DE69632577T3

DE69632577T3 - Mhc-antigen-komplexe zur detektion und reinigung antigen-spezifischer t-zellen

Info

Publication number: DE69632577T3
Application number: DE69632577T
Authority: DE
Inventors: John D. Altman; Michael G. Mcheyzer-Williams; Mark M. Davis
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1995-02-28
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2016-02-28
Also published as: EP1437366A1; US5635363A; EP0812331B1; CA2212747C; JP3506384B2; CA2212747A1; EP0812331B2; EP0812331A4; EP0812331A1; DE69632577T2; JPH11501124A; WO1996026962A1; DE69632577D1

Description

Technisches Gebiet
Das Gebiet dieser Erfindung betrifft polymere Antigen-Zusammensetzungen, die spezifisch den Antigenrezeptor von T-Zellen markieren.
Hintergrund
T-Lymphozyten stellen einen wesentlichen Teil der körpereigenen Immunabwehr gegen bakterielle, virale und protozoische Infektionen dar und sind an der Abwehr von Krebszellen beteiligt. Zahlreiche Autoimmunsyndrome sind ebenso mit Antigenspezifischen T-Zell-Angriffen auf verschiedene Teile des Körpers in Verbindung gebracht worden. Es ist deshalb von großem Interesse, wenn man in der Lage ist, Antigen-spezifische Zellen während des Verlaufes dieser Krankheiten zu verfolgen. Es wäre ebenso von großem therapeutischem Nutzen, wenn T-Zellen, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, angereichert und dann im Krankheitsfalle wieder eingeführt, oder im Falle einer Autoimmunerkrankung selektiv verarmt werden könnten.
Die vorhandene Technologie für die Isolierung oder eine andere Identifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ist sehr unausgereift. Während die T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) strukturell und genetisch den Antikörpern ähnlich sind, sind ihre Liganden komplex und bestehen aus einem Peptid, das in ein Molekül des Haupthistokompatibilitätskomplexes eingebettet ist. MHC-Proteine haben zwei Typen, Klasse I und Klasse II, wobei jede von Ihnen einen bestimmten Typ T-Zellen bedient. Die Klasse I Moleküle interagieren mit CD8⁺ T-Zellen, wohingegen die Klasse II Moleküle mit CD4⁺ T-Zellen interagieren. Die zwei Typen der MHC-Moleküle unterscheiden sich in der Länge der Peptide, die sie präsentieren können. Die Klasse I Peptid-Bindungsgrube ist an einem der beiden Enden blockiert und hat dadurch erhebliche Beschränkungen hinsichtlich der Größe der Peptide, die an sie binden können (acht bis zehn Reste), wobei längere Peptide in der Mitte ausgebeult sind. Die Klasse II Bindungsgrube erlaubt es Peptiden, an ihren Enden herauszuragen und somit können weitaus längere Peptide (8 bis 30 Reste) binden.
Die Produktion von monoklonalen Antikörper-Reagenzien, die spezifisch für verschiedene T-Zell-Epitope variabler Region sind, ist schwierig. Weiterhin ist das Markieren von Zellen mit diesen Reagenzien von beschränktem Nutzen, wenn man daran interessiert ist, T-Zellen mit einer bestimmten Antigen-Spezifität zu charakterisieren. Monoklonale Antikörper sind gewöhnlich gegen die variable Region des TCR gerichtet, einschließlich relativ konservativer Sequenzen, nicht gegen die tatsächliche TCR-Bindungsstelle. Monoklonale Antikörper können T-Zellen nachweisen, die die gleiche variable Region, aber unterschiedliche Antigen-Spezifität haben, während sie T-Zellen mit der gleichen Antigen-Spezifität, aber unterschiedlicher variabler Region, nicht nachweisen können.
Frühere Versuche, MHC-Protein-Peptidkomplexe zu benutzen, um spezifische T-Zellen zu markieren, sind erfolglos geblieben, in erster Linie wegen der kurzen Halbwertszeit des ternären Peptid-MHC-T-Zell-Rezeptorkomplexes. Bei Raumtemperatur beträgt die Halbwertszeit des ternären Komplexes nur 12 bis 25 Sekunden. Wegen der entscheidenden Rolle, die T-Zellen als Hauptbestandteil des Immunsystems spielen, bleibt es von großer Bedeutung, in der Lage zu sein, zu verstehen, wie T-Zellen selektiert, aktiviert oder toleriert werden. Ein spezifischer Nachweis und die Möglichkeit, Antigen-spezifische T-Zellen physikalisch aufzureinigen oder abzutragen, sind von besonderem Interesse.
Relevante Literatur
Die molekulare Struktur von einem Klasse I Haupthistokompatibilitätsantigen ist bei Bjorkman et al. (1987) Nature 329:506-512 beschrieben. Die Struktur eines Klasse 2-MHC-Antigen ist bei J. Brown et al. (1993) Nature 364:33-39 beschrieben. Die geringe Affinität des ternären Komplexes, der aus T-Zell-Rezeptor, MHC-Antigen und antigenem Peptid gebildet wird, ist bei K. Matsui et al. (1991) Science 254:1788-1791 beschrieben. Während die Bindungsaffinitäten von T-Zell-Rezeptoren im Bereich von 10^–4 bis 10^–7 M liegen, liegt t½, das die Stabilität des Komplexes bestimmt, sehr nahe zwischen hoch- und niedrigaffinen Rezeptoren und liegt zwischen 12 bis 25 Sekunden bei Raumtemperatur.
Die Rückfaltung und Kristallisation von Klasse I MHC-Peptidkomplexen ist bei Garboczi et al. (1992) P.N.A.S. 89:3429-3433 beschrieben. Die Bildung von funktionellen Klasse II Komplexen ist bei Altman et al. (1993) P.N.A.S. 89:10330-10334 beschrieben.
Die Substratspezifität von E. coli BirA Enzymen ist bei P. Schatz (1993) Bio/Technology 11:1138-1143 beschrieben.
Verschiedene Methoden zur Analyse der Peptidbindung am T-Zell-Rezeptor und an Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen sind erforscht worden. Fridkis-Hareli et al. (1994) P.N.A.S. 91:4872-4876 erörtern die Bindung von Peptiden an Klasse II MHC-Molekülen in lebenden Zellen. Ebenso wurde ein Europium Fluoroimmuno-Assay benutzt, um die Bindung von Antigenen an ein Klasse II MHC-Protein zu messen, Tompkins et al. (1993) J. Immunol. Meth. 163:209-216. Photoaffinitäts-Markierung des T-Zellrezeptors wird bei Romero et al. (1993) J. Immunol. 150:3825-3831 diskutiert.
Ploegh H und Benoroch P (1993) Nature 364:16-17 beziehen sich auf die dreidimensionale Struktur eines humanen Klasse II MHC Moleküls HLA-DR1. WO92/07952 beschreibt BindungsAssays mit MHC-Glykolproteinen. Dal Porto et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci:USA 90,6671-6675 beschreibt ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von Klasse I Polypeptiden der Maus und einer schweren Polypeptidkette eines Immunglobulins. Schafer PH und Pierce SK (1994) Immunity 1:699-707 beschäftigt sich mit der kristallografischen Struktur des MHC Klasse II Moleküls. WO93/10220 beschreibt chimäre Proteine, die eine MHC-Komponente aufweisen, die mit dem Bestandteil einer konstanten Region eines Immunglobulins verbunden ist. Herrman SH und Mescher MF (1986) The Journal of Immunology 136:2816-2825 untersuchen zelluläre und molekulare Anforderungen für die Erkennung von Klasse I Antigen durch den Precursor von zytolytischen T-Lymphozyten.
Zusammenfassung der Erfindung
Methoden und Zusammensetzungen zum Markieren von T-Zellen werden entsprechend der Spezifität von deren Antigenrezeptor zur Verfügung gestellt. Ein stabiler Komplex wird mit Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteinuntereinheiten R hergestellt, die eine im Wesentlichen homogen gebundene Peptid-Population haben. Der multimere MHC-Antigenkomplex, wie er in Anspruch 1 definiert ist, bildet eine stabile Struktur mit T-Zellen, die den Komplex durch ihre Antigenrezeptoren erkennen, und dadurch das Markieren, die Identifizierung und Reinigung von spezifischen T-Zellen erlauben. Die Verfahren sind ebenso zur Diagnose und Überwachung von Krankheiten geeignet, an denen das Immunsystem beteiligt ist.
Beschreibung von besonderen Ausführungsformen
Es werden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die T-Zellen entsprechend der Spezifität ihrer Antigenrezeptoren markieren. Ein stabiler multimerer Komplex aus MHC-Proteinuntereinheiten und Peptidantigen wird, wie in Anspruch 1 definiert, hergestellt. Die Spezifität des multimeren Bindungskomplexes wird sowohl durch das antigene Peptid als auch durch das MHC-Protein bestimmt. Der Bindungskomplex bindet stabil mit dem Antigenrezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen und erlaubt so den Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen. Der Bindungskomplex ist für den Nachweis, die Quantifizierung, Charakterisierung und Aufreinigung von spezifischen T-Zellen geeignet. Varianten des Bindungskomplexes für verschiedene MHC-Proteine und Peptidantigene sind leicht herstellbar.
