WO1996012505A1 - Konjugate aus einem poly- oder oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen verbindung - Google Patents

Konjugate aus einem poly- oder oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen verbindung Download PDF

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WO1996012505A1
WO1996012505A1 PCT/EP1995/003995 EP9503995W WO9612505A1 WO 1996012505 A1 WO1996012505 A1 WO 1996012505A1 EP 9503995 W EP9503995 W EP 9503995W WO 9612505 A1 WO9612505 A1 WO 9612505A1
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conjugates
peptide
lipophilic
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hirudin
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Jürgen Schweden
Wilfried Hornberger
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • proteins as active ingredients in the development of medicines has increased enormously in recent years due to advances in the field of genetic engineering. By using this technology, proteins are now available in large quantities, which naturally only occur in traces in the organism.
  • the half-life of a protein can be modified by derivatization with high molecular weight polymers.
  • EP 236 987 and EP 345 616 describe polymers as soluble and insoluble polymers such as dextrans, sepharose, heparin, laevan, gelatin partial hydrolyzates and polyalkylene glycols.
  • the polymer-modified proteins are said to have an extended circulation time in the blood.
  • EP 502 962A describes hirudins modified with polyethylene glycol, which also have an extended half-life.
  • the molecular weight of the polymer is a few kilodaltons, so that the molecular weight of the polypeptide is considerably increased.
  • high molecular weight polymers are not chemically defined exactly; rather, they form a population of different molecules that are distributed around a molecular weight range. Accordingly, the protein coupling products thus produced do not consist of a single chemical compound, but rather of molecular populations which differ from one another in terms of their molecular weight and thus in their pharmacokinetic properties.
  • the object was therefore to provide protein derivatives with pharmacological properties which are improved compared to normal proteins and which do not have the above-mentioned disadvantages of proteins modified with high molecular weight polymers.
  • conjugates consisting of a poly- or oligopeptide and a low-molecular lipophilic compound, the peptide and the lipophilic residue being covalently linked to one another directly or via a connecting link, with the exception of a) conjugates in which the peptide part consists of hirudin or one of Hirudin structurally derived peptide or peptide derivative with hirudin activity and b) conjugates, the peptide part of which was already hydrophobically modified during its biosynthesis.
  • Conjugates formed from a protein and one or more low molecular weight lipophilic compounds are particularly suitable, the lipophilic compound having an octanol / water partition coefficient of more than 1.8 and being covalently linked to the protein.
  • the distribution coefficient is determined according to E. 1977, Hagens Handbuch der Pharmaceuticaltechnik, Vol. 2, Springer Verlag, 1991, p. 403.
  • the invention also relates to medicaments which contain a conjugate as defined above, optionally together with physiologically acceptable carriers and / or auxiliaries.
  • All poly- or oligopeptides are suitable for the protein conjugates according to the invention.
  • the protein conjugates according to the invention can be used, for example, with proteins such as streptokinase, urokinase, t-PA, factor VIII, factor IX, monoclonal or polyclonal antibodies, superoxide dismutase, adenosine deamidase, catalase, glucocerebrosidase, tissue factor, TNF, interferons, interleukins , Lipases, growth factors such as macrophage colony stimulating factor, epidermal growth factor, neurothrophic factors such as GDNF, BDNF, NGF, thrombopotein, erythropotein or kalikrein, insulin, ACTH, glucagon, somatostatin, somatotropin, Thymosin, parathyroid hormone, prolactin, thyroid stimulating hormone, antidiuretic hormone.
  • proteins such as streptokinase,
  • Preferred for the production of the lipophilic conjugates according to the invention are those proteins or peptides in which the number of theoretical coupling sites for the lipophilic compounds are small, so that the resulting product is as homogeneous as possible.
  • Preferred proteins are also those in which mutations, e.g. by deletion or by exchanging Lys - Arg, the number of possible coupling sites was reduced.
  • proteins or peptides that have already been naturally modified by post-translational modification, e.g. Farnesylation, prenylation or modified by fatty acids.
  • Such proteins are e.g. accessible by fermentation or with the help of genetic engineering methods or by peptide synthesis.
  • the lipophilic compound can be linked to the poly- or oligo-peptide directly or using a connecting member, for example a spacer or crosslinker.
  • Functional groups which can be used for the attachment to the protein are the N- or C-terminus of the protein / peptide, the hydroxyl groups of the amino acids serine, threonine or tyrosine, the amino groups of the arginine, the Amino groups of lysine, the SH functions of cysteine or the carboxyl functions of aspartic acid or glutamic acid.
