DE60032473T2

DE60032473T2 - Inklusionskomplex von Opioid-Peptid mit Cyclodextrin

Info

Publication number: DE60032473T2
Application number: DE60032473T
Authority: DE
Inventors: Anil Kumar Lucknow 226001 Dwivedi; Sudhir Lucknow 226001 Srivastava; Jagdishwar S. Lucknow 226001 Srivastava; Wahajul Lucknow 226001 Haq; Puwada Sri R. Lucknow 226001 Murhty; Satyawan Lucknow 226001 Singh; Ram Lucknow 226001 Raghubir; Onkar Prasad Lucknow 226001 Asthana; Madhu Lucknow 226001 Khanna
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2008-04-24
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: EP1174152B1; DE60032473D1; EP1174152A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Einschlusskomplexe, die das bekannte Opioidpeptid L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid umfassen. Bekannte narkotische Analgetika wie Morphin können toxisch sein, machen süchtig und die Akzeptanz der Patienten kann relativ gering sein. Wir haben herausgefunden, dass das Peptid L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid im Vergleich zu den narkotischen Analgetika ein starker potentes Analgetikum ist, weniger toxisch ist, eine längere Wirkungsdauer aufweist, eine größere Wirksamkeit hat, von Patienten starker angenommen wird und keine oder eine sehr beschränkte Abhängigkeit induziert. Jedoch wird L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid schlecht über den bevorzugten Weg der oralen Verabreichung absorbiert und dies hat dessen Nutzen sowie seine breitere Anwendung als ein Analgetikum beschränkt.
Kurz nach der Entdeckung des Enkephalins, einem endogen vorkommenden Pentapeptid mit morphinomimetischer Aktivität durch Huges et. al. [Huges et. al., Nature 258, 577 (1975)] wurden weltweit Struktur-Aktivitätsstudien mit der Zielsetzung durchgeführt, ein synthetisches Congener zu bekommen, das ein klinisch verträgliches Schmerzmittel als Ersatz für Morphin sein würde. Da die Analgesie, die durch Enkephaline ausgelöst wird, nur schwach und transient nach deren Verabreichung durch den intrazerebralen Weg war, wurde starker Wert auf die strukturelle Modifikation des Pentapeptids gelegt, die zu einem Peptid(en) führen würde, das in der Lage ist, Schmerzfreiheit sogar nach dessen systemischer Verabreichung auszulösen.
Die zwei besten Enkephalinanaloga, die bis dahin recht ausgiebige klinische Studien durchlaufen hatten, waren die Verbindung FK-33-824 [Tyr-D-Ala-Gly-Met(o)-OH] von Sandoz und die Verbindung met-Kephamid (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-MeMet-NH2] von Lilly. [Von Graffenreid, B., del Pozo, E., Roubicek, J., Krebs, E., Poldinger W., Burmeister, P. und Kerp, L., Nature, 272, 729 (1978) und Frederickson, R.C.A., Smithwick, E.L., Shuman, R. und Bernis, K.G., Science, 211, 603, (1981) Frederickson, R.C.A., in „Opioid Peptides: Molecular Pharmacology, Bio synthesis and analysis" Rapaka, R.S. und Hawks, R.L., Hrsg. NIDA Research Monograph, 70 367, (1986). FK-33-824 ergab nur eine kleine Präferenz für μ-Rezeptoren und für met-Kephamid wurde herausgefunden, dass es im Wesentlichen keine Bevorzugung für μ- und δ-Rezeptoren aufwies. Eine starke analgetische Wirkung wurde bei systemischer Verabreichung durch beide der Verbindungen ausgeübt. Jedoch wurde bedingt durch eine Anzahl ernst zu nehmender Nebenwirkungen, die durch FK-33-824 bereit gestellt wurden, dieses nicht für weitere Entwicklungen als analgetischer Medikamentenkandidat verfolgt. Relativ weniger Nebenwirkungen wurden für met-Kephamid beobachtet, aber bedingt durch dessen blutdrucksenkende Wirkung wurde diese Verbindung schließlich auch aufgegeben.
Von anderen Enkephalinanaloga, Tyr-D-Met-Gly-Phe-Pro-NH₂ [Flodes, J., Torok. K. Szekeley, J., Barvenderg, J., Karezag, I., Tolna, J., Marosfi, S., Varadi, A., Gara, A., Ronai A.Z. und Szitaggi, G., Life Sciences 33, Erg. I, 769 (1983)] und Tyr-Arg-Gly-Phe(p-NO₂)-Pro-NH₂ (BW-143C) [Fallenfant, R.J., Hardy, G.W., Lowe, I.A., Schneider, C und Smith, T.W., Br. J. Pharmacol. 93, 85 (1988) und Kriss, M.G., Gralla, R.I., Clark, R.A., Tyran, I.R. und Grasheu, S., J. Clin. Oncol. 