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EINFÜHRUNG
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Technisches
Gebiet
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Das
Gebiet dieser Erfindung betrifft polymere Antigen-Zusammensetzungen,
die spezifisch den Antigenrezeptor von T-Zellen markieren.
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Hintergrund
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T-Lymphozyten
stellen einen wesentlichen Teil der körpereigenen Immunabwehr gegen
bakterielle, virale und protozoische Infektionen dar und sind an
der Abwehr von Krebszellen beteiligt. Zahlreiche Autoimmunsyndrome
sind ebenso mit Antigenspezifischen T-Zell-Angriffen auf verschiedene
Teile des Körpers
in Verbindung gebracht worden. Es ist deshalb von großem Interesse,
wenn man in der Lage ist, Antigen-spezifische Zellen während des
Verlaufes dieser Krankheiten zu verfolgen. Es wäre ebenso von großem therapeutischem Nutzen,
wenn T-Zellen, die für
ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, angereichert und dann im
Krankheitsfalle wieder eingeführt,
oder im Falle einer Autoimmunerkrankung selektiv verarmt werden
könnten.
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Die
vorhandene Technologie für
die Isolierung oder eine andere Identifizierung von Antigen-spezifischen
T-Zellen ist sehr unausgereift. Während die T-Zell-Antigenrezeptoren
(TCR) strukturell und genetisch den Antikörpern ähnlich sind, sind ihre Liganden
komplex und bestehen aus einem Peptid, das in ein Molekül des Haupthistokompatibilitätskomplexes
eingebettet ist. MHC-Proteine haben zwei Typen, Klasse I und Klasse II,
wobei jede von Ihnen einen bestimmten Typ T-Zellen bedient. Die
Klasse I Moleküle
interagieren mit CD8+ T-Zellen, wohingegen
die Klasse II Moleküle
mit CD4+ T-Zellen interagieren. Die zwei
Typen der MHC-Moleküle unterscheiden
sich in der Länge
der Peptide, die sie präsentieren
können.
Die Klasse I Peptid-Bindungsgrube ist an einem der beiden Enden
blockiert und hat dadurch erhebliche Beschränkungen hinsichtlich der Größe der Peptide,
die an sie binden können
(acht bis zehn Reste), wobei längere
Peptide in der Mitte ausgebeult sind. Die Klasse II Bindungsgrube
erlaubt es Peptiden, an ihren Enden herauszuragen und somit können weitaus
längere
Peptide (8 bis 30 Reste) binden.
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Die
Produktion von monoklonalen Antikörper-Reagenzien, die spezifisch
für verschiedene
T-Zell-Epitope variabler Region sind, ist schwierig. Weiterhin ist
das Markieren von Zellen mit diesen Reagenzien von beschränktem Nutzen,
wenn man daran interessiert ist, T-Zellen mit einer bestimmten Antigen-Spezifität zu charakterisieren.
Monoklonale Antikörper
sind gewöhnlich
gegen die variable Region des TCR gerichtet, einschließlich relativ
konservativer Sequenzen, nicht gegen die tatsächliche TCR-Bindungsstelle.
Monoklonale Antikörper
können
T-Zellen nachweisen, die die gleiche variable Region, aber unterschiedliche
Antigen-Spezifität
haben, während
sie T-Zellen mit der gleichen Antigen-Spezifität, aber unterschiedlicher variabler
Region, nicht nachweisen können.
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Frühere Versuche,
MHC-Protein-Peptidkomplexe zu benutzen, um spezifische T-Zellen zu markieren, sind
erfolglos geblieben, in erster Linie wegen der kurzen Halbwertszeit
des ternären
Peptid-MHC-T-Zell-Rezeptorkomplexes. Bei Raumtemperatur beträgt die Halbwertszeit
des ternären
Komplexes nur 12 bis 25 Sekunden. Wegen der entscheidenden Rolle,
die T-Zellen als Hauptbestandteil des Immunsystems spielen, bleibt es
von großer
Bedeutung, in der Lage zu sein, zu verstehen, wie T-Zellen selektiert,
aktiviert oder toleriert werden. Ein spezifischer Nachweis und die
Möglichkeit,
Antigen-spezifische T-Zellen physikalisch aufzureinigen oder abzutragen,
sind von besonderem Interesse.
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Relevante
Literatur
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Die
molekulare Struktur von einem Klasse I Haupthistokompatibilitätsantigen
ist bei Bjorkman et al. (1987) Nature 329: 506512 beschrieben. Die
Struktur eines Klasse 2-MHC-Antigen
ist bei J. Brown et al. (1993) Nature 364: 33–39 beschrieben. Die geringe
Affinität
des ternären
Komplexes, der aus T-Zell-Rezeptor, MHC-Antigen und antigenem Peptid
gebildet wird, ist bei K. Matsui et al. (1991) Science 254: 1788–1791 beschrieben.
Während
die Bindungsaffinitäten
von T-Zell-Rezeptoren im Bereich von 10–4 bis
10–7 M
liegen, liegt t½,
das die Stabilität
des Komplexes bestimmt, sehr nahe zwischen hoch- und niedrigaffinen
Rezeptoren und liegt zwischen 12 bis 25 Sekunden bei Raumtemperatur.
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Die
Rückfaltung
und Kristallisation von Klasse I MHC-Peptidkornplexen ist bei Garboczi
et al. (1992) P. N. A. S. 89: 3429–3433 beschrieben. Die Bildung
von funktionellen Klasse II Komplexen ist bei Altman et al. (1993)
P. N. A. S. 89: 10330–10334
beschrieben.
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Die
Substratspezifität
von E. coli BirA Enzymen ist bei P. Schatz (1993) Bio/Technology
11: 1138–1143 beschrieben.
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Verschiedene
Methoden zur Analyse der Peptidbindung am T-Zell-Rezeptor und an
Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen
sind erforscht worden. Fridkis-Hareli et al. (1994) P. N. A. S.
91: 4872–4876
erörtern
die Bindung von Peptiden an Klasse II MHC-Molekülen in lebenden Zellen. Ebenso
wurde ein Europium Fluoroimmuno-Assay
benutzt, um die Bindung von Antigenen an ein Klasse II MHC-Protein
zu messen, Tompkins et al. (1993) J. Immunol. Meth. 163: 209–216. Photoaffinitäts-Markierung des T-Zellrezeptors
wird bei Romero et al. (1993) J. Immunol. 150: 3825–3831 diskutiert.
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Ploegh
H und Benoroch P (1993) Nature 364: 16–17 beziehen sich auf die dreidimensionale
Struktur eines humanen Klasse II MHC Moleküls HLA-DR1. WO 92/07952 beschreibt
BindungsAssays mit MHC-Glykolproteinen. Dal Porto et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci: USA 90,6671-6675 beschreibt ein Fusionsprotein aus
den extrazellulären
Domänen
von Klasse I Polypeptiden der Maus und einer schweren Polypeptidkette
eines Immunglobulins. Schafer PH und Pierce SK (1994) Immunity 1:
699–707
beschäftigt
sich mit der kristallografischen Struktur des MHC Klasse II Moleküls. WO 93/10220
beschreibt chimäre
Proteine, die eine MHC-Komponente
aufweisen, die mit dem Bestandteil einer konstanten Region eines
Immunglobulins verbunden ist. Herrman SH und Mescher MF (1986) The
Journal of Immunology 136: 2816–2825
untersuchen zelluläre
und molekulare Anforderungen für
die Erkennung von Klasse I Antigen durch den Precursor von zytolytischen
T-Lymphozyten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Methoden
und Zusammensetzungen zum Markieren von T-Zellen werden entsprechend
der Spezifität von
deren Antigenrezeptor zur Verfügung
gestellt. Ein stabiler Komplex wird mit Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteinuntereinheiten hergestellt,
die eine im Wesentlichen homogen gebundene Peptid-Population haben.
Der multimere MHC-Antigenkomplex, wie er in Anspruch 1 definiert
ist, bildet eine stabile Struktur mit T-Zellen, die den Komplex
durch ihre Antigenrezeptoren erkennen, und dadurch das Markieren,
die Identifizierung und Reinigung von spezifischen T-Zellen erlauben.
Die Verfahren sind ebenso zur Diagnose und Überwachung von Krankheiten
geeignet, an denen das Immunsystem beteiligt ist.
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Beschreibung
von besonderen Ausführungsformen
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Es
werden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die T-Zellen
entsprechend der Spezifität
ihrer Antigenrezeptoren markieren. Ein stabiler multimerer Komplex
aus MHC-Proteinuntereinheiten und Peptidantigen wird, wie in Anspruch
1 definiert, hergestellt. Die Spezifität des multimeren Bindungskomplexes
wird sowohl durch das antigene Peptid als auch durch das MHC-Protein
bestimmt. Der Bindungskomplex bindet stabil mit dem Antigenrezeptor
auf der Oberfläche
von T-Zellen und erlaubt so den Nachweis von antigenspezifischen
T-Zellen. Der Bindungskomplex ist für den Nachweis, die Quantifizierung,
Charakterisierung und Aufreinigung von spezifischen T-Zellen geeignet.