Die T-Zellrezeptor (TCR) Spezifität bestimmt, welches Antigen eine bestimmte T-Zelle aktiviert. Gewöhnlich exprimieren T-Helferzellen CD4 auf ihrer Oberfläche und werden durch Bindung an einen Komplex aus antigenem Peptid und Klasse II MHC-Molekülen aktiviert. Gewöhnlich exprimieren T-Zellen CD8 auf ihrer Oberfläche und werden durch Bindung an einem Komplex von antigenem Peptid und Klasse I Molekül aktiviert. Die Spezifität des T-Zellantigenrezeptors liegt in der Kombination von Peptid und MHC-Molekül, das an das bestimmte TCR mit ausreichender Affinität bindet, um die T-Zelle zu aktivieren. Die Bindungsaffinität liegt gewöhnlich mindestens bei ungefähr 10^–4 M wie bei Matsui et al. beschrieben (siehe oben).
Der Bindungskomplex kann eine breite Vielfalt von Peptid-MHC-Kombinationen aufweisen. Multimere von Klasse I Molekülen werden üblicherweise benutzt, um CD8⁺ T-Zellen nachzuweisen und Klasse II Multimere werden gewöhnlich benutzt, um CD4⁺ T-Zellen nachzuweisen. Die mengenmäßige Bestimmung von T-Zellen kann durchgeführt werden, um den Verlauf einer Reihe von Umständen, die mit der T-Zell-Aktivierung assoziiert sind, zu überwachen, einschließlich Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung, virale Infektionen, bakterielle und protozoische Infektionen. T-Zellen mit einer besonderen Antigen-Spezifität können von komplexen Mischungen, insbesondere biologischen Proben, durch die Bindung an die Bindungskomplexe getrennt werden. Auf diese Weise kann eine selektive Verarmung oder Anreicherung von besonderen T-Zellen erreicht werden.
Der multimere Bindungskomplex weist vier Monomere mit der Formel α-β-P auf. α ist eine α-Kette von einem Klasse I oder Klasse II MHC-Protein. β ist eine β-Kette, die hier als die β-Kette eines Klasse II MHC-Proteins oder β2 Mikroglobulins eines MHC Klasse 1 Proteins definiert ist. P ist ein Peptidantigen. Der multimere Komplex bindet stabil mittels nichtkovalenter Wechselwirkungen an einen T-Zell-Rezeptor mit der geeigneten Antigen-Spezifität. Verglichen mit der Bindung eines (α-β-P) „Monomers" an eine T-Zelle, hat der Bindungskomplex eine erheblich vergrößerte Stabilität, wobei üblicherweise t½ auf etwa das zehnfache vergrößert ist, häufiger um etwa das zwanzigfache vergrößert ist und wobei es auf ungefähr das fünfzigfache vergrößert sein kann.
Die MHC-Proteine können von Säugetier oder Vogelspezies sein, z.B. Primaten, insbesondere Menschen; Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern; Kaninchen; Pferden, Rindern, Hunden, Katzen usw. Von besonderem Interesse sind humane HLA-Proteine und die H-2 Proteine von Mäusen. In die HLA-Proteine sind die Klasse II Untereinheiten HLA-Dpα, HLA-DPβ, HLA-DGα, HLA-DQβ, HLA-DRα und HLA-DRβ und die Klasse I Proteine HLA-A, HLA-B, HLA-C und β₂-Mikroglobulin eingeschlossen. Eingeschlossen in die H-2 Untereinheiten aus Mäusen sind die Klasse I H-2K, H-2D, H-2L, und die Klasse II I-Aα, I-Aβ, I-Eα und I-Eβ, und β₂-Mikroglobulin. Sequenzen von einigen repräsentativen MHC-Proteinen kann man in Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, NIH Publication No. 91-3242, pp. 724-815 finden.
Die MHC-Protein-Untereinheiten sind eine lösliche Form des normalerweise membrangebundenen Proteins. Die lösliche Form erhält man aus der nativen Form durch Abtrennung der transmembranen Domäne. Für gewöhnlich wird das Protein unter Entfernung sowohl der Zytoplasma- als auch der transmembranen Domäne trunkiert. Das Protein kann durch proteolytischen Abbau trunkiert werden oder indem eine gentechnisch trunkierte Form exprimiert wird. Als Verweis wird die von Kabat et al. gezeigte Anordnung von Aminosäuren in Domänen verwendet.
Für Klasse I Proteine schließt die lösliche Form die α1, α2 und α3-Domäne ein. Es sind nicht mehr als etwa 10, gewöhnlich nicht mehr als etwa 5, vorzugsweise keine der Aminosäuren der transmembranen Domäne enthalten. Die Tilgung kann etwa 10 Aminosäuren innerhalb der α3-Domäne umfassen, vorzugsweise wird keine der Aminosäuren der α3-Domäne entfernt. Die Tilgung wird derart durchgeführt, dass die Fähigkeit der α3-Domäne, sich als eine Struktur mit Disulfidbindungen zu falten, nicht beeinträchtigt wird. Die Klasse I β-Kette, β2-Mikroglobulin, hat keine transmembrane Domäne in ihrer nativen Form und braucht nicht trunkiert werden. Im Allgemeinen werden keine Klasse II Untereinheiten in Verbindung mit Klasse I Untereinheiten verwendet.
Lösliche Klasse II Untereinheiten schließen die α1- und die α2-Domäne für die α-Untereinheit und die β1- und β2-Domäne für die β-Untereinheit mit ein. Es sind nicht mehr als etwa 10, gewöhnlich nicht mehr als etwa 5, vorzugsweise keine der Aminosäuren der transmembranen Domäne enthalten. Die Tilgung kann etwa 10 Aminosäuren innerhalb der α2- oder β2-Domäne umfassen, vorzugsweise wird keine der Aminosäuren der α2- oder β2-Domäne entfernt. Die Tilgung wird derart durchgeführt, dass die Fähigkeit der α2- oder β2-Domäne, sich als eine Struktur mit Disulfidbindungen zu falten, nicht beeinträchtigt wird.
Man könnte wünschen, an den Enden der Polypeptide eine kleine Anzahl von Aminosäuren einzuführen, gewöhnlich nicht mehr als 20, normalerweise nicht mehr als 15. Die Tilgung oder Einfügung von Aminosäuren ist gewöhnlich das Ergebnis von Anforderungen an das Konstrukt, brauchbare Restriktionsstellen, zusätzliche Verarbeitungssignale, leichte Handhabbarkeit, Verbesserungen im Grad der Expression oder andere derartige Dinge zu ermöglichen. Zusätzlich könnte man aus ähnlichen Gründen eine oder mehrere Aminosäuren, normalerweise nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren in einer Domäne, durch eine andere Aminosäure substituieren wollen.
Die α- und β-Untereinheiten können getrennt hergestellt werden und sich dann in vitro assoziieren, um einen stabilen Heteroduplex-Komplex zu bilden (sh- Altman et al. [1993], wie oben oder Garboczi et al. [1992] wie oben), oder beide Untereinheiten können in einer einzelnen Zelle exprimiert werden. Eine alternative Strategie besteht darin, ein einzelnes Molekül mit sowohl der α- als auch der β-Untereinheit herzustellen. Ein „einkettiges Heterodimer" wird durch Fusionierung zweier Untereinheiten unter Verwendung eines kurzen Peptidlinkers hergestellt, z.B. ein 15 bis 25 Aminosäuren-Peptid oder Linker. Siehe Bedzyk et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:18615 für ähnliche Strukturen mit Antikörper-Heterodimeren. Das lösliche Heterodimer kann auch durch Isolierung eines nativen Heterodimers und Abbau mittels einer Protease, z.B. Papain, hergestellt werden um ein lösliches Produkt zu produzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden lösliche Untereinheiten unabhängig voneinander aus einem DNA-Konstrukt exprimiert, das ein trunkiertes Protein kodiert. Zur Exprimierung werden die DNA-Sequenzen in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, wobei die natürliche Initiationsstelle für die Transkription oder eine exogene Initiationsstelle für die Transkription verwendet werden kann, z.B. ein Promotor, der ein anderer Promotor ist, als der, der mit dem Gen in den normalerweise vorkommenden Chromosomen assoziiert ist. Der Promotor kann durch rekombinante Verfahren in vitro eingeführt werden, oder als das Ergebnis einer homologen Integration der Sequenz in das Chromosom. Eine große Vielzahl von Initiationsstellen für die Transkription ist für eine große Anzahl von Exprimierungswirten bekannt, wobei die Exprimierungswirte Prokaryoten oder Eukaryoten sein können, besonders E. coli, B. subtilis, Säugetierzellen, so wie z.B. CHO-Zellen, COS-Zellen, Affennierenzellen, Lymphomzellen, insbesondere menschliche Zelllinien und dergleichen. Im Allgemeinen ist ein auswählbarer Marker, der in dem Exprimierungswirt funktionsfähig ist, beteiligt.
