ES2275561T3 - Neuropeptidos estabilizados por polimeros. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado polímero-péptido sustancialmente hidrófilo que comprende un péptido covalentemente unido a polietilenglicol o a un copolímero de polietilenglicol y polipropilenglicol que tiene un peso molecular promedio nominal de desde 200 daltons hasta 40.000 daltons, en el que dicho péptido se selecciona del grupo constituido por bifalina y [D-Pen2, D-Pen5] encefalina (DPDPE).
Description
Neuropéptidos estabilizados por polímeros.
La invención se refiere a un conjugado entre un
péptido y polietilenglicol o un polímero sustancialmente sustituible
y a un procedimiento para el uso del mismo.
Durante la última década ha habido progresos
significativos en el descubrimiento y desarrollo de potenciales
agentes neurofarmacéuticos (moléculas pequeñas, péptidos, proteínas
y antisentido) para el tratamiento del dolor y de afecciones
cerebrales tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de
Parkinson. Sin embargo, la administración sistémica de muchos
agentes neurofarmacéuticos nuevos se vio obstaculizada por la falta
de un sistema eficaz para administrarlos. La administración
intravenosa es frecuentemente ineficaz debido al transporte
inadecuado a través de la barrera entre el cerebro y el suministro
de sangre ("barrera hematoencefálica" o "BHE"). La
barrera hematoencefálica es una barrera física continua que separa
el sistema nervioso central, es decir el tejido cerebral, de la
circulación general de un animal. La barrera comprende células
endoteliales microvasculares que están unidas una con otra por
medio de complejas uniones intracelulares firmes. La barrera
permite un intercambio selectivo de moléculas entre el cerebro y la
sangre y previene la entrada de muchos fármacos y péptidos
hidrófilos al cerebro. Muchos de los nuevos agentes
neurofarmacéuticos no cruzan la BHE porque tienen un peso molecular
por encima de 500 daltons y son hidrófilos. Los compuestos que no
son lipófilos y que tienen un peso molecular superior a 500 daltons
generalmente no cruzan la BHE.
Se han desarrollado varias estrategias para
administrar fármacos no lipófilos, con peso molecular alto al
cerebro, incluyendo la infusión intracerebroventricular, el
transplante de células modificadas genéticamente que secretan el
compuesto neuroactivo y la implantación de una matriz polimérica que
contiene el agente farmacéutico. Ver Pardridge, W. M., J.
Controlled Rel., (1996) 39:281-286. Sin embargo,
todas éstas incluyen procedimientos quirúrgicos invasivos que
pueden ocasionar una diversidad de complicaciones.
Se han identificado cuatro mecanismos de
transporte no quirúrgicos para cruzar la BHE, incluyendo: (i)
difusión transmembrana, (ii) transporte mediado por receptores,
(iii) endocitosis mediada por absorción y (iv) transporte mediado
por vehículos. Ver Brownless y col., J. Neurochemistry, (1993)
60(3):793-803. La permeabilidad vascular
puede aumentarse abriendo las firmes uniones con soluciones
hiperosmóticas de sacáridos y análogos de bradiquinina. Un problema
inherente en este procedimiento es la posibilidad de que compuestos
indeseables entren al cerebro a través de las aberturas
artificialmente dilatadas en la barrera hematoencefálica.
Se ha descubierto que las células endoteliales
capilares en la barrera hematoencefálica tienen un alto nivel de
receptores para transferrina, insulina, factor de crecimiento
similar a la insulina I y II, lipoproteína de baja densidad y
factor natriurético atrial. Ver Friden, P.M., J. Controlled Rel.,
(1996) 46:117-128. La Patente de EEUU Nº 5.833.988
de Friden describe un procedimiento para administrar un agente
neurofarmacéutico o de diagnóstico a través de la barrera
hematoencefálica usando un anticuerpo contra el receptor de
transferrina. Se conjuga un factor de crecimiento neural o un
factor neurotrófico a un anticuerpo específico para el receptor de
transferrina. Se administra el conjugado resultante a un animal y es
capaz de atravesar la barrera hematoencefálica hacia el cerebro del
animal.
La Patente de EEUU Nº 4.902.505 de Pardridge y
col. describe el uso de péptidos quiméricos para la administración
de neuropéptidos a través de la barrera hematoencefálica. Se usa un
péptido específico para el receptor para transportar un péptido
neuroactivo hidrófilo a través de la BHE. Las proteínas vehículo
descritas, que son capaces de cruzar la BHE por transcitosis
mediada por receptores, incluyen histona, insulina, transferrina,
factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I),
factor de crecimiento similar a insulina II
(IGF-II), albúmina básica y prolactina. La Patente
de EEUU Nº 5.442.043 de Fukuta y col. describe el uso de un
fragmento de insulina como un vehículo en un péptido quimérico para
transportar un neuropéptido a través de la barrera
hematoencefálica.
Los enfoques no invasivos para administrar
agentes neurofarmacéuticos a través de la BHE son típicamente
menos eficaces que los procedimientos invasivos para llevar el
agente realmente dentro del cerebro. Para alcanzar el efecto
terapéutico deseado son necesarias altas dosis de péptidos
quiméricos porque son propensos a la degradación. La concentración
de los péptidos quiméricos en la circulación sanguínea puede
disminuir rápidamente por proteolisis. Un sistema acuoso de
administración generalmente no es eficaz para administrar fármacos
hidrófobos.
En Pharm. Res. (1998)
15(4):576-582, Pardridge y col. describen
otro procedimiento para administrar compuestos hidrófilos dentro
del cerebro por transcitosis mediada por receptores. Se usa un
anticuerpo monoclonal para el receptor de transferrina (OX26 MAb)
modificado con estreptavidina para transportar la proteína
catiónica, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) a través
de la BHE. Primero se modifica el BDNF con
biotina-PEG^{2000} para formar
BDNF-biotina-PEG^{2000}, que
posteriormente se une al anticuerpo modificado con estreptavidina
OX26 MAb. El conjugado resultante demostró ser capaz de atravesar la
BHE hacia el cerebro.
\newpage
Mejorar la duración de los efectos
anticonceptivos en los animales puede dar como resultado una menor
frecuencia de administración de analgésicos, que puede mejorar la
conformidad del paciente y reducir los potenciales efectos
colaterales. Maeda y col. en Chem. Pharm. Bull. (1993)
41(11): 2053-2054, Biol. Pharm Bull. (1994)
17(6):823-825, y Chem. Pharm. Bull. (1994)
42(9):1859-1863 demostraron que uniendo
polietilenglicolamina 4000 a la leucina del extremo
C-terminal de Leu-encefalina
(alejada del residuo tirosina necesario para la antinocicepción),
puede incrementarse la potencia y duración de
Leu-encefalina cuando se administra directamente al
cerebro por inyección intracerebroventricular.
Existe una necesidad en la técnica para
administrar agentes neuroactivos desde la circulación sistémica a
través de la barrera hematoencefálica y dentro del cerebro que
reduzca o elimine algunos de los inconvenientes y desventajas
asociados con la técnica anterior.
En el documento WO-A1 9500162 se
describen conjugados de péptidos con polímeros no antigénicos en
sitios predeterminados. La Patente de EEUU Nº 5.932.462 describe
polímeros monofuncionales multiarmados, hidrolíticamente estables
para unir a moléculas biológicamente activas tales como proteínas.
En la Patente de EEUU Nº 5.681.811 se describen otros conjugados,
sin embargo éstos tienen un fragmento lipófilo como parte
fundamental.