  • connecting members are, for example, amino acids, oligopeptides, mono-, di- or oligosaccharides, amino- or hydroxycarboxylic acids, in particular those with a chain length of 2 to 10 carbon atoms, which can optionally carry further substituents to increase the hydrophilicity , for example Ci-C-01igoalkylene glycols.
  • connecting links can also be used, for example, to link lipophilic compounds to the poly / oligopeptide:
  • X for S, 0, NH, N (CH 3 ), N (C 2 H 5 ) W for H, OH, Cl Z for a C 2 -C 6 alkylene group or a p-phenylene group
  • Suitable low molecular weight lipophilic compounds are compounds which contain a lipophilic residue and one or more functional groups such as amino, hydroxy, carboxy or sulfonic acid. groups and in particular those with an octanol / water partition coefficient of greater than 1.8.
  • the lipophilic compounds can be natural products, e.g. saturated or unsaturated fatty acids, fatty acid diketones, terpenes, prostaglandins, fat-soluble vitamins, carotenoids or steroids, but also synthetic carboxylic acids, alcohols, amines and sulfonic acids with one or more alkyl, aryl, alkenyl or polyunsaturated compounds which can be both linear and branched and are optionally substituted with halogen, nitro, cyano, alkoxy, alkylthio or haloalkyl groups.
  • natural products e.g. saturated or unsaturated fatty acids, fatty acid diketones, terpenes, prostaglandins, fat-soluble vitamins, carotenoids or steroids, but also synthetic carboxylic acids, alcohols, amines and sulfonic acids with one or more alkyl, aryl, alkenyl or polyunsaturated compounds which can be both linear and branched and are optionally
  • lipophilic compounds are the carotenoids zeaxanthin, rhodovibrin or asthaxanthin, the steroids cholesterol, desmosterol, coprosterol, cerebrosterol, lathosterol, ergostol, sitosterol, stigmasterol, cholanic acid, choline acid, dehydrocorticosterone, aldosteronosterosterol, aldosterosterol, aldosterone chysterol, lanosterol or lumisterol, the terpenes geraniol, neurol, linalool, menthol, carveol, borneol, farnesol, nerolidol or sclareol, the prostaglandins brefeidin, PGE 2 or PGF 2 , the vitamins Ai or D, but also synthetic compounds such as oxo - Alcohols, hexylamine, ethylhexanoic acid, e
  • R 2 , R 3 , R 4 H Ci-i ⁇ -alkyl, C 3 - ⁇ 8 alkenyl, C 3 . 6 -cycloalkyl, aryl or benzyl, each optionally substituted by halogen, nitro, cyano, alkyl, alkoxy, alkylthio, haloalkyl groups.
  • Lipophilic compounds which are very suitable for the invention are the saturated or unsaturated fatty acids of the chain length C6-C24 »and the fatty alcohols or fatty amines to be derived therefrom and mixtures of fatty acids, fatty alcohols and fatty amines.
  • the saturated fatty acids myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachic acid, behenic acid and lignoceric acid are particularly suitable.
  • hydrophobic compounds are sterols, cholesterol is particularly suitable.
  • the low molecular weight lipophilic compounds preferably have a molecular weight M w of less than 1500, in particular less than 1000.
  • One or more lipophilic residues can be attached to the poly- or oligopeptide.
  • the number depends on the size of the protein and the lipophilic properties of the lipophilic compound. Depending on the desired effect or application, the number of conjugated lipophilic residues can e.g. vary between 1 and 10.
  • the protein conjugates according to the invention are prepared by either directly or using a spacer / crosslinker at 0 ° to 40 ° C. in buffer, containing up to 80% of a water-miscible organic solvent, such as e.g. Alcohols, THF, acetonitrile, acetone, DMSO, DMF at pH values between 4 to 10, preferably at pH 7 to 9.
  • a water-miscible organic solvent such as e.g. Alcohols, THF, acetonitrile, acetone, DMSO, DMF at pH values between 4 to 10, preferably at pH 7 to 9.
  • Coating of natural or artificial surfaces e.g. Cell membranes, polymers Modification of the solution properties of proteins - improvement of the absorption properties in e.g. transder ⁇ painterly, oral application.
  • solvent A 2 M NH 4 acetate pH 6.0
  • solvent B methanol flow: 2.5 ml / min
  • the palmitic acid-insulin derivatives elute at 45%, 56% and 100% B.