Varianten des Bindungskomplexes für verschiedene MHC-Proteine und Peptidantigene
sind leicht herstellbar.
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Die
T-Zellrezeptor (TCR) Spezifität
bestimmt, welches Antigen eine bestimmte T-Zelle aktiviert. Gewöhnlich exprimieren T-Helferzellen
CD4 auf ihrer Oberfläche
und werden durch Bindung an einen Komplex aus antigenem Peptid und
Klasse II MHC-Molekülen aktiviert.
Gewöhnlich
exprimieren T-Zellen CD8 auf ihrer Oberfläche und werden durch Bindung
an einem Komplex von antigenem Peptid und Klasse I Molekül aktiviert. Die
Spezifität
des T-Zellantigenrezeptors liegt in der Kombination von Peptid und
MHC-Molekül,
das an das bestimmte TCR mit ausreichender Affinität bindet,
um die T-Zelle zu aktivieren. Die Bindungsaffinität liegt
gewöhnlich
mindestens bei ungefähr
10–4 M
wie bei Matsui et al. beschrieben (siehe oben).
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Der
Bindungskomplex kann eine breite Vielfalt von Peptid-MHC-Kombinationen
aufweisen. Multimere von Klasse I Molekülen werden üblicherweise benutzt, um CD8+ T-Zellen nachzuweisen und Klasse II Multimere
werden gewöhnlich
benutzt, um CD4+ T-Zellen nachzuweisen.
Die mengenmäßige Bestimmung
von T-Zellen kann durchgeführt
werden, um den Verlauf einer Reihe von Umständen, die mit der T-Zell-Aktivierung assoziiert
sind, zu überwachen,
einschließlich Autoimmunkrankheiten,
Transplantatabstoßung,
virale Infektionen, bakterielle und protozoische Infektionen. T-Zellen
mit einer besonderen Antigen-Spezifität können von komplexen Mischungen,
insbesondere biologischen Proben, durch die Bindung an die Bindungskomplexe
getrennt werden. Auf diese Weise kann eine selektive Verarmung oder
Anreicherung von besonderen T-Zellen erreicht werden.
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Der
multimere Bindungskomplex weist vier Monomere mit der Formel α-β-P auf. α ist eine α-Kette von einem
Klasse I oder Klasse II MHC-Protein. β ist eine β-Kette, die hier als die β-Kette eines
Klasse II MHC-Proteins oder β2
Mikroglobulins eines MHC Klasse I Proteins definiert ist. P ist
ein Peptidantigen. Der multimere Komplex bindet stabil mittels nichtkovalenter
Wechselwirkungen an einen T-Zell-Rezeptor mit der geeigneten Antigen-Spezifität. Verglichen
mit der Bindung eines (α-β-P) „Monomers" an eine T-Zelle,
hat der Bindungskomplex eine erheblich vergrößerte Stabilität, wobei üblicherweise
t½ auf
etwa das zehnfache vergrößert ist, häufiger um
etwa das zwanzigfache vergrößert ist
und wobei es auf ungefähr
das fünfzigfache
vergrößert sein kann.
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Die
MHC-Proteine können
von Säugetier
oder Vogelspezies sein, z. B. Primaten, insbesondere Menschen; Nagetieren,
einschließlich
Mäusen,
Ratten und Hamstern; Kaninchen; Pferden, Rindern, Hunden, Katzen
usw. Von besonderem Interesse sind humane HLA-Proteine und die H-2
Proteine von Mäusen.
In die HLA-Proteine sind die Klasse II Untereinheiten HLA-Dpα, HLA-DPβ, HLA-DGα, HLA-DQβ, HLA-DRα und HLA-DRβ und die
Klasse I Proteine HLA-A, HLA-B, HLA-C und β2-Mikroglobulin
eingeschlossen. Eingeschlossen in die H-2 Untereinheiten aus Mäusen sind
die Klasse I H-2K, H-2D, H-2L, und die Klasse II I-Aα, I-Aβ, I-Eα und I-Eβ, und β2-Mikroglobulin. Sequenzen
von einigen repräsentativen
MHC-Proteinen kann man in Kabat et al. Sequences of Proteins of
Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, pp. 724–815 finden.
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Die
MHC-Protein-Untereinheiten sind eine lösliche Form des normalerweise
membrangebundenen Proteins. Die lösliche Form erhält man aus
der nativen Form durch Abtrennung der transmembranen Domäne. Für gewöhnlich wird
das Protein unter Entfernung sowohl der Zytoplasma- als auch der
transmembranen Domäne
trunkiert. Das Protein kann durch proteolytischen Abbau trunkiert
werden oder indem eine gentechnisch trunkierte Form exprimiert wird.
Als Verweis wird die von Kabat et al. gezeigte Anordnung von Aminosäuren in Domänen verwendet.
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Für Klasse
I Proteine schließt
die lösliche
Form die α1, α2 und α3-Domäne ein.
Es sind nicht mehr als etwa 10, gewöhnlich nicht mehr als etwa
5, vorzugsweise keine der Aminosäuren
der transmembranen Domäne
enthalten. Die Tilgung kann etwa 10 Aminosäuren innerhalb der α3-Domäne umfassen,
vorzugsweise wird keine der Aminosäuren der α3-Domäne entfernt. Die Tilgung wird
derart durchgeführt,
dass die Fähigkeit
der α3-Domäne, sich
als eine Struktur mit Disulfidbindungen zu falten, nicht beeinträchtigt wird.
Die Klasse I β-Kette, β2-Mikroglobulin,
hat keine transmembrane Domäne
in ihrer nativen Form und braucht nicht trunkiert werden. Im Allgemeinen
werden keine Klasse II Untereinheiten in Verbindung mit Klasse I
Untereinheiten verwendet.
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Lösliche Klasse
II Untereinheiten schließen
die α1-
und die α2-Domäne für die α-Untereinheit und
die β1-
und β2-Domäne für die β-Untereinheit
mit ein. Es sind nicht mehr als etwa 10, gewöhnlich nicht mehr als etwa
5, vorzugsweise keine der Aminosäuren
der transmembranen Domäne
enthalten. Die Tilgung kann etwa 10 Aminosäuren innerhalb der α2- oder β2-Domäne umfassen,
vorzugsweise wird keine der Aminosäuren der α2- oder β2-Domäne entfernt. Die Tilgung wird
derart durchgeführt,
dass die Fähigkeit
der α2-
oder β2-Domäne, sich
als eine Struktur mit Disulfidbindungen zu falten, nicht beeinträchtigt wird.
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Man
könnte
wünschen,
an den Enden der Polypeptide eine kleine Anzahl von Aminosäuren einzuführen, gewöhnlich nicht
mehr als 20, normalerweise nicht mehr als 15. Die Tilgung oder Einfügung von
Aminosäuren
ist gewöhnlich
das Ergebnis von Anforderungen an das Konstrukt, brauchbare Restriktionsstellen,
zusätzliche
Verarbeitungssignale, leichte Handhabbarkeit, Verbesserungen im
Grad der Expression oder andere derartige Dinge zu ermöglichen.
Zusätzlich
könnte
man aus ähnlichen
Gründen
eine oder mehrere Aminosäuren,
normalerweise nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren in einer Domäne, durch
eine andere Aminosäure
substituieren wollen.
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Die α- und β-Untereinheiten
können
getrennt hergestellt werden und sich dann in vitro assoziieren,
um einen stabilen Heteroduplex-Komplex zu bilden (sh-Altman et al.
[1993], wie oben oder Garboczi et al. [1992] wie oben), oder beide
Untereinheiten können
in einer einzelnen Zelle exprimiert werden. Eine alternative Strategie
besteht darin, ein einzelnes Molekül mit sowohl der α- als auch
der β-Untereinheit
herzustellen. Ein „einkettiges
Heterodimer" wird
durch Fusionierung zweier Untereinheiten unter Verwendung eines
kurzen Peptidlinkers hergestellt, z. B. ein 15 bis 25 Aminosäuren-Peptid
oder Linker. Siehe Bedzyk et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 18615
für ähnliche
Strukturen mit Antikörper-Heterodimeren.
Das lösliche
Heterodimer kann auch durch Isolierung eines nativen Heterodimers
und Abbau mittels einer Protease, z. B. Papain, hergestellt werden
um ein lösliches
Produkt zu produzieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden lösliche
Untereinheiten unabhängig
voneinander aus einem DNA-Konstrukt exprimiert, das ein trunkiertes
Protein kodiert. Zur Exprimierung werden die DNA-Sequenzen in einen
geeigneten Expressionsvektor eingefügt, wobei die natürliche Initiationsstelle
für die
Transkription oder eine exogene Initiationsstelle für die Transkription
verwendet werden kann, z. B. ein Promotor, der ein anderer Promotor
ist, als der, der mit dem Gen in den normalerweise vorkommenden
Chromosomen assoziiert ist. Der Promotor kann durch rekombinante
Verfahren in vitro eingeführt
werden, oder als das Ergebnis einer homologen Integration der Sequenz
in das Chromosom. Eine große
Vielzahl von Initiationsstellen für die Transkription ist für eine große Anzahl
von Exprimierungswirten bekannt, wobei die Exprimierungswirte Prokaryoten
oder Eukaryoten sein können,
besonders E. coli, B. subtilis, Säugetierzellen, so wie z. B. CHO-Zellen,
COS-Zellen, Affennierenzellen, Lymphomzellen, insbesondere menschliche
Zelllinien und dergleichen. Im Allgemeinen ist ein auswählbarer
Marker, der in dem Exprimierungswirt funktionsfähig ist, beteiligt.