Esta invención provee un procedimiento para
administrar un péptido dentro del cerebro de un ser humano y otro
animal a través de la barrera hematoencefálica. El péptido a
administrar está unido a un polímero no peptídico, soluble en agua
para formar un conjugado. Posteriormente se administra el conjugado
a un animal dentro de la circulación sanguínea de manera que el
conjugado pase a través de la barrera hematoencefálica y entre en
el cerebro. El polímero no peptídico soluble en agua puede
seleccionarse del grupo constituido por polietilenglicol y
copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol activados para
conjugación por medio de unión covalente al péptido.
En una forma de realización de esta invención,
se provee un conjugado sustancialmente hidrófilo que tiene un
péptido analgésico transportable, es decir un péptido analgésico
capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, unido
covalentemente a un polímero no peptídico, soluble en agua tal como
polietilenglicol. El conjugado es capaz de atravesar la barrera
hematoencefálica de un animal.
Los péptidos transportables adecuados para uso
en esta forma de realización de la invención incluyen dinorfinas,
encefalinas, endorfinas, endomorfinas y bifalina. Típicamente, estos
pequeños neuropéptidos son susceptibles de degradación dentro del
cuerpo dentro de la circulación sanguínea y en el cerebro. En
contraste, cuando están conjugados con polietilenglicol o a otro
polímero no peptídico, no inmunogénico, soluble en agua con
propiedades similares, estos péptidos exhiben una estabilidad
significativamente aumentada.
En otra forma de realización de esta invención,
se provee una composición que comprende un conjugado de esta
invención como se describió anteriormente y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. La composición puede administrarse
directamente en la circulación general de un animal por cualquier
medio adecuado, por ej. inyección parenteral, inyección en vena
intracerebral y por administración intranasal, pulmonar, ocular y
bucal.
De acuerdo con aún otra forma de realización de
esta invención, se provee un procedimiento para administrar un
péptido analgésico a través de la barrera hematoencefálica dentro
del cerebro de un animal. El procedimiento comprende proveer un
conjugado de esta invención como se describió anteriormente y
administrar el conjugado en el torrente sanguíneo del animal
huésped.
Se ha considerado previamente que los grandes
polímeros hidrófilos tal como el polietilenglicol, cuando están
unidos a un péptido que es capaz de cruzar la barrera
hematoencefálica, podrían interferir con el transporte del péptido
a través de la barrera hematoencefálica. En particular, se ha creído
que la conjugación directa de grandes polímeros hidrófilos con un
péptido no sólo aumentaría la hidrofilia sino que también afectaría
a la interacción entre el péptido y su receptor u otras estructuras
en la BHE por interferencia estérica a partir de las grandes ramas
del polímero.
Actualmente se descubrió que, aunque el
conjugado es sustancialmente hidrófilo y contiene un polímero no
peptídico soluble en agua, el conjugado es sin embargo capaz de
atravesar la barrera hematoencefálica de un animal. Comparados con
su estado nativo, los péptidos conjugados con un polímero no
peptídico soluble en agua pueden exhibir inmunogenicidad reducida,
solubilidad en agua y estabilidad incrementadas. En particular, los
péptidos conjugados con polietilenglicol de acuerdo con esta
invención tienen un tiempo de circulación mayor, una susceptibilidad
a la degradación metabólica y una depuración disminuidas y una vez
administrados dentro del cerebro a través de la barrera
hematoencefálica, exhiben vida útil aumentada en el cerebro. Por
ello, esta invención permite la administración eficaz de péptidos
analgésicos en cerebros de seres humanos y otros animales y puede
mejorar significativamente la eficacia de los péptidos
administrados.
Como se usa en este documento, "atravesar la
barrera hematoencefálica" o "cruzar la barrera
hematoencefálica" significa que, una vez administrado en la
circulación sanguínea de un animal en una dosis fisiológicamente
aceptable, un conjugado o un péptido es capaz de tasar la barrera
hematoencefálica del animal en un grado tal que se administra una
cantidad suficiente del conjugado o péptido dentro del cerebro del
animal para ejercer su efecto terapéutico, anticonceptivos o
profiláctico en el cerebro, o para afectar el funcionamiento
biológico del cerebro hasta un grado detectable. "Atravesar la
barrera hematoencefálica" o "cruzar la barrera
hematoencefálica" puede también usarse en este documento para
significar que el conjugado o péptido es capaz de ser captado por
el cerebro de un animal en un grado que es detectable por un
procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ej. la perfusión
cerebral in situ como describen Williams y col. en J.
Neurochem., 66 (3), págs.1289-1299, 1996, que se
incorpora en este documento por referencia.
El conjugado de esta invención es normalmente
sustancialmente hidrófilo. Por el término "sustancialmente
hidrófilo", se pretende significar que el conjugado de esta
invención no contiene un fragmento sustancialmente lipófilo tales
como ácidos grasos o glicolípidos. Los ácidos grasos y glicolípidos
se usan en la técnica para aumentar la lipofilicidad de una
molécula con el fin de aumentar la capacidad de una molécula para
atravesar membranas celulares.
El término "analgésico" como se usa en este
documento significa cualquier sustancia química deseable, para
administrar en el cerebro de seres humanos u otros animales con el
objeto de aliviar, mitigar o prevenir el dolor en seres humanos u
otros animales, o de otra manera mejorar el buen estado físico o
mental de seres humanos o animales. Pueden introducirse péptidos
analgésicos en el cerebro de un animal para ejercer un efecto
terapéutico, anticonceptivo o profiláctico en las funciones
biológicas del cerebro del animal y pueden usarse para tratar o
prevenir el dolor.
Pueden unirse agentes no considerados
típicamente "analgésicos" al conjugado péptido/polímero de la
invención. Por ejemplo, pueden unirse al conjugado agentes para
diagnóstico o para imágenes. Pueden usarse en el conjugado de esta
invención fluoresceína, proteínas y otros tipos de agentes
específicamente dirigidos a un tipo particular de célula o
proteína, tales como anticuerpos monoclonales, para fines
diagnósticos o de obtención de imágenes.
Como se describió anteriormente, cuando un
agente no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, es
decir, es no transportable a través de la BHE, se usará típicamente
como un vehículo un péptido que es capaz de atravesar la barrera
hematoencefálica, es decir, que es transportable a través de la BHE,
en un conjugado de esta invención.
En una forma de realización de esta invención,
el péptido es un péptido analgésico transportable. Como se usa en
este documento, el término "transportable" significa que el
péptido es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica de un animal
como se definió anteriormente. Por ello, se provee un conjugado que
comprende un péptido transportable unido a un polímero no
peptídico, no inmunogénico, soluble en agua, incluyendo
polietilenglicol.
El término "péptido" significa cualquier
secuencia de de \alpha aminoácidos polimerizada constituida por
desde 2 hasta 40 aminoácidos con un enlace peptídico
(-CO-NH-) entre cada aminoácido que puede tener
efecto en la afección y función biológica del cerebro de un
animal. Un péptido analgésico normalmente es un péptido endógeno
que se presenta naturalmente en un animal, o fragmentos o análogos
del mismo. Sin embargo, se incluyen también péptidos no endógenos
que pueden tener efecto sobre las afecciones y funciones biológicas
del cerebro del animal.
En la técnica se conocen generalmente muchos
péptidos que se cree son capaces de atravesar la barrera
hematoencefálica. Los ejemplos de péptidos transportables capaces
de cruzar la barrera hematoencefálica tras la PEGilación de acuerdo
con la invención incluyen, pero no se limitan a, bifalina y péptidos
opioides tales como dinorfinas, encefalinas, endorfinas,
endomorfinas, etc.. En la práctica de la invención pueden usarse
también muchos derivados y análogos de estos péptidos
transportables.