  • the samples are then freed from methanol and
  • 25 100 mg cholesterol hemisuccinate (Sigma (6013) are dissolved in 5 ml 50% THF and activated with 25 mg N-hydroxy-succinimide and 300 mg l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and at pH 5 Incubated for 2 h RT.
  • the blood glucose concentration was determined using the hexokinase method.
  • Glucose is phosphorylated with ATP to glucose-6-phosphate in the presence of hexokinase. This reacts with NADP to form gphosphogluconate. and NADPH 2 , the reaction is catalyzed by glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • the measured variable is NADPH 2 , the closing of which is measured photometrically until the reaction has stopped.
  • the extinction increase determined is proportional to the glucose concentration in the test batch.

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Abstract

Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung, wobei das Peptid und der lipophile Rest unmittelbar oder über ein Verbindungsglied kovalent miteinander verknüpft sind, ausgenommen a) Konjugate, in denen der Peptidteil aus Hirudin oder einem von Hirudin strukturell abgeleiteten Peptid oder Peptidderivat mit Hirudinaktivität besteht und b) Konjugate, deren Peptidteil während ihrer Biosynthese bereits hydrophob modifiziert wurde.

Description

Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer nieder¬ molekularen lipophilen Verbindung
Beschreibung
Die Bedeutung von Proteinen als Wirkstoffe zur Entwicklung von Medikamenten ist in den letzten Jahren durch die Fortschritte auf dem Gebiet der Gentechnik enorm gestiegen. Durch den Einsatz die- ser Technik sind Proteine nun in großen Mengen verfügbar, die na¬ türlicherweise im Organismus nur in Spuren vorkommen.
Häufig beobachtet man bei solchen rekombinant hergestellten Pro¬ teine, daß sie nach Injektion in einen tierischen Organismus schnell durch Abbau zerstört oder durch Ausscheidung aus der
Blutzirkulation eliminiert werden. Dieses Problem führt zu einer starken Einschränkung der Anwendbarkeit von Proteinen, besonders dann, wenn eine längere Behandlungsdauer gewünscht ist.
Durch Derivatisierung mit hochmolekularen Polymeren kann die Halbwertszeit eines Proteins modifiziert werden. Als Polymere werden in EP 236 987 und EP 345 616 lösliche und unlösliche Poly¬ mere wie Dextrane, Sepharose, Heparin, Laevan, Gelatinepartialhy- drolysate sowie Polyalkylenglykole beschrieben. Die polymer- modifizierten Proteine sollen eine verlängerte Zirkulationsdauer im Blut aufweisen.
in der EP 502 962A sind mit Polyethylenglykol modifizierte Hirudine beschrieben, die ebenfalls eine verlängerte Halbwerts- zeit aufweisen.
in den oben genannten Offenlegungsschriften wird die Verlängerung der Halbwertszeit durch Modifikation mit einem hochmolekularen Polymeren erreicht.
Die Molmasse des Polymeren beträgt dabei einige Kilodalton, so daß die Molmasse des Polypeptids erheblich vergrößert wird. Sol¬ che hochmolekularen Polymere sind jedoch chemisch nicht exakt de¬ finiert; sie bilden vielmehr eine Population verschiedener Mole- küle, die sich um einen Molmassenbereich verteilt. Demzufolge be¬ stehen auch die damit hergestellten Protein-Kopplungsprodukte nicht aus einer einzigen chemischen Verbindung, sondern aus Molekülpopulationen, die sich bezüglich ihrer Molmasse und damit in ihrem pharmako-kinetisehen Eigenschaften voneinander unter- scheiden. Es ist jedoch wünschenswert, Wirkstoffe, die als Arzneimittel eingesetzt werden, chemisch möglichst exakt zu definieren, um ihr Verhalten im Organismus besser kontrollieren zu können.
Aus Annal Review of Biochemistry, Vol. 61, 1992, S. 355-387 und Vol. 63, 1994, S. 869-915 sind Verbindungen bekannt, deren Pep¬ tidteil während ihrer Biosynthese, d.h. durch in der Natur zwangsläufig ablaufende Prozesse, bereits hydrophob modifiziert wurden.
Es bestand daher die Aufgabe, Protein-Derivate mit gegenüber dem normalen Protein verbesserten pharmakologischen Eigenschaften be¬ reitzustellen, die die obengenannten Nachteile der mit hochmole¬ kularen Polymeren modifizierten Proteine nicht besitzen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Konjugate bestehend aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung, wobei das Peptid und der lipophile Rest unmittelbar oder über ein Verbindungsglied kovalent miteinander verknüpft sind, ausgenommen a) Konjugate, in denen der Peptidteil aus Hirudin oder einem von Hirudin strukturell abgeleiteten Peptid oder Peptidderivat mit Hirudinaktivität besteht und b) Konjugate, deren Peptidteil während ihrer Biosynthese bereits hydrophob mo¬ difiziert wurde.