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Von
besonderem Interesse sind Expressionskassetten, die eine Initiierungsstelle
zur Transkription, das Gen, das die erfindungsgemäße MHC-Untereinheit
kodiert und eine Terminationsstelle zur Transkription, die optional
ein Signal zum Anheften einer poly A Sequenz hat, aufweisen. Geeignete
Restriktionsstellen können
an die Termini der MHC-Untereinheit eingebracht werden, so dass
verschiedene Untereinheiten in der Kassette zur Expression untergebracht
werden können.
Restriktionsstellen können
durch verschiedene Mittel eingebracht werden, z. B. durch Einführung während einer
Polymerase-Kettenreaktion, gezielter Mutagenese usw.
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Die
Untereinheiten werden in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert
und, wenn notwendig, gelöst.
Die zwei Untereinheiten werden mit einem antigenem Peptid kombiniert
und können
sich in vitro falten, um einen stabilen heterodimeren Komplex mit
innerkettig disulfidgebundenen Domänen zu bilden. Das Peptid kann
an der anfänglichen
Faltungsreaktion beteiligt sein oder kann zu dem leeren Heterodimer
in einem späteren Schritt
gegeben werden. Normalerweise ist die MHC-Bindungsstelle frei von
Peptiden, bevor das antigene Zielpeptid hinzugegeben wird. Die Ausnahme
besteht in solchen Fällen,
wo es wünschenswert
ist, die T-Zellen mit einem natürlichen
Peptid-MHC-Komplex zu markieren, so wie solche, die an der Oberfläche von
Zellen, die das Ziel für
einen Autoimmunangriff sind, vorhanden sein können, usw.
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Das
MHC-Heterodimer wird ein antigenes Peptid in der Mulde binden, die
von zwei von der Membran entfernten Domänen gebildet wird, entweder α2 und α1 für Klasse
I oder α1
und β2 für Klasse
II. Das gebundene Peptid wird im wesentlichen homogen sein, was
bedeutet, dass es weniger als etwa 10% des gebundenen Peptids gibt,
welches eine Aminosäuresequenz
hat, die sich von der gewünschten
Sequenz unterscheidet, gewöhnlich
weniger als etwa 5%, und normalerweise weniger als etwa 1%.
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Bedingungen,
unter denen die Faltung und Assoziierung von den Untereinheiten
und Peptiden möglich
sind, sind im Stand der Technik bekannt, z. B. bei Altman et al.
(1993) und Garboczi et al. (1992). Als ein Beispiel für geeignete
Bedingungen werden ungefähr äquimolare
Mengen von gelösten α- und β-Untereinheiten
in einer Harnstofflösung
gemischt. Die Faltung wird durch Verdünnung oder Dialyse in eine
gepufferten Lösung
ohne Harnstoff initiiert. Leere Klasse II Heterodimere werden bei
etwa pH 5–5,5
für etwa
ein bis drei Tage mit Peptiden beladen, gefolgt von Neutralisation,
Konzentration und Pufferwechsel. Es ist jedoch für jemand, der sich im Stand
der Technik auskennt, leicht verständlich, dass die spezifischen
Bedingungen für
die Faltung nicht kritisch für
die praktische Ausführung
der Erfindung sind.
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Das
antigene Peptid hat eine Länge
von 6 bis 12 Aminosäuren
für Komplexe
mit Klasse I MHC-Proteinen, gewöhnlich
von etwa acht bis zehn Aminosäuren.
Die Peptide haben eine Länge
von etwa 6 bis 20 Aminosäuren
für Komplexe
mit Klasse II MHC-Proteinen, gewöhnlich
von etwa 10 bis 18 Aminosäuren.
Die Peptide können
eine Sequenz haben, die von einer großen Anzahl von Proteinen stammt.
In vielen Fällen
ist es wünschenswert,
Peptide zu benutzen, die als T-Zell-Epitope wirken. Die Epitop-Sequenzen
einer Anzahl von Antigenen sind im Stand der Technik bekannt. Alternativ
kann die Epitop-Sequenz durch Isolierung und Sequenzierung von an
nativen MHC-Proteinen gebundenen Peptiden empirisch bestimmt werden,
durch Synthese einer Reihe von Peptiden von Zielsequenzen, dann
durch den Nachweis für
T-Zell-Reaktivität
für verschiedene
Peptide oder durch Herstellung einer Serie von Bindungskomplexen
mit verschiedenen Peptiden und Quantifizierung der T-Zell-Bindung. Die Präparation
von Fragmenten, Identifizierung von Sequenzen und Identifizierung
der Minimalsequenz ist ausführlich
im US-Patent Nr. 5,019,384, Ausgabe 28. Mai 1991, beschrieben worden
und Literaturstellen sind dort ebenfalls zitiert.
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Die
Peptide können
auf verschiedene Weise hergestellt werden. Gewöhnlich können sie mit konventionellen
Techniken unter Verwendung von automatischen Synthesizern synthetisiert
werden, oder sie können manuell
synthetisiert werden. Alternativ können DNA-Sequenzen hergestellt
werden, die das bestimmte Peptid kodieren und diese können kloniert
und exprimiert werden, um das gewünschte Peptid zu liefern. In
diesem Fall kann die erste Aminosäure Methionin sein. Zusätzlich können die
Peptide mit rekombinanten Verfahren hergestellt werden, indem sie
zu Proteinen zusammen geschlossen sind, die das eine Element eines
spezifischen Bindungspaares sind und die Aufreinigung des Fusionsproteins
mit Affinitätsreagenzien
erlauben, gefolgt von einem proteolytischen Abbau, der für gewöhnlich an
einer gentechnisch hergestellten Stelle erfolgt, um das gewünschte Peptid
zu erhalten (siehe als ein Beispiel Driscoll et al. (1993), J. Mol.
Bio. 232: 342–350). Die
Peptide können
ebenso aus natürlichen
Quellen isoliert und durch bekannte Techniken aufgereinigt werden,
einschließlich,
z. B., Chromatographie mit Ionenaustauschmaterialien, Trennung nach
Größe, Immunoaffinitätschromatographie
und Elektrophorese.
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Der
monomere Komplex (α-β-P) (hier
ein Monomer) wird multimerisiert. Das resultierende Multimer ist über eine
lange Zeitperiode stabil. Bei einer Lagerung von 4 Grad für ungefähr einen
Tag werden gewöhnlich nicht
mehr als 10% des Multimers dissoziiert, häufiger nach etwa einer Woche.
Das Multimer wird durch Bindung der Monomere an eine multivalente
Einheit durch Biotin-Komponenten an der α- oder β-Untereinheit gebildet, wie
im Detail unten beschrieben.
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Der
Biotin-Rest zur Bindung an die multivalente Einheit wird durch gentechnische
Verfahren eingeführt.
Einer der Untereinheiten wird mit einer Aminosäure-Sequenz fusioniert, die
eine Erkennungsstelle für
ein modifizierendes Enzym zur Verfügung stellt. Die Erkennungssequenz
wird gewöhnlich
an eine der Untereinheiten in der Nähe des C-Terminus fusioniert,
um eine potenzielle Behinderung an der Bindungsseite des antigenen
Peptids zu vermeiden. Gewöhnlich
enthält
eine Expressionskassette die Sequenz, die die Erkennungsstelle kodiert.
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Modifizierende
Enzyme, die von Interesse sind, schließen BirA ein. Das Monomer mit
einer biotinhaltigen Untereinheit wird dann an den multivalenten
Bindungspartner gebunden, z. B. Streptavidin oder Avidin, an die
Biotin mit extrem hoher Affinität
bindet. Streptavidin hat eine Valenz von 4 für einen Multimer von (α-β-P)4.
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Der
multivalente Bindungspartner kann in freier Lösung vorliegen oder kann an
einen unlöslichen
Träger
gebunden sein. Beispiele für
geeignete unlösliche
Träger
schließen
Kugeln ein, z. B. Magnetkugeln, Membranen und Mikrotiterplatten.
Diese sind typischerweise aus Glas, Plastik (z. B. Polystyren),
Polysacchariden, Nylon oder Nitrozellulose gemacht. Die Bindung
an einen unlöslichen
Träger
ist nützlich,
wenn der Bindungskomplex verwendet wird, um T-Zellen zu aufzutrennen.