Von besonderem Interesse sind Expressionskassetten, die eine Initiierungsstelle zur Transkription, das Gen, das die erfindungsgemäße MHC-Untereinheit kodiert und eine Terminationsstelle zur Transkription, die optional ein Signal zum Anheften einer poly A Sequenz hat, aufweisen. Geeignete Restriktionsstellen können an die Termini der MHC -Untereinheit eingebracht werden, so dass verschiedene Untereinheiten in der Kassette zur Expression untergebracht werden können. Restriktionsstellen können durch verschiedene Mittel eingebracht werden, z.B. durch Einführung während einer Polymerase-Kettenreaktion, gezielter Mutagenese usw.
Die Untereinheiten werden in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und, wenn notwendig, gelöst. Die zwei Untereinheiten werden mit einem antigenem Peptid kombiniert und können sich in vitro falten, um einen stabilen heterodimeren Komplex mit innerkettig disulfidgebundenen Domänen zu bilden. Das Peptid kann an der anfänglichen Faltungsreaktion beteiligt sein oder kann zu dem leeren Heterodimer in einem späteren Schritt gegeben werden. Normalerweise ist die MHC -Bindungsstelle frei von Peptiden, bevor das antigene Zielpeptid hinzugegeben wird. Die Ausnahme besteht in solchen Fällen, wo es wünschenswert ist, die T-Zellen mit einem natürlichen Peptid-MHC-Komplex zu markieren, so wie solche, die an der Oberfläche von Zellen, die das Ziel für einen Autoimmunangriff sind, vorhanden sein können, usw.
Das MHC-Heterodimer wird ein antigenes Peptid in der Mulde binden, die von zwei von der Membran entfernten Domänen gebildet wird, entweder α2 und α1 für Klasse I oder α1 und β2 für Klasse II. Das gebundene Peptid wird im wesentlichen homogen sein, was bedeutet, dass es weniger als etwa 10 % des gebundenen Peptids gibt, welches eine Aminosäuresequenz hat, die sich von der gewünschten Sequenz unterscheidet, gewöhnlich weniger als etwa 5 %, und normalerweise weniger als etwa 1 %.
Bedingungen, unter denen die Faltung und Assoziierung von den Untereinheiten und Peptiden möglich sind, sind im Stand der Technik bekannt, z.B. bei Altman et al. (1993) und Garboczi et al. (1992). Als ein Beispiel für geeignete Bedingungen werden ungefähr äquimolare Mengen von gelösten α- und β-Untereinheiten in einer Harnstofflösung gemischt. Die Faltung wird durch Verdünnung oder Dialyse in eine gepufferten Lösung ohne Harnstoff initiiert. Leere Klasse II Heterodimere werden bei etwa pH 5-5,5 für etwa ein bis drei Tage mit Peptiden beladen, gefolgt von Neutralisation, Konzentration und Pufferwechsel. Es ist jedoch für jemand, der sich im Stand der Technik auskennt, leicht verständlich, dass die spezifischen Bedingungen für die Faltung nicht kritisch für die praktische Ausführung der Erfindung sind.
Das antigene Peptid hat eine Länge von 6 bis 12 Aminosäuren für Komplexe mit Klasse I MHC-Proteinen, gewöhnlich von etwa acht bis zehn Aminosäuren. Die Peptide haben eine Länge von etwa 6 bis 20 Aminosäuren für Komplexe mit Klasse II MHC-Proteinen, gewöhnlich von etwa 10 bis 18 Aminosäuren. Die Peptide können eine Sequenz haben, die von einer großen Anzahl von Proteinen stammt. In vielen Fällen ist es wünschenswert, Peptide zu benutzen, die als T-Zell-Epitope wirken. Die Epitop-Sequenzen einer Anzahl von Antigenen sind im Stand der Technik bekannt. Alternativ kann die Epitop-Sequenz durch Isolierung und Sequenzierung von an nativen MHC-Proteinen gebundenen Peptiden empirisch bestimmt werden, durch Synthese einer Reihe von Peptiden von Zielsequenzen, dann durch den Nachweis für T-Zell-Reaktivität für verschiedene Peptide oder durch Herstellung einer Serie von Bindungskomplexen mit verschiedenen Peptiden und Quantifizierung der T-Zell-Bindung. Die Präparation von Fragmenten, Identifizierung von Sequenzen und Identifizierung der Minimalsequenz ist ausführlich im US-Patent Nr. 5,019,384 , Ausgabe 28. Mai 1991, beschrieben worden und Literaturstellen sind dort ebenfalls zitiert.
Die Peptide können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Gewöhnlich können sie mit konventionellen Techniken unter Verwendung von automatischen Synthesizern synthetisiert werden, oder sie können manuell synthetisiert werden. Alternativ können DNA-Sequenzen hergestellt werden, die das bestimmte Peptid kodieren und diese können kloniert und exprimiert werden, um das gewünschte Peptid zu liefern. In diesem Fall kann die erste Aminosäure Methionin sein. Zusätzlich können die Peptide mit rekombinanten Verfahren hergestellt werden, indem sie zu Proteinen zusammen geschlossen sind, die das eine Element eines spezifischen Bindungspaares sind und die Aufreinigung des Fusionsproteins mit Affinitätsreagenzien erlauben, gefolgt von einem proteolytischen Abbau, der für gewöhnlich an einer gentechnisch hergestellten Stelle erfolgt, um das gewünschte Peptid zu erhalten (siehe als ein Beispiel Driscoll et al. (1993), J. Mol. Bio. 232:342-350). Die Peptide können ebenso aus natürlichen Quellen isoliert und durch bekannte Techniken aufgereinigt werden, einschließlich, z.B., Chromatographie mit Ionenaustauschmaterialien, Trennung nach Größe, Immunoaffinitätschromatographie und Elektrophorese.
Der monomere Komplex (α-β-P) (hier ein Monomer) wird multimerisiert. Das resultierende Multimer ist über eine lange Zeitperiode stabil. Bei einer Lagerung von 4 Grad für ungefähr einen Tag werden gewöhnlich nicht mehr als 10 % des Multimers dissoziiert, häufiger nach etwa einer Woche. Das Multimer wird durch Bindung der Monomere an eine multivalente Einheit durch Biotin-Komponenten an der α- oder β-Untereinheit gebildet, wie im Detail unten beschrieben.
Der Biotin-Rest zur Bindung an die multivalente Einheit wird durch gentechnische Verfahren eingeführt. Einer der Untereinheiten wird mit einer Aminosäure-Sequenz fusioniert, die eine Erkennungsstelle für ein modifizierendes Enzym zur Verfügung stellt. Die Erkennungssequenz wird gewöhnlich an eine der Untereinheiten in der Nähe des C-Terminus fusioniert, um eine potenzielle Behinderung an der Bindungsseite des antigenen Peptids zu vermeiden. Gewöhnlich enthält eine Expressionskassette die Sequenz, die die Erkennungsstelle kodiert.
Modifizierende Enzyme, die von Interesse sind, schließen BirA ein. Das Monomer mit einer biotinhaltigen Untereinheit wird dann an den multivalenten Bindungspartner gebunden, z.B. Streptavidin oder Avidin, an die Biotin mit extrem hoher Affinität bindet. Streptavidin hat eine Valenz von 4 für einen Multimer von (α-β-P)₄.
Der multivalente Bindungspartner kann in freier Lösung vorliegen oder kann an einen unlöslichen Träger gebunden sein. Beispiele für geeignete unlösliche Träger schließen Kugeln ein, z.B. Magnetkugeln, Membranen und Mikrotiterplatten. Diese sind typischerweise aus Glas, Plastik (z.B. Polystyren), Polysacchariden, Nylon oder Nitrozellulose gemacht. Die Bindung an einen unlöslichen Träger ist nützlich, wenn der Bindungskomplex verwendet wird, um T-Zellen zu aufzutrennen.
Häufig wird der multimere Komplex markiert, um so direkt nachweisbar zu sein oder er wird in Verbindung mit sekundär markierten Immunoreagenzien verwendet, die spezifisch an den Komplex binden. Im Allgemeinen hat das Label eine Eigenschaft, durch die es mit Licht nachweisbar ist. Bevorzugte Label sind Fluorophore, so wie Fluorescein, Isothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texasrot, Phyzoerythrin und Allophyzocyanin. Andere Label von Interesse können Farbstoffe, Enzyme, chemilumineszente Stoffe, Partikel, Radioisotope oder andere direkt oder indirekt nachweisbare Agenzien sein. Für gewöhnlich trägt der multivalente Bindungspartner die markierende Gruppe. Alternativ kann ein Label der zweiten Stufe benutzt werden, z.B. ein markierter Antikörper, der gegen einen Bestandteil des Peptids gerichtet ist und dergleichen.