Se cree que los péptidos opioides son
especialmente adecuados para la práctica de la invención. Los
péptidos opioides exhiben una diversidad de actividades
farmacológicas, incluyendo entre ellas el alivio del dolor y la
analgesia.
La encefalina es un pentapéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH
(metionina encefalina) o
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH
(leucina encefalina). Se han identificado y sintetizado muchos
análogos de encefalina que son específicos para diferentes tipos de
receptores opiáceos. Ver, por ej., Hruby y Gehrig, (1989) Medicinal
Research Reviews, 9(3):343-401, Por ejemplo,
la Patente de EEUU Nº 4.518.711 describe varios análogos de
encefalina incluyendo DPDPE, [D-Pen^{2},
D-Pen^{5}] encefalina, que es un análogo cíclico
de encefalina generado sustituyendo el segundo y el quinto residuos
aminoácidos de los pentapéptidos naturales con cisteína o con D- o
L-penicilamina (beta,
beta-dimetilcisteína) y uniendo las dos posiciones
por medio de un enlace disulfuro. DPDPE ha demostrado ser capaz de
atravesar la barrera hematoencefálica hacia el cerebro. Ver por
ej., Williams y col. (1996) Journal of Neurochemistry,
66(3):1289-1299. La Patente de EEUU Nº
5.326.751 describe el DPADPE preparado sustituyendo el residuo
glicina en la posición tercera de DPDPE con un residuo alanina.
Otros análogos de encefalina incluyen bifalina
(H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-)_{2},
que es un análogo sintético de encefalina que es un tetrámero
dimerizado producido por acoplamiento de dos unidades que tienen la
fórmula
H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OH
en el extremo C-terminal con hidrazina. La forma
dimérica de encefalina mejora la afinidad y especificidad para el
receptor delta opioide. Los análogos diméricos de encefalina son
descritos por Rodbard y col. en la Patente de EEUU Nº
4.468.383,
Las dinorfinas son otra clase de péptidos
opioides. La dinorfina aislada naturalmente tiene 17 aminoácidos.
Se han propuesto en la técnica muchos fragmentos y análogos de
dinorfina, incluyendo por ej., dinorfina (1-10),
dinorfina (1-13), dinorfina (1-13)
amida, [D-Pro^{10}] Dinorfina
(1-11) (DPDYN), análogos de dinorfina amida, etc.
Ver por ej., las Patentes de EEUU 4.684.624 y 5.017.689, Aunque
tales péptidos analgésicos son capaces de transportarse a través de
la barrera hematoencefálica, muchos de ellos tienen una semivida muy
corta debido a su susceptibilidad para la biodegradación dentro del
cuerpo.
Aunque el polietilenglicol normalmente tiene un
peso molecular alto y es hidrófilo, la conjugación con los péptidos
transportables en ausencia de un fragmento lipófilo no interfiere
con la transportabilidad de los péptidos. Los péptidos conjugados
se mantienen con capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica.
Típicamente, tras la administración dentro de la circulación
general de un animal, el conjugado de la invención, que comprende
un péptido transportable unido a polietilenglicol o un polímero
equivalente, es captado por el cerebro en un porcentaje mucho mayor
en comparación con una forma no conjugada del péptido. Los péptidos
en los conjugados de esta invención tienen mayor estabilidad y
exhiben semivida prolongada dentro del cuerpo.
En otra forma de realización de esta invención,
se provee un conjugado que comprende un primer péptido, que es un
péptido transportable, y un segundo agente neuroactivo unidos uno al
otro por medio de polietilenglicol o un polímero equivalente. Este
segundo agente neuroactivo puede o no ser capaz de cruzar la barrera
hematoencefálica por sí mismo. El péptido transportable se usa como
un vehículo para transportar un agente neuroactivo no transportable
a través de la barrera hematoencefálica hacia el cerebro de un
animal. El polímero de unión sirve no sólo como un enlace sino que
también aumenta la solubilidad y estabilidad del conjugado y reduce
la inmunogenicidad del neuropéptido y del agente neuroactivo a
administrar.
De acuerdo con la invención, el péptido
transportable y, opcionalmente, otro agente neuroactivo como se
describió anteriormente, están unidos de manera covalente a un
polímero no peptídico soluble en agua para formar un conjugado de
esta invención. Los polímeros no peptídicos solubles en agua para
uso en diversos aspectos de esta invención incluyen
polietilenglicol, otros polialquilenglicoles y copolímeros de
polietilenglicol y polipropilenglicol.
Como se usa en este documento, el término
polietilenglicol ("PEG") está incluido y significa cualquiera
de una serie de polímeros con fórmula general:
HO-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
en los que n varía desde
aproximadamente 10 hasta 2.000, PEG también se refiere a la unidad
estructural:
-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-
en la que n varía desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2.000, Por ello, por PEG se
entiende PEGs modificados incluyendo metoxi-PEGs;
PEGs con al menos un fragmento terminal diferente de un grupo
hidroxilo que es reactivo con otro fragmento; PEGs ramificados;
PEGs pendientes, PEGs bifurcados y
similares.
El polietilenglicol útil en la práctica de esta
invención normalmente tiene un peso molecular promedio de desde
aproximadamente 200 hasta 100.000 daltons. Los pesos moleculares de
desde aproximadamente 200 hasta 10.000 son un tanto más comúnmente
usados. Los pesos moleculares de desde 300 hasta 8.000 y en
particular desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 5.000
daltons son un tanto típicos.
PEG es útil en aplicaciones biológicas porque
tiene propiedades que son muy deseables y está generalmente
aprobado para aplicaciones biológicas o biotécnicas. PEG es
típicamente claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable al
calor, inerte para muchos agentes químicos, no hidroliza ni se
deteriora y es generalmente no tóxico. Se considera que el
poli(etilenglicol) es biocompatible, lo que es igual a decir
que PEG es capaz de coexistir con tejidos vivos u organismos son
causar daño. Más específicamente, PEG, es por sí mismo normalmente
considerado no inmunogénico, lo que es igual a decir que PEG no
tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Los grupos
activadores terminales deseables por los que PEG puede unirse a
diversos péptidos no deberían alterar el carácter no inmunogénico
del PEG, de manera de evitar efectos inmunogénicos. Los conjugados
de PEG deseables no tienden a producir una respuesta inmune
sustancial ni causan coagulación u otros efectos indeseables.
PEG es un polímero al azar en rollo altamente
hidratado que puede proteger a las proteínas o péptidos de la
digestión enzimática, moléculas y células del sistema inmune y puede
aumentar el volumen hidrodinámico para demorar la depuración del
sistema retículo endotelial (RES). PEG es un polímero útil que tiene
las propiedades de solubilidad en agua así como también solubilidad
en muchos solventes orgánicos. Las propiedades de solubilidad
únicas del PEG permiten la conjugación (PEGilación) con ciertos
compuestos con baja solubilidad en agua, con el conjugado
resultante siendo soluble en agua. Sin embargo, la PEGilación, que
es conjugar una molécula de PEG con otra molécula, tiene sus
dificultades. Los efectos de un derivado de PEG en particular no son
necesariamente previsibles. Los resultados dependen de la
interacción específica entre un compuesto particular y el polímero
PEG no peptídico funcional.