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Häufig wird
der multimere Komplex markiert, um so direkt nachweisbar zu sein
oder er wird in Verbindung mit sekundär markierten Immunoreagenzien
verwendet, die spezifisch an den Komplex binden. Im Allgemeinen
hat das Label eine Eigenschaft, durch die es mit Licht nachweisbar
ist. Bevorzugte Label sind Fluorophore, so wie Fluorescein, Isothiocyanat
(FITC), Rhodamin, Texasrot, Phyzoerythrin und Allophyzocyanin. Andere
Label von Interesse können
Farbstoffe, Enzyme, chemilumineszente Stoffe, Partikel, Radioisotope oder
andere direkt oder indirekt nachweisbare Agenzien sein. Für gewöhnlich trägt der multivalente
Bindungspartner die markierende Gruppe. Alternativ kann ein Label
der zweiten Stufe benutzt werden, z. B. ein markierter Antikörper, der
gegen einen Bestandteil des Peptids gerichtet ist und dergleichen.
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Der
Bindungskomplex wird benutzt, um antigenspezifische T-Zellen nachzuweisen
oder zu trennen. Die T-Zellen können
aus jeder Quelle stammen, die gewöhnlich von derselben Sorte
Spezies stammt, wie das MHC-Heterodimer. Die T-Zellen können aus
einer in vitro Kultur oder aus einer physiologischen Probe kommen.
In den meisten Fällen
sind die benutzten physiologischen Proben Blut oder Lymphflüssigkeit,
aber die Proben können
auch aus anderen T-Zellen Quellen stammen, besonders von dort, wo
die T-Zellen invasiv sein können.
Folglich sind zum anderen auch Gewebe von Interesse oder damit in
Verbindung stehende Flüssigkeiten,
wie die in Hirn, Lymphknoten, Neoplasma, Milz, Leber, Niere, Pankreas,
Mandeln, Thymus, Gelenken, Synovia und dergleichen. Die Probe kann
so, wie man sie gewinnt, verwendet werden oder sie kann modifiziert werden,
wie im Falle einer Verdünnung,
Konzentration und dergleichen. Vorhergehende Behandlungen können die
Entfernung von Zellen mittels verschiedener Techniken einschließen, einschließlich Zentrifugation
unter Verwendung von Ficoll-Hypaque, waschen, Aftinitätstrennung
unter Verwendung von Antikörpern,
die für einen
oder mehrere Marker spezifisch sind, welche auf der Oberfläche von
Zellen als Oberflächenmembranproteine
vorhanden sind, oder irgendeine andere Technik, die eine Anreicherung
von der Gruppe oder Untergruppe der Zellen von Interesse zur Verfügung stellt.
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Der
Bindungskomplex wird zu einer Suspension hinzugegeben, die die interessierenden
T-Zellen enthält
und bei etwa 4°C
für eine
Zeit, die ausreichend ist, um den verfügbaren Oberflächenzellrezeptor
zu binden, inkubiert. Die Inkubation dauert gewöhnlich mindestens etwa 5 Minuten
und gewöhnlich
weniger als etwa 30 Minuten. Es ist wünschenswert, eine ausreichende
Konzentration des markierenden Reagenzes in der Reaktionsmischung
zu haben, so dass die Markierungsreaktion nicht durch einen Mangel
an markierendem Reagenz limitiert wird. Die geeignete Konzentration
wird durch Titration bestimmt. Das Medium, in dem die Zellen markiert
werden, ist irgendein geeignetes Medium, das aus dem Stand der Technik
bekannt ist. Wenn lebende Zellen gewünscht werden, wird ein Medium
ausgewählt,
das die Lebensfähigkeit
der Zellen aufrechterhält.
Ein bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte Salzlösung mit
einem Gehalt an 0,1 bis 0,5% BSA. Verschiedene Medien sind kommerziell
erhältlich
und können
entsprechend den Anforderungen der Zellen verwendet werden, einschließlich Dulbecco's Modified Eagle
Medium (dMEM), Hank's
Basic Salt Solution (HBSS), Dulbecco's phosphate buffered saline (dPBS),
RPMI, Iscove's medium;
PBS mit 5 mM EDTA, usw., häufig
unter Zusatz von fötalem
Kälberserum,
BSA, HSA usw.
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Wenn
ein markierendes Reagenz der zweiten Stufe benutzt wird, kann die
Zellsuspension gewaschen und in dem Medium, wie oben beschrieben,
vor der Inkubation mit dem Reagenz der zweiten Stufe resuspendiert
werden. Alternativ kann das Reagenz der zweiten Stufe direkt in
die Reaktionsmischung gegeben werden.
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Eine
Anzahl von Methoden zum Nachweis und der Quantifizierung von markierten
Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Durchflusszytometrie ist
ein übliches
Mittel, um Zellen zu zählen,
die einen kleinen Prozentsatz der Gesamtpopulation ausmachen. Fluoreszenzmikroskopie
kann ebenso verwendet werden. Verschiedene Immunoassays, z. B. ELISA,
RIA, usw. können
verwendet werden, um die vorhandene Anzahl von Zellen nach der Bindung
an einen unlöslichen
Träger
zu bestimmen.
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Durchflusszytometrie
kann ebenso verwendet werden, um eine markierte Untergruppe von
T-Zellen aus einer komplexen Mischung von Zellen zu trennen. Die
Zellen können
in jedem geeigneten Medium gesammelt werden, das die Lebensfähigkeit
der Zellen aufrechterhält,
für gewöhnlich mit
einem Serum-Kissen am Boden des Sammelröhrchens. Verschiedene Medien
sind kommerziell erhältlich,
wie oben beschrieben. Die Zellen können dann in geeigneter Weise
verwendet werden.
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Andere
Methoden zur Trennung nutzen aus, dass der Bindungskomplex direkt
oder indirekt an einen unlöslichen
Träger
gebunden ist, z. B. eine Säule,
Mikrotiterplatte, magnetische Kügelchen,
usw. Die Zellprobe wird zu dem Bindungskomplex gegeben. Der Komplex
kann durch alle üblichen
Mittel an den Träger
gebunden werden. Nach der Inkubation wird der unlösliche Träger gewaschen,
um nicht gebundene Komponenten zu entfernen. Das Waschen wird ein
bis sechs Mal mit einem ausreichenden Volumen durchgeführt, um
in der Probe vorhandene, nicht spezifisch gebundene Zellen gründlich auszuwaschen.
Die gewünschten
Zellen werden dann vom Bindungskomplex eluiert. Die besondere Verwendung
von magnetischen Partikeln zur Trennung von Zelluntergruppen aus
Komplexmischungen ist in Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11: 231–238 beschrieben.
-
Der
Nachweis und/oder die Quantifizierung von spezifischen T-Zellen
in einer Probe oder Fraktion kann mittels einer Vielzahl von spezifischen
Assays durchgeführt
werden. Im Allgemeinen misst der Assay die Bindung zwischen einer
Patientenprobe, gewöhnlich
aus dem Blut, im Allgemeinen in der Form von Plasma oder Serum,
und dem multimeren Bindungskomplex. Die Patientenprobe kann so wie
sie ist verwendet werden oder in geeigneter Weise verdünnt werden,
gewöhnlich
etwa 1 : 10 und meistens nicht mehr als 1 : 10.000. Die Assays können in
jedem physiologischen Puffer durchgeführt werden, z. B. PBS, physiologischer
Kochsalzlösung,
HBSS, dPBS usw.
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Ein
Sandwich-Assay wird durchgeführt,
indem zuerst der multimere Bindungskomplex an eine unlösliche Oberfläche oder
an einen unlöslichen
Träger
angeheftet wird. Der multimere Bindungskomplex kann an die Oberfläche durch
jede geeignete Methode gebunden werden, in Abhängigkeit der Natur der Oberfläche, entweder
direkt oder durch spezifische Antikörper. Die bestimmte Art und
Weise der Bindung ist nicht kritisch, solange sie mit den Reagenzien
und gesamten Verfahren der Erfindung kompatibel ist. Sie können an
die Platten kovalent oder nichtkovalent gebunden werden, vorzugsweise
nichtkovalent.
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Die
unlöslichen
Träger
können
jede Zusammensetzung haben, an die der multimere Bindungskomplex gebunden
werden kann, das schnell vom löslichen
Material getrennt werden kann und das ansonsten mit den gesamten
Methoden zur Messung von T-Zellen kompatibel ist. Die Oberfläche von
solchen Trägern
kann fest oder porös
und von jeder üblichen
Form sein. Beispiele für
geeignete unlösliche
Träger,
an die der Rezeptor gebunden ist, schließen Kügelchen, z. B. magnetische
Kügelchen,
Membranen und Mikrotiterplatten ein. Diese sind typischerweise aus
Glas, Plastik (z. B. Polystyren), Polysacchariden, Nylon oder Nitrozellulose
hergestellt. Mikrotiterplatten sind besonders geeignet, weil eine
große
Anzahl von Assays gleichzeitig durchgeführt werden können unter
Verwendung von wenigen Reagenzien und Proben.
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Bevor
Patientenproben oder Fraktionen zugegeben werden, werden auf dem
unlöslichen
Träger
die nicht spezifischen Bindungsstellen, das heißt, diejenigen, die nicht von
dem multimeren Bindungskomplex besetzt werden, im Allgemeinen blockiert.