Der Bindungskomplex wird benutzt, um antigenspezifische T-Zellen nachzuweisen oder zu trennen. Die T-Zellen können aus jeder Quelle stammen, die gewöhnlich von derselben Sorte Spezies stammt, wie das MHC-Heterodimer. Die T-Zellen können aus einer in vitro Kultur oder aus einer physiologischen Probe kommen. In den meisten Fällen sind die benutzten physiologischen Proben Blut oder Lymphflüssigkeit, aber die Proben können auch aus anderen T-Zellen Quellen stammen, besonders von dort, wo die T-Zellen invasiv sein können. Folglich sind zum anderen auch Gewebe von Interesse oder damit in Verbindung stehende Flüssigkeiten, wie die in Hirn, Lymphknoten, Neoplasma, Milz, Leber, Niere, Pankreas, Mandeln, Thymus, Gelenken, Synovia und dergleichen. Die Probe kann so, wie man sie gewinnt, verwendet werden oder sie kann modifiziert werden, wie im Falle einer Verdünnung, Konzentration und dergleichen. Vorhergehende Behandlungen können die Entfernung von Zellen mittels verschiedener Techniken einschließen, einschließlich Zentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Hypaque, waschen, Affinitätstrennung unter Verwendung von Antikörpern, die für einen oder mehrere Marker spezifisch sind, welche auf der Oberfläche von Zellen als Oberflächenmembranproteine vorhanden sind, oder irgendeine andere Technik, die eine Anreicherung von der Gruppe oder Untergruppe der Zellen von Interesse zur Verfügung stellt.
Der Bindungskomplex wird zu einer Suspension hinzugegeben, die die interessierenden T-Zellen enthält und bei etwa 4°C für eine Zeit, die ausreichend ist, um den verfügbaren Oberflächenzellrezeptor zu binden, inkubiert. Die Inkubation dauert gewöhnlich mindestens etwa 5 Minuten und gewöhnlich weniger als etwa 30 Minuten. Es ist wünschenswert, eine ausreichende Konzentration des markierenden Reagenzes in der Reaktionsmischung zu haben, so dass die Markierungsreaktion nicht durch einen Mangel an markierendem Reagenz limitiert wird. Die geeignete Konzentration wird durch Titration bestimmt. Das Medium, in dem die Zellen markiert werden, ist irgendein geeignetes Medium, das aus dem Stand der Technik bekannt ist. Wenn lebende Zellen gewünscht werden, wird ein Medium ausgewählt, das die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhält. Ein bevorzugtes Medium ist phosphatgepufferte Salzlösung mit einem Gehalt an 0,1 bis 0,5 % BSA. Verschiedene Medien sind kommerziell erhältlich und können entsprechend den Anforderungen der Zellen verwendet werden, einschließlich Dulbecco's Modified Eagle Medium (dMEM), Hank's Basic Salt Solution (HBSS), Dulbecco's phosphate buffered saline (dPBS), RPMI, Iscove's medium; PBS mit 5 mM EDTA, usw., häufig unter Zusatz von fötalem Kälberserum, BSA, HSA usw.
Wenn ein markierendes Reagenz der zweiten Stufe benutzt wird, kann die Zellsuspension gewaschen und in dem Medium, wie oben beschrieben, vor der Inkubation mit dem Reagenz der zweiten Stufe resuspendiert werden. Alternativ kann das Reagenz der zweiten Stufe direkt in die Reaktionsmischung gegeben werden.
Eine Anzahl von Methoden zum Nachweis und der Quantifizierung von markierten Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Durchflusszytometrie ist ein übliches Mittel, um Zellen zu zählen, die einen kleinen Prozentsatz der Gesamtpopulation ausmachen. Fluoreszenzmikroskopie kann ebenso verwendet werden. Verschiedene Immunoassays, z.B. ELISA, RIA, usw. können verwendet werden, um die vorhandene Anzahl von Zellen nach der Bindung an einen unlöslichen Träger zu bestimmen.
Durchflusszytometrie kann ebenso verwendet werden, um eine markierte Untergruppe von T-Zellen aus einer komplexen Mischung von Zellen zu trennen. Die Zellen können in jedem geeigneten Medium gesammelt werden, das die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhält, für gewöhnlich mit einem Serum-Kissen am Boden des Sammelröhrchens. Verschiedene Medien sind kommerziell erhältlich, wie oben beschrieben. Die Zellen können dann in geeigneter Weise verwendet werden.
Andere Methoden zur Trennung nutzen aus, dass der Bindungskomplex direkt oder indirekt an einen unlöslichen Träger gebunden ist, z.B. eine Säule, Mikrotiterplatte, magnetische Kügelchen, usw. Die Zellprobe wird zu dem Bindungskomplex gegeben. Der Komplex kann durch alle üblichen Mittel an den Träger gebunden werden. Nach der Inkubation wird der unlösliche Träger gewaschen, um nicht gebundene Komponenten zu entfernen. Das Waschen wird ein bis sechs Mal mit einem ausreichenden Volumen durchgeführt, um in der Probe vorhandene, nicht spezifisch gebundene Zellen gründlich auszuwaschen. Die gewünschten Zellen werden dann vom Bindungskomplex eluiert. Die besondere Verwendung von magnetischen Partikeln zur Trennung von Zelluntergruppen aus Komplexmischungen ist in Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11:231-238 beschrieben.
Der Nachweis und/oder die Quantifizierung von spezifischen T-Zellen in einer Probe oder Fraktion kann mittels einer Vielzahl von spezifischen Assays durchgeführt werden. Im Allgemeinen misst der Assay die Bindung zwischen einer Patientenprobe, gewöhnlich aus dem Blut, im Allgemeinen in der Form von Plasma oder Serum, und dem multimeren Bindungskomplex. Die Patientenprobe kann so wie sie ist verwendet werden oder in geeigneter Weise verdünnt werden, gewöhnlich etwa 1:10 und meistens nicht mehr als 1:10.000. Die Assays können in jedem physiologischen Puffer durchgeführt werden, z. B. PBS, physiologischer Kochsalzlösung, HBSS, dPBS usw.
Ein Sandwich-Assay wird durchgeführt, indem zuerst der multimere Bindungskomplex an eine unlösliche Oberfläche oder an einen unlöslichen Träger angeheftet wird. Der multimere Bindungskomplex kann an die Oberfläche durch jede geeignete Methode gebunden werden, in Abhängigkeit der Natur der Oberfläche, entweder direkt oder durch spezifische Antikörper. Die bestimmte Art und Weise der Bindung ist nicht kritisch, solange sie mit den Reagenzien und gesamten Verfahren der Erfindung kompatibel ist. Sie können an die Platten kovalent oder nichtkovalent gebunden werden, vorzugsweise nichtkovalent.
Die unlöslichen Träger können jede Zusammensetzung haben, an die der multimere Bindungskomplex gebunden werden kann, das schnell vom löslichen Material getrennt werden kann und das ansonsten mit den gesamten Methoden zur Messung von T-Zellen kompatibel ist. Die Oberfläche von solchen Trägern kann fest oder porös und von jeder üblichen Form sein. Beispiele für geeignete unlösliche Träger, an die der Rezeptor gebunden ist, schließen Kügelchen, z.B. magnetische Kügelchen, Membranen und Mikrotiterplatten ein. Diese sind typischerweise aus Glas, Plastik (z.B. Polystyren), Polysacchariden, Nylon oder Nitrozellulose hergestellt. Mikrotiterplatten sind besonders geeignet, weil eine große Anzahl von Assays gleichzeitig durchgeführt werden können unter Verwendung von wenigen Reagenzien und Proben.
Bevor Patientenproben oder Fraktionen zugegeben werden, werden auf dem unlöslichen Träger die nicht spezifischen Bindungsstellen, das heißt, diejenigen, die nicht von dem multimeren Bindungskomplex besetzt werden, im Allgemeinen blockiert. Bevorzugte blockierende Agenzien schließen nicht interferierende Proteine, so wie Rinderserum Albumin, Kasein, Gelatine und dergleichen ein. Proben, Fraktionen oder Aliquots davon werden dann zu getrennt analysierbaren Trägern gegeben (z.B. in getrennte Schächte einer Mikrotiterplatte), die den Träger gebundenen multimeren Komplex enthalten.
Im Allgemeinen sind etwa 0,001 bis 1 ml verdünnte oder andere Proben ausreichend, gewöhnlich sind 0,01 ml ausreichend. Vorzugsweise wird jede Probe und der Standard in mehrere Schächte gegeben, so dass für jedes gemittelte Werte erhalten werden können. Die Inkubationszeit sollte so ausreichend bemessen sein, dass die T-Zellen den unlöslichen Bindungskomplex binden können. Im Allgemeinen sind etwa 0,1 bis 3 Stunden ausreichend, gewöhnlich ist eine Stunde ausreichend.
Nach der Inkubation wird der unlösliche Träger von den ungebundenen Bestandteilen gewaschen. Im Allgemeinen wird ein verdünnter physiologischer Puffer mit einem geeigneten pH, im Allgemeinem 7 bis 8, als Waschmedium benutzt. Es können eine bis sechs Waschungen durchgeführt werden, mit einem ausreichenden Volumen, um in der Probe vorhandene, nicht spezifisch gebundene T-Zellen auszuwaschen.
Nach dem Waschen wird eine Lösung verwendet, die einen spezifischen zweiten Rezeptor enthält. Der Rezeptor kann jede Komponente sein, die Patienten-T-Zellen mit ausreichender Spezifität bindet, so dass sie von anderen vorhandenen Komponenten unterschieden werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Zweit-Rezeptoren Antikörper, die für gewöhnliche T-Zell-Antigene spezifisch sind, entweder monoklonale oder polyklonale Seren, z.B. anti-thy-1, anti-CD45, usw.