El polímero usado en esta invención normalmente
puede ser lineal o ramificado. Los esqueletos de polímeros
ramificados son generalmente conocidos en la técnica. Típicamente,
un polímero ramificado tiene un fragmento nuclear central y una
pluralidad de cadenas de polímeros lineales unidas al núcleo
central. Se usa PEG comúnmente en formas ramificadas que pueden
prepararse por agregado de óxido de etileno a diversos polioles,
tales como glicerol, pentaeritrol y sorbitol. Por ejemplo, el PEG
ramificado, de cuatro brazos preparado a partir de pentaeritritol
se muestra a continuación:
C(CH_{2} -
OH)_{4}+n \ C_{2}H_{4}O \rightarrow C[CH_{2}O -
(CH_{2}CH_{2}O)_{n} - CH_{2}CH_{2} -
OH]_{4}
El fragmento central puede derivar también de
diversos aminoácidos. Un ejemplo es la lisina.
Los polietilenglicoles ramificados pueden
representarse en forma general como
R(-PEG-OH)_{n} donde R representa el
fragmento central, tal como glicerol o pentaeritritol y n representa
el número de brazos. Pueden prepararse PEGs ramificados adecuados
de acuerdo con la Patente de EEUU Nº 5.932.462, Estos PEGs
ramificados pueden usarse de acuerdo con las enseñanzas de este
documento.
Los PEGs bifurcados y polímeros relacionados
deberían ser útiles en la práctica de la invención. El término
"ramificado" se usa para describir aquellos PEGs que están
ramificados en posición adyacente al menos a un extremo terminal
del mismo. El polímero tiene un fragmento ramificado en un extremo
de la cadena del polímero y dos grupos reactivos, uno en cada
extremo del fragmento ramificado, para unión covalente a otra
molécula. Cada fragmento reactivo tiene un grupo conector,
incluyendo, por ejemplo una cadena de alquilo, que une un grupo
reactivo al fragmento ramificado. Por ello, el extremo terminal
ramificado permite al polímero reaccionar con dos moléculas para
formar conjugados. Los PEGs bifurcados y los polímeros bifurcados
relacionados se describen en la solicitud de patente de EEUU en
tramitación Ser. Nº 09/265,989, que fue presentada el 11 de Marzo de
1999 y se titula Poly(ethylene glycol) Derivatives with
Proximal Reactive Groups. Los PEGs bifurcados pueden ser lineales o
ramificados en el esqueleto unido al extremo terminal
ramificado.
Los polímeros no peptídicos, sustancialmente no
inmunogénicos, solubles en agua diferentes de PEG deberían ser
también adecuados para la práctica de la invención, aunque no
necesariamente con resultados equivalentes. Estos otros polímeros
pueden estar en forma lineal o ramificada e incluyen, pero no se
limitan a, otros poli(alquilenóxidos), incluyendo
copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares. En la
Patente de EEUU Nº 5.990.237 se presenta una lista de ejemplos de
polímeros. Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros
aleatorios o de bloque y terpolímeros basados en los monómeros de
los polímeros anteriores, de cadena lineal o ramificada.
Los ejemplos específicos de polímeros
adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a,
poli(acriloilmorfolina) ("PAcM") y
poli(vinilpirrolidona) ("PVP"), y
poli(oxazolina). PVP y poli(oxazolina) son bien
conocidos en la técnica y su preparación debería resultar
fácilmente evidente para los expertos en la técnica. En las Patentes
de EEUU Nº 5.629.384 y 5.631.322 se describen el PAcM y su síntesis
y uso.
Para acoplar PEG a un péptido, por ej., un
péptido transportable, para formar un conjugado de esta invención,
es frecuentemente necesario "activar" el PEG para preparar un
derivado de PEG con un grupo reactivo en el extremo terminal para
reaccionar con cierto fragmento en el péptido. Muchos derivados
activados de PEF se describieron en la técnica y todos pueden
usarse en esta invención, aunque no necesariamente con resultados
equivalentes. Un ejemplo de tales derivados activados es el "éster
activado" de succinimidil succinato:
CH_{3}O -
PEG-O_{2}C - CH_{2}CH_{2} - CO_{2} -
NS
donde NS =
1
El éster activo de succinidimilo es un compuesto
útil porque reacciona rápidamente con grupos amino en proteínas y
otras moléculas para formar un enlace amida
(-CO-NH-). Por ejemplo, la Patente de EEUU Nº
4,179,337 de Davis y col. describe el acoplamiento de este derivado
a proteínas (representado como PRO-NH_{2}):
mPEG -
O_{2}CCH_{2}CH_{2}CO_{2}NS + PRO - NH_{2} \rightarrow mPEG - O_{2}C
- CH_{2} CH_{2} - CONH -
PRO
Otras moléculas PEG activadas conocidas en la
técnica incluyen PEGs con un fragmento cloruro cianúrico reactivo,
succinimidilcarbonatos de PEG, fenilcarbonatos de PEF, derivados
imidazolil formato de PEG, PEG carboximetil azida, PEG
imidoésteres, PEG vinilsulfona, derivados etilsulfona activos de
PEF, tresilatos de PEG, PEG fenilglioxal, PEGs activados con un
grupo aldehído, PEG maleimidas, PEGs con un fragmento amino terminal
y otros. Estos derivados de polietilenglicol y los procedimientos
para conjugar tales derivados con un agente son generalmente
conocidos en la técnica y están descritos en Zalipsky y col., Use of
Functionalized Poly(Ethylene Glycol)s for
Modification of Polypeptides, en Use of Polyethylene Glycol
Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris,
Ed., Plenum Press, New York (1992), y en Zalipsky, Advanced Drug
Reviews (1995) 16:157-182,
Típicamente, la conjugación de un polímero no
inmunogénico, soluble en agua con un péptido de acuerdo con esta
invención da como resultado la formación de un enlace entre el
polímero y el péptido. El término "enlace" se usa en este
documento para referirse a grupos o uniones normalmente formadas
como resultado de una reacción química.
Los enlaces covalentes formados en la práctica
de esta invención pueden ser hidrolíticamente estables. El enlace
puede ser sustancialmente estable en agua y no reaccionar en agua a
un pH útil, bajo condiciones fisiológicas, durante un período de
tiempo prolongado, de preferencia indefinidamente. Alternativamente,
el enlace covalente puede también ser hidrolíticamente degradable
bajo condiciones fisiológicas de manera que el agente neuroactivo
puede liberarse del PEG en el cuerpo de un animal, de preferencia
tras su administración dentro del cerebro del animal.
El enfoque en el que los fármacos a administrar
se liberan por degradación de agentes más complejos bajo condiciones
fisiológicas es un potente componente de la administración de
fármacos. Ver R. B. Greenwald, Exp. Opin. Ther. Patents,
7(6):601-609 (1997). Por ejemplo, pueden
formarse conjugados de la invención uniendo PEG a péptidos
transportables y/o agentes neuroactivos usando enlaces que son
degradables bajo condiciones fisiológicas. La semivida de un
conjugado de PEG-agente neuroactivo in vivo
depende del tipo de grupo reactivo de la molécula de PEG que une el
PEG con el agente neuroactivo. Típicamente, los enlaces éster,
formados por reacción de PEG ácidos carboxílicos o PEG activado
ácidos carboxílicos con grupos alcohol en agentes neuroactivos,
hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente
neuroactivo. Ver, por ej., S. Zalipsky, Advanced Drug Delivery
Reviews, 16:157-182 (1995). Por ejemplo, en la
Publicación PCT Nº WO 96/23794, se describe que paclitaxel puede
unirse a PEG usando enlaces éster y el paclitaxel unido puede
liberarse en suero por hidrólisis. También se demostró la actividad
antimalaria de dihidroartemisinina unida a PEG a través de un enlace
éster hidrolizable. Ver Bentley y col., Polymer Preprints,
38(1):584 (1997). Otros ejemplos adecuados de enlaces
hidrolíticamente inestables incluyen ésteres de carboxilato,
ésteres de fosfato, disulfuros, acetales, iminas, ortoésteres,
péptidos y oligonucleótidos.