Insbesondere geeignet sind Konjugate, gebildet aus einem Protein und einer oder mehreren niedermolekularen lipophilen Verbindungen, wobei die lipophile Verbindung einen Octanol-Was¬ ser-Verteilungskoeffizienten von mehr als 1,8 aufweist und kovalent mit dem Protein verknüpft ist. Der Verteilungskoeffi¬ zient wird nach E. Nürnberg, Hagens Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Bd. 2, Springer Verlag, 1991, S. 403, bestimmt.
Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel, die ein Konjugat wie oben definiert, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch ak¬ zeptablen Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthalten.
Für die erfindungsgemäßen Protein-Konjugate sind alle Poly- oder Oligopeptide geeignet. Die erfindungsgemäßen Protein-Konjugate können z.B. mit Proteinen wie Streptokinase, Urokinase, t-PA, Faktor VIII, Faktor IX, monoklonalen oder polyklonalen Antikör¬ pern, Superoxiddismutase, Adenosindeamidase, Katalase, Glucocere- brosidase, tissue-Factor, TNF, Interferone, Interleukine, Lipa- sen, Wachstumsfaktoren wie beispielsweise Macrophage colony sti- mulating factor, epidermal growth factor, neurothrophe Faktoren wie z.B. GDNF, BDNF, NGF, Thrombopotein, Erythropotein oder Kal- likrein, Insulin, ACTH, Glucagon, Somatostatin, Somatotropin, Thymosin, Parathyroid-Hormon, Prolactin, Thyroid stimulierendes Hormon, antidiuretisches Hormon, hergestellt werden.
Bevorzugt für die Herstellung der erfindungsgemäßen lipophilen Konjugate sind solche Proteine oder Peptide, bei denen die Anzahl von theoretischen Kopplungsstellen für die lipophilen Verbindungen gering sind, damit das entstehende Produkt möglichst homogen ist. Bevorzugte Proteine sind auch solche, bei denen durch Mutationen, z.B. durch Deletion oder durch Austausch von Lys — Arg, die Anzahl der möglichen Kopplungsstellen reduziert wurde.
Geeignet sind auch Proteine bzw. Peptide, die bereits natürli¬ cherweise durch posttranslationale Modifikation, z.B. Farnesylie- rung, Prenylierung oder auch durch Fettsäuren modifiziert sind. Solche Proteine sind z.B. fermentativ oder auch mit Hilfe von gentechnischen Methoden bzw. durch Peptid-Synthese zugänglich.
Die Anknüpfung der lipophilen Verbindung an das Poly-, Oligo-Pep- tid kann direkt oder unter Verwendung eines Verbindungsglieds, z.B. eines Spacers oder Quervernetzers, erfolgen. Funktionelle Gruppen, die für die Anknüpfung am Protein verwendet werden kön¬ nen, sind der N- oder C-Terminus des Protein/Peptids, die Hydro- xy-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin, die Ami- dinogruppen des Arginins, die Aminogruppen des Lysins, die SH- Funktionen von Cystein oder an die Carboxyl-Funktionen von Aspa- raginsäure oder Glutaminsäure. Methoden zur Anknüpfung an die o.g. funktioneilen Gruppen sind dem Fachmann bekannt und sind in Standardwerken der Peptidche ie z.B. Bodanszky, "Peptide Synthe- sis", John Wiley, New York, 1976 beschrieben. Erfolgt die Anknüp¬ fung der lipophilen Verbindung über ein Verbindungsglied, so richtet sich die Auswahl nach der Art der funktionellen Gruppen. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über mögliche Verbin¬ dungsglieder sowie deren Einsatzmöglichkeiten. Verbindungsglieder
Agen s Bifunk ionalit t Reaktiv gegenüber Chemische Bezeichnung Abkürzung Homo He ero NH2 SH Photo- reactiv
ANB-NOS X X X N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimid
APB X X X p-azidophenacyl bromid
APG X X p-azidophenyl glyoxal