T-Zell-spezifische Antikörper können markiert werden, um eine direkte oder indirekte Quantifizierung der Bindung zu ermöglichen. Beispiele für Label, die eine direkte Messung erlauben, schließen Radiolabel, wie ³H oder ¹²⁵I, fluoreszierende Stoffe, Farbstoffe, Kügelchen, chemilumineszente Stoffe, kolloidale Partikel und dergleichen ein. Beispiele für Label, die eine indirekte Messung von Bindungen erlauben, schließen Enzyme ein, bei denen das Substrat ein farbiges oder fluoreszierendes Produkt ist. Beispiele für geeignete Enzyme zum Gebrauch in Konjugaten schließen Meerrettich-Peroyxidase, alkalische Phosphatase, Malat-Dehydrogenase und dergleichen ein. Wo diese nicht kommerziell erhältlich sind, können solche Antikörper-Enzymkonjugate leicht mittels Techniken hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Alternativ kann der zweite Rezeptor unmarkiert sein. In diesem Fall wird eine für den zweiten Rezeptor spezifische Komponente verwendet, die an den gebundenen zweiten Rezeptor bindet. Solch eine für den zweiten Rezeptor spezifische Komponente kann auf jede der o.g. Arten markiert werden. Es ist möglich, solche Komponenten auf eine Weise auszuwählen, dass solche multiplen Komponenten jedes Molekül des gebundenen zweiten Rezeptors binden. Beispiele von Zweit-Rezeptor/Zweit-Rezeptor -spezifischen Molekülpaaren schließen Antikörper/Anti-Antikörper und Avidin (oder Streptavidin)/Biotin ein. Da das resultierende Signal auf diese Weise verstärkt wird, kann diese Technik vorteilhaft sein, wenn nur eine kleine Anzahl von T-Zellen vorhanden ist. Ein Beispiel ist die Verwendung eines markierten Antikörpers, der für einen zweiten Rezeptor spezifisch ist. Genauer, wenn der Zweit-Rezeptor ein anti-allotypischer Antikörper vom Kaninchen ist, stellt ein gegen die konstante Region von Kaninchen-Antikörpern gerichteter Antikörper ein geeignetes, für den Zweit-Rezeptor spezifisches Molekül dar. Das Anti-Immunglobulin kommt gewöhnlich aus einer anderen Quelle als vom Menschen, etwa vom Huhn, Nagetieren, insbesondere Maus, oder Rind.
Das Volumen, die Zusammensetzung und Konzentration der T-Zell-spezifischen Rezeptorlösung erlaubt die messbare Bindung an die T-Zellen, die schon an das unlösliche Substrat gebunden sind. Im Allgemeinen wird dasselbe Volumen wie bei der Probe benutzt: etwa 0,01 bis 1 ml sind ausreichend, gewöhnlich ist 0,1 ml ausreichend. Wenn Antikörperliganden verwendet werden, liegt die Konzentration im Allgemeinen bei etwa 0,1 bis 50 μg/ml, vorzugsweise bei etwa 1 μg/ml. Die Lösung mit dem zweiten Rezeptor wird im Allgemeinen in einem pH-Bereich von etwa 6,5 bis 9,5 gepuffert. Die Lösung kann auch ein nicht störendes Protein enthalten, wie vorher beschrieben. Die Inkubationszeit sollte ausreichend sein, damit der markierte Ligand an die vorhandenen Moleküle binden kann. Im Allgemeinen sind etwa 0,1 bis 3 Stunden ausreichend, gewöhnlich ist eine Stunde ausreichend.
Nachdem der Zweit-Rezeptor oder das Zweit-Rezeptor-Konjugat gebunden hat, wird der unlösliche Träger im Allgemeinen wieder von dem nicht spezifisch gebundenen zweiten Rezeptor freigewaschen, im wesentlichen wie für die vorherigen Waschungen beschrieben. Nachdem nicht spezifisch gebundenes Material entfernt worden ist, wird das von dem gebundenen Konjugat erzeugte Signal mit konventionellen Mitteln nachgewiesen. Wird ein Enzymkonjugat verwendet, dann wird ein geeignetes Enzymsubstrat zur Verfügung gestellt, so dass ein nachweisbares Produkt gebildet wird. Genauer, wenn das ausgewählte Enzymkonjugat eine Peroxidase ist, ist eine bevorzugte Substratkombination H₂O₂ und O-Phenylendiamin, das unter geeigneten Reaktionsbedingungen ein farbiges Produkt ergibt. Geeignete Substrate für andere Enzymkonjugate, so wie sie oben offenbart sind, sind solche, die gemäß dem Stand der Technik bekannt sind. Geeignete Reaktionsbedingungen, so wie Mittel zum Nachweis der verschiedenen geeigneten Konjugate oder ihrer Produkte sind auch aus dem Stand der Technik bekannt. Für das Produkt von dem Substrat O-Phenylendiamin z.B. wird gewöhnlich die Lichtabsorption bei 490 bis 495 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.
Im Allgemeinen wird die Anzahl der nachgewiesenen gebundenen T-Zellen mit Kontrollproben aus Proben verglichen, die einen anderen MHC Zusammenhang haben, z.B. T-Zellen aus einem Tier, das nicht die MHC-Moleküle exprimiert, die für den Bindungskomplex verwendet werden.
Eine alternative Vorgehensweise ist es, Anti-T-Zell-Reagenzien zu verwenden, z.B. anti-thy-1, anti-CD45 usw., die an die unlösliche Oberfläche gebunden sind. Nach Zugabe der Probe und dem Auswaschen nicht-spezifisch gebundener T-Zellen werden ein oder eine Kombination der erfindungsgemäßen Bindungskomplexe hinzugegeben, wobei die Bindungskomplexe so markiert werden, dass hinsichtlich der Bindung an T-Zellen keine Beeinflussung auftritt.
In einer klinischen Umgebung ist es besonders bequem, die Assays mit einem selbständigen Gerät durchzuführen. Eine Anzahl von solchen Verfahren ist nach dem Stand der Technik bekannt. Der Apparat verendet im Allgemeinen eine kontinuierliche Flussleitung eines geeigneten Filters oder einer Membran mit mindestens drei Bereichen, einen Bereich zum Transport der Flüssigkeit, einen Probenbereich und einen Messbereich. Der Probenbereich wird vor dem Kontakt der Flüssigkeit mit anderen Teilen der Flussleitung vor dem Erhalt der Probe geschützt. Nachdem der Probenbereich die Probe erhalten hat, wird sie in eine Flüssigkeit austauschende Verbindung mit den anderen Bereichen gebracht und der die Flüssigkeit austauschende Bereich wird mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht, damit eine Reagenzlösung den Probenbereich passieren und in den Messbereich gelangen kann. Der Messbereich kann den multimeren Bindungskomplex an ihn gebunden haben, mit einem Konjugat eines Enzyms mit einem T-Zell-spezifischen Antikörper, der als Reagenz verwendet wird und im Allgemeinen vor der Anwendung zu der Probe gegeben wird. Alternativ kann der Bindungskomplex an ein Enzym konjugiert sein, mit einem an den Messbereich gebundenen T-Zell-spezifischen Antikörper.
Der Nachweis von T-Zellen ist in Verbindung mit einer Anzahl von Umständen, die mit der T-Zellen-Aktivierung verbunden sind, von Interesse. Solche Umstände schließen Autoimmunkrankheiten ein, z.B. Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Rheumatoide Arthritis, Typ 1 Diabetes, Graft vs. Host Reaktion, Basedow-Krankheit usw.; verschiedene Formen von Krebs, z.B. Karzinome, Melanome, Sarkome, Lymphome und Leukämien. Verschiedene Infektionskrankheiten, die durch Viren verursacht werden, z.B. HIV 1, Hepatitis, Herpesviren, enterale Viren, respiratorische Viren, Rhabdovirus, Röteln, Pockenvirus, Paramyxoviren, Masernvirus, usw. sind von Interesse. Infektiöse Agenzien von Interesse schließen ebenso Bakterien ein, so wie Pneumokokken, Staphylokokken, Bazillen, Streptokokken, Meningokokken, Gonokokken, Eschericia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonellen, Shigella, Hämophilus, Yersenia, Listerien, Corynebakterien, Vibrio, Clostridien, Chlamydien, Mykobakterium, und Treponema; protozoische Pathogene und dergleichen. T-Zellassoziierte allergische Reaktionen können ebenso überwacht werden, z.B. verzögerte Überempfindlichkeit oder Kontaktüberempfindlichkeit mit Beteiligung von T-Zellen.