6, 663, (1988)] wurde auch gezeigt, dass sie potentere Analgetika als Morphin sind, aber bedingt durch eine Anzahl von Nebenwirkungen wurden diese Verbindungen auch nach anfänglichen klinischen Untersuchungen fallen gelassen. In ähnlicher Weise wurden Sturkur-Aktivitätsstudien in unseren Labor durchgeführt und es wurde von einem Enkephalinanalogon Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-NHC₃H₇ [Raghubir, R., Pagnaik, G.K., Sharma, S.D., Mashur, K.B. und Khawan B.N., In recent Progress in chemistry and biology of centrally acting peptides. Dhawan B.N. und Rapaka R.S. Hrsg., 167 (1988) und das indische Patent Nr. 173568 19.10.1989], das zuvor unseren Labor synthetisiert wurde, herausgefunden, dass es nach systemischer Verabreichung potenter als Morphin war. Diese Verbindung ist hoch selektiv für den μ-Rezeptor im zentralen und peripheren Essay und produziert eine starke profunde und lang andauernde Analgesie (C. Nath, G.K. Patnaik, W. Hag, K.B. Mathur, R.C. Srimal, B.N. Dhawan und F. Porreca, Pharmacological Research, 31, 269-273, 1995). Die Verbindung und das Verfahren für dessen Synthese wurden zuerst in dem indischen Patent Nr. 173568 vom 19.10.1989 offenbart. Anschließende chronische und subakute Toxizitätsstudien mit dieser Verbindung wurden durchgeführt und es wird nun offenbart, dass diese Verbindung sicher ist und keinerlei erkennbare toxischen Nebenwirkungen produziert. Diese Verbindung wurde auch bezüglich ihres Suchtpotentials und ihrer Verträglichkeit untersucht, und es wurde herausgefunden, dass sie eine deutlich niedrigere Toleranzproblematik und Suchteigenschaften im Vergleich zu Morphin aufzeigt. Die Verbindung hat im Wesentlichen keinerlei größere ZNS-Auswirkungen wie Sedierung und Atemunterdrückung; sie hat auch keinerlei signifikante kardiovaskuläre Auswirkungen. Daher hat diese Verbindung ein Potential als zentral aktives analgetisches Mittel, das als ein Ersatz für narkotische Analgetika (Morphin und damit verwandte Substanzen) verwendet werden kann. Jedoch produziert diese Verbindung bei oraler Verabreichung eine schwache Reaktion und es ist bedingt durch deren Zersetzung und schwache Absorption eine extrem hohe Dosierung notwendig, um eine Reaktion in einer ähnlicher Größenordnung zu erhalten, wie es nach parenteraler Verabreichung zu sehen ist. Die orale Wirksamkeit der therapeutischen Mittel ist als hoch wünschenswert einzuschätzen, daher wird trotz einer profunden analgetischen und vorteilhaften pharmakologischen Wirkung und der fast vollständigen Abwesenheit toxischer Wirkungen die Entwicklung des Peptids als Medikament durch dessen schwache orale Wirksamkeit eingeschränkt.
Die Entwicklung innovativer Strategien für die orale Verabreichung von auf Peptid basierenden Medikamenten (A. Fasano. (1998) TIBTECH., 16, 152-157) mit verbesserter Wasserlöslichkeit, Auflösungsvermögen, Bioverfügbarkeit und verbesserter oraler Wirksamkeit (Z. Shao, 1992) wurde stark betont. Von Cyclodextrinen wird in der Literatur berichtet, dass sie in ihrer Wasserlöslichkeit, Auflösungsvermögen, Bioverfügbarkeit und Stabilität der Verbindung durch die Bildung von Einschlusskomplexen verbessert werden. [R. Krishnamoorthy und A.K. Mitra, Pharma. Res., 9: 1157-1163 (1992)]. Kürzlich wurde in der Literatur berichtet, dass der β-Cyclodextrin-Einschlusskomplex die Halbwertszeit von Leu-Enkephalin von 45 Minuten auf 75 Minuten bedingt durch die Enzymhydrolyse mit Leucinaminopeptidase erhöht (W.J. Erwin, A.K. Dwivedi, P.A. Holbrook und M.J. Dey, Pharma Res., 11, 1994, 1698-1703). Daher wird die Zubereitung eines Einschlusskomplexes von Peptiden und anderen Substanzen mit Cyclodextrin in der Literatur berichtet. Der Vorteil der Einbindung von Substanzen in Einschlusskomplexe mit Cyclodextrin ist auch für andere Substanzen bekannt. Die U.S. Patente Nr. 4,603,123 , 5,840,714 und 5,855,916 offenbarten jeweils die erhöhte therapeutische Wirksamkeit und verringerten toxischen Wirkungen von Piroxicam, Ibuproxam und auf Säure basierenden Medikamenten. U.S. 4,670,419 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein hydrophiles Medikament enthält, das schlecht durch den Magendarmtrakt absorbierbar ist, sowie Cyclodextrin.
