和其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含使用基于微波辅助的固相合成的方法或标准肽合成方案以将被保护的氨基酸依序缩合在适合树脂载体上，去除保护基和树脂载体和纯化产物，得到如上文所定义的生理学活性肽的类似物。
实例3-3.糖醛酸的通用氧化方法
向1-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷(卡博森斯)[2.0g，5.74mmol]于20mL乙腈和20mLDI水中的溶液中添加(二乙酰氧碘基)苯(佛鲁卡)[4.4g，13.7mmol]和TEMPO(阿德里奇化学)[0.180g，1.15mmol]。在室温下搅拌所得混合物20小时。用水稀释反应混合物且冻干至干燥，得到1.52g(粗产率73.1％)呈白色粉末状的粗产物1-十二烷基β-D-葡糖醛酸，其未经进一步纯化即直接用于固相合成。这种产物先前如说明书中所描述通过替代方法使用NaOCl作为氧化剂来制备，且还可用于较长烷基。以类似方式，制备用于制造本文所描述的产物和试剂的所要烷基糖糖醛酸。
以类似方式，但使用相应1-十四烷基、1-十六烷基和1-十八烷基β-D-吡喃葡萄糖 苷(购自阿那曲斯，茂米城，俄亥俄州)，制备用于制造本文所描述的产物和试剂的所要1-烷基糖糖醛酸。
实例3-4：制备类似物EU-A387.
如实例1中所描述通过依序添加N-α-Fmoc保护的氨基酸来制备Fmoc-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Bip-Ser-Lys-Tyr-Leu-Glu-Ser-Lys(Alloc)-林克酰胺树脂的样本且通过在黑暗中在室温下用含Pd(PPh3)4(0.5eq)和DMBA(20eq)的DMF/CH2Cl2(1∶1)培育过夜使得在Lys-N-ε位置脱除保护基。在通过DMF/CH2Cl2洗涤之后，通过使用DIC/HOBt用含1′-十二烷基β-D-葡糖醛酸的DMF/CH2Cl2将Lys侧链酰化。通过茚三酮检查偶合完成，且用CH2Cl2全面洗涤产物。
使产物树脂经受最终脱除保护基且在室温下通过用裂解混合液(94％TFA：2％EDT；2％H2O；2％TIS)处理240分钟时间而从树脂裂解。用Et2O处理混合物使产物沉淀且用Et2O全面洗涤，在真空干燥之后产生粗标题肽产物。
分两批通过反相(C18)hplc进行纯化。将粗肽装载于流速为15mL/min(15％有机改性剂；乙酸缓冲液)的4.1×25cm hplc管柱上且在50℃下用60分钟内15-45％缓冲液B梯度进行洗脱。将产物份冻干，产生标题产物肽，通过分析性hplc(18.6min；含30-60％CH3CN的TFA)/质谱分析(M+1峰＝2382.14)得到纯度为98.03％。
以类似方式但使用试剂1′-甲基β-D-葡糖醛酸和1′-辛基β-D-葡糖醛酸(卡博森斯)来制备标题化合物的相应1-甲基和1-辛基类似物。使用如上文所描述制备的相应葡糖醛酸来制备相应1-癸基、1-十二烷基、1-十四烷基、1-十六烷基、1-十八烷基和1-二十烷基类似物。或者，1-烷基葡糖醛酸基或其它糖醛酰化类似物可通过脱除保护基或部分脱除保护基的肽的初始纯化，随后通过所要糖醛酸试剂酰化来制备。
通过使用下表提供的洗脱剂梯度的阳离子模式的HPLC/质谱分析进行分析。
化合物名称 预期分子量 实验分子量 HPLC(min；洗脱)
EU-A387 2379.66 2380.14 18.6[b]
EU-A388 2393.69 2393.74 16.0[a]
EU-A391 2317.62 2318.26 11.2[b]
EU-A455 2988.36 2988.00 11.5[b]
EU-A474 2570.86 2570.54 11.3[b]
EU-A478 2459.75 2459.74 11.1[b]
EU-A484 2544.86 2545.06 9.6[b]
EU-A501 2904.2 2903.34 7.9[b]
EU-A502 2776.07 2776.14 8.0[b]
EU-A503 2704.98 2704.40 8.0[b]
EU-A504 2548.80 2548.00 9.1[b]
EU-A505 2392.61 2392.40 10.5[b]
EU-A506 2305.53 2305.06 10.7[b]
EU-A507 3763.23 3762.66 9.0[b]
EU-A521 2303.56 2303.60 8.2[c]
EU-A522 2315.60 2315.60 14.2[d]
EU-A523 2615.94 2616.00 8.1[b]
EU-A524 2459.75 2459.74 12.7[d]
EU-A525 2459.75 2459.06 6.0[c]
EU-A526 2473.75 2473.60 12.7[d]