Bevorzugte blockierende Agenzien schließen nicht interferierende Proteine,
so wie Rinderserum Albumin, Kasein, Gelatine und dergleichen ein.
Proben, Fraktionen oder Aliquots davon werden dann zu getrennt analysierbaren
Trägern
gegeben (z. B. in getrennte Schächte
einer Mikrotiterplatte), die den Träger gebundenen multimeren Komplex
enthalten.
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Im
Allgemeinen sind etwa 0,001 bis 1 ml verdünnte oder andere Proben ausreichend,
gewöhnlich
sind 0,01 ml ausreichend. Vorzugsweise wird jede Probe und der Standard
in mehrere Schächte
gegeben, so dass für
jedes gemittelte Werte erhalten werden können. Die Inkubationszeit sollte
so ausreichend bemessen sein, dass die T-Zellen den unlöslichen
Bindungskomplex binden können.
Im Allgemeinen sind etwa 0,1 bis 3 Stunden ausreichend, gewöhnlich ist
eine Stunde ausreichend.
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Nach
der Inkubation wird der unlösliche
Träger
von den ungebundenen Bestandteilen gewaschen. Im Allgemeinen wird
ein verdünnter
physiologischer Puffer mit einem geeigneten pH, im Allgemeinem 7
bis 8, als Waschmedium benutzt. Es können eine bis sechs Waschungen
durchgeführt
werden, mit einem ausreichenden Volumen, um in der Probe vorhandene,
nicht spezifisch gebundene T-Zellen auszuwaschen.
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Nach
dem Waschen wird eine Lösung
verwendet, die einen spezifischen zweiten Rezeptor enthält. Der
Rezeptor kann jede Komponente sein, die Patienten-T-Zellen mit ausreichender
Spezifität
bindet, so dass sie von anderen vorhandenen Komponenten unterschieden
werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind Zweit-Rezeptoren Antikörper,
die für
gewöhnliche
T-Zell-Antigene spezifisch sind, entweder monoklonale oder polyklonale
Seren, z. B. anti-thy-1, anti-CD45, usw.
-
T-Zell-spezifische
Antikörper
können
markiert werden, um eine direkte oder indirekte Quantifizierung der
Bindung zu ermöglichen.
Beispiele für
Label, die eine direkte Messung erlauben, schließen Radiolabel, wie 3H oder 125I, fluoreszierende
Stoffe, Farbstoffe, Kügelchen,
chemilumineszente Stoffe, kolloidale Partikel und dergleichen ein.
Beispiele für
Label, die eine indirekte Messung von Bindungen erlauben, schließen Enzyme ein,
bei denen das Substrat ein farbiges oder fluoreszierendes Produkt
ist. Beispiele für
geeignete Enzyme zum Gebrauch in Konjugaten schließen Meerrettich-Peroyxidase,
alkalische Phosphatase, Malat-Dehydrogenase und dergleichen ein.
Wo diese nicht kommerziell erhältlich
sind, können
solche Antikörper-Enzymkonjugate
leicht mittels Techniken hergestellt werden, die aus dem Stand der
Technik bekannt sind. Alternativ kann der zweite Rezeptor unmarkiert sein.
In diesem Fall wird eine für
den zweiten Rezeptor spezifische Komponente verwendet, die an den
gebundenen zweiten Rezeptor bindet. Solch eine für den zweiten Rezeptor spezifische
Komponente kann auf jede der o. g. Arten markiert werden. Es ist
möglich,
solche Komponenten auf eine Weise auszuwählen, dass solche multiplen
Komponenten jedes Molekül
des gebundenen zweiten Rezeptors binden. Beispiele von Zweit-Rezeptor/Zweit-Rezeptor-spezifischen
Molekülpaaren
schließen
Antikörper/Anti-Antikörper und
Avidin (oder Streptavidin)/Biotin ein. Da das resultierende Signal
auf diese Weise verstärkt
wird, kann diese Technik vorteilhaft sein, wenn nur eine kleine
Anzahl von T-Zellen vorhanden ist. Ein Beispiel ist die Verwendung
eines markierten Antikörpers,
der für
einen zweiten Rezeptor spezifisch ist. Genauer, wenn der Zweit-Rezeptor
ein anti-allotypischer Antikörper
vom Kaninchen ist, stellt ein gegen die konstante Region von Kaninchen-Antikörpern gerichteter
Antikörper
ein geeignetes, für
den Zweit-Rezeptor spezifisches Molekül dar. Das Anti-Immunglobulin
kommt gewöhnlich
aus einer anderen Quelle als vom Menschen, etwa vom Huhn, Nagetieren,
insbesondere Maus, oder Rind.
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Das
Volumen, die Zusammensetzung und Konzentration der T-Zell-spezifischen
Rezeptorlösung
erlaubt die messbare Bindung an die T-Zellen, die schon an das unlösliche Substrat
gebunden sind. Im Allgemeinen wird dasselbe Volumen wie bei der
Probe benutzt: etwa 0,01 bis 1 ml sind ausreichend, gewöhnlich ist 0,1
ml ausreichend. Wenn Antikörperliganden
verwendet werden, liegt die Konzentration im Allgemeinen bei etwa
0,1 bis 50 μg/ml,
vorzugsweise bei etwa 1 μg/ml.
Die Lösung
mit dem zweiten Rezeptor wird im Allgemeinen in einem pH-Bereich
von etwa 6,5 bis 9,5 gepuffert. Die Lösung kann auch ein nicht störendes Protein
enthalten, wie vorher beschrieben. Die Inkubationszeit sollte ausreichend
sein, damit der markierte Ligand an die vorhandenen Moleküle binden
kann. Im Allgemeinen sind etwa 0,1 bis 3 Stunden ausreichend, gewöhnlich ist eine
Stunde ausreichend.
-
Nachdem
der Zweit-Rezeptor oder das Zweit-Rezeptor-Konjugat gebunden hat,
wird der unlösliche Träger im Allgemeinen
wieder von dem nicht spezifisch gebundenen zweiten Rezeptor freigewaschen,
im wesentlichen wie für
die vorherigen Waschungen beschrieben. Nachdem nicht spezifisch
gebundenes Material entfernt worden ist, wird das von dem gebundenen
Konjugat erzeugte Signal mit konventionellen Mitteln nachgewiesen.
Wird ein Enzymkonjugat verwendet, dann wird ein geeignetes Enzymsubstrat
zur Verfügung
gestellt, so dass ein nachweisbares Produkt gebildet wird. Genauer,
wenn das ausgewählte
Enzymkonjugat eine Peroxidase ist, ist eine bevorzugte Substratkombination
N2O2 und O-Phenylendiamin,
das unter geeigneten Reaktionsbedingungen ein farbiges Produkt ergibt.
Geeignete Substrate für
andere Enzymkonjugate, so wie sie oben offenbart sind, sind solche,
die gemäß dem Stand
der Technik bekannt sind. Geeignete Reaktionsbedingungen, so wie
Mittel zum Nachweis der verschiedenen geeigneten Konjugate oder
ihrer Produkte sind auch aus dem Stand der Technik bekannt. Für das Produkt
von dem Substrat O-Phenylendiamin z. B. wird gewöhnlich die Lichtabsorption
bei 490 bis 495 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.
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Im
Allgemeinen wird die Anzahl der nachgewiesenen gebundenen T-Zellen
mit Kontrollproben aus Proben verglichen, die einen anderen MHC
Zusammenhang haben, z. B. T-Zellen aus einem Tier, das nicht die
MHC-Moleküle
exprimiert, die für
den Bindungskomplex verwendet werden.
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Eine
alternative Vorgehensweise ist es, Anti-T-Zell-Reagenzien zu verwenden,
z. B. anti-thy-1, anti-CD45 usw., die an die unlösliche Oberfläche gebunden
sind. Nach Zugabe der Probe und dem Auswaschen nicht-spezifisch
gebundener T-Zellen werden ein oder eine Kombination der erfindungsgemäßen Bindungskomplexe
hinzugegeben, wobei die Bindungskomplexe so markiert werden, dass
hinsichtlich der Bindung an T-Zellen keine Beeinflussung auftritt.
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In
einer klinischen Umgebung ist es besonders bequem, die Assays mit
einem selbständigen
Gerät durchzuführen. Eine
Anzahl von solchen Verfahren ist nach dem Stand der Technik bekannt.
Der Apparat verendet im Allgemeinen eine kontinuierliche Flussleitung
eines geeigneten Filters oder einer Membran mit mindestens drei
Bereichen, einen Bereich zum Transport der Flüssigkeit, einen Probenbereich
und einen Messbereich. Der Probenbereich wird vor dem Kontakt der
Flüssigkeit
mit anderen Teilen der Flussleitung vor dem Erhalt der Probe geschützt. Nachdem
der Probenbereich die Probe erhalten hat, wird sie in eine Flüssigkeit austauschende
Verbindung mit den anderen Bereichen gebracht und der die Flüssigkeit
austauschende Bereich wird mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht,
damit eine Reagenzlösung
den Probenbereich passieren und in den Messbereich gelangen kann.