Wir haben nun einen Weg zur Formulierung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid entdeckt, wodurch dieses zur oralen Verabreichung dadurch geeignet wird, dass es eine erhöhte Wasserlöslichkeit, längere Wirkungsdauer, verbesserte analgetische Aktivität, erhöhte Auflösungsbioverfügbarkeit und verbesserte orale/transdermale Wirksamkeit gegenüber L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid allein aufweist.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung einen Einschlusskomplex zur Verfügung, der einen Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit einem Cyclodextrin aufweist, worin das Molverhältnis zwischen L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und dem Cyclodextrin von 1:5 bis 2:1 beträgt. Vorzugsweise wird das Cyclodextrin aus der Gruppe ausgewählt, die aus β-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Dimethyl-β-cyclodextrin und Hydroxyethyl-β-cyclodextrin besteht.
In einer Ausführungsform umfasst der Einschlusskomplex L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Einschlusskomplex L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxyethyl-β-Cyclodextrin.
In einer Ausführungsform umfasst der Einschlusskomplex L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Einschlusskomplex L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Dimethyl-β-Cyclodextrin.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Einschlusskomplexes gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann zur oralen oder zur parenteralen Verabreichung formuliert sein, wie eine Tablette, eine Kapsel, eine injizierbare Formulierung, oder zur transdermalen oder rektalen Verabreichung formuliert sein.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen Einschlusskomplex gemäß der Erfindung zum Gebrauch als ein Analgetikum zur Verfügung.
Wir haben herausgefunden, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung eine wesentliche analgetische Aktivität bei einer verringerten Suchtwahrscheinlichkeit, einer geringeren respiratorischen Unterdrückung, einer geringeren gastrischen Irritation und einer geringeren Sedierung im Vergleich zu bekannten narkotischen Analgetika aufzeigen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Einschlusskomplexes gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer akuten Entzündung und zur Linderung von Schmerzen zur Verfügung.
Der Komplex der Erfindung aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und Cyclodextrin (1:2) wird zur oralen Verabreichung des Peptids verwendet, weil diese Komplexe mehr Schutz für das Peptid gegen die Umgebung des Magens bietet. Der Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl- isopropylamid und Cyclodextrin (1:2) wird zur transdermalen Verabreichung des Peptids verwendet, weil diese Komplexe die transdermale Permeation des Peptids erleichtern.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Einschlusskomplexes gemäß der Erfindung zur Verfügung, das das Zufügen von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid zu einer wässrigen Lösung aus dem Cyclodextrin; und das Abkühlen des Gemisches auf von 0°C bis 5°C umfasst, wobei der Komplex aus der Lösung ausgefällt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Einschlusskomplexes gemäß der Erfindung bereit gestellt, das das Zufügen L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid, das in Methanol zu einer wässrigen Lösung aus dem Cyclodextrin aufgelöst ist; und das Abdampfen der Lösungsmittel umfasst.
In den folgenden Beispielen wird auf die beigefügten Zeichnungen nur im Wege der Darstellung Bezug genommen, in denen:
1 eine Strukturformel von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid ist;
2 ein Massenspektrum von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid zeigt;
3 ein NMR-Spektrum von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid zeigt;
4 ein differenziell abtastendes kalorimetrsches (DSC, differential scanning calorimetry) Thermogramm von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid zeigt;
5 ein DSC-Thermogramm in der Kurve des erhaltenen Komplexproduktes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin zeigt. Es wurde keinerlei endothermer Übergang für einen Schmelzpunkt nachgewiesen, der für eine physikalische Mischung aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin charakteristisch ist;
6 ein NMR-Spektrum des Komplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methyl-phenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin zeigt;
7 ein Massenspektrum des Komplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin zeigt;