Típicamente, la tasa de degradación del
conjugado debería controlarse de manera que no se produzca
degradación sustancial hasta que el conjugado pasa dentro del
cerebro del animal. Muchos péptidos en su estado nativo son objeto
de degradación sustancial en la circulación sanguínea y en órganos
tales como el hígado y el riñón. Los enlaces hidrolíticamente
degradables pueden formarse de manera tal que la semivida del
conjugado sea mayor que el tiempo necesario para que la circulación
del conjugado en el torrente sanguíneo alcance la barrera
hematoencefálica. Puede necesitarse algún pequeño grado de
experimentación para determinar el enlace hidrolíticamente
inestable adecuado entre los agentes neuroactivos específicos y los
derivados de PEG, lo que se encuentra dentro de la capacidad de un
experto en la técnica una vez informado de la presente
invención.
Puede formarse el enlace covalente entre un
péptido y un polímero haciendo reaccionar un derivado del polímero
tal como un PEG activado con un fragmento activo en el péptido.
Pueden estar unidas una o más moléculas de PEG a un péptido.
A la inversa, péptidos múltiples, incluyendo
péptidos transportables y/u otros tipos de agentes neuroactivos,
pueden estar unidos a una molécula de PEG. Típicamente, tal molécula
de PEG tiene múltiples fragmentos reactivos para reaccionar con el
péptido y agentes neuroactivos. Por esta razón, pueden usarse PEGs
bifuncionales, PEGs pendientes y PEGs dendríticos. Se han
sintetizado también PEGs reactivos en los que diversos grupos
funcionales activos están localizados a lo largo del esqueleto del
polímero. Por ejemplo, en la técnica se prepararon conjugados de
lisina-PEG en los que un número de grupos activados
están localizados a lo largo del esqueleto del polímero. Zalipsky y
col., Bioconjugate Chemistry, (1993) 4:54-62,
En una forma de realización de esta invención,
se provee un conjugado que tiene una estructura de pesa en el que
un péptido transportable u otro agente neuroactivo transportable
capaces de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal está
unido al otro extremo de la molécula de PEG. Este otro agente
neuroactivo puede ser un péptido transportable, o cualquier otro
agente neuroactivo. Típicamente, no es transportable y no puede
atravesar por sí solo la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, el
péptido transportable u otro agente en un extremo de la molécula de
PEG actúa como vehículo para administrar el agente neuroactivo no
transportable dentro del cerebro. Para este objetivo, pueden usarse
PEGs bifuncionales, ya sean PEGs homobifuncionales o
heterobifuncionales. Como se usa en este documento "PEG
bifuncional" significa un derivado de PEG que tiene dos
fragmentos activos, cada uno capaz de reaccionar con un fragmento
activo en otra molécula. Los dos fragmentos activos pueden estar en
los dos extremos de una cadena de PEG, o próximos uno al otro en un
extremo bifurcado de una molécula de la cadena de PEG, teniendo en
cuenta el impedimento estérico, si lo hay. A continuación se
describen péptidos transportables adecuados para uso en esta
invención incluyendo, pero no limitados a, dinorfinas, encefalinas,
bifalina, endorfinas, endomorfinas y derivados y análogos de los
mismos.
\newpage
El conjugado de esta invención puede
administrarse a un animal con el objetivo de tratar, mitigar o
aliviar el dolor. Los ejemplos de animales huésped incluyen, pero
no se limitan a, mamíferos tales como seres humanos y animales
domésticos, incluyendo gatos, perros, vacas, caballos, ratones y
ratas.
El conjugado de esta invención puede
administrarse a un animal de cualquier manera adecuada. Por ejemplo,
puede administrarse el conjugado por vía parenteral por medio de
inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección
subcutánea. Alternativamente, puede también introducirse el
conjugado de esta invención en el cuerpo por inhalación intranasal
y pulmonar o por administración oral y bucal. De preferencia, se usa
la inyección intravenosa de manera que sustancialmente todo el
conjugado en una inyección se administra al torrente sanguíneo del
animal, a través del cual el conjugado circula hacia la barrera
hematoencefálica del animal.
Puede inyectarse el conjugado en la forma de
cualquier tipo de formulación adecuada. Por ejemplo, puede
prepararse una composición inyectable por cualquier procedimiento
conocido en la técnica conteniendo el conjugado de esta invención
en un solvente tal como agua o solución, incluyendo solución salina
y solución de Ringer. Pueden agregarse uno o más vehículos
farmacéuticamente aceptables compatibles con los otros ingredientes
en la formulación. También pueden incluirse excipientes, incluyendo
manitol, alginato de sodio y carboximetil celulosa. Pueden también
incluirse en la formulación otros componentes farmacéuticamente
aceptables, incluyendo antisépticos tal como feniletilalcohol;
estabilizantes tales como polietilenglicol y albúmina; agentes para
mantener la isotonía tales como glicerol, sorbitol y glucosa;
compuestos para ayudar a la disolución; tampones estabilizadores
tales como citrato de sodio, acetato de sodio y fosfato de sodio;
conservantes tales como alcohol bencílico; espesantes tal como
dextrosa; y otros aditivos comúnmente usados. La formulación
inyectable puede también prepararse en una forma sólida tal como
una forma liofilizada.
Pueden administrarse los péptidos PEGilados de
la invención en una variedad de formulaciones, incluyendo, por
ejemplo, administración intranasal, bucal y oral. La dosificación
del conjugado administrado a un ser humano u otro animal variará
dependiendo del animal huésped, los tipos de péptidos transportables
y/o agentes neuroactivos usados, los medios de administración y los
síntomas sufridos por el animal. Sin embargo, los intervalos de
dosificación adecuada en una situación específica deberían poder
determinarse fácilmente por un experto en la técnica sin excesiva
experimentación.
La invención es además ilustrada por medio de
los siguientes ejemplos, los que tienen una finalidad sólo
ilustrativa y que no deberían considerarse de ninguna manera como
limitadores de la invención.
Se disolvió dinorfina A (1-11)
(H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-NH_{2})
(1,47 mg) en 0,25 ml de agua desionizada y 0,25 ml de tampón NaP 25
mM, pH 5,8 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se agregó el
reactivo NHS-PEG_{2K}-Fluoresceína
(1,0 mg) a la solución de péptido en un exceso molar de
aproximadamente el doble. Tras 30 minutos de reacción se agregó 0,1
ml de tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7,4 y se dejó reaccionar a
temperatura ambiente durante 3 horas.
Se controló la conjugación de
NHS-PEG_{2K}-Fluoresceína por
medio de electoforesis capilar (EC) y espectrometría de masa
(MALDI). Se realizó la purificación del conjugado
PEG-Dinorfina A en una columna de intercambio
catiónico HiTrap SP de Amersham/Pharmacia usando un gradiente de
elución de tampón fosfato de sodio desde 5 mM, pH 4,0 hasta fosfato
de sodio 50 mM, tampón NaCl 1,5M, pH 7,5 en 53 minutos. Se
recogieron las fracciones y se analizaron los contenidos mediante
MALDI. Se combinaron estas fracciones y se almacenaron congeladas
previo a su ensayo in vivo.