Der Messbereich kann den multimeren Bindungskomplex an ihn gebunden
haben, mit einem Konjugat eines Enzyms mit einem T-Zell-spezifischen
Antikörper,
der als Reagenz verwendet wird und im Allgemeinen vor der Anwendung zu
der Probe gegeben wird. Alternativ kann der Bindungskomplex an ein
Enzym konjugiert sein, mit einem an den Messbereich gebundenen T-Zell-spezifischen
Antikörper.
-
Der
Nachweis von T-Zellen ist in Verbindung mit einer Anzahl von Umständen, die
mit der T-Zellen-Aktivierung verbunden sind, von Interesse. Solche
Umstände
schließen
Autoimmunkrankheiten ein, z. B. Multiple Sklerose, Myasthenia gravis,
Rheumatoide Arthritis, Typ 1 Diabetes, Graft vs. Host Reaktion,
Basedow-Krankheit usw.; verschiedene Formen von Krebs, z. B. Karzinome,
Melanome, Sarkome, Lymphome und Leukämien. Verschiedene Infektionskrankheiten,
die durch Viren verursacht werden, z. B. HIV 1, Hepatitis, Herpesviren,
enterale Viren, respiratorische Viren, Rhabdovirus, Röteln, Pockenvirus,
Paramyxoviren, Masernvirus, usw. sind von Interesse. Infektiöse Agenzien
von Interesse schließen
ebenso Bakterien ein, so wie Pneumokokken, Staphylokokken, Bazillen,
Streptokokken, Meningokokken, Gonokokken, Eschericia, Klebsiella,
Proteus, Pseudomonas, Salmonellen, Shigella, Hämophilus, Yersenia, Listerien,
Corynebakterien, Vibrio, Clostridien, Chlamydien, Mykobakterium,
und Treponema; protozoische Pathogene und dergleichen. T-Zell-assoziierte allergische
Reaktionen können
ebenso überwacht
werden, z. B. verzögerte Überempfindlichkeit
oder Kontaktüberempfindlichkeit
mit Beteiligung von T-Zellen.
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Von
besonderem Interesse sind Umstände,
die mit einem spezifischen Peptid oder MHC Haplotyp assoziiert sind,
wobei die erfindungsgemäßen Bindungskomplexe
benutzt werden können,
um die T-Zell-Antwort in Bezug auf den Haplotyp und das Antigen
zu verfolgen. Eine große
Anzahl von Verbindungen sind zu Krankheitszuständen gefunden worden, die nahe
legen, dass spezifische MHC Haplotype oder spezifische Protein-Antigene
für Krankheitszustände verantwortlich
sind. Ein direkter Nachweis von T-Zellen in Patientenproben ist
jedoch nicht möglich
gewesen. Nachweis und Quantifizierung mit den erfindungsgemäßen Bindungskomplexen
erlaubt einen solchen direkten Nachweis. Als Beispiel kann die Aktivität von zytolytischen
T-Zellen gegen HIV-infizierte CD4+ T-Zellen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
bestimmt werden. Die Verbindung von Diabetes mit dem DQB1*0302 (DQ
3.2) Allel kann durch den Nachweis und die Quantifizierung von T-Zellen,
die dieses MHC-Protein in Kombination mit verschiedenen Peptiden
des Interesses erkennen, untersucht werden. Die Anwesenheit von
für Peptide
des basischen Myelin-Proteins spezifischen T-Zellen in Verbindung
mit MHC-Proteinen von Multiple Sklerose-Patienten kann bestimmt
werden. Die antigene Spezifität
kann für
die große
Anzahl von aktivierten T-Zellen bestimmt werden, die in der synovialen
Flüssigkeit
von Rheumatoiden Arthritis-Patienten gefunden werden. Es ist zu
hervorzuheben, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auf eine Anzahl
von Erkrankungen und immunassoziierten Umständen anwendbar sind.
-
Die
Isolierung von antigenspezifischen T-Zellen findet breite Anwendungsmöglichkeiten.
Die isolierten T-Zellen können
in der Behandlung von Krebs im Falle von Tumorinfiltrierenden Lymphozyten
angewandt werden. Spezifische T-Zellen können aus einem Patienten isoliert,
in einer Kultur durch Zytokine, Antigenstimulation expandiert werden
usw. und in den autologen Wirt zurückgebracht werden, so dass
sie eine vergrößerte Immunität gegen
das Zielantigen zur Verfügung
stellen. Eine Patientenprobe kann an T-Zellen, die mit einem spezifischen
Antigen reagieren, verarmt werden, um die Autoimmunantwort zu vermindern.
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Die
DNA-Sequenz von einzelnen T-Zell-Rezeptoren mit einer gegebenen
Antigen-Spezifität wird bestimmt,
indem einzelne Zellen mit dem erfindungsgemäßen Trennverfahren isoliert
werden. Für
gewöhnlich wird
zur Isolierung von einzelnen T-Zellen
Durchflusszytometrie in Verbindung mit Einzelzell-PCR-Amplifikation
verwendet. Um unbekannte TCR-Sequenzen zu amplifizieren, kann Anker-PCR
verwendet werden. Ein Amplifikations-Primer ist für eine konstante
TCR-Region spezifisch. Der andere Primer wird mit dem Ende von cDNA
verbunden, die aus TCR kodierender mRNA synthetisiert ist. Die variable
Region wird durch PCR zwischen der Sequenz der konstanten Region
und dem verbundenen Primer amplifiziert. Die Hemmung der Immunfunktion
kann durch Induktion einer Anergie durch spezifische T-Zellen erreicht
werden oder durch Entfernung von reaktiven T-Zellen. Die erfindungsgemäßen Bindungskomplexe
erlauben eine Therapie, die gegen sehr spezifische Untergruppen
von T-Zellen gerichtet ist. Die Fähigkeit, Funktionen des Immunsystems
zu inhibieren, ist als therapeutisch nützlich zur Behandlung einer
Anzahl von Krankheiten wie etwa Atherosklerose, Allergien, Autoimmunkrankheiten,
bestimmte Malignitäten,
Arthritis, entzündliche
Darmkrankheiten, Transplantatabstoßungen und Reperfusionsschäden bekannt.
Spezifische Krankheiten von Interesse schließen systemischen Lupus Erythematosus; Rheumatoide
Arthritis; Polyarteritis nodosa; Polymyositis; Dermatomyositis; Progressive
systemische Sklerose (diffuse Sklerodermie); Glomerulonephritis;
Myasthenia gravis; Sjorgren-Syndrom; Hashimoto-Thyreoiditis; Basedow-Krankheit;
Nebennierenentzündung;
Hypoparathyreoidismus; perniziöse
Anämie;
Diabetes; Multiple Sklerose and verwandte Entmarkungskrankheiten;
Uveitis; Pemphigus; Pemphigoid; Zirrhose; Colitis ulcerosa; Myocarditis;
regionale Enteritis; akutes Atemnotsyndrom des Erwachsenen; lokale
Manifestationen von Arzneimittelwirkungen wie Dermatitis, usw.;
entzündliche
oder allergische Erscheinungen der Haut; atopische Dermatitis und
infantiles Ekzem; Kontaktdermatitis; Psoriasis; Lichen planus; allergische
Enteropathien; Heuschnupfen; Bronchialasthma; Transplantatabstoßung, z.
B. Herz, Niere, Lunge, Leber, Inselzellen des Pankreas, usw.; überempfindliche
oder schädliche
Reaktionen auf infektiöse
Erreger; Poststreptokokken Krankheiten, z. B. kardiale Erscheinungen
von rheumatischen Fieber und dergleichen.
-
Um
spezifische T-Zellen abzutrennen, kann der erfindungsgemäße Bindungskomplex
an einen Toxinbestandteil gebunden werden. Verschiedene zytotoxische
Agenzien sind bekannt und sind in Verbindung mit spezifisch bindenden
Molekülen
verwendet worden. Anschauliche Beispiele für diese Komponenten sind Rizin, Abrin,
Diphterietoxin, Maytansinoide, Cisplatin und dergleichen. Bei zwei
Untereinheiten wird nur die zytotoxische Untereinheit verwendet,
z. B. die α-Einheit
von Rizin. Das Toxin wird mit dem Bindungskomplex konjugiert, im
Allgemeinen mit Hilfe von einem Crosslinker oder einer anderen Konjugation,
die eine Disulfidbindung mit einschließt. Toxin-Konjugate sind in
dem US-Patent Nr. 5,208,020; US-Patent Nr.: 4,863,726; US-Patent Nr.
4,916,213 und US-Patent Nr. 5,165,923 offenbart. Das Toxin-Konjugat
wird gegeben, damit die Ziel-T-Zellen spezifisch eliminiert werden
ohne eine signifikante Toxizität
gegen andere Zellen zu erzeugen.