8 ein DSC-Thermogramm in der Kurve des erhaltenen Komplexproduktes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclo dextrin zeigt. Es wurde kein endothermer Übergang für einen Schmelzpunkt nachgewiesen, der für eine physikalische Mischung aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin charakteristisch ist;
9 ein NMR-Spektrum des Komplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin zeigt;
10 ein DSC-Thermogramm des Komplexproduktes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin- zeigt; und
11 ein NMR-Spektrum des Komplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxypropyl-β-cyclodextrin zeigt.
BEISPIEL 1
Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid
Das Pentapeptid wurde durch ein Verfahren der Peptidsynthese in Lösungsphase unter Einsatz eines Kondensationsverfahrens mit drei plus zwei Fragmenten oder durch das schrittweise Prozedere der Kettenverlängerung synthetisiert. Diese Verbindung wurde auch auf einem festen Träger unter Verwendung kommerziell verfügbarer Träger unter Verwendung von entweder BOC- oder FMOC-Chemie hergestellt. Die Kopplungsreaktionen wurden durch übliche verfügbare Reagenzien durchgeführt, die auf die genannten Verfahren angepasst wurden. Die Grundriss des Verfahrens zur Herstellung des Pentapeptids wurde in dem indischen Patent mit der Nr. 173568 19.10.1989 offenbart. Es wird auf die 1 bis 4 für weitere Informationen diesbezüglich Bezug genommen.
BEISPIEL 2
Herstellung eines Einschlusskomplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin
a) Verfahren in wässrigem Medium
β-Cyclodextrin (1,135 g, 1,0 mmol) in Wasser (25 ml) wurde zum Sieden erhitzt. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g, 1,0 mmol) wurde zu dieser Lösung hinzu gegeben, diese wurde intensiv für 15 Minuten gerührt und dann wurde die Mischung unter Rühren auf eine Temperatur zwischen 0° und 5°C abgekühlt. Der erhaltene Komplex wurde im Vakuum bei einer Temperatur von 40°C getrocknet. Der Einschlusskomplex (1,62 g, 95,1%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N- methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit p-Cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in einem Molarverhältnis von 1:1 erhalten.
Die Daten der Reaktionsausbeute, der Gehalt von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methyl-phenyl-alanyl-glycyl-isopropylamid in dem Komplex (theoretisch und experimenteil durch spektrofotometrische Bestimmung bei der Wellenlänge 275 nm bestimmt) werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wird für weitere Informationen auf die 5, 6 und 7 Bezug genommen.
b) Verfahren in einer Lösungsmittelmischung (Methanol/Wasser in einem Verhältnis von 5:20)
β-Cyclodextrin (1,135 g; 1,0 mmol) wurde in Wasser (25 ml) bei einer Temperatur von ungefähr 70°C aufgelöst. Während des Rührens wurde eine Lösung aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g, 1,0 mmol) in Methanol (5 ml) hinzu gegeben. Sie wurde für weitere 15 Minuten gerührt, die Lösungsmittel wurden verdampft und der erhaltene Komplex wurde im Vakuum bei einer Temperatur von ungefähr 40°C getrocknet. Der Einschlusskomplex (1,59 g, 93,4%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in einem molaren Verhältnis von 1:1 erhalten.
Die differenziell abtastende Kalorimetrie, Massen- und NMR-Spektren zeigten die gleichen Ergebnisse wie in dem Verfahren zur Herstellung des Einschlusskomplexes in einem wässrigen Medium.
BEISPIEL 3
Herstellung eines Einschlusskomplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin
a) Verfahren in wässrigem Medium
β-Cyclodextrin (1,135 g; 1,0 mmol) in Wasser (25 ml) wurde auf Siedetemperatur erhitzt, in die siedende Lösung wurde L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,284 g; 0,5 mmol) hinzu gegeben, intensiv für 15 Minuten gerührt und die Mischung wurde während des Rührens auf eine Temperatur zwischen 0° und 5°C abgekühlt. Der erhaltene Komplex wurde im Vakuum bei einer Temperatur von ungefähr 40°C getrocknet. Ein Einschlusskomplex (1,33 g; 93,7%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in dem molaren Verhältnis von 1:2 erhalten.
Die Daten der Reaktionsausbeuten, der Gehalt an L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid in dem Komplex (theoretisch und experimentell durch spektrofotometrische Bestimmung bei der Wellenlänge 275 nm bestimmt) werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wird auf die 8 und 9 für weitere Informationen Bezug genommen.