EU-A527 2390.64 2390.40 14.6[d]
EU-A529 2546.83 2546.80 9.5[b]
EU-A531 2546.83 2546.80 9.5[b]
EU-A532 2559.00 2558.66 9.6[b]
EU-A533 2560.96 2560.66 9.5[b]
EU-A534 2544.99 2544.94 9.7[b]
EU-A535 2573.05 2574.00 12.0[b]
EU-A536 2602.96 2603.46 14.3[b]
EU-A538 2516.99 2516.40 10.3[b]
EU-A539 2657.20 2656.80 10.8[b]
EU-A540 2685.20 2684.94 9.8[c]
EU-A541 2713.20 2712.80 13.0[c]
EU-A544 2631.94 2632.26 10.8[b]
EU-A546 2687.94 2688.8 9.1[c]
EU-A549 2388.67 2388.66 6.3[e]
EU-A551 2444.67 2445.20 11.4[e]
EU-A552
EU-A554 2560.86 2560.40 10.3[c]
EU-A556 2616.86 2616.40 11.7[e]
EU-A560 2570.86 2571.06 8.3[c]
EU-A562 2626.86 2626.66 9.9[e]
EU-A563
EU-A565 2542.80 2542.54 9.5[c]
EU-A567 2598.80 2599.06 12.0[e]
在0.1％TFA中的HPLC梯度
[a.]30分钟内35到65％CH3CN
[b.]20分钟内30到60％CH3CN
[c.]20分钟内35到65％CH3CN
[d.]20分钟内25到55％CH3CN
[e.]20分钟内40到70％CH3CN
经菲罗门卢娜(Phenomenex Luna)C185μm250×4.6mm进行HPLC。
实例3-5：化合物的细胞分析.
精确称重约1mg量的化合物且用标准细胞分析(西瑞普SA)进行分析。读数为用促效剂或拈抗剂模式的测试化合物处理的细胞中所产生的cAMP的量。所用分析为在胰高血糖素和GLP-1细胞分析中刺激cAMP含量。分析描述于Chicchi，G.G.等人，(1997)生物化学杂志272：7765-7769和朗格，S.等人，(2003)英国药理学杂志138：787-794中。
对于化合物EU-A391，GLCR细胞反应不发生变化且GLP1R细胞反应急剧增加且EC50为420nM。
n.c的意思是EC50不可算得
§的意思是超拈抗剂
实例3-6：化合物的活体内分析
从JAX实验室接收六十(60)只14周龄的饮食诱发的肥胖C57BL/6J雄性小鼠。对小鼠进行耳刻以加以鉴别且收容于个别且用HEPA过滤的空气的积极通风的聚碳酸酯笼中，密度为每笼一只小鼠。动物房间完全用人造荧光灯照明，控制为12小时光/暗循环。动物房间的标准温度和相对湿度范围分别为22±4℃和50±15％。任意提供酸化到pH值为2.8到3.1的过滤的自来水和高脂肪饮食(60千卡％)。
在2周适应之后，基于所要体重范围选择40只小鼠且将小鼠随机化为如下各组(n＝10)。第1组.媒剂处理；第2组.低剂量测试化合物；第3组.中等剂量测试化合物；第4组.高剂量测试化合物。每天通过皮下对小鼠给药28天。每天记录体重和笼侧面观察值。每周记录食物和水摄入。小鼠在第1天(给药前)和第26天经受NMR测量以测定全身脂肪和瘦肉组成。在第0天、第14天和第27天使小鼠空腹过夜以进行口服葡萄糖耐受性测试。第二天，通过尾巴切口收集第一血液样本(t＝0)。接着向小鼠投予1.0g/kg葡萄糖丸剂。在葡萄糖之后5、30、60和120分钟通过尾巴切口获得血液样本且立即使用血糖仪测定血浆葡萄糖。
处死和组织收集：在第29天将小鼠处死。将末端血液处理成血清/血浆且将等分试样送去进行葡萄糖、胰岛素和脂质概况分析。收集脂肪组织，称重并且冷冻以进行分析。最佳化合物概况显示OGTT中的葡萄糖漂移降低、基础胰岛素分泌减少、葡萄糖依赖性胰岛素分泌加强、重量增加减少、脂肪质量减少，但对瘦肉质量的影响最小。
实例3-7：化合物的用途
本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质适用于预防和治疗许多与肥胖症、新陈代谢综合症、心血管疾病和糖尿病相关的疾病。可将适当标记的表面活性剂改性的肽用作诊断探针。
代表性递送方案包括经口、不经肠(包括皮下、肌肉内和静脉内注射)、经直肠、经颊(包括舌下)、经皮、吸入、眼部和鼻内递送方案。引人注目且广泛使用的肽递送方法需要皮下注射控制释放的可注射调配物。施用本文所描述的共价改性的肽和/或蛋白质的其它投药途径为皮下、鼻内和吸入投药。
实例3-8.治疗胰岛素抗性的医药用量.