APTP X X X n-4- (azidophenylthio)phthalimid
BS3 X X bis(sulfosuccinimidyl)suberat
BMH X X bis maleimidohexan
BSOCOES X X bis[2- (succinimidooxy-carbonyl- oxy)-ethyl]sulfon
DFDNB X X 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzol
DIDS X X 4,4'-diisothiocyano-2,2'-di- sulfon stilben
DMA X X dimethyl adipimidat-2 HCl
DMP X X dimethyl pimelimidat-2 HCl
DMS X X dimethyl suberimidat-2 HCl
DSP X X dithiobis(succinimidylpropionat)
DSS X X disuccinimidyl suberat
DST X X disuccinimidyl tartarat
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Agen s Bifunktionalität Reaktiv gegenüber Chemische Bezeichnung Abkürzung Homo Hetero NH2 SH Photo- reac iv
SANPAH X X X N-succinimidyl-6(4'-azido-2' -nitro-phe- nyl-amino)hexanoat
SASD X X X sulfosuccinimidyl 2- (p-azidosalicyl- amido)ethyl-l,3'-dithio-propionat
SIAB X X X X N-succinimidyl (4-iodoacetyl)amino-ben- zoat
SMCC X X X succinimidyl 4- (N-maleimidome- thyl)-cyclohexane-1-carboxylat
SMPB X X X succinimidyl 4- (p-maleimidophe- nyl)-butyrat
Figure imgf000008_0001
SPDP X X X N-succinimidyl 3-(2-pyridyldi- thio)propionat
Sulfo- X X bis[2- (sulfosuccini idooxy-carbonyl- BSOCOES oxylethyl]sulfon
Sulfo- X X disulfosuccinimidyl tartrat DST
Sulfo- X X ethylene glycolbis(sulfosuccinimidyl- EGS succinat
Sulfo- X X X m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-sulfo- MBS succinimid ester
Sulfo- X X X sulfosuccinimidyl(4-azidophenyldi- SADP thio)-propionat
Agents Bifunktionalität Reaktiv gegenüber Chemische Bezeichnung Abkürzung Homo Hetero NH2 SH Photo- reactiv
Sulfo- X X X sulfosuccinimidyl 6- (4'-azido-2'-nitro- SANPAH phenylamino)hexanoat
Sulfo- X X X sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)amino- SIAB benzoat
Sulfo- X X X sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimido- SMCC methyl)cyclohexane-1-carboxylat
Sulfo- X X X sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimido- SMPB pheny1)butyrat
Traut's X X 2-iminothiolan-HCl
Als Verbindungsglieder eignen sich beispielsweise auch Aminosäu¬ ren, Oligopeptide, Mono-, Di- oder Oligosaccharide, Amino- oder Hydroxycarbonsäuren, insbesondere solche mit einer Kettenlänge von 2 bis 10 C-Atomen, die gegebenenfalls zur Erhöhung der Hydro- philie weitere Substituenten tragen können, beispielsweise Ci-C -01igoalkylenglykole.
Für die Anknüpfung von lipophilen Verbindungen an das Poly-/Oli- gopeptid können beispielsweise auch folgende Verbindungsglieder eingesetzt werden:
co-
co- NH- -NH CO-
Figure imgf000010_0001
X CO CH2 CH2
Figure imgf000010_0002
W
wobei
X für S, 0, NH, N(CH3), N(C2H5) W für H, OH, Cl Z für eine C2-C6-Alkylengruppe oder eine p-Phenylengruppe
steht.
Als niedermolekulare lipophile Verbindung eignen sich Verbidun- gen, die einen lipophilen Rest und über eine oder mehrere funk¬ tioneile Gruppe wie Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Sulfonsäure- gruppen verfügen und insbesondere solche, die einen Octanol-Was- ser-Verteilungskoeffizienten von größer als 1,8 besitzen.
Die lipophilen Verbindungen können Naturstoffe sein, z.B. gesät- tigte oder ungesättigte Fettsäuren, Fettsäure-Diketone, Terpene, Prostaglandine, fettlösliche Vitamine, Carotinoide oder Steroide, aber auch synthetische Carbonsäuren, Alkohole, Amine und Sulfon- säuren mit einem oder mehreren Alkyl-, Aryl-, Alkenyl oder auch mehrfach ungesättigten Verbindungen, die sowohl linear als auch verzweigt sein können und gegebenenfalls mit Halogen-, Nitro-, Cyano-, Alkoxy-, Alkylthio- oder Halogenalkylgruppen substituiert sind.