b) Verfahren in einer Lösungsmittelmischung (Methanol/Wasser in dem Verhältnis von 5:20)
β-Cyclodextrin (1,135 g; 1,0 mmol) wurde in Wasser (25 ml) bei einer Temperatur von ungefähr 70°C gelöst. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,284 g; 0,5 mmol) in Methanol (5 ml) wurde hinzu gegeben und für weitere 15 Minuten gerührt. Die Lösungsmittel wurden verdampft und der erhaltene Komplex wurde im Vakuum bei einer Temperatur von ungefähr 40°C getrocknet. Ein Einschlusskomplex (1,36 g, 95,8%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in dem molaren Verhältnis von 1:2 erhalten.
Die differenziell abtastende Kalorimetrie und ein NMR-Spektrum zeigten die gleichen Ergebnisse wie in dem Verfahren zur Herstellung des Einschlusskomplexes in einem wässrigen Medium.
BEISPIEL 4
Herstellung eines Einschlusskomplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
a) Verfahren in methanolischem Medium
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g; 1,0 mmol) wurde zu einer Lösung aus Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (1,38 g; 1,0 mmol) in Methanol (25 ml) gegeben und die erhaltene Lösung wurde für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Methanol wurde dann verdampft und der erhaltene Komplex wurde im Vakuum bei einer Temperatur von ungefähr 40°C getrocknet. Der Einschlusskomplex (1,82 g; 93,4%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxypropyl-β-cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in einem molaren Verhältnis von 1:1 erhalten.
Die Daten der Reaktionsausbeuten, der Gehalt an L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid in dem Komplex (theoretisch und experimentell durch spektrofotometrische Bestimmung bei der Wellenlänge von 275 nm bestimmt) werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wird auf die 10 bis 11 für zusätzliche Informationen Bezug genommen.
b) Verfahren in wässrigem Medium
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (1,38 g; 1,0 mmol) wurde in Wasser (40 ml) aufgelöst und die erhaltene Lösung wurde auf die Temperatur von 70°C erhitzt und L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g; 1,0 mmol) wurde hinzu gegeben. Es wurde intensiv für weitere 15 Minuten gerührt und dann wurde die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert. Der Einschlusskomplex (1,81 g, 92,9%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methyiphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxypropyl-β-cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in dem molaren Verhältnis von 1:1 erhalten.
Die differenziell abtastende Kalorimetrie und ein NMR-Spektrum zeigten die gleichen Ergebnisse wie in dem Verfahren zur Herstellung des Einschlusskomplexes in dem methanolischen Medium.
BEISPIEL 5
Herstellung eines Einschlusskomplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxyethyl-β-cyclodextrin
a) Verfahren in methanolischem Medium
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g; 1,0 mmol) wurde zu einer Lösung aus Hydroxyethyl-β-cyclodextrin (1,44 g; 1,0 mmol) in Methanol (10 ml) hinzu gegeben und die erhaltene Lösung wurde für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Methanol wurde dann verdampft und der erhaltene Komplex wurde in vacuo bei der Temperatur von 40°C getrocknet. Der Einschlusskomplex (1,87 g; 93,1%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit Hydroxyethyl-β-cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in einem molaren Verhältnis von 1:1 erhalten.
Differenziell abtastende Kalorimetrie und ein NMR-Spektrum zeigten die Bildung eines Einschlusskomplexes.
b) Verfahren in wässrigem Medium
Hydroxyethyl-β-cyclodextrin (1,44 g; 1,0 mmol) wurde in Wasser (40 ml) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf die Temperatur von 70°C erwärmt und L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid (0,568 g; 1,0 mMol) wurde hinzu gegeben, Es wurde intensiv für weitere 15 Minuten gerührt und die Lösung wurde filtriert. Das Filtrat wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und der lyophilisierte Einschlusskomplex (1,89 g, 94,1%) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-iso propylamid mit Hydroxyethyl-β-cyclodextrin wurde in der Form eines weißen Pulvers in dem molaren Verhältnis von 1:1 erhalten.