Se disolvió endomorfina II
(H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH_{2},
2,3 mg) en 1,15 ml de tampón fosfato de sodio 5 mM, pH 8,0. La
modificación de Endomorfina II se realizó en 1,5 horas a temperatura
ambiente agregando mPEG_{2000}-SPA (38 mg) en un
exceso de 5 moles. Se analizó la mezcla de reacción mediante
espectrometría de masa (MALDI) para determinar la extensión de la
modificación. Se usó MALDI para verificar que se completó la
reacción entre mPEG_{2000}-SPA y Endomorfina II.
Se dializó la muestra contra agua usando una membrana 2000 MWCO y se
liofilizó previo a su ensayo in vivo.
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad de Arizona aprobó el protocolo para los
experimentos de perfusión en cerebro de rata. La perfusión in
situ, depleción capilar, extracción cerebral y los estudios de
unión a proteínas se realizaron como se informó previamente
(Williams y col., J. Neurochem., 66 (3), págs.
1289-1299, 1996). La PEG-dinorfina A
(PdinA) tuvo un valor R_{Br} de captación in situ muy alto
de 0,343 \pm 1,84. En contraste, la perfusión in situ con
I^{125} Dinorfina, dio un R_{Br} muy alto de aproximadamente
0,96. Se recuperó la radiactividad total en el frente de solvente de
HPLC subsiguiente mostrando que la dinorfina A
(1-11) marcada se degrada, probablemente a I^{125}
Tyr.
Se realizaron los estudios de depleción capilar
de PdinA, y revelaron aproximadamente el 88% de la radiactividad
asociada con la fracción capilar más que con el parénquima
cerebral.
La captación in situ de
PEG-endomorfina II (Pend) dio un valor de R_{Br}
de 0,057 \pm 0,008, similar al informado previamente para
péptidos. La depleción capilar subsiguiente mostró que de la
radiactividad que entró al cerebro, 32% se asoció con la fracción
capilar con 67% en el parénquima cerebral.
Se estudió la unión a proteínas de Pend usando
el sistema de filtro centrifree. Se halló que 30% de 25.000 dpm de
Pend estaba unido a 1% de solución de SAB.
La principal contribución es que la PEGilación
mejoró dramáticamente la estabilidad enzimática en cerebro y en
sangre. La endomorfina y la dinorfina son muy inestables en cerebro
y en sangre con semividas del orden de minutos. Tras la PEGilación,
aquellas semividas aumentaron hasta horas para endomorfina II. En el
caso de endomorfina II, la semivida en plasma sanguíneo era de 3,2
minutos y en tejido cerebral de 13 minutos. Tras la PEGilación,
aquellas semividas aumentaron hasta más de dos horas.
Se disolvió endomorfina I
(H-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH_{2},
3,0 mg, 4,9 E-6 moles) en 1 ml de tampón fosfate de
sodio 50 mM, pH 8,2 conteniendo 150 mM de NaCl y 50 mM de DTT. Se
agregó un exceso molar de cuatro veces de reactivo de Traut (2,7
mg) y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
purificó la endomorfina modificada con tiol a partir de DTT y
reactivo de Traut usando una columna de exclusión por tamaño
Superdex 30 (Pharmacia). Se recogieron las fracciones de
endomorfina modificada y se liofilizaron.
Se disolvió clorhidrato de doxorrubicina (3,0
mg, 5,2 E-6 moles) en 1,0 ml de tampón fosfate de
sodio 50 mM, pH 7,2 conteniendo 150 mM de NaCl. Se tituló el pH de
la solución hasta 8,0 con hidróxido de sodio 0,1N. Se agregó un
exceso molar de diez veces de PEG heterobifuncional
(NHS-PEG_{2K}-OPSS) a la solución
de doxorrubicina. Se dejó proceder la reacción a temperatura
ambiente durante 2 horas. Se purificó la
OPSS-PEG_{2K}-doxorrubicina a
partir de PEG sin reaccionar y doxorrubicina libre usando una
columna de exclusión por tamaño Superdex 30. Se recogieron las
fracciones de
OPSS-PEG_{2K}-doxorrubicina y se
liofilizaron.
Se reconstituyeron los polvos liofilizados de
endomorfina I modificada y
OPSS-PEG_{2K}-doxorrubicina en
tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0. Se mezcló una cantidad
equimolar de cada solución y se hicieron reaccionar a temperatura
ambiente durante 6 horas. Se purificó el conjugado de
doxorrubicina-PEG_{2K}-endomorfina
en una columna de exclusión por tamaño Superdex 30.
Se disolvieron 3,0 g de DPDPE
(Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen)
en 5 ml de acetonitrilo anhidro. Se agregó un exceso molar de 20%
molar de reactivo PEG (mPEG-SPA 5K [27,9 mg] o
mPEG-SPA 2K [11,1 mg]) y trietilamina (0,8 \mul)
al DPDPE. Se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente bajo
atmósfera de argón durante 2 días. Se diluyó la muestra hasta 15 ml
con agua desionizada y se liofilizó. Se reconstituyó el polvo de
PEG-DPDPE en 5 ml de agua desionizada y se purificó
en una columna de exclusión por tamaño Superdex 30. Se combinaron
las fracciones pertinentes juntas, se dializó contra agua y se
congeló hasta los experimentos de perfusión in situ.
Tanto PEG_{2k}-DPDPE como
PEG_{5k}-DPDPE se yodaron y probaron en estudios
de perfusión in situ, depleción capilar, extracción cerebral
y de unión a proteínas como en el Ejemplo 3. Se observó un aumento
significativo en la captación en cerebro para
PEG_{2k}-DPDPE y PEG_{5k}-DPDPE.
Se determinó que para ambos compuestos, el aumento de captación fue
debido a la entrada del péptido al cerebro más que por el
atrapamiento en los capilares.
Se disolvió bifalina (21,1 mg, 0,046 mmol) en 15
ml de acetonitrilo anhidro y se trató con 16 \mul de trietilamina
(0,115 mmol, exceso molar de 2,5 veces). Al mismo tiempo, se
disolvió mPEG_{2K}-SPA (110 mg, 0,055 mmol,
exceso molar de 1,2 veces) en 5 ml de acetonitrilo. Se agregó
lentamente el mPEG_{2K}-SPA disuelto en la
solución anterior de bifalina y se agitó la mezcla de reacción
durante 66 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de
nitrógeno.
Se separaron
[(mPEG_{2K})_{2}-bifalina]
di-pegilada y
[mPEG_{2K}-bifalina]monopegilada del PEG
sin reaccionar y bifalina libre en una columna de fase inversa
Vydac C18 a 1 ml/min y detector UV 215 nm usando un gradiente de
elución de 30% hasta 60% de solvente B. El solvente A es 0,1% TFA en
agua y el solvente B es 0,1% TFA en acetoni-
trilo.
trilo.
Se disolvieron 118,7 mg de
metoxi-PEG_{5K}-SPA (2,374 x
10^{-5} moles, exceso molar 1,5 veces) en 3,0 ml de acetonitrilo
anhidro. Sobre un flujo lento de Argón, se agregaron 10,0 mg de
Bifalina (1,583 x 10^{-5} moles de grupo -NH_{2}) seguidos por
4,4 \mul de trietilamina mediante pipeta (3,166 x 10^{-5}
moles, exceso molar 2,0 veces) en la solución. Se agitó la solución
a temperatura ambiente durante la noche.