Weitere Beispiele für lipophile Verbindungen sind die Carotinoide Zeaxanthin, Rhodovibrin oder Asthaxanthin, die Steroide Choleste- rin, Desmosterol, Coprosterol, Cerebrosterol, Lathosterol, Erge- sterol, Sitosterol, Stigmasterol, Cholansäure, Cholinsäure, Dehydrocorticosterol, Aldosteron, Androsteron, Testosteron, Ta- chysterol, Lanosterol oder Lumisterol, die terpene Geraniol, Ne- rol, Linalool, Menthol, Carveol, Borneol, Farnesol, Nerolidol oder Sclareol, die Prostaglandine Brefeidin, PGE2 oder PGF2, die Vitamine Ai oder D, aber auch synthetische Verbindungen wie Oxo- alkohole, Hexylamin, Ethylhexansäure, Ethylhexanol, Ethylhexyl- amin oder Alkylbenzolsulfonsäuren.
Weitere geeignete lipophile Reste leiten sich von Verbindungen der allgemeinen Formel
H-Y-R1
ab,
worin
R1 {CH2)m-C(R2) (R3)-(CH2)n-(CH=CH-CH2)o-CH3 mit m = 0-28, n = 3-6, o = 0-6, und Y -C(02)-, -N(R4)-, -0- mit
R2,R3,R4 H, Ci-iβ-Alkyl, C3-ι8-Alkenyl, C3.6-Cycloalkyl, Aryl oder Benzyl, jeweils gegebenenfalls substituiert durch Halo- gen-, Nitro-, Cyano-, Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio-, Halogenalkylgruppen.
Für die Erfindung gut geeignete lipophile Verbindungen sind die gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren der Kettenlange C6-C24» sowie die daraus abzuleitender Fettalkohole oder Fettamine sowie Mischungen von Fettsäuren, Fettalkoholen und Fettaminen. Besonders gut geeignet sind die gesättigten Fettsäuren Myristin- säure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure und Lignocerinsäure.
Ebenfalls gut geeignete hydrophobe Verbindungen sind Sterole, be¬ sonders gut geeignet ist Cholesterin.
Die niedermolekularen lipophilen Verbindungen weisen bevorzugt ein Molekulargewicht Mw von unter 1500 auf, insbesondere unter 1000.
Am Poly- oder Oligopeptid können ein oder auch mehrere lipophile Reste angeknüpft werden. Die Anzahl richtet sich dabei nach der Größe des Proteins und nach den lipophilen Eigenschaften der lipophilen Verbindung. Je nach angestrebter Wirkung bzw. Anwen¬ dung kann die Anzahl der konjugierten lipophilen Reste z.B. zwi¬ schen 1 und 10 variieren.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Protein-Konjugate erfolgt, indem man das Protein/Peptid entweder direkt oder mittels eines Spacers/Quervernetzers bei 0° bis 40°C in Puffer, enthaltend bis zu 80 % eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels wie z.B. Alkohole, THF, Acetonitril, Aceton, DMSO, DMF bei pH- Werten zwischen 4 bis 10 bevorzugt bei pH 7 bis 9 zur Reaktion bringt.
Mit den erfindungsgemäßen Protein-Konjugaten können z.B. die fol¬ genden vorteilhaften Wirkungen und Anwendungen erzielt werden:
- Verlängerung der biologischen Halbwertszeit nach parenteraler Applikation,
Beschichtung von natürlichen oder auch künstlichen Oberflä¬ chen, z.B. Zellmembranen, Polymere Modifikation der Lösungseigenschaften von Proteinen - Verbesserung der Resorptionseigenschaften bei z.B. transder¬ maler, oraler Applikation.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfin¬ dung:
Beispiel 1
Herstellung von Palmitinsäure-Insulin
200 μl Insulin-Lösung (100 mg/ml H20) werden mit 200 μl 0.1 M Na- Borat pH 9.0 gemischt und anschließend 600 μl THF in dem 1.5 mg Palmitinsäure-N-Hydroxy-Succinimid gelöst sind, zugesetzt. Die Reaktion wird nach 12 h bei RT durch Zusatz von Ethanolamin abge- stoppt und die Reaktionsmischung auf einen HiPore RP-304 Säule (10x250mm) aufgetragen und unter folgenden Bedingungen ent¬ wickelt:
5 Laufmittel A: 2 M NH4-Acetat pH 6.0 Laufmittel B: Methanol Flow: 2,5 ml/min
Gradient:
10
Zeit Anteil B min %
0 0
10 40
15 60 80
60.1 100
Die Palmitinsäure-Insulin Derivate eluieren bei 45 %, 56 % und 100 % B. Die Proben werden anschließend von Methanol befreit und
20 in Wasser resuspendiert.