Von besonderem Interesse sind Umstände, die mit einem spezifischen Peptid oder MHC Haplotyp assoziiert sind, wobei die erfindungsgemäßen Bindungskomplexe benutzt werden können, um die T-Zell-Antwort in Bezug auf den Haplotyp und das Antigen zu verfolgen. Eine große Anzahl von Verbindungen sind zu Krankheitszuständen gefunden worden, die nahe legen, dass spezifische MHC Haplotype oder spezifische Protein-Antigene für Krankheitszustände verantwortlich sind. Ein direkter Nachweis von T-Zellen in Patientenproben ist jedoch nicht möglich gewesen. Nachweis und Quantifizierung mit den erfindungsgemäßen Bindungskomplexen erlaubt einen solchen direkten Nachweis. Als Beispiel kann die Aktivität von zytolytischen T-Zellen gegen HIV-infizierte CD4+ T-Zellen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Die Verbindung von Diabetes mit dem DQB1*0302 (DQ 3.2) Allel kann durch den Nachweis und die Quantifizierung von T-Zellen, die dieses MHC-Protein in Kombination mit verschiedenen Peptiden des Interesses erkennen, untersucht werden. Die Anwesenheit von für Peptide des basischen Myelin-Proteins spezifischen T-Zellen in Verbindung mit MHC-Proteinen von Multiple Sklerose-Patienten kann bestimmt werden. Die antigene Spezifität kann für die große Anzahl von aktivierten T-Zellen bestimmt werden, die in der synovialen Flüssigkeit von Rheumatoiden Arthritis-Patienten gefunden werden. Es ist zu hervorzuheben, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auf eine Anzahl von Erkrankungen und immunassoziierten Umständen anwendbar sind.
Die Isolierung von antigenspezifischen T-Zellen findet breite Anwendungsmöglichkeiten. Die isolierten T-Zellen können in der Behandlung von Krebs im Falle von Tumorinfiltrierenden Lymphozyten angewandt werden. Spezifische T-Zellen können aus einem Patienten isoliert, in einer Kultur durch Zytokine, Antigenstimulation expandiert werden usw. und in den autologen Wirt zurückgebracht werden, so dass sie eine vergrößerte Immunität gegen das Zielantigen zur Verfügung stellen. Eine Patientenprobe kann an T-Zellen, die mit einem spezifischen Antigen reagieren, verarmt werden, um die Autoimmunantwort zu vermindern.
Die DNA-Sequenz von einzelnen T-Zell-Rezeptoren mit einer gegebenen Antigen-Spezifität wird bestimmt, indem einzelne Zellen mit dem erfindungsgemäßen Trennverfahren isoliert werden. Für gewöhnlich wird zur Isolierung von einzelnen T-Zellen Durchflusszytometrie in Verbindung mit Einzelzell-PCR-Amplifikation verwendet. Um unbekannte TCR-Sequenzen zu amplifizieren, kann Anker-PCR verwendet werden. Ein Amplifikations-Primer ist für eine konstante TCR-Region spezifisch. Der andere Primer wird mit dem Ende von cDNA verbunden, die aus TCR kodierender mRNA synthetisiert ist. Die variable Region wird durch PCR zwischen der Sequenz der konstanten Region und dem verbundenen Primer amplifiziert. Die Hemmung der Immunfunktion kann durch Induktion einer Anergie durch spezifische T-Zellen erreicht werden oder durch Entfernung von reaktiven T-Zellen. Die erfindungsgemäßen Bindungskomplexe erlauben eine Therapie, die gegen sehr spezifische Untergruppen von T-Zellen gerichtet ist. Die Fähigkeit, Funktionen des Immunsystems zu inhibieren, ist als therapeutisch nützlich zur Behandlung einer Anzahl von Krankheiten wie etwa Atherosklerose, Allergien, Autoimmunkrankheiten, bestimmte Malignitäten, Arthritis, entzündliche Darmkrankheiten, Transplantatabstoßungen und Reperfusionsschäden bekannt. Spezifische Krankheiten von Interesse schließen systemischen Lupus Erythematosus; Rheumatoide Arthritis; Polyarteritis nodosa; Polymyositis; Dermatomyositis; Progressive systemische Sklerose (diffuse Sklerodermie); Glomerulonephritis; Myasthenia gravis; Sjorgren-Syndrom; Hashimoto-Thyreoiditis; Basedow-Krankheit; Nebennierenentzündung; Hypoparathyreoidismus; perniziöse Anämie; Diabetes; Multiple Sklerose and verwandte Entmarkungskrankheiten; Uveitis; Pemphigus; Pemphigoid; Zirrhose; Colitis ulcerosa; Myocarditis; regionale Enteritis; akutes Atemnotsyndrom des Erwachsenen; lokale Manifestationen von Arzneimittelwirkungen wie Dermatitis, usw.; entzündliche oder allergische Erscheinungen der Haut; atopische Dermatitis und infantiles Ekzem; Kontaktdermatitis; Psoriasis; Lichen planus; allergische Enteropathien; Heuschnupfen; Bronchialasthma; Transplantatabstoßung, z.B. Herz, Niere, Lunge, Leber, Inselzellen des Pankreas, usw.; überempfindliche oder schädliche Reaktionen auf infektiöse Erreger; Poststreptokokken Krankheiten, z.B. kardiale Erscheinungen von rheumatischen Fieber und dergleichen.
Um spezifische T-Zellen abzutrennen, kann der erfindungsgemäße Bindungskomplex an einen Toxinbestandteil gebunden werden. Verschiedene zytotoxische Agenzien sind bekannt und sind in Verbindung mit spezifisch bindenden Molekülen verwendet worden. Anschauliche Beispiele für diese Komponenten sind Rizin, Abrin, Diphterietoxin, Maytansinoide, Cisplatin und dergleichen. Bei zwei Untereinheiten wird nur die zytotoxische Untereinheit verwendet, z.B. die α-Einheit von Rizin. Das Toxin wird mit dem Bindungskomplex konjugiert, im Allgemeinen mit Hilfe von einem Crosslinker oder einer anderen Konjugation, die eine Disulfidbindung mit einschließt. Toxin-Konjugate sind in dem US-Patent Nr. 5,208,020 ; US-Patent Nr.: 4,863,726 ; US-Patent Nr. 4,916,213 und US-Patent Nr. 5,165,923 offenbart. Das Toxin-Konjugat wird gegeben, damit die Ziel-T-Zellen spezifisch eliminiert werden ohne eine signifikante Toxizität gegen andere Zellen zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen Bindungskomplexe können einem Wirt gegeben werden, um eine Anergie von spezifischen T-Zellen zu induzieren. Der Bindungskomplex induziert eine T-Zell-Anergie nach dem Binden, weil die co-stimulierenden Moleküle, die für die T-Zell-Aktivierung notwendig sind, nicht vorhanden sind. Die Bindungskomplexe werden Individuen, vorzugsweise Säugetieren, in einer Weise gegeben, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Bindungskomplexe die Ziel-T-Zellen erreichen und an sie binden, maximiert wird, und hierdurch eine Anergie induziert wird. Dieses inhibiert in Folge die Immunantwort, die durch diese T-Zellen vermittelt wird.
Die Dosis für Individuen von verschiedenen Spezies und für verschiedene Krankheiten wird durch Messung des Effektes des Bindungskomplexes auf die Verminderung von diesen Parametern gemessen, die für die behandelte Krankheit anzeigend sind. Die Bindungskomplexe werden normalerweise parenteral gegeben, vorzugsweise intravenös. Die Dosen für Bindungskomplexe im Mausmodell reichen im Allgemeinen von etwa 0,5 bis 2 mg pro Wirt pro Woche für etwa eine bis vier Wochen. Die Dosis für die Bindungskomplexe kann in Abhängigkeit von der bestimmten Krankheit wiederholt periodisch gegeben werden müssen.
Bei parenteraler Gabe werden die Bindungskomplexe in einer injizierbaren Dosierform (Lösung, Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten parenteralen Träger formuliert. Solche Träger wirken von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele für solche Vehikel sind Wasser, Salzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung und Hanklösung. Nicht wässrige Träger, wie etwa feste Öle und Ethyloleat können ebenso verwendet werden. Der Träger kann kleinere Mengen Additive enthalten, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität vergrößern, z.B. Puffer und Konservierungsstoffe. Die Bindungskomplexe werden vorzugsweise in gereinigter Form formuliert, im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen bei Konzentrationen von etwa 1 bis 50 mg/ml. Geeignete pharmazeutische Träger und ihre Formulierungen sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben und nicht zur Einschränkung.
Experimentelles
Synthese eines tretrameren MHC-Antigen-Peptid-Komplexes
Die Herstellung eines tretrameren MHC-Antigen-Peptid-Bindungskomplex-Reagenzes wird wie folgt durchgeführt. Kurz gesagt wurden Plasmidvektoren hergestellt, um ein Fusionsprotein aus einem mit einem der Ketten von einem Klasse 2 MHC-Molekül verbundenen BirA Substrat Peptid (BSP) (sh. Schatz et al. [1993]) zu exprimieren. Die α-Kette von dem I-E^k der Maus wurde benutzt.