Se evaporó el disolvente en un evaporador
rotatorio a 40ºC hasta casi sequedad, posteriormente se secó más en
alto vacío durante 5 minutos (se usó una trampa de nitrógeno líquido
al aplicar el vacío). Se disolvió el producto restante en 10 ml de
agua desionizada. El pH de la solución fue de 4,5. Se cargó la
solución por medio de inyección en una caja de diálisis
Slide-A-Lyzer con 3500 MWCO (de
PIERCE) y se dializó contra 2 x 900 ml de agua desionizada durante
tres días.
Se cargó la solución en una columna de Sefarose
DEAE de 2 ml. Se recogió el eluyente. Se eluyó la columna con 125
ml más de agua desionizada, se recogió el eluyente (pH 7,6). Se
combinaron las dos fracciones, se congeló la solución por medio de
nitrógeno líquido y se liofilizó en un secador de congelación.
Se disolvieron 141,4 mg de
metoxi-PEG_{12K}-SPA (1,187 x
10^{-5} moles, exceso molar 1,5 veces) en 2,0 ml de acetonitrilo
anhidro. Bajo un flujo lento de Argón se agregaron 5,0 mg de
Bifalina\cdot2TFA (7,915 x 10^{-6} moles de grupo -NH_{2})
seguidos por 2,2 \mul de trietilamina por medio de pipeta (1,583 x
10^{-5} moles, exceso molar 2,0 veces) en la solución. Se agitó
la solución a temperatura ambiente durante la noche.
Se evaporó el disolvente en alto vacío a
temperatura ambiente hasta sequedad (se usó una trampa de nitrógeno
al aplicar vacío). Se disolvió el compuesto restante en 10 ml de
agua desionizada. Se cargó la solución por medio de inyección en
una Caja de Diálisis prehidratada con 10000 MWCO (de PIERCE) y se
dializó contra 2 x 800 ml de agua desionizada durante tres
días.
Se diluyó la solución hasta 18 ml con agua
desionizada. Se cargó la solución en una columna de DEAE Sefarose
de 10 ml. Se recogió el eluyente. Se eluyó la columna con otros 90
ml de agua desionizada. Se combinaron las fracciones, se congeló
por medio de nitrógeno líquido y posteriormente se liofilizó en un
secador de congelación.
Se disolvieron 255,2 mg de
metoxi-PEG_{20K}-SPA (1,187 x
10^{-5} moles, exceso molar 1,5 veces) en 3,0 ml de acetonitrilo
anhidro. Bajo un flujo lento de Argón se agregaron 5,0 mg de
Bifalina\cdot2TFA (7,915 x 10^{-6} moles de grupo -NH_{2})
seguidos por 2,2 \mul de trietilamina por medio de pipeta (1,583 x
10^{-5} moles, exceso molar 2,0 veces) en la solución. Se agitó
la solución a temperatura ambiente durante la noche.
Se evaporó el disolvente en alto vacío a
temperatura ambiente hasta sequedad (se usó una trampa de nitrógeno
al aplicar vacío). Se disolvió el compuesto restante en 10 ml de
agua desionizada. Se cargó la solución por medio de inyección en
una Caja de Diálisis prehidratada con 10000 MWCO (de PIERCE) y se
dializó contra 2 x 800 ml de agua desionizada durante tres
días.
Se diluyó la solución hasta 25 ml con agua
desionizada. Se cargó la solución en una columna de DEAE Sefarose
de 15 ml. Se recogió el eluyente. Se eluyó la columna con otros 150
ml de agua desionizada. Se combinaron las fracciones, se congeló
por medio de nitrógeno líquido y posteriormente se liofilizó en un
secador de congelación.
Se determinó la pureza de cada muestra por medio
de HPLC en fase inversa y mediante espectrometría de masa
(MALDI).
Se usaron ratones ICR macho
(20-25 g) o ratas Sprague-Dawley
(250-300 g) (Harlan Sprague-Dawley
Inc., Indianapolis, IN) para estos experimentos. Se alojó a los
animales de a cuatro por jaula en una instalación de cuidado animal,
se mantuvieron a 22 \pm 0,5ºC con un ciclo alternado de 12 horas
de luz-oscuridad. Tuvieron alimento y agua
disponibles ad libitum. Se usaron los animales sólo una
vez.
Se disolvieron todos los fármacos en solución
salina estéril y se prepararon de manera que la dosis adecuada se
administraría en 5 \mul (i.c.v.), 100 \mul (i.v.), 100 \mul
(s.c.) y 100 \mul (i.m.) de vehículo. Se registró la latencia
basal de todos los roedores previo a la inyección del fármaco. Se
usó un control de morfina con los procedimientos de inyección
i.c.v. e i.v. para comparar las eficacias analgésicas del compuesto
de prueba.
Se colocaron los roedores en una jarra
conteniendo gasa empapada con éter etílico hasta conseguir un sueño
ligero. Se retiraron los roedores inmediatamente de la jarra y se
realizó una incisión de ½ '' con un escalpelo para exponer la parte
superior del cráneo. Se localizó el ventrículo lateral derecho
midiendo 2 mm laterales a la línea media y 2 mm caudales al
Bregma. En este punto se colocó una jeringa Hamilton (22G, ½ '') a
través del cráneo y se administró una inyección de 5 \mul del
compuesto. Posteriormente se colocó nuevamente a los roedores en
sus jaulas hasta el momento especificado de la prueba. Se colocó
azul de metileno en el sitio de la inyección para asegurar la
administración adecuada del compuesto dentro del ventrículo
lateral.
Se colocaron los roedores en soportes para
restringir sus movimientos y se colocaron sus colas en un recipiente
con agua templada y se frotaron con etanol para maximizar la
vasodilatación de las venas de la cola. Se seleccionó una vena y se
ajustó el soporte para prevenir excesivos movimientos. Se seleccionó
una aguja 30 G como el tamaño apropiado para administrar los
compuestos. Se insertó cuidadosamente la aguja en la vena de cada
ratón y se administró lentamente un bolo de 100 \mul. El
empalidecimiento de la vena hacia el cuerpo fue indicativo de una
administración adecuada.
Se cogieron las ratas con la mano para prevenir
excesivo movimiento. Se seleccionó una aguja 30 G como tamaño
apropiado para administrar los compuestos. Se insertó cuidadosamente
la aguja dentro del pescuezo de cada rata y se administró
lentamente un bolo de 100 \mul.
Se cogieron las ratas con la mano para prevenir
excesivo movimiento. Se seleccionó una aguja 30 G como tamaño
apropiado para administrar los compuestos. Se insertó cuidadosamente
la aguja dentro del músculo de la pata trasera derecha de cada rata
y se administró lentamente un bolo de 100 \mul.
Se colocaron los roedores en soportes para
restringir sus movimientos y se colocaron sus colas bajo un haz de
luz emisor de calor. Se encendió la luz y se registró el tiempo
hasta que el animal retiró con un movimiento rápido la cola del haz
de luz en cada momento puntual. Cuando los animales movieron sus
colas sin movimientos rápidos, se los sometió nuevamente a la
prueba sólo si la duración del tiempo bajo el haz de luz radiante
era menor que 5 segundos.
Se convirtieron los datos sin procesar (tiempos
registrados) en un porcentaje del máximo efecto posible (% M.E.P.)
que se determinó como 15 segundos. El % de M.E.P. se determinó
mediante la siguiente ecuación:
% \ M.E.P. = (Tiempos \ registrados \ - \
Basal) / (15 \ - \ Basal) \ x \ 100
Estos porcentajes permitieron posteriormente
realizar una gráfica % M.E.P. vs Tiempo del compuesto.