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Die
erfindungsgemäßen Bindungskomplexe
können
einem Wirt gegeben werden, um eine Anergie von spezifischen T-Zellen
zu induzieren. Der Bindungskomplex induziert eine T-Zell-Anergie
nach dem Binden, weil die co-stimulierenden Moleküle, die
für die
T-Zell-Aktivierung notwendig sind, nicht vorhanden sind. Die Bindungskomplexe
werden Individuen, vorzugsweise Säugetieren, in einer Weise gegeben,
dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Bindungskomplexe die Ziel-T-Zellen
erreichen und an sie binden, maximiert wird, und hierdurch eine
Anergie induziert wird. Dieses inhibiert in Folge die Immunantwort,
die durch diese T-Zellen vermittelt wird.
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Die
Dosis für
Individuen von verschiedenen Spezies und für verschiedene Krankheiten
wird durch Messung des Effektes des Bindungskomplexes auf die Verminderung
von diesen Parametern gemessen, die für die behandelte Krankheit
anzeigend sind. Die Bindungskomplexe werden normalerweise parenteral
gegeben, vorzugsweise intravenös.
Die Dosen für
Bindungskomplexe im Mausmodell reichen im Allgemeinen von etwa 0,5
bis 2 mg pro Wirt pro Woche für
etwa eine bis vier Wochen. Die Dosis für die Bindungskomplexe kann in
Abhängigkeit
von der bestimmten Krankheit wiederholt periodisch gegeben werden
müssen.
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Bei
parenteraler Gabe werden die Bindungskomplexe in einer injizierbaren
Dosierform (Lösung,
Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten
parenteralen Träger
formuliert. Solche Träger
wirken von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele
für solche
Vehikel sind Wasser, Salzlösung,
Ringerlösung,
Dextroselösung
und Hanklösung.
Nicht wässrige
Träger,
wie etwa feste Öle
und Ethyloleat können
ebenso verwendet werden. Der Träger
kann kleinere Mengen Additive enthalten, wie Substanzen, die die
Isotonizität
und chemische Stabilität
vergrößern, z.
B. Puffer und Konservierungsstoffe. Die Bindungskomplexe werden
vorzugsweise in gereinigter Form formuliert, im wesentlichen frei
von Aggregaten und anderen Proteinen bei Konzentrationen von etwa
1 bis 50 mg/ml. Geeignete pharmazeutische Träger und ihre Formulierungen
sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin beschrieben.
-
Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben und nicht
zur Einschränkung.
-
Experimentelles
-
Synthese eines
tretrameren MHC-Antigen-Peptid-Komplexes
-
Die
Herstellung eines tretrameren MHC-Antigen-Peptid-Bindungskomplex-Reagenzes wird wie
folgt durchgeführt.
Kurz gesagt wurden Plasmidvektoren hergestellt, um ein Fusionsprotein
aus einem mit einem der Ketten von einem Klasse 2 MHC-Molekül verbundenen
BirA Substrat Peptid (BSP) (sh. Schatz et al. [1993]) zu exprimieren.
Die α-Kette
von dem I-Ek der Maus wurde benutzt.
-
Das
Fusionsprotein, genannt Ec-I-Eκ α-BSP
wurde in E. coli exprimiert. Das Fusionsprotein wurde dann in vitro
mit dem Ec-I-Eκ α gefaltet
und die αβ-Heterodimere wurden
auf einer Immunoaffinitätssäule (beschrieben
in Altman et al. [1993] sh. o. und Wettstein et al. [1991] J. Exp.
Med. 714: 219–228)
aufgereinigt. Die Heterodimere wurden in vitro mit dem aufgereinigten
BirA-Enzym biotiniliert. Spezifische antigene Peptide werden dann
in das MHC-Heterodimer eingefügt.
Der Komplex wird an Streptavidin, das vorher mit Texas-Rot markiert
wurde, gebunden und durch Gelfiltrationschromatographie aufgereinigt.
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Herstellung
des Plasmids zur Expression von Ec-I-Eκ α-BSP
-
Unter
Verwendung der Polymerase Kettenreaktion wurde für das BirA-Substrat Peptid
mit 15 Resten (BSP) (SEQ ID NO: 1) LHHILDAQKMVWNHR kodierende DNA
mit dem 3' Ende
eines vorher beschriebenen Genes für die Expression von löslichem
I-Eκ α in
E. coli (Altmann, 1993) fusioniert (Schatz, 1993). Ein antisense Oligonukleotid
wurde hergestellt (SEQ ID NO: 2) 5'CCGGAATTCTTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCC-AGAATATGATGCAGGAGGAGGGGTTTTCTCTTC
3'. In der sense
Richtung stellt das Oligonukleotid 18 dem C-Terminus von löslichem
Ec-I-Eκ α entsprechenden
Basen, 45 Basen, die BSP kodieren, ein Stop-Kodon und eine EcoR1
Restriktionsstelle und angrenzende Basen zur Verfügung. Der
sense Primer für
die PCR (SEQ ID NO: 3) CATATG-GCTAGCATCAAAGAGGAACACACCAT ist vorher
beschrieben worden (Altman, 1993).
-
Die
Genkodierung für
die Ec-I-Eκ α-BSP
wurde unter Verwendung des Ultma-Enzyms
(Perkin-Elmer/Cetus) entsprechend den Anweisungen des Herstellers
mit den zur Verfügung
gestellten Puffer-Komponenten amplifiziert. Die Amplifizierungsmischungen
enthielten 50 μM
dNTP, 1,5 mM MgCl2 und 0,1 μg des pGEM-EAK-Plasmids
als Ziel-DNA. Die Reaktionsmischungen wurden drei Zyklen bei 94
Grad für
eine Minute, 45 Grad für
eine Minute und 72 Grad für
eine Minute ausgesetzt. Die Erwärmungstemperatur
wurde dann von 45 Grad auf 55 Grad für zwölf zusätzliche Zyklen erhöht, gefolgt
von einer abschließenden
Inkubation von 72 Grad bei sieben Minuten.
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Das
PCR Produkt wurde dann mit NheI und mit EcoRI abgebaut und wurde
in das mit denselben Enzymen abgebaute pGEMEX-1 Plasmid (Promega)
eingebunden.
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Die
Plasmide wurden in den E. coli-Stamm JM109 transformiert und Klone,
die die richtige Sequenz enthielten, wurden durch Sequenzierung
der Doppelstrangplasmid-DNA
mit Sequenase (Amersham/USB) identifiziert. Ein Plasmid, das die
richtige Sequenz für
das Ec-I-Eκ α-BSP-Gen
enthielt, wurde benutzt, um den BL21(DE3) pLysS Strang von E. coli
zur Expression des Fusionsproteins zu benutzen.
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Expression
von Ec-I-Eκ α-BSP
und in vitro Faltung
-
Ec-I-Eκ α-BSP-Proteinhaltige
Inklusionskörper
wurden gemäß etablierter
Protokolle (Altman et al. [1993]) mit den folgenden Modifikationen
hergestellt. Nach der Expression wurde das Protein in einem Puffer ohne
reduzierende Agenzien (z. B. Dithiothreitol oder Merkaptoethanol)
gelöst,
die aber alle vorher genannten Komponenten wie beschrieben enthielten
(6 M Guanidiumhydrochlorid, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Die Proteinkonzentration
wurde bei und unter 1 mg/ml gehalten und die Disulfide konnten sich
durch Luftoxidation über
drei bis fünf
Tage bilden, während
das Protein weiterhin im denaturierten Zustand war. Für die Ec-I-Eκ α-Kette wurde dieses
modifizierte Protokoll ebenso angewandt.
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Lösliche Ec-I-Eκ-Heterodimere
wurden im großen
Umfang in vitro durch Faltungsreaktionen produziert wie beschrieben
(Altman, 1993), außer
dass Glutathion und Peptidliganden an den Faltungsreaktionen nicht beteiligt
waren. Leere Ec-I-Eκ α-BSP/β Heterodimere
wurden durch Immunoaffinitätschromatographie
auf einer Säule,
die das Anti-I-Ek monoklonale Antikörper 14-4-4S
enthielt, wie beschrieben isoliert (Wettstein, 1991). Für BPS wurde
der Induktionspuffer der Säule
durch Diafiltration in einem Centricon 30 Ultrafiltrationsgerät (Amicon)
ausgetauscht.