Das Fusionsprotein, genannt Ec-I-E ^κ _α-BSP wurde in E. coli exprimiert. Das Fusionsprotein wurde dann in vitro mit dem Ec-I-E ^κ _α gefaltet und die αβ-Heterodimere wurden auf einer Immunoaffinitätssäule (beschrieben in Altman et al. [1993] sh. o. und Wettstein et al. [1991] J. Exp. Med. 714:219-228) aufgereinigt. Die Heterodimere wurden in vitro mit dem aufgereinigten BirA-Enzym biotiniliert. Spezifische antigene Peptide werden dann in das MHC-Heterodimer eingefügt. Der Komplex wird an Streptavidin, das vorher mit Texas-Rot markiert wurde, gebunden und durch Gelfiltrationschromatographie aufgereinigt.
Herstellung des Plasmids zur Expression von Ec-I-E ^κ _α-BSP
Unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion wurde für das BirA-Substrat Peptid mit 15 Resten (BSP) (SEQ ID NO:1) LHHILDAQKMVWNHR kodierende DNA mit dem 3' Ende eines vorher beschriebenen Genes für die Expression von löslichem I-E ^κ _α in E.coli (Altmann, 1993) fusioniert (Schatz, 1993). Ein antisense Oligonukleotid wurde hergestellt (SEQ ID NO:2) 5'CCGGAATTCTTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGGAGGAGGGGTTTTCTCTTC 3'. In der sense Richtung stellt das Oligonukleotid 18 dem C-Terminus von löslichem Ec-I-E ^κ _α entsprechenden Basen, 45 Basen, die BSP kodieren, ein Stop-Kodon und eine EcoR 1 Restriktionsstelle und angrenzende Basen zur Verfügung. Der sense Primer für die PCR (SEQ ID NO:3) CATATG-GCTAGCATCAAAGAGGAACACACCAT ist vorher beschrieben worden (Altman, 1993).
Die Genkodierung für die Ec-I-E ^κ _α-BSP wurde unter Verwendung des Ultra-Enzyms (Perkin-Elmer/Cetus) entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit den zur Verfügung gestellten Puffer-Komponenten amplifiziert. Die Amplifizierungsmischungen enthielten 50 μM dNTP, 1,5 mM MgCl₂ und 0,1 μg des pGEM-EAK-Plasmids als Ziel-DNA. Die Reaktionsmischungen wurden drei Zyklen bei 94 Grad für eine Minute, 45 Grad für eine Minute und 72 Grad für eine Minute ausgesetzt. Die Erwärmungstemperatur wurde dann von 45 Grad auf 55 Grad für zwölf zusätzliche Zyklen erhöht, gefolgt von einer abschließenden Inkubation von 72 Grad bei sieben Minuten.
Das PCR Produkt wurde dann mit NheI und mit EcoRI abgebaut und wurde in das mit denselben Enzymen abgebaute pGEMEX-1 Plasmid (Promega) eingebunden.
Die Plasmide wurden in den E.coli-Stamm JM109 transformiert und Klone, die die richtige Sequenz enthielten, wurden durch Sequenzierung der Doppelstrangplasmid-DNA mit Sequenase (Amersham/USB) identifiziert. Ein Plasmid, das die richtige Sequenz für das Ec-I-E ^κ _α-BSP-Gen enthielt, wurde benutzt, um den BL21(DE3) pLysS Strang von E.coli zur Expression des Fusionsproteins zu benutzen.
Expression von Ec-I-E ^κ _α-BSP und in vitro Faltung
Ec-I-E ^κ _α-BSP-Proteinhaltige Inklusionskörper wurden gemäß etablierter Protokolle (Altman et al. [1993]) mit den folgenden Modifikationen hergestellt. Nach der Expression wurde das Protein in einem Puffer ohne reduzierende Agenzien (z.B. Dithiothreitol oder Merkaptoethanol) gelöst, die aber alle vorher genannten Komponenten wie beschrieben enthielten (6M Guanidiumhydrochlorid, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Die Proteinkonzentration wurde bei und unter 1 mg/ml gehalten und die Disulfide konnten sich durch Luftoxidation über drei bis fünf Tage bilden, während das Protein weiterhin im denaturierten Zustand war. Für die Ec-I-E ^κ _α-Kette wurde dieses modifizierte Protokoll ebenso angewandt.
Lösliche Ec-I-E ^κ-Heterodimere wurden im großen Umfang in vitro durch Faltungsreaktionen produziert wie beschrieben (Altman, 1993), außer dass Glutathion und Peptidliganden an den Faltungsreaktionen nicht beteiligt waren. Leere Ec-I-E ^κ _α-BSP/β Heterodimere wurden durch Immunoaffinitätschromatographie auf einer Säule, die das Anti-I-E^k monoklonale Antikörper 14-4-4S enthielt, wie beschrieben isoliert (Wettstein, 1991). Für BPS wurde der Induktionspuffer der Säule durch Diafiltration in einem Centricon 30 Ultrafiltrationsgerät (Amicon) ausgetauscht.
Enzymatische Biotinylation von Ec-I-E^κ-BSP
Das pJS169-Plasmid ist ein pACYC184-Derivat, das die Überexpression von K unter der Kontrolle des tac promoters steuert. Nach der Expression und Lyse der Bakterienzelle wurde das BirA durch Säulenchromatographie aufgereinigt, zuerst auf Fast Flow Blue Sepharose und dann durch Ionenaustauschchromatographie auf einer MonoS-Säule (Pharmacia). Jede BirA-Charge wurde hinsichtlich der Aktivität in einem Reaktionsgemisch mit 20 mM Tris (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, 100 μM Biotin und 2,3 μM Ec-I-E K BSP titriert. Die Ansätze wurden für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Entfernung von freiem Biotin durch Diafiltration mit Centricon 30 Konzentratoren wurden der Biotinilierungsgrad durch eine Kombination von Präzipitation mit Streptavidin-Agarose (Sigma) und mengenmäßiger Bestimmung nicht-präzipitierbarem I-E^κ durch Sandwich ELISA bestimmt. Verschiedene Verdünnungen von biotiniliertem Ec-I-E^κ BSP werden in einem kleinen Volumen von Streptavidin – Agarose – Kügelchen über Nacht bei vier Grad in einem 2-Prozent-BSA und 5mM Natriumazid in PBS-haltigem Puffer inkubiert. Die Überstände aus diesen Mischungen wurden genauso wie die Kontrollen mit den unmodifizierten Agarose-Kugeln danach mit ELISA untersucht.
Für ELISA werden Immulon-4-Platten über Nacht bei vier Grad mit 14-4-4S bei einer Konzentration von 3,3 μg/ml in PBS beschichtet. Die Platten werden mit 2-prozentigen BSA in PBS-Puffer für eine Stunde beim Raumtemperatur blockiert. Serienmäßige Verdünnungen von Ec-I-E^k-BSP-haltigen Lösungen und ein Standard mit einer bekannten Ec-I-E^k-Konzentration werden auf der Platte für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Platte mit Waschpuffer (0,25 % BSA/0,05 % Tween20/5 mM Natriumazid) wurde ein Kaninchen Anti Ec-I-E^k-Antiserum bei einer Verdünnung von 1:4.000 bis 1:10.000 für eine Stunde aufgebracht. Zum Schluss wurde der Assay durch Zugabe von einem Maus-gebundenen Ziege-Anti-Kaninchen-alkalische Phosphatase Konjugat (Inkubationszeit 1 Stunde) und Zugabe von Substrat (Sigma AP 104 Tabletten) entwickelt. Typischerweise werden 90 bis 100 Prozent vom Ec-I-E^k aus den Lösungen durch Präzipitation durch mit Streptavidin-Agarose entfernt, was die nahezu komplette Biotinilierung des Ec-I-E^k-BSP-Proteins widerspiegelt. Ec-I-E^k-Proteine ohne BSP werden nach diesem Protokoll nicht biotiniliert, was stark daraufhin deutet, dass die Biotinilierung an einer einzelnen Stelle am BSP erfolgt.
Die Beladung des Bio-Ec-I-E^k-BSP mit Peptid
Enzymatisch biotinilierte Proteine werden mit dem 88-103 Peptid aus Motten-Cytochrom C, SEQ ID NO:4, ANERADLIAYLKQATK gemäß gängigen Protokollen beladen (Wettstein [1991], wie oben; Reay [1992] wie oben). Das leere αβ-Heterodimer wurde mit Mcllvaine's Zitronenphosphatpuffer (CPB) bei 37 Grad in behandelten Mikorzentrifugenröhrchen inkubiert. Die Reaktionen wurden auf einen pH von 7.0 durch Zugabe von 2 M Na₂HPO₄ eingestellt. Die peptidbeladenen Bio-Ec-I-E^k-BSP-Moleküle werden durch Gel-Filtration auf Superdex 200 Säulen in einer mobilen PBS-Phase aufgereinigt.
Herstellung von Bio-Ec-I-E^k-BSP-Tetrameren
Tetramere wurden durch Mischen der Bio-Ec-I-E^k-BSP-Moleküle mit Streptavidin - Texas-Rot (Boehringer, Mannheim) bei einem molaren Verhältnis von 4:1 hergestellt. Um die Herstellung von Tetrameren zu maximieren, wird die gewünschte Menge Streptavidin in 10 gleichen Schritten hinzugegeben mit einer Inkubationszeit von 15 Minuten zwischen den Zugaben. Dies stellt sicher, dass das bei jeder Zugabe zugegebene Streptavidin mit Bio-Ec-I-E^k-BSP gesättigt ist und nach der zehnten Zugabe enthält die Mischung hauptsächlich Bio-Ec-I-E^k-BSP-Tetramere und kleine Mengen überschüssigen Streptavidins und das Ec-I-E^k-Protein, das nicht durch BirA biotiniliert wurde.