Posteriormente puede analizarse la curva para determinar el área
bajo la curva (ABC).
Los resultados de la administración i.c.v. del
PEG-DPDPE indican claramente que la PEGilación no
interfiere con la capacidad del DPDPE para producir un efecto
analgésico (Figura 1). Además, el estudio mostró una tendencia
hacia una prolongación del efecto analgésico del compuesto PEGilado
en comparación con el compuesto inicial.
La inyección intravenosa de
PEG-DPDPE mostró que el compuesto PEGilado es capaz
de cruzar la barrera hematoencefálica, en cantidad suficiente como
para mantener sus propiedades analgésicas (Figura 2). Este estudio
también ayudó a confirmar que la PEGilación de DPDPE prolonga
significativamente la duración del efecto analgésico.
Todas las muestras de bifalina PEGilada y
bifalina exhibieron una respuesta analgésica potente en ratones con
una respuesta máxima de 80-90% alcanzada entre
30-45 minutos. La
(mPEG_{2K})_{2}-bifalina continuó
prolongando el efecto analgésico con un 50% de M.E.P. observado en
el minuto 400 del estudio en comparación con el minuto 90 para
bifalina nativa. Los datos también muestran una relación inversa
entre el peso molecular del PEG y el % M.E.P. (Figura 3). Al
comparar el efecto analgésico de bifalina monopegilada
(mPEG_{2K}-bifalina) en la misma concentración en
ratones, la duración del efecto analgésico para
mPEG_{2K}-bifalina es casi la mitad del efecto
para (mPEG_{2K})_{2}-bifalina en el 50%
M.E.P. (Figura 4). De hecho, hay un efecto analgésico casi
equivalente de mPEG_{2K}-bifalina con la mitad de
la dosis de
(mPEG_{2K})_{2}-bifalina.
La administración intravenosa de
(mPEG_{2K})_{2}-bifalina da un efecto
analgésico de mayor duración en ratas que la bifalina nativa en las
diversas dosis probadas. (Figura 5). Las ratas a las que se les
administró (mPEG_{2K})_{2}-bifalina por
vía subcutánea o intramuscular mostraron actividad analgésica
elevada y sostenida en comparación con bifalina nativa en la misma
concentración (Figura 6).
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad de Arizona aprobó el protocolo para los
experimentos de perfusión en cerebro de rata. Los estudios de
perfusión in situ se realizaron como se informó
anteriormente (Williams y col., J. Neurochem., 66 (3), págs.
1289-1299, 1996). PEG_{2K}-DPDPE
tuvo un valor de captación RBr muy alto de 3,41 + 0,15. La
perfusión in situ de I^{125} DPDPE es comparable con la de
DPDPE monopegilado, R_{Br}= 3,54 \pm 0,30. La Bifalina marcada
con I^{125} tiene una captación de perfusión in situ de
7,26 \pm 0,11, mientras que la captación in situ de
(mPEG_{2K})_{2}-Bifalina fue
dramáticamente inferior, valor de RBr de 2,70 \pm 0,27.
Muchas modificaciones y otras formas de
realización de la invención surgirán en la mente de un experto en
la técnica a la que pertenece esta invención con el beneficio de las
enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y los
gráficos asociados. Por consiguiente, debe entenderse que la
invención no está limitada a las formas de realización específicas
descritas y que la intención es incluir esas modificaciones y otras
formas de realización dentro del alcance de las reivindicaciones.
Aunque en este documento se usan términos específicos, sólo se los
usa en un sentido genérico y descriptivo y sin intención de
limitación alguna.
Claims (18)
1. Un conjugado polímero-péptido
sustancialmente hidrófilo que comprende un péptido covalentemente
unido a polietilenglicol o a un copolímero de polietilenglicol y
polipropilenglicol que tiene un peso molecular promedio nominal de
desde 200 daltons hasta 40.000 daltons, en el que dicho péptido se
selecciona del grupo constituido por bifalina y
[D-Pen2, D-Pen5] encefalina
(DPDPE).
2. El conjugado de la Reivindicación 1 en el que
dicho polímero está además caracterizado por la ausencia de
fragmentos lipófilos.
3. El conjugado de la Reivindicación 1
caracterizado además por la unión covalente de
polietilenglicol o un copolímero de polietilenglicol y
polipropilenglicol en un residuo tirosina de dicho péptido.
4. El conjugado de la Reivindicación 1 en el que
dicho polímero es polietilenglicol.
5. El conjugado de la Reivindicación 4, en el
que dicho polietilenglicol se selecciona del grupo constituido por
monometoxipolietilenglicol, polietilenglicol ramificado,
polietilenglicol con enlaces degradables en el esqueleto,
polietilenglicol homobifuncional, polietilenglicol
heterobifuncional, polietilenglicol de brazos múltiples,
polietilenglicol pendiente y polietilenglicol bifurcado.
6. El conjugado de la Reivindicación 1, en el
que dicho péptido está conjugado con al menos una molécula de
polietilenglicol.
7. El conjugado de la Reivindicación 1, que
comprende bifalina unida covalentemente a dos fragmentos de
polietilenglicol.
8. El conjugado de la Reivindicación 1, en el
que dicho polímero es polietilenglicol con un peso molecular
promedio nominal de desde 200 daltons hasta 10.000 daltons, ó 300
hasta 8.000 daltons, ó 500 hasta 5.000 daltons, ó 5.000 daltons, ó
2.000 daltons.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a
8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. El conjugado de la Reivindicación 1 que
comprende además un agente neuroactivo que puede ser el mismo
péptido o uno diferente, conjugado con dicho polímero.
11. El conjugado de la Reivindicación 10
caracterizado además por una estructura en forma de pesa.
12. El conjugado de la Reivindicación 1 que
además comprende doxorrubicina o un agente para diagnóstico o para
generación de imágenes conjugado con dicho polímero.
13. El uso del conjugado de la Reivindicación 1
para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el
dolor, en el que dicha composición se administrará a través de la
circulación general.
14. El uso del conjugado de la Reivindicación 1
para la preparación de una composición farmacéutica para administrar
un péptido dentro del cerebro de un animal, en el que dicha
composición se administrará en el torrente sanguíneo de dicho
animal.
15. El uso de la Reivindicación 14, en el que
dicho polímero se selecciona del grupo constituido por
monometoxipolietilenglicol, polietilenglicol ramificado,
polietilenglicol con enlaces degradables en el esqueleto,
polietilenglicol homobifuncional, polietilenglicol
heterobifuncional, polietilenglicol de brazos múltiples,
polietilenglicol pendiente y polietilenglicol bifurcado.
16. El uso de la Reivindicación 14 ó 15, en el
que la etapa de administración de la composición comprende la
inhalación pulmonar o intranasal en dicho animal.
17. El uso de la Reivindicación 14 ó 15, en el
que la etapa de administración de la composición es por
administración oral, ocular, bucal, transdérmica o rectal.
18. El uso de un conjugado
polímero-péptido sustancialmente hidrófilo entre un
péptido opioide y polietilenglicol o un copolímero de
polietilenglicol y polopropilenglicol con un peso molecular promedio
nominal de desde 200 hasta 40.000 daltons en el que el péptido se
selecciona del grupo constituido por dinorfina, encefalina,
endorfina y endomorfinas para la preparación de una composición
farmacéutica para administrar un péptido opioide dentro del cerebro
de un animal para el tratamiento del dolor, en el que dicha
composición se administrará en el torrente sanguíneo de un
animal.
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