-
Enzymatische
Biotinylation von Ec-I-Eκ-BSP
-
Das
pJS169-Plasmid ist ein pACYC184-Derivat, das die Überexpression
von K unter der Kontrolle des tac promoters steuert. Nach der Expression
und Lyse der Bakterienzelle wurde das BirA durch Säulenchromatographie
aufgereinigt, zuerst auf Fast Flow Blue Sepharose und dann durch
Ionenaustauschchromatographie auf einer MonoS-Säule (Pharmacia). Jede BirA-Charge
wurde hinsichtlich der Aktivität
in einem Reaktionsgemisch mit 20 mM Tris (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5
mM ATP, 100 μM Biotin
und 2,3 μM
Ec-I-Eκ-BSP
titriert. Die Ansätze
wurden für
16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Entfernung von
freiem Biotin durch Diafiltration mit Centricon 30 Konzentratoren
wurden der Biotinilierungsgrad durch eine Kombination von Präzipitation
mit Streptavidin-Agarose (Sigma) und mengenmäßiger Bestimmung nicht-präzipitierbarem
I-Eκ durch Sandwich
ELISA bestimmt. Verschiedene Verdünnungen von biotiniliertem
Ec-I-Eκ-BSP
werden in einem kleinen Volumen von Streptavidin-Agarose-Kügelchen über Nacht
bei vier Grad in einem 2-Prozent-BSA
und 5 mM Natriumazid in PBS-haltigem Puffer inkubiert. Die Überstände aus
diesen Mischungen wurden genauso wie die Kontrollen mit den unmodifizierten
Agarose-Kugeln danach mit ELISA untersucht.
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Für ELISA
werden Immulon-4-Platten über
Nacht bei vier Grad mit 14-4-4S bei einer Konzentration von 3,3 μg/ml in PBS
beschichtet. Die Platten werden mit 2-prozentigen BSA in PBS-Puffer für eine Stunde beim
Raumtemperatur blockiert. Serienmäßige Verdünnungen von Ec-I-Ek-BSP-haltigen
Lösungen
und ein Standard mit einer bekannten Ec-I-Ek-Konzentration
werden auf der Platte für
ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen
der Platte mit Waschpuffer (0,25% BSA/0,05% Tween20/5 mM Natriumazid)
wurde ein Kaninchen Anti Ec-I-Ek-Antiserum
bei einer Verdünnung
von 1 : 4.000 bis 1 : 10.000 für eine
Stunde aufgebracht. Zum Schluss wurde der Assay durch Zugabe von
einem Maus-gebundenen Ziege-Anti-Kaninchen-alkalische Phosphatase
Konjugat (Inkubationszeit 1 Stunde) und Zugabe von Substrat (Sigma
AP 104 Tabletten) entwickelt. Typischerweise werden 90 bis 100 Prozent
vom Ec-I-Ek aus den Lösungen durch Präzipitation
durch mit Streptavidin-Agarose entfernt, was die nahezu komplette
Biotinilierung des Ec-I-Ek-BSP-Proteins
widerspiegelt. Ec-I-Ek-Proteine ohne BSP werden nach diesem
Protokoll nicht biotiniliert, was stark daraufhin deutet, dass die
Biotinilierung an einer einzelnen Stelle am BSP erfolgt.
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Die Beladung
des Bio-Ec-I-Ek-BSP mit Peptid
-
Enzymatisch
biotinilierte Proteine werden mit dem 88–103 Peptid aus Motten-Cytochrom C, SEQ
ID NO: 4, ANERADLIAYLKQATK gemäß gängigen Protokollen
beladen (Wettstein [1991], wie oben; Reay [1992] wie oben). Das
leere αβ-Heterodimer wurde
mit Mcllvaine's
Zitronenphosphatpuffer (CPB) bei 37 Grad in behandelten Mikorzentrifugenröhrchen inkubiert.
Die Reaktionen wurden auf einen pH von 7.0 durch Zugabe von 2 M
Na2HPO4 eingestellt.
Die peptidbeladenen Bio-Ec-I-Ek-BSP-Moleküle werden durch Gel-Filtration
auf Superdex 200 Säulen
in einer mobilen PBS-Phase aufgereinigt.
-
Herstellung
von Bio-Ec-I-Ek-BSP-Tetrameren
-
Tetramere
wurden durch Mischen der Bio-Ec-I-Ek-BSP-Moleküle mit Streptavidin-Texas-Rot (Boehringer,
Mannheim) bei einem molaren Verhältnis
von 4 : 1 hergestellt. Um die Herstellung von Tetrameren zu maximieren,
wird die gewünschte
Menge Streptavidin in 10 gleichen Schritten hinzugegeben mit einer
Inkubationszeit von 15 Minuten zwischen den Zugaben. Dies stellt
sicher, dass das bei jeder Zugabe zugegebene Streptavidin mit Bio-Ec-I-Ek-BSP gesättigt
ist und nach der zehnten Zugabe enthält die Mischung hauptsächlich Bio-Ec-I-Ek-BSP-Tetramere und kleine Mengen überschüssigen Streptavidins
und das Ec-I-Ek-Protein, das nicht durch
BirA biotiniliert wurde.
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Die
Streptavidin-TR-Bindungsreaktion werden zuerst in Centricon 30 Geräten konzentriert
und die kleineren Verunreinigungen werden auf einfache Weise durch
Gel-Filtration mit Superdex-200-Säulen entfernt. Das Tetramer
eluiert aus der Säule
in einem frühen
Peak entsprechend einem molekularen Gewicht von etwa 250.000, während die
Verunreinigungen ein molekulares Gewicht um etwa 50.000 haben. Die
markierten Tetramere werden zu einer Konzentration von 3–4 mg/ml
konzentriert und werden vor der Verwendung in PBS + 5 mM Natriumazid
bei 4 Grad in bernsteinfarbigen Phiolen aufbewahrt.
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Markierung
von antigenspezifischen T-Zellen mit einem tetrameren MHC-Antigenpeptid-Komplex
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Zellen
von den ableitenden Lymphknoten einer 5C.C7 T-Zell-Rezeptor (TCR)
transgenen Maus werden mit den Lymphknotenzellen einer nicht-transgenen
AK/J-Maus in verschiedenen
Verhältnissen
gemischt. Die transgene Maus ist bei Seder et al. (1992) J. Exp.
Med. 176: 1091–1098
beschrieben. Sie ist hinsichtlich einer α- und β-Kette des 5C.C7 T-Zell-Rezeptors
transgen. Die 5C.C7-Maus hat einen B10.BR genetischen Hintergrund,
welche Ec-I-Ek und Thy 1.2 positiv ist,
während
der AKR/J-Stamm
auch Ec-I-Ek positiv, aber Thy 1.2 negativ
ist. Der Thy 1 allotypische Marker erlaubt deshalb eine einfache
Identifizierung von T-Zellen aus den transgenen Mäusen. FACS
Plots zeigen Zellen, die sich als CD4+ und negativ für CD8, B220
und Mac-1 erweisen, unter Verwendung der Desk Software der Stanford
FACS Einrichtung, die Daten sind in 1 gezeigt.
Die Antikörper
und Konzentrationen, die in den Färbeexperimenten verwendet wurden,
sind in Tabelle 1 aufgelistet.
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2 × 106 Zellen bei einer Konzentration von 4 × 107 Zellen/ml wurden mit dem Färbereagenz
30 bis 60 Minuten bei 4 Grad inkubiert. Die Zellen wurden vor der
Analyse einmal mit PBS + 2% FCS gewaschen. Die in 1 gezeigten
Daten ergeben sich aus der Analyse von 5 × 105 Zellen.
Die Daten in 2 wurden aus einer Analyse von
5 × 104 Zellen erhalten.
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Das
Experiment mit dem Mischen zeigt, dass das multimere Markierungsreagenz
mit den transgenen Zellen bindet, sogar mit einem großen Hintergrund
nicht-transgener Zellen, von denen viele auch an I-Ek gebundene
Peptide erkennen.
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Durch
das folgende Experiment wurde gezeigt, dass die Färbung mit
dem erfindungsgemäßen Markierungsreagenz
spezifisch für
transgene T-Zell-Rezeptoren ist. 5C.C7 transgene Lymphknotenzellen
wurden vorher mit einem KJ25 monoklonalem Antikörper blockiert, der spezifisch
für die
TCR.Vβ3
variablen Regionen ist (das 5C.C7-TCR-Transgen ist Vβ3/Vα11).
Diese Zellen wurden dann mit dem erfindungsgemäßen Markierungsreagenz gefärbt. Die
Daten sind in 2 gezeigt. Die gezeigten Zellen
erwiesen sich als positiv für
CD4 und negativ für
B220, CD8 und Mac-1. Der KJ25-Antikörper blockierte die Bindung
des MHC-Reagenzes bei höheren
Konzentrationen vollständig.
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Auf
Grund der o. g. Ergebnisse ist es offensichtlich, dass der erfindungsgemäße Gegenstand
eine neue Methode zum spezifischen Markieren von T-Zellen gemäß ihrem
Antigen-Rezeptor zur Verfügung
stellt. Stabile multimere Komplexe aus MHC-Proteinen und spezifischen antigenen
Peptiden können
an T-Zellen binden, die den Komplex erkennen, die das Markieren,
die Analyse und Trennung der einzelnen T-Zell-Untergruppe erlauben. Die Erfindung
ermöglicht
den Nachweis und die Trennung von spezifischen T-Zellen.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispielen
zum Zwecke des klaren Verständnisses
in einigen Details beschrieben worden ist, wird es für diejenigen,
die sich im Stand der Technik auskennen, sofort im Lichte der Lehre
dieser Erfindung offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen
und Modifizierungen hierzu gemacht werden müssen/können, ohne hierbei den Bereich
der beigefügten
Ansprüche zu
verlassen.