Beispiel 2
Herstellung von Cholesterin-Insulin
25 100 mg Cholesterin-Hemisuccinat (Sigma (6013) werden in 5 ml 50 % THF gelöst und zur Aktivierung mit 25 mg N-Hydroxy-Succinimid und 300 mg l-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid versetzt und bei pH 5 2 h RT inkubiert.
30 200 μl des aktivierten Cholesterins werden dann analog zu Bei¬ spiel 1 mit Insulin umgesetzt und die Derivate durch RP-Chromato- graphie wie beschrieben aufgetrennt. Die Cholesterin-Insulin-De- rivate eluieren zwischen 80 und 100 % B.
35 Beispiel 3
GlucosebeStimmung als Maß der Insulinwirkung an der Ratte
Methode: Narkotisierten (Urethan 2x8 mg/kg i.p.) Ratten wurde Placebo, humanes Insulin, Palmitoyl-Insulin oder Cholesteryl-In-
40 sulin intravenös appliziert. Zu definierten Zeiten (vor und 30, 60 und 180 min nach Applikation) wurden den Tieren venöse Blut¬ proben zur Gewinnung von Citratplasma entnommen. Dafür wurde fri¬ sches Vollblut mit Natriumeitrat 0,11 mol/1 im Verhältnis 8,5+1,5 gemischt und 10 min bei 1600 xg zentrifugiert. Als Maß der Insu¬
45 linwirkung im Plasma wurde die Blutglucosekonzentration mit der Hexokinase-Methode bestimmt. Dabei wird Glucose in Anwesenheit von Hexokinase mit ATP zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert. Dies reagiert mit NADP unter Bildung von Gphosphogluconat. und NADPH2, die Reaktion wird durch die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ka¬ talysiert. Meßgröße ist NADPH2, dessen Zu bis zum Stillstand der Reaktion im photometrisch gemessen wird. Die ermittelte Extink- tionszuna me ist proportional der Glucosekonzentration im Test¬ ansatz.
Ergebnis:
Bei Ratten, denen 20 μg/kg humanes Insulin intravenös appliziert worden war, wurde 30 min nach Applikation ein Abfall der Blutglu¬ cosekonzentration auf etwa -0 % des Ausgangswertes bestimmt. 60 min nach Applikation war die Blutglucosekonzentration noch leicht vermindert und 180 min nach Applikation war der Ausgangswert wie- der erreicht. Nach intravenöser Applikation von Palmitoyl-Insulin oder Cholesteryl-Insulin g Aktivität war die Blutglucosekon¬ zentration auch nach 180 min noch stark vermindert. Bei den Placebo-Tieren blieb die Blutglucosekonzentration kon¬ stant.

Claims

Patentansprüche
1. Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer nieder- molekularen lipophilen Verbindung, wobei das Peptid und der lipophile Rest unmittelbar oder über ein Verbindungsglied kovalent miteinander verknüpft sind, ausgenommen
a) Konjugate, in denen der Peptidteil aus Hirudin oder einem von Hirudin strukturell abgeleiteten Peptid oder Peptid- derivat mit Hirudinaktivität besteht und
b) Konjugate, deren Peptidteil während ihrer Biosynthese be¬ reits hydrophob modifiziert wurde.
2. Arzneimittel, enthaltend ein Konjugat nach Anspruch 1, gege¬ benenfalls zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern und/oder Hilfsstoffen.
3. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Protein und einer oder mehreren niedermolekularen lipophilen Verbindungen gebildet sind, wobei die lipophile Verbindung einen Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten von mehr als 1,8 aufweist.
Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die lipophilen Reste von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 24 C-Atomen und/oder von Cholesterin ableiten.