Die Streptavidin-TR-Bindungsreaktion werden zuerst in Centricon 30 Geräten konzentriert und die kleineren Verunreinigungen werden auf einfache Weise durch Gel-Filtration mit Superdex-200-Säulen entfernt. Das Tetramer eluiert aus der Säule in einem frühen Peak entsprechend einem molekularen Gewicht von etwa 250.000, während die Verunreinigungen ein molekulares Gewicht um etwa 50.000 haben. Die markierten Tetramere werden zu einer Konzentration von 3-4 mg/ml konzentriert und werden vor der Verwendung in PBS +5 mM Natriumazid bei 4 Grad in bernsteinfarbigen Phiolen aufbewahrt.
Markierung von antiqenspezifischen T-Zellen mit einem tetrameren MHC-Antigenpeptid-Komplex

Zellen von den ableitenden Lymphknoten einer 5C.C7 T-Zell-Rezeptor (TCR) transgenen Maus werden mit den Lymphknotenzellen einer nicht-transgenen AK/J-Maus in verschiedenen Verhältnissen gemischt. Die transgene Maus ist bei Seder et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1091-1098 beschrieben. Sie ist hinsichtlich einer α- und β-Kette des 5C.C7 T-Zell-Rezeptors transgen. Die 5C.C7-Maus hat einen B10.BR genetischen Hintergrund, welche Ec-I-E^k und Thy 1.2 positiv ist, während der AKR/J-Stamm auch Ec-I-E^k positiv, aber Thy 1.2 negativ ist. Der Thy 1 allotypische Marker erlaubt deshalb eine einfache Identifizierung von T-Zellen aus den transgenen Mäusen. FACS Plots zeigen Zellen, die sich als CD4+ und negativ für CD8, B220 und Mac-1 erweisen, unter Verwendung der Desk Software der Stanford FACS Einrichtung, die Daten sind in 1 gezeigt. Die Antikörper und Konzentrationen, die in den Färbeexperimenten verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1

ANTIGEN	FÄRBENDES REAGENZ	LABEL	TRÄGER	END-KONZENTRATION
CD4	YT5 191.1	APC	Caltag	10 μg/ml
CD8	53-6.7	PE	Pharmingen	10 μg/ml
B220	RA3-6B2	PE	Pharmingen	10 μg/ml
Mac-1	M1/70	PE	Pharmingen	10 μg/ml
Thy 1.2	53-2.1	FITC	Pharmingen	10 μg/ml
	Streptavidin	Texas-Rot	Boehringer-Mannheim	10 μg/ml
TCR	Bindungskomplex	Texas-Rot	-	70 μg/ml

2 × 10⁶ Zellen bei einer Konzentration von 4 x 10⁷ Zellen/ml wurden mit dem Färbereagenz 30 bis 60 Minuten bei 4 Grad inkubiert. Die Zellen wurden vor der Analyse einmal mit PBS + 2 % FCS gewaschen. Die in 1 gezeigten Daten ergeben sich aus der Analyse von 5 × 10⁵ Zellen. Die Daten in 2 wurden aus einer Analyse von 5 × 10⁴ Zellen erhalten.
Das Experiment mit dem Mischen zeigt, dass das multimere Markierungsreagenz mit den transgenen Zellen bindet, sogar mit einem großen Hintergrund nicht-transgener Zellen, von denen viele auch an I-E^k gebundene Peptide erkennen.
Durch das folgende Experiment wurde gezeigt, dass die Färbung mit dem erfindungsgemäßen Markierungsreagenz spezifisch für transgene T-Zell-Rezeptoren ist. 5C.C7 transgene Lymphknotenzellen wurden vorher mit einem KJ25 monoklonalem Antikörper blockiert, der spezifisch für die TCR.V_β3 variablen Regionen ist (das 5C.C7-TCR-Transgen ist V_β3/V_α11). Diese Zellen wurden dann mit dem erfindungsgemäßen Markierungsreagenz gefärbt. Die Daten sind in 2 gezeigt. Die gezeigten Zellen erwiesen sich als positiv für CD4 und negativ für B220, CD8 und Mac-1. Der KJ25-Antikörper blockierte die Bindung des MHC-Reagenzes bei höheren Konzentrationen vollständig.
Auf Grund der o.g. Ergebnisse ist es offensichtlich, dass der erfindungsgemäße Gegenstand eine neue Methode zum spezifischen Markieren von T-Zellen gemäß ihrem Antigen-Rezeptor zur Verfügung stellt. Stabile multimere Komplexe aus MHC-Proteinen und spezifischen antigenen Peptiden können an T-Zellen binden, die den Komplex erkennen, die das Markieren, die Analyse und Trennung der einzelnen T-Zell-Untergruppe erlauben. Die Erfindung ermöglicht den Nachweis und die Trennung von spezifischen T-Zellen.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispielen zum Zwecke des klaren Verständnisses in einigen Details beschrieben worden ist, wird es für diejenigen, die sich im Stand der Technik auskennen, sofort im Lichte der Lehre dieser Erfindung offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifizierungen hierzu gemacht werden müssen/können, ohne hierbei den Bereich der beigefügten Ansprüche zu verlassen.

Claims

Ein multimerer Bindungskomplex zum Markieren, Nachweisen oder Trennen von Säugetier-T-Zellen entsprechend ihrem Antigenrezeptor, wobei der genannte Komplex vier MHC-Peptid-Komplex-Monomere der Formel α-β-P aufweist, wobei α eine lösliche Form einer α-Kette von einem Klasse I oder Klasse II MHC Protein umfasst, β eine lösliche Form einer (i) β-Kette von einem Klasse II MHC Protein oder (ii) β2 Mikroglobulin für ein Klasse I MHC Protein umfasst, und P ein im Wesentlichen homogenes Peptidantigen umfasst, welches in der Rinne gebunden ist, die durch (i) membranferne α1- und α2-Domänen für ein Klasse-I-MHC-Protein oder (ii) membranferne α1- und β1-Domänen für ein Klasse-II-MHC-Protein gebildet wird; wobei α oder β mit einer Aminosäuresequenz verbunden ist, die eine Erkennungsstelle für ein modifizierendes Enzym zur Verfügung stellt, und eine Biotin-Komponente an der Erkennungsstelle durch das modifizierende Enzym zugeführt wird, und wobei die genannten MHC Peptid Komplex Monomere durch Bindung der genannten Biotin-Komponente an eine multivalente Einheit, an die Biotin mit hoher Affinität bindet, multimerisiert werden.
Der multimere Bindungskomplex nach Anspruch 1, wobei das modifizierende Enzym BirA ist.
Der multimere Bindungskomplex nach Anspruch 1, wobei das t_1/2 des genannten multimeren Bindungskomplexes und des T-Zell-Rezeptors um mindestens etwa das Zehnfache der Bindung des genannten Monomers an einen T-Zell-Rezeptor erhöht ist.
Der multimere Bindungskomplex nach Anspruch 1, wobei das t_1/2 des genannten multimeren Bindungskomplexes und des T-Zell-Rezeptors um etwa das Fünfzigfache der Bindung des genannten Monomers an einen T-Zell-Rezeptor erhöht ist.
Der multimere Bindungskomplex nach Anspruch 1, wobei die genannte multivalente Einheit mindestens eines aus Streptavidin und Avidin aufweist.
Der multimere Bindungskomplex nach Anspruch 1, wobei der genannte multimere Bindungskomplex weiterhin eine Licht detektierbare Markierung aufweist.
Ein Verfahren zum Nachweis von Säugetier-T-Zellen entsprechend der Spezifität ihres Antigenrezeptors, wobei das Verfahren umfasst: a) Kombinieren einer Suspension der genannten T-Zellen und eines multimeren Bindungskomplexes entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 6, und b) Nachweisen der Anwesenheit einer spezifischen Bindung des genannten multimeren Bindungskomplexes und der genannten T-Zellen, wobei der genannte multimere Bindungskomplex an T-Zellen gebunden ist, die einen Antigenrezeptor aufweisen, der spezifisch für das genannte Peptidantigen ist, welches von den genannten α- und den genannten β-MHC Ketten präsentiert wird.
Ein Verfahren zur Trennung von Säugetier-T-Zellen entsprechend ihrem Antigenrezeptor, wobei das Verfahren umfasst: a) Kombinieren einer Suspension der genannten T-Zellen und eines multimeren Bindungskomplexes entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 6, und b) Trennen von an den genannten Komplex gebundenen Zellen von ungebundenen Zellen, wobei der genannte Komplex an T-Zellen gebunden ist, die einen Antigenrezeptor aufweisen, der spezifisch für das genannte Peptidantigen ist, genannten α- und den genannten β-MHC Ketten präsentiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das genannte Trennen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wird.