用EU-A596通过从所属领域所用的标准雾化器鼻内投予(200μL)含有0.5到10mg/mL医药剂且含有标准赋形剂(如苯甲醇)的医药剂于生理盐水中的溶液来治疗有胰岛素或新陈代谢综合症迹象的人类患者。视如肥胖症、血糖升高等的症状的缓减所需要重复进行治疗。以类似方式，视减少胰岛素抗性所需要，通过定量吸入器(MDI)鼻内投予EU-A596和所选赋形剂于含有如氢氟烷烃的蒸发溶剂中的溶液。使用包括测量血糖含量、身体质量指数和/或体重和/或测量腰臀比的标准测试确定治疗效果。
以类似方式，测试通过经颊、阴道内、吸入、皮下、静脉内、眼内或经口途径投予的调节量以确定体内GLP1R和/或GLCR对细胞刺激的程度并且确定治疗效果。
序列
图1中的表1描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.1和149-169的序列。另外，如图1的表1中所示，图1的表1提供化合物EU-A101到EU-A199和EU-A600到EU-A649的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO2-148，和SEQ.ID.NO.645。由此将图1的表1中的化合物和其在图1的表1中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图2中的表2描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.170-174和SEQ.ID.NO.283-302的序列。另外，如图2的表2中所示，图2的表2提供化合物EU-201到EU-299和EU-900到EU-908的SEQ.ID.编号，分别为SEQ.ID.NO.175-282。由此将图2的表2中的化合物和其在图2的表2中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图8中的表3描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.303-305和SEQ.ID.NO.619-644的序列。另外，如图8的表3中所示，图8的表3提供化合物EU-A300到EU-A425的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO.306-431。由此将图8的表3中的化合物和其在图8的表3中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。
图9中的表4描绘通过本文所描述的方法制备的化合物。本说明书提供SEQ.ID.No.303-305和SEQ.ID.NO.619-644。另外，如图9的表4中所示，图9的表4提供化合物EU-A426到EU-A599的SEQ.ID编号，分别为SEQ.ID.NO.432-520。由此将图2的表2中的化合物和其在图9的表4中所示的各别SEQ.ID.NO.并入所提交的说明书中。

Claims (19)

1.一种肽产物，其具有式II结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式II
其中：
aa1为Dmt；
aa2为Pro或Tic；
aa3为Phe或Tmp；
aa4为Phe、Lys(X)或D-Lys(X)；
aa5不存在或为Aib或Lys(X)；
其限制条件为aa4和aa5中的一者为共价连接到表面活性剂X的连接氨基酸；
X为1-烷基葡糖醛酸；
Z为-NH2或-NHR3；且
R3为C1-C12分支链或直链烷基、或芳烷基。
2.根据权利要求1所述的肽产物，其中aa4为Phe或Lys(X)。
3.根据权利要求1所述的肽产物，其中1-烷基葡糖醛酸的1-烷基基团为C8-C20烷基。
4.根据权利要求1所述的肽产物，其中：
aa2为Pro；
aa3为Tmp；
aa4为Lys(X)；且
aa5不存在。
5.根据权利要求1所述的肽产物，其中：
aa2为Tic；
aa3为Phe；
aa4为Lys(X)；且
aa5不存在或为Aib。
6.根据权利要求5所述的肽产物，其中aa5不存在。
7.根据权利要求1所述的肽产物，其中：
aa1为Dmt；
aa2为Tic；
aa3为Phe；
aa4为Phe；且
aa5为Lys(X)。
8.根据权利要求3所述的肽产物，其中X为选自以下的1-烷基葡糖醛酸：1-辛基β-D-葡糖醛酸、1-癸基β-D-葡糖醛酸基、1-十二烷基β-D-葡糖醛酸、1-十四烷基β-D-葡糖醛酸、1-十六烷基β-D-葡糖醛酸、1-十八烷基β-D-葡糖醛酸和1-二十烷基β-D-葡糖醛酸基。
9.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-辛基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
10.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-癸基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
11.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-十二烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
12.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-十四烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
13.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-十六烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
14.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-十八烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
15.根据权利要求3所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-二十烷基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
16.根据权利要求1所述的肽产物，其为
H-Dmt-Tic-Phe-Lys(N-ε-1-甲基β-D-葡糖醛酸基)-NH2。
17.一种肽产物，其具有式II结构：
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Z 式II
其中：
aa1为Dmt；
aa2为D-Lys(X)；
aa3为Tmp；
aa4为Phe；
aa5不存在；
Z为-NH2或-NHR3
X为1-烷基葡糖醛酸；且
R3为C1-C12分支链或直链烷基、或芳烷基。
18.一种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1到17中任一权利要求所述的肽产物或其医药学上可接受的盐，和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。
19.一种根据权利要求1到17中任一权利要求所述的肽产物或其医药学上可接受的盐在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
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