Differenziell abtastende Kalorimetrie und ein NMR-Spektrum zeigten die Bildung eines Einschlusskomplexes. Tabelle 1 Reaktionsausbeute; Gehalt an L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid in dem Komplex für die Einschlusskomplexe aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit unterschiedlichen Derivaten von β-Cyclodextrins.

Einschlusskomplex	Reaktionsausbeute (%)	%-Gehalt an, L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid in dem Komplex
β-Cyclodextrin (1:1)	95,1	97,2
β-Cyclodextrin (1:2)	93,7	92,88
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (1:1)	93,4	98,7
Hydroxyethyl-β-cyclodextrin (1:1)	93,1	97,5

BEISPIEL 6
30 Tage dauernde Toxizitätsstudie von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid in Ratten und Rhesusaffe bei subkutaner Verabreichung.
Die in Kochsalzlösung aufgelöste Verbindung L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid wurde täglich subkutan an Gruppen von Ratten (n = 10 männliche und 10 weibliche in jeder Gruppe) und Rhesusaffen (n = 2 männliche und 2 weibliche in jeder Gruppe) ein Mal täglich für 30 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die in den Ratten verwendeten Dosierungsmengen waren 0,0, 7,5, 15,0 und 30,0 mg/kg und in Affen 0,0, 3,75, 7,5 und 15 mg/kg. Die Dosierungsmengen wurden auf der Basis einer Ratten-ED von 3,0 mg/kg und einer Extrapolation daraus für die Affen ausgewählt.
Eine vorsichtige allgemeine Untersuchung der Tiere wurde wenigstens ein Mal jeden Tag durchgeführt. Die Beobachtungen am Käfig umfassten Veränderungen in der Haut und dem Fell, den Augen und den Schleimmembranen, die allgemeine Aktivität und das Verhalten sowie auch allgemeine Anzeichen von abnormalen Funktionen des respiratorischen, zirkulatorischen, autonomen und zentralen Nervensystems und die somatomotorische Aktivität.
Es wurden die Körpergewichte (wöchentlich in Ratten, zu Anfang und am Tag 30 bei Affen), die tägliche Nahrungs-(Ratte und Affen) und Wasser-(nur Ratten) Aufnahme sowie die Parameter der Hämatologie, der Urinanalyse und der Blutbiochemie der Tiere aufgezeichnet. Alle diese Tieren wurden am Ende der 30 Tage geopfert. Eine Nekropsie wurde durchgeführt und eine histophathologische Untersuchung aller wichtigen Organe und Gewebe wurde durchgeführt.
Die Analyse des Urins umfasste das Aufzeichnen der Farbe, der spezifischen Schwerkraftreaktion (pH) und das Testen auf Zucker, Aceton, Urobillinogen, Bilirubin und Albumin und okkultes Blut. Die mikroskopische Untersuchung der Urinsedimente wurde auf die Gegenwart von Epithelzellen, WBZs (weisse Blutzellen), RBZs (rote Blutzellen), Abdrücke, Kristalle und andere abnormalen Konstituenten hin durchgeführt.
Die hämatologischen Untersuchungen umfassten das Hämoglobin, die T-RBZ-Zahl der mittleren korpuskulären Hämoglobinkonzentration, das mittlere korpuskuläre Volumen, die Gesamtleukozytenzahlen, das mittlere korpuskuläre Volumen gepackter Zellen, die Plättchenzahl, die differenziellen Leukozytenzahlen, die Sedimentationsgeschwindigkeit der Erythrozyten (nur Affen) und den Zeittest für Prothrombin (nur Affen).
Die biochemischen Untersuchungen im Blut am Tag 30 in Ratten und den Tagen 0 und 30 in Affen umfassten Glucose, Creatinin, Harnstoff-Stickstoff, Natrium, Kalium SGPT (ALT), alkalische Phosphatase (ALP), Bilirubin, Cholesterin, Gesamtserumprotein, Albumin und Globulin.
Während der der Untersuchung auf Nekropsie der äußeren Oberfläche des Körpers wurden alle Öffnungen und die kranischen, Brust- und abdominalen Kavitäten und deren Inhalte untersucht. Es wurde eine intensive Untersuchung der Größe, Form, Oberfläche, Farbe, Konturen, etc. aller wichtiger Organe und Gewebe durchgeführt. Leber, Nieren, Nebennieren, Hirn, Herz, Lungen, Milz und Hoden wurden gewogen und deren relativen Gewichte wurden auch berechnet.
All die oben genannten Organe und repräsentative Stücke der Haut, der Luftröhre, des Thymus, der unterschiedliche Teile des GIT-Pankreas, der Harnblase, der Brustdrüsen und ganze Augen wurden in 10% gepufferter Formalinlösung konserviert bis sie zur Paraffineinbettung und Schnittdarstellung fertig waren.
Repräsentative Proben aus all den konservierten Organen und Geweben wurden in Paraffin eingebettet. Vier bis sechs Mikrometer dicke Schnitte wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gemäß Standardverfahren zur mikroskopischen Untersuchung gefärbt.
Die Tiere blieben während des Zeitraumes des Experiments aktiv und gesund. Tiere sowohl der mit Medikamenten behandelten wie auch der Kontrollgruppen zeigten einheitliche (Ratten) oder unregelmäßige (Affen) Trends zur Zunahme an Körpergewicht. Die Laboruntersuchungen zeigten einige kleinere zufällige Variationen, aber es gab keinerlei Indikation, dass das Medikament Schäden in den verschiedenen Werten der Urinanalysen, hämatologischen sowie biochemischen Blutwerte induzierte. Auch die Nekropsie (einschließlich absoluter und relativer Organgewichte) von wichtigen Organen sowie histopathologische Untersuchungen zeigten keine Anzeichen von Zielorgantoxizität.
Die Verbindung L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid wurde als in Ratten und Rhesusaffen in der 30 Tage dauernden Toxizitätsstudie bei subkutaner Verabreichung bei der genannten Dosierungsmenge als sicher befunden.
BEISPIEL 7
Verringerung von Schmerz:
Die Analgesie wurde durch den Schwanzbewegungslatenzzeit-(t.f.l., tail flick latencies)-Assay in Ratten (D'Amour, F.E. und Smith, D.L., J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79, 1941) gemessen. Der Test setzt die Bestimmung der Latenzzeiten von Schwanzbewegungen bei Hitzestimulation voraus. Die Latenzzeiten der basalen Schwanzbewegung wurden zwei Mal in 10 minütigen Intervallen bestimmt und der Druchschnitt gebildet, um eine einzelne Latenzzeit vor der Medikamentengabe zu bestimmen. Eine Erhöhung in der Latenzzeit um 100% oder mehr zeigte einen analgetischen Zustand des Tieres an. Eine Abbruchzeit von 10 Sekunden wurde verwendet, um einen Schaden der Schwanzhaut zu vermeiden.