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005361A2 (en) * 1996-08-07 1998-02-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Long-acting drugs and pharmaceutical compositions comprising them
EP1982732A2 (de) 2000-02-11 2008-10-22 Maxygen Holdings Ltd. Faktor VII- oder VIIA-ähnliche Moleküle
US7524819B2 (en) 1999-11-18 2009-04-28 Ischemix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
EP2080771A2 (de) 2001-02-27 2009-07-22 Maxygen Aps Neue Interferon-betaartige Moleküle
EP2133098A1 (de) 2000-01-10 2009-12-16 Maxygen Holdings Ltd G-CSF-Konjugate
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
WO2012010516A1 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone conjugates
US8513192B2 (en) 2009-01-22 2013-08-20 Novo Nordisk A/S Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
US8779109B2 (en) 2010-01-22 2014-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8841249B2 (en) 2009-08-06 2014-09-23 Novo Nordisk A/S Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8865868B2 (en) 2008-08-06 2014-10-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
US9211342B2 (en) 2010-01-22 2015-12-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
WO2016179007A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders
EP3372617A2 (de) 2010-04-02 2018-09-12 Amunix Operating Inc. Bindungsfusionsproteine, bindungsfusionsproteinarzneimittelkonjugate, xten-arzneimittelkonjugate sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
EP2536752B1 (de) * 2010-02-16 2015-04-08 Novo Nordisk A/S Modifizierter, rekombinanter Faktor VIII

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
WO1993011772A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 The Trustees Of Princeton University Glycosylated steroid derivatives for transport across biological membranes and process for making same
WO1995007931A1 (en) * 1993-09-17 1995-03-23 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
DE4437502A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Basf Ag Hirudin-Konjugate aus Hirudin und lipophilen Verbindungen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
WO1993011772A1 (en) * 1991-12-13 1993-06-24 The Trustees Of Princeton University Glycosylated steroid derivatives for transport across biological membranes and process for making same
WO1995007931A1 (en) * 1993-09-17 1995-03-23 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
DE4437502A1 (de) * 1993-12-02 1995-06-08 Basf Ag Hirudin-Konjugate aus Hirudin und lipophilen Verbindungen

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURSTEDT, TORE ET AL: "Hydrophobic surfactant-associated polypeptides: SP-C is a lipopeptide with two palmitoylated cysteine residues, whereas SP-B lacks covalently linked fatty acyl groups", PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A. (1990), 87(8), 2985-9 CODEN: PNASA6;ISSN: 0027-8424 *
DATABASE CHEMABS CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; MURANISHI, SHOZO ET AL: "Preparation of insulin acylated at B chain for treatment of diabetes" *
WESS G ET AL: "PREPARATION OF 3A- AND 3B-(W-AMINOALKOXY)-7A,12A-DIHYDROXY-5B-CHOLAN OIC ACID ESTERS: VERSATILE SHUTTLES FOR DRUG TARGETING", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 34, no. 5, 29 January 1993 (1993-01-29), pages 817 - 818, XP000335945 *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005361A2 (en) * 1996-08-07 1998-02-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Long-acting drugs and pharmaceutical compositions comprising them
WO1998005361A3 (en) * 1996-08-07 1998-06-18 Yeda Res & Dev Long-acting drugs and pharmaceutical compositions comprising them
AU725468B2 (en) * 1996-08-07 2000-10-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Long-acting drugs and pharmaceutical compositions comprising them
US6504005B1 (en) 1996-08-07 2003-01-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Long-acting drugs and pharmaceutical compositions comprising them
US7524819B2 (en) 1999-11-18 2009-04-28 Ischemix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
US8034774B2 (en) 1999-11-18 2011-10-11 Ischemix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
US8772237B2 (en) 1999-11-18 2014-07-08 Ischemix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
EP2133098A1 (de) 2000-01-10 2009-12-16 Maxygen Holdings Ltd G-CSF-Konjugate
EP1982732A2 (de) 2000-02-11 2008-10-22 Maxygen Holdings Ltd. Faktor VII- oder VIIA-ähnliche Moleküle
EP2319541A1 (de) 2000-02-11 2011-05-11 Bayer HealthCare LLC Faktor VII- oder VIIA-ähnliche Konjugate
EP2080771A2 (de) 2001-02-27 2009-07-22 Maxygen Aps Neue Interferon-betaartige Moleküle
US8865868B2 (en) 2008-08-06 2014-10-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
US8513192B2 (en) 2009-01-22 2013-08-20 Novo Nordisk A/S Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
US8841249B2 (en) 2009-08-06 2014-09-23 Novo Nordisk A/S Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8779109B2 (en) 2010-01-22 2014-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US9211342B2 (en) 2010-01-22 2015-12-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
US9695226B2 (en) 2010-01-22 2017-07-04 Novo Nordisk Healthcare Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
EP3372617A2 (de) 2010-04-02 2018-09-12 Amunix Operating Inc. Bindungsfusionsproteine, bindungsfusionsproteinarzneimittelkonjugate, xten-arzneimittelkonjugate sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
CN103269720A (zh) * 2010-07-22 2013-08-28 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生长激素缀合物
WO2012010516A1 (en) * 2010-07-22 2012-01-26 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone conjugates
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate
WO2016179007A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders
EP4014985A1 (de) 2015-05-01 2022-06-22 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin-peptidomimetika zur behandlung von augenerkrankungen

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DE4437604A1 (de) 1996-04-25

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