Die Testverbindungen wurden (subkutan oder peroral) in abgestuften Dosierungsgruppen von 8-10 Ratten pro Gruppe verabreicht. Die Latenzzeit der Schwanzbewegung wurde alle 10 Minuten bestimmt, bis sie fast auf dem Zustand vor dem Medikament war. Der Prozentanteil der Tiere, die eine Analgesie aufzeigten, wurde für jede Dosierungsmenge der verschiedenen Verbindungen bestimmt sowie die ED₅₀ zusammen mit 95%igen Vertrauenswerten [Tabelle 2] durch die „Prohibit"-Analyse (Finney, 1971) berechnet. Die Dauer der analgetischen Wirkung wurde als „Pest"-Wirkung bestimmt. Die Analgesie dauerte 5 bis 6 Stunden nach oraler Verabreichung. Tabelle 2

Verbindung/Formulierung	ED₅₀ (mg/kg)
	s.c. Verabreichung	p.o. Verabreichung
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid	2,58	22,30
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid: β-CD-Komplex (1:2)	4,45 (äquivalent zu 0,89 mg der Verbindung)	54,23 (äquivalent zu 10,84 mg der Verbindung)

Es ist aus der oben gezeigten Tabelle offensichtlich, dass die ED₅₀ des β-CD-Komplexes ungefähr ein Drittel von der der Verbindung L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid durch subkutane Verabreichung ausmacht und nur die Hälfte der Wirkung durch die orale Verabreichung war. Die LD₅₀ der Verbindung L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid beträgt 1000 mg/kg i.p. und die des Komplexes beträgt > 10000 mg/kg P.O. in Mäusen.
BEISPIEL 8
Entzündungshemmende Wirkung

Die entzündungshemmende Wirkung wurde in vivo durch die Hemmung eines durch Carrageenin ausgelösten Ödems gemessen. Den Ratten wurden 250/500 mg/kg der Testsubstanz 1 Stunde vor der Injektion von 0,1 ml 1% Carrageenin-Suspension gegeben. Die Hemmung des gebildeten Ödems wurde 3 Stunden nach der Injektion des Carrageenins gemessen. [Tabelle 3] Tabelle 3 Messung der entzündungshemmenden Wirkung in vivo bei den Dosierungen 500/250 mg/kg der per oral verabreichten aktiven Substanz.

	Dosierung (p.o.) (mg/kg)	entzündungshemmende Wirkung (210 Min)
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid: β-CD-Komplex (1:2)	250	4,0
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid: β-CD-Komplex (1:2)	500	18,4
L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid	50	19,6

Die Messung der entzündungshemmenden Wirkung in vivo zeigte, dass der Einschlusskomplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin eine entzündungshemmende Wirkung aufzeigte.
BEISPIEL 9
Wirkung auf die Magenschleimhaut
Die Wirkung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und des Einschlusskomplexes aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin auf die Magenschleimhaut wurde in Ratten gemessen. Ratten wurden über Nacht fasten gelassen und ihnen wurde 100 mg/kg der aktiven Substanz oral verabreicht. Nach 4 Stunden wurde deren Wirkung auf die Irritation der Magenschleimhaut und Magengeschwürbildung, das Flüssigkeitsvolumen des Magens und die freie und die gesamte Säure bestimmt. [Tabelle 4]. Tabelle 4 Messung der Wirkung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid: β-Cyclodextrin (1:1) auf die Darmschleimhaut

Dosierung (mg/kg) Geschwür Flüssigkeitsvolumen des Magens Freie Säure Gesamtsäure

100 – –23 +9,0 +10,0
Die oben genannten Daten zeigen, dass L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid bei Einbindung mit β-Cyclodextrin zusammen in den Einschlusskomplex keinerlei irritierende Wirkung auf die Magenschleimhaut der Tiere ausübte.
BEISPIEL 10
Herstellung von Tabletten mit 125 mg aktiver Substanz [Einschlusskomplex) (1:2)] aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin

Es wurden Tabletten mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt: Tabelle 5

Aktiver Inhaltsstoff	Gewicht
Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenyl-alanyl-glycyl-isopropylamid: β-Cyclodextrin-(1:2)	125 mg
Laktose	70 mg
Methylcellulose	5 mg
Magnesiumstearat	2 mg

Herstellung der Tabletten: Die aktive Substanz wurde mit Hilfsmitteln bis zur Homogenität gerührt. Die Mischung wurde durch ein Sieb gesiebt und in Tabletten auf einer rotierenden Tablettierungsmaschine gepresst, und die resultierende Tablette wurde in eine mit Polyethylen ausgekleidete blisterartige Packung verpackt, um das in Kontakt kommen mit Feuchtigkeit vor der Verwendung zu verhindern.
BEISPIEL 11
Herstellung transdermaler Pflaster der aktiven Substanz (Einschlusskomplex (1:1) aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin
Polyvinylalkohol (4 g) und Polyvinylpyrrolidon (2 g) wurden in einem Becherglas aufgenommen und bei 75°C gerührt, 120 ml Ethylalkohol (50% V/V) wurden langsam hinein gegeben, um eine feine Latexlösung zu erhalten. Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin (1:1) (1,8) g wurde genommen und in Propylenglycol (2 ml), PEG 400 (0,5 ml), Polypropylenglycol (2 ml) und Tritan X-100 (1,5 ml) unter Verwendung eines Ultraschallbades hergestellt. Das im vorherigen Schritt hergestellte Polymerlatex wurde darauf unter kontinuierlichem Rühren übertragen und für 15 weitere Minuten gerührt. Das so gebildete Hydrogel wurde einheitlich in eine Petri-Schale gegossen und trocknen gelassen. Am nächsten Tag wurde ein gelb gefärbtes Pflaster erhalten. Dieses wurde mit dem Plastikfilm abgedeckt und auf die gewünschte Größe geschnitten. Die so erhaltenen Pflaster wurden entsprechend in eine mit Polyethylen ausgekleidete blisterartige Packung verpackt, um das in Kontakt kommen mit Feuchtigkeit vor der Verwendung zu vermeiden.

Claims

Einschlusskomplex, umfassend einen Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit einem Cyclodextrin, worin das Molverhältnis zwischen L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und dem Cyclodextrin von 1:5 bis 2:1 beträgt.
Einschluss nach Anspruch 1, worin das cyclodextrin β-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Dimethyl-β-cyclodextrin oder Hydroxyethyl-β-cyclodextrin darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Einschlusskomplexes nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, die zur oralen oder parenteralen Verabreichung formuliert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die orale Form eine Tablette oder Kapsel darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die parenterale Form eine injizierbare Zusammensetzung darstellt oder zur transdermalen oder rektalen Verabreichung vorgesehen ist.
Einschlusskomplex nach Anspruch 1 oder 2 zum Gebrauch als ein Analgetikum.
Verwendung eines Einschlusskomplexes nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer akuten Entzündung und zur Linderung von Schmerzen.
Verwendung nach Anspruch 8, worin der Einschlusskomplex einen Komplex aus L-Tyrosyl-D-alanyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid mit β-Cyclodextrin umfasst und das Arzneimittel zur oralen oder topischen Verabreichung vorgesehen ist.
Verfahren zur Herstellung eines Einschlusskomplexes nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Zufügen von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid zu einer wässrigen Lösung aus dem Cyclodextrin; und Abkühlen des Gemischs von 0°C bis 5°C, wobei der Komplex aus der Lösung ausgefällt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Einschlusskomplexes nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Zufügen von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl isopropylamid, das in Methanol zu einer wässrigen Lösung aus dem Cyclodextrin aufgelöst ist; und Abdampfen der Lösungsmittel.
Einschlusskomplex nach Anspruch 1, umfassend L-Tyrosyl-D-analyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin mit einem Differenzial-Scanning-Kalorimetrie-Thermogramm nach 5, einem NMR-Spektrum nach 6 und einem Massenspektrum nach 7.
Einschlusskomplex nach Anspruch 1, umfassend L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl-isopropylamid und β-Cyclodextrin mit einem Differenzial-Scanning-Kalorimetrie-Thermogramm nach 8 und einem NMR-Spektrum nach 9.
Einschlusskomplex nach Anspruch 1, umfassend L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N-methylphenylalanyl-glycyl isopropylamid und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit einem Differenzial-Scanning-Kalorimetrie-Thermogramm nach 10 und einem NMR-Spektrum nach 11.